CN105683210A - 用于细胞破碎和/或回收生物分子的微粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞破碎和从细胞释放生物分子的新方法。本发明包括含有磨碎的树脂的带正电荷和/或带负电荷微粒的用途。它尤其适用于由细胞培养纯化生物分子。

Description

用于细胞破碎和/或回收生物分子的微粒
发明技术领域
本发明一般涉及回收生物分子和细胞破碎的领域，特别涉及从细胞悬浮液回收细胞内生物分子诸如多肽或多聚核苷酸。它覆盖从流体诸如生物流体中回收生物分子的方法。在进一步方面，本发明涉及细胞培养和从细胞培养中纯化生物分子的领域。
发明背景
尽管之前做了所有的努力来发展人工生产系统，生物实体如细胞在生产复杂物质如抗生素、蛋白质和核酸方面的能力是无与伦比的。如今几乎所有的工业生产的细胞起源物质都是在细胞内产生随后被排泄到环境中的细胞外产品。然而，一大部分潜在有用的物质仍然保留在细胞内。为了释放细胞内物质，细胞典型地通过机械、物理、化学或酶的方法而被解体。有价值的细胞产品的回收效率同它们在生物系统内的形成、位置及其相互作用密切联系。在过去的数十年，对这些细胞系统内的分子结构和它们的功能的调查已经增强了此类产品及其大规模加工的多元化。与此同时，特别是在医疗保健部门，对于产品质量的需求使交付定义良好的、有效的和高纯度物质成为必要。
现行的细胞破碎方法包括机械和非机械方法。非机械方法包括物理(减压、渗透休克法、热分解、冷冻干燥、微波)、化学(抗生素、螯合剂、洗涤剂、溶剂、碱金属、超临界CO2)和酶的(溶解、自溶、噬菌体)方法。另一方面，用于细胞破碎的机械途径和设备包括玻珠研磨机、拌匀器、空化(超声波、水动力)和微射流机。只有一些细胞破碎方法(主要为机械)以工业规模进行，其中它们通常集中在下游(如回收，净化)处理。
对于大规模而言，最常见的机械方法是玻珠研磨和高压匀质化，它们典型地作为标准操作来实施。当使用高压匀质化时，在高压下细胞溶液被强制通过一个狭窄的阀门。通过阀门时细胞经受湍流、空化，高剪切力和撕裂细胞排放时突然的压力下降。建设时必须考虑到阀门的应力和腐蚀，阀门的应力和腐蚀随着均质压力的增加而增加。进一步地，该溶液温度随着压力的增大而升高，致使该方法耗费能源，使该设备冷却且必须暂停，特别是当释放了温度不稳定的酶。大约超过90％的电力被拌匀器以热量消散形式而消耗，冷却成本占细胞解体总成本的很大一部分。进一步地，为了达到足够高的产量，经常需要连续的通道(Kula等人，“PurificationofProteinsandtheDisruptionofMicrobialCells.”BiotechnologyProgress1987)。
玻珠研磨中，将珠加入生物流体中，随后通过搅拌或振动来高速搅动。通过珠的碰撞，细胞被破坏，细胞内内容物被释放。玻珠研磨还产生热量，需要冷却。这是一个相当复杂的过程，其受到各种包括玻珠研磨机的建设、操作参数和产品具体特性的参数的影响。玻珠研磨机的建设和几何结构是关键的过程变量。然而，通常较小型玻珠研磨机与工业规模玻珠研磨机在几何学上不相同，这促使从实验室测试到批量处理的数据外推法变得复杂(Kula等人,“PurificationofProteinsandtheDisruptionofMicrobialCells.”BiotechnologyProgress1987)。
机械破碎方法存在几个缺点。由于细胞被完全破坏，所有的细胞内材料被释放，由此增加了中间产品的污染物含量。因此，必须将感兴趣的产品从蛋白质、核酸和细胞片段的复杂混合物中分离。此外，释放的核酸可增加该溶液的粘度，可使随后的处理步骤例如色谱法变得复杂。通过机械解体产生的细胞碎片通常由小的细胞片段组成，这使溶液难以澄清。完全的产品释放通常要求多于一个穿过破坏装置，其通过进一步减少片段尺寸使得这个问题更加严重。由于该装置的生产能力与颗粒直径的平方成反比，这些都是很难通过连续离心分离被除去。匀浆粘性性质和它对膜的污染倾向使过滤变得复杂。此外，机械方法要求定期保养和昂贵的设备且是耗能的。它们产生热量，要求大范围冷却以便能被用于温度敏感酶。进一步地，它们使细胞和由此提取的产品暴露于高剪切应力中。大部分产品将由于产生的热量而变性，除非该装置经过充足的冷却。
如上所述，更多选择性的释放方法包括物理、化学或酶处理。化学处理包括应用EDTA、离液剂、有机溶剂、抗生素、酸、碱金属和表面活性剂。除了过量化学品的废物处理的问题，这些方法是相当昂贵的，因此不适合大规模应用。另一个缺点是该类化学品对预期产品有污染。有些化学物质的选择性不强，往往会损害敏感蛋白、酶和细胞壁。
当应用于具有几个不同的层如细菌细胞壁的复杂细胞结构时，酶细胞破碎更为具体但是通常有限。此外，这受限于酶和缓冲液的成本。因此，酶处理不适用于大规模或工业规模。另一个缺点是，酶对预期产品有潜在污染。
物理透化作用通过冻融或渗透压冲击处理来完成。冻融需要多次循环来实现有效产品的释放，该过程可能相当漫长。另一方面，渗透压冲击处理可能不足以破坏具有坚固细胞壁结构的细胞。
总而言之，这些方法的劣势包括成本相对高、大规模的实用性低、效率低、重现性差，释放后需要去除所添加的物质。
考虑到细胞生产系统的潜力，需要回收生物分子的替代方法，特别是从细胞悬浮液中回收生物分子的易于处理的、具有成本效益的和可扩展的替代方法。此外，该方法对敏感性生物分子应足够温和，能够回收高选择性的生物分子从而生产低污染的产品。因此本发明的一个目的是提供一种能克服一个或多个上述缺点的方法或系统。
必须指出的是，除非上下文有其它明确指示，本文所使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”包括复数描述。因此，例如，提及的“试剂”包括一种或多种这种不同的试剂，提及的“所述方法”包括本领域普通技术人员已知的等效的步骤和方法，其可以被修改或替代本文所述的方法。
除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一个元素。本领域技术人员将承认或仅使用常规实验能够确定本文所述的具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案意图包含在本发明中。
术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”和“该术语所连接的元素的全部或任何其它组合”。
本文使用的术语“约”或“近似”意为在给出的值或范围的20％内，优选为10％内，更优选为给出的数值或范围的5％内。然而它还包括具体数目例如约20包括20。
术语“小于”或“大于”包括具体数目。例如，小于20意为小于或等于20。同样地，多于或大于分别意为多于或等于、或大于或等于。
本发明全文及其所附的权利要求中，除非上下文有其它要求，词语“包括(comprise)”以及变形词语诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当本文使用术语“包括(comprising)”时能够术语“含有(containing)”或“包含(including)”替代，或有时本文使用时会以术语“具有”替代。
当本文使用“由…组成”意为排除了权利要求要素中未规定的任何元素、步骤或成分。当本文使用“本质上由…组成”并不排除实质上不影响权利要求的基本特征和新颖性特征的材料或步骤。
本文每一个实例中，术语“包括”、“本质上由…组成”和“由…组成”中的任意一个可被其它两个术语中的任意一个替代。
应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等，因为这些能够改变。本文所使用的术语只用于描述特定实施方案的目的而并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
本说明书全文所引用的所有出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导书等)，无论在前还是在后，其以全文并入本文。由于在先发明，本文不能被解释为承认本发明不早于这样的公开物。在一定程度上，通过引入方式并入的材料或与本说明书矛盾或不一致，本说明书将取代任何这样的材料。
发明简述
本发明提供新型的获得生物分子的方法，也被称为克服了上述一个或多个缺点的生物分子回收方法。该方法能够被用于从液体和流体中获得生物分子，该液体和流体为例如细胞培养、细胞匀浆、细胞裂解液、细胞悬浮液、发酵液、培养液、发酵上清液、培养上清液、细胞上清液，诸如大肠杆菌、毕赤酵母和CHO细胞培养。此外，本发明涉及细胞破碎的方法，该方法能够用于释放包含于细胞中的生物分子。如将在说明书中显示的，本发明特别用于破坏细胞和回收细胞内生物分子。本文公开的方法简单、具有成本效益，可扩展为工业应用。该方法提供一种简单的选择性回收生物分子的过程，其中除了缓冲液和盐之外，既不需要复杂的设备，也不需要可溶性添加剂。如前述，从细胞悬浮液回收生物分子的现有技术涉及或是机械应力和/或是化学添加剂。与如今应用于工业规模的常规方法相比，本发明的方法温和，不需要将所述细胞和/或所预期的生物分子产品置于苛刻条件下。因此，本文公开的方法减少了污染的碎片量，对预期生物分子所施加的潜在的有害机械和物理应力较小。
本发明人已经惊奇地发现，包含磨碎的树脂的带电荷微粒或疏水微粒能够从生物流体中回收(本文还称之为“萃取”)生物分子。此外，在一些实施方案中，当向细胞悬浮液中加入带电荷微粒时，该带电荷微粒能破坏细胞，同时还能吸附从细胞中释放的生物分子。因而，一个方面，所述微粒能够用于破坏细胞并释放生物分子，进一步以简单、可扩展的方式吸附生物分子。某些方面所述微粒已经被发现能与细胞和/或生物分子和/或带相反电荷的微粒相互作用而形成絮凝物，并能容易地从生物流体中被分离出去。因而，通过分离絮凝物和絮凝物上所吸附的生物分子能够容易地回收所释放的生物分子。因此本发明进一步提供简单的方法，其中，下游处理中的细胞破碎步骤和生物分子萃取步骤被合并。这种技术被称为胶体固相萃取(CSPE)。不受理论的约束下，可假设来源于阳离子交换树脂的带正电荷微粒通过吸附至带负电荷的细胞表面而与细胞形成了絮凝物，由此置换了阳离子，特别是钙和/或镁离子，这些离子与特别是细菌细胞的常规带负电荷细胞表面相互关联。因此，该构造细胞膜的分子的排列(liningup)在某种程度上不稳定，由此该细胞开始渗漏。
在来源于螯合阳离子交换树脂的带负电荷颗粒的情况下，假设该颗粒结合了阳离子，特别是钙和/或镁离子，由此减弱了建立细胞膜的分子排列的稳定性。对于疏水微粒，也发现其形成絮凝物。
通过以低片段细胞结构(如细胞壁)温和地“打开”细胞，是目前萃取细胞内生物分子的唯一的方法，其减少了污染水平。同时，该项新技术允许选择性萃取生物分子，其可与本领域已知的机械破坏离子方法如高压匀质化和玻珠研磨相比，但在效率方面，其提供了较高的选择性和较低的污染水平。同时，利用本文公开的该项新技术，可能在保持细胞的完整性的情况下回收所预期的生物分子。因此，“打开”细胞意为该细胞无论如何优选不被完全破坏。相应地来说，优选地所述“打开”意为该细胞开始渗漏而由此释放它们的细胞质成分。
第一方面，本发明提供带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒用于回收生物分子的新用途，其中所述带正电荷的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述带负电荷的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂。在一个实施方案中，只使用带正电荷的微粒。在另一个实施方案中，只使用带负电荷的微粒。在进一步的实施方案中，既使用带正电荷的微粒也使用带负电荷的微粒。
本发明的第二方面，所述组合物包含疏水微粒。这些疏水微粒尤其能够吸附肽或多肽，还吸附其它生物分子。用于吸附的机制被认为首先是基于所吸附的配体如肽或多肽的疏水部分和微粒的聚合物表面之间的疏水(范德华，伦敦型)引力。
如本文所述，该微粒可通过研磨树脂获得(能够获得)，例如，通过研磨离子交换树脂并任选对该磨碎的树脂进行调节。本发明中这些颗粒被称为“微粒”、“吸附性颗粒”、“吸附剂”、“颗粒”、“磨碎的颗粒”或“磨碎的树脂”。这些术语交替使用。优选地，所述微粒通过研磨常规的大直径小孔隙的微粒来获得，该类颗粒通常意图用于例如水的去离子化和废水处理。
所述带正电荷的微粒能够通过研磨阴离子交换树脂来制备。该阴离子交换树脂可以是弱碱性或强碱性。同样地，阳离子交换树脂能够被用来制备所述带负电荷的微粒。该阳离子交换树脂可是弱酸性或强酸性。本发明的一些实施方案中，所述阳离子交换树脂和/或阴离子交换树脂可以是螯合树脂。
根据本发明的离子交换树脂能够基于任何适当的材料。优选地，所述树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的、甲基丙烯酸(MAA)基的。更优选地，所述树脂为以二乙烯基苯(DVB)交联的聚苯乙烯。
优选地，所述微粒为磨碎颗粒的形式，该颗粒平均粒径小于约10μm，例如小于约5μm。
根据本发明的微粒能够通过研磨阴离子交换树脂或阳离子交换树脂而获得。阴离子交换树脂可以是，例如AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-485、Dowex1X2-100、Dowex1-8-100、DIAIONSA20A、MarathonA2或其它本领域所知的阴离子交换树脂；阳离子交换树脂可以是，例如AmberliteIRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、DIAIONSK110、MarathonMSC或其它本领域所知的阳离子交换树脂。优选的阴离子交换树脂包括AmberliteIRA-458和MarathonA2。优选的阳离子交换树脂包括AmberliteIRC-748。
在另一方面，本发明提供了带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒或本文公开的疏水微粒吸附生物分子的用途，所述生物分子优选蛋白质或多聚核苷酸，诸如DNA如源于流体的质粒DNA、粘粒DNA、BACDNA、YACDNA、微环DNA。所述流体是生物流体，诸如细胞匀浆、发酵上清液、发酵液、培养液、培养上清液、细胞裂解液或细胞悬浮液。
进一步地，本发明提供本文所公开的微粒用于细胞破碎的用途。优选地，该破碎的细胞释放吸附于微粒上的生物分子。这些被破坏的细胞包括真核细胞和原核细胞。在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞。该细胞可选自但不限于以下：肠杆菌科、假单胞菌科、乳酸菌科或芽孢杆菌科。在一个优选的实施方案中，该细胞为大肠杆菌。
在进一步的方面，本发明提供一种获得生物分子的方法，该方法包括将带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒或本文所公开的疏水微粒加入生物流体中并从该生物流体中回收所述生物分子。在一些实施方案中，该方法进一步包括允许所述微粒形成絮凝物，从所述生物流体中去除该絮凝物，以及从该絮凝物中解吸生物分子。在某些情况下，根据所要回收的生物分子，所述微粒可被用来和不想要的细胞结构一起形成絮凝物，去除该絮凝物后，所述流体中的生物分子被回收。通过例如离心或过滤能够从生物流体中去除絮凝物。在一个实施方案中，在加入所述微粒期间或之后，和/或从所述絮凝物或所述生物流体中解吸生物分子期间，搅拌生物流体。
本发明进一步提供一种破坏细胞的方法，该方法包括向细胞悬浮液中加入带电荷的微粒和/或疏水微粒。所述带电荷的微粒可以是带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒。在某些方面，该方法进一步包括从所述细胞中释放生物分子。此外，本发明还提供一种生物流体和带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒或疏水微粒。
以下将通过描述和实施例来使本领域技术人员了解本发明的确切性质及优点。本发明并不限于所公开的优选实施方案或实施例。本领域技术人员能够容易地根据本发明所教导的内容从而获得其它的实施方案和应用。
附图简要说明
图1：MarathonMSC(MMSC)、MarathonA2(MA2)、AmberliteIRC748和AmberliteIRA458的官能团和它们与聚合物基体的结合位点的化学结构示意图。
图2：MarathonA2微粒的细胞体积浓度、树脂与细胞的体积比率对从培养(50mMTRIS，pH8.0)1小时的GFP表达的大肠杆菌中回收GFP的影响。
图3：MarathonA2微粒的树脂与细胞的体积比率对从培养(50mMTRIS，pH8.0)1小时的GFP表达的大肠杆菌(10％v/v)中回收GFP的影响。
图4：以MarathonA2微粒(树脂与细胞的体积比率为100％、70％、50％、30％、0％)在pH值(7.5、8.0、8.5)下静态培养0.2-3小时，pH、培养时间以及树脂与细胞的体积比率对从包含GFP表达的大肠杆菌的细胞培养液中回收GFP的影响。
图5：经MarathonA2微粒(树脂与细胞的体积比率为100％、70％、50％、30％、0％)在不同的NaCl浓度(500mM、100mM、50mM、0mM)下培养(50mMTRIS，pH8.0)1小时并经1MNaCl洗脱后，盐浓度对从GFP表达的大肠杆菌(10％v/v)中回收GFP的影响。
图6：在不同浓度的NaCl(500mM、100mM、50mM、0mM)下静态培养(50mMTRIS，pH8.0)并经1MNaCl洗脱后，通过在MarathonA2微粒(树脂与细胞的体积比率为100％、70％、50％、30％、0％)上吸附而从大肠杆菌细胞(10％v/v)所萃取的GFP的平衡容量。通过经1MNaCl洗脱前和后的荧光性来量化水相中的GFP。不同的GFP量被认为吸附在树脂上。趋势符合标准的“兰缪尔”方程式。
图7：经螯合AmberliteIRC748微粒(树脂与细胞的体积比率为70％、30％)一起搅拌(1-2小时，50mMTRIS，pH8.0)，不经过1MNaCl洗脱，该培养条件对从GFP表达的大肠杆菌(5％v/v)中回收GFP的影响。
图8：经螯合AmberliteIRC748微粒(树脂与细胞的体积比率为100％、70％、30％)2小时静态培养(50mMTRIS，pH8.0)，经过或不经过1MNaCl洗脱后，树脂与细胞的体积比率和洗脱对从GFP表达的大肠杆菌(5％v/v)中回收GFP的影响。
图9：经螯合Amberlite微粒(树脂与细胞的体积比率为70％)2小时搅拌培养(50mMTRIS，pH8.0)后，GFP表达的大肠杆菌的细胞体积浓度(20％、15％、10％、5％v/v)对回收GFP的影响。
图10：经螯合Amberlite微粒(树脂与细胞的体积比率为70％)2小时搅拌培养(50mMTRIS，pH8.0)后，不同细胞体积浓度(20％、15％、10％、5％v/v)下GFP表达的大肠杆菌的GFP萃取动力学。
图11：经丙烯酸IRA458微粒比率(树脂与细胞的体积比率100％、70％、50％v/v)静态培养1-3小时并经不同浓度的NaCl(1.0M、0.5M、0M)洗脱后，树脂与细胞的体积比率对从SOD表达的大肠杆菌(10％v/v)中回收SOD的影响。通过SDS-Page密度测定法确定SOD的量。
图12：经丙烯酸AmberliteIRA458微粒(树脂与细胞的体积比率100％、70％、50％v/v)短暂混合并培养(50mMTRIS，pH7.7)，并经不同浓度的NaCl(1.0M、0.5M、0M)洗脱后，从10％v/v细胞悬浮液中获得的大肠杆菌匀浆中回收SOD。通过SDS-Page密度测定法确定SOD的量。
图13：GFP表达的大肠杆菌经不同浓度NaCl(200-1000mM)洗脱后使用MarathonA2微粒(树脂与细胞的体积比率50％)培养(50mMTRIS，pH8.0)3小时所得到的非靶蛋白萃取物与大肠杆菌匀浆、匀浆上清液得到的非靶蛋白萃取物之间的对比，由SDS-Page和考马斯亮蓝染色所确定。
图14：图13中SDS-Page的光密度分析。
图15：GFP表达的大肠杆菌匀浆上清液的蛋白质图谱，与大肠杆菌经MarathonA2微粒(树脂与细胞的体积比率50％)静态培养(50mMTRIS，pH8.0)3小时并经300mMNaCl洗脱所获得的洗脱液的蛋白质图谱相比较。
图16：使用AmberliteIRA458和MarathonA2(树脂与细胞的体积比率50、70、100％v/v)微粒静态培养(50mMTRIS,pH8.0)并随后经NaCl洗脱后，从大肠杆菌匀浆和细胞悬浮液(10％v/v)萃取蛋白质(SOD)期间的dsDNA下降动力学。由英杰公司的“PicoGreenQuantIt”分析系统来估算DNA的量。
图17：使用MarathonA2微粒静态培养(50mMTRIS，pH8.0)并随后经NaCl洗脱后，从大肠杆菌匀浆和细胞悬浮液(10％v/v)萃取蛋白质(SOD)动力学过程中，内毒素减少。由购于龙沙公司的PyroGeneTM重组因子C分析系统来估算内毒素的量。
图18：磨碎的树脂的原子力显微镜(AFM)图像。MarathonA2(图像1)、MarathonMSC(图像2)和AmberliteIRC748(图像3)的高度测量。
图19：大肠杆菌细胞的原子力显微镜(AFM)图像。经磨碎的MarathonA2培养之前(左图)和培养1小时之后的高度测量。
图20：无微粒培养的大肠杆菌HMS174(GFPmut3.1)的覆盖图像(图1)，使用磨碎的MarathonA2培养1小时后的覆盖图像(图2)，使用AmberliteIRC748在50mM，pH8.0TRIS中培养1小时的覆盖图像(图3)。
图21：使用MarathonA2微粒(树脂与细胞的体积比率70％)静态培养(50mMTRIS，pH8.0)并经生理缓冲液以1:10稀释后，大肠杆菌细胞(10％v/v)的存活率。活的(绿色)/死的(红色)细胞由英杰公司的“BacLite”荧光染色试剂盒进行染色。
图22：SDS-Gel显示了使用微粒来从细胞匀浆中捕获GFP的洗脱图谱。
图23：SDS-Gel显示了使用微粒从细胞匀浆中回收IFN-γ的洗脱图谱。
图24：显示了实施例13.2中捕获上清液(1)、清洗缓冲液(2)、经洗脱的GFP(3)中的GFP的量与使用化学破坏法(4)的GFP最大量的比较的柱状图。
本发明的项目
还可以通过下述项目来描述本发明的特点：
1.带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述带正电荷的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，以及其中所述带负电荷的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂，其中所述生物分子优选为多肽或多核苷酸。
2.带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒用于细胞破碎的用途，其中所述带正电荷的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，以及其中所述带负电荷的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂。
3.疏水微粒用于回收生物分子的用途。
4.根据项目1或2所述的用途，其中所述阳离子交换树脂为弱酸性或强酸性。
5.根据项目1或2所述的用途，其中所述阴离子交换树脂为弱碱性或强碱性。
6.根据项目1或2所述的用途，其中所述阳离子交换树脂和/或所述阴离子交换树脂为螯合树脂。
7.根据前述任一项目所述的用途，其中所述阴离子交换树脂和所述阳离子交换树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的、甲基丙烯酸(MAA)基的。
8.根据前述任一项目所述的用途，其中所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂为以二乙烯基苯交联的聚苯乙烯。
9.根据前述任一项目所述的用途，其中所述微粒的平均粒径低于约5μm。
10.根据前述任一项目所述的用途，其中所述带正电荷的微粒或带负电荷的微粒通过研磨聚合的阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂可获得。
11.根据前述任一项目所述的用途，其中所述阴离子交换树脂为AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-485、Dowex1X2-100、Dowex1-8-100、MarathonA2或DIAIONSA20A。
12.根据前述任一项目所述的用途，其中所述阳离子交换树脂为AmberliteIRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、MarathonMSC或DIAIONSK110。
13.根据前述任一项目所述的用途，其中所述树脂无孔。
14.根据前述任一项目所述的用途，其中所述细胞为真核细胞或原核细胞。
15.根据项目1至14中任一项所述的用途，其中所述细胞选自肠杆菌科、假单胞菌科、乳酸菌科或芽孢杆菌科。
16.根据项目14或15所述的用途，其中所述细胞为大肠杆菌。
17.根据前述任一项目所述的用途，其中所述生物分子为蛋白质或多核苷酸。
18.一种从生物流体中获得生物分子的方法，包括：a)向生物流体中加入项目1至13中任一项所定义的带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒或疏水微粒，并从该生物流体中回收该生物分子。
19.根据项目18所述的方法，进一步包括：b)允许所述微粒形成絮凝物；c)从所述生物流体中去除该絮凝物；以及d)解吸该生物分子。
20.根据项目19所述的方法，其中所述生物流体是细胞悬浮液、发酵液、培养液、细胞匀浆或发酵上清液。
21.根据项目18至20中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括经步骤a)和/或步骤d)后搅拌所述生物流体。
22.根据项目18至21中任一项所述的方法，其中步骤c)通过分离技术如离心或过滤来进行。
23.根据项目18至22中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换树脂为弱酸性或强酸性。
24.根据项目18至22中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换树脂为弱碱性或强碱性。
25.根据项目18至22中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换树脂和/或所述阴离子交换树脂为螯合树脂。
26.根据项目18至25中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换树脂和所述阳离子交换树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的、甲基丙烯酸(MAA)基的。
27.根据项目18至26中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂为以二乙烯基苯交联的聚苯乙烯。
28.根据项目18至28中任一项所述的方法，其中所述微粒的平均粒径低于约5μm。
29.根据项目18至28中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的微粒或带负电荷的微粒通过研磨聚合的阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂可获得。
30.根据项目18至29中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换树脂为AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-485、Dowex1X2-100、Dowex1-8-100、MarathonA2或DIAIONSA20A。
31.根据项目18至30中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换树脂为AmberliteIRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、MarathonMSC或DIAIONSK110。
32.根据项目18至31中任一项所述的方法，其中所述树脂无孔。
33.根据项目18至32中任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞或原核细胞。
34.根据项目18至33中任一项所述的方法，其中所述细胞选自肠杆菌科、假单胞菌科、乳酸菌科或芽孢杆菌科。
35.根据项目34所述的方法，其中所述细胞为大肠杆菌。
36.根据项目18至35中任一项所述的方法，其中所述生物分子为蛋白质或多核苷酸。
37.一种用于破坏细胞的方法，包括向细胞悬浮液中加入带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒或疏水微粒。
38.项目37所述的方法，进一步包括从所述细胞中释放生物分子。
39.项目37或38所述的方法，其中所述生物分子为多肽或多核苷酸。
40.一种生物流体，包括带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒或疏水微粒，其中所述带正电荷的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，以及其中所述带负电荷的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂。
41.根据项目40所述的流体，还包括絮凝物。
42.带正电荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述带正电荷的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述生物分子为酸性或碱性。
43.项目42所述的用途用于从细胞裂解液或细胞匀浆中回收生物分子。
44.项目42所述的用途用于从细胞悬浮液中回收生物分子。
45.带负电荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述带负电荷的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂，以及其中所述生物分子为酸性或碱性。
46.项目45所述的用途用于从细胞裂解液或细胞匀浆中回收生物分子。
47.项目45所述的用途用于从细胞悬浮液中回收生物分子。
48.带正电荷的微粒和带负电荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述带正电荷的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，所述带负电荷的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂，其中所述生物分子为酸性或碱性。
49.项目48所述的用途用于从细胞裂解液或细胞匀浆中回收生物分子。
50.项目48所述的用途用于从细胞悬浮液中回收生物分子。
51.带正电荷的微粒用于细胞破碎和释放细胞中的生物分子的用途，其中所述带正电荷的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，以及其中所述生物分子为酸性或碱性。
52.带负电荷的微粒用于细胞破碎的用途，其中所述带负电荷的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂，以及其中所述生物分子为酸性或碱性。
53.一种从生物流体中获得生物分子的方法，包括：a)向生物流体中加入带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒，以及从该生物流体中回收该生物分子，其中所述生物分子为酸性或碱性。
54.根据项目53所述的方法，其中所述生物流体为细胞悬浮液、细胞裂解液或细胞匀浆。
55.一种从细胞获得生物分子的方法，包括：a)加入带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒来破坏细胞，由此从细胞中释放该生物分子，以及b)回收该释放的生物分子。
56.根据项目55所述的方法，其中所述生物分子为酸性或碱性。
57.根据项目55所述的方法，其中加入所述带正电荷的微粒。
58.根据项目55所述的方法，其中加入所述带负电荷的微粒。
发明详述
本发明提供使用本文所述的带电荷的微粒或疏水的微粒来回收生物分子和/或破碎细胞的简单而快捷的方法。本发明在一定程度上基于惊奇的发现，特别是，所述带电荷的微粒能够破坏细胞，并能够进一步从所述细胞中释放和吸附生物分子，因而能够快速、有效地回收生物分子。此外，已经发现带电荷的微粒当被加入生物流体时能快速形成大直径(例如至少5μm)絮凝物，如此则所述微粒能够与细胞相互作用或被吸附至细胞和/或吸附生物分子，这样能使被吸附于微粒上的生物分子和/或由微粒和生物分子形成的絮凝物被容易地分离。这同样也适用于疏水微粒。
本领域技术人员将领会的是，本发明尤其适用于包括本文所述的试验规模或工业规模的大规模应用中从生物流体诸如细胞悬浮液中分离蛋白质或质粒。带电荷的微粒和/或疏水微粒能够有利地用于间歇处理(本文称为“间歇吸附”)。
此外，本文所述的新型方法提供高的回收效率和低的污染水平。本发明能够有利地应用于回收生物分子，特别是，当应用常规方法萃取生物分子时，该生物分子对温度或剪切敏感并易于变形。
细胞和生物分子
正如之前所述，本发明提供从流体如生物流体中回收生物分子的方法。在一些实施方案中，本发明的方法涉及在生物流体中破坏细胞和从细胞中释放生物分子。所述生物分子优选为细胞内生物分子，诸如蛋白质或质粒。随后所释放的生物分子能够从生物流体中被回收。
如本文所述，术语“细胞内的”是指细胞内所发现的任何物质。本文所定义的“生物分子”包括通常在细胞中被发现的或由细胞所合成的任何分子，其包括多肽或多聚核苷酸。所述生物分子可以是酸性或碱性生物分子。生物分子的实例包括但不限于寡糖、多糖、脂多糖、寡肽、蛋白质、核苷、类黄酮、寡核苷酸、DNA(多链或单链DNA)、质粒DNA、RNA(多链或单链RNA)、有机金属化合物、氨基酸、脂肪、嘧啶、嘌呤、碳水化合物、肽类化合物、毒素、类固醇和酶。
当本文使用“细胞”时，其是指能够产生(表达)生物分子的细胞，优选“宿主细胞”。该类细胞能够应用于本发明的方法中。外源核苷酸序列可被引入该细胞用于产生生物分子。
可被用于本发明的方法中的细胞或宿主细胞或者可以是原核细胞或者可以是真核细胞，或者既有原核细胞又有真核细胞。更优选地，本发明的方法中使用的细胞为包括哺乳动物、鸟类、两栖类、鱼类细胞和昆虫细胞的脊椎动物细胞。细胞或宿主细胞还包括真核细胞。典型地，真核细胞为哺乳动物细胞、鸟类细胞或昆虫细胞。细胞或宿主细胞还包括酵母细胞或真菌细胞。然而，该宿主细胞优选为原核细胞，该原核细胞包括来自革兰氏阴性细菌的细菌细胞，例如来自肠杆菌科的细胞，例如大肠杆菌，或来自假单胞菌科的细胞，如恶臭假单胞菌，或来自革兰氏阳性细菌的细胞，例如来自乳酸细菌或芽孢杆菌的细胞。然而，该宿主细胞最优选为大肠杆菌。
微粒
本文所定义的“带电荷的”微粒是带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒。“带正电荷的”微粒具有至少一个基本电荷的质子，更典型地在pH中性时具有多于一个基本电荷的质子。“带负电荷的”微粒具有至少一个基本电荷的电子，更典型地在pH中性时具有多于一个基本电荷的电子。
所述微粒可包括磨碎的树脂。应用于本发明的树脂是固体、非可溶性聚合物材料，该聚合物材料能够相互作用于或依附于各种要素，并允许从混合物中捕获该类元素。树脂通常由惰性化合物组成，其包括但不限于：交联葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或中性多糖。它们还可包括交联的天然聚合物如纤维素、葡萄聚糖或琼脂糖。
根据优选实施方案，微粒是由离子交换树脂、更优选聚合的阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂来制备的。离子交换树脂是指包含带电荷聚合物的不溶性载体的固相支持体，所述带电荷聚合物携带了固定官能团或具有可交换离子的位点。用于制备微粒的适当的离子交换树脂的说明性实例包括阴离子交换树脂、阳离子交换树脂和混合模式层析树脂，本文有时也称为混合模式的离子交换树脂。可交换离子形式通常为Na+、H+、OH-或Cl-离子中的一个或多个，这取决于离子交换树脂的种类。离子交换树脂包括弱酸和强酸阳离子交换树脂以及弱碱和强碱阴离子交换树脂。适当的离子交换树脂还包括螯合树脂。
离子交换树脂广泛应用于各种工业领域。离子交换树脂通常用在例如水处理领域，用于锅炉水的去矿化或用于发电厂冷凝处理；食品领域，用于糖溶液的纯化；或超纯水领域，用于半导体的制备。
本发明的优选实施方案中，微粒由多孔球形离子交换树脂制备。球形离子交换树脂通过悬浮聚合法来制备，其中将包括单官能基加成聚合单体和自由基聚合引发剂的单体混合物加入水性介质中，随后搅拌，以制备单体混合物的悬浮液。然后将该悬浮液在聚合温度下保持一段时间，以获得球形交联共聚物。用于水处理的离子交换树脂的直径典型地为300-600μm。在其它实施方案中，微粒可由凝胶类型和/或大孔离子交换树脂制备。
离子交换树脂的聚合物基体可包括聚苯乙烯、聚苯乙烯和苯乙烯共聚物、聚丙烯酸酯、芳基取代乙烯基共聚物、聚甲基丙烯酸酯、苯酚-甲醛、聚烷基胺及其组合，诸如此类。在一个优选的实施方案中，所述聚合物基体为聚苯乙烯和苯乙烯共聚物、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯，而在另一个实施方案中，所述聚合物基体为苯乙烯二乙烯基苯(DVB)共聚物。优选地，所述用于制备微粒的离子交换树脂所使用的树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(DMAEMA)基的、聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(pDMAEMA)、甲基丙烯酸(MAA)基的。最优选地，所述树脂由以二乙烯基苯(DVB)交联的聚苯乙烯制成。
本文所使用的阳离子交换树脂可以是弱酸性或强酸性。正如本文所使用的，术语“弱酸性阳离子交换树脂”是指这样一种树脂，其经常规方法(例如Fisher等人，“EffectofCross-linkingonthePropertiesofCarboxylicPolymers.I.ApparentDissociationConstantsofAcrylicandMethacrylicAcidPolymers”J.Phys.Chem.,60(8),1030(1956))测量的表观解离常数或电离常数(pKa)高于约4.5。它可具有作为交换基团的羧酸基团、酚型羟基团、膦酸基团和胂羧基团。另一方面，术语“强酸性阳离子交换树脂”是指pKa小于约1.5的树脂。强酸性阳离子交换树脂可具有磺酸基团诸如聚苯乙烯磺酸钠或聚AMPS。所述磺酸基团(-HSO3)是交换基团，其为强酸性表现，在碱性溶液中，甚至在酸性溶液中会离解成(-SO3)-和H+。
本文所使用的阴离子交换树脂可以是弱碱性或强碱性。本文使用的术语“弱碱性阳离子交换树脂”是指这样一种树脂，其经常规方法(例如Fisher等人,“EffectofCross-linkingonthePropertiesofCarboxylicPolymers.I.ApparentDissociationConstantsofAcrylicandMethacrylicAcidPolymers”J.Phys.Chem.,60(8),1030(1956))测量的表观解离常数或电离常数(pKa)高于约8.5。该树脂可具有作为交换基团的伯氨基、仲氨基和/或叔氨基基团例如聚乙烯胺。在另一方面，术语“强碱性阴离子交换树脂”是指pKa小于约12的树脂。强碱性阴离子交换树脂可具有季氨基基团，例如，作为交换基团的三甲基胺基团如聚APTAC，或二甲基乙醇胺。
本文使用的阴离子交换树脂和阳离子交换树脂还包括螯合树脂，该螯合树脂包括能够与金属离子形成螯合物(复合物)的官能团。螯合树脂典型的特征是对特定的金属离子具有很大的选择性。某些螯合树脂可以是碱性和/或酸性，这取决于它们的官能团和pH。螯合树脂典型的官能团包括但不限于亚氨基二乙酸、多胺、甲基葡萄糖酰胺、硫脲、氨基膦酸。AmberliteIRC748是示例性的螯合阳离子交换树脂，其具有亚氨基二乙酸官能团，该官能团能用于制备例如能从细胞悬浮液中回收生物分子的微粒。
可商购的离子交换树脂为：例如Amberlite、Amberjet、Duolite和Imac树脂，由美国宾夕法尼亚州费城的罗门哈斯公司(Rohm&HaasofPhiladelphia,PennsylvaniaUSA)提供；Lewatit树脂，来自德国勒沃库森的拜耳公司(BayerofLeverkusen,Germany)；Dow树脂，来自美国密歇根州米德兰的陶氏化学公司(DowChemicalofMidland,MichiganUSA)；Diaion和Relite树脂，来自日本东京的三菱化学公司(MitsubishiChemicalofTokyo,Japan)；Purolite树脂，来自美国宾夕法尼亚州巴拉辛魏德镇的漂莱特公司(PuroliteofBalaCynwyd,PennsylvaniaUSA)；Ionac树脂，来自美国新泽西州伯明翰盛邦公司(SybronofBirmingham,N.J.USA)；以及来自美国新泽西州西柏林的Resintech公司(ResintechofWestBerlin,N.J.USA)的树脂。
带正电的微粒能够由聚合的阴离子交换树脂来制备。商购的阴离子交换树脂典型地为OH-或Cl-的形式。在一个实施方案中，所述阴离子交换树脂是OH-的形式。该树脂可以为例如“Diaion”阴离子交换树脂，诸如DiaionSA树脂(包括DIAIONSA20A)和DiaionSK树脂(包括DIAIONSK110)(来自三菱化学公司)(MitsubishiChemical)、“Amberlite”树脂诸如AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-458、AmberliteIRA-734和AmberliteIRA-900(来自罗门哈斯公司公司(Rohm&Haas))或“Dowex”树脂诸如Dowex1、Dowex2、Dowex11、Dowex21K、Dowex1x2、Dowex1x4、Dowex1x8和DowexMarathon树脂(来自陶氏化学公司(DowChemicalCo))。在优选实施方案中，所述阴离子交换树脂为AmberliteIRA-458或MarathonA2。阴离子交换树脂的官能团可包括季胺基团例如苄基三甲铵基团(1型树脂)、苄基二甲基乙醇铵基团(2型树脂)、三烷基苄基铵基团(1型树脂)、二甲基乙醇胺基团(2型树脂)或叔胺官能团。对于细胞破碎，MarathonMA2和AmberliteIRA-458是特别优选的用于制备带正电荷微粒的阴离子交换树脂。
带负电荷的微粒能够由聚合的阳离子交换树脂制备。本文所使用的聚合物材料可以是指聚合物、聚合物混合物、交联聚合物及其混合物，或者是指聚合物网络。通常，聚合物材料简单地被称为聚合物。可商购的阳离子交换树脂典型地或者是H+的形式或者是Na+的形式。在一个实施方案中，阳离子交换树脂是H+的形式。该树脂可以是例如“Diaion”阳离子交换树脂诸如DiaionPK树脂、DiaionSK树脂(来自三菱化学公司(MitsubishiChemical))，“Amberlite”树脂例如AmberliteIRC-748(来自罗门哈斯公司(Rohm&HaasCo.))，或“Dowex”树脂诸如Dowex50WX2、Dowex50WX8和DowexMarathon树脂诸如MarathonC、MarathonMSC(来自陶氏化学公司(DowChemical))。阳离子交换树脂的官能团可包括磺酸基团(-SO3H)、膦酸基团(-PO3H)、次膦酸基团(-PO2H)、羧酸基团(-COOH或-C(CH3)-COOH)及其组合。在一个实施方案中，阳离子交换树脂中的官能团可以是-SO3H、-PO3H或-COOH，而在最优选的实施方案中，阳离子交换树脂中的官能团为-SO3H。对于细胞破碎，具有螯合官能团的阳离子交换树脂，例如AmberliteIRC748特别优选用于制备带负电荷的微粒。
本文使用的聚合的阳离子交换树脂是指具有一个或多个基本电荷的质子的聚合物材料，或者是指该大分子本身。聚合的阴离子交换树脂具有一个或多个基本电荷的电子。
本发明所述带正电的微粒是至少具有一个基本电荷的质子的颗粒，更加典型地，该微粒在中性pH时具有多于一个基本电荷的质子，而中性pH条件下带负电的微粒具有至少一个基本电荷的电子。
当微粒成分中至少一部分为离子电荷时，获得带正电或带负电的微粒。
本发明还提供一种作为新型吸附材料的用于捕获生物分子的微粒，该微粒为固体且是疏水性的。所述微粒是磨碎的形式，可通过磨碎诸如AmberliteXAD4、AmberliteXAD7HP、AmberliteXAD761的疏水吸附材料来制备。
在一个实施方案中，只将带正电荷的微粒加入生物流体中。在另一个实施方案中，只将带负电荷的微粒加入生物流体中。还有另外一个实施方案中，将带正电荷的微粒和带负电荷的微粒均加入生物流体中。如果将带正电荷的微粒和带负电荷的微粒均加入生物流体中，带正电荷的微粒和带负电荷的微粒的比率可为约0.1：99.9(w/w)至99.9：0.1(w/w)。例如，该比率可为约50：50，但是该比率也可以是不同的，诸如90：10、80：20、75：25、60：40、40：60、20：80、25：75、10：90等。还有另一个实施方案中，将疏水微粒加入所述生物流体中。
在一个优选的实施方案中，所述微粒以磨碎颗粒的形式存在，这些颗粒的平均粒径小于约10μm，如小于约9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm和1μm。优选地，这些磨碎的颗粒的平均粒径小于约5μm，更优选为小于约2.5μm。优选地，这些磨碎的颗粒的平均粒径大于0.5μm。因此，这些磨碎的颗粒的平均粒径可优选的范围为约10μm至0.5μm、约9μm至约0.5μm、约8μm至约0.5μm、约7μm至约0.5μm、约6μm至约0.5μm、约5μm至约0.5μm、约4μm至约0.5μm、约3μm至约0.5μm或约2.5μm至约0.5μm。然而，这些磨碎的颗粒的粒径可大于10μm以及小于0.5μm。
制备微粒
通过研磨阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂可获得或获得微粒。优选地，通过研磨树脂和调节树脂可获得(或获得)本发明所述微粒。
优选的是，调节磨碎的颗粒来去除在制备树脂过程中所剩余的副产品。本领域已知离子交换树脂的典型的调节方法，供给方也描述了这些调节方法。
如必要，可进行“调节”来将所述树脂中的H+或OH-转化为Na+或Cl-。在一个实施方案中，通过使用NaCl和水的重复清洗步骤进行调节。在此过程中，可在水中磨碎所述树脂并经离心产生沉淀。可选择的，已经以Na+或Cl-形式存在的树脂还可经商业途径获得，以及从供应方获取。
在一个优选的实施方案中，所述微粒通过以下步骤来制备：(a)研磨离子交换树脂；以及(b)将所述磨碎的树脂在水中重新悬浮；(c)允许所述磨碎的树脂产生沉淀；(d)从沉淀的悬浮液的上清液中收集磨碎的树脂；(e)将所收集的磨碎的树脂在约2M的氯化钠中重新悬浮；(f)允许所述磨碎的树脂产生沉淀；(g)从(f)步骤产生的沉淀的悬浮液的上清液中收集磨碎的树脂；(h)允许所述磨碎的树脂产生沉淀；(i)收集(h)步骤产生的磨碎的树脂沉淀物，以及(j)清洗所收集的磨碎的树脂。
本发明的疏水微粒优选被研磨过夜，磨碎的树脂在水中悬浮。离心上清液。树脂重新悬浮于盐溶液诸如2M的氯化钠中，离心并丢弃颗粒物。转移上清液并再次离心，丢弃上清液。磨碎的树脂于水中重新悬浮，将其转移至试管中。离心树脂，丢弃上清液，树脂于水性清洗液中重新悬浮。清洗顺序为：
-1x50％EtOH(稀释有机残留物)
-3x去离子水(稀释EtOH)
研磨
可通过本领域已知的任何方式进行研磨，其包括但不限于，通过诸如研磨机(包括喷射式粉碎机、球磨机、锤式粉碎机等此类)的研磨设备进行研磨，或通过例如研钵及研杵来手动研磨。本文使用的“研磨”是指减少粒径大小的一种操作。技术人员能够很容易地选择研磨方法来制备所述树脂。例如，在一个实施方案中，以自动化方式通过在研钵中移动一个或多个研杵来湿磨树脂。该研磨过程一直持续至所得到的大部分颗粒的粒径小于约10μm，比如所得到的颗粒粒径小于9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5μm。大部分的意思是超过50％，诸如超过60％、70％、80％、90％或95％。在其它的实施方案中，大部分的颗粒具有的平均粒径至少为0.1μm，诸如0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、3μm、4μm或5μm。
技术人员运用本领域的已知方法能够容易地确定所磨碎的颗粒尺寸。随后通过本领域已知的手段和方法能够确定平均粒径。例如，在使用诸如实施例所述的基于软件的尺寸确定法通过光学显微镜能够确定尺寸。所磨碎的树脂的粒径可在放大1000倍下通过估算等效圆直径来确定。分布优选通过比较1％v/v下约100-500个颗粒的直径尺寸来计算。研磨具有大幅度增大表面积的效果，这能显著增大生物分子尤其是蛋白质或多肽的结合容量。优选在技术手段，诸如能识别颗粒和测量直径的软件的帮助下确定直径。
当本文使用“重新悬浮”或“悬浮”或其的任何语法形式时，其意为将微粒引入悬浮液中。
当本文使用“允许沉淀”时，其意为允许微粒从流体中沉淀，其中这些微粒被夹带并依靠障碍物停止移动。所述沉淀是由于粒子移动穿过流体时为响应作用于它们上的外力而产生的。该外力可以是重力或通过例如离心机所产生离心加速度，优选后者。
“收集”意为从悬浮液中收获所述微粒。
本文使用的“洗涤”意为减少那些能破坏或干扰所述微粒性能的残留流体的量。例如，如上述预处理，可使用50％(v/v)乙醇(EtOH)和双去离子(ddH2O)来清洗树脂，随后使用ddH2O重复清洗。这些流体的每一种体积均超出微粒的体积，优选超出10倍或20倍。
经研磨后，可任选例如通过离心、沉淀、过滤或其它本领域技术人员所熟知的任何方法来移除上述优选范围外的颗粒。
令人惊奇的是，已经发现所述磨碎的颗粒的粗糙表面所提供的蛋白质吸附容量，可相当于具有高结合容量的常规色谱介质所提供的蛋白质吸附容量，该常规色谱介质如Bio-RadLaboratories(USA)所开发的Nuvia介质。
添加微粒
第一步，将所述微粒加入至生物流体中。本发明所公开的微粒能够用于实验室规模、中试规模或工业规模。本文所使用的“实验室规模”包括从约1或10ml流体至约1000ml的流体中间歇吸附生物分子。本文所使用的“中试规模”包括从约1升流体至约10升液体中间歇吸附生物分子。本文所使用的“工业规模”或大规模包括从约10升流体至约1000升或甚至10000升液体或更多液体中间歇吸附生物分子。
本文所述的方法包括向所述生物流体中添加带正电荷的微粒，或添加带负电荷的微粒，或既添加带正电荷的微粒也添加带负电荷的微粒，或添加疏水微粒。当既添加带正电荷的微粒也添加带负电荷的微粒时，它们能够作为制备的混合物被添加，或者分别被添加，以同时或连续的方式被添加。如果带正电荷的微粒和带负电荷的微粒以连续的方式被添加，也就是说，一个接一个，因而，本发明包括向所述生物流体中先添加或者是带正电荷的微粒或者是带负电荷的微粒，其次向该生物流体中添加带相反电荷的微粒。考虑到例如所述生物流体和将从该生物流体中被回收的所预期的生物分子，技术人员能够确定是否只使用带正电荷的微粒或只使用带负电荷的微粒，或既使用带正电荷的微粒也使用带负电荷的微粒。
可选择地，根据本发明的吸附剂包括磨碎颗粒形式的疏水树脂。此种疏水树脂的突出的蛋白质吸附容量优于在低盐浓度下常规色谱介质，其尤其适用于例如多聚核苷酸和亲水蛋白质的负纯化。因此，本发明提供通过应用疏水微粒来负纯化多聚核苷酸或亲水蛋白质的用途和方法。为了在匀浆或标准蛋白质溶液中达到这个目的，50％(v/v)疏水微粒悬浮液被加入至匀浆或蛋白质溶液。培养微粒悬浮液例如30分钟。之后离心微粒，通过添加洗脱缓冲液来进行结合蛋白的洗脱，混合并培养例如30分钟。任选地，能够包括使用洗脱缓冲液的第二步清洗步骤。洗脱后，该微粒如前所述被再次离心。能够通过例如光度分析来量化上清液中蛋白质浓度，并能够通过SDS-PAGE来检查靶蛋白的纯度。
能够将所述微粒加入至从中生物分子将被分离的生物流体中。应在广义上理解术语“生物流体”。它们是指任何与生物体有关联的流体，诸如从任何生物体中获得或由任何生物体所产生。生物流体的实例包括细胞培养液、发酵上清液、发酵液、细胞悬浮液、细胞裂解液。生物流体的进一步的实例如本文以上所述。在其它的实施方案中，生物流体还可以是唾液、尿液、淋巴液、前列腺液、精液、血液、血浆、血清、汗液、分泌的粘液、牛奶、牛奶乳清、腹水、器官提取物、植物提取物、动物提取物。在一个优选的实施方案中，所述生物流体是本文所述的任意一种生物流体，诸如多肽或多核苷酸如质粒DNA、粘粒DNA、BACDNA、微环DNA等。包括来源于各种体内或体外过程的流体，尤其是包括发酵液、培养液、发酵上清液、培养上清液、细胞匀浆、细胞裂解液或细胞悬浮液。“细胞匀浆”通常被理解为破碎的细胞混合物。细胞匀浆可通过机械或化学方法来获得。例如，能够通过常规方法如通过高压匀质或通过裂解液中的简单涡流来使细胞均匀化从而得到发酵匀浆，所述裂解液包括碱裂解。
因此，本发明还包括一种流体，其包含生物分子、带正电和带负电的微粒。在一个优选的实施方案中，在本发明的方法的任一步骤过程中和/或之后搅拌生物流体，但是优选不在允许颗粒形成絮凝物的步骤中和/或将絮凝物从生物流体中移除的步骤中进行搅拌。
“细胞匀浆”通常被理解为破碎的细胞混合物。细胞匀浆可通过机械或化学方法来获得。例如，可通过常规方法如通过高压匀质或通过裂解液中的简单涡流来使细胞均匀化从而得到发酵匀浆，所述裂解液包括碱裂解。
生物流体的实例包括例如源自大肠杆菌和CHO细胞培养液的细胞培养液、细胞匀浆、细胞裂解液和发酵上清液。发酵上清液或细胞匀浆可被另外以其他方式进行过滤、离心、透析、调节或处理。
本发明的一个优选实施方案中，所述生物流体是细胞悬浮液。本文使用的“细胞悬浮液”是指一种液体，诸如细胞培养液、缓冲液或其它任意适当的流体，优选包括完整的细胞。“完整的”是指会封闭细胞的细胞内成份的细胞膜的物理连续性，其意味着细胞膜没有以任何方式已经被破坏到将会释放细胞的细胞内成分到在常规培养条件下超过细胞膜的渗透性的程度。
在向生物流体中添加微粒的过程中和/或之后，它们能够通过搅拌或振荡(只有在添加了MPs后)混合来获得均匀混合物。在一些实施方案中，混合能够通过促进细胞和/或生物分子和微粒的相互接触来增强絮凝和/或细胞破坏。当所述颗粒与生物流体混合的同时吸附自发产生。然而，在一些实施方案中，添加了微粒后不需要进行混合(在实施例中被称为静态培养)。
培养参数
当微粒被加入至生物流体中，可调整细胞的最佳体积浓度(用“％(v/v)”表示，这是指各自的体积分数的比率)。在一些实施方案中，最佳的细胞浓度小于30％(v/v)，例如小于约25％(v/v)，小于约20％(v/v)，小于约15％(v/v)，小于约10％(v/v)，小于约9％(v/v)，小于约8％(v/v)，小于约7％(v/v)，小于约6％(v/v)，小于约5％(v/v)，小于约4％(v/v)，小于约3％(v/v)，小于约2％(v/v)或小于约1％(v/v)。可使用混合来获得细胞和微粒的均匀混合物。
在本发明的某些方面，所述微粒浓度优选小于约300％(v/v)，例如小于约200％、100％(v/v)、80％(v/v)、70％(v/v)、60％(v/v)、50％(v/v)、40％(v/v)、30％(v/v)、20％(v/v)、10％(v/v)或更少。选择树脂与细胞的体积比率，例如能够依据微粒尺寸分布(有效表面积)和电荷密度(每个可及区域的官能团)。
絮凝
在一些实施方案中，在向生物流体添加了微粒后的下一步骤是允许形成絮凝物。已经令人惊讶的发现，所述微粒一旦将细胞和/或生物分子吸附至微粒就能够在生物流体中与细胞和/或生物分子快速形成大直径絮凝物。
当微粒被加入至细胞悬浮液，细胞可以通过被吸附至微粒上而被固定在絮凝物上。在一些实施方案中，细胞释放生物分子并保持活性。被释放的生物分子可以或不可以被吸附至所述微粒上。
当所述微粒被加入至生物流体中，例如细胞裂解液或细胞匀浆或发酵上清液，一旦生物分子被吸附至微粒上就可以形成絮凝物。在一些实施方案中，带正电荷和带负电荷的微粒首先被混合随后被加入生物流体中，一旦微粒混合物和生物流体相互接触，就会发生絮凝。在其它实施方案中，先向生物流体中加入带正电荷的微粒或先加入带负电荷的微粒，随后再分别加入带相反电荷的微粒，从而形成絮凝物。
在一个实施方案中，所述生物分子为酸性。在这种情况下，带正电荷的微粒被加入至生物流体例如细胞裂解液或细胞匀浆中来进行吸附。带正电荷的微粒还可被加入至细胞悬浮液，其加入量或者是仅足够破坏细胞而释放生物分子的量，或者是将破坏细胞并吸附生物分子的较高的量。技术人员能够确定部分地或完全地破坏细胞所需要的量。之后带负电荷的微粒可被加入，其作为交联剂来增大絮凝物的粒径和稳定性。可选择地，带负电荷的微粒诸如由螯合阳离子树脂制备的微粒还可被加入至该细胞悬浮液中，其加入量是足以破坏该细胞并释放生物分子用于进一步的纯化的量。任选地，带正电荷的微粒可随后被加入来增加絮凝物。
在另一个实施方案中，所述生物分子为碱性。这种情况下，带正电荷的微粒可被加入生物流体诸如细胞裂解液或细胞匀浆中，以和细胞碎片或其它诸如DNA、宿主细胞蛋白和细胞片段的杂质形成絮凝物。带负电荷的微粒可被加入来增大絮凝物的粒径和稳定性，从而该絮凝物能够被容易地分离出并被丢弃。由于该碱性生物分子没有被结合至带正电荷的微粒，因此，它能够从上清液中被回收。可选择地，带正电荷或带负电荷的微粒可以以足够破坏细胞并释放生物分子并用于进一步纯化的量被加入至细胞悬浮液。该絮凝物典型地具有100μm的尺寸或甚至更大的尺寸，这使得它们是可见的并利于将它们分离。这意味着其它非预期的材料诸如细胞和/或细胞碎片能够通过过滤而不需要进行离心而被容易地去除。因此本发明比现有技术的方法快速而简单。本发明并不必须但是如果使用柱色谱法则可能需要再生树脂。此外，所述微粒是价格便宜的材料，因而在使用后可以将其丢弃。
在一个优选的实施方案中，絮凝物具有的平均粒径至少为5μm，诸如至少为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μm、2000μm或形成更大的絮凝物。
吸附容量
本文使用的“吸附容量”被定义为平衡状态下每ml树脂所吸附的生物分子的量(mg)。本文使用的平衡是指吸附率等于解吸率的状态。所述微粒对预期的生物分子特别是可溶性多肽或多核苷酸的吸附容量，能够通过生物分子洗脱之前和之后例如量化上清液中的多肽或多核苷酸来确定，例如通过荧光性或分光光度法来确定。生物分子量的差被认为吸附到了微粒上。正如本领域技术人所能理解的是，该吸附容量可取决于各种参数，诸如微粒的特性、生物分子、pH、温度、盐浓度以及其它参数，或其组合。在一些实施方案中，在实施例3.1.5所列出的条件下，每ml树脂的带正电荷的微粒能够吸附至少5mg，诸如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg的GFP。在其它实施方案中，在实施例4.1.3所列出的条件下，每ml树脂的带正电荷的微粒可吸附至少5mg，诸如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg的SOD。
去除絮凝物
通常，能够通过过滤、离心、沉淀或其它任何适当的方法将所述絮凝物从液体(如生物流体或缓冲液)中去除。技术人员能够容易地确定使用何种方法能从流体分离或解吸该絮凝物。对于中试和工业规模的操作，所述絮凝物悬浮液能够例如或者是在斗式离心机(实验室规模)、管式离心机、倾析式离心机或者是在碟片式离心机(diskstackcentrifuge)中被处理。同样地，可能通过过滤或者通过沉淀或萃取来去除絮凝物残留处的絮凝物。能够通过逆流萃取倾析机、混合沉降器或柱式萃取器来完成解吸。其它对去除有用的方法可以是正切流动过滤、深层过滤、死端过滤或涉及使用压滤机、滤过器的方法。
生物分子的解吸
能够利用本领域已知的任何方法进行解吸。例如，能够通过将絮凝物在缓冲液中重新悬浮来进行解吸，这允许解吸生物分子如蛋白质(解吸缓冲液)。这能够通过使用本领域已知的任何方法来实现，这些方法包括管式(静态)混合器或其它混合设备例如搅拌槽。还能够通过逆流萃取倾析机、混合沉降器或柱式萃取器来进行解吸。
然后，使所述悬浮液经历适合解吸的条件。技术人员能够容易地确定该类用于解吸吸附在所述絮凝物上的生物分子的条件。通常，能够采纳用在常规离子交换色谱法中的解吸方法。例如，能够通过在低于或高于等电点的pH下洗脱或者通过增加盐浓度来完成解吸。
所述生物分子能够通过本领域已知的方法来进一步纯化或富集。这些方法包括，例如，沉淀法、结晶法和/或选自下列的色谱法：疏水作用色谱法、亲和色谱法、假亲和色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法和/或尺寸排阻色谱法。因此，在一个优选的实施方案中，本文所述的方法包括通过使用上述沉淀法和/或色谱法来纯化和/或富集该(期望的)生物分子的进一步的步骤，所述生物分子尤其为蛋白质。
然而，在一些实施方案中已经发现，所述细胞在没有吸附至微粒的情况下一旦与所述微粒相互作用就能够释放生物分子。在这种情况下，细胞没有被吸附至微粒上，将不会发生絮凝。例如，当带电荷的微粒被加入至携带了相反表面静电荷的细胞的细胞悬浮液中时，该细胞不会被吸附至微粒上，将不会观察到絮凝。细胞的“表面净电荷”在此被定义为细胞表面存在的所有的电荷总数，这可取决于周围溶液的pH。
所释放的生物分子可以或不可以吸附至微粒上。如果所述生物分子没有吸附至微粒上，不发生生物分子解吸。在这种情况下，能够通过将细胞和微粒从流体中分离，例如通过离心或过滤或其它任何方式，将生物分子从上清液中回收。如果生物分子吸附至微粒上，通过改变微粒的条件例如通过解吸缓冲液来允许洗脱生物分子而使解吸得以实现。由于所述絮凝物的尺寸，在所述生物分子被解吸缓冲液所解吸后，所形成的絮凝物很容易从解吸缓冲液中被分离出去。
本领域技术人员很容易了解应用何种方法来实现从微粒和/或细胞中分离上清液。
回收
本发明能够用来从生物流体和/或细胞中回收生物分子。以所有语法形式存在的回收生物分子可表示为获得(obtained)、收获(harvested)、取得(achieved)或得到(gained)生物分子。生物分子可以是质粒、多聚核苷酸或表达产物诸如肽、蛋白质，包括糖基化修饰的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质。通过本领域已知的和/或本文所述的手段和方法，可使生物分子被分离和/或被进一步处理，如被进一步纯化。此外，回收还包括这样的实施方案，即破坏细胞而从细胞中释放生物分子，这可能使其从细胞培养液被分离出去。随后的步骤中，生物分子能够被进一步的纯化和/或富集。
细胞破碎
本发明进一步提供通过向细胞悬浮液中加入带电荷的微粒来破坏细胞的方法。术语“细胞破碎”或“破坏细胞”在本文中在使细胞渗透到能从细胞中释放生物分子的程度的方法或过程中被交替使用。细胞破碎可以或不可以包括细胞死亡。优选地，细胞破碎不包括细胞结构如细胞壁的完整碎片，这种细胞破碎引致了细胞片段的减少，降低了不需要的污染物水平，所述污染物包括细胞碎片。本发明的一些实施方案中，通过本文所述的方法破坏的细胞会释放生物分子并保持细胞的活力。术语“活力”是指细胞具有在适当的生长条件下繁殖的能力。
所释放的生物分子可以或不可以吸附至用于破坏细胞的微粒上。通过使用本文所述的方法或其它已知技术，随后能够从生物流体中回收生物分子。因此，本发明提供了新的以简单的两步法工艺用于细胞破碎、生物分子释放和随后生物分子的回收的方法。本发明的微粒可用于打开细胞来释放生物分子，从而无论生物分子(也就是说，该生物分子可以是酸性、碱性或中性)的酸度如何，该生物分子能在细胞悬浮液中被回收。
选择性
相对于通过细胞破碎常规方法所获得的生物分子，本发明的方法所提供的生物分子具有较高的纯度。特别是，相对于现有技术中使用的常规方法，本发明的方法具有较高的选择性，这是因为所回收的生物分子部分中非靶物质的量较少。所回收的生物分子具有高纯度是有利的，因为它不需要进一步的连续纯化步骤。优选地，本发明的方法提供的生物分子相对于非靶生物分子的相对富集超过30％，诸如超过40％，超过50％，超过60％，超过70％，超过80％，超过90％或直至100％。相比于非靶生物分子，给定生物分子的纯度的评估方法对本领域技术人员而言是可获得的。对于多肽，示例性方法为：蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Page)上被分离后，经考马斯蓝染色，然后进行定量测量。
当应用常规方法进行细胞破碎时，细胞被破坏，核酸、细胞壁成分和其它片段被释放。因此，所回收的生物分子必须经过进一步纯化来去除污染物。然而，文本所述方法能够减少大分子污染物的释放。该类污染物可包括但不限于dsDNA、RNA、宿主细胞蛋白、宿主细胞碎片和内毒素。已经令人惊奇地发现，相对于实施例2.2所述的通过标准HPH方案所获得的细胞匀浆中的dsDNA含量，本发明的方法显著减少了高达2、3、4、5、6、7、8、9或10倍或甚至更多的dsDNA含量。本领域技术人员能够通过例如可购买得到的荧光或比色检测来确定给定样品中的dsDNA含量。优选地，当使用本发明的方法时，细胞释放的dsDNA减少了5倍，更优选减少了10倍，或更少，诸如所释放的dsDNA减少了100倍或1000倍。
本文所使用的“内毒素”与脂多糖(LPS)交替使用，其是革兰氏阴性菌的外部细胞膜的主要成分。一旦细菌外部细胞膜破坏。典型地会释放内毒素。令人惊讶的是，与如实施例2.2中所述的通过标准HPH方案获得的细胞匀浆中的内毒素含量相比，本发明的方法已经显示减少了释放的内毒素的量。优选地，当使用本发明的方法时，细胞所释放的内毒素减少了5倍，更优选减少了10倍，或更少，诸如减少了100倍、1000倍、104倍、105倍或106倍。本领域技术人员能够通过例如使用鲎变形细胞溶解物(LAL)凝胶检测、LAL显色检测和其它可商购或本领域已知的显色检测而容易地确定内毒素的含量。
培养能产生生物分子的细胞(即“产物”)
在应用本发明的吸附剂之前，本文所定义和描述的获得生物分子的方法可任选包括培养(宿主)细胞的步骤，其会产生例如表达生物分子(所述“产物”)，优选表达产物诸如蛋白质或多核苷酸。在本发明的宿主细胞的描述中，在培养基(或者有血清或者没有血清)中，术语“细胞的培养”或“培养细胞”分别是指将细胞接种于培养容器中，在贴壁培养的情况下细胞在培养基中生长直至形成单分子层，或在悬浮液培养液的情况下，细胞在培养基中生长直至建立足够的细胞密度，和/或是一旦形成单分子层时在培养基中维持细胞，或是在悬浮液中维持细胞。在培养基中，术语“细胞的培养”或“培养细胞”还包括使用无血清培养基以进行上述所提及的所有步骤，以便在细胞的整体培养过程中，不存在或本质上不存在动物血清产物。培养细胞可通过指数喂养、或线性、或常数喂养，或其它类型的喂养、补料分批培养或高密度培养来进行培养。还可选择的是，上述提及的步骤还可结合包含培养基的血清进行。
核苷酸序列和/或编码的多肽相对于细胞可以是或可以不是异源的。所谓“异源”的意思是源自具有不同基因组背景的细胞或生物体，或者相对于(宿主)细胞是同源的，但是相比于自然发生对应的所述核苷酸序列，其位于不同的基因组环境。这意味着，如果核苷酸序列相对于宿主是同源的，则它不位于它在所述宿主飞基因组中的天然位置，尤其是它被不同的基因所包围。
在本发明一个优选的实施方案中，所述表达产物是蛋白质的产物。本文使用的“蛋白质的”是指任意一组复合有机大分子，其包括碳、氢、氧、氮，通常还包括硫，由一条或多条氨基酸链所组成。优选的蛋白质的表达产物为多肽。因此，术语“蛋白质的”还意为与蛋白质相关的、由蛋白质组成的、类似蛋白质的或与蛋白质有关的。在本发明一个更优选的实施方案中，所述产物是所产生的感兴趣的多肽。优选地是，所述产物是具有生物活性的。所述蛋白质产物可以是酸性或碱性。
所述表达产物可以是核苷酸序列转录和/或翻译的产物，优选在基因工程的宿主细胞中通过本领域已知的常规手段和方法被外源添加至细胞的核苷酸序列。所述产物可以是包括例如质粒、微环DNA、粘粒、BAC、ssDNA或dsDNA序列或RNA序列(核酶、反义RNA、siRNA、iRNA、miRNA核酸，诸如此类)的核苷酸序列，所有这些能够在细胞中产生，或者其可以是通过在细胞中翻译转录RNA的方式产生的肽或多肽。
本文使用的“多肽”包括蛋白质、肽、多肽及其片段，所述“多肽”全部优选是有生物活性的。术语“多肽”和“蛋白质”可交替使用，其是指具有任意长度，通常具有多于约10、20或30个氨基酸的聚合物。这些术语还包括通过包括糖基化、乙酰化和磷酸化反应翻译后修饰的蛋白质。所述多肽类可以是融合于用于延长半衰期的融合伴侣的融合多肽，例如作为亲和色谱的亲和标记物的Fc融合、白蛋白融合，或者用于提供正确的N-末端或用于增加感兴趣的蛋白的产量的融合伴侣。术语“肽”是指较短的氨基酸，通常少于约30个氨基酸。多肽可作为激动剂或拮抗剂，和/或具有治疗或诊断的用途。
此外，尽管也能够生产微生物和酵母产品，但在本发明的细胞中所表达的多肽可以是哺乳动物起源。
哺乳动物多肽或蛋白质的实例包括激素，细胞因子，淋巴因子，抗体如抗原结合片段(Fabs)、纳米抗体、单域抗体(dAbs)、单链抗体(scFvs)，受体，粘附分子和酶及其片段。所期望产物的非详尽的列表包括例如人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺素、促甲状腺激素，卵泡刺激素生长，黄体化激素，激素释放因子，脂蛋白，α1-抗胰蛋白酶，胰岛素A链，胰岛素B链，胰岛素原，降血钙素，胰高血糖素，分子诸如肾素，凝结因子如VIIIC因子、IX因子，组织因子，血管性血友病因子(vonWillebrandsfactor)，抗凝血因子如蛋白C，心房钠尿因子，肺表面活性物质，纤溶酶原激活物如尿激酶、或人尿、或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，铃蟾肽，凝血酶，造血生长因子，肿瘤坏死因子α和β，脑啡肽酶，RANTES(正常T细胞表达和分泌的活性调节)，人巨噬细胞炎性蛋(MIP-1-α)，血清白蛋白例如人血清清蛋白，副中肾管抑制物质，松弛素A或B链，前松弛素(prorelaxin)，小鼠促性腺激素相关肽，脱氧核糖核酸(Dnase)，抑制素，激活素，激素或生长因子受体，整联蛋白，蛋白A或D，类风湿因子，神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，包括血管内皮生长因子(VEGF)的生长因子，神经生长因子如NGF-，血小板源性生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子如aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5、FGF-6，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，其包括TGF-pl、TGF-p2、TGF-p3、TGF-p4或TGF-p5，胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-11)，des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白，CD蛋白质如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19，红细胞生成素，骨诱导因子，免疫毒素，骨形态发生蛋白(BMP)，干扰素如干扰素α、β和γ，集落刺激因子(CSF)例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF，白细胞介素类(IL)例如IL-1至IL-10，超氧化物歧化酶，红细胞生成素，T-细胞受体，表面膜蛋白例如HER2，诱饵加速因子，病毒抗原诸如例如AIDS包膜部分，运输蛋白，归巢受体，禀呈素，调节蛋白，抗体，嵌合蛋白如免疫粘附素，以及上述所列举任一项多肽的片段。
本文优选的多肽和蛋白质是具有治疗作用的蛋白质，诸如TGF-β、TGF-α、PDGF、EGF、FGF、IGF-I、DNase；纤溶酶原激活剂，如t-PA；凝结因子，如组织因子和VIII因子；激素，如松弛素和胰岛素；细胞因子，如IFN-y；嵌合蛋白，如TNF受体IgG免疫粘附素(TNFr-IgG)，或抗体如双特异性抗体、骆驼抗体及其片段、VHH域抗体、域抗体；免疫球蛋白类，如抗-IgG、抗-IgA、抗-IgM、抗-IgD或抗-IgE。优选的具有治疗作用的蛋白质是人源蛋白质或“人源化”蛋白质，如本文上述的人源化抗体。
如果产物是多肽，该多肽可以优选允许所述多肽分离和/或纯化的异源多肽标记，即融合。所述异源多肽可以例如是组氨酸标签、Flag-标签、链霉亲和素标签、链球菌II标签、内含肽、麦芽糖结合蛋白质、IgA或IgGFc部分、蛋白质A或蛋白质G。
如果所述产物是包括核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列可与异源核苷酸序列融合，该异源核苷酸序列允许所述作为核苷酸序列的表达产物分离和/或纯化。例如，所述异源核苷酸序列能够结合至互补的核苷酸序列，由此允许所述核苷酸序列的分离和/或纯化。当在异源多肽或核苷酸序列的描述中使用“异源”时，其意为多肽或核苷酸序列不同于所需要产物的多肽或核苷酸序列。
作为多核苷酸的实例，如果所述产物为质粒，则所述质粒对于基因治疗或DNA疫苗是有用的，或所述质粒可编码具有治疗作用的蛋白质，例如本文所述的蛋白质。
在另一方面，所述细胞可表达病毒，也就是说该宿主细胞作为生产细胞系，其能提供例如适当的病毒复制和/或被传播的环境。因此，所述产物可以是病毒。事实上，任何病毒能够被本发明的方法回收，例如dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒,痘病毒类)、ssDNA病毒(例如细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤)、(+)ssRNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)、(-)ssRNA(例如正粘病毒、弹状病毒)、ssRNA-RT病毒(例如逆转录病毒)和dsDNA-RT病毒(例如嗜肝病毒)。病毒复制的术语用于描述在靶细胞中的感染和繁殖的过程中形成病毒。从病毒的角度看，病毒复制的目的是为了允许这种类型的病毒的生产和生存。通过产生其基因组的丰富副本以及将这些副本包装到病毒中，该病毒能够继续感染新的宿主。本发明的上下文中，优选地，通过适当宿主细胞产生的病毒不能够或本质上不能够退出宿主细胞，例如通过裂解或萌芽。
如前所述，所述产物可以是病毒。“病毒”包括“天然”病毒和“重组”病毒，其中，“天然”意为从自然中分离但不是通过基因工程(例如临床分离)得到的病毒，或能够在自然(也就是说，自然发生的)中发现的病毒，或典型地建立的病毒株，例如用于免疫目的(例如致弱病毒)。
总而言之，本发明提供的方法快速、高效和成本低，能够容易地应用于工业规模。
实施例
实施例1：由离子交换树脂制备微颗粒
用于水处理的树脂珠购自DOW。表1示出了经测试的树脂概况。
表1
所有树脂经预处理为它们的钠或氯形式分别用于阳离子交换剂(MarathonMSC，AmberliteIRC748)和阴离子交换剂(MarathonA2，AmberliteIRA458)。之后颗粒经去离子水(<1mS/cm，pH中性)重复清洗。图1示出了树脂官能团的概况。
微粒在NETSCH公司以LabstarLS1砂磨机湿磨或使用杵和研钵手动湿磨。表2示出了经研磨获得的平均粒径分布(PSD)概况。通过光学显微镜放大1000x来测量粒径，通过计算500-50000离散投影来估算平均当量直径。
表2：粒径分布
光学投影的磨碎颗粒的形状被认为是不明确的。悬浮液浓度经离心进行调节并在去离子水中由填充床体积来估计。根据湿树脂和干树脂的重量差来计算含水量。
实施例2：回收靶蛋白
实施例2.1通过CSPE回收靶蛋白
将大肠杆菌(HMS174)细胞在37℃(GFPmut3.1)和30℃(SOD)的分批补料中培养。IPTG诱导重组蛋白表达。通过离心来收集细胞。室温下，对等分样品进行蛋白质萃取实验。最初的细胞体积浓度(湿填充床)大约为10％v/v。这在4000rcf下离心50ml的悬浮液10分钟来确定。各种细胞和盐浓度的实验中，颗粒在各自的缓冲液中经充分混合而悬浮。通过向50％悬浮液中加入10x的储备溶液并使用ddH2O稀释而将最终细胞、颗粒、缓冲液和盐浓度调节至工作体积(20ml)。室温下(～23℃)于搅拌烧杯(混合)或试管(静态)中进行多达3小时的培养。两者具有相似的高径比。使用底部的便捷磁力搅拌器将混合强度调整至800rpm。为了量化释放蛋白，取1ml等分样品经各自的缓冲液以1：2稀释。随即样品于8000rcf下经离心多达10min(～23℃)，上清液被收集用于进一步研究。
实施例2.2：通过HPH萃取靶蛋白
将大肠杆菌(HMS174)细胞在37℃(GFPmut3.1)和30℃(SOD)的分批补料中培养。将细胞在缓冲液(50mMTris，pH8.0，100mMNaCl)中悬浮至25％v/v并经高压匀质化(Niro-SoavePanda2k，100Mpa下2x通过)而被破坏。
实施例3：利用荧光量化靶蛋白
实施例3.1：荧光
使用阴离子交换(AIEXCaptoQ)、疏水作用(ButylSepharose)和凝胶过滤(SuperdexG75制备级)色谱分析连续纯化澄清的大肠杆菌匀浆(10000rcf下离心60分钟并经0.2微孔过滤)来制备GFPmut3.1标准品(>95％)。浓度由280nm(在100℃下8M尿素中变性10分钟)处的吸光度确定。当量荧光在酶标仪(TecanGENiosPro)上485nm(激发)和535/20nm(发射)处的标准校正来确定。
相对于HPH细胞破碎(如实施例2.2所述，在100Mpa下2个通道(passages))量化GFP的回收效率(回收率％)。
实施例3.1.1：细胞浓度
确定来自通过在磨碎的MarathonA2(MA2)上吸附并以NaCl洗脱而回收的大肠杆菌细胞中的GFP的回收率。在体积浓度20％(v/v)、6％(v/v)和1％(v/v)下，细胞经离心并悬浮于50mM，pH8.0的TRIS而从细胞培养液中被分离。细胞悬浮液与各种体积比率200％、100％、50％和0％的树脂混合并静态培养1小时。通过以2MNaCl以1:2稀释的等分悬浮液进行洗脱。水相中的GFP通过荧光被量化。相同条件下使用磨碎的MarathonMSC(MMSC)来与阳离子树脂比较。
图2显示了在细胞浓度为6％(v/v)时GFP的回收率达到100％。在细胞浓度为20％(v/v)时所萃取的蛋白的量减少至50％以下。相反，向20％(v/v)细胞悬浮液中加入较少量的微粒引致了较高的回收率，高达45％。所回收的GFP以1％的量随着微粒量成比例减少。在不加入微粒的情况下，上清液中的GFP低于20％。通过在相同条件下使用磨碎的MarathonMSC(阳离子交换剂)进行培养，没有观察到其对蛋白质萃取和细胞破碎产生影响。
实施例3.1.2：树脂：细胞的体积比率
在不同的树脂：细胞的体积比率下，确定来自通过在磨碎的MarathonA2(MA2)上吸附并以NaCl洗脱而回收的大肠杆菌细胞中的萃取的GFP的回收率。在10％(v/v)下，细胞经离心而从细胞培养液中被分离并悬浮于50mM，pH8.0的TRIS中。所述细胞悬浮液与各种体积比率200％、100％、70％、50％、30％和0％的树脂混合并静态培养1小时。通过以2MNaCl以1:2稀释的等分悬浮液进行洗脱。水相中的GFP通过荧光被量化。
图3显示了经过1小时培养后，通过从磨碎的MarathonA2进行解吸，几乎100％的GFP被回收。不添加MarathonA2时从细胞所萃取的总的可溶性GFP少于20％。
实施例3.1.3：pH和培养时间
在不同pH和培养时间下，确定来自通过在磨碎的MarathonA2(MA2)上吸附并以NaCl洗脱而回收的大肠杆菌细胞中的萃取的GFP的回收率。通过加入NaOH将细胞培养悬浮液的pH调节至7.5、8.0和8.5。细胞悬浮液与体积比率为100％的树脂进行混合，静态培养3小时。通过以2MNaCl以1:2稀释的等分悬浮液进行定期(10、60、120、180分钟)洗脱。水相中的GFP通过利用荧光被量化。在3小时的最大培养时间后，在pH7.5和8.0下，从细胞培养液中可以回收总可溶性GFP约40％和70％。只有在pH8.5时能回收100％的GFP。
实施例3.1.4：pH、树脂：细胞体积比率和培养时间
进一步研究树脂：细胞体积比率在1-100％之间的影响。通过加入NaOH将细胞培养悬浮液的pH调节至7.5、8.0和8.5。细胞悬浮液以各种树脂：细胞体积比率100％、70％、50％、30％和0％进行混合，静态培养3小时。通过以2MNaCl以1:2稀释的等分悬浮液进行定期(10、60、120、180分钟)洗脱。水相中的GFP通过利用荧光被量化。
图4显示了pH对最大回收率具有显著的影响，而所加入的树脂的影响微不足道。在pH8.5时，树脂：细胞比率(v/v)为70％并经2小时静态培养后，其被认为能有效破坏10％(v/v)的细胞悬浮液并能直接从细胞培养液中回收GFP。
实施例3.1.5：盐浓度和GFP吸附容量
在不同NaCl盐浓度(0-500mM)下，确定来自通过在磨碎的MarathonA2(MA2)上吸附并以NaCl洗脱而回收的大肠杆菌细胞中的萃取的GFP的回收率。细胞经离心而从细胞培养液中被分离并悬浮于50mM，pH8.0的TRIS中。使用2MNaCl缓冲溶液调节悬浮液的NaCl浓度。细胞悬浮液以各种树脂：细胞体积比率100％、70％、50％、30％和0％进行混合，静态培养1小时。通过以2MNaCl以1:2稀释的等分悬浮液进行洗脱。水相中的GFP通过利用荧光被量化。
图5显示了在0mMNaCl下，高达100％的GFP被回收。
通过比较解吸前和解吸后(图6)的水相(上清液)中的浓度来研究结合至微粒的GFP的量。GFP量的差被认为吸附至树脂。该趋势符合标准朗格缪尔方程。
实施例3.1.6：以阴离子螯合树脂萃取
还证实了通过使用螯合微粒(图7)从大肠杆菌细胞培养中来萃取蛋白质。与MarathonA2的强碱性季基团相反，由AmberliteIRA748自制的微粒的亚氨基二乙酸基团是具有对多价阳离子有高亲和力的阳离子交换剂。在这种情况下，没有观察到悬浮液的絮凝。
在50mMTRIS，pH8.0缓冲液中，30％和70％v/v体积比率的树脂：细胞(5％v/v)中培养并随后经1MNaCl进行洗脱后，确定使用螯合(磨碎的AmberliteIRA748)和阳离子微粒(磨碎的MarathonA2)而从细胞悬浮液(大肠杆菌)得到的GFP萃取物，与在相同条件下但不经过盐洗脱得到的GFP萃取物相比较(图7a、b)。进一步地，确定在搅拌和静态培养条件下得到的GFP萃取物(图7a、b)。相比于磨碎的MA2中的蛋白质经解吸而被回收，GFP没有被吸附至螯合微粒上。在所进行的规模下，使用螯合微粒进行培养时使用静态或搅拌条件似乎并不影响所产生的蛋白质产量。
实施例3.1.7：洗脱条件对蛋白质萃取的影响
在50mMTRIS，pH8.0缓冲液中，30％、70％和100％v/v体积比率的树脂：细胞(5％v/v)中培养并随后经1MNaCl进行洗脱后，确定使用螯合(磨碎的AmberliteIRA748)和阳离子微粒(磨碎的MarathonA2)而从细胞悬浮液(大肠杆菌)得到的GFP萃取物，与在相同条件下但不经过盐洗脱得到的GFP萃取物相比较。通过在pH8.0，50mMTRIS，使用磨碎的AmberliteIRA748培养大肠杆菌细胞2小时而获得的GFP萃取率高达100％(图8)。随着被添加的螯合微粒体积比率的增加，回收GFP的产量增加。
实施例3.1.8：细胞浓度对蛋白质萃取的影响
搅拌烧杯中，在50mMTRIS，pH8.0缓冲液中，20％、15％、10％和5％细胞体积浓度下的70％v/v树脂：细胞体积比率中培养但不经过盐洗脱后，确定使用螯合树脂(磨碎的AmberliteIRA748)而从细胞悬浮液(大肠杆菌)得到的蛋白质(GFP)萃取物(图9)。悬浮液中较高的细胞浓度有利地影响了螯合微粒的萃取率。确定了涉及大肠杆菌的干重(d.m.)的蛋白质萃取量的GFP萃取动力学(图10)。
实施例4：利用SDSPage量化靶蛋白
大肠杆菌匀浆中重的固体部分在4000rcf下离心15分钟被分离出。上清液被转移，其中轻的部分在4000rcf下离心60分钟被收集。颗粒在去离子水中悬浮，随后如前述被依次洗涤两次。细胞碎片和粗的匀浆的标准样品以，pH8.0的10M尿素以1:5稀释并在旋转振动筛上培养1小时。
在1：4SDS样品缓冲液和0.2MDTT中，所有的样品在100℃下加热10分钟。在200V、最多为400mA下、MES-SDS电泳缓冲液中，在8-12％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳60分钟。使用考马斯亮蓝R250和BismarkBraunR(Choi等人，1996)进行染色。利用光学凝胶扫描(EpsonPerfectionScanV770,600dpi，16bit灰度模式)软件进行光密度测定，以LumiAnalyst(v3.0RocheDiagnostics)软件进行评估。
实施例4.1：SOD萃取
证明来源于经AmberliteIRA458制得的阳离子微粒所培养的大肠杆菌细胞的蛋白质萃取物。与MarathonA2的聚苯乙烯/二乙烯苯(PS/DVB)基质相比，由丙烯酸树脂所获得的微粒在相同填充床体积下包含更多的水。使用丙烯酸微粒(较大的絮凝物和较快的沉淀)的絮凝明显增强，但并没有进行详细研究。此外，靶蛋白是超氧化物歧化酶(SOD)而不是(GFP)。
实施例4.1.1：不同培养条件下的蛋白质产量
在试管中，50mM，pH8.0的TRIS缓冲液中【请指出】，50％、70％和100％v/v体积比率的树脂：细胞(10％v/v)中静态培养并随后经NaCl进行洗脱后，使用丙烯酸树脂(磨碎的AmberliteIRA458)而从细胞悬浮液(大肠杆菌)得到的蛋白质(SOD)萃取率被确定。通过密度法从SDS-Page上的标准校准来评估蛋白质的量(图11)。使用丙烯酸树脂静态培养1小时后的SOD释放动力学基本完成。以0.5M和1.0MNaCl回收吸附在丙烯酸微粒上的SOD至相等的量。
实施例4.1.2：从大肠杆菌匀浆中回收SOD
经过短暂混合和培养(50mMTRIS，pH8.0)并随后使用NaCl(0.0M、0.5M、0.1M)进行洗脱后，使用AmberliteIRA458微粒(树脂：细胞体积比率100％、70％、50％v/v)培养后，确定从10％(v/v)细胞悬浮液得到的大肠杆菌匀浆中SOD的回收率。在浓度为0.5M和1.0M下洗脱，被吸附至AmberliteIRA458微粒上的SOD所被回收的量相等(图12)。
实施例4.1.3：SOD吸附容量
研究结合至微粒上的SOD的量。
SOD标准(>95％由SDS-Page的考马斯染色鉴别)通过以下来制备：使用A2微粒从大肠杆菌细胞萃取和在70％v/v(树脂/细胞)50mM，pH8.0TRIS缓冲液中经培养2小时后使用0.2MNaCl解吸并随后通过凝胶过滤进行纯化(GE的SuperdexG75制备级)。根据在280nm(100℃下8M尿素变性10min)处的吸光度来确定浓度。根据SDS-page上5点刻度处的光密度来评估样品浓度。通过相对于标准进行整合，比较经萃取和匀质化所获得的SOD样品浓度。
实施例5：非靶蛋白萃取
通过SDS-Page检查吸附在经磨碎的MarathonA2上的所萃取的GFP的纯度，与匀浆相比较。HPH后，在4000rcf下离心分离大肠杆菌匀浆中重的固体部分(包含例如GFP内含体)15分钟。在4000rcf离心60分钟后，转移上清液并收集轻的均浆部分。该轻的匀浆部分包含细胞碎片和膜蛋白诸如外膜蛋白A(OmpA)，并作为细胞破碎的指示剂。颗粒在去离子水中悬浮，如前述顺序清洗两次。细胞碎片和粗品匀浆的标准样品经10M，pH8.0尿素以1:5稀释，在旋转振动器上培养1小时。使用以50％v/v磨碎的MarathonA2在50mM，pH8.0TRIS中培养细胞3h而萃取得到的粗匀浆、匀浆上清液和洗脱的蛋白进行SDS-Page。等分悬浮液在200、250、300、350、400、450、500和1000mMNaCl中以1:2被稀释。所有样品在相同稀释比率下进行SDS-Page，考马斯染色的光密度测定法用于评估蛋白质的量。经清洗的细胞碎片被应用作为～39kDa(OMP)的主要膜蛋白的参考。
萃取后，与粗品的和澄清的匀浆进行比较，在300mMNaCl解吸条件下只有15％各自17％的非靶蛋白被检测到。相同条件下，在上清液中的轻的匀浆部分中分别发现了6％和12％的蛋白质。
进一步地，匀浆上清液和洗脱的蛋白分别在静态条件下混合的70％v/v的磨碎的AmberliteIRC748和磨碎的MarathonA2，pH8.0，50mMTRIS中培养细胞2小时后进行比较。等分悬浮液在50mMTRIS缓冲液或1MNaCl中以1：2被稀释。所有样品的SDS-Page在相同稀释比率下进行，考马斯染色的光密度测定法用于鉴别蛋白质的量。
GFP回收率根据SDS-Page(考马斯亮蓝)的光密度法来评估，并与洗脱的宿主细胞蛋白特别是膜蛋白(图13、14、15)进行比较。所萃取的蛋白在50％v/v磨碎的MarathonA2，pH8.0，50mMTRIS中培养细胞3小时后，进行比较。等分悬浮液在200、250、300、350、400、450、500和1000mMNaCl中以1：2被稀释。所有样品的SDS-Page在相同稀释比率下进行，考马斯染色的光密度测定法用于鉴别蛋白质的量(图13)。在300mMNaCl下，MarathonA2上清液中的GFP几乎被回收了100％。较高盐浓度下的解吸使较高量的非靶蛋白和轻质蛋白部分被回收(图14)。与上清液高压匀质相比，使用微粒培养细胞分别萃取了平均15％的轻质蛋白部分和平均20％的非靶蛋白。
考马斯染色检测的蛋白质图谱显示了在利用HPH破坏的细胞的上清液中的蛋白纯度与使用微粒萃取的蛋白纯度不同。图15示出了匀浆上清液的蛋白质图谱，以及使用50％v/v磨碎的MarathonA2，在pH8.0，50mMTRIS中培养细胞3小时后使用300mMNaCl洗脱后的蛋白质图谱。样品的SDS-Page在相同稀释比率下进行，考马斯染色的光密度测定法用于鉴别蛋白质相对量。匀浆中GFP的相对纯度为9.8％，在300mMNaCl洗脱液中GFP的相对纯度为37.4％，经过萃取后平均值为33.2％±2.9％。
在另一方法中，使用70％的磨碎的Amberlite748在pH8.0，50mMTRIS培养细胞2小时后，确定匀浆上清液和萃取的蛋白质的蛋白质图谱定。样品的SDS-Page在相同稀释比率下进行，考马斯染色的光密度测定法用于鉴别蛋白质相对量。匀浆中的GFP的相对纯度为12.4％，上清液中的GFP的相对纯度为38.4％，经过萃取后的平均相对纯度为41.6％±2.7％。
在50mM，pH8.0(10％v/v)TRIS缓冲液中静态培养细胞，随后经NaCl洗脱，在使用阳离子树脂(MarathonA2)而从细胞悬浮液(大肠杆菌)萃取蛋白质(SOD)动力学过程中，确认所述非靶蛋白的减少。通过从SDS-Page的光密度测定来估算非靶蛋白的量。从细胞萃取的SOD纯度比使用苯乙烯微粒从匀浆中捕获的SOD纯度高出两倍。
实施例6：SOD活性
使用苯乙烯阳离子微粒MarathonA2(MA2)在50mM，pH8.0TRIS缓冲液，70％v/v体积比率树脂：细胞(10％v/v)中静态培养细胞并随后经0.5MNaCl洗脱后，从细胞悬浮液(大肠杆菌)和匀浆中进行萃取后，确定了使用苯乙烯阳离子微粒MarathonA2(MA2)而从细胞萃取的SOD的酶活性。上清液经离心(1ml，30min，23℃和16000rcf)、过滤(PVDF膜，0.2μm)和经各自的缓冲液以1:10逐步稀释至有效测量范围。SOD活性由购自Sigma的19160SOD测定试剂盒来确定。使用(MA2)微粒从细胞萃取的SOD的酶活性比从匀浆捕获的SOD的酶活性平均增大了一个单位。
实施例7：污染物
使用购自英杰公司的Quant-iTTM dsDNA检测试剂盒量化DNA。使用购自Lonza公司的PyroGeneTM重组因子C检测系统量化内毒素。所有的上清液样品经离心(1ml，30min，23℃和16000rcf)、过滤(PVDF膜，0.2μm)和经各自的缓冲液以1:10逐步稀释至有效测量范围，根据酶标仪(GENiosPro或Infinite200M，来自Tecan)上各自的试剂盒指示说明进行测量。
实施例7.1：dsDNA
使用丙烯酸树脂(AmberliteIRA458)和阳离子树脂(MarathonA2)在50mM，pH8.0TRIS缓冲液，50、70、100％v/v体积比率树脂：细胞(10％v/v)中静态培养细胞并随后经NaCl洗脱后，确定了在从细胞悬浮液(大肠杆菌)萃取蛋白质(SOD)的过程中dsDNA减少了。如上述量化DNA。使用微粒培养细胞所释放的dsDNA减少了高达102。蛋白质洗脱条件(0.5MNaCl)下，上清液中的dsDNA减少量在102和103之间(图16)。
实施例7.2：内毒素
在50mM，pH8.0(10％v/v)TRIS缓冲液中静态培养细胞，随后经NaCl洗脱后，在使用阳离子树脂(MarathonA2)从细胞悬浮液(大肠杆菌)萃取蛋白质(SOD)动力学过程中，确定内毒素减少。如前所述量化内毒素的量。
在洗脱条件下被释放至上清液的内毒素比从匀浆所吸附的内毒素减少103(图17)。在0.5MNaCl和1.0MNaCl中内毒素减少了约10倍。
实施例8：显微技术
实施例8.1：原子力显微镜(AFM)
使用蔗糖(50mM)溶液、去离子水和微粒稀释悬浮液依次处理带正电荷的显微切片。经每一个步骤后，65℃下干燥24小时。在BOKU(Dr.GerhardSekhot)公司的纳米生物技术部门进行测量。
开源软件Gwyddion(v2.60)用于AFM数据的可视化。由于原珠机械磨损的结果，明显产生了边缘表面形貌。磨碎的颗粒具有类似的表面形貌(图18)。
使用磨碎的MarathonA2进行培养前和培养后，利用大肠杆菌的AFM(图19)所产生的图像表明蛋白质不经过细胞破碎而被萃取。
实施例8.2：光学显微技术
在维也纳生物技术研究所(VIBT)，在莱卡“活细胞”宽视野显微镜上进行共聚焦显微技术和荧光显微技术。样品在各自缓冲液中被稀释至～1％v/v的固体浓度，1000倍放大(莱卡HCXPLAPO100x1.4油)下能够可见。
1000倍放大下进行明视野(BF)、微分干涉对比(DIC)和荧光显微技术。在默认的GFP的激发和发射波长下，细胞是移动的，有亮荧光。细胞通过被吸附至微粒上而被固定(图20)。
实施例9：细胞活性
实施例9.1：BacLite
使用MarathonA2微粒(70％树脂：细胞体积比)静态培养(50mMTRIS，pH8.0)2小时并在生理缓冲液中以1:10被稀释后，大肠杆菌细胞(10％v/v)的存活率。细胞经“BacLite”(英杰公司)染色。图21示出了活细胞(绿色)和死细胞(红色)。
实施例9.2：柯赫氏板(Koch’splates)
使用磨碎的MarathonA2和AmberliteIRA458所获得的微粒(70％v/v树脂：细胞比)在50mM，pH8.0TRIS中静态培养大肠杆菌细胞(10％v/v)3小时后，确定细胞活性。细胞(大肠杆菌GFP)和细胞/树脂悬浮液(1ml等分)被渐进化稀释，并在无菌的0.9％w/wNaCl中以1:10充分混合。蒸汽压力罐中，默克公司的用于微生物的营养琼脂(NA)以20g/l存在于ddH2O中，121℃下被加热15分钟。等分(1ml)稀释缓冲液被倾倒入培养皿中，与55℃下调节的NA溶液混合。室温下30分钟后，认为完全形成凝胶，将该板37℃下过夜培养30小时。
使用阳离子微粒培养后，确定了更多的菌落形成单位(CFU)并高达103。在生理缓冲液中被稀释1000倍，表明被吸附的细胞不能繁殖后，获得微粒相关的CFU值。
在经10倍稀释而不使用树脂的细胞和使用阳离子微粒进行萃取GFP后经1000倍稀释的细胞中，利用光学显微镜来确定细胞的身份。尺寸、形状和荧光性与大肠杆菌GFP相符合。
实施例10：疏水微粒
制备疏水微粒
吸附型树脂由DOW提供：AmberliteXAD4、AmberliteXAD7HP和AmberliteXAD761购于SigmaAldrich，Vienna，Austria，2011。
使用电动机驱动陶瓷涂层的研钵研磨树脂过夜(20g，～12小时)。研磨的树脂在水中(～10％v/v，添加50ml)悬浮。上清液在4000xg(相当于相对离心力)下离心30分钟。树脂在离心分离1分钟(4000xg)的2M氯化钠(50ml)中重新悬浮。丢弃离心1分钟后的颗粒。转移上清液，再次离心30分钟(4000xg)，丢弃上清液，磨碎的树脂在水中重新悬浮(1：2)，移入试管。在4000xg下离心树脂，丢弃上清液，树脂在50ml水性清洗液中重新悬浮。
清洗顺序为：
1x50％EtOH(稀释有机残留物)
3x去离子水(稀释EtOH)
疏水微粒的粒径
通过测量1％v/v和600x倍放大下约500个颗粒的亮视野显微镜影像来从当量圆直径计算微粒的粒径分布。
微粒和常规色谱介质吸附/解吸的常规方案。
在1mL批量(匀浆或标准蛋白质溶液)中进行解吸和吸附的研究。将50％(v/v)微粒悬浮液(μL)的各种量加入2mL试管中的蛋白质溶液中。与蛋白质浓度和导电率相关的稀释因子被考虑在内。
培养微粒悬浮液30分钟，培养常规色谱介质悬浮液12小时。然后将微粒或常规色谱介质在7000xg下离心10分钟，通过加入1mL洗脱缓冲液来洗脱结合蛋白，充分混合并培养30分钟。在某些情况下，包括使用洗脱缓冲液的第二步清洗步骤。洗脱后，微粒或常规色谱介质如前述被再次离心。上清液中的蛋白质浓度根据光度分析而被量化，靶蛋白的纯度由SDS-PAGE检查。
实施例11：回收酸性生物分子
按下列步骤，使用微粒(MPs)(磨碎的色谱树脂MARATHONA2(MA2))从大肠杆菌粗匀浆进行间歇吸附重组GFP。该实施例使用GFP作为酸性细胞内可溶蛋白。
大肠杆菌菌株HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)以5L规模分批补料工艺进行发酵。使用IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导细胞内可溶靶蛋白GFP(绿色荧光蛋白)表达。
收获和匀质化：将大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，在15000g下离心20分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒进一步处理。该细胞颗粒在50mMTris，pH7.5中重新悬浮，稀释为生物质含量为20％wt的细胞/缓冲液。细胞经高压匀质化在1000bar下被破坏两个通道(twopassages)，产生粗细胞裂解物。
还可能使用冷冻的生物质从所述裂解物进行间歇吸附。这种情况下，该生物质(20％w/v)在50mMTris，pH7.5中重新悬浮，其所应用的破坏程序还可与新鲜发酵的大肠杆菌细胞在这种情况下的破坏程序相同。
捕获靶蛋白
室温下(rt)，以1mL体积的小规模在试管中，以及以高达100mL的规模在玻璃烧杯中进行间歇吸附。将MA2加入至粗细胞裂解物中(每1μg细胞颗粒中加入1μL的50％v/vMA2)，在实验室漩涡混合器中混合～5秒，或在更大规模中以顶置式电子搅拌器混合～30秒。混合过程中，絮凝发生，MA2结合至靶蛋白以及如DNA、hcp(宿主细胞蛋白质)和细胞片段的杂质。经过絮凝后，该样品在13400g下离心3分钟或在顶置式压力的死端过滤器中经1.5bar、0.2μm滤板过滤。丢弃该上清液，该颗粒/滤饼经进一步处理，用于清洗步骤。
絮凝物清洗
该絮凝物的颗粒在含75mMNaCl、pH7.5的50mMTris清洗缓冲液中重新悬浮。经短暂培养后，使用离心(13400g，3分钟)来分离絮凝物。当使用过滤工艺进行分离时，滤饼不会重新悬浮，但是而是通过穿过滤饼过滤清洗缓冲液来清洗滤饼(1.5bar，0.2μm滤板)。丢弃该上清液，进一步处理该颗粒/滤饼，用于洗脱步骤。低盐浓度能够洗脱结合强度低的杂质。
洗脱：洗脱步骤中，经过清洗的絮凝物在含有400mMNaCl，pH7.5的50mMTris缓冲液中重新悬浮。该絮凝物在容量杯中混合5分钟。在400mMNaCl浓度下，所述靶蛋白从MPs洗脱，随即进入上清液中。上清液经离心(13400g，3min)或经过死端过滤(0.2μm滤板，1.5bar)而从絮凝物中分离。丢弃包含结合了杂质的MPs的微粒/滤饼，包含感兴趣的蛋白质(GFP)的上清液经进一步处理。
图22示出了GFP的洗脱图谱。通道1上可见的裂解物样本是纯化过程的起始物料。通道2是标记物(Mark12TM)。通道3显示经过捕获的上清液。缺失的GFP带显示所有的GFP分子都结合至MPs上。洗脱在100-400mMNaCl之间发生。洗脱样品池提供GFP的98％的产量和约60％的通道纯度。
实施例12：使用带正电荷的微粒回收碱性生物分子
本实施例说明了使用由磨碎的MARATHONA2(MA2)树脂得到的MPs从细胞匀浆回收重组表达的碱性蛋白。蛋白干扰素γ、IFN-γ作为实例用于细胞内可溶性表达碱性蛋白。本实施例显示，带正电的交换树脂能够通过结合至多余的细胞结构和细胞内物质(被称为负净化)而用于回收生物分子。
通过分批补料发酵，在大肠杆菌中IFN-γ表达为细胞内可溶。
收获和匀质化
使用表达干扰素γIFN-γ的细胞的冷冻生物质(20％w/v)，并在裂解缓冲液(20mMTris，10mMEDTA，1M尿素，0.1％β-巯基乙醇)中重新悬浮。细胞经950bar高压匀质化破坏三个通道，产生粗细胞裂解物。细胞破碎也将与新鲜生物质一同运作。
靶蛋白的负净化
室温下(rt)以2mL体积的小规模在试管中进行间歇吸附。该粗细胞裂解物与MA2(50％v/v)混合，并在实验室漩涡混合器(每1μg湿细胞颗粒中加入0.7μL的50％v/vMA2)中混合～5秒。混合过程中，絮凝发生，其中MA2结合带负电的如DNA、hcps(宿主细胞蛋白质)和细胞片段的杂质。经过絮凝，该样品经13400g离心3分钟，或在具有顶置式压力的死端过滤器中1.5bar下经0.2μm滤板过滤。丢弃包含结合了杂质的MPs的颗粒/滤饼，包含感兴趣的蛋白质(IFN-γ)的上清液经进一步处理。
图23示出了干扰素γIFN-γ的洗脱图谱。通道1是Mark12TM标记物，随后是通道2-4上用作量化目的的BSA。通道5是细胞匀浆。通道6是上清液样品，其中添加了结合有HCPsDNA和细胞片段的带正电荷的微粒(MarathonA2)。通道7显示了示例性的颗粒清洗和使用1000mMNaCl洗脱杂质的条带。产量高达99％，纯度30％。
实施例13：使用带正电荷的微粒从大肠杆菌细胞回收酸性生物分子
本实施例显示使用由MA2制备的带正电的MPs从完整大肠杆菌细胞萃取酸性细胞内可溶性蛋白。在该实施例中，使用的靶蛋白是GFP。蛋白质的萃取使用两种不同的大肠杆菌菌株HMS174(DE3)和BL21示出，所述菌株具有不同的GFP分子，分别为GFPmut3.1和GFP.1。进行了两个变种的蛋白质萃取。
实施例13.1
大肠杆菌菌株HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)和BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)在5L规模分批补料工艺中发酵。使用IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导表达细胞内可溶靶蛋白GFP(绿色荧光蛋白)。
收获细胞和清洗
收获所述细胞，于4℃下袋中储存过夜(～12小时)。将大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，在15000g下离心20分钟，后以50mM，pH7.5同时包含相同的生物质含量的Tris缓冲液重新悬浮。
细胞絮凝和回收蛋白质
实施例13.1使用减少的量的MPs(30％湿生物质含量，每1mL细胞悬浮液中85μLMA2(50％v/v))来结合大肠杆菌并使大肠杆菌絮凝。当MPs与细胞相互接触时发生萃取，靶蛋白(这里是GFP)被释放并在上清液中积累。经过2-3小时的培养，萃取完全，该絮凝的细胞经死端过滤(0.2μm滤饼，1.5bar)或离心(13000g，3分钟)而被分离。丢弃该细胞颗粒/滤饼，包含靶蛋白的上清液经进一步处理。
实施例13.2
该实施例中，更多的微粒被加入细胞悬浮液。较高的量的微粒允许靶蛋白直接结合和萃取。
大肠杆菌菌株HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)和BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)在5L规模分批补料工艺中发酵。使用IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导表达细胞内可溶性靶蛋白GFP(绿色荧光蛋白)。
细胞收获和清洗
收获所述细胞以及于4℃下袋中储存过夜(～12小时)。大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，在15000g下离心20分钟，后以50mM，pH7.5同时包含相同的生物质含量的Tris缓冲液重新悬浮。
细胞絮凝和回收蛋白质
相比于实施例13.1，实施例13.2使用较高的量的微粒(30％湿生物质含量，每1mL细胞悬浮液中350μLMA2(50％v/v))来结合大肠杆菌并使大肠杆菌絮凝。当微粒与细胞相互接触时发生靶蛋白萃取，该蛋白质直接被MPs结合。经过1.5至2.5小时之间的培养后，萃取完全。上清液经死端过滤(0.2μm滤饼，1.5bar)或离心(13000g，3分钟)而被分离。丢弃该上清液，靶蛋白絮凝的小球经进一步处理。
清洗絮凝物
将絮凝物颗粒重新悬浮于含75mMNaCl、pH7.5的50mMTris清洗缓冲液中。经短时培养后，该絮凝物经离心(13400g，3分钟)而被分离。当使用过滤工艺进行分离时，滤饼不会重新悬浮，而是通过穿过滤饼过滤清洗缓冲液来清洗滤饼(1.5bar，0.2μm滤板)。丢弃该上清液，该颗粒/滤饼经进一步处理，用于洗脱步骤。低盐浓度能够洗脱结合强度低的杂质。
洗脱
洗脱步骤中，经过清洗的絮凝物在含有400mMNaCl，pH7.5的50mMTris缓冲液中重新悬浮。该絮凝物在容量杯中混合5分钟。在400mMNaCl浓度下，所述靶蛋白从MPs洗脱，随即进入上清液中。上清液经离心(13400g，3min)或经过死端过滤(0.2μm滤板，1.5bar)而从絮凝物中分离。丢弃包含结合了杂质的MPs的颗粒/滤饼，包含感兴趣的蛋白质(GFP)的上清液经进一步处理。
图24为显示两种不同培养时间：1小时和2小时下实施例13.2的GFP产量的柱状图。1表示捕获上清液中的GFP的量。2表示在絮凝清洗步骤中的清洗缓冲液中的GFP的量。在1或2中没有发现GFP漏出物。3表示在50mMTris使用400mMNaCl洗脱，其中该GFP从MPs被洗脱并集中于上清液中。4表示经化学破坏方法得到的裂解细胞中的最大量的GFP。
实施例14：使用带正电的微粒从细胞回收碱性蛋白
由磨碎的DowexM-A2阴离子交换树脂制备带正电的微粒，以获得如实施例1所述的微粒。
通过分批补料发酵，在大肠杆菌中IFN-γ表达为细胞内可溶。
细胞收获和清洗
收获所述细胞以及于4℃下袋中储存过夜(～12小时)。将大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，15000g下离心20分钟，后以包含相同的生物质含量的缓冲液(20mMTris，10mMEDTA，1M尿素，0.1％β-巯基乙醇)重新悬浮。
细胞絮凝和回收蛋白质
将MPs(每1mL细胞悬浮液(30％湿生物质含量)85μLMA2(50％v/v))加入细胞悬浮液来结合大肠杆菌细胞并使大肠杆菌细胞絮凝。当MPs与细胞相互接触时发生萃取，该靶蛋白(此处为IFN-γ)被释放并集中于上清液中。经过2-3小时的培养，萃取完全，该絮凝的细胞经死端过滤(0.2μm滤饼，1.5bar)或离心(13000g，3分钟)而被分离。丢弃细胞颗粒/滤饼，包含靶蛋白的上清液经进一步处理。
实施例15：使用带负电荷的螯合微粒从细胞回收碱性蛋白
由螯合阳离子交换树脂AmberliteIRC748制备微粒。
通过分批补料发酵，在大肠杆菌中IFN-γ表达为细胞内可溶。
细胞收获和清洗
收获所述细胞以及于4℃下袋中储存过夜(～12小时)。大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，在15000g下离心20分钟，以包含相同的生物质含量的缓冲液(20mMTris，10mMEDTA，1M尿素，0.1％β-巯基乙醇)重新悬浮。
细胞絮凝和回收蛋白质
将MPs(每1mL细胞悬浮液(30％湿生物质含量)85μLAmberliteIRC748(50％v/v))加入细胞悬浮液来结合大肠杆菌细胞并使大肠杆菌细胞絮凝。当MPs与细胞相互接触时发生萃取，该靶蛋白(此处为IFN-γ)被释放并集中于上清液中。经过2-3小时的培养，萃取完全，该絮凝的细胞经死端过滤(0.2μm滤饼，1.5bar)或离心(13000g，3分钟)而被分离。丢弃细胞颗粒/滤饼，包含靶蛋白的上清液经进一步处理。
实施例16：由离子交换树脂制备微粒
不同类型离子交换树脂购自SigmaAldrich和DIAION。
使用以下阴离子交换树脂：AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-743、Dowex1X2-100、Dowex1X2-400、Dowex1X8-100、MarathonA2、DIAIONSA20A、DIAIONSA10A、DIAIONSA312。
使用以下阳离子交换树脂：Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、MarathonC、MarathonMSC、DIAIONPK216、DIAIONSK110。
在陶瓷涂层的研钵中手动湿磨(20g，1/2h)树脂约30分钟。磨碎的树脂在水中(添加50ml)悬浮。一段时间(约96小时)后树脂沉淀物的上清液被移至试管中。上清液在7000rcf(相对离心力)下被分段(1ml)离心15分钟直至每个试管的约200μl的树脂被收集。树脂经离心(7000rcf)1分钟在2M氯化钠(1.5ml)中重新悬浮。经1分钟离心分离后，丢弃颗粒(除AmberliteIRA-743之外)。上清液被转移并再次离心15分钟(7000rcf)。丢弃经15分钟离心的上清液。微颗粒(约200μl)也在2M氯化钠中离心。微颗粒(约150μl)和其它磨碎的树脂(50-200μl)在水中重新悬浮(1：4)并且其中一部分(50μl树脂)被移入试管中。
等量的树脂在7000rcf下经离心，丢弃上清液，树脂在20倍体积(约1ml)的水性冲洗液中重新悬浮。在溶液中的培养时间为30分钟。
清洗顺序：
-1x50％EtOH(稀释有机残留物)；
-3x去离子水(稀释EtOH)；
-检查接近中性pH；
-微颗粒和磨碎的树脂在去离子水中重新悬浮(约70％v/v)；
-树脂在相应的缓冲液中达到平衡用于特定试验。
使用光学显微镜确定颗粒尺寸
使用基于软件的尺寸测定法，通过光学显微镜来确定所制备的微粒的颗粒尺寸。1000倍放大下估算相对直径来测量磨碎材料和微颗粒的颗粒尺寸。通过比较1％v/v下1000-5000个颗粒的直径尺寸来计算分布。结果见表3。
表3所列出的树脂用于制备微粒。

Claims (18)

1.带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述带正电荷的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，以及其中所述带负电荷的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物分子是多肽或多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒形成絮凝物絮凝物。
4.带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒用于细胞破碎的用途，其中所述带正电荷的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，以及所述带负电荷的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂。
5.前述任一项权利要求所述的用途，其中所述阴离子交换树脂和所述阳离子交换树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的、甲基丙烯酸(MAA)基的。
6.前述任一项权利要求所述的用途，其中所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂为以二乙烯基苯交联的聚苯乙烯。
7.前述任一项权利要求所述的用途，其中所述微粒的平均粒径小于约5μm。
8.前述任一项权利要求所述的用途，其中所述带正电荷的微粒或带负电荷的微粒能够通过研磨聚合的阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂获得。
9.前述任一项权利要求所述的用途，其中所述阴离子交换树脂为AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-485、Dowex1X2-100、Dowex1-8-100、MarathonA2或DIAIONSA20A。
10.前述任一项权利要求所述的用途，其中所述阳离子交换树脂为AmberliteIRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、MarathonMSC或DIAIONSK110。
11.前述任一项权利要求所述的用途，其中所述细胞为真核细胞或原核细胞。
12.一种从生物流体中获得生物分子的方法，包括：a)将权利要求1至10中任一项所定义的带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒加入至生物流体中，并从该生物流体中回收所述生物分子。
13.根据权利要求12的方法，进一步包括：b)允许所述微粒形成絮凝物絮凝物；c)从所述生物流体中去除絮凝物所述絮凝物，以及d)解吸所述生物分子。
14.一种破坏细胞的方法，包括向细胞悬浮液中加入带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒。
15.根据权利要求14的方法，进一步包括从所述细胞中释放生物分子。
16.根据权利要求14或15的方法，其中所述生物分子是多肽或多核苷酸。
17.一种包含带正电荷的微粒和/或带负电荷的微粒的生物流体，其中所述带正电荷的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，以及所述带负电荷的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂。
18.根据权利要求17的流体，进一步包括絮凝物絮凝物。
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