ES2321931T3 - Biosensores para detectar glucosa. - Google Patents

Abstract

Biosensor para detectar glucosa bajo condiciones fisiológicas, que comprende una proteína de unión periplasmática bactericida, donde la proteína periplasmática bactericida es una proteína de unión a glucosa (GBP) y por lo menos un grupo informador fijado en una posición de dicha GBP correspondiente a la posición 183 de GBP E. coli, donde la unión de glucosa en una cavidad de unión a glucosa de dicho biosensor provoca un cambio en la señalización por dicho grupo informador.

Description

Biosensores para detectar glucosa.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a biosensores y procedimientos para la fabricación y utilización de los mismos.

Antecedentes

Los biosensores son herramientas analíticas que pueden utilizarse para medir la presencia de una única especie molecular en mezclas complejas mediante la combinación de propiedades de reconocimiento molecular muy fuertes de macromoléculas biológicas con mecanismos de transducción de señal que relacionan la unión a ligando con los cambios físicos fácilmente detectables (Hall, Biosensors, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey; Scheller y otros, Curr. Op. Biotech. 12:35-40, 2001). Idealmente, un biosensor es menos reactivo y, en contraposición con los ensayos basados en encimas o inmunoensayos competitivos, no modifican la composición como consecuencia de realizar la medida (Hellinga & Marvin, Trends Biotech. 16:183-189, 1998). La mayoría de los biosensores combinan una macromolécula que se encuentra en la naturaleza tal como un encima o un anticuerpo, con la identificación de una señal física adecuada particular para la molécula en cuestión, y la construcción de un detector específico para este sistema (Meadows, Adv. Drug Deliv. Rev. 21:177-189, 1996). Recientemente, las técnicas de ingeniería molecular han estudiado como desarrollar macromoléculas que combinen un amplio margen de especificidades y afinidades de unión con un mecanismo de transducción de señal común, para construir un sistema de detección genérico para muchos analitos diferentes (Hellinga & Marvin, Trends Biotech. 16:183-189, 1998).

Las proteínas de unión periplásmica a Escherichia coli son miembros de una súperfamilia de proteínas (proteínas de unión periplásmica bacteriana, bPBPs) (Tam & Saier, Microbiol. Rev. 57:320-346, 1993) que han mostrado ser muy adecuadas para la ingeniería de biosensores (Patente U.S. 6.277.627). Estas proteínas comprenden dos dominios unidos a una región conectora (Quiocho & Ledvina, Molec. Microbiol. 20:17-25, 1996). El sitio de unión a ligando se localiza en la interfase entre los dos dominios. Generalmente, las proteínas adoptan dos conformaciones: una forma abierta libre de ligando y una forma cerrada unida al ligando, que interconvierte vía un mecanismo de plegamiento de la región conectora sobre la unión a ligando. Este cambio global conformacional mediado por el ligando se ha explorado para relacionar la unión a ligando con los cambios en la intensidad de fluorescencia situando fluoróforos individuales sensibles medioambientalmente en lugares donde se producen cambios conformacionales de acuerdo con el cambio global (Brune y otros, Biochemistry 33:8262-8271, 1994; Gilardi y otros, Prot. Eng. 10:479-486, 1997; Gilardi y otros, Anal. Chem. 66:3840-3847, 1994; Marvin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997, Marvin y Hellinga, J. Am. Chem. Soc. 120:7-11, 1998; Tolosa y otros, Anal. Biochem. 267:114-120, 1999; Dattelbaum & Lakowicz, Anal. Biochem. 291: 89-95, 2001; Marvin & Hellinga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4955-4960,2001; Salins y otros, Anal. Biochem. 294:19-26, 2001). Los mecanismos de unión también pueden elaborarse para alterar el flujo de corriente entre la superficie de un electrodo derivatizado con la bPBP diseñada por ingeniería que contiene un cofactor redox unido covalentemente (Benson y otros, Science 293:1641-1644, 2001).

Marvin y Hellinga, J. Am. Chem. Soc. 120:7-11, 1998 describen biosensores obtenidos por unión covalente de grupos fluorescentes sensibles medioambientalmente a residuos de cisteína en las posiciones 15, 152 255 257 294 y 296 de la proteína de unión a glucosa GBP E. coli.

La US 6277627 (Hellinga) describe un biosensor de glucosa que comprende una GBP que se ha diseñado por ingeniería para incluir mutaciones, por ejemplo, en las posiciones 15 152 255 257 294 y 296 que permiten la introducción del sitio específico de un grupo informador sensible medioambientalmente, cuya señal cambia linealmente con el grado de unión a glucosa.

La presente invención se refiere a un procedimiento de utilización de bPBPs para generar biosensores para glucosa. Estos biosensores presentan utilidad de amplio espectro incluyendo características medioambientales, clínicas e industriales.

Descripción resumida de la invención

Los biosensores pueden fabricarse a partir de un mutante o miembros naturales de la súperfamilia de proteínas de unión periplásmica bacterianas (bPBP), y utilizarse en ensayos para (por ejemplo, detectar y/o cuantificar) ligandos. La estructura terciaria de las bPBPs está comprendida de dos dominios unidos por una región conectora con una cavidad de unión a ligando situada en una interfase entre los dos dominios. Generalmente, éstas adoptan dos conformaciones: una forma abierta libre de ligando y una forma cerrada unida al ligando, que interconvierte vía un mecanismo de plegamiento de la región conectora que depende de si el ligando está unido o no en el sitio. Los biosensores están hechos por la unión covalente o no covalente de por lo menos un grupo informador en una o más posiciones específicas de una bPBP. Después de la unión del ligando al biosensor, se produce un cambio en la señal transducida por el grupo informador que puede analizarse mediante evaluación de cualquiera de sus propiedades observables (por ejemplo, propiedades ópticas o electroquímicas). Los biosensores se clasifican según la relación entre el sitio de unión del grupo informador y el sitio(s) de unión del ligando (es decir, alostérico, endostérico o peristérico) o la distancia entre estos sitios (es decir, distal o proximal).

El acontecimiento de enlazar el ligando al biosensor modifica el entorno local del grupo informador unido específicamente a una posición. La señal del grupo informador puede generarse por uno o más fluoróforos y/o cofactores redox. El biosensor puede funcionar bajo condiciones fisiológicas sin reactivos adicionales.

Un aspecto de la invención es proporcionar un biosensor de acuerdo con la reivindicación 1.

A partir de la descripción que sigue quedarán claros los objetivos y ventajas de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra las estructuras 3-D de once bPBPs que indican las posiciones de sitios alostéricos, endostéricos y peristéricos utilizados. Cada proteína se muestra en la forma cerrada, con el ligando de unión indicado por estructuras bola y palo. Los dos dominios de cada bPBP están orientados verticalmente con el primero (conteniendo la N-terminal) por encima del segundo (conteniendo el C-terminal). Un segmento conector conecta los dominios. La estructura de BP histidina se utiliza para representar la estructura todavía no resuelta de BP glutamato/aspartato. Los residuos mutados a cisteína se indican por esferas sombreadas de forma distinta y diferenciados como alostéricos (sombreado fuerte), endostéricos (sombreado medio, en sólo GBP) o peristéricos (sombreado ligero). Las estructuras están agrupadas por los grupos tal y como se define en Tam & Saier (Microbiol. Rev. 57:320-346, 1993) de acuerdo con las relaciones basadas en secuencias. El grupo 2: BP arabinosa (ABP), BP glucosa (GBP) y BP ribosa (RBP). El grupo 5: BP dipéptido (DPP). El grupo 3: BP glutamina (QBP), BP histidina (HBP) y BP glutamato/aspartato (EBP). El grupo 6: BP fosfato (PBP) y BP sulfato (SBP). El grupo 1: BP maltosa (MBP) y BP Fe(III) (FeBP). Los gráficos moleculares se representaron con Molscript (Kraulis, J. Appl. Crystallogr. 24:946-950, 1991).

La Figura 2 muestra el alineamiento de las secuencias de YBEJ E. coli (BP glutamato/aspartato putativo), BP glutamina e BP histidina utilizando clustalW (Thompson y otros, Nucl. Acids Res. 22:4673-4680, 1994). La numeración empieza desde el codón de iniciación putativo del marco de lectura abierto para YBEJ, incluyendo su secuencia lectora. La metionina subrayada es el codón de iniciación para la expresión de YBEJ utilizada en el estudio. Los residuos en cada proteína que mutaron a cisteína para conjugación de fluoróforo están en negrita. Las letras "a" y "p" debajo de estos residuos indican, respectivamente, su clasificación como alostérica o peristérica.

La Figura 3 muestra las fórmulas estructurales de los fluoróforos reactivos al tiol. Las longitudes de onda aproximadas de excitación y emisión fluorescencia máxima respectivamente, de los fluoróforos unidos a proteína están (en nm): pireno (340, 390); acrilodan (390,500); fluoresceína (485, 520); NBD (490, 540); NBDE (490, 530); JPW4039 (485, 590); JPW4042 (470, 640); y JPW4045 (470, 640).

Las Figuras 4A y 4B muestran una definición de los parámetros fluorimétricos. La Fig. 4A muestra parámetros \lambda_{std}, I_{1}, y I_{2} utilizados para determinar el cambio de intensidad estándar \Delta_{Istd}. La Fig. 4B muestra los parámetros A_{1}, A_{2}, ºA, y \inftyA utilizados para determinar \DeltaR. Cada una de las áreas \inftyA incluye el área respectiva ºA.

Las Figuras 5A y 5B muestran la valoración fluorimétrica de conjugados BP glutamato/aspartato y BP glucosa. La Fig. 5A muestra la valoración de glucosa BP W183C-acrilodan con glucosa. La Fig. 5B. La valoración de BP glutamato/aspartato T129C-NBD con aminoácidos. Valor de los datos: \medbullet ácido glutámico; + ácido aspártico; \blacklozenge asparagina; X glutamina. En las Fig. 5A y Fig. 5B, las líneas mostradas son las mejores isotermas de unión en dichas condiciones.

Las Figuras 6A-6C muestran la existencia de los parámetros fluorimétricos en el juego de 320 conjugados fluorescentes. La Fig. 6A muestra la distribución de la desviación en la longitud de onda de intensidad fluorescente máxima (max\lambda_{saturada}- max\lambda_{apo}). La Fig. 6B muestra la distribución del parámetro de cambio de intensidad \DeltaI_{std}. La Fig. 6C muestra la distribución del parámetro de cambio radiométrico \DeltaR_{max}. Para cada parámetro, se indica el enlace superior de cada intervalo.

La Figura 7 muestra la existencia de los cambios en la afinidad de ligando entre tres clases de sitios de unión fluoróforo. Leyenda: sitios endostéricos, barras llenas; sitios peristéricos, barras ralladas; sitios alostéricos, barras en blanco. En el caso de la BP arabinosa, el valor para ^{wt}K_{d} es el del mutante C64A, en el cual todos los conjugados dieron datos no incluidos para la BP dipéptido y la BP Fe (III). Para el primero, no se informa de la K_{d} para el dipéptido Gly-Leu en el tipo natural. En el caso de BP Fe(III), no se determinó la K_{d} del mutante no conjugado E57D. Para cada intervalo en los ejes x, se ha indicado el enlace superior. Por ejemplo, el intervalo rotulado "0" contiene valores de log(^{mut}Kd/^{wt}Kd) > -1 y \leq 0.

Las Figuras 8A y 8B muestran la valoración ratiométrica de proporciones de conjugados fluoróforos bPBP utilizando pares diferentes de bandas de longitud de onda de emisión. La Fig. 8A muestra la glucosa BP-W183C conjugada a acrilodan, valorada con glucosa en las siguientes bandas de emisión de fluorescencia (longitudes de onda en nm): \lozenge, F_{450-459}/F_{550-559} (^{app}K_{d} \sim 5,0 mM); \boxempty, F_{450-459}/F_{486-495} (^{app}K_{d} \sim 10,4 mM); \medcirc, F_{472-481}/F_{450-459} (^{app}K_{d} \sim 17,4 mM). Las líneas concuerdan con la ecuación 4. El margen normal de glucosa sérica (euglicemia) de 4 a 6 mM está delimitado por las líneas verticales. La Fig. 8B muestra BP ribosa-T135C conjugada a acrilodan, valorada con ribosa en los siguientes márgenes de emisión de fluorescencia (longitudes de onda en nm): \boxempty, F_{501-510}/F_{450-459} (^{app}K_{d} \sim 41 mM), \medcirc, F_{450-459}/F_{501-510} (^{app}K_{d} \sim 254 mM); \lozenge, F_{450-459}/F_{547-556} (^{app}K_{d} \sim 461 mM).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un biosensor para la detección de glucosa bajo condiciones fisiológicas que comprende una proteína de unión periplásmica bacteriana, donde la proteína periplásmica bacteriana es una proteína de unión a glucosa (GBP), y por lo menos un grupo informador unido en una posición de dicha GBP que corresponde a la posición 183 de la GBP E. coli, donde la unión de glucosa en la cavidad de unión a glucosa de dicho biosensor provoca un cambio en la señalización por dicho grupo informador tal y como se reivindica en la reivindicación 1. Otros aspectos de la invención se refieren a procedimientos que utilizan el biosensor para la detección de la presencia o ausencia de glucosa o para el ensayo de glucosa en una muestra. En las reivindicaciones dependientes se definen las realizaciones preferidas.

Los conjugados se construyen de manera que pueda monitorizarse la unión de ligandos a bPBPs. Los conjugados pueden obtenerse mediante la introducción de mutaciones en una bPBP en uno o más sitios específicos en la estructura de proteína donde los grupos informadores unidos covalentemente (por ejemplo, fluoróforos o cofactores redox) responden a un cambio conformacional de la bPBP que tiene lugar durante la unión a ligando. Otros métodos para la unión covalente o no covalente en por lo menos un grupo informador a una o más posiciones de residuos aminoácidos en la secuencia primaria de aminoácidos de un mutante o bPBP natural incluyen: adición o sustitución de cualquier agente de reticulación activable, utilización de un diseñador o tRNAs no natural, introducción de sitios de coordinación, etc.

En la invención se describe la universalidad del mecanismo de acoplamiento conformacional por ingeniería en bPBPs. Tal y como se describe en el ejemplo que sigue, se han utilizado diez bPBPs de estructura conocida y se han introducido ocho fluoróforos diferentes sensibles medioambientalmente en una variedad de ubicaciones predecidas para relacionar los cambios conformacionales locales al movimiento de plegamiento de la región conectora mediada por ligando. Pueden utilizarse las técnicas bioinformáticas para predecir la ubicación de los sitios de unión en bPBPs de estructuras no conocidas, haciendo posible de esta manera utilizar una gran cantidad de parálogos y homólogos que se han identificado recientemente en esta familia mediante estudios secuenciales genómicos (Blattner y otros, Science 277: 1453-1474, 1997; Quentin y otros, J. Mol. Biol. 287:467-484, 1999). Conjuntamente con las oportunidades de rediseño basadas en la estructura de especificidad de unión a ligando (Hellinga & Richards, J. Mol. Biol. 222:763-785, 1991; Marvin & Hellinga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4955-4960, 2001), el ejemplo que se proporciona a continuación demuestra el amplio potencial de la súper familia de bPBP como base para un sistema de biosensores adecuados para un amplio margen de aplicaciones.

Además, la cavidad de unión a ligando puede diseñarse por ingeniería para unir ligandos que no se unen por la bPBP natural. El sitio de unión a ligando se localiza en la interfase entre los dos dominios de las bPBP. La mutación de residuos aminoácidos en las interfases que están cerca (por ejemplo, en o alrededor) del sitio de unión de la bPBP natural puede generar nuevos contactos con el ligando (por ejemplo, Zn^{++} para MBP) y destruir o alterar la unión con el ligando cognato (por ejemplo, maltosa para MBP). Esto puede utilizarse para cambiar la especificidad de la cavidad de unión a ligando. Por ejemplo, la proteína de unión a maltosa se ha mutado para unir específicamente al ligando no cognato: por ejemplo, el ión metálico Zn^{++}, trinitrotolueno, L-lactato, y serotonina (Marvin & Hellinga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4955-4960, 2001; Looger y otros, Nature 423:185-190, 2003; Dwyer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11255-11260, 2003). Así, los biosensores que unen ligandos no cognatos pueden obtenerse mediante la mutación de residuos aminoácidos en la interfase de los dos dominios de bPBP para generar una nueva cavidad de unión a ligando; el enlace a ligando mediante estos biosensores no puede unir a la bPBP natural.

Pueden obtenerse otras mutaciones en la bPBP que afecten la función del biosensor: por ejemplo, las mutaciones pueden aumentar o disminuir la afinidad de unión o especificidad de unión; aumentar o reducir la transducción de señal; añadir un nueva funcionalidad mediante la fusión con otro carbohidrato, lípido o dominio de proteína; aumentar la termoestabilidad o termolabilidad; introducir una actividad catalítica; reducir o alargar la vida operacional; ampliar o limitar las condiciones de funcionamiento; o cualquier combinación de las mismas. Se prefiere la mutación de residuos aminoácidos en las posiciones de la bPBP cuando no está unido un grupo informador (por ejemplo, por lo menos una mutación sin sentido invertida que no es una cisteína conjugada a través de un enlace tiol a un fluoróforo).

Un procedimiento de construcción de un biosensor fluorescente reactivo puede comprender sitios de identificación en la bPBP que conduce a un cambio conformacional local conjuntamente con un movimiento de plegamiento de la región conectora mediada por ligando. Los residuos de cisteína pueden introducirse en uno o más de estos sitios y un fluoróforo acoplado al mismo de manera que la intensidad fluorescente del fluoróforo cambia en la unión a ligando.

Las bPBPs adecuadas para utilizar en el presente procedimiento pueden seleccionarse o diseñarse. La súper familia de bPBP es muy adecuada para el rediseño de especificidades de unión a ligando bien por métodos computacionales o bien por otros medios o ambos basados en el ligando a detectar (véase, por ejemplo, los analitos referenciados en la Tabla). Loa sitios en la bPBP apropiada para unir uno o más receptores (por ejemplo, fluoróforos o cofactores redox) incluyen sitios alostéricos, sitios peristéricos y sitios endostéricos (un informador también puede estar presente en un sitio no señalizado para utilizar, por ejemplo, como referencia). En el caso de sitios alostéricos, el informador (por ejemplo, fluoróforo) puede situarse en una o más ubicaciones distantes del sitio de unión a ligando (es decir, distales de la cavidad de unión a ligando) que conducen a cambios conformacionales locales en la unión a ligando. En el caso de sitios peristéricos, el informador (por ejemplo, fluoróforo) puede ubicarse en el "borde" del sitio de unión pero no de manera que interactúe directamente con el ligando. Con un sitio endostérico, el informador (por ejemplo, fluoróforo) puede estar presente en el sitio de unión de manera que interactúe directamente con el ligando. Los dos últimos ejemplos muestran la unión proximal a la cavidad de unión a ligando.

TABLA 1 Aplicaciones potenciales de los biosensores para ligandos de bPBP

1

Los sitios alostéricos, peristéricos y endostéricos pueden diseñarse de por lo menos dos formas distintas, tal y como se detalla en el ejemplo que sigue. Generalmente, puede utilizarse una aproximación de diseño basada en la estructura en la cual se examinan las estructuras de los estados abierto o cerrado (para diseños alostéricos) o sólo el estado cerrado (para diseños peristéricos y endostéricos). Alternativamente, puede utilizarse una aproximación de diseño basada en la secuencia donde las relaciones homólogas puedan explorarse para predecir la ubicación de las mutaciones de cisteína en proteínas cuyas estructuras tridimensionales no se han determinado, siempre que dichas mutaciones estén caracterizadas en proteínas de estructura conocida.

Tal y como se ha indicado más arriba, los informadores adecuados para utilizar en la invención incluyen, pero no se limitan a ellos, fluoróforos y cofactores redox. En el caso de fluoróforos, la selección es dependiente, por lo menos en parte, de la naturaleza de la ubicación dentro de la proteína particular. Mientras un fluoróforo puede funcionar mejor en un lugar determinado en vez de otro, un experto en la material puede fácilmente seleccionar el fluoróforo preferido para una aplicación particular (véase, por ejemplo, la Patente U.S. 6.277.627). En el ejemplo que sigue, se utilizan ocho fluoróforos diferentes en el diseño de sensores fluorescentes para:

Arabinosa

Proteína de unión a arabinosa (ABP)

Dipéptidos

Proteína de unión a dipéptido (DPP)

Glutamato y asparato

Proteína de unión a Glu/Asp (EBP)

Glutamina

Proteína de unión a glutamina (QBP)

Fe(III)

Proteína de unión a hierro (FeBP)

Histidina

Proteína de unión a histidina (HBP)

Maltosa

Proteína de unión a maltosa (MBP)

Glucosa

Proteína de unión a glucosa (GBP)

Fosfato

Proteína de unión a fosfato (PhBP)

Sulfato

Proteína de unión a sulfato (SBP).

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Los informadores redox para utilizar en la invención pueden ser un centro de metal activo-redox o una molécula orgánica activa-redox. Puede ser un cofactor orgánico natural tal como NAD, NADP, FAD o un centro de metal natural tal como cobre azul, grupos de azufre-hierro o heme o un centro sintético tal como un compuesto organometálico tal como un complejo de rutenio, un ligando orgánico tal como una quinona o un centro de metal diseñado por ingeniería introducido en la proteína o sitio de unión a cofactor orgánico diseñado por ingeniería. Los sitios de unión a cofactor pueden diseñarse por ingeniería utilizando diseño racional o técnicas de evolución dirigidas. El informador redox puede unirse covalente o no covalentemente a la proteína, ya bien sea por sitio específico o interacciones inesperadas entre el cofactor y la proteína. Puede ser intrínseco a la proteína tal como un centro metálico (natural o diseñado por ingeniería) u orgánico natural (NAD, NADP, FAD) o cofactor organometálico (heme), o extrínseco (como un grupo organometálico sintético, conjugado covalentemente). El informador redox puede, por ejemplo, unirse (por ejemplo, covalentemente) en una posición donde el residuo aminoácido está en la superficie de la proteína.

El informador redox puede ser un grupo que contiene metales (por ejemplo, un grupo que contiene metales de transición) que es capaz de transferir reversiblemente o semireversiblemente uno o más electrones. Puede utilizarse un número de grupos informadores posibles de metales de transición. Ventajosamente, el grupo informador tiene un potencial redox en la ventana potencial debajo de este sujeto para interferir mediante el oxígeno molecular y tiene un grupo funcional adecuado para la conjugación covalente a la proteína (por ejemplo, funcionalidades reactivas a tiol tal como maleimidas o yodoacetamida para acoplarse a residuos de cisteína únicos en la proteína). El metal del grupo informador debe ser inerte en la sustitución en estado reducido o estado oxidado (es decir, ventajosamente, los grupos exógenos no forman enlaces inesperados con el grupo informador). El grupo informador puede ser capaz de producir un cambio amperimétrico o potenciométrico en respuesta a la unión a ligando. En una realización preferida, el grupo informador es agua soluble, es capaz de acoplarse a un sitio específico a una proteína (por ejemplo, vía un grupo funcional reactivo a tiol en el grupo informador que reacciona con una cisteína única en la proteína), y conduce a una respuesta potenciométrica sobre la unión a ligando. Los metales de transición adecuados para utilizar en la invención incluyen, pero no se limitan a estos, cobre (Cu), cobalto (Co), paladio (Pd), hierro (Fe), rutenio (Ru), rodio (Rh), osmio (Os), renio (Re), platino (Pt), escandio (Sc), titanio (Ti), vanadio (V), cromo (Cr), manganeso (Mn), níquel (Ni), molibdeno (Mo), tecnecio (Tc), tungsteno (W), e iridio (Ir). Es decir, son preferidos la primera serie de los metales de transición, los metales de platino (Ru, Rh, Pd, Os, Ir y Pt), además de Fe, Re, W, Mo y Tc. Especialmente preferibles son los metales que no cambian el número de sitio de coordinación con el cambio en el estado de oxidación, que incluyen rutenio, osmio, hierro, platino y paladio, siendo especialmente preferido el rutenio.

El grupo informador puede estar presente en el biosensor como un conjugado covalente con la proteína. Preferiblemente, el grupo informador se conjuga covalentemente a la proteína vía un enlace del grupo funcional maleimida a una cisteína (tiol) sobre la proteína. En cualquier caso, el grupo informador está unido a la proteína de manera que se sitúa entre la proteína y el electrodo.

Las proteínas diseñadas por ingeniería según la invención pueden obtenerse mediante la introducción del sitio específico de un grupo(s) informador mediante la síntesis total o semi-síntesis (véase, por ejemplo, Adams y otros, Nature 39:694-697, 1991; Brune y otros, Biochemistry 33:8262-8271, 1994; Gilardi y otros, Anal. Chem. 66:3840-3847, 1994; Godwin y otros, J. Am. Chem. Soc. 118:6514-6515, 1996; Marvin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:4366-4371, 1997; Post y otros, J. Biol. Chem. 269:12880-12887, 1994; Romoser, J. Biol. Chem. 272:13270-13274, 1997; Thompson y otros, J. Biomed. Op. 1:131-137, 1996; Walkup y otros, J. Am. Chem. Soc. 119:5445-5450, 1997).

Con los biosensores pueden llevarse a cabo ensayos para ligandos. Se pone en contacto una muestra con el biosensor bajo condiciones de ensayo apropiadas. Los ligandos presentes en la muestra, si existen, pueden detectarse por unión al biosensor y medirse la señal transducida por el biosensor de enlace a ligando en el ensayo. Para fines de detección, la unión no es necesaria cuantificarla porque sólo se requiere una determinación simple de si el ligando está o no presente (con límites de detección). Por otra parte, la comparación de series de muestras de control (por ejemplo, cantidades conocidas de ligando) pueden ser necesarias para cuantificar la cantidad o concentración de ligando en la muestra. Dado el volumen de la muestra, la cantidad (es decir, la masa) del ligando y la concentración de ligando son interconvertibles. Puede utilizarse una muestra en blanco que no contiene ligando para determinar la señal de fondo. Pueden utilizarse estándares para construir una curva estándar (por ejemplo, hiperbólica) para cuantificar muestras desconocidas. Aunque son preferibles los formatos de ensayos homogéneos (es decir, aquellos que no requieren separación del ligando unido o no unido), la separación en un ensayo heterogéneo puede ser necesario si las sustancias que significativamente interfieren con la transducción y/o medida están presentes en la muestra. Preferiblemente, la transducción de señal no requiere la adición de reactivos inusuales de manera que los ensayos de los fluidos corporales pueden realizarse con la preparación mínima de la muestra y bajo condiciones fisiológicas. Estas pueden incluso llevarse a cabo en vivo si el biosensor se adapta a un dispositivo médico de implante. Alternativamente, un biosensor en contacto con la piel puede ensayar el fluido intersticial o de transpiración. El lavado puede utilizarse para tejidos de mucosa en la muestra.

La muestra puede obtenerse en un laboratorio (por ejemplo, en un centro clínico o de investigación); a partir de una fuente medioambiental (por ejemplo, aire, acuíferos y otros cuerpos de agua, productos animales o de plantas que crecen en la tierra, suelo); a partir de una fuente industrial (por ejemplo, industrias alimentarias, biofarmacéuticas, químicas u otras industrias de transformación). El analito a ensayar es idéntico al ligando, comprendido de múltiples copias de ligando, químicamente relacionadas con el ligando de manera que éste se identifica por un cambio en la transducción de señal (por ejemplo, una estructura química relacionada se une más fuertemente o más débilmente al biosensor comparada con la unión a su ligando "correcto"), o cualquier combinación de estos. El cambio en la transducción de señal puede correlacionarse con el cambio en la estructura química de manera que el analítico no idéntico se identifica (véase la descripción que sigue de los ensayos integrados). Ejemplos de ligandos que pueden detectarse o cuantificarse incluyen: aminoácidos; carbohidratos; compuestos bioactivos sólidos y gaseosos que son soluble en una muestra acuosa; sustancias controladas o de contrabando (es decir, sustancias que su utilización o posesión es ilegal o que están fuertemente reguladas); contaminantes medioambientales (por ejemplo, fosfatos, sulfatos); explosivos (por ejemplo, TNT); contaminantes alimentarios y subproductos (por ejemplo, carcinógenos, toxinas de plantas, teratógenos); lípidos; iones metálicos (por ejemplo, cationes divalentes, iones férricos); toxinas microbiológicas (por ejemplo, productos tóxicos de virus, bacterias o protozoos); neurotransmisores (por ejemplo, serotonina); nucleósidos o nucleótidos (por ejemplo, NAD, NADP, FAD); péptidos o esteroides (por ejemplo, factores de crecimiento, hormonas, señales morfogénicas o de desarrollo); y fármacos terapéuticos. Objetos (por ejemplo, maletas, carteras, otros contenedores); personas o vehículos que pasan a través de un punto de control; y áreas de embarque o seguridad que pueden inspeccionarse de agentes biológicos, de productos de contrabando, explosivos, venenos y toxinas como aplicaciones de seguridad o militares.

Uno o más biosensores pueden unirse covalentemente o no a un sustrato sólido o poroso. El sustrato puede ser liso y plano (por ejemplo, un filtro de membrana, una lámina de vidrio, un chip semiconductor); cilíndrico (por ejemplo, fibra óptica, perfil de plástico); esférico (por ejemplo, polímero reticulado o perlas de vidrio); o formado como un contenedor (por ejemplo, celda o tubo, placa múltiple). El sustrato puede fabricarse para análisis mediante instrumentos que miden la señal transducida por el grupo informador (por ejemplo, microscopio, fotómetro, espectrómetro). Los biosensores individuales pueden codificarse por un marcador unido (por ejemplo, código de columnas, radio frecuencia o RFID, o biopolímero) que pueden decodificarse por un lector (por ejemplo, escáner de patrones de luz y sombra, receptor de radio, sonda de unión específica o secuenciador automatizado) o separado por un clasificador según su marcador. El código que identifica cada biosensor puede utilizarse en análisis paralelo mediante el ensayo rápido de una muestra para una pluralidad de ligandos. Se utilizan biosensores múltiples con especificidades diferentes de unión a ligando en el mismo ensayo para detectar y/o cuantificar múltiples ligandos al mismo tiempo. Alternativamente, puede utilizarse la unión de biosensores diferentes en lugares específicos en el sustrato para identificar sus especificidades de unión a ligando por donde se hayan producido las señales. Las señales pueden autentificarse repitiendo en ensayo, utilizando múltiples biosensores con la misma especificidad para ensayos redundantes o correlacionando los resultados a partir de múltiples biosensores con especificidades solapadas para ensayos integrados. En el último, los patrones de reactividad específica de los biosensores se correlacionan con la identidad del analito unido por estos. Los analitos que están relacionados más cerca con su estructura química al ligando se unirán más fuertemente al biosensor cognato. Las señales de una pluralidad de biosensores con especificidades de unión a ligando conocidas y solapadas están integradas para deducir la identidad del analito.

Los biosensores pueden construirse utilizando los métodos descritos más arriba y utilizarse para la detección de analitos en, por ejemplo, entornos industriales, clínicos y medioambientales. Las utilidades particulares se describen en los ejemplos específicos que siguen. Se proporciona una descripción de un números de sitios que pueden utilizarse para sensores ópticos de glucosa basados en GBP (se ha utilizado con éxito W183C conjugada a acrilodán en prototipos de fibra óptica de un sensor de glucosa.

En el ejemplo no limitativo que sigue se describen determinados aspectos de la invención con más detalle.

Ejemplo Detalles experimentales

Clonación molecular. Se utilizó PCR para amplificar los genes naturales para bPBPs a partir del DNA genómico de E. coli cepa CSH100 (arabinosa, dipéptido, histidina, ribosa, sulfato y BP glutamato/aspartato); cepa W1485 (BP glucosa y glutamina) y cepa RU1012 (BP fosfato), o de la cepa de H. Influenzae Rd (BP Fe(III)). Los productos amplificados se clonaron dentro de uno de los vectores de expresión de proteína pAED4 (Doering, "Functional and structural studies of a small f-actin binding domain" en la tesis de Ph.D., Massachusetts Institute of Technology, 1992); pKK223-3 (Brosius & Holy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6929-6933, 1984); o vectores pET (Studier y otros, Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990) (Novagen). Los primers oligonucleótidos N-terminal se diseñaron para clonar sólo la forma periplasmática procesada, cortando la secuencia de señal. El primer C-terminal se diseñó para añadir la secuencia Gly-Ser-Gly-(His)n o Gly-Ser-(His)n, donde n=5, 6 ó 10. Dos tandem codones terminación (TAATGA) siguen el ultimo codón His. Los mutantes BP a maltosa se obtuvieron y expresaron a partir del plásmido pMAL-c2X (New England BioLabs). Se utilizaron las cepas E. coli XL1-BLUE (Stratagene) y DH5\alpha (Hanahan, J. Mol. Biol. 166:557-580, 1983) para la construcción del plásmido. Se generaron sustituciones individuales de aminoácidos por solapamiento de mutagénesis PCR (Ho y otros, Gene 77:51-59, 1989). Todos los clones y mutaciones se confirmaron por secuenciamiento de nucleótidos. En el caso de BP arabinosa, la cisteína individual en la secuencia de tipo natural se reemplazó por alanina para eliminar la posibilidad de conjugación del grupo informador a este tiol (Miller y otros, J. Biol. Chem. 254:7521-7528, 1979). De forma adicional, la secuencia de BP Fe(III) se mutó por sustitución de Glu57 con Asp para aumentar la K_{d} a un margen de concentración convenientemente medida utilizando citrato de
Fe(III).

Expresión de proteína. Los plásmidos se transformaron en la cepa E. coli BL21-DE3, crecieron en caldo de nutriente durante toda la noche a 37ºC, a continuación se diluyeron 100 veces en un medio fresco y crecieron de nuevo a 37ºC o 25ºC. La expresión se indujo mediante la adición de \beta-D-1-tiogalactopiranosido isopropílico a 1 mM cuando la densidad óptica del cultivo a 600 nm alcanzó 0,4. Después de 2 a 4 horas, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 20 mM de ácido de 3-morfolinopropanosulfónico 50 (MOPS), 100 mM NaCl, pH 6,9 y se almacenaron congeladas o se sometieron a lisis inmediatamente para la purificación de proteína.

Purificación de proteína. Las células se sometieron a lisis mediante sonicación o mediante el paso a través de una celda de presión French. El lisado se trató mediante la adición de Polimina P a 0,33% (p/v), se enfrió en hielo durante 15 min, a continuación se centrifugó hasta fragmentos de célula granulados. El supernadante se cargó en una columna cargada de Ni(II) de flujo rápido de Sepharose^{TM} quelante (Amersham Pharmacia Biotech) mantenido en equilibrio con 20 mM MOPS, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 7,5. La columna se lavó con tampón de carga, a continuación, conteniendo 60 mM de imidazol, seguido de 100 mM de imidazol. Finalmente, la proteína se eluyó con tampón que contenía 400 mM de imidazol y se recogió en fracciones y se examinó la pureza por electroforesis de gel. Todas la preparaciones fueron por lo menos 95% puras por este criterio. Las fracciones que contenían proteína se dializaron exhaustivamente contra tampón (20 mM MOPS, 100 mM NaCl, pH 6,9, o 20 mM NaH_{2}PO_{4}, 100 mM NaCl, pH 6,9) o se desalaron por filtración de gel para extraer el ligando enlazado.

Conjugación de fluoróforo a bPBPs sustituidas a cisteína. Los fluoróforos reactivos al tiol obtenidos a partir de Molecular Probes (Eugene, Oregon) fueron 5-yodoacetamidofluoresceína (fluoresceína); N-(1-pireno) yodoacetamida (pireno); N,N'-dimetil-N-(yodoacetil)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)etilendiamida (NBD); N-((2-(yodoacetoxi)etil)-N-metil)amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBDE); y 6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrilodán). Los colorantes estirilo y naftilo JPW4039, JPW4042, y JPW4045 (Fig. 3) se sintetizaron en la Universidad del estado de Connecticut. En general, todas las etapas de conjugación fluorófora se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se añadió a la proteína, a una concentración de 100 \muM, tris-(2-carboxietil)fosfina HCl con un exceso molar de cinco veces para reducir los enlaces disulfuro intermoleculares. Se añadió un fluoróforo reactivo a tiol (20 a 25 mM en acetonitrilo o dimetil sulfóxido) en alícuotas pequeñas a un exceso molar de cinco veces sobre la proteína. La conjugación prosiguió a oscuras y a temperatura ambiente durante 4 horas o durante toda la noche a 4ºC. Se consiguió la separación de la proteína del fluoróforo no reaccionado por diálisis exhaustiva o por cromatografía de exclusión por tamaño. Se valoró la eficacia de la unión del grupo informador por determinación del tiol no reaccionado con reactivo de Ellman (Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 74:443-450, 1958) o por medición de la relación de fluoróforo a proteína a partir del espectro de absorbancia del conjugado purificado.

Agotamiento de sulfato y fosfato. Las soluciones de BP sulfato y BP fosfato y sus tampones se trataron para disminuir la concentración de sulfato y fosfato contaminante, respectivamente. El tampón BP sulfato (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) se pasó a través de la forma cloruro de resina Dowex 1X2-100 de intercambio aniónico fuertemente básica. Las soluciones BP sulfato se trataron por diálisis contra tampón tratado; se incluyó también la resina Dowex mantenida en un tubo de diálisis separado. Las soluciones BP fosfato y el tampón (20 mM MOPS, 100 mM NaCl, pH 6,9) agotaron el fosfato por adición de 7-metilguanosina a 1 mM y se dializaron contra fosforilasa nucleosida bacteriana (1 unidad ml^{-1}) (Sigma-Aldrich) dividida en un tubo de diálisis separado (Brune y otros, Biochem. 33:8262-8271, 1994).

Fluorimetría. Todas las medidas se llevaron a cabo con un fluorímetro SLM Aminco-Bowman serie 2, con agitación de la muestra a 25ºC. Los espectros de emisión de fluorescencia se adquirieron con anchas rendijas de excitación y emisión de 4 y 8 nm, respectivamente. El potencial de tubo de fotomultiplicador se mantuvo entre 400 y 800 voltios. Las concentraciones de proteína estaban en el margen de 50 a 1000 nM. La excitación específica de fluoróforo fue en las siguientes longitudes de onda: triptofan, 290 nm; acrilodán, 390 nm; fluoresceína, 485 nm; pireno, 340 nm; NBD y NBDE, 490 nm; JPW4039, 485 nm; JPW4042, 470 nm; JPW4045, 470 nm.

Para medir la afinidad de unión a ligando, el ligando se añadió por series a 3 ml de bPBP a una concentración de 50 a 1000 nM, y se tomaron medidas de las intensidades de emisión. Las correcciones se realizaron para la dilución de la proteína y para la señal de fondo del tampón. Las curvas de unión se ajustaron para las isotermas de unión utilizando la ecuación 3 ó 4, como las apropiada.

La BP de Fe(III) tiene una constante de disociación para el Fe(III) del orden de 10^{-21} M (Adhikari y otros, J. Biol. Chem. 270: 25142-25149, 1995), impidiendo medidas precisas basadas en fluorescencia de la afinidad a concentraciones de proteína nanomolares. En la invención, se utilizó citrato de Fe(III) (logK \sim 10,25) (Martell y Smith, Critical Stability Constants, Plenum Press, New York, 1977) como ligando en un ensayo de competición.

Resultados

Familia de biosensores. Se seleccionó un juego de once bPBPs con especificidades de unión a ligando ampliamente variables para la función de biosensor diseñado por ingeniería (Tabla 2). Todos fueron a partir de E. coli excepto la BP de Fe(III), que es a partir de Haemophilus influenzae. Se han caracterizado las especificidades y afinidades de unión de estas proteínas para sus respectivos ligandos (referencias en la Tabla 2). Tres proteínas enlazan monosacáridos (BP arabinosa, glucosa y ribosa), una enlaza di- y trisacáridos de glucosa (BP maltosa), tres enlazan aminoácidos (BP glutamato/aspartato, histidina y glutamina), una enlaza di- y tripéptidos (BP dipéptido), dos enlazan oxianiones (BP fosfato y sulfato), y una enlaza un ión metálico (BP Fe(III)). La mayoría de estas bPBPs unen por lo menos dos o tres ligandos relacionados con elevada afinidad (micromolar o mejor). Por ejemplo, la BP fosfato enlaza fosfato y arseniato pero no otros oxianiones (Luecke & Quiocho, Nature 347:402-406, 1990), mientras la BP glucosa enlaza glucosa y galactosa pero no otros monosacáridos (Anraku, J. Biol. Chem. 243:3116-3122, 1968). La BP dipéptido es una excepción en el hecho de que enlaza una amplia variedad de di- y tripéptidos (Smith y otros, Microbiology 145:2891-2901, 1999). Generalmente, las constantes de disociación de ligando medidas en estas proteínas están en el margen de 0,1 a 1 mM. Una excepción es la BP Fe (III), donde la K_{d} para Fe(IH)(ac) se cree que es 10^{-21} M en ensayos de competición con quelatos de Fe(III) (Adhikari y otros, J. Biol. Chem. 270:25142-25149, 1995).

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TABLA 2 Referencias y ficheros de PDB^{a} para estructuras, genes y uniones a ligando

2

3

Abouhamad y otros, Molec. Microbiol. 5:1035-1047 (1991)

Adhikari y otros, J. Biol. Chem. 270:25142-25149 (1995)

Anraku, J. Biol. Chem. 243:3116-3122 (1968)

Barash & Halpern, Biochim. Biophys. Acta 386:168-180 (1975)

Bjorkman & Mowbray, J. Mol. Biol. 279:651-664 (1998)

Bruns y otros, Biochemistry 40:15631-15637 (2001)

Bruns y otros, Nat. Struct. Biol. 4:919-924 (1997)

Clark y otros, Biochemistry 21:2227-2233 (1982)

Dunten & Mowbray, Protein Sci. 4:2327-2334 (1995)

Duplay y otros, J. Biol. Chem. 259:10606-10613 (1984)

Groarke y otros, J. Biol. Chem. 258:12952-12956 (1983)

Guyer y otros, J. Bacteriol, 168:775-779 (1986)

He & Quiocho, Protein Sci. 2:1643-1647 (1993)

Hellinga & Evans, Eur. J. Biochem. 149:363-373 (1985)

Hsiao y otros, J. Mol. Biol. 262:225-242 (1996)

Jacobson & Quiocho, J. Mol. Biol. 204:783-787 (1988)

Joshi & Ames, GenBank Accession Number U47027 (1996)

Ledvina y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6786-6791 (1996)

Luecke & Quiocho, Nature 347:402-406 (1990)

Magota y otros, J. Bacteriol. 157:909-917 (1984)

Medveczky & Rosenberg, Biochim. Biophys. Acta 192:369-371 (1969)

Miller y otros, J. Biol. Chem. 258:13665-13672 (1983)

Mowbray & Cole, J. Mol. Biol. 225:155-175 (1992)

Nickitenko y otros, Biochemistry 34: 16585-16595 (1995)

Nohno y otros, Molec. Gen. Genet. 205:260-269 (1986)

Pflugrath & Quiocho, Nature 314:257-260 (1985)

Quiocho y otros, Structure 5:997-1015 (1997)

Quiocho & Vyas, Nature 310:381-386 (1984)

Sanders y otros, Infect. Immun. 62:4515-4525 (1994)

Scholle y otros, Molec. Gen. Genet. 208:247-253 (1987)

Scripture y otros, J. Mol. Biol. 197:37-46 (1987)

Schwartz y otros, Eur. J. Biochem. 71:167-170 (1976)

Sharff y otros, Biochemistry 31:10657-10663 (1992)

Smith y otros, Microbiology 145:2891-2901 (1999)

Spurlino y otros, J. Biol. Chem. 266:5202-5219 (1991)

Sun y otros, J. Mol. Biol. 278:219-229 (1998)

Vyas y otros, Biochemistry 33:4762-4768 (1994)

Vyas y otros, Science 242:1290-1295 (1988)

Weiner y otros, Arch. Biochem. Biophys. 142:715-717 (1971)

Willis & Furlong, J. Biol. Chem. 249:6926-6929 (1974)

Willis & Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580 (1975)

Yao y otros, Biochemistry 33:4769-4779 (1994)

Para nueve de las once proteínas seleccionadas para este estudio se han encontrado las estructuras cristalinas del estado cerrado de enlace a ligando (Tabla 2). En el caso de la BP sulfato, no se ha representado la estructura cristalina de la proteína E. coli, de manera que la BP sulfato Salmonella typhimurium se ha adoptado como modelo de la proteína E. coli. La BP sulfato de E. coli y S. typhimurium son 95% idénticas en la secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, tienen estructuras muy similares, en analogía a la BP histidina de estos dos organismos (Oh y otros, J. Biol. Chem. 269:4135-4143, 1994; Yao y otros, Biochemistry 33: 4769-4779, 1994). Las estructuras se han identificado para el estado abierto sin ligando para seis de las once proteínas tal y como se muestra en la Tabla 2.

Diseño basado en la estructura de acoplamiento conformacional. El acoplamiento entre la unión a ligando y un cambio en la señal fluorescente de un fluoróforo sensible medioambientalmente unido covalentemente puede establecerse si el entorno local del fluoróforo cambia como resultado de la formación del complejo y un cambio conformacional relacionado. Pueden distinguirse dos mecanismos para establecer las relaciones de unión estructural. La unión directa conlleva la formación de un contacto sin enlace entre el ligando de unión y el fluoróforo conjugado. La unión indirecta conlleva cambios en la estructura de proteína local en el entorno inmediato del fluoróforo unido y cuenta con los cambios conformacionales mediados por ligando tales como el movimiento de plegamiento de la región conectora observado en las bPBPs.

Las relaciones de unión directa se diseñan fácilmente mediante la sustitución de un residuo conocido para formar un contacto de ligando con una cisteína a la cual el fluoróforo está unida (sitio de unión "endostérica"). Las relaciones de unión indirecta pueden establecerse de dos maneras. El método más sencillo se basa en la inspección visual de la estructura compleja del ligando y la identificación de residuos que están situados en la vecindad del sitio de unión, pero no interactúan directamente con el ligando y están posiblemente involucrados en los cambios conformacionales. En el caso de las bPBPs, se trata de residuos situados en el perímetro de la fisura del interdominio que forma el sitio de unión a ligando. El entorno de dichos sitios "peristéricos" cambia significativamente después de la formación del estado cerrado. Estas son ejemplos de posiciones que están próximas a la cavidad de unión a ligando. El segundo objetivo identifica sitios en la estructura de proteína que están situados a cierta distancia del sitio de unión a ligando (es decir, alejado de la cavidad de unión a ligando) y conducen a un cambio conformacional local conjuntamente con la unión a ligando. Si se conocen las estructuras de los dos estados abierto y cerrado, entonces estos sitios "alostéricos" pueden identificarse utilizando un procedimiento computacional que analiza el cambio conformacional (Marvin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997). Alternativamente, se han identificado once sitios alostéricos en una bPBP, la modelación y fundamentos de homología estructural pueden utilizarse para identificar dichos sitios en otras bPBPs en las cuales sólo se ha caracterizado un estado (Marvin & Hellinga, J. Am. Chem. Soc. 120:7-11, 1998). La Tabla 3 resume los diseños de las tres clases de sitios en cada receptor utilizado en este estudio. En la Figura 1 se muestra la situación de estos sitios en las once bPBPs.

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TABLA 3 Sitios de conjugación de fluoróforos

4

Diseño basado en la secuencia de acoplamiento conformacional. El número de bPBPs de secuencias conocidas excede en gran medida el número para el cual se han encontrado estructuras o para el cual se han asignado funciones mediante caracterización genética o bioquímica. Para sacar provecho de este depósito de potenciales biosensores, deben identificarse las secuencias de codificación para bPBPs y establecerse sus especificidades de unión a ligando putativas. La identificación de bPBPs en genomas microbianos depende de la localización de homologías de secuencia de aminoácidos para grupos particulares de la familia de bPBP (Tam & Saier, Microbiol. Rev. 57: 320-346, 1993). A continuación, la unión a ligando puede determinarse por experimentación directa o deducirse por relaciones estructurales con las bPBPs de función conocida o bien estableciendo vinculaciones genéticas a otros genes de función conocida (Pellegrini y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4285-4288, 1999). Subsiguientemente, deben identificarse los sitios en los que el homólogo sufre un cambio conformacional y en los que pueden relacionarse funciones del informador. La selección de los sitios de unión de las funciones del informador depende de la homología a las bPBPs de estructura conocida.

Para demostrar dichos principios, se construyó un biosensor de glutamato a partir de sólo los datos de secuencia genómica. El genoma de E. coli K12 contiene el lugar ybeJ que codifica para una proteína identificada como una bPBP putativa basada en la homología de secuencia de aminoácidos con PBs de glutamina e histidina (identidad de secuencia de 26% y 23%; parecido de secuencia de 41% y 43%, respectivamente) (Blattner y otros, Science 277:1453-1474, 1997). La asignación de YBEJ como proteína de unión a aminoácido se fortaleció con la presencia de residuos conservados asociados a la unión de los grupos \alpha-amino y \alpha-carboxilato del ligando en todas las proteínas de unión a aminoácidos bPBP de estructura conocida identificadas en E. coli (Tabla 4). Tiene también interés la presencia de un residuo de arginina en YBEJ situado en una posición que en otras proteínas de unión de aminoácido interactúa directamente con la cadena lateral del aminoácido unido, sugiriendo que YBEJ enlaza un aminoácido que lleva una cadena lateral cargada negativamente. Finalmente, ybeJ se localiza adyacente a tres genes tandem (gltJ, gltK, gltL) que se cree que están implicados en el sistema de transporte glutamato/aspartato (Lum & Wallace, GenBank Accession Number U10981, 1995), sugiriendo que ybeJ codifica una BP glutamato/aspartato. Los sitios putativos alostéricos, endostéricos y peristéricos se identificaron a partir del alineamiento de secuencia basado en la estructura de YBEJ con BP glutamina y BP histidina (Fig. 2).

TABLA 4 Interacciones de ligando con residuos en proteínas polares de unión a aminoácidos

5

Mutagénesis y producción de proteína. Todos los genes para la bPBPs utilizados en este estudio se clonaron a partir de ADN genómico de E. Coli o H. influenzae utilizando la PCR. La secuencia peptídica guía que dirige la expresión en el periplasma se identificó por comparación del N-terminal de la proteína conocido o, en el caso de YBEJ, por homología a las secuencias guía conocidas (von Heijne, Nucl. Acids Res. 14:4683-4690, 1986). La proteína se produjo por sobre-expresión de la forma procesada en el citoplasma con una metionina de iniciación situada justo antes del N-terminal de la proteína procesada, bajo el control de un promotor fuertemente inducible en el pAED4 (Doering, "Functional and structural studies of a small f-actin binding domain" en Ph.D. tesis, Massachusetts Institute of Technology, 1992); plásmidos pET-21a (Studier y otros, Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990) (Novagen); o pKK223-3 (Blattner y otros, Science 277:1453-1474, 1997). Un marcador oligohistidina se fusionó al terminal carboxi del receptor clonado para permitir una fácil purificación mediante cromatografía de afinidad con ión metálico inmobilizado (Hochuli y otros, J. Chromatogr. A 411:177-184, 1987). En todos los casos, los receptores se expresaron bien (por lo menos 50 mg de proteína pura por litro de fermentación). Las masas moleculares estimadas por electroforésis de gel correspondieron a la masa predecida del marco de lectura de expresión.

Las mutaciones del punto cisteína se introdujeron por el método de solapamiento de PCR (Ho y otros, Gene 77:51-59, 1989). Generalmente, las proteínas mutantes se expresaron además de la proteína natural. Todas las sustituciones cisteína en la BP arabinosa se construyeron en el plano C64A para evitar interferencia de ésta cisteína endógena (Miller y otros, J. Biol. Chem. 254: 7521-7528, 1979). En el caso de BP Fe(III), todas las mutaciones se construyeron en el plano E57D. En la estructura cristalina de la BP Fe(III), este glutamato se acopla al hierro (Bruns y otros, Nat. Struct. Biol. 4:919-924, 1997). Se comprobó que la mutación E57D debilita la afinidad de la BP Fe(III) para el Fe(III) de aproximadamente 1x10^{-21} (Adhikari y otros, J. Biol. Chem. 270:25142-25149, 1995) hasta aproximadamente 3x10^{-8}, suponiendo una estabilidad constante del complejo citrato de Fe(III) 1:1 de logK=10,25 (Martell & Smith, Critical Stability Constants, Plenum Press, New York, 1977). Esto permitió la determinación sencilla de la afinidad del Fe(III) por valoración directa con citrato de Fe(III) a concentraciones nanomolares de BP Fe(III).

Transducción de señal por fluorescencia. Para informar de la unión a ligando mediante el conjunto de las once bPBPs, se fijaron grupos informadores fluorescentes a los tioles cisteína individuales diseñados en sitios que fueran predecibles al cambio conformacional dependiente de la unión. Se examinaron ocho fluoróforos reactivos al tiol que se escogieron en base a la sensibilidad de los espectros de emisión a los cambios en el entorno y abarcando un amplio margen de longitudes de onda de emisión y excitación (Fig. 3). En la Tabla 5 se muestran los resultados para los conjugados biosensor que son ilustrativos de la invención (11 receptores, 68 mutantes cisteína, 320 conjugados fluoróforos).

TABLA 5 Parámetros de unión y parámetros espectrales de bPBPs conjugados a fluoróforo

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Evaluación de la función fluorescente del biosensor. El espectro de emisión de fluorescencia de los conjugados fluoróforos a bPBP se registró en ausencia y presencia de la saturación de concentraciones de ligando. Los cambios espectrales se caracterizaron mediante cuatro parámetros: desviación de la longitud de onda (la diferencia entre las longitudes de onda de máxima emisión en la no unión y los estados saturados a ligando), la dirección del cambio de intensidad (aumento o disminución en las longitudes de onda de emisión máxima en los dos estados), cambio de intensidad estándar (\DeltaI_{std}), y cambio radiométrico estándar (\DeltaR). El \DeltaI_{std} se define como el cambio de intensidad normalizado en relación a la intensidad media, determinado en el punto medio de la longitud de onda entre las dos emisiones máximas:

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donde \lambda_{std} = (\lambda_{max, no unido} + \lambda_{max, saturado})/2 y I_{1}, I_{2} son las intensidades de fluorescencia en \lambda_{std} de cada espectro respectivamente (Fig 4A). El \DeltaR se define en términos de dos bandas de emisión, A_{1} ([\lambda_{1}, \lambda_{2}]) y A_{2} ([\lambda_{3}, \lambda_{4}]) (Fig 4B):

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donde ºA_{1}, \inftyA_{2} son las áreas en ausencia de ligando y \inftyA_{1}, \inftyA_{2} son las áreas en presencia de ligando saturado. Se utilizó un programa de ordenador para contar el \DeltaR de todos los posibles pares de bandas de longitud de onda en los dos espectros, para identificar la condición sensora óptima, definida como el valor máximo del \DeltaR. Los parámetros regulables de la fórmula y sus valores utilizados para las cantidades \DeltaRmax referidas aquí son: tamaño del paso (2 nm), anchura del paso (10 nm), límite de área de integración mínima (fracción total: 0,1), y límite del área de integración máxima (fracción total: 1).

Medidas de afinidad del analito. Se utilizaron 133 conjugados de fluoróforo a bPBP con \DeltaIstd > 0,1 para determinar la afinidad de unión a ligando por valoración fluorimétrica (Tabla 5). La longitud de onda de emisión monitorizada fue la de mayor diferencia en intensidad entre los estados de unión y libre de ligando. Para cada conjugado, se ajustaron las observaciones intensiométricas de fluorescencia a una isoterma de unión hiperbólica para un modelo de dos estados (Marvin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4366-4371, 1997):

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donde F es la fluorescencia a concentración de ligando [S], Kd es la constante de disociación y FF, FB son las intensidades de fluorescencia de los estados libre de ligando y saturado de ligando, respectivamente. En la Figura 5 se muestran las isotermas de unión para BP gluocosa y BP glutamato/aspartato. Para las observaciones ratiométricas, debe modificarse la ecuación 3 para determinar diferencialmente las aportaciones ponderadas de las dos bandas de emisión (Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed. Kluwer Academic Press, New York, p. 698, 1999):

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donde R es la relación A_{1}/A_{2}, R_{B} = \inftyA_{1}/\inftyA_{2}, R_{F} = ^{0}A_{1}/^{0}A_{2}, y ^{app}K_{d} es una constante de disociación aparente:

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El éxito de la estrategia de diseño del biosensor fluorescente se evaluó determinando la probabilidad de encontrar un conjugado fluorescente que responda eficazmente y evaluando como se ven afectadas las afinidades de unión a ligando por el conjugado fluoróforo.

Valoración de los cambios mediados por ligando en fluorescencia. Los resúmenes de desplazamiento de longitud de onda, \DeltaI_{std}, y \DeltaR_{max} para todos los conjugados (n=320) se presentan en forma de histogramas en la Figura 6A. La distribución de los desplazamientos de longitud de onda fue simétrico respecto el cero; es decir, no hubo tendencia en general hacia la desviación azul o roja. Del total del grupo variado de conjugados, 130 mostraron aumentos y 190 mostraron disminuciones en la intensidad de fluorescencia en la unión. Una parte de este sesgo es debido a la conclusión de que la adición de citrato de Fe(III) al total de conjugados BP Fe(III) provocó una disminución de la emisión de fluorescencia. Para examinar si esto se debió a la extinción de Fe(III) en solución, el citrato de Fe(III) se añadió a los conjugados de otras bPBPs y se monitorizó el efecto de la intensidad de emisión. Se encontró que el citrato de Fe(III) apagó la fluorescencia en todos los casos, pero sólo a concentraciones mucho superiores a aquellas inducidas por el efecto de la BP Fe(III). La disminución en la intensidad observada en todos los conjugados de BP Fe(III) es, por lo tanto, debida al proceso específico de unión y puede implicar la relajación del estado excitado vía un mecanismo redox mediado por iones metálicos (Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed. Kluwer Academic Press, New York, p. 698, 1999). La probabilidad de encontrar un conjugado que responda a una intensidad determinada desciende con el aumento de la magnitud de \DeltaI_{std} (Fig 6B). La respuesta ratiométrica se comporta de manera similar (Fig. 6C).

Los dos criterios de utilidad mayores para la percepción óptica son \DeltaI_{std} y \DeltaR_{max}. El grupo variado de conjugados bPBP se clasificó por categorías de sitio estérico, fluoróforo y supercóntigo de proteína, a continuación, para cada categoría, cuantificado según la fracción con \DeltaI_{std} > 0,25 y con \DeltaR_{max} > 1,25. Los resultados (Tablas 6 a 8) dan una indicación del índice de éxito en conjunto para encontrar conjugados potencialmente útiles para el biosensor fluorescente. Para el grupo variado de 320 conjugados, aproximadamente 24% reúnen el criterio para \DeltaI_{std} y aproximadamente 28% el criterio para \DeltaR_{max}.

TABLA 6 Parámetros de señalización mediante proteína de unión

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TABLA 7 Parámetros de señalización por sitio estérico

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TABLA 8 Parámetros de señalización por fluoróforo

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Parece ser una correlación entre el índice de éxito de señalización y la familia de secuencia relacionada o grupo (Tam & Saier, Microbiol. Rev. 57:320-346, 1993) al cual pertenece un supercóntigo. Los supercóntigos que tienen los índices de éxito más elevados para \DeltaI_{std} y \DeltaR_{max} son BP arabinosa, BP glucosa, BP ribosa y BP fosfato (Tabla 6). Los tres primeros pertenecen al grupo 2, que incluye proteínas de unión para hexosas y pentosas, mientras la BP fosfato, junto con BP sulfato, pertenece al grupo 6, que incluye proteínas de unión para polianiones inorgánicos. Los supercóntigos que tienen el índice de éxito más bajo fueron BP dipéptido (grupo 5, unión a níquel y péptido) y el grupo 3 (unión de aminoácido polar) proteínas BP glutamina, BP histidina y BP Glu/Asp.

Entre las tres clases de sitios de unión, los sitios endostéricos y alostéricos tienen una casualidad mayor de encontrar los criterios de umbral que los sitios peristéricos (Tabla 7). Los índices de éxito en términos de \DeltaI_{std} variaron según la sensibilidad ambiental del fluoróforo, siendo superior con los colorantes sirilo y naftilo JPW4039, JPW4042 y JPW4045. De forma similar, los índices de éxito superior para \DeltaR_{max} se asociaron con JPW4045 y acrilodan
(Tabla 8).

Evaluación de cambios en las afinidades de unión a ligando. La diversidad de constantes de disociación, Kd, extraídas de las curvas de unión para cada ligando se muestran en la Tabla 9. Dado que existe una interrelación termodinámica entre la unión a ligando y la interacción del fluoróforo fijado con la proteína, se espera que el fluoróforo cambie la constante intrínseca de disociación del ligando. El cambio en la afinidad dado por el fluoróforo se espera que sea dependiente de su situación en la proteína. Los diversos conjugados muestran un amplio margen de afinidades (Tabla 9). El cambio en la afinidad, definido como log(^{mut}K_{d}/^{wt}K_{d}), se examinó como una función de la clasificación del sitio de fijación (endostérico, alostérico o peristérico) entre los 108 conjugados, para los cuales se midieron las constantes de disociación y para los cuales es conocida la constante de disociación de la proteína no conjugada (Tabla 2). Los resultados revelan que las tres clases de sitio tienen efectos diferentes en la afinidad (Fig. 7). La fijación de fluoróforo en los sitios endostéricos tiende a alterar la afinidad más grande y uniformemente a valores superiores de K_{d} que el tipo silvestre. La fijación alostérica y peristérica conlleva valores K_{d} que son o bien superiores o bien inferiores a las del tipo silvestre, con sitios peristéricos que muestran la variación más grande en resultados. De forma interesante, de aquellos conjugados con afinidad superior que la del tipo silvestre (K_{d} inferior), una proporción mayor proviene de la conjugación en los sitios alostéricos. Esto corrobora estudios detallados en BP maltosa cuya afinidad se aumentó por manipulación del volumen de residuos en los sitios alostéricos (Marvin & Hellinga, Nat. Struct. Biol. 8:795-798, 2001). Las diferencias en los resultados pueden racionalizarse en términos de la probabilidad que un conjugado particular interferirá estéricamente directamente con la unión a ligando (sitios endostéricos y algunos sitios peristéricos) o por influencia del equilibrio intrínseco entre los estados abierto y cerrado (sitios alostéricos, sitios peristéricos).

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TABLA 9 Margen de afinidades a ligando en conjugados fluorescentes bPBP

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El efecto en las constantes de disociación se determina no sólo por el sitio de fijación sino también por la naturaleza del fluoróforo fijado, tal y como se ilustra para la BP arabinosa. Las constantes de disociación para arabinosa de los cinco mutantes de sustitución de cisteína (todos con la mutación C64A), medidos por fluorescencia triptofano, son 5,0 \muM (F23C), 3,2 \muM (L253C), 3,4 \muM (D257C), 7,6 \muM (L298C) y 1,6 \muM (K301C). Así, las sustituciones cisteína alteraron ligeramente la afinidad para la arabinosa (K_{d} de la mutación C64A \sim 2,2 \muM). La dependencia más grande en el fluoróforo fijado se encontró para la mutación L253C, para cuyos valores K_{d} abarcaban desde 0,7 \muM (acrilodan) hasta 775 \muM (NBD). De forma similar, la mutación K394C de la BP dipéptido tiene afinidades para el dipéptido Gly-Leu que varían desde 6 nM (NBD) hasta 93 \muM (fluoresceína). La mayoría de las mutaciones no mostraron dicho amplio margen de afinidad de ligando dependiente del fluoróforo. Por ejemplo, cinco fluoróforos diferentes conjugados a BP ribosa E192C tienen afinidades para ribosa que varían desde 2,6 \muM (NBD y JPW4039) hasta 15 \muM
(JPW4045).

Construcción de un biosensor nuevo utilizando información de secuencia. Para demostrar que los diseños no están limitados a aquellas bPBPs con estructura conocida, se introdujeron mutaciones cisteína en un parálogo previsto de codificar para una BP glutamato/aspartato, utilizando BPs histidina y glutamina como estructuras para indicar las ubicaciones para los sitios probablemente peristéricos y alostéricos. Todos los diez sitios que se ensayaron proporcionaron conjugados que mostraron cambios dependientes del glutamato y aspartato en la fluorescencia. Varios sitios proporcionaron sensores ratiométricos o intensiométricos buenos o excelentes. La Tabla 10 demuestra que la respuesta es específica para tanto el aspartato como el glutamato, con afinidad de 50- a 500-veces más débil para glutamina y asparagina. Otros aminoácidos y azúcares no producieron cambios mediados por el ligando en la fluorescencia.

TABLA 10 Especificidad de unión y afinidad en mutaciones de BP glutamato/aspartato

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La bioinformática hace posible descubrir nuevas aplicaciones biomédicas sin experimentación directa. En el caso de biosensores, los genomas bacterianos individuales pueden codificar montones de bPBPs que unen moléculas específicas para iniciar el transporte o transducción de señal (Blattner y otros, Science 277:1453-1474, 1997; Quentin y otros, J. Mol. Biol. 287: 467-484, 1999). Pocos de estos se han caracterizado, dejando un inmenso número sin explorar como supercóntigos para biosensores potenciales. Se ha demostrado la viabilidad de aplicación de información genómica, combinada con información estructural a partir de proteínas homólogas para construir un biosensor de nueva especificidad.

Previamente, se ha purificado la BP glutamato/aspartato a partir de la E. coli (Barash & Halpern, Biochim. Biophys. Acta 386:168-180, 1975; Willis & Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975) y se ha caracterizado. Varias partes de evidencias sugieren que YBEJ corresponde a esta proteína. Primero, la BP glutamato/aspartato se aisló de los extractos periplásmicos, de acuerdo con ybeJ que codifica para una proteína con una secuencia de señal de localización periplásmica putativa. Segundo, la masa molecular determinada previamente de BP glutamato/aspartato de 32 kDa (Barash & Halpern, Biochim. Biophys. Acta 386:168-180, 1975) o 31 kDa (Willis & Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975) corresponde a la masa de 32,5 kDa predecida para el producto ybeJ procesado y la masa de 30 kDa encontrada por electroforesis de gel en el presente estudio. Tercero, las composiciones de aminoácidos determinadas previamente (Barash & Halpern, Biochim. Biophys. Acta 386:168-180, 1975; Willis & Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975) son similares a las predecidas a partir de la secuencia genética, con algunas desviaciones debidas probablemente a la inexactitud inherente en el análisis de hidrolizados ácidos de proteína. Finalmente, los valores de K_{d} dados para el glutamato (0,8 mM), aspartato (1,2 mM), así como la afinidad relativamente inferior para la glutamina y asparagina (Willis & Furlong, J. Biol. Chem. 250:2574-2580, 1975) son similares a aquellas determinadas aquí y comparables al conjugado fluoresceína-Q123C (Tabla 10). Por lo tanto, ybeJ probablemente codifica para la BP glutamato/aspartato previamente caracterizada.

Diseños de sensores eficaces. La utilidad de un conjugado se determina por el cambio absoluto en la intensidad de señal, el cambio ratiométrico y el margen de concentración en funcionamiento respecto el cual el sensor puede responder con precisión. De los dos parámetros observables, el cambio ratiométrico es preferible para intensidades absolutas ya que es independiente de la concentración a investigar.

Aunque los conjugados útiles pueden definirse porque tienen \DeltaI_{std} > 0,25 y \DeltaR_{max} > 1,25, los sensores "excelentes" pueden definirse porque tienen \DeltaI_{std} > 0,9 y \DeltaR_{max} > 2,5. Las magnitudes de los cambios en los sensores excelentes son probablemente suficientemente grandes para permitir medidas consistentes en aplicaciones "reales" en fluidos complejos tales como la sangre. Basado en estos criterios sólo hay trece sensores de intensidad absoluta excelente (4% del total), pero 36 sensores ratiométricos excelentes (11% del total); existen siete conjugados que son tanto de intensidad absoluta excelente como sensores ratiométricos excelentes (Tabla 5). Con la excepción de la BP dipéptido, la BP Fe(III) y la BP histidina, todas las proteínas tienen por lo menos un conjugado basado en la intensidad y ratiometría excelente. La BP glucosa tiene el mayor número de conjugados excelentes. Estos conjugados todos implican fluoróforos conocidos por ser especialmente sensibles medioambientalmente (acrilodan, NBD, pireno y los colorantes de estirilo). La repercusión de sensores excelentes es uniformemente distribuida entre sitios alostéricos y peristéricos. Todos los sitios endostéricos dan lugar a sensores excelentes.

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La constante de disociación de un conjugado determina el margen de concentración en funcionamiento respecto el cual el sensor puede responder acertadamente. El margen de funcionamiento garantizado para dar menos de un 5% de error abarca concentraciones que caen dentro de cinco veces el valor de K_{d} (Marvin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997). Si el margen requerido para una determinación fiable es más amplio que el abarcado, entonces puede construirse un biosensor compuesto utilizando receptores de 10 afinidades diversas como se ha demostrado para la BP maltosa (Marvin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997). Hay tres factores que afectan la constante de disociación: la naturaleza del conjugado, la selección de las bandas de emisión para un sensor ratiométrico (ec. 2) y las mutaciones adicionales. Para aplicaciones particulares, estos tres factores pueden manipularse para construir un sensor apropiado.

Sensor de glucosa. Entre los analitos aplicables a la medicina clínica, la glucosa es una de las más importantes, especialmente en consideración al diagnóstico y tratamiento de la diabetes. El margen normal de concentración de glucosa en un suero humano adulto es de 4 a 6 mM (Burtis & Ashwood, Teitz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pennsylvania, 1994). El conjugado de acrilodan del sitio endostérico W183C en BP glucosa tiene una respuesta ratiométrica excelente (\DeltaR_{max} = 5,57) y una constante de disociación de 5,98 mM y es, por lo tanto, un buen candidato para detectar fluctuaciones de glucosa en el intervalo fisiológico por ratiometría (Figura 8A). Además, ajustando los parámetros ratiométricos, la ventana de observación es fácilmente ampliada desde 5,0 hasta 17,4 mM, permitiendo ser observados todos los intervalos relevantes clínicamente con un sensor
(Figura 8A).

Otros sensores para química clínica. Los aminoácidos son también normalmente probados en ensayos clínicos como indicadores de una situación de enfermedad. La histidina es un indicador de la deficiencia de histidasa (Taylor y otros, Molec. Biol. Med. 8:101-116, 1991). El conjugado de BP histidina de mejor señalización, V163C-JPW4042, tiene una K_{d} de 0,25 \muM, debajo del margen normal en suero de aproximadamente 48 a 125 \muM. Sin embargo, con la dilución de la muestra este conjugado podría funcionar de forma eficaz. De forma alternativa, la K_{d} puede ajustarse por mutagénesis como se hizo para la BP maltosa (Marvin & Hellinga, Nat. Struct. Biol. 8:795-798, 2001) y la BP Fe(III) con la mutación E57D. El glutamato aminoácido neuro excitatorio tiene concentraciones de suero normal de 20 a 220 \muM (Burtis & Ashwood, Teitz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pennsylvania, 1994). El biosensor más adecuado es la BP glutamato/aspartato F126C-acrilodan, que tiene una K_{d} \sim 80 \muM y \DeltaR_{max} = 2,70. A menudo, la glutamina se mide en el fluido cerebroespinal (Smith & Forman, Clin. Lab. Sci. 7:32-38, 1994) en el cual el margen normal está entre 120 y 360 \muM, considerablemente superior a la K_{d} (\sim 1,4 \muM) del conjugado BP glutamina de mejor señalización, Y163C-acrilodan. Este biosensor puede utilizarse para tal fin por mutagénesis para ajustar la K_{d}, o por dilución de la muestra.

Las concentraciones de fosfato en suero y orina son clínicamente relevantes (Burkhardt y otros, Am. J. Clin. Pathol. 72: 326-329, 1979). Varias BP fosfato conjugan bien la señal, siendo la mejor S39C-JPW4045, y sus valores de K_{d} son todos inferiores a 2 \muM. Generalmente, el fosfato inorgánico en suero es de 1 a 3 mM (Burtis & Ashwood, Teitz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd Ed. W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pennsylvania 1994), requiriendo el ajuste de la K_{d} o la dilución de la muestra para medidas exactas con estos sensores.

La concentración de maltosa es relevante para una deficiencia en maltasa ácida, con la concentración en plasma normal de aproximadamente 2 \muM (Rozaklis y otros, Clin. Chem. 48:131-139, 2002). Los mejores sensores de maltosa en el presente trabajo son conjugados BP maltosa S233C-JPW4042 (\DeltaR_{max} = 4,0) y S233C-JPW4045 (\DeltaR_{max} = 3,9), ambos con afinidades similares (K_{d} \sim 400 \muM). Los conjugados fluorescentes de mutantes BP maltosa que tienen afinidades en el intervalo 2 \muM se han descrito en Marvin y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4366-4371, 1997).

Aplicaciones industriales y medioambientales. Los conjugados bPBP pueden funcionar como sensores para analitos industriales y medioambientales. La arabinosa es relevante para mejorar la eficacia de producción de etanol a partir de maíz (Deanda y otros, Appl. Environ. Microbiol. 62:4465-4470, 1996). De los conjugados BP arabinosa, los mejores señalizadores son K301C-NBD (K_{d} \sim 31 \muM, \DeltaR_{max} = 3,2) y L253C-fluoresceína, (K_{d} \sim 48 \muM, \DeltaR_{max} = 2,7). La concentración de ribosa, ensayada en alimentos y bebidas (AOAC, Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th Ed. AOAC International, Arlington, Virginia, 1995), puede medirse por conjugados BP ribosa T135C-acrilodan (K_{d} \sim 0,4 mM, \DeltaR_{max} = 6,3) y A234C-JPW4045 (K_{d} \sim 3,8 \muM, \DeltaR_{max} = 4,1). La sensibilidad ratiométrica de la ribosa utilizando un derivado de BP ribosa individual se muestra por el conjugado T135C-acrilodan (Fig. 8B). Variando las bandas de longitud de onda de emisión en el margen de fluorescencia (ecuaciones 4, 5) las ^{app}K_{d} para ribosa pueden ajustarse sobre un intervalo de 41 a 146 \muM (Fig. 8B). Las concentraciones de sulfato en agua para beber son de interés (U.S. EPA, Health Effects From Exposure to High Levels of Sulfate in Drinking Water, pp. 1-25, Office of Drinking Water and Ground Water, 1999), y pueden analizarse por el conjugado BP sulfato R134C-acrilodan (K_{d} - 4 \muM, \DeltaR_{max} = 2,3). Las concentraciones elevadas de fosfato son medioambientalmente perjudiciales y podrían monitorizarse utilizando conjugados BP fosfato, como se ha apuntado más arriba para aplicaciones clínicas. La concentración de hierro limita la productividad principal de ciertas regiones de los océanos (Martin, Iron as a Limiting Factor in Primary Productivity and Biogeochemical Cycles in the Sea. Falkowski & Woodhead, eds., pp. 123-137, Plenum Press, New York). El ión férrico disponible puede determinarse utilizando un biosensor derivado de BP Fe(III), tal como un conjugado E203C-acrilodan (K_{d} \sim 138 \muM, \Delta_{std} 0,4).

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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Claims (19)

1. Biosensor para detectar glucosa bajo condiciones fisiológicas, que comprende una proteína de unión periplasmática bactericida, donde la proteína periplasmática bactericida es una proteína de unión a glucosa (GBP) y por lo menos un grupo informador fijado en una posición de dicha GBP correspondiente a la posición 183 de GBP E. coli, donde la unión de glucosa en una cavidad de unión a glucosa de dicho biosensor provoca un cambio en la señalización por dicho grupo informador.

2. Biosensor según la reivindicación 1, donde dicha GBP es GBP mutante W183C.

3. Biosensor según la reivindicación 1 ó 2, donde dicha GBP es GBP E. coli.

4. Biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha GBP está además comprendida de una o más mutaciones en la(s) posición aminoácido donde dicho grupo informador no está unido covalentemente.

5. Biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho grupo informador está fijado covalentemente.

6. Biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho grupo informador no está fijado covalentemente.

7. Biosensor según las reivindicaciones 5 ó 6, donde dicho grupo informador es un cofactor redox.

8. Biosensor según la reivindicación 5, donde dicho grupo informador es un fluoróforo.

9. Biosensor según la reivindicación 8, donde dicho grupo informador es acrilodan.

10. Biosensor según la reivindicación 8, donde dicho cambio de intensidad estándar del biosensor (\Deltal_{std}) en la unión de glucosa es superior a 0,25.

11. Biosensor según la reivindicación 10, donde dicha \Deltal_{std} es superior a 0,9.

12. Biosensor según la reivindicación 8, donde dicho valor máximo del biosensor del cambio ratiométrico estándar (\DeltaR_{max}) en la unión de glucosa es mayor de 1,25.

13. Biosensor según la reivindicación 12, donde dicha \DeltaR_{max} es superior a 2,5.

14. Utilización de un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para analizar glucosa.

15. Procedimiento para detectar la presencia o ausencia de glucosa en una muestra, que comprende: poner en contacto un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 con dicha muestra bajo condiciones tales que dicho biosensor es capaz de unir la glucosa presente en dicha muestra; comparar la señal transducida por dicho grupo informador cuando dicho biosensor está en contacto con dicha muestra con la señal transducida por dicho grupo informador cuando dicho biosensor está en contacto con por lo menos una muestra control que contiene un cantidad conocida de glucosa; y determinar la presencia o ausencia de glucosa en dicha muestra a partir de dicha comparación.

16. Procedimiento de cuantificación de la cantidad o concentración de glucosa en una muestra, que comprende: poner en contacto un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 con dicha muestra bajo condiciones tales que dicho biosensor es capaz de unir la glucosa presente en dicha muestra; comparar la señal transducida por dicho grupo informador cuando dicho biosensor está en contacto con dicha muestra en comparación con las señales transducidas por una serie de muestras control que contienen cantidades conocidas de glucosa; y calcular la cantidad de glucosa en dicha muestra a partir de dicha comparación.

17. Procedimiento de análisis de glucosa en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto un biosensor según las reivindicaciones 1 a 13 con dicha muestra bajo condiciones tales que dicho biosensor es capaz de unir la glucosa presente en dicha muestra;

(b) medir el cambio ratiométrico (\DeltaR) para la señal transducida por dicho grupo informador; y

(c) por lo menos detectar o cuantificar la glucosa presente en dicha muestra.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, donde dicha muestra se compara con un fluido fisiológico.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, donde dicho fluido fisiológico se selecciona entre el grupo que consiste en sangre, fluido intersticial, lavado, sudoración, plasma, saliva, suero y orina.