CN117645653A - 人乳头瘤病毒l1蛋白纯化和vlp组装的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法。本发明在人乳头瘤病毒L1蛋白纯化时，使其吸附在层析介质上(阳离子交换介质、阴离子交换介质)，再用不含还原剂(DTT或β‑巯基乙醇)的缓冲液进行预洗，然后再用不含还原剂的洗脱缓冲液洗脱介质上的L1蛋白，最后在洗脱的L1蛋白中补加组装VLP需要的盐类，并调整至合适的离子浓度、pH值等，于4℃静置30min即可形成VLP，且形成的VLP粒径分布均一，电镜观察形成的VLP颗粒完整、结构紧密。

Description

人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法。
背景技术
目前，人乳头瘤病毒L1蛋白在借助基因工程手段(病毒载体、大肠杆菌或酵母等表达系统)表达过程中会形成VLP，纯化时需要加入还原剂(DTT或β-巯基乙醇)以打开二硫键，使VLP还原成L1单体蛋白，使可能存在于VLP内部的杂蛋白或核酸释放出来，在L1蛋白得到纯化后，再通过某些方法(超滤或透析)去除还原剂并置换缓冲液，从而使人乳头瘤病毒L1蛋白重新组装成VLP。但是，利用超滤或透析的方法使人乳头瘤病毒L1蛋白重新组装成VLP时，存在以下问题：一是透析时需要使用大量的组装缓冲液，且置换效率低(需要2天)，无法用于大规模生产；二是超滤时，因切向流会影响L1蛋白稳定性，使蛋白容易降解和聚集形成沉淀。
另还有用羟基磷灰石层析，分两步洗脱，收集洗脱组分，得到粒径均一的HPV L1蛋白类病毒样颗粒。
现有技术一般包括如下步骤：
HPV L1蛋白表达产物(可以源于病毒载体、大肠杆菌或酵母等表达系统)→层析纯化→重组装VLP(疫苗抗原)。
但超滤重组装的成本高，需购买超滤系统、中空纤维柱或者膜包；操作较复杂；容易产生蛋白聚集，可能会影响L1蛋白的稳定性；因蛋白聚集较严重，不利于制成半成品时的除菌过滤，会损失较多的目的蛋白；因中空纤维柱或者膜包的吸附，可能会损失一部分目的蛋白。
透析重组装的成本较高，缓冲液用量很大，生产时需购买比较大的容器、磁力搅拌器用于置换缓冲液；耗时长，透析袋置换缓冲液的效率较低，特别是当生产时无法放大体积。
羟基磷灰石层析的成本要高很多，不耐低pH值；介质使用寿命较短，柱头的介质表面很容易受金属离子污染而变色板结，相当于变相增加了成本。
因此，提供一种人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法。该方法中层析纯化步骤，在平衡、预洗、洗脱过程中，均没有添加还原剂(例如：DTT、β-巯基乙醇)，只是在待进行层析纯化的样本中补加了一定量的DTT解聚。VLP的状态很好，澄清，且粒径分布、电镜结果均非常好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法，取表达重组HPV L1的细胞经破碎、离心、盐析、重悬解聚后，层析纯化，重组装；
所述层析纯化的平衡、预洗、洗脱过程中，均不添加还原剂；
所述重组装具体为：在洗脱的L1蛋白中补加组装VLP需要的盐类或表面活性剂中的一种或多种，并调整至合适的离子浓度、pH值，于4℃组装30min，获得VLP。
在本发明的一些具体实施方案中，所述还原剂包括DTT或β-巯基乙醇。
在本发明的一些具体实施方案中，所述组装VLP需要的盐类包括NaCl、Ca2+或Mg2+中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述VLP包括但不限于HPV6 L1VLP、HPV11L1VLP、HPV16 L1VLP、HPV18 L1VLP、HPV31 L1VLP、HPV33L1VLP、HPV35 L1VLP、HPV39 L1VLP、HPV45 L1VLP、HPV51 L1VLP、HPV52 L1VLP、HPV56 L1VLP、HPV58 L1VLP、HPV59 L1VLP、HPV68L1VLP，或上述型别修饰后的型别HPV16 cVLP、HPV18cVLP、HPV31 cVLP、HPV58 cVLP中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述层析纯化包括阳离子交换层析和阴离子交换层析；
所述阳离子交换层析的洗脱液包括10mM磷酸盐，100mM～300mMNaCl，pH6.0～pH6.8；
所述阴离子交换层析的洗脱液包括10mM磷酸盐，100mM～300mMNaCl，pH6.8～pH8.0；
所述洗脱液不包括还原剂。
在本发明的一些具体实施方案中，如果所述阳离子交换层析的纯度≥80％，可直接用于重组装；如果所述阳离子交换层析的纯度＜80％，则调整洗脱样本至10mM磷酸盐、50mMDTT、电导率≤4.0mS/cm、pH6.8～pH8.0，然后进行阴离子交换层析。
在本发明的一些具体实施方案中，所述调整合适的离子浓度包括调整NaCl的终浓度为150mM～500mM，电导率为15.0mS/cm～47.0mS/cm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述离心为14000rpm、4℃离心30min；
所述重悬使用的缓冲液包括10mM磷酸盐、50mM DTT，pH6.0～pH6.8，所述解聚为4℃条件下解聚16h。
在本发明的一些具体实施方案中，如果所述重组装后的纯度＜95％，所述重组装后还包括精纯的步骤；
所述精纯采用分子筛精纯，选用4FF层析，洗脱条件为：10mM磷酸盐、150mM NaCl，pH7.2。
基于上述研究，本发明还提供了上述方法制得的VLP，和/或根据所述VLP制得的产品；所述产品包括但不限于疫苗。
本发明在人乳头瘤病毒L1蛋白纯化时，使其吸附在层析介质上(阳离子交换介质、阴离子交换介质)，再用不含还原剂(DTT或β-巯基乙醇)的缓冲液进行预洗，然后再用不含还原剂的洗脱缓冲液洗脱介质上的L1蛋白，最后在洗脱的L1蛋白中补加组装VLP需要的盐类，并调整至合适的离子浓度、pH值等，于4℃静置30min即可形成VLP，且形成的VLP粒径分布均一，电镜观察形成的VLP颗粒完整、结构紧密。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1中HPV16 cVLP重组装样本纯度测定(银染图谱)；其中，第1泳道为Marker，用于标定蛋白分子量大小；第2泳道为BSA标准品，可作为参比条带，根据灰度值来给目的条带进行定量；第3泳道为重组装样本；
图2示实施例1中HPV16 cVLP重组装样本的DLS粒径分析结果；
图3示实施例1中HPV16 cVLP重组装样本电镜结果；
图4示实施例2中HPV18 cVLP精纯(4FF层析)样本纯度测定(银染图谱)；其中，第1泳道为BSA标准品，可作为参比条带，根据灰度值来给目的条带进行定量；第1泳道为Marker，用于标定蛋白分子量大小；第3、4、5、6、7、8泳道为精纯样本；
图5示实施例2中HPV18 cVLP重组装样本的DLS粒径分析结果；
图6示实施例2中HPV18 cVLP重组装样本电镜结果；
图7示实施例3中HPV6 L1VLP重组装样本纯度测定(SDS-PAGE图谱)；其中，第1泳道为Marker，用于标定蛋白分子量大小；第1泳道为BSA标准品，可作为参比条带，根据灰度值来给目的条带进行定量；第3、4泳道为重组装样本，SDS-PAGE要求纯度分析时的上样量10μg/孔，所以第4泳道更适合用于纯度分析；
图8示实施例3中HPV6 L1VLP重组装样本的DLS粒径分析结果；
图9示HPV6 L1VLP重组装样本电镜结果；
图10示对比例1中超滤重组装DLS粒径分析结果；
图11示对比例2中透析重组装DLS粒径分析结果；
图12示本发明技术方案流程图。
具体实施方式
本发明公开了一种人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
HPV：人乳头瘤病毒；
L1蛋白：人乳头瘤病毒的主要衣壳蛋白；
VLP：病毒样颗粒；
DTT：二硫苏糖醇；
β-ME：β-巯基乙醇；
SDS-PAGE：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，一种用于分离蛋白质的电泳技术。
本发明的有益效果包括但不限于：
(1)所有的层析纯化步骤，在平衡、预洗、洗脱过程中，均没有添加还原剂(例如：DTT、β-巯基乙醇)，只是在待进行层析纯化的样本中补加了一定量的DTT解聚；
(2)在重组装过程中，因层析纯化后的样本中已不含还原剂(例如：DTT、β-巯基乙醇)，故只需添加有助重组装的各类母液(例如：NaCl、Ca2+、Mg2+、表面活性剂等)，在pH6.2～8.0之间(即层析纯化后样本的pH，基本无需调整)，4℃低温组装30分钟，即可形成VLP，VLP的粒径分布、电镜结果均比较好。
(3)成本低：
①节省还原剂的用量(DTT或β-巯基乙醇)；
②节省了设备、耗材，在传统重组装方法中需要购买超滤系统、中空纤维柱或者膜包、透析装置、透析袋等；
③节省了缓冲液的消耗，在传统重组装方法中需要大量的缓冲液来去置换去除残存的还原剂。
④选用的层析填料(阳离子交换介质、阴离子交换介质)，相较于羟基磷灰石介质要便宜非常多，而且使用寿命也远优于羟基磷灰石介质。
(4)重组装过程非常简单，大大节省了人力成本。
(5)重组装样本状态很好，澄清，且粒径分布、电镜结果均非常好。
(6)因没有引入超滤、透析，不存在死体积、吸附等，目的蛋白回收率很高。
本发明提供的人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1～实施例3
本申请采用的是昆虫细胞—杆状病毒表达体系，本工艺适用的型别有HPV6L1VLP、HPV11 L1VLP、HPV16 L1VLP、HPV18 L1VLP、HPV31 L1VLP、HPV33 L1VLP、HPV35L1VLP、HPV39 L1VLP、HPV45 L1VLP、HPV51L1VLP、HPV52 L1VLP、HPV56 L1VLP、HPV58 L1VLP、HPV59 L1VLP、HPV68 L1VLP，及它们修饰后的型别(如HPV16 cVLP、HPV18cVLP、HPV31cVLP、HPV58 cVLP等)，载体构建是由中国医学科学院基础医学研究所的许雪梅教授完成并提供，细胞培养、发酵表达是由本公司专门负责HPV项目上游工艺开发的人员完成，获得表达重组HPV L1的细胞。
银染、SDS-PAGE、DLS粒径测定，是由本公司质量研究室完成；电镜观察，是委托中国农业科学院长春兽医研究所完成。
试验结果：
1、HPV16 cVLP(实施例1)
①HPV16 cVLP重组装样本纯度测定(银染图谱)如图1所示。第三泳道为重组装样本，上样量2μg/孔，人乳头瘤病毒L1蛋白(目的条带)分子量约为58KDa，无杂带，即纯度≥95％，人乳头瘤病毒L1蛋白浓度500μg/ml。
②HPV16 cVLP重组装样本的DLS粒径分析结果如图2所示。平均粒径为68.89nm，只有一个组分，即病毒样颗粒Peak1＝75.99nm；PdI＝0.128，NanoZS粒度分析仪要求PdI≤0.3时样本状态较好可接受，很明显该组装样本状态很好。
③HPV16 cVLP重组装样本电镜结果如图3所示。病毒样颗粒直径约50nm，壳粒清晰、边缘清楚、结构致密。
2、HPV18 cVLP(实施例2)
①HPV18 cVLP精纯(4FF层析)样本纯度测定(银染图谱)如图4所示。第3、4、5、6、7、8泳道为精纯样本，上样量2μg/孔，人乳头瘤病毒L1蛋白(目的条带)分子量约为58KDa，无杂带，即纯度≥95％，人乳头瘤病毒L1蛋白浓度≥350μg/ml。
②HPV18 cVLP重组装样本的DLS粒径分析结果如图5所示。平均粒径为85.49nm，只有一个组分，即病毒样颗粒Peak1＝96.20nm；PdI＝0.101，NanoZS粒度分析仪要求PdI≤0.3时样本状态较好可接受，很明显该组装样本状态很好。
③HPV18 cVLP重组装样本电镜结果如图6所示。病毒样颗粒直径约50nm，壳粒清晰、边缘清楚、结构致密。
3、HPV6 L1VLP(实施例3)
①HPV6 L1VLP重组装样本纯度测定(SDS-PAGE图谱)如图7所示。第3、4泳道为精纯样本，第3泳道上样量2μg/孔，第4泳道上样量10μg/孔，人乳头瘤病毒L1蛋白(目的条带)分子量约为58KDa，基本无杂带，即纯度≥95％，人乳头瘤病毒L1蛋白浓度≥300μg/ml。
②HPV6 L1VLP重组装样本的DLS粒径分析(Zetasizer Nano ZS 90动态光散射仪，马尔文公司)结果如图8所示。平均粒径为67.10nm，只有一个组分，即病毒样颗粒Peak1＝74.00nm；PdI＝0.120，Nano ZS粒度分析仪要求PdI≤0.3时样本状态较好可接受，很明显该组装样本状态很好。
③HPV6 L1VLP重组装样本电镜结果如图9所示。病毒样颗粒直径约50nm，壳粒清晰、边缘清楚、结构致密。
对比例1超滤重组装
取HPV L1蛋白表达产物(同实施例1～3的表达重组HPV L1的细胞)室温下进行纯化时，裂解液中加入4％β-巯基乙醇(w/w)或50mM DTT对表达产物进行解聚，然后0.22μm过滤杂质，再依次使用DEAE阴离子或CM阳离子交换层析(20mM Tris，180mM NaCl，4％β-ME，pH7.9洗脱)、TMAE或Q阴离子交换层析(20mM Tris，180mM NaCl，4％β-ME，pH7.9洗脱)及羟基磷灰石层析(100mM NaH2PO4，30mM NaCl，4％β-ME，pH6.0洗脱)纯化。纯化产物采用Planova超滤系统，用13KDa中空纤维柱超滤，洗滤126个样本体积的组装缓冲液(20mMNaH2PO4，500mM NaCl，pH6.0)，重组装时间64小时，重组装条件4℃，将样本的缓冲体系置换成组装缓冲液，促使VLP组装。
结果如图10所示。平均粒径为24.29nm，有两个主要组分，分别是五聚体Peak2＝11.63nm、病毒样颗粒Peak1＝108.5nm；PdI＝0.693，Nano ZS粒度分析仪要求PdI≤0.3时样本状态较好可接受，很明显该组装样本较差。
对比例2透析重组装
取HPV L1蛋白表达产物(同实施例1～3的表达重组HPV L1的细胞)室温下进行纯化时，裂解液中加入4％β-巯基乙醇(w/w)或50mM DTT对表达产物进行解聚，然后0.22μm过滤杂质，再依次使用DEAE阴离子或CM阳离子交换层析(20mM Tris，180mM NaCl，4％β-ME，pH7.9洗脱)、TMAE或Q阴离子交换层析(20mM Tris，180mM NaCl，4％β-ME，pH7.9洗脱)及羟基磷灰石层析(100mM NaH2PO4，30mM NaCl，4％β-ME，pH6.0洗脱)纯化。纯化产物于透析袋(MWCO为14KDa)中4℃透析5天(磁力搅拌)，透析液体积约为透析样品的250倍以上，中间每天更换组装缓冲液(组装缓冲液：500mM NaCl，20mM HEPES，2mM CaCl2，0.02％吐温80，pH7.20)。
结果如图11所示。平均粒径为63.38nm，有两个主要组分，分别是五聚体Peak2＝17.24nm、病毒样颗粒Peak1＝115.9nm；PdI＝0.505，Nano ZS粒度分析仪要求PdI≤0.3时样本状态较好可接受，很明显该组装样本较差。
对比例3羟基磷灰石层析
①取含HPV L1蛋白类病毒样颗粒的料液(同实施例1～3的表达重组HPV L1的细胞)进行初步纯化(菌体细胞破碎、过滤、阳离子交换层析)，初步纯化过程中加入还原剂和非离子型表面活性剂，得到初步纯化液；
②调节初步纯化液电导率后，进行羟基磷灰石层析，分两步洗脱，第一步用含盐的pH6.0-9.0的缓冲液I洗脱，第二步用含磷酸根离子的pH6.0-9.0的缓冲液II洗脱，缓冲液I、II均不含还原剂；
③收集缓冲液II的洗脱组分，得到粒径均一的HPV L1蛋白类病毒样颗粒。
羟基磷灰石层析的缺点：
①羟基磷灰石介质较传统的离子交换介质(阳离子交换层析如CM、SP，阴离子交换介质如Q、DEAE)，成本要高很多，不耐低pH值；
②本申请人之前使用羟基磷灰石层析时是收集流穿，因为羟基磷灰石对HPV L1蛋白的吸附效果不好，当然也可能和表达系统(原核表达缺少翻译后修饰)不一样有关(专利CN105907729B：表达人乳头瘤病毒L1蛋白的原核生物(特别是毕赤酵母菌)，而我们公司是昆虫细胞—杆状病毒表达体系)；
③本申请人之前使用羟基磷灰石层析，发现该介质使用寿命较短，柱头的介质表面很容易受金属离子污染而变色板结，相当于变相增加了成本，而离子交换介质相当的皮实耐用。
效果例
分别以本发明实施例1～3和对比例1～3作对比，结果如下：
表1工艺对照表
注：一般HPV重组装的L1蛋白浓度控制在300～500μg/ml，考虑到杂蛋白也会占用介质载量，则1个柱体积的介质可用于吸附至少4个重组装样本体积的蛋白。(即：4个柱体积≈1个重组装样本体积)
表2介质价格对照表
结果表明：对比例1～3
①成本高，需购买超滤系统、中空纤维柱或者膜包，或单价更高的羟基磷灰石介质；
②超滤重组装、透析重组装操作较复杂；
③超滤重组装容易产生蛋白聚集，可能会影响L1蛋白的稳定性；
④超滤重组装因蛋白聚集较严重，不利于制成半成品时的除菌过滤，会损失较多的目的蛋白；
⑤超滤重组装因中空纤维柱或者膜包吸附，会损失一部分目的蛋白。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.人乳头瘤病毒L1蛋白纯化和VLP组装的方法，其特征在于，取表达重组HPV L1的细胞经破碎、离心、盐析、重悬解聚后，层析纯化，重组装；
所述层析纯化的平衡、预洗、洗脱过程中，均不添加还原剂；
所述重组装具体为：在洗脱的L1蛋白中补加组装VLP需要的盐类或表面活性剂中的一种或多种，并调整至合适的离子浓度、pH值，于4℃组装30min，获得VLP。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂包括DTT或β-巯基乙醇。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组装VLP需要的盐类包括NaCl、Ca2+或Mg2+中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述VLP包括但不限于HPV6 L1VLP、HPV11L1VLP、HPV16 L1VLP、HPV18 L1VLP、HPV31 L1VLP、HPV33 L1VLP、HPV35 L1VLP、HPV39L1VLP、HPV45 L1VLP、HPV51 L1VLP、HPV52 L1VLP、HPV56 L1VLP、HPV58 L1VLP、HPV59L1VLP、HPV68 L1VLP，或上述型别修饰后的型别HPV16 cVLP、HPV18cVLP、HPV31 cVLP、HPV58cVLP中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述层析纯化包括阳离子交换层析和阴离子交换层析；
所述阳离子交换层析的洗脱液包括10mM磷酸盐，100mM～300mM NaCl，pH6.0～pH6.8；
所述阴离子交换层析的洗脱液包括10mM磷酸盐，100mM～300mM NaCl，pH6.8～pH8.0；
所述洗脱液不包括还原剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，如果所述阳离子交换层析的纯度≥80％，可直接用于重组装；如果所述阳离子交换层析的纯度＜80％，则调整洗脱样本至10mM磷酸盐、50mM DTT、电导率≤4.0mS/cm、pH6.8～pH8.0，然后进行权利要求5中所述的阴离子交换层析。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调整合适的离子浓度包括调整NaCl的终浓度为150mM～500mM，电导率为15.0mS/cm～47.0mS/cm。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心为14000rpm、4℃离心30min；
所述重悬使用的缓冲液包括10mM磷酸盐、50mM DTT，pH6.0～pH6.8，所述解聚为4℃条件下解聚16h。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，如果所述重组装后的纯度＜95％，所述重组装后还包括精纯的步骤；
所述精纯采用分子筛精纯，选用4FF层析，洗脱条件为：10mM磷酸盐、150mMNaCl，pH7.2。
10.如权利要求1至9任一项所述方法制得的VLP，和/或根据所述VLP制得的产品；所述产品包括但不限于疫苗。
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