CN115838686A

CN115838686A - 一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法

Info

Publication number: CN115838686A
Application number: CN202211529615.4A
Authority: CN
Inventors: 焦义; 廖红军; 杨恒
Original assignee: Tongren Factorr Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tongren Factorr Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明公开一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)采用无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs；(2)对步骤1中的sEVs进行切向流超滤、尺寸排阻色谱处理，制备得到临床级的sEVs。具有可操作性高、可实现规模化扩展、操作时长短、不依赖专有设备、蛋白性杂质去除率高等特点，可获得高纯度的临床级sEVs。可应用于烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域、外泌体载药或者外泌体药物开发领域的临床应用研究。

Description

一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的，涉及一种人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的纯化技术及在制药或医疗整形美容领域的应用。

背景技术

人间充质干细胞(human mesenchymal stem cell)是一类贴壁培养后呈成纤维细胞样形态(纺锤形和梭形)、可在体外自我更新并具有成骨、成脂、成软骨等分化能力的干细胞。人间充质干细胞可由多种人体组织(如骨髓、脐带、胎盘、脂肪、脐带血等)分离得到，也可以通过分化或转分化等方式获得。小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEVs)是由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程，主动分泌的具有双层膜结构的直径小于200nm的微小囊泡。其内含有功能性蛋白质、mRNA及microRNA等物质，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用，广泛参与机体损伤组织修复、基因交换、抗原呈递免疫反应、肿瘤转移等生理病理过程。

小细胞外囊泡(sEVs)尤其是间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs越来越被认为是治疗各种不同疾病的生物治疗剂。为了将它们有效地转化为临床应用，需要满足药品生产质量管理规范(GMP)的可扩展生产流程。与其他生物治疗药物一样，sEVs产品的制造可以细分为上下游过程和后续质量控制，每个环节都包含多个单元操作。在上游处理(USP)期间，细胞被分离、储存(细胞库)和扩增；此外，还生产含有sEVs的条件培养基。在下游处理(DSP)期间，处理条件培养基(CM)以获得浓缩和纯化的sEVs产品。CM要么存储到DSP，要么直接处理。作为DSP中的第一个单元操作，澄清去除剩余的细胞、碎片和其他较大的杂质。每个批次小细胞外囊泡的DSP的关键操作是减少体积与纯化浓缩的EV相结合。

差速离心法是目前最常用的sEVs分离方法，其次还有密度梯度离心法、沉淀法、过滤法、尺寸排阻色谱法以及免疫亲和法等。然而，虽然sEVs的分离技术已经有了很大改进，但是实现sEVs的高纯度、高效率和无损伤的分离仍然是目前sEVs分离领域的主要挑战。比如差速离心法虽然是一种成熟的sEVs分离方法，但是该方法需要昂贵的设备，并且离心力会破坏sEVs的结构和功能，蛋白质的污染也会对sEVs的纯化产生一定的干扰；密度梯度离心法分离sEVs虽然较差速离心法分离纯度更高，但是分离介质的引入会导致sEVs的污染；沉淀法虽然能够高效地进行sEVs的分离，但沉淀介质会对sEVs的纯化产生一定的干扰；超滤法虽然操作简单，但是过滤膜的堵塞会导致sEVs回收率低，而且还会破坏sEVs的结构和功能；SEC虽然是一种分离纯度高、破坏性小的sEVs分离方法，但是由于对上样体积的严格要求，导致该方法只适用于小体积样本的提取；免疫亲和法虽然是目前特异性最好的sEVs分离方法，但是昂贵的试剂和严格的反应条件限制了该方法在大体积样本中的应用；微流控技术虽然是一种新兴的sEVs分离方法，但是受到抗体、滤膜、声波以及电场强度等影响较大，导致该方法的稳定性和重复性较差；基于适配体的磁分离法虽然较基于抗体的磁分离法更加稳定，但是有限的适配体限制了该方法的使用，因此，研发出高效特异性的sEVs分离和纯化方法仍然是sEVs研究和应用的核心环节。同时，确定合适的EV浓缩和纯化方法以扩大规模是治疗性EV领域的主要挑战。

发明内容

本发明的目的在于使用一种无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs，在结合切向流超滤、尺寸排阻色谱的方法，可规模化从上清液中制备临床级的sEVs。具有可操作性高、可实现规模化扩展、操作时长短、不依赖专有设备、蛋白性杂质去除率高等特点，可获得高纯度的临床级sEVs。可应用于烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域、外泌体载药或者外泌体药物开发领域的临床应用研究。

本发明技术方案：一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，包含以下步骤：(1)采用无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs；(2)对步骤1中的sEVs进行切向流超滤、尺寸排阻色谱处理，制备得到临床级的sEVs。

所述的步骤(1)具体操作：(a)华通氏胶分离：将脐带组织按照规程的要求，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm³的组织块；(b)接种：按照0.5～0.6g华通氏胶/T75瓶接种组织块，加入专用无血清培养基进行培养，期间根据培养情况进行换液，观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获；(c)传代：根据收获原代细胞(P0)的数量和活力，将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，经标准条件培养并连续传代至P2，收获并冻存P2代细胞，作为种子细胞库；(d)MSC体外扩增及条件培养基(CM)获得：复苏P2代种子库细胞，进行扩增培养；观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获，传代，收获MSC细胞及条件培养基，条件培养基离心，上清液再用滤膜过滤，-80℃保存备用，作为小细胞外囊泡纯化起始原材料。

所述的切向流超滤具体操作：P2～P8代条件培养上清液，进行超滤浓缩，控制超滤系统的进口压力为30psi，出口压力为10psi，TMP为20psi，在此条件下浓缩20倍，截留液用无菌、无热源的PBS缓冲液开始连续洗滤，调整PBS缓冲液流入浓缩端的速度与透过端的一致，连续洗滤6DV,最后收集浓缩液。

所述的尺寸排阻色谱处理：填料颗粒直径为40～165μm，球形蛋白质分离范围为10～20000kD。

所述的步骤(b)的培养是将T75培养瓶放置于CO₂培养箱中培养，37.0±0.5℃，CO₂浓度为5％。

所述的尺寸排阻色谱处理：(1)SEC柱装填，要求柱高为15cm×20cm(D×H)，理论塔板数≥3000，不对称因子(As)为0.8～1.2；(2)柱平衡，先用无热源注射用水冲洗至少3CV柱体积(CV)，然后用0.5M氢氧化钠溶液清洗3CV，保持NaOH溶液接触填料及层析系统60min以上，无热源注射用水冲洗至流出端pH为中性；最后用pH7.2 PBS平衡至相应的pH与电导值；(3)sEVs纯化：用蠕动泵将经超滤初步浓缩及纯化含sEVs的浓缩液，加载到平衡好的SEC柱中，上样完毕后，切换pH7.2 PBS缓冲液，保持恒定的流速洗脱，根据洗脱体积及OD280变化，收集sEVs组分，-80℃保存或根据制剂浓度需要进一步超滤浓缩。

本发明的有益效果：本申请使用一种无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs，在结合切向流超滤、尺寸排阻色谱的方法，超滤法的优势在于可容易实现大体体积样本的处理，同时可以去除条件培养基中90％左右的杂蛋白及小分子物质，在实现高倍浓缩的同时可纯化sEVs，结合尺寸排阻色谱法，可以温和的分离目标分子量的sEVs，而且不损伤sEVs的结构，同时可进一步纯化sEVs，很容易规模化从上清液中制备临床级的sEVs。与该领域的金标准UC相比，提出的分离方法是一个重大改进。分离的sEV保持其再生特性，而下游污染物被最小化。UF/SEC的使用使得sEV在临床环境中大规模生产所需的标准化和可扩展性得以实现。

同时，本申请方法具有可操作性高、可实现规模化扩展、操作时长短、不依赖专有设备、蛋白性杂质去除率高等特点，可获得高纯度的临床级sEVs。可应用于烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域、外泌体载药或者外泌体药物开发领域的临床应用研究。

附图说明

图1为总蛋白测定结果曲线图；

图2为sEVs纳米粒径分布图(稀释100倍后的粒径分布图)；

图3为Western Blot对sEVs蛋白指标检测结果；

图4为sEVs电镜检测图。

具体实施方式

以通过具体的实施例对本发明内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原材料若无特殊说明，均可从常规商业途径获得。

实施例一：含间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs条件培养基(CM)的获得

1、华通氏胶分离：将捐赠的且经两次传染病筛查合格的脐带组织，按照规程的要求，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm³的组织块；洗涤组织块，收集末次离心洗涤上清液，送检厌氧菌、需氧菌和真菌检测，组织样本保存液送检支原体检测；

2、接种：根据分离胶体重量确定种瓶数，按照0.5～0.6g华通氏胶/T75瓶接种组织块，加入专用无血清培养基，将T75培养瓶放置于CO₂培养箱中培养，37.0±0.5℃，CO₂浓度为5％。期间根据培养情况进行换液，观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获，传代。

3、传代：根据收获原代细胞(P0)的数量和活力，将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，平置培养瓶使细胞悬液能均匀分布整个培养瓶底面，经标准条件培养并连续传代至P2，收获并冻存P2代细胞，P2代细胞经过全检后，如均符合质量标准的要求，则作为种子细胞库；

4、MSC体外扩增及条件培养基(CM)获得：按照需求量复苏P2代种子库细胞，进行扩增培养；观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获，传代，收获MSC细胞及条件培养基，条件培养基1500×g离心15min，去除细胞碎片，残留的细胞等，上清液再用0.22μm的滤膜过滤，-80℃保存备用。每一代次的MSC均作流式表型检测，条件培养基进行无菌、支原体、内毒素检测；所有检测均符合标准，方可作为小细胞外囊泡(small extracellularvesicles，sEVs)纯化起始原材料。

实施例二：用切向流超滤法从条件培养基(CM)中浓缩并初步纯化sEVs

1、超滤系统的准备选用PALL公司的C1超滤系统，使用聚醚砜材质、截留分子量为100kD，面积为0.1m²的超滤膜包，按照规程要求，将膜包及垫片安装至超滤系统的夹具上，用扭力矩调整至合适的力度，连接蠕动泵。系统先用大量注射用水清洗，去除超滤膜包的保存液；再用0.5M氢氧化钠溶液循环60min，去除系统及膜包中的热源物质，用注射用水清洗系统至超滤系统透过端为中性。最后用无菌、无热源的PBS缓冲液润洗系统，备用。

2、浓缩及洗滤取10L收集的保存于-80℃的P2～P8代条件培养上清液置于37℃水浴快速解冻，然后进行超滤浓缩，控制超滤系统的进口压力为30psi，出口压力为10psi，TMP为20psi。在次条件下浓缩20倍，此时系统截留液剩余500ml，然后用3L无菌、无热源的PBS缓冲液开始连续洗滤，调整PBS缓冲液流入浓缩端的速度与透过端的一致，也就是说浓缩端体积维持在500ml左右不变，连续洗滤6DV(3L),操作过程中避免微生物及热源的污染。最后收集500ml浓缩液。

3、尺寸排阻色谱法(SEC)纯化sEVs尺寸排阻色谱法(SEC)填料选取颗粒直径为40～165μm，球形蛋白质分离范围为10～20000kD(葡聚糖分离范围10～5000kD)。

(1)SEC柱装填，选取符合上述要求的凝胶过滤填料，按照要求将分子筛凝胶装填，要求柱高为15cm×20cm(D×H)，理论塔板数≥3000，不对称因子(As)为0.8～1.2。

(2)柱平衡，先用无热源注射用水冲洗至少3CV柱体积(CV)，以去除分子筛填料中的保存缓冲液；接下来用0.5M氢氧化钠(NaOH)溶液清洗3CV，保持0.5M NaOH溶液接触填料及层析系统60min以上，以去除层析系统中的热源及微生物；无热源注射用水冲洗至流出端pH为中性；最后用pH7.2 PBS平衡至相应的pH与电导值。

(3)sEVs纯化，用蠕动泵将250ml经超滤初步浓缩及纯化含sEVs的浓缩液，按照规定的流速加载到平衡好的SEC柱中，上样完毕后，切换pH7.2 PBS缓冲液，保持恒定的流速洗脱，根据洗脱体积及OD280变化，收集sEVs组分，-80℃保存或根据制剂浓度需要进一步超滤浓缩。

在sEVs纯化过程中，所有过程均在符合GMP标准的C级环境下进行，所有接触sEVs溶液的仪器及容器均进行去除热源处理，缓冲液均为无菌、无热源溶液，操作过程中严格控制微生物及热源的污染。

实施例三：sEVs的检测

1、sEVs蛋白浓度和颗粒浓度测定

(1)sEVs蛋白浓度测定

1)在37℃水浴中速融sEVs，并迅速加入5×的RIPA裂解液。

2)混匀后在冰上裂解30min，期间混匀。

3)配制BCA法测蛋白浓度的标准样品，并取5μL样品加入到BCA混合液中，混匀。

4)37℃孵育30min，酶标仪上在OD562 nm处检测吸光值并记录。

5)根据标准曲线算出待测样品蛋白浓度。

2、sEVs纳米粒径跟踪分析

1)用水稀释样本，颗粒浓度在1×107/mL和1×109/mL范围内。

2)采用Zeta View PMX110仪器在405nm激光测定样本中粒子数量和大小。

3)以30张/秒拍摄照片，持续时间为1分钟。

4)采用NTA软件(ZetaView8.02.28)分析颗粒的运动。

5)结果分析和数据报告。

3、Western Blot对sEVs蛋白指标检测

1)将清洗干净的玻璃板固定于制胶板上。

2)按下表给出数据在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配置一定体积的分离胶溶液。依次混合各成分。

10ml分离胶配方

3)迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶，不能有气泡，留出灌注浓缩胶所需空间。然后小心的在分离胶溶液上覆盖1ml异丙醇，这使凝胶表面变的平整。当凝胶聚合后尽可能排去凝胶上的液体并用超纯水冲洗掉，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。

4)按下法制备浓缩胶：按下表在小烧杯中制备5ml浓度为4％的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。

5ml浓缩胶各成分所需体积

试剂	用量
		超纯水	3.06ml
30％丙烯酰胺	0.66ml
		0.5M Tris-HCl pH6.8	1.26ml
10％SDS	0.05ml
		10％过硫酸铵	0.06ml
TEMED	6μl

5)在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩液。立即在浓缩胶溶液中插入干净的实验预设计的梳子，小心避免混入气泡，将凝胶垂直放置于室温下。

6)浓缩胶聚合完全后(以剩余的浓缩胶状态确定)，把凝胶固定于电泳装置上，电泳槽中加入适量电泳缓冲液(Tris-甘氨酸电泳缓冲液),小心移出梳子。

7)SDS-PAGE电泳

A取1μl样本用超微量紫外分光光度计检测两个样本的蛋白含量。

B将20μl(不足的话用水补齐)sEVs样品置于凝胶加样缓冲液中，在100℃加热10min以使蛋白质变性。每个电泳道加样体积为20μl。

C把电泳装置与电源连接好，调节电压，浓缩胶：80V，分离胶150V，及时观察防止条带跑出胶。

D电泳结束后从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。

8)转膜

A切除浓缩胶，将分离胶从玻璃板中剥下来，按海绵-4层滤纸-凝胶-PVDF膜-4层滤纸-海绵的顺序(每对齐覆盖一层，均需固定好位置排除气泡一次)，合起转膜夹并固定。

B将装好的转膜夹装入转膜电泳槽，加入适量4℃转膜缓冲液。

C连接好电源，4℃恒流250mA转膜80min。

9)电转完毕后，将NC膜置于4％的脱脂奶粉(TBST配制)中封闭，室温封闭1小时。

10)一抗孵育

A封闭的膜用TBST漂洗3次。将一抗按终浓度1-1.5ug/ml稀释，(稀释液：4％ BSA),将膜放入倒入一抗的表面皿中，室温孵育膜2h。

B弃一抗后用TBST洗膜3次，8min/次。

11)二抗孵育

A将二抗按1：3000稀释，(稀释液：4％ BSA),将膜放入倒入二抗的表面皿中，室温孵育膜1h。

B弃二抗后用TBST洗膜3次，8min/次。

12)显影成像

A将NC膜平铺在保鲜膜上，取ECL超敏发光液A、B各300μl，充分混匀后均匀滴到NC膜上，覆盖保鲜膜，保证NC膜完全浸入超敏发光液混合液中。

B用凝胶成像仪曝光保存蛋白条带图像。

4sEVs电镜检测

1)纯化的sEVs溶于50-100μl 2％多聚甲醛溶液中(可在4℃储存一周)。

2)取5-10μlsEVs溶液加到Formvar-carbon载样铜网上。

3)取100μl PBS加到封口膜上，用镊子将铜网(Formvar膜面朝下)放在PBS液滴上清洗。

4)将铜网放在50μl 1％戊二醛液滴上5分钟。

5)将铜网放在100μl ddH2O洗2分钟(洗8次)。

6)将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上(pH7.0)5分钟。

7)将铜网放在50μl甲基纤维素液滴上10分钟，冰上操作。

8)铜网放到样品台顶端的不锈钢环上，在滤纸上吸去多余液体。

9)空气干燥5-10分钟。

10)将铜网放在样品盒里，80kV下拍摄电镜照片；

5无菌检测；

6内毒素检测。

实施例四：sEVs检测结果

1.总蛋白测定结果

标准曲线见图1

2.sEVs纳米粒径跟踪分析

粒径分布及大小见图2

样品	sEVs原液
		颗粒数/mL	4.4×10^9
平均粒径(nm)	170.1

结果分析：小细胞外囊泡浓度较高。颗粒数与总蛋白的比值为1.9×10^10。

3.Western Blot对sEVs蛋白指标检测结果

sEVs表达主要标志物免疫印迹结果见图3.

样品	MARKER	sEVs原液
			上样本体积(μl)	------	20
上样本蛋白量(μg)	------	30

结果分析:在纯化的sEVs原液中，CD9、CD63、CD81和Alix蛋白在样本中表达明显；Tsg101在样本中有表达。

4.sEVs电镜检测

结果分析：sEVs电极检测结果见图4，纯化的sEVs原液中可以看到清晰的sEVs“茶托装”结构。

通过对最终纯化的的sEVs原液进行总蛋白测定，与条件培养基相比，总蛋白去除99％以上；平均粒径为170.1nm，符合外泌体的范围为60至200nm要求。sEVs原液CD9、CD63、CD81和Alix表达明显；Tsg101有表达。符合2018年国际细胞外囊泡学会(MISEV2018)提出的细胞外囊泡标准。根据MISEV2018对EV的一般表征将包含至少三个EV的阳性蛋白标记，包括至少一种跨膜/脂质结合蛋白和胞质蛋白，以及至少一种阴性蛋白标记。电镜检测能够清晰看到sEVs“茶托装”结构。

Claims

1.一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)采用无血清培养MSC细胞的方法，获得间充质干细胞(MSCs)来源的sEVs；(2)对步骤1中的sEVs进行切向流超滤、尺寸排阻色谱处理，制备得到临床级的sEVs。

2.根据权利要求1所述的一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：所述的步骤(1)具体操作：(a)华通氏胶分离：将脐带组织按照规程的要求，分离出华通氏胶，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm³的组织块；(b)接种：按照0.5～0.6g华通氏胶/T75瓶接种组织块，加入专用无血清培养基进行培养，期间根据培养情况进行换液，观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获；(c)传代：根据收获原代细胞(P0)的数量和活力，将细胞悬液接种到T-175培养瓶中，经标准条件培养并连续传代至P2，收获并冻存P2代细胞，作为种子细胞库；(d)MSC体外扩增及条件培养基(CM)获得：复苏P2代种子库细胞，进行扩增培养；观察到细胞汇合度达到70％～80％时，进行细胞收获，传代，收获MSC细胞及条件培养基，条件培养基离心，上清液再用滤膜过滤，-80℃保存备用，作为小细胞外囊泡纯化起始原材料。

3.根据权利要求1所述的一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：所述的切向流超滤具体操作：P2～P8代条件培养上清液，进行超滤浓缩，控制超滤系统的进口压力为30psi，出口压力为10psi，TMP为20psi，在此条件下浓缩20倍，截留液用无菌、无热源的PBS缓冲液开始连续洗滤，调整PBS缓冲液流入浓缩端的速度与透过端的一致，连续洗滤6DV,最后收集浓缩液。

4.根据权利要求1所述的一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：所述的尺寸排阻色谱处理：填料颗粒直径为40～165μm，球形蛋白质分离范围为10～20000kD。

5.根据权利要求2所述的一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：所述的步骤(b)的培养是将T75培养瓶放置于CO₂培养箱中培养，37.0±0.5℃，CO₂浓度为5％。

6.根据权利要求4所述的一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法，其特征在于：所述的尺寸排阻色谱处理：(1)SEC柱装填，要求柱高为15cm×20cm(D×H)，理论塔板数≥3000，不对称因子(As)为0.8～1.2；(2)柱平衡，先用无热源注射用水冲洗至少3CV柱体积(CV)，然后用0.5M氢氧化钠溶液清洗3CV，保持NaOH溶液接触填料及层析系统60min以上，无热源注射用水冲洗至流出端pH为中性；最后用pH7.2 PBS平衡至相应的pH与电导值；(3)sEVs纯化：用蠕动泵将经超滤初步浓缩及纯化含sEVs的浓缩液，加载到平衡好的SEC柱中，上样完毕后，切换pH7.2 PBS缓冲液，保持恒定的流速洗脱，根据洗脱体积及OD280变化，收集sEVs组分，-80℃保存或根据制剂浓度需要进一步超滤浓缩。