KR20160065092A - 신규 흡착 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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알로이스 융바우어
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베링거 인겔하임 에르체파우 게엠베하 운트 코 카게
산도즈 아게
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Abstract

본 발명은 유체로부터 생체분자를 회수하기 위한 신규 흡착 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 분쇄된 입자 형태로 양과 음으로 하전된 미세입자를 포함한다. 상기 흡착제는 특히 세포배양액으로부터 생체분자를 정제하는 데 유용하다.

Description

신규 흡착 조성물 및 이의 용도{NOVEL ADSORBENT COMPOSITION AND USE THEREOF}
본 발명은 일반적으로 유체, 특히 생물학적 유체로부터 생체분자의 분리에 관한 것이다. 본 발명은 생물학적 유체로부터 생체분자의 회수에 적용되는 조성물, 용도 및 방법에 관한 것이다. 게다가, 다른 측면에서, 본 발명은 세포 배양 및 세포 배양액으로부터 생체분자의 정제에 관한 것이다.
혼합물로부터의 생체분자의 분리는 통상적으로 크로마토그래피 기술, 여과 또는 침전을 이용하여 왔다. 생명공학 제품 및 공정의 지속적인 개발로, 효율적이고 경제적인 분리 및 정제 방법, 그리고 장치가 필요하게 되었다. 발효공정에 의한 생체분자의 제조는 일반적으로 "업스트림(upstream)" 및 "다운스트림(downstream)" 공정으로 언급되는, 두가지 일반적 범주로 나뉘어질 수 있다. 업스트림 공정은 원하는 생약 제품을 생산하기 위한 시스템의 생화학적 디자인을 다루고 다운스트림 공정은 최종 생성물을 수득하고 정제하는 것을 중점으로 한다.
다운스트림 공정은 일반적으로 (1) 예를 들면, 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드(plasmid)와 같은 발효생성물은 숙주세포에서 분비되어 이미 배양상청액에 존재할 수 있기 때문에, 필요한 경우, 세포 파쇄에 의한 발효세포 내용물의 방출; (2) 일반적으로 원하는 생성물과 다른 생물학적 물질을 포함하는 모액으로부터 세포 잔해물을 분리함으로써, 내용물을 정제하는 원심분리; (3) 다음 단계를 위해 모액을 농축하는 여과; 및 (4) 일반적으로 예를 들면, 이온교환, 소수성 결합 및 역상과 같은 다양한 분리방법을 사용하는 액체 크로마토그래피 기술에 의한 최종 생성물의 정제를 포함한다.
일반적으로 단백질 흡착에 사용되는 크로마토그래피 수지는 매크로다공성, 친수성 물질을 포함한다. 통상적인 크로마토그래피 기술에서 입자와 기공 크기가 결정된 통상적인 과립상 크로마토그래피 물질이 사용된다. 공극률은 높은 용량을 위해 충분한 표면적을 제공하는데 필수적인 반면에 친수성 표면은 가역적 흡착을 가능하게 한다. 크로마토그래피 수지에 사용되는 기재는 보통 셀룰로스(cellulose), 덱스트란(dextran) 또는 아가로스(agarose)와 같은 교차 결합된 천연 고분자뿐만 아니라, 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate) 및 폴리스티렌 디비닐벤젠 유도체(polystyrene divinylbenzene derivatives)로 구성된 합성 고분자이다. 후자는 종종 친수성 고분자로 코팅된다. 이온 교환 수지(ion exchange resin), 소수성 상호 작용 수지(hydrophobic interaction resin) 또는 친화 수지(affinity resins)는 화학적인 유도화 또는 표면 그래프팅 기술(surface grafting technologies)에 의해 기능성 리간드와 결합된다.
산업에서, 업스트림 제조 용량은, 많은 제조업자들이 동시에 약 10000L 바이오리엑터(bioreactors)를 가동하면서, 급격히 증가하고 있다. 그러나, 표준 크로마토그래피 방법은 빠른 스케일업이 어렵다.
크로마토그래피 정제 공정(또한 수집(capture) 과정이라고 불림)의 첫 단계에서, 처리되어야 하는 샘플 부피가 크기 때문에 일반적으로 많은 양의 충전 부피량(bed volume)이 사용된다. 그러나 큰 컬럼(columns)은 히스테리시스(hysteresis), 가장자리 효과(edge-effects) 및 수지 압축(resin compression)과 같은 크기 관련 충전(packing) 문제가 있다. 그 결과 예상하지 못한 액체 유동 분포(fluid distribution) 와 압력강하(pressure drops)가 발생한다.
산업 및 예비 적용분야에서 충전된 크로마토그래피 컬럼의 성능은 최대 허용 압력강하에 의해 제한된다. 압력강하 제한때문에, 40㎛ 이상의 큰 직경을 가지는 수지 비드들이 사용된다.
생체분자를 수집하는 것은 기공(pore) 확산에 의존하지만 큰 생체분자는 기공으로 쉽게 확산되지 않는다. 그리고 확산 경로는 큰 수지 입자의 사용으로 증가된다. 이것은 대량 전달 저항의 원인이 되고 컬럼 효율을 더 낮춘다. 그러므로 큰 생체분자는 수지 비드의 표면에만 결합할 수 있다. 그러므로 수지 입자 안쪽의 결합 리간드를 찾기 위해서는 체류 시간이 더 길어질 것이 요구되는데, 이는. 느린 흡착 공정을 야기한다. 높은 처리량(high throughput)은 큰 부피의 샘플량을 처리하는데 중요하므로, 특히 큰 단백질의 흡착을 위해서는 큰 입자의 사용이 전체 생산성에 큰 영향을 미친다.
정리하면, 현재 크로마토그래피 기술은 산업적 요구를 충족하기 위해 쉽게 스케일업 할 수 없다. 상기 방법은 산업적 규모로 수행되기에 시간 낭비와 고비용의 결점이 있다.
따라서, 컬럼 크로마토그래피에 대한 대안이 필요하다. 막 여과(membrane filtration), 수용성 이단계 추출(aqueous two-phase extraction), 침전(precipitation), 결정화(crystallization), 일체형(monoliths) 및 막 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피를 대체할 방법이 제안되었다(Przybycien et al "Alternative bioseparation operations: life beyond packed-bed chromatography" Curr Opin Biotechnol. 2004; 15(5):469-78).
Paril et al. J. Biotechnol . 2009; 141: 47-57는 표면이 하전된 미세입자에 pDNA 를 흡착시키는 수단 및 방법을 제공한다. 특히, Paril 등은, pDNA의 흡착에 Rohm과 Haas에 의해 제공된 폴리스티렌 기반의 미세입자를 사용한다. 그러나, Paril 등은 pDNA가 흡착될 수 있는 이들 미세입자를 어떻게 제조하는지에 대해서는 개시하고 있지 않다. 일반적으로, 미세입자는 마이크론 크기를 가지는 입자를 말한다.
대안, 바람직하게는 표준 크로마토그래피 기술의 대안으로 유체로부터 생체분자를 수득하는 향상된 방법이 여전히 필요하다. 본 발명의 기술적 문제는 하나 또는 하나 이상의 위에서 언급된 필요에 따른 것이다.
***
본 발명에서 사용된 용어 단수형태 "한(a)", "한(an)" 및 "그(the)"는 명백히 이와 달리 명시하지 않았다면 복수의 형태를 포함한다. 예를 들어, "시약(reagent)"에 대한 것은 그러한 다른 시약 하나 또는 이상을 포함하고 "방법(method)"에 대한 것은 본 발명에 기재된 방법을 변경하거나 치환할 수 있는 본 발명의 기술분야에서 통상의 기술자에게 널리 알려진 등가의 단계 및 방법을 포함한다.
달리 명시하지 않으면, 일련의 요소 앞에 기재된 "적어도(at least)"라는 용어는 일련의 모든 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 기술자가 본 발명에 기재된 특정 실시예의 많은 등가물을 통상의 실험만으로 이해하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 본다.
본 명세서에서 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "모든 또는 상기 용어에 의해 연결된 요소들의 다른 조합"을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 주어진 값 또는 범위의 20% 내를 의미하고, 바람직하게는 10%내, 그리고 더욱 바람직하게는 5%내를 의미한다. 그 지정된 숫자도 포함한다. 예를 들면 약 20은 20을 포함한다.
용어 "이하" 또는 "이상" 은 구체적인 숫자를 포함한다. 예를 들어, 20 이하(less than)는 20보다 적거나 같음을 의미한다. 비슷하게, 이상은 많거나 같음을 의미한다.
이하 본 발명의 명세서와 청구범위에 달리 명시가 없다면, 용어 "포함하다(comprise, 또는 comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 다른 용어는 정해진 정수(integers) 또는 단계 또는 정수 그룹 또는 단계들뿐 아니라, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 그룹 또는 단계들도 포함함을 내재하고 있는 것으로 이해되어야 것이다. 본 발명에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"으로 치환되어 사용될 수 있거나 때때로 용어 "가진(having)"으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "로 구성된(consisting of)"이 사용되는 경우, 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본 발명에서 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"이 사용되는 경우, 실질적으로 청구항의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본 발명에서 각각의 경우에, 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "구성되는(consisting of)" 중 어느 하나는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
본 발명은 특히 본 발명에 기술된 방법론, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등에 제한되지 않고 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위한 것이며, 청구항에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 명세서의 전반에 걸쳐 인용된 모든 출판물 및 특허문헌(모든 특허 문헌, 특허 출원, 과학 출판물, 제조업체의 사양, 설명서 등)은 본 명세서에 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 기재도, 선행 발명에 의해 본 발명이 그러한 공개보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석될 수 없다. 참조로 인용된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 한도 내에서, 본 명세서가 이러한 자료를 대체할 것이다.
요약
본 발명은 예를 들면, 액체, 배양 상청액과 같은 유체(fluid), 세포 균질액 및/또는 다른 생물학적 유체로부터 분자, 바람직하게는 생체분자를 직접 포획할 수 있는 신규 공정 및 흡착 물질을 제공한다. 본 발명은 통상의 크로마토그래피 기술과 비교하여 쉽고 빠르고 저렴하다. 상기 기술한 것과 같이, 현재 생체분자의 포획은 다공성 입자를 가진 고정된 충전층에 흡착시키거나 다공성 입자를 가진 배치 흡착(batch adsorption)에 의해서 이루어졌다. 그러나, 이러한 공정은 단점이 있는데 이는 보통 큰 직경을 가지는 입자 내 기공의 긴 확산 통로 때문에 흡착이 느려져, 큰 충전 부피량의 컬럼이 요구되기 때문이다. 또한, 이러한 공정들은 대량 전달이 제한적이다.
본 발명은, 생체분자를 포획하는 신규 흡착물질을 제공한다. 상기 흡착물질은 고체이고 하전된 미세입자를 포함한다. 상기 미세입자는 분말형으로 존재하고 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지를 분쇄하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 고체이고 소수성인 미세입자를 포함하는, 생체분자 포획용 하는 신규 흡착물질을 제공한다. 미세입자는 분말형으로 존재하고 Amberlite XAD4, Amberlite XAD7HP, Amberlite XAD761와 같은 소수성 흡착물질을 분쇄하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 거친 표면을 가진 고운(fine) 입자는, 충전층(packed beds)에서 크로모토그래피 배지로 사용되지 않는데, 그 이유는 상기 고운 입자가 프릿(frits)과 필터를 막아서 처리를 어렵게 하기 때문이다. 또한, 상기 고운 입자는 배치 공정 어플리케이션의 장착 시간(settling time)을 늘리고 수지 마찰을 야기한다. 그러나, 통상의 일반적인 지식에 기초한 실망스러운 가정에도 불구하고, 본 발명자들은 놀랍게도 분자, 바람직하게는 생체분자, 특히 폴리펩타이드(polypeptide)를 빠르고 매우 효율적으로 배치 흡착에 적용하여 흡착할 수 있는 입자를 발명하였다. 또한, 본 발명이 빠른 흡착을 나타냄을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 상기 입자, 본 발명의 하전된 소수성 입자 각각은 분자, 바람직하게는 생체분자에 결합하자마자 응집됨을 확인하였다. 응집물(flocs)의 형성은 원하지 않는 세포 부유물를 포함하는 생물학적 유체로부터 생체분자를 쉽게 분리할 수 있게 해 준다. 그러므로, 본 발명의 흡착제는 확장 가능한 방법으로 분자, 바람직하게는 생체분자를 흡착하는데 이용될 수 있다. 또한, 놀랍게도 회수 과정에 하전된 입자를 사용하는 것이 흡착 용량을 높일 수 있다는 것을 발견하였다. 추가적으로, 유체로부터 형성된 응집물의 분리가 쉬울 뿐 아니라 그것들로부터 형성된 응집물을 처리하는 것도 용이하다는 것을 또한 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 미세입자가 세포 구조를 파쇄한다는 것을 발견하였다. 그러므로 한 측면에서 본 발명은 세포 파쇄 단계 및 업스트림 공정에서 생체분자의 회수단계를 결합한 간단한 용도 및 방법을 제공한다.
용어 "세포 파쇄" 또는 "세포의 파쇄"는 교환적으로 사용되고 일반적으로 세포 보전을 방해하는 방법 또는 공정을 지칭한다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, 세포 파쇄는 생체분자가 세포로부터 방출될 정도로 세포를 투과 용이하게 만드는 방법 또는 공정으로만 제한되지 않는다. 세포 파쇄는 세포 사멸을 포함할 수도 있고 그러하지 않을 수도 있다. 바람직하게는, 세포 파쇄는 세포 구조의 완전한 조각화를 포함하지 않는다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 세포 조각화의 감소가 세포 부유물의 수준을 감소시킬 것으로 예상된다. 본 발명의 일부 실시예에서, 세포는 본 발명에 설명된 방법에 의해서 파쇄되거나 생체분자를 방출하지만, 가능한 그대로 남아있다. 방출된 생체분자는 세포 파쇄에 사용된 미세입자에 흡착될 수도 있고 아닐 수도 있다. 방출된 생체분자는 그 다음 본 발명에 설명된 방법 또는 기존에 알려진 다른 방법을 사용하여 생물학적 유체로부터 회수될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 간단한 두 단계로 세포 파쇄, 생체분자 방출 및 그 후 생체분자 회수를 위한 신규한 방법을 제공한다. 본 발명의 미세입자는 세포를 개방하여 생체분자를 방출시켜 생체분자의 산도에 관계없이 생체분자가 세포 현탁액에서 회수될 수 있도록 할 수 있다(즉, 생체분자는 산성, 염기성 또는 중성일 수 있다).
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 본 발명의 조성물은 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 조성물로, 상기 양으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하고, 상기 음으로 하전된 미세입자는 분쇄된 양이온 교환 수지를 포함한다. 상기 조성물은 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자가 서로 혼합되거나 혼합되지 않은 것을 지칭한다. 본 발명의 명세서에서 나타난 것과 같이, 흡착물질은 생물학적 유체에 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 각각을 첨가하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 미세입자들은 미리 혼합되어 생물학적 유체에 첨가될 수 있다.
본 발명의 제 2 양태에 따르면, 상기 조성물은 소수성 미세입자를 포함한다. 상기 소수성 미세입자는 특히 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 흡착할 수 있다. 흡착 원리은 먼저 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 같은 흡착 리간드의 소수성 부분과 미세입자의 고분자 표면간의 소수성 결합(Van der Waals, London Type)에 기초한 것으로 생각된다.
상기 미세입자는 본 발명에 설명된 것과 같이 수지의 분쇄를 통해 얻을 수 있다. 예를 들면, 이온 교환 수지를 분쇄하고 선택적으로 수지를 조절(conditioning)함으로써 얻을 수 있다. 이러한 입자는 바람직하게는 본 발명에서 "미세입자", "흡착 물질", "흡착제", "입자들", "분쇄된 입자", 또는 "분쇄된 수지"와 같이 지칭된다. 이들 용어들은 교환적으로 사용된다. 바람직하게는, 상기 미세입자는 예를 들면, 물의 탈이온화 및 폐수 처리를 위해 보통 사용되는 통상적인 큰 직경의 작은 기공을 가진 입자를 분쇄하여 얻을 수 있다.
양으로 하전된 미세입자는 바람직하게는 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하고 음으로 하전된 미세입자는 바람직하게는 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 미세입자는 분말 형태로 존재하거나 입자 현탁액을 생성하는 액체배지로 존재한다. 바람직하게는, 상기 미세입자는 액상젤 형으로 존재하지 않는다. 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 각각을 포함하는 조성물은, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 혼합하여 제조할 수 있다. 조성물은 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 별도로 준비하고, 이들을 상기 생물학적 유체에 각각 별도로 첨가하여 조성물을 제조할 수 있다.
양이온 교환 수지는 음으로 하전된 미세입자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 양이온 교환 수지는 약산 또는 강산이 될 수 있다. 반대로, 음이온 교환 수지는 양으로 하전된 미세입자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 음이온 교환 수지는 약염기 또는 강염기가 될 수 있다.
본 발명에 따르면, 이온 교환 수지는 임의의 적합한 물질을 바탕으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate(HEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(DMAEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(pDMAEMA) -based), 폴리아크릴아마이드계(polyacrylamide-based) 또는 메타크릴 산계(methacrylic acid(MAA) -based )일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 수지는 디비닐벤젠계(divinylbenzene-based)와 교차결합된 폴리스티렌이다.
바람직한 일 실시예에서, 상기 미세입자는 약 5㎛ 이하, 약 10㎛ 이하의 평균 입자 크기를 가지는 분쇄된 입자 형태로 존재한다. 측정된 표면적, 측정된 단백질 용량 및 구형 단백질의 육각형 공간을 가정한 이론적 계산에 기초하여, 본 발명의 ~ 1 ㎛ 직경(d50)의 미세입자는 ~ 100 nm 직경(d50)을 가진 구형 나노입자와 비슷한 단백질 용량을 가진다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 미세입자는 예를 들면, Bio-Rad Laboratories (USA)에 의해 개발된 Nuvia 배지(Nuvia S Media - online Catalog 2013, No. 156-0311, Nuvia Q Media - online Calalog 2013, No. 156-0411, 또는 Nuvia cPrime media - online Catalog 2013 No. 156-3401)의 입자와 같이 높은 결합 용량을 가지는 매크로 다공성 배지(macro-porous media)와 견줄만한 특정영역을 가지고 있다. 상기 "특정 영역"이라 하면, 슬러리(slurry)의 밀리리터(ml) 당 영역 또는 수지의 그램(g) 당 영역을 의미한다.
본 발명에 따른 미세입자는, 음이온 교환 수지 및 양이온 교환수지를 분쇄하여 얻을 수 있다. 음이온 교환 수지는, 예를 들면, Amberlite IRA-485, Amberlite IRA-400, Dowex 1X2-100, Dowex 1-8-100, DIAION SA 20A, Marathon A2 또는 본 발명의 기술분야에서 알려진 다른 양이온 교환 수지일 수 있다. 그리고 양이온 교환 수지, 예를 들면, Amberlite IRC-748, Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, DIAION SK 110, Marathon MSC 또는 본 발명의 기술분야에서 알려진 음이온 교환 수지일 수 있다.
양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 비율은 약 0.1:99.9 (w/w) 내지 99.9:0.1(w/w) 범위일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 유체로부터 생체분자, 바람직하게는 단백질, 또는 DNA, 예를 들면, 플라스미드 DNA와 같은 폴리뉴클레오타이드 흡착에 이용하기 위해, 상기 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도를 제공한다. 또한, 소수성 미세입자도 같은 목적으로 사용된다. 본 발명의 미세입자에 흡착될 수 있는 생체분자를 이하에 설명하였다. 유체는 세포 균질액, 발효 상청액, 세포 현탁액, 발효액 등과 같으 생물학적 유체이다. "생물학적 유체"의 더 상세하고 바람직한 설명뿐만 아니라 실시예는 이하에서 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 미세입자의 용도로, 특히 세포를 파쇄하고 세포로부터 방출된 생체분자의 흡착에 이용하기 위한 하전된 미세입자의 용도이다. 그러한 세포는 바람직하게는 상기 설명된 세포 현탁액, 발효액 또는 배양액에 포함되어 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 세포 균질액 또는 발효 상청액 등 생물학적 유체로부터 생체분자를 수득하는 방법에 관한 것이다: 상기 설명된 흡착제를 첨가하고; 미세입자가 응집물을 형성하도록 하고; 상기 생물학적 유체로부터 상기 응집물을 제거하고, 그리고 상기 응집물로부터 상기 생체분자를 탈착시켜 생체분자를 회수하거나 또는 상기 생물학적 유체로부터 상기 생체분자를 정제하는 단계.
바람직하게는, 상기 방법은 발효액, 발효 상청액, 세포 균질액 또는 세포 현탁액으로부터 생체분자를 수득하기 위해 사용된다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 미세입자를 첨가한 후, 상기 생물학적 유체를 교반한다.
생물학적 유체의 예로는 E. coli , Pichia pastoris 및 CHO 세포 배양으로부터와 같은 세포 배양액 및 세포 균질액, 세포 용해액, 세포 현탁액, 발효액, 배양액, 발효 상청액, 배양 상청액, 세포 상청액을 포함한다. 상기 세포 배양액 및 세포 균질액, 세포 용해액, 세포 현탁액, 발효액, 배양액, 발효 상청액, 배양 상청액, 세포 상청액은 추가적으로 여과, 농축, 투석, 컨디셔닝 또는 임의의 다른 방법으로 처리될 수 있다. 세포 배양액 및 세포 균질액, 세포 용해액, 세포 현탁액, 발효액, 배양액, 발효 상청액, 배양 상청액, 세포 상청액 및 상기 설명된 것과 유사한 것은, 예를 들면, 희석, pH조정, 염 조정 등에 의해 조절되거나 임의의 다른 방법으로 처리될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 물과 같은, 미세입자를 현탁할 수 있는 수단을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 생체분자 및 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 또는 본 발명의 소수성 미세입자를 포함하는 생물학적 유체를 제공한다.
본 발명의 정확한 성질과 장점은, 이하의 설명 및 실시예를 통해서 통상의 기술자가 명확히 이해할 수 있다. 그러므로 본 발명은 바람직한 실시예 또는 실시예에 기재된 내용으로 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 다른 실시예 및 응용에 본 발명을 쉽게 적용할 수 있다.
도 1: 광학 현미경 사진(1000x 배율) (도 1a) 및 Dowex 1X8-100으로 제조된 미세입자의 크기 분포(도 1b).
도 2: 미세입자 종류별 크기 분포.
도 3a-b: MARATHON A2 표면의 원자력 현미경 이미지(분쇄전 도 3a 및 분쇄후 도 3b); 왼쪽에서 오른쪽으로 갈수록 세부적인 차이가 증가.
도 3c-d: MARATHON MSC 표면의 원자력 현미경 이미지(분쇄전 도 3c 및 분쇄후 도 3d); 왼쪽에서 오른쪽으로 갈수록 세부적인 차이가 증가.
도 4: 0.1 mg/ml 농도에서 미세입자에 대한 트립신 억제제(TI) 및 IgG의 흡착속도(왼쪽 패널)와 0.5 mg/ml 농도에서 트립신 억제제(TI)의 흡착속도(오른쪽 패널).
도 5: Labstar LS1 mill로MARATHON MSC의 분쇄과정 동안 미세입자의 크기 분포(도 5a) 및 평균 직경(도 5b). 백분율은(v/v)로 제공.
도 6: 음이온 교환 미세입자 종류별 트립신 억제제(도 6a) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)(도 6b)의 평형 용량. 버퍼 조건은 20 mM Tris, pH 8.0이고 배양시간은 30분.
도 7: 양이온 교환 미세입자 종류별 및 고분자자 입자 Nuvia S에 대한 라이소자임(도 7a) 및 다중클론 항체(IgG)(도 7b)의 평형 용량. 버퍼 조건은50 mM 아세트산나트륨, pH 6.0이고 배양 시간은 미세입자는30분, Nuvia S 는 12시간.
도 8: 음이온 교환 미세입자에 대한 대장균 정용 여과액으로부터 GFP의 평형 용량. 버퍼 조건은 20 mM Tris, pH 8.0이고 배양시간은 30분.
도 9: NuviaS 수지(도 9a) 및 MARATHON MSC 미세입자(도 9b)에 대한 흡착 버퍼의 전도도에 따른 다중클론 항체(lgG)의 평형 용량 그래프.
도 10: pH 6.0에서 입자크기에 따른 MARATHON MSC에 대한 다중클론 항체(IgG)의 평형 용량. 흡착 조건은: 20 mM MES pH 6.0에 1 mg*mL-1 다중클론항체(IgG). IgG 농도는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)에서 280 nm으로 측정.
도 11: 흡착, 용출 및 재생 단계의 각 01, 02, 03회차 후 분쇄된 DOWEX MATATHON A2 (MA2)로부터의 GFP, HCP 및 dsDNA의 회수율(%). 01, 02 및 03회차는 동일한 샘플에 대한 다음의 과정에서 동의어로 사용된다. 도 11a-c는 GFP, HCP 및 dsDNA의 회수 결과를 각각 보여준다.
도 12: 흡착/용출 실험동안 상청액의 엔도톡신 농도.
도 13a: 30초 침강 후, 10 % MARATHON A2 미세입자로 응집된 MARATHON MSC.
도 13b: 분쇄된 Marathon MSC로 다중클론항체(IgG)를 포집한 다음 분쇄된 Marathon A2로 응집이 일어나는 동안 형성된 응집물의 측정된 유체역학적 직경의 박스플랏(Boxplot). 유체역학적 직경 d10 은 10% 백분위(percentile)(응집물의 90%는 주어진 직경보다 더 큼)를 말한다. 이 데이터는 Marathon A2 (AIEX) 및 Marathon MSC (CIEX)의 부피비율로 그룹화되었다. 세선은 1.5배 사분범위로 도시하였다. 빨간선은 분포의 중앙값을 나타낸다. 파란 플러스 표시는 세선에 의해 표시된 범위를 벗어난 데이터 포인트이다.
도 14a: 응집된 MARATHON MSC 미세입자의 속도 분포.
도 14b: CHO 세포 상청액으로부터 IgG의 포집 및 용출을 과정을 기술한 흐름도.
도 14c: AIEX 미세입자를 사용하여 세포 포집 후, IgG의 포집. 99 % 이상의 DNA 및 60 % 이상의 숙주세포 단백질이 세포와 함께 포집되었다.
도 14d: 염 및 버퍼 조건에 따른 Marathon MSC로부터 IgG의 회수. 1 mg/mL농도의 다중클론항체 IgG가 분쇄된 Marathon MSC를 사용하여 수득되었다. 흡착 조건은: 50 mM MES pH 6.0. 흡착은 15 mL 팔콘 튜브(Falcon tubes)에서 15 분 동안 20 rpm의 로터리 쉐이커(rotary shaker)로 수행되었다. Marathon MSC의 결과량은 약 40 mg/mL이었다. 미세입자는 10분동안 16000rcf로 원심분리하여 분리되었다. 어세이의 부피는 2 mL이었다. 용출은 1ml 반응버퍼(corresponding buffer)를 사용하여 수행되었다.
도 15: 분쇄된 미세입자 MARATHON A2 및 MARATHON MSC 와 통상적으로 이용되는 미소구체 AIEX 및 CIEX의 입자크기 분포.
도 16: 분쇄된 미세입자 MARATHON A2 및 MARATHON MSC 와 통상적으로 이용되는 미소구체 AIEX 및 CIEX의 제타 포텐셜(Zeta potential).
도 17: 분쇄된 미세입자 MARATHON A2 및 MARATHON MSC 와 통상적으로 이용되는 미소구체 AIEX 및 CIEX의 단백질 결합 용량.
도 18: Marathon MSC(ORS) 및 응집 전 Marathon MSC(TRS)에 대한 IgG의 단백질 용량 비교. Marathon A2에 대한 Marathon MSC의 비율은 0.4이다. 흡착은 15분 동안 수행되었다.
발명의 구성
본 발명은 또한 다음 구성으로 특징지어질 수 있다.
1.분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자, 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음이온으로 하전된 미세입자를 포함하는, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 조성물.
2.소수성 미세입자를 포함하는 조성물.
3.구성 1에 있어서, 상기 양이온 교환수지는 약산 또는 강산인 것인, 조성물.
4.구성 1에 있어서, 상기 음이온 교환수지는 약염기 또는 강염기인 것인, 조성물.
5.상기 구성 중 어느 하나에 있어서, 상기 음이온 교환 수지와 양이온 교환 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate(HEMA)-based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(DMAEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계 (dimethylamino ethylmethacrylate(pDMAEMA) -based), 폴리아크릴아마이드계 (polyacrylamide-based) 메타크릴산계 (methacrylic acid(MAA) -based )인 것인, 조성물.
6.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양이온 교환 수지와 음이온 교환 수지는 디비닐벤젠(divinylbenzene)과 교차결합된 폴리스티렌(polystyrene)을 바탕으로 한 교환수지인 조성물.
7.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 미세입자는 평균 입자의 크기가 약 5㎛ 이하인 조성물.
8.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음으로 하전된 미세입자는 실시예 4에 명시된 조건을 사용하여 적어도 5mg의 GFP을 흡착할 수 있는 조성물.
9.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자는 실시예 4에 명시된 조건을 사용하여 적어도 5mg의 다중클론 IgG 를 흡착할 수 있는 조성물.
10. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 미세입자들은 음이온 교환수지 및 양이온 교환수지를 갈아서 획득할 수 있고, 상기 분쇄된 음이온 교환수지 및 분쇄된 양이온 교환수지를 혼합하여 획득할 수 있는 조성물.
11.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 Amberlite IRA-485, Amberlite IRA-400, Dowex 1X2-100 , Dowex 1-8-100, Marathon A2 또는 DIAION SA 20A인 조성물.
12.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 양이온 교환 수지는 Amberlite IRC-748, Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, Marathon MSC 또는 DIAION SK 110인 조성물.
13.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 수지는 다공이 없는(non-porous) 조성물.
14.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자는 상기 수지를 갈거나 조절시켜(conditioning) 얻을 수 있는 조성물.
15.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 조성물은 분말 형태인 조성물.
16.상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 조성물은 슬러리(slurry) 또는 현탁액 (suspension)과 같은 액체 배지에 존재하는 조성물.
17. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자와 음으로 하전된 미세입자의 비율은 약 0.1 : 99.9 (w/w)에서 99.9 : 0.1 (w/w)까지인 조성물.
18.생체분자, 바람직하게는 단백질 또는 플라스미드 흡착에 이용하기 위한 상기 구성 중 어느 한 구성의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자의 용도.
19.구성 17에 있어서, 세포 균질액 또는 발효 상청액으로부터 생체분자, 바람직하게는 단백질 흡착에 이용하기 위한 것인, 용도.
20.세포 파쇄에 이용하기 위한, 상기 구성 중 어느 한 구성의 양으로 하전된 미세입자와 음으로 하전된 미세입자의 용도.
21.세포 파쇄, 그리고 분자, 바람직하게는 생체분자, 더욱 바람직하게는 폴리펩티드 및 플라스미드 흡착에 이용하기 위한, 구성 1 내지 16중 어느 한 구성의 양으로 하전된 미세입자와 음으로 하전된 미세입자의 용도.
22.하기 단계를 포함하는, 상기 생체분자를 포함하는 생물학적 유체로부터 생체분자를 수득하는 방법:
a)생물학적 유체에 구성1 내지 16 중 어느 한 구성의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 첨가하고,
b)상기 미세입자가 응집물을 형성하도록 하고,
c)상기 응집물을 생물학적 유체에서 제거하고, 그리고
d)상기 응집물로부터 생체분자를 탈착하거나 상기 c)의 생물학적 유체로부터 생체분자를 정제하는 단계.
23.구성 21에 있어서, 상기 생물학적 유체는 세포 균질액 또는 발효 상청액인 것인 방법.
24.구성 21에 있어서, 상기 유체는 세포 현탁액이고, 상기 방법은 단계 a) 및/또는 d) 이후에 세포 상청액을 교반하는 단계를 더 포함하는 방법.
25. 구성 21, 22 또는 23에 있어서, 상기 단계 c)는 원심분리 또는 여과 등의 분리에 의해 수행되는 방법.
26.구성 21 내지 24 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 단계a)의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자는 각각 별개로 첨가되는 방법.
27.구성 21 내지 24 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 단계 a)는 생물학적 유체에 음으로 하전된 미세입자를 첨가하고 난 뒤, 양으로 하전된 미세입자를 첨가하는 것을 포함하는 방법.
28.구성 1 내지 16 중 어느 한 구성의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자와 선택적으로 현탁 수단을 포함하는 키트.
29.구성 1내지 16 중 어느 한 구성으로 정의된 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자 및 생체분자를 포함하는 생물학적 유체.
30.구성 29에 있어서, 응집물을 더 포함하는 생물학적 유체.
31.생체분자 회수에 이용하기 위한 양과 음으로 하전된 미세입자의 용도에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하고, 상기 음으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 양이온 교환수지를 포함하고, 그리고 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 용도.
32.구성 31에 있어서, 세포 용해액(lysate) 또는 세포 균질액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 용도.
33.구성 31에 있어서, 세포 상청액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 용도.
34.세포 분쇄 및 세포로부터 생체분자의 방출에 이용하기 위한 양 및 음으로 하전된 미세입자의 용도로, 상기 양으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하고, 상기 음으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하고, 그리고 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 용도.
35.a) 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 생물학적 유체에 첨가하고, 그리고 생물학적 유체로부터 생체분자를 회수하는 단계를 포함하는 생물학적 유체로부터 생체분자를 획득하는 방법으로, 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 방법.
36.구성 35에 있어서, 상기 생물학적 유체는 세포 현탁액, 세포 용해액 또는 세포 균질액인 방법.
37.하기 단계를 포함하는 세포로부터 생체분자를 획득하는 방법:
a) 세포 파쇄를 위해, 양으로 하전된 미세입자 또는 음으로 하전된 미세입자를 첨가하는 단계,
b) 반대의 전하로 하전된 미세입자를 첨가하는 단계, 및
c) 생체분자를 회수하는 단계.
38.구성 37에 있어서, 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 방법.
39.구성 37에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자가 먼저 첨가되는 것인 방법.
40.구성 55에 있어서, 상기 음으로 하전된 미세입자가 먼저 첨가되는 것인 방법.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 본 명세서에 기술된 것과 같이, 상기 흡착제를 사용하여 생체 분자를 회수하는 간단하고 빠른 방법을 제공한다. 본 발명은, 하전된 미세입자를 포함하는 흡착제는 큰 직경(적어도 5 ㎛)의 응집물(floc)을 쉽게 형성하여 생물학적 유체로부터 분자, 바람직하게는 생체분자를 쉽게 분리할 수 있다는 놀라운 발견에 일부 기초한다. 게다가, 본 발명의 흡착제는 정제 효율 및 불순물 감소가 매우 높았다. 본 발명의 분야에서 통상의 기술자에 의해 예상되듯이, 본 발명은 명세서에 설명된 것과 같이 시험적 또는 상업적 규모와 같은 큰 규모에서 세포 균질액 및 발효상청액으로부터 단백질을 분리하는데 특히 유용하다. 상기 흡착제는 지속적 공정 또는 배치 공정(배치 흡착으로 언급됨)에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 용어 "생체분자"는 일반적으로 유기체(organism)에서 발견되거나 합성되는 분자를 의미하는 것으로, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 생체분자는 산성 또는 염기성 생체분자일 수 있다. 생체분자에 포함되는 예로, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 올리고펩타이드, 단백질, 뉴클레오시드, 플라보노이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA(ds 또는 ssDNA), 플라스미드 DNA (plasmid DNA), 코스미드 DNA(cosmid DNA), BAC DNA, YAC DNA, RNA (ds 또는 ssRNA), 유기금속 화합물(organometallic compounds), 아미노산, 지질, 피리미딘(pyrimidines), 퓨린(purines), 탄수화물(carbohydrates), 펩타이드 모방체 화합물(peptidomimetic compounds), 독소(toxins), 스테로이드(steroids), 효소(enzymes)가 있고, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용어는 또한 하기 기술된 것과 같이 "생산물(product)" 또는 "발현물(expression product)"을 포함한다. 생체분자는 바람직하게는 하전되어 있다.
본 발명의 흡착제는 분쇄된 입자 형태의 이온 교환 수지를 포함한다.
또는, 본 발명의 흡착제는 분쇄된 입자 형태로 소수성 수지를 포함한다. 이러한 소수성 입자의 뛰어난 단백질 흡착력은 낮은 염 농도에서 기존 크로마토그래피 배지보다 월등하다. 그리고 특히 폴리뉴클레오타이드 또는 소수성 단백질의 네거티브 정제(negative purification)에 유용하다. 따라서, 본 발명은 소수성 미세입자를 적용하여 폴리뉴클레오타이드 또는 소수성 단백질의 네거티브 정제를 위한 용도 및 방법을 제공한다. 이와 같은 목적을 위해 균질액 또는 표준 단백질 용액에 50% (v/v)의 소수성 미세입자 현탁액이 첨가된다. 미세입자 현탁액을, 예를 들면, 30분 동안 배양(incubation)한다. 그 다음 미세입자를 원심분리하고 용출 버퍼를 첨가하여 혼합하고, 예를 들면, 30분 동안 배양하여 결합 단백질을 추출한다. 선택적으로, 용출 버퍼를 이용한 두번째 세척단계가 포함될 수 있다. 이 후에 추출된 미세입자는 다시 전과 동일한 방법으로 원심분리된다. 상청액의 단백질의 농도는 배광분석(photometric analysis)에 의해 정량화 될 수 있고 목적 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해서 확인할 수 있다.
제 1 양태에서, 본 발명은 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음으로 하전된 미세입자를 포함하는, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 유용한 수지는, 다양한 종류의 물질에 결합 및 부착할 수 있고 혼합물로부터 물질을 포집할 수 있는 고체, 불용성 고분자 물질이다. 수지는 일반적으로 세파덱스(sephadex), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate) 또는 중성 폴리사카라이드(neutral polysaccharides)를 포함하는, 불활성 화합물로 구성되나, 이에 제한되지 않는다. 수지는 또한 셀룰로오스(cellulose), 덱스트란(dextran) 또는 아가로스(agarose)와 같은 교차결합이 존재하는 천연 고분자를 포함한다. 이와 같은 수지는, 본 발명의 설명에 따라, 분쇄된 입자, 즉 미세입자가 된다.
본 발명에서 정의된 것과 같이, "양으로 하전된" 미세입자는 하나 이상의 양성자를 가지고. 더 일반적으로 중성 pH에서 하나 이상을 가진다. "음으로 하전된" 미세입자는 하나 이상의 전자를 가지고, 더 일반적으로 중성 pH에서 하나 이상을 가진다.
바람직한 실시예에 따른 미세입자는 이온 교환 수지로부터 제조된다. 더 바람직하게는, 고분자 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지를 말한다. 이온 교환 수지는 고체 지지체를 의미하고, 상기 고체 지지체는 교환성 이온을 지닌 고정된 관능기 또는 활성부위를 운반하는 불용성 전하를 띈 고분자 담체를 포함한다. 적절한 이온 교환 수지의 예는 음이온 교환 수지, 양이온 교환 수지 및 혼합형 크로마토그래피 수지를 포함한다. 또한 본 발명에서는 혼합형 이온 교환 수지로 기재된다. 교환가능한 이온 형태는 이온 교환 수지 종류에 따라 일반적으로 하나 또는 하나 이상의 Na+, H+, OH-, 또는 Cl- 이온이다. 이온 교환 수지는 약산 및 강산 양이온 교환 수지와 약염기 및 강염기 음이온 교환 수지를 포함한다. 이온 교환 수지는 다양한 산업분야에서 널리 이용된다. 이온 교환 수지는 예를 들면, 발전소에서 보일러용 물의 광물질 제거 또는 응축물 처리와 같은 수처리 분야, 설탕액의 정제와 같은 식품분야 및 반도체 정제수 제조 분야에서 공통적으로 사용된다.
본 발명의 흡착 입자는 바람직하게는 다공성, 구형의 이온 교환 수지로부터 제조된다. 구형의 이온 교환 수지는 서스펜션 중합(suspension polymerization)에 의해서 제조된다. 단일 반응성 추가 중합가능 모노머(monofunctional addition-polymerizable monomer) 및 라디칼 중합 개시제가 포함된 모노머 혼합체가 액체 배지에 첨가된다. 다음 모노머 혼합체의 현탁액을 제조하기 위해 저어준다. 그 다음 상기 현탁액은 구형의 교차결합된 고분자가 형성되도록 중합 온도에서 일정 시간 동안 둔다. 수처리용 이온 교환 수지의 직경은 일반적으로 300-600 ㎛이다.
이온교환 수지의 고분자 매트릭스는 폴리스티렌, 폴리스티렌 및 스티렌 공중합체, 폴리아크릴레이트, 치환된 방향족 공중합체, 폴리메타크릴레이트, 페놀-포름알데하이드, 폴리알킬아민, 이들의 조합 등을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예로, 고분자 매트릭스는 폴리스티렌, 폴리스티렌 및 스티렌 공중합체, 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트인 반면에 다른 실시예로, 고분자 매트릭스는 스티렌디비닐벤젠 공중합체이다. 바람직하게는, 흡착입자용 이온 교환 수지는 폴리스티렌계, 하이드록시에틸 메타크릴레이트계, 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계, 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계, 메타크릴산계를 사용한다. 더욱 바람직하게는, 수지는 디비닐벤젠과 교차결합된 폴리스티렌으부터 제조된다.
본 발명의 양이온 교환 수지는 약산 또는 강산일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약산성 양이온 교환 수지"는 일반적인 방법으로 측정하여 약 4.5 이상의 이온화 상수(pKa) 또는 해리 상수를 가지는 수지를 말한다(Fishery et al., J. Phys. Chem., 60, 1030 (1956)). 수지는 교환기로써 카복실기, 페놀하이드록실기, 인산기 및 알소노기(arsono group)를 가질 수 있다. 일반적으로, 그러한 수지는 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산 형태이다. 바람직하게는, 수지는 메타크릴산 형태를 가진다.
약산성 양이온 교환수지의 다양한 이온에 대한 흡착력은 일반적으로 강산성 수지의 흡착력과 유사하다. 선택성은 더 큰 원자가 이온에서 더 높다.
반면에, 용어 "강산성 양이온 교환 수지"는 1.5 이하의 이온화 상수 (pKa) 를 가지는 수지를 말한다. 강산성 양이온 교환 수지는 소듐 폴리스티렌 설포네이트(sodium polystyrene sulfonate) 또는 polyAMPS와 같은 설폰산기(sulfonic acid groups )를 가질 수 있다. 설폰산기(-HSO3)는 교환기이고 산성 용액에서 SO3- 및 H+이 해리되면서 강산의 역할을 수행한다. 그러나 알카리성 용액에서는 그러하지 않다.
본 발명의 이온 교환수지는 약염기 또는 강염기일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약염기성 양이온 교환 수지"는 일반적인 방법으로 측정하여 약 8.5 이상의 이온화 상수(pKa) 또는 해리 상수를 가지는 수지를 말한다(Fishery et al., J. Phys. Chem., 60, 1030 (1956)). 수지는 교환기로 폴리스티렌 아민과 같은 일차, 이차 및/또는 3차 아미노기를 가질 수 있다. 반면에, 용어 "강염기성 이온 교환 수지"는 약 12이하의 이온화 상수를 가지는 수지를 말한다. 강염기 음이온 교환 수지는, 교환기로 예로들어 트리메틸암모늄기, 즉, polyAPTAC과 같은4차 아미노기를 가질 수 있다.
통상의 기술자는 생체분자 흡착에 이용하기 위한 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지를 선택할 수 있다. 생체분자와 이온 교환기의 흡착 용량을 결정하는 몇가지 파라미터가 있다. 통상의 기술자의 일반적인 지식 범위 내에서 생체분자가 어떤 조건하에서, 이온 교환기의 형태에 의해 흡착될 수 있는지 결정할 수 있다. 흡착제의 선택은 특히 관심있는 생체분자의 등전점(isoelectric point, IEP) 및/ 또는 흡착제의 전반적인 소수성에 의존한다. 단백질과 같은 생체분자 용액의 pH와 생체분자의 등전점은 주로 생체분자가 양이온 또는 음이온 교환기에 중 어디에 결합할지를 결정한다. 단백질은 생체분자의 등전점 이하의 pH에서 양이온 교환기에 결합하거나 등전점 이상의 pH에서 음이온 교환기에 결합한다는 것이 알려져 있다.
시판되는 이온 교환 수지, 예를 들어 Amberlite, Amberjet, Duolite 및 Imac 수지는 Rohm & Haas of Philadelphia, Pennsylvania USA로부터, Lewatit 수지는 Bayer of Leverkusen, Germany로부터, Dow 수지는 Dow Chemical of Midland, Michigan USA으로부터, Diaion 및 Relite 수지는 Mitsubishi Chemical of Tokyo, Japan으로부터, Purolite 수지는 Purolite of Bala Cynwyd, Pennsylvania USA로부터, Ionac 수지는 Sybron of Birmingham, N.J. USA 및 Resintech of West Berlin, N.J. USA로부터 제공된다.
양으로 하전된 미세입자는 고분자 음이온 교환 수지로부터 제조될 수 있다. 시판되는 음이온 교환 수지는 일반적으로 OH- 또는 Cl- 형태 중 하나이다. 일실시예에서, 음이온 교환 수지는 OH- 형태이다. 수지는 예를 들어 Diaion SA resins (including DIAION SA 20A) and Diaion SK resins (including DIAION SK 110) (from Mitsubishi Chemical)과 같은 "Diaion" 이온 교환 수지, Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-734, and Amberlite IRA-900 (from Rohm & Haas Co.)과 같은 "Amberlite" 수지 또는 Dowex 1, Dowex 2, Dowex 11, Dowex 21K, Dowex 1x2, Dowex 1x4, Dowex 1x8 and Dowex Marathon resins (from Dow Chemical Co)와 같은 "Dowex" 수지일 수 있다. 바람직하게는, 미세 메쉬 구형 이온 교환 수지(fine mesh spherical ion exchange resins)인 Dowex 1x2, Dowex1x4, 1x8가 사용된다. 음이온 교환 수지에서 기능기는 4차 암모늄기, 즉, 벤질트리메틸암모늄기(타입 1 수지), 벤질디메틸에탄올암모늄기(타입 2 수지), 트리알킬벤질 암모늄기(타입 1 수지), 디메틸에탄올아민(타입2) 또는 3차 아민 기능기를 포함할 수 있다.
음으로 하전된 미세입자는 고분자 양이온 교환 수지로부터 제조될 수 있다. 시판되는 양이온 교환 수지는 일반적으로 H+ 또는 Na+ 형태 중 하나일 수 있다. 일 실시예에서, 양이온 교환수지는 H+ 형태이다. 수지는 예로들어 Diaion PK resins및 Diaion SK resins (from Mitsubishi Chemical)와 같은 "Diaion" 양이온 교환 수지 또는 Dowex 50WX2, Dowex 50WX8와 같은 "Dowex" 수지 및 Marathon C, Marathon MSC (from Dow Chemical Co)와 같은Dowex Marathon 수지일 수 있다. 양이온 교환 수지의 작용기는 설폰산기(-SO3H), 포스폰산기(-PO3H), 포스핀산기(-PO2H), 카복실기(-COOH or -C(CH3)-COOH) 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 양이온 교환 수지의 작용기는 -SO3H, -PO3H, 또는 -COOH일 것이고, 반면에 가장 바람직한 일 실시예로 양이온 교환 수지의 작용기는 -SO3H이다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, 고분자 물질은 고분자, 고분자 혼합물, 가교 고분자, 이의 혼합물 또는 고분자 네트워크를 지칭할 수 있다. 종종, 고분자 물질은 간단히 고분자로 지칭된다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, 고분자 양이온 교환 수지는 하나 이상의 양성자를 가진 고분자 물질 또는 그러한 고분자 그 자체를 지칭할 수 있다. 고분자 음이온 교환 수지는 하나 이상의 전자를 가질 수 있다.
본 발명의 양으로 하전된 미세입자는 중성 pH에서 적어도 하나의 양성자를 가지는 입자이고 더 일반적으로는 하나 이상을 가진다. 반면에 음으로 하전된 미세입자는 동일한 조건에서 적어도 하나의 전자를 가진다.
양 또는 음으로 하전된 미세입자는 적어도 미세입자 성분의 일부가 이온적으로 하전될 때, 얻을 수 있다.
양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 비율은 약 0.1:99.9 (w/w)에서 99.9:0.1 (w/w)까지가 될 수 있다. 예를 들면, 약 50:50이 될 수 있지만 또한, 90:10, 80: 20, 75:25, 60:40, 40:60, 20:80, 25:75, 10:90, 등등 다르게 될 수도 있다. 바람직한 비율은 약 90:10이다.
본 발명의 소수성 미세입자는, 바람직하게는 밤새 분쇄하고 분쇄한 수지를 수용액으로 현탁한다. 상청액을 원심분리한다. 수지를 2M NaCl과 같은 염 용액으로 다시 현탁하고 원심분리한다. 그 후 펠렛을 제거한다. 상청액을 옮겨서 다시 원심분리한다. 상청액을 제거한다. 분쇄된 수지를 수용액으로 다시 현탁하고 튜브로 옮긴다. 수지를 원심분리하고, 상청액은 버리고 수지를 수용성 세척 용액으로 다시 현탁한다. 세척 조건은 다음과 같다:
- 1x 50% EtOH (유기 잔류물 희석)
- 3x 탈 이온수(EtOH의 희석)
바람직한 일 실시예에서 미세입자는 약 9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 6 ㎛, 5 ㎛, 4 ㎛, 3 ㎛, 2 ㎛ 및 1 ㎛이하 등 약 10 ㎛ 이하의 평균 미세입자를 가지는 분쇄된 입자의 형태를 가진다. 바람직하게는, 분쇄된 입자는 평균 입자 크기가 약 5 ㎛ 이하이고, 더욱 바람직하게는 2.5 ㎛이하이다. 바람직하게는, 분쇄된 입자는 0.5 ㎛ 이상의 평균 입자 크기를 가진다. 따라서, 분쇄된 입자는 바람직하게 약 0.5 ㎛ 내지 10 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 9 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 8 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 7 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 6 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 5 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 4 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 3 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 2.5 ㎛ 범위의 평균 입자 크기를 가진다. 그러나, 분쇄된 입자는 0.5 ㎛ 이하뿐만 아니라 10 ㎛ 이상의 입자크기를 가질 수 있다.
흡착 입자 제조
미세입자는 음이온 교환 수지 및/ 또는 양이온 교환 수지를 분쇄하여 얻을 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 미세입자는 수지를 분쇄하거나 컨디셔닝하여 얻을 수 있다.
수지의 제조 공정에서 잔여 부산물을 제거하기 위해 분쇄된 입자를 컨디셔닝하는 것이 바람직하다. 일반적인 이온 교환 수지 컨디셔닝 방법은 본 발명의 기술분야에서 잘 알려져 있고 또한 공급자에 의해서 잘 설명된다.
필요하다면, "컨디셔닝"은 H+ 또는 OH- 형에서 Na+ 또는 Cl- 형으로 전이시키기 위해 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 컨디셔닝은 NaCl 및 물을 사용하여 세척단계를 반복하여 수행될 수 있다. 상기 공정에서, 수지는 물 속에서 분쇄될 수 있고 매우 작은 입자를 제거하는데 유용한 원심분리에 의해 침전된다. 매우 작은 입자는 보통 침전되지 않고 표면에 뜨는 미세입자이다. 따라서 미세입자는 자동적으로 떠오르거나 기계적으로 제거될 수 있다. 또한 Na+ 또는 Cl- 형인 수지는 상업적으로 이용가능하고 공급업체로부터 얻을 수 있다.
바람직한 실시예에서, 미세입자는 (a) 이온 교환 수지를 분쇄하는 단계, (b) 수용액에 상기 분쇄된 수지를 재현탁하는 단계, (c) 상기 분쇄된 수지의 침강 단계, (d) 침강이 일어난 상청액으로부터 분쇄된 수지를 획득하는 단계, (e) 약 2 M NaCl에서 수집한 분쇄된 수지를 재현탁하는 단계, (f) 상기 분쇄된 수지를 침강시키는 단계, (g) (f) 단계의 침강이 일어난 상청액으로부터 분쇄된 수지를 획득하는 단계, (h) 상기 분쇄된 수지를 침강시키는 단계, (i) (h) 단계의 분쇄된 수지의 침강물을 수집하는 단계, 및 (j) 상기 수집된 분쇄된 수지를 세척하는 단계에 의해서 제조될 수 있다.
분쇄
분쇄는 분쇄기(제트밀(jet mill), 볼밀(ball mill), 해머밀(hammer mill) 등)와 같은 분쇄장치 또는 예를 들면, 막자사발을 이용한 손수 분쇄하는 방법을 포함하는 본 발명의 기술분야에서 알려진 방법에 의해서 수행될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용된 "분쇄"는 입자 크기를 감소시키는 공정을 말한다. 통상의 기술자는 수지를 제조하기 위하여 쉽게 분쇄방법을 선택할 수 있다. 일 실시예에서, 수지는 사발에서 하나 이상의 막자를 작동시키는 자동화된 수단으로 습식 분쇄된다. 분쇄공정은 입자의 대부분이 약 10 ㎛ 이하, 즉, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1㎛ 이하의 크기가 될 때까지 계속 수행된다. 바람직하게는, 수지는 입자의 대부분이 이하 설명된 평균 입자 크기를 가지도록 분쇄된다. 대부분 50% 이상, 즉, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 의미한다. 다른 실시예에서, 입자의 대부분은 적어도 0.1 ㎛, 즉, 0.2 ㎛, 0.3 ㎛, 0.4 ㎛, 0.5 ㎛, 0.6 ㎛, 0.7 ㎛, 0.8 ㎛, 0.9 ㎛, 1.0 ㎛, 1.1 ㎛, 1.2 ㎛, 1.3 ㎛, 1.4 ㎛ 1.5 ㎛, 1.6 ㎛, 1.7 ㎛, 1.8 ㎛, 1.9 ㎛, 2.0 ㎛, 3 ㎛, 4 ㎛ 및 5 ㎛의 평균 입자 크기를 가진다.
통상의 기술자는 본 발명의 기술분야에서 알려진 방법으로 쉽게 분쇄된 입자의 크기를 결정할 수 있다. 그로부터, 평균 입자 크기는 본 발명의 기술분야에서 알려진 수단 및 방법에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들면, 크기는 실시예에 기재된 것과 같이 소프트웨어 기반 크기 측정을 사용하는 광학현미경에 의해서 결정된다. 분쇄된 수지의 입자 크기는 동등한 구 직경을 추정함으로써 1000배 배율로 측정될 수 있다. 분포는 바람직하게 1% v/v 에서 약 100 내지 500 입자의 직경 크기를 비교함으로써 계산된다. 분쇄는 좁은 구멍을 깨서 표면적을 증가시키는 효과를 가지고, 표면적의 증가로 특히, 단백질 또는 폴리펩타이드와 같은 생체분자의 결합능의 증가뿐만 아니라 매우 빠른 결합 속도를 나타낸다. 직경의 측정은 바람직하게는 입자를 인식하고 직경을 측정하는 소프트웨어 같은 기술적 수단의 도움으로 수행된다.
"재현탁", "현탁" 또는 본 발명에서 사용된 이러한 문법적 형태는 미세입자가 현탁액에 첨가되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "침강"은 혼합되어 있는 용액에서 미세입자가 가라앉아 바닥면에 멈추는 것을 의미한다. 침강은 미세입자에 작용하는 힘에 반응한 용액을 통한 입자 운동 때문이다. 상기 힘은 중력 또는 원심분리에 의한 원심 가속도일 수 있고, 바람직하게는 후자이다.
"수집"은 미세입자가 현탁액으로부터 수득되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "세척"은 미세입자의 성능을 방해할 수 있는 액체 부유물의 양이 감소되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 세척 단계는 다음 조건을 가진다: 1　x　50% 에탄올, 3　x　물, 바람직하게는 탈이온수, 1　x　0.5M NaOH, 4　x　물, 바람직하게는 탈이온수 및 물, 바람직하게는 탈이온수로 재현탁. 이러한 유체 각각의 부피는 미세입자를 부피를 초과한다. 바람직하게는 10배 또는 20배 초과한다.
분쇄 공정 후, 바람직한 범위 외의 입자는 예를 들면, 원심분리, 침강, 여과 또는 본 발명의 기술분야에서 통상의 기술자에게 알려진 다른 방법에 의해서 선택적으로 제거될 수 있다.
음으로 하전된 미세입자는 실시예 4에 기재된 조건을 사용하여 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는100 mg의 GFP, 즉 적어도 5 mg의 GFP를 흡착한다. 양으로 하전된 미세입자는 실시예 4에 기재된 조건을 사용하여 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는100 mg의 다중클론 IgG (polyclonal IgG), 즉 적어도 5 mg의 다중클론 IgG 를 흡착한다.
놀랍게도, 분쇄 입자의 거친 표면이 Bio-Rad Laboratories (USA)에서 개발된 Nuvia 배지와 같은 높은 결합능을 가진 마크로 다공성 배지와 비교하여 흡착을 위한 유사한 특정 부위를 제공함을 알 수 있었다. Nuvia 배지는 Bio-Rad Laboratories (USA)에서 개발된 Nuvia S 배지(online Catalog 2013, No. 156-0311), Nuvia Q 배지(online Calalog 2013, No. 156-0411) 또는 Nuvia cPrime 배지(online Catalog 2013 No. 156-3401)를 포함한다.
조성물
본 발명에서 청구된 조성물은 분말 형태 또는 현탁액 중의 양으로 하전된 미세입자와 음으로 하전된 미세입자를 혼합하여 제조될 수 있다. 별도의 현탁액에 양으로 하전된 미세입자와 음으로 하전된 미세입자를 준비한 다음 이 현탁액을 혼합함으로써 또한 제조될 수 있다.
생체분자를 흡착하는 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 유체로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도를 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "유체"는 흐르는 성질이 있는 비정질 물질을 지칭한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 분자, 바람직하게는 생체분자, 특히 폴리펩타이드를 생물학적 유체로부터 수득하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a)양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 생물학적 유체에 첨가하고,
b)상기 입자가 응집물을 형성하도록 하고,
c)상기 생물학적 유체로부터 상기 응집물을 제거하고,
d) 단계c)의 응집물로부터 생체분자를 분리하거나 생물학적 유체로부터 생체분자를 정제하는 단계.
다른 실시예에서, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자는 별도로 생물학적 유체에 각각 첨가된다. 본 발명은 다음의 방법를 포함한다:
a)양으로 하전된 미세입자 또는 음으로 하전된 미세입자 중 하나를 생물학적 유체에 첨가하고,
b)상기 생물학적 유체에 반대로 하전된 미세입자를 첨가하고,
c)상기 입자가 응집물을 형성하도록 하고,
d)상기 생물학적 유체로부터 상기 응집물을 제거하고,
e)단계c)의 응집물로부터 생체분자를 분리하거나 생물학적 유체로부터 생체분자를 정제하는 단계.
미세입자의 첨가
첫 단계에서, 미세입자는 유체에 첨가된다. 본 발명의 흡착제는 실험실 규모, 시험적 규모 또는 산업적 규모로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "실험실 규모"는 약1또는 10 ml내지 약 1000 ml의 유체로부터 생체분자의 배치흡착을 포함한다(1리터 대장균 세포 파쇄액 또는 발효 상청액은 보통 약 450-550g의 대장균 습윤 세포 중량에 해당한다). 본 발명에서 사용된 바와 같이, "시험적 규모"는 약 1리터 내지 10리터의 유체로부터 생체분자의 배치흡착을 포함한다(10리터 대장균 세포 파쇄액 또는 발효 상청액은 보통 약 4.5-5.5kg의 대장균 습윤 세포 중량에 해당한다). 본 발명에서 사용된 바와 같이, "산업적 규모" 또는 대 규모는 약 10리터 내지 약 1000 또는 10000리터의 유체로부터 생체분자의 배치흡착을 포함한다(10000리터 대장균 세포 파쇄액 또는 발효 상청액은 보통 약 4.5-5.5톤의 대장균 습윤 세포 중량 또는 그 이상에 해당한다).
미세입자는 생체분자가 분리가 되어야 하는 생물학적 유체에 첨가될 수 있다. 용어 "생물학적 유체"는 넓게 이해될 수 있다. 이것은 어떤 기관으로부터 얻어지거나 생산된 것과 같이, 기관과 관련된 유체를 지칭한다. 생물학적 유체는 세포 배양 배지, 세포 발효 상청액, 발효액, 세포 현탁액, 세포 용해액을 포함된다. 생물학적 유체의 또 다른 예는 상기 위에 설명되어 있습니다. 다른 실시예에서, 생물학적 유체는 타액, 소변, 림프액, 전립선액, 정액, 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 점액분비, 우유, 유청, 복수의 유체, 기관 추출물, 식물 추출물, 동물 추출물일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 생물학적 유체는 시험관내 또는 생체내 과정에서 다양한 유래의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, BAC DNA, minicircle DNA 등을 함유하는 유체로서, 본 발명에 기재된 임의의 생물학적 유체, 특히, 발효액, 배양액, 발효 상청액, 배양 상청액, 세포 균질액, 세포 용해물 또는 세포 현탁액 중 어느 하나일 수 있다. "세포 파쇄액"은 일반적으로 파쇄된 세포의 혼합체로 이해될 수 있다. 세포 균질액은 기계적 또는 화학적 방법으로 얻어질 수 있다. 예를 들면, 세포는 발효 균질액을 만들기 위해 균질기로 고압처리하는 것과 같은 통상적인 방법 또는 알카리 용해물을 포함하는 용해액에서 단순히 볼텍싱(vortexing)함으로써 균질화 될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 생체분자, 양과 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자로 구성된 유체를 또한 포함한다. 바람직한 실시예에서, 생물학적 유체는 본 발명의 방법 중 어느 한 단계 동안 및/ 또는 후에 교반된다. 그러나 바람직하게는 입자가 응집물을 형성하도록 하는 단계 및/또는 응집물이 생물학적 유체로부터 제거되는 단계 동안은 아니다.
미세입자가 생물학적 유체에 첨가되는 동안 및/또는 후에 그것들은 균질한 혼합물을 얻기 위해 젓거나 흔들어 줌으로써 혼합될 수 있다. 이론에 구애됨에 없이, 입자가 생물학적 유체와 혼합되는 동안 저절로 흡착이 이루어지는 것으로 한다.
바람직한 실시예에서, 미세입자는 세포를 분쇄하기 위하여 생물학적 유체에 첫번째로 첨가된다. 사실상, 놀랍게도 본 발명의 미세입자는 세포를 분쇄하고 세포내에서 생체분자를 흡착하는데 사용될 수 있으므로 렌더링(rendering), 예를 들면, 고압의 균질기의 사용이 불필요하다는 것을 알았다. 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 다른 용도는 세포 파쇄 및 분자, 바람직하게는 생체분자, 더욱 바람직하게는 단백질 또는 상기 설명된 폴리뉴클레이티드의 흡착에 이용하기 위한 (조합된) 용도뿐만 아니라 세포 파쇄에 이용하기 위함이다.
응집( Flocculation )
다음 단계는 응집물을 형성하도록 하는 것이다. 흡착제 입자가 생체분자를 흡착하여 빠르게 생체분자와 큰 직경의 응집물을 형성한다는 것은 놀라운 발견이었다. 응집물은 생체분자가 흡착하자마자 형성되고(양 및 음으로 하전된 미세입자가 먼저 혼합된 다음 생물학적 유체로 첨가될 때)뿐만 아니라 미세입자 각각이 별도로 첨가된 후, 반대로 하전된 미세입자가 첨가되자마자 형성될 것이다.
일 실시예에서 반대로 하전된 미세입자는 시간차를 두고 첨가된다. 생체분자가 산성일 때, 양으로 하전된 미세입자를 흡착에 이용하기 위해 세포 용해액 또는 세포 균질액과 같은 생물학적 유체에 첨가할 수 있다. 양으로 하전된 미세입자는 세포를 파쇄하고 생체분자를 정제하기에 충분한 양으로, 또는 생체분자의 흡착과 세포를 파쇄하기에 더 많은 양으로 중 어느 하나로 세포 현탁액에 첨가될 수 있다. 통상의 기술자는 세포를 부분적으로 또는 완전히 파괴하기에 필요한 양을 결정할 수 있다. 음으로 하전된 미세입자는 그 후에 첨가될 수 있다. 이것은 입자의 크기를 증가시키고 응집물을 안정화 시키는 교차결합제의 역할을 한다. 또한, 양이온 교환 수지를 킬레이팅하여 제조된 음으로 하전된 미세입자가 세포를 파쇄하고 생체분자를 분리하기에 충분한 양으로 세포 현탁액에 먼저 첨가될 수 있다. 그 다음, 양으로 하전된 미세입자가 응집을 증가시키기 위해 첨가된다.
회수될 생체분자가 어떤 경우에는 염기성이 될 수 있다. 이와 같은 경우에서, 양으로 하전된 미세입자가 세포 파편 또는 DNA, 숙주세포 단백질 및 세포 조각과 같은 다른 불순물로 응집물을 형성하기 위해 세포 용해액 또는 세포 균질액과 같은 생물학적 유체에 먼저 첨가될 수 있다. 그 다음, 음으로 하전된 미세입자가 응집를 증가시키기 위하여 첨가될 수 있다. 그래서 응집물은 쉽게 분리되어 제거 될 수 있다. 그 후 염기성 생체분자는 상청액으로부터 회수될 수 있다. 또한, 양으로 하전된 미세입자 또는 음으로 하전된 미세입자 중 하나의 사용이 세포 파쇄를 위해 세포 상청액에 첨가될 수 있다. 이것은 세포 상청액으로부터 생체분자를 분리하게 될 것이다. 상기 상청액은 정제가 더 진행 될 수 있다.
응집물은 일반적으로 100 ㎛ 이상의 크기를 가진다. 이러한 형성은 중력 또는 여과에 의하여 내부에 흡착된 생체분자를 포함하는 응집물 분리를 용이하게 한다. 이것은 세포 파편과 같은 다른 원하지 않는 물질을 원심분리를 하지 않고 여과를 통해서 쉽게 제거할 수 있다. 그러므로 본 발명은 통상의 방법보다 더 빠르고 간단하다. 게다가, 컬럼 크로마토그래피에 의해 요구되는 수지를 재생산할 필요가 없다. 미세입자는 사용 후 폐기될 수 있는 값싼 물질이다.
게다가, 생체분자가 흡착 버퍼로 흡착된 후, 크기 때문에 흡착 버퍼로부터 형성된 응집물을 분리하기가 쉽다.
바람직한 실시예에서, 응집물은 적어도 5 ㎛, 즉, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ㎛ 의 평균입자 크기를 가지거나 그 이상의 크기가 형성된다.
본 발명자들은 오직 양으로 하전되거나 음으로 하전된 미세입자만으로 응집시키는 것은 생체분자 흡착 후 문제가 있음을 확인하였다. 흡착 후, 미세입자는 생체분자가 쉽게 분리될 수 없는 균질한 현탁액을 형성할 것이다. 이런 이유에서, 원심분리 또는 미세여과가 입자로부터 생체분자를 분리하기 위해 요구된다. 그러나, 놀랍게도 반대로 하전된 미세입자를 병용하면, 더 작은 미세입자의 경우에도 흡착 후 응집물을 유지하고 단순한 침강에 의해서 생체분자로부터 쉽게 분리될 수 있다는 것을 발견하였다. 그러므로, 발명자들은 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 조합하면 더 작은 직경을 가진 미세입자의 사용이 가능해 진다는 예기치 않은 이점을 발견하였다. 더 작은 직경(1 ㎛ 미만)의 미세입자 사용은 부피당 더 많은 양의 생체분자를 처리할 수 있도록 한다는 점에서 유리하다. 게다가, 본 발명은 간단한 방법으로 조작할 수 있는 간단한 혼합-침강 장치의 사용을 제공한다.
응집물의 제거
일반적으로, 액체(생물학적 유체 또는 버퍼)로부터 응집물의 제거는 여과, 원심 분리, 침강 또는 다른 적절한 수단에 의해서 수행될 수 있다. 통상의 기술자는 유체로부터 응집물을 분리하거나 흡착하는데 사용될 수 있는 방법을 쉽게 선택할 수 있다. 응집물의 현탁은 예를 들어 버킷(bucket), 원심분리기(실험실 규모), 관형(tubular) 원심분리기, 디켄터(decanter) 또는 시험적 및 산업적 규모 운영을 위한 디스크 스택(disk stack) 원심분리기 중 어느 하나로 처리될 수 있다. 마찬가지로, 남아 있는 응집물은 여과, 침강 또는 추출에 의해서 제거가 가능하다. 탈착은 추출 디켄터, 혼합-침강기 또는 컬럼 추출기에 의해서 수행될 수 있다. 제거를 위한 다른 유용한 방법은 접선 유동 여과(tangential flow filtration), 딥 베드 여과(deep-bed filtration), 데드 엔드 여과(Dead End Filtration) 또는 필터 프레스(filter press), 누체 필터(nutsche filter)의 사용을 포함하는 방법에 의할 수 있다.
생체분자의 탈착
탈착은 본 발명의 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 탈착은 단백질과 같은 생체분자의 탈착이 가능한 버퍼(탈착 버퍼)에서 응집물을 재현탁함으로써 수행될 수 있다. 이것은 관형 혼합기 또는 교반기와 같은 다른 혼합 장치를 포함하는, 본 발명의 기술분야에서 알려진 수단을 사용함으로써 수행될 수 있다. 탈착은 또한 추출 디켄터, 혼합-침강기 또는 컬럼 추출기에 의해서 수행될 수 있다.
현탁액은 탈착을 위한 적절한 조건이 적용된다. 통상의 기술자는 응집물에 흡착된 생체분자를 탈착하기 위한 조건을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 통상의 이온 교환 크로마토그래피에서 사용되는 탈착 방법이 적용될 수 있다. 예를 들면, 탈착은 등전점 이하 또는 이상의 pH에서 용출되거나 증가된 염 농도에 의해 수행될 수 있다.
생체분자는 본 발명의 기술분야에서 알려진 방법에 의하여 더 정제되거나 농축될 수 있다. 이들은 예를 들면, 침전, 결정화 및/또는 소수성 결합 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), (슈도-친화 크로마토그래피(pseudo-affinity chromatography), 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피(anion or cation exchange chromatography) 및/또는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 구성되는 군으로부터 선택되는 크로마토그래피를 포함한다. 따라서, 바람직한 실시예에서 본 발명에 설명된 방법은 상기 기술된 침전 및/또는 크로마토그래피를 사용함으로써 생체분자, 특히 단백질을 정제 하고/하거나 농축하는 더 많은 단계를 포함한다.
마지막으로, 본 발명의 흡착제에 의해 흡착된 생체분자가 회수된다. 모든 문법 형태에 로 "생체분자를 회수하는 것"은 생체분자가 얻어지다, 수확되다, 달성되다, 받다, 획득되다가 포함된다. 생체분자는 플라스미드, 폴리뉴클레오타이드 또는 펩티드, 당화되거나 번역 후 수정된 단백질을 포함하는 단백질과 같은 발현 생성물일 수 있다. 생체분자는 예를 들면, 본 발명의 기술분야에 알려지고/지거나 본 발명에서 기술된 수단 및 방법에 의하여 분리되고/되거나 더 처리될 수 있다, 예를 들면 정제될 수 있다. 게다가, 용어 "생체분자를 회수하는 것"은 또한 바람직하게는 본 발명의 흡착제에 의하여 흡착이 가능할 정도로 숙주세포가 파괴되어 목적물이 방출되는 것, 그리고 생성물의 추가 정제 및/또는 농축이 가능해지는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 탈착 버퍼로부터 응집물을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 방법은 다음 단계로 수행될 수 있다:
- 예를 들면, 농도, pH 또는 염도를 조절함으로써 생물학적 액체를 얻고 선택적으로 제조하는 단계 또는 생물학적 액체를 희석하고,
- 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 생물학적 유체에 동시에 또는 별도로 첨가하고,
- 흔들거나 저어주고,
- 원하는 생체분자를 흡착/결합시키고,
- 입자가 응집물을 형성하도록 하고,
- 예를 들면, 침강, 원심 분리 또는 여과에 의해 생물학적 유체로부터 응집물을 제거하고,
- 액체의 불순물을 분리하여 제거된 응집물을 세척하고,
- 적절한 탈착 버퍼를 첨가하고,
- 흔들거나 저어주고,
- 원하는 생체분자를 미세입자로부터 탈착시키고,
- 예를 들면, 침강, 원심분리 또는 여과에 의해 탈착 버퍼로부터 응지물을 제거하고,
- 응집물에서 잔류 생체분자를 회수하기 위해 응집물을 세척하고,
- 응집물에서 생체분자를 탈착하는 단계.
생체분자(목적물) 생산하는 세포 배양
본 발명의 흡착제를 적용하기 전에, 본 발명에서 정의되고 기술된 것과 같이 생체분자를 얻는 방법은 생체분자(목적물), 바람직하게는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드 같은 발현물을 발현하는 것 같이 생산하는 (숙주)세포를 배양하는 단계를 포함한다. 숙주세포 내에서 또는 배지(혈청 또는 무 혈청)에서 용어 "세포 배양" 또는 "세포를 배양하는 것"은 배양용기에 세포를 시드하는 것, 부착배양의 경우 단일층을 형성할 때까지 배지에서 세포가 성장하는 것 또는 현탁 배양의 경우 단일층을 형성하자마자 충분한 세포 밀도가 달성되거나 유지되는 것 또는 현탁액내에서 세포를 유지하는 것을 각각 지칭한다. 배지에서 용어 "세포 배양" 또는 "세포의 배양"은 또한 상기 언급된 모든 단계가 무 혈청 배지에서 수행되는 것을 포함해서 전체 세포 배양 과정동안 어떠한 동물 혈청 생성물은 존재하지 않는다. 세포는 지수 공급(exponential feed), 또는 선형 또는 지속적 공급(linear or constant feed) 또는 다른 형태의 공급, 일괄 공급 배양(fed batch cultivation), 또는 고밀도 배양(high density cultivation)에 의해서 배양될 수 있다.
염기서열 및/또는 코딩된 폴리펩타이드는 세포에 대해서 이종이거나 아닐 수 있다. "이종", 이것은 다른 유전적 배경을 가진 세포 또는 기관으로부터 유래된 것이거나 자연적으로 발생한 상기 염기서열의 대응보다 다른 유전적 환경에 위치한 숙주세포에 대해서 동종인 것을 의미한다. 이것은 염기서열이 숙주와 동종이라면, 상기 숙주의 게놈에서 그것의 자연적 위치에 존재하지 않고 특히 다른 유전자에 의해 둘러싸여 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "세포"는 생체분자를 생산할 수 있는 세포를 지칭한다. 상기 세포는 본 발명의 방법 및 사용에 적용된다. 이 목적을 위해, 세포가 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드를 발현한다면, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 생산하는 염기서열이 세포내에 도입된다.
생체분자가 회수되는 세포는 원핵세포, 진핵세포 또는 그 각각 중 어느 하나가 될 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 방법에 적용된 세포는 포유류, 조류, 양서류, 물고기 세포 및 곤충 세포를 포함한 척추 동물 세포이다. 또한 그 세포로 포함되는 것은 진핵세포이다. 일반적으로 진핵세포는 인간 세포, 포유류 세포, 조류 세포 또는 곤충 세포이다. 세포는 또한 효모세포 또는 진균 세포를 포함한다. 그러나, 세포는 장내세균(e.g. E. coli) 또는 Lactobacteriaceae 또는 Bacillaceae 와 같은 그람 양성 박테리아의 세포를 포함하는 원핵세포인 것이 더 바람직하다. 그러나 가장 바람직하게는, 세포는 E. coli 이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 발현 생성물은 단백질 생성물이다. 본 발명에서 사용된 "단백질"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 보통 황을 포함하는 어떤 복합 유기 거대분자군과 하나 또는 그 이상의 아미노산 고리로 구성된 것을 지칭한다. 바람직한 단백질 발현 생성물은 폴리펩타이드이다. 따라서, 그 용어 "단백질"은 또한 단백질과 관련된, 단백질로 이루어진, 단백질로 구성된 또는 단백질에 관한 것을 의미한다. 본 발명의 더 바람직한 실시예에서, 생성물은 발현되고 생산된 목적 폴리펩타이드 일 수 있다. 생성물은 생물학적으로 활성을 가지는 것이 바람직하다. 단백질 생성물은 산성 또는 염기성일 수 있다.
발현 생성물은 염기서열의 전사 생성물 및/또는 번역 생성물이 될 수 있다. 바람직하게, 염기서열은 유전적으로 조작된 숙주세포에서 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 알려진 수단 및 방법에 의해서 세포에 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 생성물은 예를 들면, 플라스미드(plasmid), mini-circle DNA, 코스미드(cosmid), BAC, ssDNA 또는 dsDNA 서열 또는 RNA 서열 (ribozyme, antisense RNA, siRNA, iRNA, miRNA 등), 숙주세포에서 생성될 수 있는 모든 것을 포함하는 염기서열이 될 수 있다. 또한, 그것은 세포에서 전사된 RNA의 번역에 의해 생성된 폴리펩타이드가 될 수 있다.
"폴리펩타이드"는 단백질, 폴리펩타이드 및 그것들의 조각를 포함하고 상기 조각은 바람작하게는 생물학적으로 활성을 가지는 것이다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 일반적으로 약 10. 20 또는 30 이상의 아미노산의 길이를 가진 아미노산 폴리머로 지칭되어 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 당화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 반응을 통해서 번역 후 변경된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 Fc-융합, 알부민-융합과 같은 반감기 연장을 위한 융합 파트너, 또는 친화 크로마토그래피용 친화 태그로써 융합 파트너, 또는 관심있는 단백질의 N-말단을 변경하거나 생산을 증가시키는 융합 파트너로 융합된 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 용어 "펩타이드"는 일반적으로 약 30미만의 아미노산으로 이루어진 짧은 가닥의 아미노산을 지칭한다. 폴리펩타이드는 작용제 또는 길항제의 역할 및/또는 치료 또는 진단용으로 사용될 수 있다.
또한, 비록 미생물 및 효모 생성물로 또한 생산될 수 있지만 본 발명의 세포에서 발현된 폴리펩타이드는 포유류 유래일 수 있다.
포유류 폴리펩타이드 또는 단백질의 예로는 호르몬, 사이토카인(cytokines), 림포카인(lymphokines) 및 Fabs, 나노바디(nanobodies), dAbs, scFvs, 리셉터(receptors), 부착분자(adhesion molecules)와 같은 항체 및 효소뿐만 아니라 그들의 파편이 포함된다. 원하는 생성물의 비포괄적인 목록은 예를 들어, 인간 성장 호르몬(human growth hormone), (소 성장 호르몬(bovine growth hormone), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone), 난포 자극 호르몬 성장(follicle stimulating hormone growth), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone); 호르몬 분비 인자(hormone releasing factor); 지질단백질(lipoproteins); 알파1 항트립신(alpha-1-antitrypsin); 인슐린 A체인(insulin A-chain); 인슐린 B 체인(insulin B-chain); 인슐린 전구체(proinsulin); 칼시토닌(calcitonin); 글루카콘(glucagon); 레닌(rennin)과 같은 분자; VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자, 및 본 빌레프란트 인자(von Willebrands factor)와 같은 응고 인자(clotting factors); 단백질 C, 심방 나트륨이뇨성 인자(atrial natriuretic factor), 폐계면활성제(lung surfactant)와 같은 항 응고 인자(anti-clotting factors); 우로키나아제(urokinase), 인뇨(human urine) 또는 t-PA(tissue-type plasminogen activator)와 같은 플라스미노겐활성화인자(plasminogen activator); 봄베신(bombesin); 트롬빈(thrombin); 조혈 성장 인자(hemopoietic growth factor); 종양 괴사 인자-알파 및 -베타(tumor necrosis factor-alpha and-beta); 엔케팔리나아제(enkephalinase); RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증 단백질(human macrophage inflammatory protein, MIP-1-alpha); 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민(serum albumin); 뮬러 억제 물질(mullerian-inhibiting substance); 릴랙신(relaxin A- 또는 B-chain); 릴랙신 전구체(prorelaxin); 쥐 성선 자극 호르몬 관련 펩티드(mouse gonadotropin-associated peptide); DNase; 인히빈(inhibin); 액티빈(activin); 호르몬 또는 성장 인자용 리셉터; 인테그린(integrin); 단백질 A 또는 D; 류머티즘 인자(rheumatoid factors); 뼈 유래 신경 영양 인자(bone-derived neurotrophic factor, BDNF), neurotrophin-3,-4,-5,-6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 포함하는 성장인자, 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF)와 같은 신경 영양 인자(neurotrophic factor); 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF); aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, FGF-6와 같은 섬유 아세포 성장 인자(fibroblast growth factor); TGF-alpha 및 TGF-pl, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4, TGF-p를 포함하는 TGF-beta와 같은 변형 성장 인자(transforming growth factor, TGF); 인슐린 유사 성장 인자-1 및 -2(insulin-like growth factor-I 및 -II, IGF-I 및 IGF-11); des (1-3)-IGF-I(brain IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(insulin-like growth factor binding proteins); CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19과 같은 CD 단백질(CD protein); 적혈구 생성 촉진 인자(erythropoietin); 골유도 인자(osteoinductive factors); 항체독소(immunotoxins); 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP); 인터페론 알파, 베타 및 감마 와 같은 인터페론(interferon); M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF와 같은 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors, CSFs); IL-1 내지 IL-10과 같은 인터루킨(interleukins, ILs); 과산화물 제거 효소(superoxide dismutase); T 세포 리셉터(T-cell receptors); HER2와 같은 표면 막 단백질(surface membrane proteins); 부패 촉진 인자(decoy accelerating factor); 예를 들면, AIDS 껍질 부분과 같은 바이러스 항원(viral antigen); 운반 단백질(transport proteins); 수용체(homing receptors); 주소단백질(addressins); 조절 단백질(regulatory proteins); 항체(antibodies); 면역접합체(immunoadhesins)와 같은 키메라 단백질(chimeric proteins) 및 상기 기재된 폴리펩타이드의 어느 하나의 파편을 포함한다.
본 발명에서 바람직한 폴리펩타이드 및 단백질은 TGF-β, TGF-α, PDGF, EGF, FGF, IGF-I, DNase, t-PA 와 같은 플라스미노겐활성화인자, 조직인자 및 인자 VIII과 같은 응고인자, 릴랙신 및 인슐린과 같은 호르몬, IFN-y와 같은 사이토카인, TNF receptor IgG immunoadhesin(TNFr-IgG)와 같은 키메라 단백질 또는 이중 특이성 항체(bispecific antibodies), 카멜리드 항체(cameldid antibodies) 및 이들의 파면, VHH 도메인 항체, 도메인 항체와 같은 항체, anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-IgD 또는 anti-IgE와 같은 면역글루불린(immunoglobulins)과 같은 치료용 단백질이다. 바람직한 치료용 단백질은 본 발명에서 기술된 인간 항체와 같은 인간 유래 또는 "인간화" 단백질이다.
생성물이 폴리펩타이드라면, 폴리펩타이드는 태그될 것이다. 예를 들면, 바람직하게는 상기 폴리펩타이드로 분리 및/또는 정제시킬 수 있는 이종의 폴리펩타이드와 융합될 수 있다. 이종의 폴리펩타이드는 예를 들면, 히스티틴 태그(histidine tag), 플래그 태그(Flag-tag), 스트렙타비딘 태그(streptavidin tag), 스트랩 II 태그(strep II tag), 인테인(intein), 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein), IgA Fc portion, IgG Fc portion, 단백질 A(protein A) 또는 단백질(protein G)가 될 수 있다.
생성물이 어떤 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드라면, 상기 염기서열은 염기서열을 포함하는 상기 발현 생성물을 분리 및/또는 정제시킬 수 있는 이종의 염기서열과 융합될 수 있다. 예를 들면, 이종 염기서열은 상보적인 염기서열에 결합할 수 있다. 이에 따라, 상기 염기서열의 분리 및/또는 정제가 가능하다. 이종의 폴리펩타이드 또는 염기서열의 문맥에서 사용된 "이종의"는 폴리펩타이드 또는 염기서열이 목적하는 생성물을 발현하는 폴리펩타이드 또는 염기서열과 다른 것을 의미한다.
생성물이, 폴리뉴클레오타이드의 예로써, 플라스미드라면, 상기 플라스미드는 유전자 치료 또는 DNA 백신에 유용하거나 상기 목적하는 생성물과 같이 치료용 단백질을 코딩할 수 있다.
반면에, 세포는 바이러스를 발현할 수 있다. 예를 들면 상기 세포는 말하자면, 바이러스가 복제 및/또는 전파되는 적절한 환경을 제공하는 생산 세포주 역할을 수행한다. 따라서, 생성물은 바이러스가 될 수 있다. 실제로, dsDNA 바이러스(e.g. Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses), ssDNA 바이러스(e.g. Parvoviruses), dsRNA 바이러스(e.g. Reoviruses), (+) ssRNA 바이러스(e.g. Picornaviruses, Togaviruses), (-) ssRNA (e.g. Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses), ssRNA-RT 바이러스(e.g. Retroviruses) 및 dsDNA-RT 바이러스(e.g. Hepadnaviruses)와 같은 어떠한 바이러스도 본 발명의 방법에 의해서 회수될 수 있다. 바이러스 복제는 숙주세포에 감염 또는 전파 과정동안 바이러스의 형성을 설명하는데 사용하는 용어이다. 바이러스 관점에서, 바이러스 복제의 목적은 이러한 종류의 생산 및 생존을 위한 것이다. 풍부한 게놈 카피를 생성하고 이들 카피로 바이러스를 조립함으로써, 바이러스는 계속적으로 새로운 숙주에 감염할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 적절한 숙주 세포로부터 생성된 바이러스는 라이시스(lysis) 또는 버딩(budding)에 의해 숙주세포에서 필수적으로 탈거하지 않을 수 있다.
전에 언급했던 것과 같이, 생성물은 바이러스 일 수 있다. "바이러스"는 "천연" 바이러스 및 "재조합" 바이러스를 포함한다. "천연"은 유전적 조작(임상분리)없이 자연으로부터 분리된 바이러스 또는 자연에서(자연적으로 나타나는) 발견되는 바이러스 또는 전형적인 재조 바이러스, 예를 들면, 예방 접종 목적에서 사용되는(약화된 바이러스)를 의미한다.
그러므로 본 발명은 산업적 규모로 쉽게 적용될 수 있는 빠르고, 효율적이며 저비용 방법을 제공한다.
양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도
다른 측면에서, 발명은 또한 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도와 관련된다. 특히, 본 발명은 분자, 바람직하게는 생체분자, 더 바람직하게는 단백질을 흡착하기 위한 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도를 제공한다. 상기 단백질은 바람직하게는 세포 균질액 또는 원하는 단백질을 발현하고 분비하는 세포의 액체 배양 배지로부터 기인한다. 동일한 실시예가 소수성 미세입자에도 적용될 수 있다.
본 발명의 수단 및 방법의 맥락에서 설명된 실시예는 상기 설명된, 준용된 용도에 동일하게 적용될 수 있다.
키트
본 발명은 또한 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자 또는 각각의 발명 및 상기 미세입자를 현탁하는 선택적 수단을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 예를 들면 미세입자를 포함하는 원심분리병을 포함할 수 있다.
미세입자는 파우더 형태로 될 수 있다. 또한, 슬러리 또는 현탁액과 같은 액체 배지 형태로 될 수 있다. 미세입자는 바람직하게 겔 형태로 존재하지 않는다. 게다가, 키트는 탈착 버퍼를 포함하는 분리병을 포함할 수 있다.
본 발명의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자는 혼합물 또는 별도로 제공될 수 있다. 후자에서, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자는 각각 생물학적 유체에 첨가된다. 그것들은 각각이 생물학적 유체에 첨가될 때까지 서로 접촉되지 않는다. 그러므로 본 발명은 또한 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 생물학적 유체를 포함한다.
실시예
실시예 1 이온 교환 수지로부터 미세입자의 제조
다른 형태의 이온 교환 수지를 Sigma Aldrich 및DIAION으로부터 구입하였다.
다음의 음이온 교환 수지가 사용되었다: Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-743, Dowex 1X2-100, Dowex 1X2 -400, Dowex 1X8-100, Marathon A2, DIAION SA20A, DIAION SA10A, DIAION SA312.
다음의 양이온 교환 수지가 사용되었다: Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, Marathon C, Marathon MSC, DIAION PK216, DIAION SK110.
수지는 약 30분 동안 세라믹 막자사발로 손수 습식 분쇄(30분 동안 20 g)되었다. 분쇄된 수지를 물(50 ml)에서 현탁하였다. 약 96시간 후에 수지 침전물의 상청액을 튜브로 옮겼다. 튜브당 약 200 ㎕ 수지가 모일 때까지7000 rcf(상대 원심력)으로 15분 동안 1 ml씩 상청액을 원심분리하였다. 2 M NaCl(1.5 ml)에서 1분 동안 원심분리(7000 rcf)하여 수지를 재현탁하였다. 1분 동안 원심분리 후 펠렛을 제거하였다 (excepting Amberlite IRA-743). 상청액은 옮겨서 15분 동안 다시 원심분리하였다(7000rcf). 15분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하였다. 미세입자(약 200 ㎕)를 2 M NaCl에서 원심분리하였다. 미세입자(약 150 ㎕) 및 다른 분쇄된 수지(50 - 200 ㎕)는 물과 1:4 비율로 재현탁하였고 수지를 튜브에 50 ㎕씩 옮겼다.
수지의 일부를7000 rcf로 원심분리하고 상청액은 제거하고 수지는 20배 부피(약 1 ml)의 수용성 세척용액으로 재현탁하였다. 용액에서 배양시간은 30분이었다.
세척 조건:
- 1x 50% EtOH (유기 잔유물의 희석)
- 3x deionized water (EtOH의 희석)
- 중성 pH에 가깝도록 체크
- 탈이온 수(약 70% v/v)로 미세입자 및 분쇄된 수지의 재현탁
- 특정 실험에 사용되는 알맞은 버퍼로 수지를 평형화시켰다.
광학현미경을 통한 입자 크기 결정
제조된 미세입자의 입자크기는 소프트웨어 기반의 크기 결정을 사용하는 광학 현미경에 의해서 결정되었다. 분쇄된 물질 및 미세입자의 입자 크기는 상대적 직경 측정에 의해 1000배 배율에서 측정되었다. 크기 분포는 1% v/v에서 1000-5000 입자의 직경을 비교함으로써 계산되었다. 결과를 표 1에 나타내었다.
타입 음이온 교환기 리간드
d (mm) q BSA
Amberlite IRA-400 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.3-1.2 0.3±0.11
Amberlite IRA-743 Methylglucamine 0.5-0.7 6.1±0.25
Dowex 1X2-100 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.1-0.5 0.5±0.18
Dowex 1X2 -400 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.04-0.07 0.8±0.01
Dowex 1X8-100 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.1-0.5 0.4±0.03
Marathon A2 -N+-(CH2-CH2OH)-(CH3)2 (Type2) 0.4-0.6 0.2±0.02
DIAION SA20A Dimethylethanolamine 0.3 - 1.18 n.a.
DIAION SA10A Trimethylamine 0.3 - 1.18 n.a.
DIAION SA312 Trimethylamine 0.3 - 1.18 n.a.
타입
양이온 교환기 		리간드
d (mm)
Dowex 50 WX2-100 -SO3 - n.a. n.a.
Dowex 50 WX8-100 -SO3 - n.a. n.a.
Marathon C -SO3 - 1.2 n.a.
Marathon MSC -SO3 - 1.2 n.a.
DIAION PK216 Sulphonic 0.3 - 1.18 n.a.
DIAION SK110 Sulphonic 0.3 - 1.18 n.a.
음이온 교환기 Dowex 1X8-400에 의한 대표 도면 및 평가를 도 1a-b에 나타내었다. 도 2와 같이, 다른 모든 수지를 이용하여 비슷한 입자크기 범위를 얻었다.
형태
AFM 측정이 MARATHON A2 및 MARATHON MSC에 의해 제조된 미세입자들의 시각화를 위해서 수행되었다. 샘플은 에탄올로 세척하고 현미경 글라스 슬라이드에서 건조시켰다. AFM 측정에 의해 도출된 자료를 시각화하고 분석하기 위해서 오픈소스 소프트웨어 Gwyddion(v 2.30)가 사용되었다. 결과는 도 3-4에 나타내었다. 분쇄된 미세입자는 형상이 불규칙적이고 기공(mesopores)이 발견되지 않았다.
실시예 2. NETZSCH사의 실험실용 분쇄기를 사용한 미세입자의 제조
Marathon MSC 수지는 NETZSCH LabstarLS1 mill을 사용하여 습식 분쇄하였다. 수지 2 kg을 물 3 kg과 혼합하였다. 약 200분 후, 평균직경(d50)이 1 ㎛에 도달하였다. 분쇄하는 동안 동적관산란법(dynamic light scattering)으로 크기분포를 분석하였다.
MARATHON A2 수지는 NETZSCH Labstar LS1 mill 을 사용한 습식분쇄에 대한 더 높은 기계적 안정성 때문에 12시간 동안 세라믹 막자사발로 먼저 분쇄되었다.
도 5a-b에서, Marathon MSC 의 평균 직경(d50)뿐만 아니라 크기 분포는 분쇄 공정 시간에 따라 도시되었다. 분쇄되는 동안 크기 분포는 넓게 시작해서 200분부터 좁아지고 약 300분에 단일상이 되었다. 이 단계에서 평균 직경은 약 300 nm이다. Labstar LS 1 mill 로 전체 평균 직경 1-2 ㎛로 Marathon MSC의 분쇄는 항상 적어도 이봉분포(bimodal distribution)를 나타낸다. 200분에서 1-2 ㎛의 평균직경(d50)을 가진, 전반적으로 1 ㎛의 직경을 가지는 입자의 비율은 약 30%이다. 1 ㎛ 보다 더 작은 입자는 약 55%를 차지하는 반면 2 ㎛ 내지 5 ㎛의 평균직경을 가지는 입자는 약 15%를 차지한다. 백분율은 각각의 부피 분율(v/v)의 비율로 주어진다. Labstar LMZ(2 mm beads)로 분쇄하기 전에 평균직경이 4 ㎛가 되도록 LME30 mill을 가진 Marathon A2(5 mm beads)로 분쇄하여 1 ㎛의 평균직경을 가지는 단일상 분포를 만든다.
실시예 3 미세입자의 흡착 반응속도
Dow 로부터 얻은 파쇄형 수지 표본을 7000 rcf로 원심분리하고 상청액은 버리고 수지는 10배 부피(1ml) 의 수용성 세척액으로 재현탁하였다. 용액에 배양 시간은 30분이다. 세척은 다음에 의해 수행되었다:
- 1x 50% EtOH (유기 잔유물이 희석)
- 3x 탈이온수 (EtOH의 희석)
- 1x 0.5M NaOH (OH-로 음이온의 치환)
- 4x 탈이온수 (간질액(interstitial fluid)에서 음이온 희석)
- 탈이온수(약 20% v/v)에서 미세입자의 재현탁.
흡착 반응속도는 배치 흡착에 의해 측정되었고 매우 짧은 시간 간격으로, 구별하여 샘플을 도시하였다. 트립신 억제제(Trypsin inhibitor, TI) 및 IgG 의 저장액(Stock solutions)은 20 mM Tris, pH 7.5에 약 5 mg 단백질/ml로 조절되었다. 또 다른 저장액은 0.1 및 0.5 mg 단백질/ml의 농도까지 버퍼로 각각의 단백질을 희석하였다. 20 mM Tris, pH 7.5에 4% v/v까지 미세입자를 희석하였다. 미세입자의 용량을 측정하고 첨가된 미세입자의 양은 평형상태에서 단백질양의 절반을 흡착하도록 조절하였다. 실험의 최종 전체 부피는 10 ml 였다. 이 부피를 5 ml씩 두 반쪽으로 나누었다(단백질을 포함하는 절반과 미세입자를 포함하는 절반). 상기 두 반쪽은 다른 시간 간격으로 배양이 진행된 SpinX 원심분리 튜브에서 0.25 ml씩 혼합되었다. 정해진 시간 후, 미세입자에 단백질의 흡착을 정지시키기 위해서 혼합물을 여과하였다. 흡착된 단백질의 양은 마이크로 웰 플레이트(micro well plates)에서 280 nm 에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
도 4에 나타난 것과 같이, 흡착 반응속도는 극히 빨랐다. 10초 안에 평형 용량의 거의 90%에 도달하였다. 그러므로, 단백질 종류에 따른 차이는 실험적으로 관찰할 수 없었다. 적절한 흡착 모델을 사용하여 양을 결정하는 것도 불가능하였다. 유사한 실험조건을 사용하는 통상의 크로마토그래피 물질은 6시간까지 30분간의 기간 전에는 평형에 도달하지 않았음을 보여준다. 이것은 미세입자가 기공이 없다는 SEM 측정 결과를 뒷받침한다.
실시예 4. 평형 용량
실시예 4.1
실시예 1에서 제조된 미세입자는 트립신 억제제(trypsin inhibitor, TI), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 면역글루불린 G (IgG), 및 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)를 흡착하기 위해 사용되었다. 평형 용량 및 흡착 등온선(adsorption isotherms)이 측정되었다. 트립신 억제제, 소 혈청 알부, 면역글루불린 G 및 녹색 형광 단백질이 약 1 mg 단백질/ml로 조절되었다. 흡착 조건: 20 mM Tris, pH 8.0 또는 20 mM 아세트산 나트륨(NaAc), pH 6.0. 분쇄된 수지(10% v/v)는 1 ml 단백질 용액에 각각 첨가되었고 약23℃에서 20 rpm으로 회전시키면서 배양되었다. 30분 후에 1 ml의 샘플이 튜브로부터 획득되었고 0.2 ㎛는 여과되었다. 흡착된 단백질의 양은 마이크로 웰 플레이트에서 280nm에서 흡광도를 측정하여 결정되거나 GFP인 경우는 형광에 의해서 결정되었다.
도 6은 트립신 억제제(도 6a) 및 BSA(도 6b)에 대한 다른 음이온 교환 미세입자들 간의 평형 용량을 나타낸다. DIAION SA20 및 DIAION PA312는 거의 같은 용량임을 보여주는 반면에, DIAION SA10의 용량은 더 낮다.
도 7은 라이소자임(도 7a) 및 다중항체 IgG(도 7b)에 대한 다른 양이온 교환 미세입자들 간에 평형 용량을 나타낸다. NuviaS가 통상적인 비드 물질을 대표하는 물질로 포함된다. 두 양이온 교환기 DIAION PK 216 및 DIAION SK110은 Dow 수지(40-100 mg/ml) 및 Nuvia S(약 150 mg/ml)와 비교하여 상당히 더 낮은 용량(15-25 mg/ml)을 가진다.
도 8은 투석여과된 GFP 균질액으로부터 GFP에 대한 다른 음이온 교환기 간의 평형 용량을 나타낸다. 용량은 Marathon A2, DIAION SA20 및 DIAION PA312(40-50mg GFP/ml)가 거의 동일한 반면, DIAION SA10는 낮은 용량을 가진다(~ 20-25 mg/ml).
실시예 4.2
MARATHON MSC 및 NuviaS (Biorad)의 평형 용량은 높은 염 농도에서 측정되었다(약 3.5 mS/cm 내지 약 17 mS/cm의 전도도). NuviaS와 달리, MARATHON MSC에 대한 다중항체 IgG의 평형 용량은 염 농도의 전체 범위에 걸쳐 거의 일정하게 유지되었다. 이것은 그러므로 분쇄된 미세입자가 세포 배양 상청액으로부터 lgG를 직접 흡착하는데 최적이라는 것을 보여준다. 도 9는 NuviaS 수지(도. 9a) 및 MARATHON MSC 미세입자(도 9b)에 대한 흡착 버퍼의 전도도에 따라 도시된 다중클론 lgG의 평형 용량을 보여준다.
실시예 5 흡착 및 입자 크기
평형 용량에 대한 입자 크기의 효과를 조사하였다. 다른 크기의 미세입자를 얻기 위하여 역류(counter current flow) 또는 분별 원심분리(fractionated centrifugation)를 통해서 미세입자를 제조하였다.
도 10에서, 다중클론 IgG에 대한 Marathon MSC의 용량이 입자 크기(d50) 따라 도시되었다. 도시된 것과 같이, 1 ㎛ 보다 작은 미세입자는 더 높은 용량을 가질 수 있지만, 용량은 평균 직경이 2 ㎛부터 급격히 감소한다. 그러나, 이러한 제한은 반대되는 전하로 하전된 미세입자를 포함함으로써 해결할 수 있다(실시예 7참고).
실시예 6 대장균 균질액에서 GFP의 흡착/탈착
대장균 균질액에서 재조합 GFP의 배치 흡착은 다음 단계에 의해 MARATHON A2를 사용하여 수행되었다.
세포 파괴:
대장균 현탁액을 밤새 4 ℃로 냉각시키고 15분 동안4000 rcf, 4 ℃로 원심분리 하였다. 상청액은 버리고 세포의 펠렛은 165 g wet/kg(~30 g d.m. /kg)로 50 mM Tris, pH 7.5, 50 mM NaCl 조건에서 재현탁하였다. 세포는 두 곳에서 1000 ba의 고압 균질기로 파괴되었다. 균질액은 30분동안 4 ℃에서 10000 rcf로 원심분리하고 상청액은 0.2 ㎛로 여과하였다. 균질액은 50 mM Tris, pH 7.5, 50 mM NaCl와 1:5 비율로 희석하고 4 ℃로 저장하였다.
흡착/탈착:
배치 흡착/탈착은 평균직경이 1.5 ㎛ 인 분쇄된 Dowex Marathon A2 (MA2, Cl 형)에 대한 작은 규모의1 ml v 에 ~1 mg/ml C GFP로 튜브에서 수행되었다. 균질액의 시작 전도도는 ~9 mS/cm이었다. 1 ml의 균질액에 100 ㎕, 50% v /v의 MA2가 첨가되었다. 샘플은 적어도 15분동안 회전 혼합기(rotatory shaker)로 배양되었다. 이후에 샘플은 5분(흡착) 또는 15분(탈착)동안 7000 rcf로 원심분리 되고 상청액은 다른 튜브로 옮겨졌다. 1 ml의 버퍼가 펠렛에 첨가되고 수지는 강한 혼합에 의해 현탁되었다.
프로토콜:
흡착
- 1 ml 균질액
- 1 ml 50 mM Tris, pH 7.5
용출
- 1 ml 50 mM Tris, pH 7.5, 0.5 M NaCl
재생
- 1 ml 50 mM Tris, pH 7.5, 1.0 M NaCl
- 1 ml 50 mM Tris, pH 7.5, 2.0 M NaCl
세척
- 3x 1 ml ddH2O
모든 단계는 수지 및 튜브의 교체없이 세번 반복되었다(pass 01 - 03).
분석
녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP), 숙주 세포 단백질(host cell protein, HCP) 및 ds DNA는 형광(micro well plates), SDS-Page(은(Silver) 및 쿠마시(Coomassie) 염색법)의 농도 및 피코 그린 어세이(Pico green assay, micro well plates)에 의해서 정량되었다.
GFP 측정:
샘플은 마이크로 웰 플레이트에서 1:2, 1:4, 1:8 및 1:16 비율로 희석되었다. 형광은 485 nm 여기(excitation) 및535 nm 방출(emission)에서 측정되었다. 농도는 18000FLU(약 80 ㎍ GFP/ml )까지 GFP 표준 눈금으로 측정하였다.
DsDNA(double-stranded DNA) 측정:
샘플은 마이크로 웰 플레이트에서 1:2, 1:4, 1:8 및 1:16 비율로 희석되었다. dsDNA 는 형광은 485 nm 흥분 및535 nm 방출에서 형광을 측정함으로써 피코그린 어세이 로 결정되었다. 농도는 10000FLU(약 10㎍ dsDNA /ml )까지 람다(lambda) dsDNA 표준 눈금으로 측정하였다.
엔도톡신(endotoxins) 측정:
엔도톡신은 endpoint fluorometric analysis (PyroGene, rFC Endotoxin Detection System, Lonza)에 의해 측정되었다.
HCP의 측정:
전기영동 샘플은 SDS Sample Buffer 4x(25%), 2 M DTT (10%)로 희석되고(65%) 10분동안 100 ℃ 로 가열하여 제조된다. 전기영동을 MES - SDS 러닝 버퍼(running buffer)로 NuPage 10-20% 아크릴아마이드 겔(200 V, 400 mA, 50분)에서 수행하였다. 단백질은 10분동안 산 메탄올 용액으로 겔에 고정화되고 Coomassie - Bismarkbraun (Choi J-K, Yoon S-H, Hong H-Y, Choi D-K, Yoo G-S (1996) Anal Biochem 236:82)으로 염색되었다. 염색의 광학밀도는 농도계 분석 및 단백질 각 밴드를 계산하여 측정하였다. 모든 다른 단백질을 대표하는, GFP의 순도 및 HCP의 양은 이 분석에 의해서 측정된다.
MARATHON A2미세입자에 대한 높은 염 농도에서 비 변성 재생 후 배치 흡착/탈착의 반복(3 번; Pass 01-03)이 연구되었다. 그 결과를 도 11a-c에 나타내었다. GFP 및 HCP의 결합 용량은 회차에 따라 상당한 변화가 없는데 반하여, ds DNA의 결합 용량은 1회차에서 3회차까지 점차적으로 감소하였다. 도 11은 1회, 2회 및 3회차의 흡착, 용출 및 재생 후에 분쇄된 DOWEX MATATHON A2 (MA2)로부터 GFP, HCP 및 ds DNA의 회수률(%)을 보여준다.
미세입자의 용출 분획물은 거의 100% GFP 회수율을 보여주는 동시에 약 60-70%의 HCP가 제거됨을 보여주었다. DsDNA는 용축액에서 발견되지 않았다(ds DNA는 NaCl> 1 M의 높은 염 농도에서 회수되었다). 미세입자의 결합 용량은 2 M NaCl 로 재생시킴으로써 완전히 복원시킬 수 없었다.
흡착/용출 실험 동안 상청액의 엔토독신 농도를 측정하였다. 흡착 조건은 20 mM Tris pH 7.5 및 100 mM NaCl이었다. 용출은 20 mM Tris pH 7.5로 수행되었다. 여과된 세포 균질액은 20 mM Tris pH 7.5 100 mM NaCl 로 1:20비율로 희석되었다. 그 결과 GFP 농도는 0.5 mg/mL이었다. 흡착 및 용출 동안 100 ㎕ MARATHON A2 미세입자 (MA2)로부터 엔도톡신의 회수는 도 12에 도시하였다. 5 log 감소가 1000 mM NaCl 염 수준까지 진행되었다. 2 M NaCl로 재생은 수행되지 않았다.
실시예 7.1 다중클론 IgG 의 흡착
다중클론 IgG은 pH 및 염 농도(pH 5.0 및 6.0; 50 mM 내지 100 mM NaCl)를 달리하여 MARATHON MSC에 흡착시켰다. 단백질 농도는 0.3 mg/mL 및 1.3 mg/mL 사이에서 변화시켰다. MARATHON MSC가 실시예 4에 설명된 것과 같이 다중클론 IgG를 흡착하는데 사용되었다. 전체 고형분 농도는 0.5 % 및 2 % 사이에서 변화시켰다. IgG 농도는 0.2 mg/mL 및 1.3 mg/mL사이에서 변화시켰다. 흡착 조건은 20 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0 또는 20 mM MES, pH 6.0 중 하나였다. 염화나트륨 농도는 50 mM 또는 100 mM 중 하나였다. 용출 조건은 20 mM 인산 나트륨, pH 7.0 및 1 M NaCl이었다. 침강은 혼합탱크(EasyMax, Mettler Toledo)에서 수행되었다. 침강 행동은 photocentrifuge (LumiSizer, L.U.M GmbH, Berlin)로 측정되었다.
응집물은 흡착 단계 후 형성된다. 샘플은5 mL Pipettes (최소 팁 직경 3 mm)로 획득되었다. 2 % 고형분 농도에서 응집된 MARATHON MSC의 일반적인 예를 도 13a에서 나타내었다.
MARATHON MSC에 MARATHON A2의 추가(Two Resin System; TRS)가 형성된 응집물의 유체역학적 직경에 미치는 영향 및 침강 속도(평균 290상대 원심력)의 정규 분포가 추가로 측정되었다. 도 13b는 MARATHON A2 와 MARATHON MSC의 부피비에 따른 유체역학적 직경을 10% 백분위(percentile)(플락의 90%가 더 커짐)의 박스플랏(boxplot)으로 나타내었다. 침강 속도(평균 290상대 원심력)의 정규 분포에 MARATHON MSC에 10% MARATHON A2첨가의 효과 및 세 파라미터의 정규 곡선의 피팅 파라미터를 추가로 측정하였다. 도 14a는 고정된 정규 곡선으로 응집된 MARATHON MSC 미세입자의 속도 분포 그래프를 보여준다. 응집은 흡착된 다중클론 IgG 단독(원, 빨간 점선) 및 10 % MARATHON A2(세모, 녹색선)를 추가하여 수행하였다. 평균 침강 속도는 150 ㎛/s +/- 39.0 에서 2874 ㎛/s +/- 580까지 증가하였다.
MARATHON A2를 흡착 후 첨가하였다. 데이터는 photo centrifuge(LumiSizer, L.U.M GmbH, Berlin)로 기록하고 Software SepView(LumiSizer, L.U.M GmbH, Berlin)로 분석하였다. Stokes Law이 유체역학적 직경을 계산하는데 사용되었다. 밀도가 1.5 g/mL 로 계산되었다. 플랏팅(Plotting) 및 피팅(fitting)이 각각 software matplotlib 및 scipy으로 수행되었다. 수염이 1.5배 사분범위로 그려졌다. 그러므로 발명자들은 놀랍게도 10 % MARATHON A2를 첨가함으로써, 크기 순서로 유체역학적 직경이 증가함을 발견하였다. 유체역학적 직경의 중앙값은 0.7 ㎛에서40 ㎛까지 증가했다. 유체역학적 직경은 다양한 조건에서 변화한 반면에, 조건이 일정하게 유지(0.2 비율)된다면 정확한 범위로 유지되었다.
반대로 하전된 미세입자로 응집은 단백질 흡착 전 또는 후에 반대로 하전된 미세입자를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 정전기적 상호작용 때문에 큰 응집물이 형성되었다.
MARATHON A2 및 MARATHON MSC 사이에서 형성된 응집물은 원심분리 튜브를 교체하여 쉽게 재현탁될 수 있다.
응집물이 흡착 단계 후에 형성되었다면, MARATHON A2 양은 바람직하게는 20% 내지 30% 미만의 MARATHON A2이라는 것을 발견했다. 그 외의 MARATHON A2 입자는 응집되지 않은 채로 남아있을 것이다.
pH 6.0 이하 및 100 mM NaCl에서 2분 동안 응집하는 것이 다중클론항체 IgG, MARATHON MSC 및 10% MARATHON A2에 대한 바람직한 조건(침강 속도 측면에서)을 나타낸 것으로 보인다. 미세입자의 크기는 0.1 ㎛ 내지 2 ㎛ (d50)일 수 있다. 이와 같은 조건에서, 높은 표면적 및 단순한 침강 거동이 함께 달성될 수 있다.
실시예 7.2 분쇄된 Marathon MSC 및 분쇄된 Marathon A2를 사용하여 CHO 세포 브로스(broth)로부터 IgG의 정제 및 회수
TRS를 적용하는데 있어서 낮은 선택성을 극복할 수 있다(IgG의 흡착 전 또는 후에 분쇄된 Marathon MSC에 분쇄된 Marathon A2의 첨가). 예를 들어 양으로 하전된 단백질(IgG)이 CIEX 수지로 포집되고 그 다음 상기 수지가 AIEX 수지로 응집된다면, DNA 또는 HCP와 같은 불순물은 또한 결합될 것이고 결국 목적하는 단백질과 함께 용출될 것이다. 이러한 효과는 CHO 세포 상청액으로부터 포집된 IgG 와 DNA의 경우에서 관찰될 수 있다. IgG는 이온 교환기에 높은 친화력을 가지므로 높은 염 농도(1 M salt like NaCl)에서만 용출된다. 불행하게도 DNA가 도 14b가 기술하는 과정으로 1 M 염 농도에서 함께 용출될 것이다. 세포 상청액의 pH 는 2 M HCl을 사용하여 6.0으로 조절하였다. 그 다음 약 80㎕ 의 50%(v/v 충전층(packed bed)) Marathon MSC 현탁액이 2 mL 세포 상청액에 첨가되었다. 2 분 후 20 rpm의 로토리 쉐이커(rotary shaker)에서 2분 후 8 ㎕ 내지 40 ㎕의 Marathon A2 (v/v 충전층)가 첨가되었다. 달리 말하면, Marathon MSC에 대한 Marathon A2의 부피 비는 10% 내지 50%이다. 모든 미세입자는 초순수(ultra pure water)로 현탁되었다. 응집된 미세입자는 5분 동안 1000rcf로 원심분리되어 분리되었다. 펠렛은 0.5 mL의 50 mM 인산 버퍼(phosphate buffer), pH 7.0로 재현탁되었다. 미세입자는 5분 동안 1000 rcf로 원심분리되어 분리되었다. 용출은 1 M NaCl를 포함하는 0.5 mL의 50 mM 인산 버퍼, pH 7.0를 사용하여 수행되었다. 모든 경우에서, CHO 세포 상청액의60-80% DNA는 IgG와 함께 용출되었다.
분쇄된 Marathon MSC/ 분쇄된 Marathon A2에 IgG의 흡착 전에 선택성의 손실을 막기 위해, CHO 세포가 AIEX 미세입자로 응집되었다. 그러고 난 후 상기 세포는 쉽게 분리될 수 있다. 침강시키거나 수분내에서 5 g 내지 50 g의 상대 원심력으로 원심분리하여 응집된 세포를 분리하는 것이 가능하다. DNA 및 다른 음으로 하전된 단백질과 같은 불순물은 AIEX 수지에 결합될 것이다. 도 14c의 흐름도는 이 방법을 설명한다. 350 ㎕의 50 %(v/v 충전층) Marathon A2 현탁액이 10 mL의 CHO 상청액에 첨가된다. CHO세포의 선택량 이하의 응집은 불완전하고 분리 효율을 감소시켰다. 형성된 응집물은 그 다음 5 내지 50 rcf의 상대 원심력으로 원심분리하여 분리되었다. IgG의 포집 및 용출은 이전 문단에서 기술된 것과 같이 수행되었다.
분쇄된 Marathon A2 로 세포의 응집 후 얻어진 세포 상청액은 거의 자유 DNA이고 동시에 약 60%의 숙주 세포 단백질이 세포 포집 단계 동안 분리되었다. 전체로, 87% 이상의 숙주 세포 단백질이 분리될 수 있다. 결과를 표 2에 정리하였다.
세포 응집이 없는 상청액 세포 응집 후의 상청액 IgG 용출 후의 상청액
IgG [mg/mL] 1.0 1.0 5 or higher
DNA [ng/mL] 1800 15 below LOQ
HCP [㎍/mL] 155 58 < 20
표 2는 도 3에 따라서 포집 및 용출되는 동안 IgG, DNA 및 숙주 세포 단백질의 농도를 측정한 것이다. 농도는 다음의 방법에 따라 측정되었다: IgG: 280nm로UV 검출기를 사용하는 SEC 크로마토그래피, DNA: 피코그린 어세이(Invitrogen), 숙주 세포 단백질: HCP - ELISA (Cygnus). 용출은 1M NaCl를 포함하는 PO4 버퍼를 사용하여 수행하였다.
IgG 의 용출
IgG를 용출하는 것은 Marathon MSC에 대한 높은 친화력 때문에 어려울 수 있다. 이온 교환기에 대한 용출 이온의 친화력이 높을수록, 완전한 회수를 위해서 더 적은 양이 필요하다. 1M KCl를 사용하면 1.5 M NaCl를 사용하는 효과와 비슷하다. 95% 이상의 IgG가 1M KCl를 포함하는 20 mM PO4 버퍼, pH 7.0를 사용하여 회수될 수 있다. Marathon MSC 및 단일클론항체 IgG를 사용한 용출 실험의 결과가 도 14d에 도시되었다.
실시예 8 통상적으로 이용하는 미소구체( Microspheres )와의 비교
분쇄된 Marathon A2 및 Marathon MSC와 유사한 작용기를 가지는 양이온 교환기 CIEX(Polysciences Polybead® Sulfate Microspheres 1.00㎛) 및 음이온 교환기 AIEX 미소구체(Estapor® Microspheres White Functionalized Microspheres K6-100)의 흡착용량을 비교하였다. 입자 크기는 1000x 배율로 광학 현미경을 통해서 측정된다. 제타포텐셜(Zeta potential)은 ddH20에서 Malvern Zeta Sizer Nano series 장비로 동적광산란법(dynamic light scattering)에 의해 측정되는 <0.1mS/cm의 전기영동 이동성(electrophoretic mobility; Smoluchowski formula에 기초)으로 측정되었다.
도면에서 나타나는 것과 같이, 이러한 미소구체는 크기(도 15)와 제타 포텐셜(도 16)이 유사하다.
GFP 결합 용량이 AIEX 미소구체 및 분쇄된 Marathon A2에 대해서 측정된 반면에, 다중클론항체 IgG 결합 용량은 CIEX 미소구체 및 분쇄된 Marathon MSC에 대해서 측정되었다. 흡착 조건은 GFP 및 IgG에 대해서 각각 50 mM TRIS, pH 8.0 및 50 mM MES, pH 6.0이다. 평형 단백질 농도는 약 0.1 mg/ml 수지이다.
실시예 4에 기재된 것과 같은 조건이 AIEX(양으로 하전된 미세입자)에 대한 GFP의 결합 용량 및 다중클론항체 IgG의 결합 용량을 측정하기 위해 사용되었다.
분쇄된 미소구체는 크기면에서(도 15 참고) 유사하고 미소구체에 대한 유사한 제타 포텐셜을 가지는 반면에, 그들의 결합 용량은 통상적으로 이용되는 미소구체보다 훨씬 높음을 확인할 수 있다. 도 17는 분쇄된 미세입자의 단백질 결합 용량이 통상의 미소구체보다 월등함을 보여준다.
실시예 9 소수성 미세입자
소수성 미세입자의 제조
흡착형 수지는 DOW에 의해 제공된다: Amberlite XAD4, Amberlite XAD7HP 및 Amberlite XAD761는 Sigma Aldrich, Vienna, Austria, 2011로부터 구매했다.
수지는 전기구동, 세라믹 코팅된 막자사발로 밤새(12시간동안 20g) 분쇄하였다. 분쇄된 수지는 물에서 현탁하였다(~10% v/v 및 ad. 50ml). 상청액은 30분 동안 4000x g (평균 상대 원심력)로 원심분리하였다. 수지는 1분 동안(4000x g) 원심분리된 2 M NaCl (50ml)로 재현탁하였다. 1분 원심분리 후 펠렛은 폐기하였다. 상청액은 옮겨서 다시 30분동안(4000x g) 원심분리하였다. 상청액은 제거하였다. 분쇄된 수지는 물에서 (1:2) 재현탁하고 튜브로 옮겼다. 수지는 4000x g로 원심분리하고, 상청액은 제거하고 수지는 50 ml 수용성 세척 용액에서 재현탁하였다.
세척 조건:
1x 50% EtOH (유기 잔유물 희석)
3x 탈이온수 (EtOH의 희석)
소수성 미세입자의 입자크기
미세입자의 크기 분포는 1% v/v 및 600x배 배율에서 약 500입자의 명시야 현미경 예측(bright field microscopy projections) 측정에 의한 평균 구 직경으로부터 계산하였다.
미세입자 및 통상적인 크로마토그래피 배지 흡착/탈착을 위한 일반적인 프로토콜
흡착 및 탈착 연구를 1 mL 배치(균질액 또는 표준 단백질 용액)에서 수행하였다. 다양한 양의 50%(v/v) 미세입자 현탁액(㎕)을 2 mL 튜브내의 단백질 용액에 첨가하였다. 단백질 농도와 전도도에 대한 희석 인자를 고려하였다.
미세입자 현탁액은 30분 동안 배양하고 통상의 크로마토그래피 배지 현탁액은 12시간 동안 배양했다. 그 후에 미세입자 또는 통상의 크로마토그래피 배지를 10분 동안 7000x g로 원심분리하였고 결합된 단백질 용출은 1 mL 용출 버퍼를 추가하여 잘 혼합하고 30분동안 배양하여 수행하였다. 일부 경우에, 용출 버퍼를 사용한 두번째 세척 단계가 포함될 수 있다. 미세입자 또는 통상의 크로마토그래피 배지를 용출한 후에 다시 전과 같이 원심분리하였다. 상청액에서 단백질의 농도는 광도 분석(photometric analysis)으로 정량 하였고 목적 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였다.
실시예 10
E. coli 균질액으로부터 재조합 GFP의 배치 흡착은 다음 단계로 양으로 하전된 미세입자(MPs) (분쇄된 크로마토그래피 수지 MARATHON A2 (MA2)) 및 음으로 하전된 미세입자 (MPs) (Marathon MSC (MMSC))를 사용하여 수행하였다. 이 실시예는 산성 세포 용해 단백질로써 GFP를 사용하였다.
E. coli 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)는 5 L 규모의 유가식 공정(fed-batch process)으로 발효되었다. 세포내 용해 목적 단백질 GFP(green fluorescent protein)의 발현을 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
수확 및 균질화: E. coli 현탁액(biomass content ~30%wt)을 4 ℃로 냉각시키고 20분동안 15000 g로 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포 펠렛은 추가로 처리하였다. 세포 펠렛을 50 mM Tris, pH 7.5로 재현탁하고 바이오매스(biomass) 함량 20%wt cells/buffer로 희석하였다. 천연 세포 용해액을 제조하는 두 경로를 위해 세포를1000 bar의 고압 균질기로 파쇄하였다.
용해액으로부터 배치 흡착을 위해 냉동 바이오매스를 사용하는 것도 가능하다. 이 경우에 바이오매스(20% w/v)는 50 mM Tris, pH 7.5에서 재현탁하고 천연발효된 E. coli 세포에서와 같이 동일한 파쇄 공정이 적용될 수 있다.
배치 흡착이 실온에서 100ml의 유리 비커의 규모에서뿐만 아니라 1 ml 부피의 작은 규모의 튜브에서도 수행되었다. 천연 세포 용해액에 MA2가 추가되고(1 ㎍ 세포 펠렛당 1.2 ㎕의 50% v/v MA2가 추가됨) 실험실 와동(lab vortex)로 5초동안 혼합되거나 30초동안 더 큰 규모의 교반기(overhead stirrer)로 혼합되었다. 혼합되는 동안 응집이 일어나고 MA2가 DNA, 숙주 세포 단백질 및 세포 파편과 같은 불순물뿐만 아니라 목적 단백질에 결합하였다. 첫 응집 후에 음으로 하전된 MPs(0.06 ㎕의 Marathon MCS 50% v/v)를 혼합물에 첨가하였다. 이렇게 카운터 하전된 MPs 는 가교제 역할을 하여 입자의 크기 및 응집물의 안정성을 증가시킨다. 응집물은 원심분리 되거나 여과될 수 있다.
세척하는 동안 응집물의 펠렛을 75 mM NaCl이 포함된 50 mM Tris 세척 버퍼, pH 7.5로 재현탁하였다. 짧은 시간 배양 후 응집물을 원심분리하여 분리하였다(3분 동안 13400 g). 여과 과정을 거쳐 분리가 일어날 때, 필터 케이크(filter cake)를 재현탁 하지 않고 필터 케이크에 세척 버퍼를 여과시킴으로써 세척한다(1.5 bar에서0.2 ㎛ 필터 플레이트(filter plate)). 상청액을 버리고 펠렛/필터 케이크는 용출 단계를 더 수행한다. 낮은 염 농도는 낮은 결합력을 가지는 불순물을 용출할 수 있다.
용출 단계에서 세척된 응집물을 400 mM NaCl를 포함하는 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5에서 재현탁하였다. 응집물을 텀블러에서 5분동안 혼합하였다. 400 mM NaCl 에서 목적 단백질은 MPs 로부터 용출되고 상청액에 존재한다. 상청액은 원심분리(13400 g로 3분 동안) 또는 전량 여과(dead-end filtration)(1.5 바에서0.2 ㎛ 필터 플레이트) 방식을 사용하여 응집물로부터 분리하였다. 불순물이 결합된 MPs를 포함하는 펠렛/필터 케이크를 제거하고 목적 단백질(GFP)을 포함하는 상청액은 더 처리하였다
실시예 11
대장균 균질액으로부터 재조합 GFP의 배치 흡착을 양으로 하전된 미세입자(MPs) (분쇄된 크로마토그래피 수지 MARATHON A2 (MA2)) 및 음으로 하전된 미세입자 Marathon MSC (MMSC))를 사용하여 다음 단계에 따라 수행하였다. 이 실시예는 산성 세포 용해 단백질로써 GFP를 사용하였다.
대장균 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)를 5L 규모 유가식 배양 과정으로 발효시켰다. 세포 용해 목적 단백질 GFP(green fluorescent protein)를 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
수확 및 균질화: 대장균 상청액(바이오매스 함유량 ~30%wt)을 4℃로 냉각하고 15000g로 20분동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포 펠릿은 더 처리하였다. 세포 펠렛을 50 mM Tris, pH 7.5로 재현탁하고 바이오매스 함유량 20%wt cells/buffer로 희석하였다. 조 세포 용해액을 생산하기 위해 두가지 경로를 통해서 세포를 1000 bar에서 고압 균질기로 파괴하였다.
용해액으로부터 배치 흡착을 위해 냉동 바이오매스를 사용하는 것이 가능하다. 이 경우에, 바이오매스(20% w/v)를 50 mM Tris, pH 7.5로 재현탁하고 천연 발효 대장균 세포에 대한 경우와 같이 같은 파괴 공정을 또한 적용할 수 있다.
배치 흡착을 1 ml 부피의 작은 규모인 튜브에서뿐만 아니라, 100 ml 규모의 유리 비커에서 실온에서 수행하였다. 조 세포 용해액에 MA2를 첨가하고(습식 세포 펠렛 1 ㎍ 당 1.2 ㎕의 50%v/v MA2가 첨가) 실험실용 볼텍스로 5분동안 혼합하거나 큰 규모의 경우 30초 미만으로 교반기로 혼합하였다. 혼합하는 동안 응집이 일어나고 MA2가 목적 단백질뿐만 아니라 DNA, hcps (host cell proteins) 및 세포 파편과 같은 불순물에 결합한다. 응집 후에 샘플을 13400g로 3분 동안 원심분리 하거나 오버헤드 압력(overhead pressure)을 이용하는 전량여과(dead-end filtration)에서 1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트(filter plate)를 여과하였다. 상청액을 버리고 펠렛/필터 케이크는 세척단계를 처리하였다.
응집물의 세포 펠렛을 75 mM NaCl를 포함하는 50 mM Tris 세척 버퍼, pH 7.5로 재현탁하였다. 짧은 시간 배양 후 응집물을 원심분리(13400g로 3분 동안)하여 분리하였다. 여과 과정을 통해 분리가 일어날 때, 필터 케이크를 재현탁이 아니라 필터 케이크를 통해 세척 버퍼를 여과 시켜 세척하였다(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트). 상청액을 버리고 펠렛/필터 케이크를 용출단계를 처리하였다. 낮은 염 농도는 결합력을 낮추어 불순물을 용출시킬 수 있다.
용출단계를 위해 세척된 응집물 목적 단백질을 용출할 수 있는 염 농도를 포함하는 50 mM Tris 버퍼로 재현탁하였다. 상청액을 바로 더 큰 안정한 응집물을 생성하기 위해 음으로 하전된 미세입자를 혼합하였다(습식 세포 펠렛 1 ㎍ 당 0.06㎕의 50% v/v Marathon MSC). 목적 단백질을 MPs로부터 용출하고 단백질은 상청액에 존재한다. 상청액은 원심분리 또는 전량 여과(1.5 bar에서 0.2　㎛ 필터 플레이트)를 사용하여 응집물로부터 분리될 수 있다. 불순물이 결합된MPs를 포함하는 펠렛/ 필터 케이크를 버리고 목적 단백질을 포함하는 상청액을 더 처리할 수 있다.
실시예 12
이 실시예는 분쇄된 MARATHON A2 (MA2) 수지의 MPs 를 사용하여 세포 균질액으로부터 발현된 재조합 염기성 단백질의 회수를 설명한다. 단백질 인터페론 감마, IFN-γ는 세포 용해 발현 염기성 단백질 시료로써 기능한다. 이 실시예는 양으로 하전된 수지가 불필요한 세포 구조 및 세포 물질에 결합함으로써 생체분자 회수에 사용될 수 있음을 보여준다(음성적 정제(negative purification)로 언급).
IFN-γ는 유가식 발효에 의해서 E. coli 세포 내 용해되어 발현되었다.
수확 및 균질화
IFN-γ 를 발현하는 냉동 바이오매스(20% w/v) 세포를 사용하여 용해 버퍼(20mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M Urea, 0.1 % beta-mercaptoethanol)에서 재현탁하였다. 조 세포 용해액을 생성하는 세가지 경로를 위해 950bar에서 고압 균질기로 상기 세포를 파쇄되었다. 상기 세포 파쇄는 새로운 바이오매스와도 수행하였다.
목적 단백질의 음성적 정제(Negative Purification)
배치 흡착을 실온에서 2 ml 작은 규모의 튜브에서 수행하였다. 조 세포 용해액을 MA2와 혼합하고 ~5초 동안 실험실 볼텍스로 혼합하였다(습식 세포 펠렛1 ㎍당 0.84㎕의 50% v/v Marathon A2). 혼합하는 동안 MA2가 음으로 하전된 DNA, hcps (숙주 세포 단백질) 및 세포 파편과 같은 불순물에 결합한다.
응집 후에 카운터 하전된 MPs을 혼합물에 첨가하였고(습식 세포 펠렛 1 ㎍당 0.042 ㎕의 50%v/v Marathon MSC) 두번째 혼합 단계를 수행하였다. 반대로 하전된 MPs는 입자 크기 및 응집물의 안정화를 증가시키는 가교제 역할을 수행한다. 응집물을 원심분리 또는 여과시킬 수 있다. 불순물이 결합된 MPs를 포함하는 펠렛/ 필터 케이크를 버리고 목적 단백질을 포함하는 상청액을 더 처리한다.
실시예 13
이 실시예는 양과 음으로 하전된 MP2(MA2 및 MMSC)를 사용하여 E. coli 세포로부터 산성 세포 재조합 단백질의 추출을 보여준다.
E. coli 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1) 및 BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)를 5 L 규모의 유가식 공정을 사용하여 발효시켰다. 세포 용해 목적 단백질GFP의 발현을 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
세포를 배양하고 Flexboy® Bags에서 밤새(~12 시간) 4 ℃로 보관하였다. 대장균 상청액(바이오매스 함유량 ~30%wt)을 4 ℃로 냉각시키고 15000 g로 20분 동안 원심분리한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5으로 동일한 바이오매스 함유량을 가지도록 재현탁하였다.
세포 응집 및 단백질 추출
첫 응집 동안 대장균 세포에 결합하고 응집시키기 위해 양으로 하전된 MPs를 세포 상청액에 추가하였다(30% 습식 바이오매스 함유량에서 1 mL 세포 상청액 당102 ㎕ MA2 (50 % v/v)). MPs가 세포에 접촉하면 추출이 일어나고 목적 단백질(GFP)이 상청액에 축적될 것이다. 2-3시간 배양 후, 추출이 완료되고 음으로 하전된 MPs를 응집된 세포에 추가하였다(30% 습식 바이오매스 함유량에서 1 mL 세포 상청액 당 5.4 ㎕의 음으로 하전된 MarathonMSC). 응집물의 입자 크기는 증가하고 플락화된 물질의 안정성이 증가한다. 두번째 응집 단계 후, 응집물을 여과 또는 원심분리를 사용하여 분리하였다. 세포 펠렛/ 필터 케이크를 버리고 목적 단백질을 포함하는 상청액을 더 처리하였다.
양으로 하전된 MPs의 첫번째 추가 후, 상청액은 결합되지 않은 MPs에 의해 혼탁화 되었다(MA2 경우에서). 반대로 하전된 MPs(MMSC)을 혼합물에 추가하자 두번째 응집이 진행되어 혼탁함이 사라진다. MA2-MPs에 결합한 세포는 카운터-하전된(counter-charged) MPs (MMSC)에 의해 안정화된다.
실시예 14 양으로 하전된 MPs ( DIAION SA20A ) 및 음으로 하전된 MPs ( DOW 50WX2-100)를 사용한 GFP 의 추출
실시예 1에 설명된 것과 같이, 양으로 하전된 MPs를 DIAION SA20A로부터 제조하고 음으로 하전된 MPs를 DOW 50WX2-100로부터 제조하였다.
E. coli 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1) 및 BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)를 5L 규모의 유가식 공정을 사용하여 발효시켰다. 세포 용해 목적 단백질 GFP(green fluorescent protein)의 발현을 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
세포를 배양하고 Flexboy® Bags에서 밤새(~12 시간) 4 ℃로 보관하였다. E. coli 상청액(바이오매스 함유량 ~30%wt)을 4 ℃로 냉각시키고 15000 g로 20분 동안 원심분리한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5으로 동일한 바이오매스 함유량을 가지도록 재현탁하였다.
첫 응집 동안 E. coli 세포에 결합하고 응집시키기 위해 양으로 하전된 MPs를 세포 상청액에 추가하였다(30% 습식 바이오매스 함유량에서 1 mL 세포 상청액 당102 ㎕ MA2 (50 % v/v)). MPs가 세포에 접촉하면 추출이 일어나고 목적 단백질(GFP)이 상청액에 축적될 것이다. 2-3시간 배양 후, 추출이 완료되고 음으로 하전된 MPs를 플락화된 세포에 추가하였다(30% 습식 바이오매스 함유량에서 1 mL 세포 상청액 당 5.4㎕의 음으로 하전된 MarathonMSC). 응집물의 입자 크기는 증가하고 응집물의 안정성이 증가한다. 두번째 응집 단계 후, 응집물을 여과 또는 원심분리를 사용하여 분리하였다. 세포 펠렛/ 필터 케이크를 버리고 목적 단백질을 포함하는 상청액을 더 처리하였다.
실시예 15 양으로 하전된 MPs ( DIAION SA312 ) 및 음으로 하전된 MPs (DOW 50WX8-100)를 사용한 GFP 의 추출
실시예 1에 설명된 것과 같이, 양으로 하전된 MPs를 DIAION SA312로부터 제조하고 음으로 하전된 MPs를 DOW DOW 50WX8-100 로부터 제조하였다.
E. coli 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1) 및 BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)를 5 L 규모의 유가식 공정을 사용하여 발효시켰다. 세포 용해 목적 단백질 GFP(green fluorescent protein)의 발현을 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
세포를 수확하고 Flexboy® Bags에서 밤새(~12 시간) 4 ℃로 보관하였다. E. coli 상청액(바이오매스 함유량 ~30%wt)을 4 ℃로 냉각시키고 15000 g로 20분 동안 원심분리한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5으로 동일한 바이오매스 함유량을 가지도록 재현탁하였다.
첫 응집 동안 E. coli 세포에 결합하고 응집시키기 위해 양으로 하전된 MPs를 세포 상청액에 추가하였다(30% 습식 바이오매스 함유량에서 1 mL 세포 상청액 당102 ㎕ MA2 (50 % v/v)). MPs가 세포에 접촉하면 추출이 일어나고 목적 단백질(GFP)이 상청액에 축적될 것이다. 2-3시간 배양 후, 추출이 완료되고 음으로 하전된 MPs를 응집된 세포에 추가하였다(30% 습식 바이오매스 함유량에서 1 mL 세포 상청액 당 5.4 ㎕의 음으로 하전된 MarathonMSC). 응집물의 입자 크기는 증가하고 플락화된 물질의 안정성이 증가한다. 두번째 응집 단계 후, 응집물을 여과 또는 원심분리를 사용하여 분리하였다. 세포 펠렛/ 필터 케이크를 버리고 목적 단백질을 포함하는 상청액을 더 처리하였다.
실시예 16 분쇄된 Marathon MSC에 대한 다중클론항체 IgG의 결합 용량과 분쇄된 Marathon MSC 혼합물과 분쇄된 Marathon A2의 비교
다중클론항체 IgG를 분쇄된 Marathon MSC(d50 = 1 ㎛)에 50 mM 및 100 mM NaCl를 각각 포함하는 50 mM MES pH 6.0에서 흡착시켰다. 한 경우에서 상기 수지를 흡착 단계 전에(Two Resin System; TRS) 분쇄된 Marathon A2로 응집시켰다. 다른 경우에서 Marathon MSC만을 단백질 흡착에 사용하였다(One Resin System; ORS). Marathon MSC에 대한 Marathon A2의 비율 0.4로 조정하였다. 0.01 내지 0.99 범위의 다른 비율도 가능하다. 흡착을 15분 동안 로터리 쉐어커(rotary shaker)로 수행하였다. 그 후에 입자를 원심분리로 분리하였다. 그 다음 0.2 ㎛ 크기의 기공을 가진 주사기 필터(syringe filter)를 사용하는 여과를 단백질 측정에 방해가 되는 입자를 제거하기 위하여 수행하였다. 단백질 농도를 마이크로타이터 플레이트(microtiter plates)에서 280nm에서 UV 흡광도을 측정하여 결정하였다. 그 결과는 도 18에 도시하였다.
ORS 및 TRS를 사용하여 단백질간 용량을 비교하였다. 다중클론항체 IgG의 흡착 전에 응집은 다중클론항체IgG에 대한 최대 단백질 용량을 감소시키지 않는다.
사용된 다중클론항체 IgG: Octagam 5% (Octapharma AG). 용액은 해당 버퍼의 5% 용액을 희석하여 제조하였다.

Claims (15)

  1. 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음이온으로 하전된 미세입자를 포함하는, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 약산 또는 강산인 것인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 약염기 또는 강염기인 것인, 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate(HEMA)-based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(DMAEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계 (dimethylamino ethylmethacrylate(pDMAEMA) -based), 폴리아크릴아마이드계 (polyacrylamide-based), 메타크릴산계 (methacrylic acid(MAA) -based )인 것인, 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지 및 음이온 교환 수지는 디비닐벤젠계(divinylbenzene-based)와 교차결합된 폴리스티렌(polystyrene)인 것인, 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세입자는 평균 입자의 크기가 약 5㎛ 이하인 것인, 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 Amberlite IRA-485, Amberlite IRA-400, Dowex 1X2-100, Dowex 1-8-100, Marathon A2 또는 DIAION SA 20A인 것인, 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 Amberlite IRC-748, Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, Marathon MSC 또는 DIAION SK 110 인 것인, 조성물.
  9. 생체분자, 바람직하게는 단백질 또는 플라스미드 흡착에 이용하기 위한, 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  10. 생체분자, 바람직하게는 세포 균질액 또는 발효 상청액의 단백질 흡착에 이용하기 위한, 제 8항의 미세입자의 용도.
  11. 세포 파쇄에 이용하기 위한, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  12. 세포 파쇄, 그리고 분자, 바람직하게는 생체분자, 더욱 바람직하게는 폴리펩타이드 및 플라스미드 흡착에 이용하기 위한, 제 1항 내지 제 16항의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  13. 하기 단계를 포함하는, 생체분자를 포함하는 생물학적 유체(biological fluid)로부터 생체분자를 수득하는 방법:
    e) 생물학적 유체에 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 첨가하고,
    f) 상기 미세입자가 응집물(flocs)을 형성하도록 하고,
    g) 상기 응집물(flocs)을 생물학적 유체에서 제거하고, 그리고
    h) 생체분자를 회수하는 단계.
  14. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항으로 정의된 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자, 그리고 선택적으로 현탁 수단을 포함하는 키트.
  15. 생체분자와 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항으로 정의된 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 생물학적 유체.

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