CN118076425A - 用于分离和纯化目标组分的分离系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分离和纯化目标组分的分离系统、用于分离和纯化目标组分的方法以及交叉流渗滤单元用于处理目标相的用途，该目标相在分离双水相体系后获得并且包含目标组分。

Description

用于分离和纯化目标组分的分离系统及方法
本发明涉及用于分离和纯化目标组分的分离系统、用于分离和纯化目标组分的方法以及交叉流渗滤单元用于处理目标相的用途，该目标相在分离双水相体系后获得并且包含目标组分。
近年来，生产目标组分的细胞系的上游工艺已经取得了很大的改进。这导致生产中的瓶颈转移到下游工艺(DSP)中的后续澄清、捕获和纯化单元操作。
一个实例是单克隆抗体(mAb)。由于单克隆抗体对于治疗癌症、自身免疫性病症和炎性疾病等数种严重疾病的重要性，单克隆抗体的市场不断增长。随着生产mAb的细胞系(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)的上游工艺的持续改进，已导致细胞密度增加和高达25g/l的高产品滴度。然而，这些成就将mAb生产中的瓶颈转移到了DSP上。
当mAb分泌到培养基中时，必须首先去除细胞。由于其经济效益和可扩展性，最常见的连续圆盘式离心机被用作商业规模的第一澄清步骤。替代的澄清方法是深度过滤、絮凝、动态主体进料过滤或使用声学细胞保留装置。作为后续的mAb捕获步骤，蛋白A亲和色谱法用于大多数平台工艺，其具有产量高、纯度高以及体积小的优点。然而，DSP面临的挑战主要是由色谱方法的容量有限，尤其是蛋白A色谱的价格引起的。
克服这一瓶颈的有前景的方法是应用双水相萃取(ATPE；图1)，如WO 2014/135420A1和US2011/0257378 A1所述。双水相体系(ATPS)的形成是通过在水中混合各种成相组分来实现的。当成相组分高于一定浓度时，形成两个不混溶相。作为成相组分，聚合物/聚合物(通常是聚乙二醇(PEG)和葡聚糖)或聚合物/盐(例如磷酸盐、柠檬酸盐或硫酸盐)是最常用的。例如，在后一种情况下，形成富含聚合物的轻相(LP)和富含盐的重相(HP)。基于ATPS的组成，可以实现目标分子(例如mAb)的选择性萃取，而诸如脱氧核糖核酸(DNA)和宿主细胞蛋白(HCP)等杂质在另一个相中富集。诸如细胞、细胞碎片和其它生物颗粒等颗粒在ATPS界面聚集，从而实现了澄清和第一目标组分纯化的集成。
已经证明，ATPE适合作为mAb的下游工艺的第一纯化步骤，与目前确立已久的平台工艺相比，其具有经济效益并在环境上可持续(参见Kruse等人的Antibodies 2019,8,40；和Kruse等人的Biochemical Engineering Journal，第161卷，107703)。为了进一步纯化，必须确保含有目标相的mAb的分离。现有方法利用了ATPS两相的不同密度。
借助重力的相分离通常由混合沉降器装置进行。然而，由于两相之间的密度差异较小，这种方法通常耗时且因此昂贵。迄今为止的替代方案是柱式或离心式萃取器，其中分离也通过两相之间的密度差来实现。然而，如果将这些方法用作澄清单元操作，则需要额外的无菌过滤步骤，以确保完全去除细胞。诸如交叉流渗滤的膜技术也已应用于相分离(参见Kruse等人的Antibodies 2019,8,40；和Kruse等人的Biochemical Engineering Journal，第161卷，107703)。
对于随后的纯化步骤，通常需要进行缓冲液交换。为此，分离的含有目标物的相可以通过渗滤进一步处理。然而，这种膜技术存在目标组分沉淀的问题，因此产物损失高，或者需要在过滤前进行稀释步骤，因此产生更多的浪费、时间和费用的支出。
因此，本发明的技术问题是提供用于目标组分的下游处理的方法，当与用于DSP的常规方法相比时，所述方法应该相当便宜，并且应当仍然提供高纯度和高产率。特别地，当应用ATPE作为纯化步骤时，其目的在于为随后的纯化步骤提供用于有效的缓冲液交换的方法。
上述技术问题的解决方案通过权利要求中所描述的实施方案来实现。
特别地，本发明涉及被配置为处理含有多种组分的流体的分离系统，其中该流体的多种组分中的至少一种组分是目标组分，并且其中该分离系统包括：
双水相萃取单元，其用于流体的双水相萃取，
分离单元，其用于分离在双水相萃取后获得的目标相，其中该目标相含有目标组分，和
交叉流渗滤单元，其用于对分离的目标相进行连续渗滤以获得渗余物和渗透物，其中该交叉流渗滤单元至少包括渗滤通道、第一过滤材料、渗余物通道、第二过滤材料和渗透物收集通道，这些被布置成使得第一过滤材料将渗滤通道和渗余物通道彼此划界，并且第二过滤材料将渗余物通道和渗透物收集通道彼此划界，
其中该渗滤通道以流体传导的方式连接到渗滤介质的至少一个入口；渗余物通道以流体传导的方式连接到目标相的至少一个入口和渗余物的至少一个出口；并且渗透物收集通道以流体传导的方式连接到渗透物的至少一个出口。
使用本发明的分离系统，优选有利地可以将从双水相萃取分离后获得的目标相直接应用于交叉流渗滤，而不必预先稀释目标相。因此，可以显著减少所需的液体量。此外，通过使用特定的交叉流渗滤单元(参见图2和3)，可以优选有利地避免渗滤过程中目标组分的沉淀，该单元使用目标相作为进料流体。此外，优选地，在渗滤和缓冲液交换可以非常快速地进行之后，可以有利地实现高浓度目标组分的高产率。
目标组分没有特别限制。例如，目标组分可以是任何感兴趣的生物分子，例如蛋白、mAb、激素、疫苗、核酸、外泌体(exosomes)、病毒和病毒样颗粒。在优选实施方案中，目标组分是抗体，更优选单克隆抗体或其片段或衍生物。单克隆抗体的实例是阿达木单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、英夫利西单抗、奥马珠单抗和地诺单抗。目标组分可以从例如细胞培养物中获得，如“中国仓鼠卵巢细胞”(CHO细胞)或其它哺乳动物细胞系。作为ATPE的起始物质的流体没有特别限制，只要它含有目标组分。合适的流体是通过过滤或离心方法获得的细胞肉汤和细胞肉汤上清液或进一步纯化的物质。
本发明中使用的双水相萃取单元没有特别限制。例如，可以应用能够容纳双水相体系的任何器皿、容器等。
术语“两相体系”不受任何特别限制，只要组合物能够形成至少两相。优选地，组合物形成两相。通常，上相因此具有比下相更低的密度。
可以使用任何ATPS。此外，ATPS的任何相都可以进行渗滤。ATPS的实例是(1)聚合物-聚合物体系(例如PEG/葡聚糖)；(2)聚合物-盐体系(例如PEG/磷酸盐或柠檬酸盐或硫酸盐)；(3)醇-盐体系(例如丙醇或乙醇/盐)；(4)胶束ATPS(基于表面活性剂)；和(5)基于离子液体的ATPS。
目标组分可以在ATPS的任何相中。优选地，目标组分主要在ATPS的一个相中。优选地，所需物质主要在上相中。
组合物形成两相体系，其中目标组分优选地位于其中一相。基于组合物中目标组分的总量/总质量，目标组分在富集相中的比例不受任何特定限制。基于ATPS中目标组分的总质量，富集相中的目标组分(如抗体)的比例为例如至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％、至少97重量％、至少98重量％或至少99重量％。
由于经ATPE处理的组分具有不同的生物物理特性，它们在两相之间的分布也不同(图1)。该分布系数会受到双水相体系组成的影响。影响分布系数的其它参数为例如温度、pH和目标组分的性质。对于每种工艺/产物，可以重新确定双水相体系的组成，以获得最佳纯度和产率。
在使用统计实验设计(DoE)方法的众多研究中，已经描述了具有高产率和高纯度的目标分子的ATPS组成的优化(Gronemeyer,P.等人的Biochem.Eng.J.2016,113,158–166；Glyk,A.等人的Chemom.Intell.Lab.Syst.2015,149,12–21；Rosa,P.A.J.等人的J.Chromatogr.A 2007,1141,50–60；Kruse等人的Antibodies 2019,8,40；和Kruse等人的Biochemical Engineering Journal，第161卷，107703)。对于给定的目标组分和伴随的杂质，可以创建一个模型，然后该模型可以用于推导出具有目标组分的最大可能产率并且同时最大程度减少工艺相关杂质的最佳体系组成。
例如，可以应用用于双水相体系的组合物，基于组合物的总量，该组合物包含：4.0至25.0wt.％的平均分子量为300至20000的聚乙二醇；5.0至40wt.％的选自磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐的第一盐或聚合物，特别是葡聚糖；0至10.0wt.％的第二盐，特别是氯化物盐或硫酸二铵(NH4)2SO4；10.0至50.0wt.％的含有目标组分的流体，例如细胞培养液或其滤液；其余为水。合适的其它体系是本领域技术人员已知的。各个组分的比例以形成ATPS的方式选择。聚乙二醇的平均分子量和含量相对于彼此适当选择。例如，当应用平均分子量较高的聚乙二醇时，可以选择该聚乙二醇的较低含量，反之亦然。
不同组分的指示量是指组合物的总量/总质量。除了聚乙二醇、第一盐或聚合物、第二盐和流体(例如细胞培养液或其滤液)之外，还可以包括现有技术中已知的其它组分。在这种情况下，添加除水以外的其它组分后剩余的残余量对应于组合物中含有的水的量，其中流体(例如细胞培养液或滤液)中含有的水包括在流体的量中，因此不包括在水的残余量中。这些组分可以以纯物质的形式或以溶液的形式使用以形成组合物。组合物中这些组分的按重量计的指示比例对应于相应的纯物质的按重量计的比例。因此，将一定比例的任何溶剂添加到任选的其它组分中，或者在水溶液的情况下添加到水中。例如，通过使用600g40％(w/w)的磷酸盐水溶液和90g 50％(w/w)的PEG1450水溶液制备的总质量为1kg的组合物具有24wt.％(240g)的磷酸盐和4.5wt.％(45g)的PEG1450。
术语“聚乙二醇”没有特别限制。可以使用单一的聚乙二醇或几种不同分子量的聚乙二醇的混合物。
所述组合物可以包含平均分子量为300至20000的聚乙二醇。优选地，聚乙二醇的平均分子量为350至10000，更优选350至4000，更优选400至2000。例如，相应的聚乙二醇是可商购获得的。
用于ATPE的组合物的pH不受任何特别限制，可以是例如4.0至10.0，优选5.0至9.0，更优选6.0至8.0。当pH值高于8.0时，例如抗体的氨基酸可能会发生脱氨基反应。
ATPE的持续时间没有特别限制。优选地，进行ATPE直至达到相平衡。
本发明中使用的分离单元没有特别限制。因此，可以应用本领域已知的用于分离双水相萃取后获得的相的任何分离单元。合适的分离单元包括例如混合沉降器装置、离心机和柱式或离心式萃取器以及基于膜的相分离方法(参见Kruse等人的Antibodies 2019,8,40)。优选地，分离单元是离心机。通过分离单元，可以将ATPE后获得的相彼此分离。然后可以将含有(大部分)目标组分的目标相转移到渗滤单元中。其余的其它相不含有或含有少量的目标组分。
交叉流渗滤单元至少包括渗滤通道、(优选扁平的(flat))第一过滤材料、渗余物通道、(优选扁平的)第二过滤材料和渗透物收集通道，这些被布置成使得第一过滤材料将渗滤通道和渗余物通道彼此划界，并且第二过滤材料将渗余物通道和渗透物收集通道彼此划界，
其中，渗滤通道以流体传导(连通)的方式连接到渗滤介质的至少一个入口；渗余物通道以流体传导的方式连接到目标相的至少一个入口和渗余物的至少一个出口；并且渗透物收集通道以流体传导的方式连接到渗透物的至少一个出口。例如，在图2和图3中示意性地示出了各自的交叉流渗滤单元的实例。合适的交叉流渗滤单元例如在DE 102016 004115A1(用于连续渗滤的交叉流渗滤单元)中描述的。
第一过滤材料和第二过滤材料的形状(空间形式)不受任何特定限制。优选地，第一过滤材料和第二过滤材料是扁平的过滤材料。术语“扁平的”表示各自的过滤材料基本上位于单个平面内。在优选实施方案中，所有的过滤材料或多或少都位于彼此基本平行的平面内。在另一优选实施方案中，两种过滤材料沿流动方向的距离减小，这可能导致产物浓度进一步升高。
此外，交叉流渗滤单元可以是缠绕组件(wound module)。为此目的，将第一过滤材料和第二过滤材料的初始扁平或平面布置被缠绕在芯周围，使得第一过滤材料和第二过滤材料(以及渗滤通道、渗余物通道和渗透物通道)各自具有螺旋横截面。
此外，交叉流渗滤单元可以是中空纤维组件。在这种情况下，第一过滤材料和第二过滤材料具有中空纤维形状(没有圆盘状端部的圆柱体)。第一中空纤维过滤材料和第二中空纤维过滤材料的内径不同，以允许第一过滤材料和第二过滤材料分别插入第二过滤材料和第一过滤材料中，以形成渗滤通道、渗余物通道和渗透物通道。
第一过滤材料优选地具有1kDa至1500kDa的截留分子量(MWCO)。第二过滤材料优选地具有1kDa至1500kDa的截留分子量。截留分子量的测定可以根据美国标准ASTM E1343-90(“扁平片材超滤膜的截留分子量评估的标准测试方法”)进行。优选选择膜的MWCO，使得目标组分保留在渗余物通道中，而ATPS的较小成相组分通过膜渗透并在渗透物出口中排出。
第一过滤材料的孔径优选为0.001至50μm，优选0.01至0.5μm。第二过滤材料的孔径优选为0.001至50μm，优选0.01至0.5μm。
对于孔径至少为0.1μm，即平均孔径为0.1至10μm的微滤膜，使用毛细管通量孔隙度测定法(capillary flux porosimetry)来测定孔径。这是气体/液体孔隙度测定法，其中首先在湿态下测量通过膜样品的气体压差和流速，然后在干燥状态下测定。在测量之前，将膜样品与润湿液体接触，使得所有的孔都充满该液体。填充孔隙并引入样品后，必须关闭测量池并开始测量。开始测量后，气压自动逐渐增加，与所施加压力相对应的孔径会被气体压力排空。这一直持续直到已经覆盖相关的孔隙范围，即甚至在测量范围内存在的最小孔隙都没有液体为止。然后再次降低压力，并自动对现已干燥的样品进行重复测量。使用Young-Laplace方程从两条压力-流速曲线之间的差异计算孔径分布(另见A.Shrestha的“Characterization of porous membranes via porometry”，2012年，MechanicalEngineering Graduate Theses&Dissertations，第38页，University of Colorado atBoulder)。
为了测定大于10μm且至多1mm的孔径，可以使用Journal of Membrane Science372(2011年),第66至74页中描述的基于图像分析的方法。
对于小于0.1μm的孔径，使用与毛细管流动孔隙度测定法(capillary flowporometry)相似的液-液置换法。然而，测量的不是气体流速，而是作为压差增量的函数的置换液体的流速(另见R.Dávila，“Characterization of ultra and nanofiltrationcommercial filters by liquid-liquid displacement porosimetry”，2013年)。
第一过滤材料可以例如是过滤膜、无纺材料或多孔片材。根据优选实施方案，第一过滤材料是第一过滤膜，或者第二过滤材料是第二过滤膜。特别优选的是，第一过滤材料是第一过滤膜，并且第二过滤材料是第二过滤膜。
特别地，超滤和微滤范围内的多孔膜适合作为第一过滤材料和/或第二过滤材料。
在优选实施方案中，第一过滤材料和第二过滤材料是相同的。
超滤膜的特征在于孔径小于0.01μm或截留分子量为约1至1500kDa的分子量，而微滤膜的孔径为0.01至50μm、优选0.01至0.5μm，或截留分子量为30至1500kDa。过滤膜可以由例如聚偏二氟乙烯、纤维素及其衍生物、聚醚砜或聚砜组成，其中特别优选交联纤维素水合物。
如果需要，可以通过本领域已知的各自的方式(例如间隔物)来保持通道(即渗滤通道、渗余物通道和渗透物收集通道)开放。这种间隔物可以由任何合适的材料(例如无纺材料)制成。
进料流体(此处：目标相)的入口优选安装在交叉流渗滤单元的第一边缘区域；并且渗余物的出口安装在交叉流渗滤单元的面向第一边缘区域的第二边缘区域。由于这种布置，可以确定从作为起始点的进料流体入口到作为终点的渗余物出口的渗余物的基本一致的流动方向。因此，渗余物的流动方向基本上平行于沿着(扁平的)过滤材料的流动路径，即基本上没有偏转，从而通过交叉流渗滤单元可以确保渗余物的稳定且可靠的流动。此外，由于基本线性的流动路径而没有偏转、环路等，可以最小化过滤单元中的压降以及非线性流动对进料流体中含有的目标物质的不期望的影响。出于上述原因，还优选将渗滤介质的入口安装在交叉流渗滤单元的第一边缘区域。然而，也可以将渗滤介质的入口安装在第二边缘区域或在第三边缘区域和/或第四边缘区域。
根据优选实施方案，将渗透物的出口安装在交叉流渗滤单元的第二边缘区域。特别优选的是，在每种情况下，渗透物的至少一个出口安装在交叉流渗滤单元的第一边缘区域和第二边缘区域两者处。在本发明的另一个实施方案中，作为替代或补充，渗透物的出口安装在交叉流渗滤单元的第三边缘区域和/或第四边缘区域。第三边缘区域在从渗滤通道一侧观察的交叉流渗滤单元的平面图中位于流动方向的左侧。相应地，第四边缘区域位于右侧，因此与第三边缘区域相对。出口的上述布置不仅可以实现特别高的渗透性能，还能实现设计优势。
第一边缘区域优选包括过滤单元的与流动方向相反的长度的外部三分之一。相应地，第二边缘区域包括过滤单元的沿流动方向的长度的外部三分之一。这同样适用于第三和第四边缘区域。使第一边缘区域至第四边缘区域尽可能小是有利的。因此，特别优选的是，边缘区域至多包括各自外部的20％，甚至更优选的是至多包括各自外部的10％，并且最优选的是至多包括各自外部的3％。
原则上，入口和出口的安装没有特别的限制。例如，可以将入口和出口安装成使得进料流体已经沿流动方向进入渗余物通道，并沿流动方向离开渗余物通道。相应地，可以将渗透物的出口安装成使得渗透物沿流动方向离开渗透物收集通道；和/或可以将渗滤介质的入口安装成使得它沿流动方向进入渗滤通道。然而，优选地，将入口和出口安装成使得渗滤介质垂直于流动方向进入渗滤通道；然后进料流体垂直于流动方向进入渗余物通道，并作为渗余物垂直于流动方向离开渗余物通道。入口和出口的这种安装有利于多个本发明过滤单元的布置以形成过滤盒。例如，在图2和图3中示意性地示出了各自的布置。如图3所示，包含目标组分以及成相组分的ATPS目标相通过进料口供应。由于膜的选择的MWCO，目标组分被截留在渗余物通道中，而较小的成相组分通过膜渗透并在渗透物的出口中排出。同时，渗滤缓冲液由额外的通道主动提供，通过膜渗透并将成相组分从渗余物冲洗到渗透物中(缓冲液交换)。
优选地，交叉流渗滤单元包括用于进料流体(此处：目标相)的多个入口、用于渗余物的多个出口和用于渗透物的多个出口。
在连续渗滤中，进料流体(此处：目标相)和渗滤介质都是连续加入的，因此该过程不必中断。因此，交叉流渗滤单元使得能够以高效且经济的方式运行该过程。
渗滤介质没有特别限制。原则上，任何流体都是合适的，其中优选水和盐的水溶液。例如，缓冲剂水溶液可以用作渗滤介质。优选地，渗滤介质选自KPi缓冲液、磷酸钠缓冲液、乙酸钠缓冲液、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、甘氨酸、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、BIS-Tris缓冲液、HEPES缓冲液和水。缓冲剂在水溶液中的浓度没有特别限制，可以例如为1.0mM至5.0M，优选5.0mM至1.0M，更优选10mM至200mM，最优选25至100mM。
渗滤介质的pH没有特别限制。例如，渗滤介质的pH可以为2.0至12.0，优选3.0至10.0，最优选5.0至9.0。当在低pH值、优选2.5至4.5、最优选3.0至4.0下使用渗滤时，优选有利地在渗滤过程中通过酸化实现病毒灭活。
在优选实施方案中，交叉流渗滤单元被配置成使得所供应的渗滤介质的体积流速是所供应的目标相(即所供应的进料流体)的体积流速的0.5至20倍。所供应的渗滤介质的体积流速优选是所供应的目标相的体积流速的1.0至15倍，更优选2.0至10倍，更优选4.0至9.0倍，最优选5.0至7.0倍。
所供应的渗滤介质的体积流速可以为1.0mL/min至2.0L/min，优选2.0mL/min至1.0L/min，更优选4.0mL/min至500mL/min，最优选10mL/min至175mL/min。所供应的目标相的体积流速可以为0.5mL/min至100mL/min，优选1.0mL/min至50mL/min，更优选2.0mL/min至25mL/min。出口处渗余物的体积流速可以为0.5mL/min至100mL/min，优选1.0mL/min至50mL/min，更优选2.0mL/min至25mL/min。
在优选实施方案中，渗滤介质在0.1至4巴的压力下供应。更优选地，渗滤介质在大于渗余物出口压力的压力下供应。在这种情况下，术语“大于”例如意指供应渗滤介质的压力比渗余物出口压力大至少0.1巴、至少0.2巴、至少0.3巴、至少0.5巴、至少1巴、至少2巴、至少3巴或至少5巴。
优选地，连续进行渗滤，即在渗滤介质和进料流体的恒定/连续添加下进行，从而可以提供特别有效且经济的过滤方法。
优选地，将分离的目标相直接应用于交叉流渗滤单元。因此，将分离的目标相优选地在没有任何稀释的情况下应用于交叉流渗滤单元。如有必要，可以在渗滤前对分离的目标相进行过滤(例如，使用0.2μm无菌过滤器)。潜在的洗涤步骤可以在所述过滤后进行至不发生显著稀释的程度(例如，稀释小于0.50体积当量，更优选小于0.1体积当量，更优选小于0.01体积当量)。
分离的目标相中目标组分的浓度没有特别限制。例如，分离的目标相中目标组分的浓度可以为0.01g/L至500g/L，优选0.1g/L至50g/L，最优选0.5g/L至10g/L。
渗滤后渗余物中目标组分的浓度没有特别限制。例如，渗滤后渗余物中目标组分的浓度可以为0.01g/L至500g/L，优选0.1g/L至50g/L，最优选0.5g/L至10g/L。
交叉流渗滤后，(大部分的)目标组分优选地包含在渗余物中。因此，包含在渗余物中的目标组分的质量与经历渗滤的目标组分的总质量的质量比优选大于50质量％，更优选至少80质量％，更优选至少90质量％，最优选至少95质量％。
渗滤后，可以将渗余物或渗透物(优选渗余物)进行进一步的纯化步骤，例如以任何合适的顺序进行亲和色谱法和/或疏水相互作用色谱法和/或阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法和/或无菌过滤和/或病毒过滤和/或病毒灭活。因此，本发明的分离系统可以以任何合适的顺序进一步包括各自的另外的纯化单元，例如亲和色谱单元和/或疏水相互作用色谱单元和/或阳离子交换色谱单元和/或阴离子交换色谱单元和/或无菌过滤单元和/或病毒过滤单元和/或病毒灭活单元。优选地，选择渗滤介质使得所得渗余物或渗透物，优选渗余物，具有用于后续纯化步骤的合适缓冲液。
在另一方面，本发明涉及用于纯化包含在流体中的目标组分的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)对流体进行双水相萃取，
(b)将含有目标组分的目标相与双水相萃取后获得的另一相分离，
(c)使用交叉流渗滤单元对分离的目标相进行渗滤，
其中交叉流渗滤单元至少包括渗滤通道、第一过滤材料、渗余物通道、第二过滤材料和渗透物收集通道，这些被布置成使得第一过滤材料将渗滤通道和渗余物通道彼此划界，并且第二过滤材料将渗余物通道和渗透物收集通道彼此划界，
其中该渗滤通道以流体传导的方式连接到渗滤介质的至少一个入口；渗余物通道以流体传导的方式连接到目标相的至少一个入口和渗余物的至少一个出口；并且渗透物收集通道以流体传导的方式连接到渗透物的至少一个出口。上述陈述和定义类似地应用于本发明的这一方面。优选地，根据本发明的方法通过使用根据本发明的分离系统来实施。
在另一方面，本发明涉及交叉流渗滤单元用于处理目标相的用途，其在双水相体系的分离后获得并含有目标组分，其中交叉流渗滤单元至少包括渗滤通道、第一过滤材料、渗余物通道、第二过滤材料和渗透物收集通道，这些被布置成使得第一过滤材料将渗滤通道和渗余物通道彼此划界，并且第二过滤材料将渗余物通道和渗透物收集通道彼此划界，
其中该渗滤通道以流体传导的方式连接到渗滤介质的至少一个入口；渗余物通道以流体传导的方式连接到目标相的至少一个入口和渗余物的至少一个出口；并且渗透物收集通道以流体传导的方式连接到渗透物的至少一个出口。上述陈述和定义类似地应用于本发明的这一方面。优选地，交叉流渗滤单元是根据本发明的分离系统的交叉流渗滤单元。优选地，通过应用根据本发明的分离系统的双水相萃取单元来进行双水相萃取。
附图标记
图1和图3
1＝富含聚合物的轻相(LP)，2＝目标组分，mAb，3＝宿主细胞蛋白(HCP)，4＝细胞，5＝DNA，6＝富含盐的重相(HP)，31＝目标组分，32＝ATPS成相组分，33＝渗滤缓冲液
图1：生物分子在用于提取例如作为目标组分的mAb的双水相体系中的目标分布的示意图。
图2：本发明中使用的交叉流渗滤单元的实施方案的示意图。FIR＝流量传感器(指示、记录)，CIR＝电导率传感器(指示、记录)，PIR＝压力传感器(指示、记录)。
图3：使用期间本发明中使用的交叉流渗滤单元的实施方案的示意图。包含目标组分以及成相组分的ATPS目标相经由进料口供应至渗滤单元。由于膜的选择的MWCO，目标组分被截留在渗余物通道中，而较小的成相组分通过膜渗透并在渗透物的出口中排出。同时，渗滤缓冲液由额外的通道主动提供，通过膜渗透并将成相组分从渗余物冲洗到渗透物中(缓冲液交换)。渗滤缓冲液的主动供应有力地支持了有效且快速的缓冲液交换，从而显著降低了目标组分的沉淀，而无需预先稀释目标相。
图4：实施例3中目标相的整个常规渗滤的渗透流速。
将在以下实施例中进一步示例性说明本发明，但本发明不限于此。
实施例1
在采用商业无血清培养基补料分批培养CHO细胞中产生mAb(G型免疫球蛋白，IgG，等电点＝8.4)。将细胞在250一次性生物反应器(Sartorius,/>Germany)中以855rpm、36.8℃和pH 7.1培养12天。在收获时间点，存活率≥80％，存活细胞密度≥10*106细胞/ml，IgG浓度≥2.8g/l。
用于从培养肉汤中直接提取的ATPS组合物(参见表1)采用自先前的研究(Kruse等人的Antibodies 2019,8,40)，该研究基于DoE方法，在轻目标相(LP)中获得最高的mAb的产率和纯度(涉及DNA和HCP)。分子量为400g/mol的PEG购自Merck(Darmstadt,Germany)。无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)和无水磷酸氢二钾(K2HPO4)用于制备各自的储备溶液(40质量％磷酸盐缓冲液)。通过滴定两种储备溶液来调节pH值。所有盐类(包括作为置换剂的NaCl)均购自Carl Roth(Karlsruhe,Germany)。
表1.ATPS组合物
组分 质量％
PEG400 19
40wt.-％PO4缓冲液(pH 8.0) 41
进料 36
NaCl 4
在Schott烧瓶中称量适量的ATPS组分。使用含有细胞的培养肉汤作为进料。为了确保平衡条件，用磁力搅拌器以500rpm将ATPS搅拌10min。为了快速简便地进行相分离，使用离心机作为分离单元，用于分离双水相萃取后获得的目标相(LP)。因此，将ATPS转移到500ml离心管(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)中，并以538x g离心5min。通过移液取出以含有mAb的相的形式的LP。为了确保完全去除细胞，使用标称孔径为0.2μm的无菌过滤器(Sartopore/>XLG,Sartorius,/>)以1巴的恒定压力进行LP过滤。
表2.经ATPE和相分离后，细胞肉汤和目标相获得的浊度、IgG以及DNA和HCP的浓度以及各自的以百万分率计的量(ppm；与mAb浓度有关)。
参数 细胞肉汤 目标相
浊度[NTU] 2235 10.5
IgG浓度[mg/mL] 2.9±0.2 2.2±0.1
DNA浓度[μg/mL] 389±3 16.8±0.1
DNA含量[ppm] 132936 7557
HCP浓度[μg/mL] 452±27 228±8
HCP含量[ppm] 154565 102467
在ATPE和相分离之后，获得了81.9％产率的mAb。与培养肉汤的浓度(2.9mg/ml，表2)相比，mAb被略微稀释到LP中(2.2mg/ml)。浊度从2235下降到10.5NTU。
在ATPE和相分离后，大部分DNA(95.3％)和45.7％的HCP作为与工艺相关的杂质被去除。DNA浓度从393μg/mL降低至16.8μg/mL，相当于7557ppm。同时，HCP浓度从452μg/mL降低至228μg/mL，相当于102467ppm(表2)。这些结果表明，ATPE技术能充分澄清并直接从培养肉汤中捕获产物(IgG)，而且产率高，并能同时去除诸如DNA和HCP等与工艺相关的杂质。
实施例2
通过本发明的渗滤方法进一步纯化如实施例1中所述的含有目标组分(IgG)的这种经分离的目标相。因此，使用平均截留分子量为30kDa的聚醚砜膜。示例性地检测了两种不同的渗滤缓冲液：50mM KPi缓冲液(pH 7.4)作为中性缓冲液条件的实例，50mM醋酸钠(NaAc，pH3.0)作为酸性缓冲液条件的实例，其也可用于通过酸化灭活病毒。对于两次渗滤，都处理了400g的经分离的目标相，由此该处理也可以针对显著更高量的目标相进行操作或连续操作。
表3.50mM KPi缓冲液(pH 7.4)作为渗滤缓冲液获得的工艺参数和结果。
50mM KPi C IgG[g/L] 产率[％]
目标相 10mL/min
渗滤缓冲液 50mL/min
渗余物 10mL/min
经处理的目标相 402.18g或359.1mL 2.033
产物 325.6g或mL 2.108 94.0
表4.50mM乙酸钠(pH 3.0)作为渗滤缓冲液获得的工艺参数和结果。
50mM NaAc C IgG[g/L] 产率[％]
目标相 10mL/min
渗滤缓冲液 50mL/min
渗余物 10mL/min
经处理的目标相 402.27g或359.2mL 2.019
产物 340.71g或mL 2.028 95.3
对于两个实验，目标相和渗余物的流速设定为10mL/min，各自的渗滤缓冲液的流速设定为50mL/min。由于目标相的密度，按计划处理了约400g，相当于约359mL的体积。由于两种物料流的流速相等，产物(渗余物)的IgG浓度与目标相相似，约为2g/L。在整个过程中，50mM KPi缓冲液和50mM乙酸钠分别实现了94.0％(表3)和95.3％(表4)的高IgG产率。在整个过程中，在产物相中没有观察到沉淀，并因此获得了低于5NTU的非常低的浊度。
实施例3
作为对比例，使用与实施例2中相同类型的膜(30kDa MWCO，聚醚砜)，但应用常规渗滤，对由实施例1获得的相同目标相进行处理。使用Sartoflow Smart台式渗滤系统，该系统具有总膜面积为400cm2的两个Slice 200膜盒。作为渗滤缓冲液，类似于实施例2，使用50mM KPi缓冲液，pH 7.4。
在渗滤开始时，获得约25g/min的渗透流量，表明有效的缓冲液交换。然而，经过4分钟的处理时间后，渗透流量急剧下降至5g/min以下，这使得实验必须中止。因此，在这种情况下不可能完全渗滤。
由产物(mAb)的强烈沉淀引起膜污染，导致中止过程结束时约500NTU的高浊度和48％的低产率。
实现常规渗滤的可行方法是用渗滤缓冲液将目标相稀释五倍，以避免目标组分沉淀，如Kruse等人2020年所述。然而，这导致了多个缺点，如较长的处理时间和需要额外的浓缩步骤来恢复目标组分的初始浓度。
为此，本发明的方法提供了多个优点，因为没有发生目标组分的显著沉淀，从而实现了有效的缓冲液交换和目标组分的高产率，并且不需要额外稀释目标相。

Claims (14)

1.分离系统，其被配置为处理含有多种组分的流体，其中所述流体的所述多种组分中的至少一种组分是目标组分，并且其中所述分离系统包括：
双水相萃取单元，其用于所述流体的双水相萃取，
分离单元，其用于分离在双水相萃取后获得的目标相，其中所述目标相含有所述目标组分，和
交叉流渗滤单元，其用于对分离的所述目标相进行连续渗滤以获得渗余物和渗透物，其中所述交叉流渗滤单元至少包括渗滤通道、第一过滤材料、渗余物通道、第二过滤材料和渗透物收集通道，它们被布置成使得所述第一过滤材料将所述渗滤通道和所述渗余物通道彼此划界，并且所述第二过滤材料将所述渗余物通道和所述渗透物收集通道彼此划界，
其中所述渗滤通道以流体传导的方式连接到所述渗滤介质的至少一个入口；所述渗余物通道以流体传导的方式连接到所述目标相的至少一个入口和所述渗余物的至少一个出口；并且所述渗透物收集通道以流体传导的方式连接到所述渗透物的至少一个出口。
2.用于纯化在流体中包含的目标组分的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)对所述流体进行双水相萃取，
(b)将含有所述目标组分的目标相与双水相萃取后获得的另一相分离，
(c)使用交叉流渗滤单元对分离的所述目标相进行渗滤，
其中所述交叉流渗滤单元至少包括渗滤通道、第一过滤材料、渗余物通道、第二过滤材料和渗透物收集通道，它们被布置成使得所述第一过滤材料将所述渗滤通道和所述渗余物通道彼此划界，并且所述第二过滤材料将所述渗余物通道和所述渗透物收集通道彼此划界，
其中所述渗滤通道以流体传导的方式连接到所述渗滤介质的至少一个入口；所述渗余物通道以流体传导的方式连接到所述目标相的至少一个入口和所述渗余物的至少一个出口；并且所述渗透物收集通道以流体传导的方式连接到所述渗透物的至少一个出口。
3.交叉流渗滤单元用于处理目标相的用途，所述目标相在双水相体系的分离后获得并含有目标组分，其中所述交叉流渗滤单元至少包括渗滤通道、第一过滤材料、渗余物通道、第二过滤材料和渗透物收集通道，它们被布置成使得所述第一过滤材料将所述渗滤通道和所述渗余物通道彼此划界，并且所述第二过滤材料将所述渗余物通道和所述渗透物收集通道彼此划界，
其中所述渗滤通道以流体传导的方式连接到所述渗滤介质的至少一个入口；所述渗余物通道以流体传导的方式连接到所述目标相的至少一个入口和所述渗余物的至少一个出口；并且所述渗透物收集通道以流体传导的方式连接到所述渗透物的至少一个出口。
4.根据权利要求1所述的分离系统，或根据权利要求2所述的方法，或根据权利要求3所述的用途，其中所述目标组分在渗滤后包含在所述渗余物中。
5.根据权利要求1或4所述的分离系统，或根据权利要求2或4所述的方法，或根据权利要求3或4所述的用途，其中分离的所述目标相直接应用于所述交叉流渗滤单元。
6.根据权利要求1、4和5中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2、4和5中任一项所述的方法，或根据权利要求3至5中任一项所述的用途，其中供应的所述渗滤介质的体积流速是供应的所述目标相的体积流速的0.5倍至20倍。
7.根据权利要求6所述的分离系统，或根据权利要求6所述的方法，或根据权利要求6所述的用途，其中供应的所述渗滤介质的所述体积流速是供应的所述目标相的所述体积流速的5.0倍至7.0倍。
8.根据权利要求1和4至7中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2和4至7中任一项所述的方法，或根据权利要求3至7中任一项所述的用途，其中所述目标组分在所述分离的所述目标相中的浓度为0.5g/L至10g/L。
9.根据权利要求1和4至8中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2和4至8中任一项所述的方法，或根据权利要求3至8中任一项所述的用途，其中渗滤后所述目标组分在所述渗余物中的浓度为0.5g/L至10g/L。
10.根据权利要求1和4至9中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2和4至9中任一项所述的方法，或根据权利要求3至9中任一项所述的用途，其中所述第一过滤材料和所述第二过滤材料是相同的。
11.根据权利要求1和4至10中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2和4至10中任一项所述的方法，或根据权利要求3至10中任一项所述的用途，其中所述渗滤介质的pH为2.0至12.0。
12.根据权利要求1和4至11中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2和4至11中任一项所述的方法，或根据权利要求3至11中任一项所述的用途，其中所述渗滤介质选自由以下组成的组：KPi缓冲液、磷酸钠缓冲液、乙酸钠缓冲液、PBS、甘氨酸、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、BIS-Tris缓冲液、HEPES缓冲液和水。
13.根据权利要求1和4至12中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2和4至12中任一项所述的方法，或根据权利要求3至12中任一项所述的用途，其中基于组合物的总量，用于所述双水相萃取的所述组合物包含：4.0至25.0wt.％的平均分子量为300至20000的聚乙二醇；5.0至40wt.％的选自磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐的第一盐或聚合物；0至10.0wt.％的第二盐；10.0至50.0wt.％的含有所述目标组分的流体；其余为水。
14.根据权利要求1和4至13中任一项所述的分离系统，或根据权利要求2和4至13中任一项所述的方法，或根据权利要求3至13中任一项所述的用途，其中所述目标组分选自蛋白、单克隆抗体、激素、疫苗、核酸、外泌体、病毒和病毒样颗粒。
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