KR101964242B1 - 복합 구조체를 이용한 진단 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 다양한 형상 및 재질의 기재(substrate) 상에 기상 증착 방식으로 바이오물질의 핵산에 대한 바인딩 특성 또는 고정능을 갖는 고분자 코팅 층(또는 부착 층)을 형성함으로써 간편하면서 효과적인 진단 플랫폼을 제공할 수 있는 시스템 및 방법이 기재된다.

Description

복합 구조체를 이용한 진단 시스템 및 방법{System and Method for Assay Using Hybrid Structures}
본 개시 내용은 복합 구조체를 이용한 진단 시스템 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 다양한 형상 및 재질의 기재(substrate) 상에 기상 증착 방식으로 바이오물질의 핵산에 대한 바인딩 특성 또는 고정능을 갖는 고분자 코팅 층(또는 부착 층)을 형성함으로써 간편하면서 효과적인 진단 플랫폼을 제공할 수 있는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
인간을 포함한 모든 온혈동물의 장 내에는 박테리아, 바이러스 등과 같은 다양한 병원체가 서식하는데 매우 좋은 환경이 제공되고 있다. 병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있는 바, 구체적으로 박테리아 병원체는 흙, 동물 장기, 동물의 변에 의하여 오염된 물 등에서 발견되고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독(botulism), 콜레라(cholera), 설사(diarrhea), 구토(emesis), 폐렴(pneumonia), 장티푸스(typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 특히, 200 종류 이상의 질병이 음식 및 음용수 단독을 통하여 전염될 수 있다. 예를 들면, Escherichia Coli(또는 E. coli) 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다.
특히, 병원성 대장균 E. coli O157:H7은 장 출혈성 대장균으로서 식중독의 원인균으로 널리 알려져 있으며, 전세계적으로 문제시되고 있다. 또한, 감염 시 용혈성 요독 증후군, 출혈성 대장염, 설사, 신장부전, 발작 등을 유발하며, 심한 경우에는 사망에 이르도록 한다(Reisner, A. et al., 2006. Journal of Bacteriology. 188, 3572-3581; Barrientos, R. M. et al., 2009. Brain, Behavior, and Immunity. 23, 450-454; Schrag, S. J. et al., 2006. PEDIATRICS. 118, 570-576). 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium) 역시 식중독을 일으키는 대표적인 병원체로서 장티푸스 및 파라티푸스의 원인균이며, 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있다. 또한, 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 못한다면, 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식수, 식품 등을 통하여 다른 식품과 교차 오염될 수 있다.
병원체는 오염된 토양, 그리고 수질 환경을 통해 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 통상의 조건 하에서 병원체의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 따라서, 오염된 환경으로부터 빠르고 간편하게 병원체(특히, E. coli)의 유무를 검출할 수 있는 진단 기술이 요구되고 있다.
이와 관련하여, 병원체의 존재 유무를 진단하는 방법에 대하여 지속적으로 연구가 진행되고 있으며, 특히 DNA 및 RNA와 같은 핵산을 기반으로 하는 검출법이 널리 이용되고 있다. 상기 방법 중 핵산, 특히 DNA의 경우에는 PCR(polymerase chain reaction)이라는 강력한 증폭 기술에 의하여 진단 감도를 높일 수 있어 널리 이용되고 있다. 일반적으로, PCR은 체외에서 DNA 유전자 시료를 증폭하는 분자 생물학적인 방법으로서, DNA에 대한 감도를 증가시키기 위하여 DNA 시료의 양 및 농도를 높이는 기술이다. 특히, PCR은 온도 조절이 매우 중요한 화학반응으로서, 대상 시료를 3가지 온도 프로파일(통상, 각각 55-65℃, 72℃ 및 95℃)로 반복하여 가열 및 냉각시키는 방법이다.
핵산-기반 진단 기술의 경우, 전술한 바와 같이 병원체의 검출뿐만 아니라, 포렌식(forensic) 분석, 인류학적 연구 등과 같이 유전학적 분석을 필요로 하는 다양한 기술 분야에서 적용되고 있다. 최근에는 지카 바이러스, 에볼라 바이러스, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 등과 같은 치명적인 바이러스가 전세계적으로 확산됨에 따라 질병 조절 및 예방 분야에서도 중요성이 증가하고 있는 추세이다.
이처럼, 유전학적 분석을 기반으로 하는 임상 진단 기술은 통상적으로 박테리아(bacteria), 균류(fungus) 또는 바이러스(virus)로부터 핵산을 회수하여 증폭 반응을 수행한 다음, 다양한 검출 수단(예를 들면, 광학적, 전기화학적 또는 기계적 바이오센서 디바이스)을 이용하여 앰플리콘(amplicon) 분석을 수행하는 방식이다.
한편, 자연발생적으로 입수되는 환경 시료(예를 들면, 식수, 음식물 등)의 경우, 진단 대상인 특정(타겟) 박테리아 또는 바이러스가 미량으로 존재하는 경우가 일반적이다. 특히, E.coli를 함유하는 환경 시료의 경우에 있어서, 진단하고자 하는 타겟 병원체가 제한된 량으로 존재하기 때문에 정확한 검출을 위하여는 시료 내 바이오물질의 핵산을 효과적으로 회수하는 것이 요구된다.
통상적으로, 바이오물질의 핵산은 페놀, 클로로포름, 구아니디늄 티오시아네이트 등을 이용하여 용해물(lysate)로부터 화학적으로 추출되고 있다. 그러나, 화학적 방법은 독성 화학 물질의 사용 및 숙련된 기술을 요구하는 복잡한 단계를 거쳐야 하기 때문에 용이하게 적용하기는 곤란하다. 핵산을 회수하기 위한 방안으로, 주로 고상 추출법(SPE)이 이용되었는 바, 상기 방법은 화학적 방법에서보다 비교적 독성이 약한 화학 물질을 사용하고, 또한 보다 간단한 방법으로 실시할 수 있는 장점을 갖고 있다.
이와 관련하여, 고상 추출법은 카오트로픽(chaotropic) 시약의 존재 하에서 핵산을 고정 또는 포획할 수 있는 표면-개질 멤브레인 또는 비드(bead)를 사용하며, 다운스트림 분석을 위하여 핵산 회수 후에는 독성 화학 물질을 제거할 수 있어야 한다. 예를 들면, 미국특허번호 제5,234,809호는 핵산에 결합하는 고상물질을 이용하여 핵산을 정제하는 방법을 개시하고 있는 바, 상기 특허에서 정제 공정은 출발 물질, 카오트로픽 물질 및 핵산 결합 고상 물질을 혼합하고, 상기 결합된 핵산을 갖는 고상 물질을 액체로부터 분리한 다음, 고상 물질-핵산 복합체를 세척하는 순으로 진행된다.
그러나, 카오트로픽 물질은 대표적인 생물 반응의 저해 물질로서 핵산 증폭 반응에 대한 카오트로픽 물질의 클로깅(clogging) 및 저해 작용을 억제하기 위하여는 별도의 세척 공정을 거쳐야 하기 때문에 상용 기술에 적용하는데 한계가 있다. 더욱이, SPE-기반의 핵산 추출 공정 중 원심 분리(centrifuge), 볼텍싱(voltexing) 및 가열(heating)과 같은 다수의 복잡한 과정을 거치기 때문에 전염성 질환의 현장 진료(point-of-care) 테스트에 대한 요구를 충족할 수 없는 단점을 갖고 있다.
이처럼, 종래에 알려진 핵산 추출법의 기술적 한계를 극복하기 위하여, 최근에는 이온 교환 메커니즘 또는 친화도에 의하여 핵산과 상호 작용할 수 있는 고분자를 개발하고자 하는 연구가 진행 중이다.
예를 들면, Pandit 등은 키토산 미세입자를 기반으로 하면서 전하 상호작용을 이용하여 DNA를 포획하는 방법을 제안한 바 있으나, 여전히 불균일한 입자 및 고가의 장비 사용으로 인한 한계가 존재한다. 또한, Ham 등은 DNA를 고정하기 위하여 다양한 기재 상에 카테콜계 고분자를 합성하여 코팅하는 기술을 제시하였고, Leiske 등은 세포 용해물로부터 DNA를 효과적으로 추출하기 위하여 플라스틱 기재 상에 폴리(2-옥사졸린)의 다층 구조를 형성하고 RT-PCR(real-time PCR) 테크닉을 이용하여 유전적 진단을 수행하는 연구를 수행한 바 있다. 전술한 방법들의 경우, 합성 고분자를 이용하여 어느 정도 핵산을 추출할 수 있었으나, 고분자 합성에 비교적 많은 시간을 요구하고, 또한 복잡한 절차를 수반하기 때문에 재현성 및 효율성 면에서 문제점이 있다.
따라서, 종래기술의 문제점을 해소하고, 특히 환경 시료와 같이 저 농도로 존재하는 병원체를 함유하는 시료에 대하여도 보다 간편하면서 효율적으로 진단할 수 있는 시스템 및 방법에 대한 개발이 요구되고 있다.
본 개시 내용에 따른 구체예에서는 종래기술의 한계를 극복하기 위하여, 다양한 형상의 기재 표면 상에, 바이오물질(예를 들면, 각종 병원체 등의 타겟 바이오물질)의 핵산(구체적으로 DNA)에 대하여 효과적인 바인딩(고정 또는 포획) 특성을 갖는 특정 고분자를 코팅(또는 증착)함으로써 추가적인 장비 또는 화학 물질을 사용하지 않고도 바이오물질을 간편하게 검출 또는 분석할 수 있는 스마트 진단 시스템 및 방법을 제공하고자 한다.
본 개시 내용의 제1 면에 따르면,
a) 바이오물질의 용해물(lysate)을 핵산에 대한 고정능을 갖는 기재와 접촉시켜 상기 용해물 중 바이오물질의 핵산을 상기 기재 상에 고정하는 단계;
b) 상기 기재에 고정된 핵산을 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭된 핵산을 검출하는 단계;
를 포함하는 바이오물질의 진단 방법으로서,
상기 바이오물질의 핵산에 대한 고정능을 갖는 기재는,
1차원, 2차원 또는 3차원 형상을 갖는 기재; 및
상기 기재의 표면에 기상 증착 방식에 의하여 형성된 양이온성 고분자의 코팅 층;
을 포함하며,
여기서, 상기 양이온성 고분자는 고분자 반복 단위의 측쇄 말단에 양전하의 질소를 갖는 아민을 함유하며, 상기 바이오물질의 핵산과 전하 상호작용에 의하여 핵산에 대한 고정능 또는 포획능을 나타내는, 바이오물질의 진단 방법이 제공된다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 기상 증착 방식은 화학 기상 증착법(CVD)일 수 있으며, 보다 구체적으로 플라즈마 화학 증착법(PECVD) 또는 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(iCVD)일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 바이오물질의 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 단계 b)에 앞서 또는 상기 단계 b) 중 삽입 염료(intercalating dye)를 첨가하여 증폭된 핵산의 이중 스트랜드 내로 삽입 염료를 삽입함으로써, 상기 삽입 염료로부터 기인하는 형광을 검출할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 양이온성 고분자의 코팅 층이 형성된 기재는 특정 바이오물질의 핵산에 대하여 특이적 바인딩 특성 또는 고정능을 나타낼 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 상기 양이온성 고분자는 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS)일 수 있다.
본 개시 내용의 제2 면에 따르면,
1차원, 2차원 또는 3차원 형상의 기재;
상기 기재의 표면에 기상 증착 방식에 의하여 형성된 양이온성 고분자의 코팅 층, 여기서 상기 양이온성 고분자는 고분자 반복 단위의 측쇄 말단에 양전하의 질소를 갖는 아민을 함유하며, 상기 양이온성 고분자의 코팅 층은 전하 상호작용(charge interaction)에 의하여 바이오물질의 핵산에 대한 고정능 또는 포획능을 나타냄;
상기 양이온성 고분자의 코팅 층에 바인딩 또는 고정된 핵산에 대한 증폭 수단; 및
상기 증폭된 핵산의 검출 수단;
을 포함하는 바이오물질의 진단 시스템이 제공된다.
본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 복합 구조체를 이용한 분석 시스템 및 방법은, 기상 증착 공정을 이용하여 독성 용매를 사용하거나 합성 후 정제 과정을 거치지 않고도 특정 고분자로 다양한 형상을 갖는 기재의 표면을 균일하게 코팅(개질)시킴으로써 바이오물질로부터 유래 또는 추출된 핵산에 대한 고정능 또는 포획능을 제공할 수 있다. 또한, 바이오물질에 대한 진단 과정에서 추가 단계(예를 들면, 세척 또는 정제 단계) 또는 장치, 및/또는 화학물질의 사용 없이도 간편하고 정확하게 바이오물질을 검출할 수 있는 방안을 제시한다. 특히, 환경 시료와 같이 저농도의 바이오물질(예를 들면, 병원체 등)을 함유하는 시료에 대하여도 효과적으로 적용 가능하고, 더 나아가 복합 구조체(즉, 고분자로 코팅된 기재) 상에서 인-시튜( in- situ)로 검출이 가능한 신규의 플랫폼을 제공한다. 따라서, 향후 임상 진단, 환경 모니터링, 약물 유전학 분석 등의 다양한 분야에서 광범위한 활용이 기대된다.
도 1은 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 기재 상에 고분자 코팅 층을 형성하기 위한 iCVD 공정의 기본적인 원리를 도시하는 도면이고;
도 2는 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 기상 증착 공정에 의하여 양이온성 고분자를 기재 상에 코팅(또는 부착)한 후에 바이오물질의 핵산을 고정하고, 후속적으로 증폭(구체적으로, PCR) 및 검출(앰플리콘 검출)을 수행하는 일련의 과정을 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 3a 내지 도 3c 각각은 실시예 1에서 고분자 코팅 전 기재(구체적으로 필터 구조물)의 표면에 대한 SEM 사진, 기상 증착 공정을 이용하여 양이온성 고분자로 표면이 코팅된 기재의 표면에 대한 SEM 사진, 그리고 양이온성 고분자로 코팅된 기재의 SEM 단면 사진이고;
도 4a 내지 도 4c는 각각 실시예 1에서 제작된, PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 기재의 접은 상태의 디지털 카메라 사진, 그리고 접힌 부위의 150 배율 SEM 사진 및 5000 배율 SEM 사진이고;
도 5a는 실시예 1에서 PDMAMS 고분자, 코팅 전 기재 및 PDMAMS 고분자로 코팅된 기재 각각에 대한 라만 스펙트럼이고;
도 5b는 실시예 1에서 기재 중 PDMAMS 고분자로 코팅된 부분 및 코팅되지 않은 부분 각각에 대한 라만 스펙트럼이고;
도 6a 내지 도 6d는 각각 실시예 1에서 기재 상에 PDMAMS 고분자가 코팅되기 전, 코팅된 후, 그리고 DNA가 고정된 후의 기재 표면의 변화를 나타내는 AFM 사진, 공초점 명시야(confocal bright field) 현미경 사진, 공초점 형광 현미경 사진 및 공초점 병합(merged) 사진이고;
도 7a는 실시예 1에서 기재 상에 PDMAMS가 코팅되기 전, 코팅된 후, 그리고 DNA가 고정된 후의 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy) 원소 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 7b는 실시예 1에서 기재 상에 PDMAMS 고분자가 코팅된 후의 P2p(peak for phosphorous) 고해상도 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 7c는 실시예 1에서 PDMAMS 고분자가 코팅된 기재 상에 DNA가 고정된 후의 P2p(peak for phosphorous) 고해상도 분석 결과를 나타내는 그래프이고;
도 7d는 실시예 1에서 기재 상에 PDMAMS 고분자가 코팅되기 전, 코팅된 후, 그리고 DNA가 고정된 후의 제타 포텐셜을 각각 나타내는 그래프이고;
도 7e는 실시예 1에서 PDMAMS 고분자가 코팅된 기재과 접촉하는 용해물(lysate) 용액(DNA 용액)의 농도를 각각 달리하여 침지시킨 후(각각 5 ng/㎕, 10 ng/㎕ 및 20 ng/㎕), 면적 당 포획된 DNA 개수를 나타내는 그래프이고;
도 8은 실시예 1에 따라 인위적으로 배양된 병원체, 즉 E. Coli O157:H7의 용해(lysis), PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 기재 상에 용해물(lysate)로부터 추출된 DNA의 고정(포획), PCR 및 형광 검출을 수행하는 일련의 과정을 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 9는 실시예 1에서 배양된 E. Coli O157:H7의 시료 농도를 변화시키면서 PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 필터 구조물의 타겟 병원체로서 E. Coli O157:H7에 대한 검출 한계(limit of detection) 실험을 수행한 결과를 나타내는 그래프이고;
도 10는 실시예 2에 따라 E. Coli O157:H7로 오염된 각종 식품의 채취 시료 중 바이오물질에 대한 용해(lysis), PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 필터 구조물 상에 용해물(lysate)로부터 추출된 DNA의 고정(포획), PCR 및 형광 검출을 수행하는 일련의 과정을 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 11은 실시예 2에 따라 PDMAMS로 표면 개질된 필터 구조물에 대하여 다양한 식품 샘플로부터 유래된 E. Coli O157:H7의 검출 한계 실험의 결과를 나타내는 그래프이고; 그리고
도 12는 실시예 3에 따라 복합 구조체의 기재로서 나일론 메쉬 및 Kimtech 페이퍼의 적용 가능성을 확인하기 위한 형광 검출 실험을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.
또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위하여 실제 층의 두께(또는 높이) 또는 다른 층과의 비율에 비하여 다소 과장되게 표현된 것일 수 있으며, 그 의미는 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
"고분자"는 단일중합체 및 공중합체를 모두 포함하며, 공중합체는 랜덤 공중합체 및 블록 공중합체를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
"바이오물질"은 광의로는 임의 타입의 생물학적 유기체(biological organism)로부터 유래하는 물질을 의미할 수 있으며, 협의로는 복수의 세포로 이루어질 수 있고 핵산일 필요는 없으며, 예를 들면 병원체(병원성 세포) 또는 암(종양) 세포일 수 있다.
"기재(substrate)"는 그 위에 부착(고정) 또는 코팅(도포) 가능한 표면을 제공하는 구조 또는 구조물을 의미할 수 있으며, 1차원, 2차원 또는 3차원 형상을 가질 수 있다.
"필터 구조물"은 유체 또는 매질이 통과할 수 있도록 다수의 개구부(opening) 또는 포어를 갖는(예를 들면, 메쉬 패턴을 갖는) 임의의 구조로 이해될 수 있다.
"시료"는 검출하고자 하는 바이오물질를 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다. 이외에도, 시료는 바이오물질을 저농도로 함유하는 환경 시료(environmental sample)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 식수, 음식물 등과 같이 다양한 형태 및 종류를 포함할 수 있다.
“핵산”은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 즉, 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다. 다만, 보다 전형적으로는 DNA, RNA 등일 수 있다.
"프라이머"는 상보적 스트랜드의 합성이 폴리머라아제에 의하여 촉매화되는 조건 하에 있는 경우, 상보적 스트랜드를 따라 핵산의 합성 또는 복제 초기 지점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드(합성 또는 천연)를 의미할 수 있다.
"증폭(amplification)"은 주형(template)으로서 핵산 분자 중 적어도 하나를 이용하여 핵산 분자에 대한 복수의 복제물 또는 핵산 분자에 상보적인 복수의 복제물을 형성하는 것을 의미할 수 있는 바, 이러한 증폭 시스템 또는 증폭 수단은, 예를 들면 PCR 시스템, 리가아제 체인 반응(LCR) 시스템, 핵산 서열 기반의 증폭(NASBA), Q-베타 리플리카아제(Q-Beta Replicase) 시스템, 전사-기반 증폭 시스템(TAS) 및 스트랜드 변위 증폭(SDA) 등을 포함할 수 있으며, 증폭 생성물을 앰플리콘으로 지칭한다.
"고정(immobilization)"은 임의의 물질 또는 생활성제가 기재에 공유적 또는 비공유적으로 직접 또는 간접 방식에 의하여 부착되는 것을 의미할 수 있다.
"용해 완충액(lysis buffer)"은, 예를 들면 25?에서 약 6 내지 약 9의 pKa로, pH 값을, 예를 들면 6 내지 9(구체적으로 약 7.5 내지 9, 보다 구체적으로 약 7.8 내지 8.5)로 효과적으로 유지할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 이때, 완충액은 전형적으로 효소 활성의 기능과 조화되고, 생물학적 분자의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 생리학적으로 조화가능한(physiologically compatible) 완충액을 의미할 수 있다.
"접촉한다"는 협의로는 2개의 대상 간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
"PCR"은 사이클 프로세스(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미하는 바, 통상적으로 PCR 혼합물은 (i) 증폭하고자 하는 염기서열을 갖는 주형인 이중나선형 DNA 분자, (ii) 프라이머(주형 DNA 내 상보적 DNA 염기서열과 결합할 수 있는 단일 스트랜드 DNA 분자), (iii) dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물(PCR 증폭 과정에서 새로운 DNA 분자를 형성하도록 합쳐지는 뉴클레오티드 서브유닛)인 dNTP, 및 (iv) Taq DNA 폴리머라아제(dNTP)를 사용하여 새로운 DNA 분자를 합성하는 효소)를 포함할 수 있다.
"삽입 염료(intercalating dye)"는 핵산, 특히 DNA 이중 스트랜드의 주된 홈(major groove)에 결합하는 성질을 갖는 염료를 의미할 수 있다.
"형광(fluorescence)"이라는 용어는 전자기적 여기에 의하여 짧은 시간 동안 생성되는 발광 타입을 의미할 수 있다. 즉, 형광은 특정 물질이 짧은 파장에서 광 에너지를 흡수한 후에 보다 긴 파장에서 광 에너지를 방출할 때 생성되는 현상을 의미한다. 예시적으로, 흡수와 방출 간의 시간 길이는 통상적으로 비교적 짧은데, 예를 들면 약 10-9 내지 10-8 초 수준일 수 있다.
"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 특정 고분자로 코팅(개질)된 복합 구조체(구체적으로 메쉬 타입의 복합 구조체)를 이용하여 다양한 바이오물질로부터 유래되거나 추출된 핵산을 바인딩하여 고정(포획)하고, 이후 고정 또는 포획된 핵산을 증폭하여 바이오물질(또는 타겟 바이오물질)을 검출하기 위한 진단 시스템 및 방법이 제공된다. 이때, 복합 구조체는 임의의 형상을 갖는 기재의 표면에 기상 증착 공정에 의하여 형성된 양이온성(또는 양이온성 관능기를 갖는) 고분자의 코팅(부착) 층이 형성되어 있다.
이와 관련하여, 기상 증착 공정은 일반적으로 기체화된 소스를 기재의 표면에 코팅 또는 부착하는 공정을 의미하는 바, 이러한 기상 증착 공정은 고순도의 코팅층 형성, 계면 특성의 제어 용이성 등과 같은 장점을 제공할 수 있다.
본 개시 내용의 예시적 구체예에서는 고분자 코팅을 위하여 화학 기상 증착법(CVD)을 적용할 수 있다. 구체적으로, 고분자 코팅(또는 부착)을 위한 화학 기상 증착법은 액상 유기 합성 반응을 기상 반응 공정에 적용한 것으로 기화된 모노머가 기상 반응기 내에서 활성화되어 고분자 중합반응이 이루짐에 따라 기재 표면 상에 고분자 코팅층이 형성되므로 고분자 중합반응과 코팅 층의 부착이 하나의 공정에서 동시에 이루어질 수 있다. 이처럼, 본 개시 내용에 따른 구체예에서는 기상 증착 공정, 특히 화학 기상 증착 공정을 이용하여 고분자 코팅 층을 형성할 수 있다.
화학 기상 증착 공정은 일반적으로 진공 분위기 하에서 가스 상 반응물의 화학적 반응을 이용하여 필름 또는 파우더 형태의 고상 물질을 형성하는 원리를 이용한다. 종래의 용액-기반의 표면 코팅 기술과 비교하면, 기재 또는 기판의 마이크로 스케일 및 나노 스케일 구조를 완전히 보전하고, 유기 용매로 인하여 발생되는 각종 손상을 방지할 수 있고, 복잡한 기하학적 형상을 갖는 기재에 대하여도 균일하게 코팅할 수 있으며, 그리고 코팅 두께를 용이하게 조절할 수 있는 장점을 갖는다. 특히, 화학 기상 증착 공정의 경우, 다양한 형상 및 재질의 기재에 대하여 적용할 수 있고, 또한 비교적 저온(예를 들면, 약 500 ℃ 이하, 구체적으로 약 300 ℃ 이하, 보다 구체적으로 100 ℃ 이하의 온도)에서 수행 가능하다. 이와 관련하여, 화학 기상 증착 공정으로서, 예를 들면 플라즈마 화학 증착법(PECVD) 또는 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(iCVD)을 적용할 수 있다.
플라즈마 강화 화학 증착법(PECVD)의 경우, 모노머의 충돌을 유도하기 위하여 플라즈마를 이용하고, 전자, 이온, 라디컬 및 원자의 혼합물을 생성하는데, 이는 후속적으로 자유 라디컬 메커니즘을 이용한 중합 과정을 거치게 된다.
한편, iCVD 공정은 이미 액상 공정으로는 공지된, 자유 라디칼을 이용한 연쇄중합 반응을 이용하는데, 개시제 및 모노머를 기화하여 기상에서 고분자 반응이 이루어지게 함으로써, 고분자 코팅을 기재 표면에 부착하는 공정이다. 이때, 개시제 및 모노머는 단순히 혼합된 상태에서는 중합 반응이 일어나지 않으나, 기상 반응기 내에 위치한 고온의 필라멘트에 의하여 개시제가 분해되어 라디칼이 생성되면, 이에 의하여 모노머가 활성화되어 연쇄 중합 반응이 이루어질 수 있는 것이다.
더욱이, 고분자 중합 반응에 사용된 구동력은 오직 필라멘트의 고온뿐이며, 이러한 필라멘트의 온도에서는 모노머에 대한 화학적 손상이 없기 때문에, 고분자 코팅 층 역시 모노머가 갖고 있는 다양한 관능성 그룹을 그대로 유지한 채, 고분자 코팅 층으로 전환시킬 수 있게 된다.
다만, 전술한 PECVD 공정의 경우, 높은 에너지 유입으로 인하여 분지 및 가교 정도가 높은 고분자 코팅 구조가 형성될 수 있고, 경우에 따라서는 공정 중에 원하는 관능기가 아닌 비특이적 관능기가 생성될 가능성이 있기 때문에 화학 기상 증착 공정 중 iCVD 공정을 적용하는 것이 보다 유리할 수 있다. 이처럼, iCVD 공정이 다양한 장점을 갖고 있기 때문에 이하에서는 iCVD 공정을 중심으로 기술하기로 한다. 그러나, 본 구체예에서 PECVD 공정 역시 적용할 수 있음은 전술한 바와 같다.
도 1은 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 기재(substrate) 상에 고분자 코팅 층을 형성하기 위한 iCVD 공정의 기본적인 원리를 도시한다.
전술한 바와 같이, iCVD 공정은 증착 과정 중 모노머 및 개시제를 온도 제어기를 사용하면서 가열하여 기화시키고, 이와 같이 생성된 가스상 성분을 질량 흐름 제어기로 계량하여 반응기 내로 공급한다. 이때, 반응기는 통상적으로 투명한 석영 커버가 구비되어 있는데, 예를 들면 Ni-Cr 필라멘트가 배열되도록 구성된다. 이러한 필라멘트는, 통상적으로 약 180 내지 250 ℃ 범위로 가열되는 한편, 반응 영역은 순환수에 의하여 약 20 내지 50 ℃ 범위로 유지될 수 있다. 또한, 반응기 내부 압력은, 통상적으로 버터플라이 스로틀링 밸브에 의하여 약 0.05 내지 1 Torr 범위에서 유지될 수 있다. 기재(substrate) 근처에 위치하는 기준(reference) 실리콘 웨이퍼 상에서 두께 증가를 인-시튜(in-situ)로 측정하여 증착 프로세스를 모니터링할 수 있도록 He-Ne 레이저 및 광도계로 이루어지는 간섭 시스템을 이용할 수 있다.
도시된 바에 따르면, 반응기 내부의 중합 반응은 가열된 필라멘트의 근처에서 개시제의 분해에 의하여 개시된다. 중합 반응은 연속적으로 형성된 라디컬과 모노머가 기상에서 충돌함으로써 활발히 이루어진다. iCVD 공정 중 중합 반응은 흡착 기반의 단일 단계 표면 중합 프로세스로서, 관능성 모노머 및 올리고머는 기재의 표면 상에 흡착되어 표면 상에서 사슬(chain)이 전파된다. 이처럼, 모노머의 표면 농도가 iCVD 중합 반응의 주된 요인으로서, 용액 기반의 자유 라디컬 중합 반응과 구별되는 점이다. 이때, iCVD 공중합 공정에서 생성물의 조성은 모노머의 유속 및 공중합 반응 비율뿐만 아니라, 기재에 대한 각각의 모노머의 흡착율과 관련성이 있다. 이와 같이, iCVD 공정을 이용하여 넓은 범위의 관능기를 갖는 고분자 코팅을 형성할 수 있다.
예시적 구체예에 있어서, 기재 상에 iCVD 공정을 통한 고분자 코팅 층을 형성할 경우, 하기와 같은 다양한 장점을 갖고 있다:
첫째, 개시제를 도입하여 증착 공정에서 에너지 유입량을 상당히 낮출 수 있으며(예를 들면, 약 0.01 W/cm2), 그 결과 고분자의 특정 관능기가 박막 필름 상에서도 유지될 수 있고 고분자 조성을 정밀하게 조절할 수 있다. 특히, 기상에서 고분자를 합성하기 때문에 코팅 또는 증착 공정이 간단하다. 또한, 기재는 공정 중 순환수에 의하여 냉각되며, 개시제가 분해되는 가열 필라멘트로부터 멀리 유지되어 기재 물질이 과도한 열에 노출되는 것을 방지할 수 있다.
둘째, 기재의 벌크 특성에 영향을 주지 않고도 표면이 특정 물성을 갖도록 개질할 수 있다.
셋째, 코팅 두께를 정밀하게 조절하면서 복잡한 형상을 갖는 기재 표면에 고품질의 코팅을 형성할 수 있다. 예를 들면, 금속 메쉬, 섬유 메쉬, 페이퍼류 등과 같이 다양한 재질 및 형태를 갖는 3차원의 기재 상에서도 균일한 코팅 층을 형성할 수 있다. 즉, 표면 장력 효과가 없기 때문에 복잡한 형태학적 특징을 갖는 기재에 대하여 유연한 코팅 층을 형성할 수 있는 것이다. 이러한 장점은 바이오계면의 개질에 중대한 유용성을 제공하는데, 실제 액상 공정에서는 기재의 표면 특성을 유지하면서 균일하게 박막을 형성하기 곤란하다. 구체적으로, 종래의 액상 기반의 고분자 코팅 방식에서는, 기재가 복잡한 형상을 갖는 경우에 기재의 타입에 대한 의존성이 높은 반면, iCVD 공정을 이용할 경우에는 모세관 브릿지 없이도 기재의 전체 표면 상에 유연한 코팅 층을 형성할 수 있게 된다. 이처럼, 높은 표면적의 유연한 코팅이 기재 표면에 형성됨으로써 핵산과 고분자 코팅의 표면 간 상호작용을 증가시킬 수 있다.
넷째, 용해물로부터 핵산을 추출하기 위하여 추가적인 장치를 사용할 필요가 없다. 기존의 SPE 방법에서는 원심분리를 반복 실시하여 세포 막, 세포 소기관(organelles), 세포 용해 화학물질을 포함하는 세포 파편(debris)을 제거해야 한다. 그러나, 본 구체예에서와 같이 iCVD를 적용하여 양이온성 고분자를 코팅할 경우, 기재 표면이 양 전하를 나타내기 때문에 세포 용해물 용액 내에서 간단히 인큐베이팅시킴으로써 전하 상호작용을 이용하여 핵산을 직접 바인딩하여 포획 또는 고정할 수 있다. 따라서, 상술한 세정 또는 세척 과정 없이 핵산을 기재 상에 고정할 수 있다.
마지막으로, iCVD 공정은 독성 용매를 사용하지 않고도 생물학적 상용성(biocompatibility) 및 순도 면에서 양호하며, 이와 동시에 다양한 물질을 증착할 수 있다. 특히, 공중합 반응을 통하여 박막의 안정성을 향상시킬 수 있다.
도 2는 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 기상 증착 공정에 의하여 양이온성 고분자(예를 들면, PDMAMS 고분자)를 기재 상에 코팅(또는 부착)한 후에 바이오물질의 핵산을 고정하고, 후속적으로 증폭 반응(구체적으로, PCR 증폭) 및 검출(앰플리콘 검출)을 수행하는 일련의 과정을 개략적으로 도시한다.
일 구체예에 따르면, 기재는 이의 표면에 전술한 고분자를 코팅 가능한 임의의 형상을 갖는 구조 또는 구조물인 한, 특정 재질 또는 형상으로 한정되는 것은 아니다. 이러한 기재의 재질의 예로서, 플라스틱 또는 수지계 재질(예를 들면, 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 폴리염화비닐(PVC), 폴리카보네이트(PC), 폴리에스테르, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리우레탄(PU) 등), 무기계(예를 들면, 실리콘, 유리, 세라믹 등), 각종 유기계 (예를 들면, 페이퍼, 섬유, 가죽 등), 금속계(예를 들면, 구리(Cu), 알루미늄(Al), 스테인레스 스틸(SUS), 금(Au), 은(Ag), 티타늄(Ti) 등)을 들 수 있다.
예시적 구체예에 있어서, 기재는, 예를 들면 임의 형상의 필터 구조물일 수 있는 바, 도시된 바와 같이 메쉬 타입의 구조물일 수 있다. 이러한 구조물의 경우, 예를 들면 금속(예를 들면 스테인레스 스틸(SUS), 구리, 알루미늄, 티타늄 등) 메쉬 구조, 섬유(예를 들면, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 테플론(Teflon) 등) 메쉬 구조, 페이퍼(예를 들면, Kimtech 페이퍼, 니트로셀룰로오스 페이퍼, 필터 페이퍼), 세라믹 필터 구조물 등일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 기재로서 1차원, 2차원 또는 3차원 구조 또는 구조물을 특별한 제한 없이 사용할 수 있으나, 3차원 구조를 갖는 기재를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이는 3차원 구조의 경우, 보다 높은 표면적을 제공할 수 있기 때문에 다량의 DNA를 고정 또는 포획할 수 있고, 결과적으로 보다 신속하고 정확하게 바이오물질을 검출할 수 있기 때문이다. 다만, 본 개시 내용에서 3차원 구조의 기재로 한정되는 것은 아니며, 본 개시 내용의 본질을 해하지 않는 범위 내에서 다양한 재질 또는 형상(또는 패턴)을 갖는 기재에 대하여도 적용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
특정 구체예에 있어서, 기재로서 메쉬 타입의 필터 구조물을 사용할 수 있다. 이때, 메쉬 치수는 후속 과정에서 양이온성 고분자가 표면 코팅(또는 개질)된 후에 바이오물질로부터 유래되거나 추출된 핵산을 효과적으로 고정할 수 있는 범위에서 적절히 선택될 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 메쉬의 포어 사이즈 및 메쉬를 구성하는 금속 또는 섬유 스트랜드의 두께(직경)는, 각각 예를 들면 약 0.1 내지 1000 ㎛(구체적으로 약 1 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 10 내지 50 ㎛) 및 약 1 내지 1000 ㎛(구체적으로 약 10 내지 500 ㎛, 보다 구체적으로 약 50 내지 100 ㎛) 범위일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 기재 상에 코팅 가능한 양이온성 고분자로서, 구체적으로 고분자 반복 단위의 측쇄 말단에 양전하의 질소를 갖는 1차 아민, 2차 아민, 또는 3차 아민을 함유하는 고분자를 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 고분자 반복 단위의 측쇄 말단에 양전하의 질소를 갖는 3차 아민을 함유하는 고분자를 사용할 수 있는 바, 양전하의 질소를 갖는 3차 아민을 함유하는 고분자의 핵산에 대한 고정능이 보다 우수하기 때문이다. 이러한 양이온성 고분자로서, 폴리-2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 폴리 다이메틸아미노에틸아크릴레이트(pDMAEA), 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA) 등을 예시할 수 있으며, 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS)은, 측쇄 상에 3차 아민기를 함유하고 있으며 pH<8.5에서 양성자화되는 것으로 알려져 있다. 이처럼, 기재 상에 코팅되는 양이온성 고분자는, 양 전하의 질소 원자를 함유하고 있기 때문에 양이온성 고분자 층이 코팅된 기재의 표면은 (+) 전하를 띄게 된다.
또한, 예시적 구체예에 따르면, iCVD 공정을 적용할 수 있는 바, 이때 모노머와 함께 반응기 내로 도입되는 개시제로서, 예를 들면 퍼옥사이드(peroxide)계 개시제를 사용할 수 있는데, 구체적으로 t-부틸 퍼옥사이드(t-butyl peroxide), 아밀 퍼옥사이드(amyl peroxide), 벤조일 퍼옥사이드(benzoyl peroxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), t-부틸 퍼옥시벤조에이트(t-butyl peroxybenzoate) 등을 예시할 수 있다. 이와 관련하여, t-부틸 퍼옥사이드는 약 110 ℃에서 비등하는 휘발성 화합물로서, 약 150 ℃ 전후에서 열분해된다. 이처럼, 전술한 개시제는 가열을 통하여 분해되어 라디칼을 형성할 수 있는 것이다.
예시적 구체예에 따르면, iCVD 공정 중 모노머 대 개시제의 공급 비율은, 몰 기준으로 예를 들면 약 1 : 1 내지 5 : 1, 구체적으로 약 2 : 1 내지 3 : 1 범위일 수 있으나, 반드시 상기 수치 범위로 한정되는 것은 아니다.
한편, 기상 증착 방식, 구체적으로 화학 기상 증착 방식에 의하여 기재 상에 양이온성 고분자를 코팅하는 공정에 있어서, 양이온성 고분자의 코팅(증착) 층의 두께는, 증착 시간에 따라 변화할 수 있는데, 예를 들면 약 1 내지 1000 nm, 구체적으로 약 10 내지 500 nm, 보다 구체적으로 약 100 내지 300 nm 범위일 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, iCVD 공정을 적용할 경우, 반응기 내 압력은, 예를 들면 약 10 내지 1000 mTorr, 구체적으로 약 50 내지 500 mTorr, 보다 구체적으로 약 100 내지 300 mTorr 범위일 수 있다. 또한, 기재 온도 및 반응기 내 필라멘트의 온도는, 각각 예를 들면 약 10 내지 50 ℃(구체적으로 약 20 내지 40 ℃, 보다 구체적으로 약 25 내지 35 ℃), 그리고 약 180 내지 300 ℃(구체적으로 약 190 내지 250 ℃, 보다 구체적으로 약 200 내지 220 ℃) 범위일 수 있다. 또한, 모노머 및 개시제 각각의 유속(flow rate)은, 예를 들면 약 0.1 내지 1 sccm(구체적으로 약 0.2 내지 0.8 sccm, 보다 구체적으로 약 0.3 내지 0.5 sccm) 범위에서 선정될 수 있다.
상술한 바와 같이 기상 증착 방식에 의한 코팅 과정이 수행된 후에는, 바이오물질로부터 유래되거나 추출된 핵산을 양이온성 고분자로 코팅된 기재와 접촉시켜 기재 표면 상에 고정 또는 포획되도록 한다. 이와 같이 핵산(특히, DNA)이 상기 개질 표면에 고정되는 이유는 다음과 같다: 바이오물질로부터 유래되거나 추출된 핵산의 주쇄 내에 존재하는 포스페이트기는 (-) 전하를 갖는 산소 원자를 갖고 있기 때문에, 핵산의 포스페이트-당 주쇄는 전체적으로 (-) 전하를 갖는다. 따라서, 코팅된 기재의 표면과 핵산이 접촉할 경우, 전하 상호작용(charge interaction)에 의하여 서로 바인딩될 수 있는 것이다. 이처럼, 코팅된 기재는 용해물 중 핵산 이외의 성분을 제거하기 위한 부가 단계(예를 들면, 세척 또는 세정 단계, 용해물의 정제 단계 등)을 거치지 않고도, 인-시튜로 핵산을 추출할 수 있고 유전학적 분석에 직접 적용할 수 있는 장점을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 바이오물질은 병원체 또는 병원성 세균을 포함할 수 있다. 병원체는 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물로서, 그람 양성균 및 그람 음성균을 포함할 수 있고, 구체적으로 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 보다 구체적으로는 E. coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi 등일 수 있다. 이외에도, 바이러스 종류로서 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 누수투 또는 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 또는 토스카나 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로시오 바이러스, 홍역 바이러스, 머레이 뇌염 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 림프구 무도수막염(lymphocytic choreomeningitis) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 크리미아-콩고 출혈 열 바이러스, 리사 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 단순 포진 1형 및 2형 바이러스, 보다 전형적으로 알파바이러스, 아데노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 플라비바이러스, 리노바이러스, 오쏘부냐바이러스(orthobunyavirus), 폴리오바이러스, 인간 파보바이러스, 엔테로바이러스, 코로나바이러스, 인간 파필로마바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 1, 2 및 3형의 파라인플루엔재 바이러스, 또는 임의의 확인된 바이러스를 포함할 수 있다. 상기 나열된 종류는 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 반드시 특정 종류로 한정되는 것은 아니다.
전술한 병원체는 다양한 방식, 즉 각종 기상, 액상 및/또는 고상 매질 또는 매개체(medium)를 통하여 전파될 수 있는 바, 특히 식수, 음식물 등에 함유되고 증식되어 인체 내로 침입할 수 있고, 또한 환경 시료는 다양한 형태의 매질 내에 함유된 바이오물질을 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 바이오물질로부터 핵산을 추출하기 위하여 용해(lysis), 구체적으로 세포 용해 단계를 수행한다. 이와 관련하여, 당업계에서 알려진 다양한 용해법을 적용할 수 있는 바, (i) 조절된 온도 조건 하에서 바이오물질 함유 시료를 약 70 내지 95 ℃(구체적으로 약 80 내지 90 ℃)에서 가열하는 방법. (ii) 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 펄스 온(pulse on) 및 펄스 오프(pulse off)를 교대로 실시하는 방법, 그리고 (3) 용해 완충액(lysis buffer)을 사용하는 방법이 예시될 수 있다.
특정 구체예에 따르면, 용해 완충액을 이용하여 용해물(lysate)을 얻고, 이를 이용하여 코팅된 기재 상에 핵산(구체적으로 DNA)를 고정시킨다. 용해 완충액에 첨가 가능한 버퍼(buffer) 성분의 예로서, HEPES((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산(Tricine), 트리스(히드록시메틸)메틸아민 산(Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼(K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, 및/또는 NaH2PO4), 또는 이의 조합 등을 들 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 용해 완충액 내 버퍼 성분의 농도는, 예를 들면 약 3 내지 30 mM, 구체적으로 약 5 내지 20 mM, 보다 구체적으로 약 6 내지 10 mM 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 반드시 상기 수치 범위에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로, 용해 완충액은 프로테나아제 K, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 스트렙토그리신 등과 같이 당업계에서 핵산 추출을 위하여 사용되는 프로테아제를 더 함유할 수도 있다.
이러한 완충액은 상업적으로 입수 가능한데, 예를 들면 독일 Qiagen GmbH사에서 시판 중인 QIAamp® DNA Mini Kit에서 제공되는 용해 완충액을 사용할 수 있다. 용해 완충액이 특정 제품으로 한정되는 것은 아니나, 예시적인 용해 완충액의 조성을 하기 표 1에 나타낼 수 있다:
성분 농도
Tris·Cl (pH 8.0) 20 mM
EDTA 20 mM
NaCl 200 mM
DTT 80 mM
SDS 4%
Proteinase K 250 μg/ml
일 구체예에 있어서, 바이오물질의 용해 과정 중 온도는 사용되는 효소의 종류 등을 고려하여 적절한 범위로 조절할 수 있는데, 예를 들면 약 30 내지 95 ℃(전형적으로 약 40 내지 80 ℃, 보다 전형적으로 약 55 내지 72 ℃) 범위 내에서 정하여질 수 있다. 상기 온도 범위는 예시 목적으로 기술되는 바, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
용해 과정을 거친 결과, 용해물은 핵산을 함유하게 되며, 전술한 바와 같이 양성 고분자로 코팅된 기재를 용해물 내로 투입하고, 용해물 내에 존재하는 핵산이 상기 코팅된 기재의 표면 상에 고정되는데 충분한 조건 하에서 인큐베이팅시킨다. 이때, 핵산의 고정에 적합한 온도는, 예를 들면 약 10 내지 30 ℃(구체적으로 약 20 내지 25 ℃) 범위일 수 있고, 인큐베이팅 시간은, 예를 들면 약 40 내지 120분, 구체적으로 약 50 내지 100분 범위 내에서 선택될 수 있으나, 이는 예시적인 것으로 이해되어야 한다. 이처럼, 코팅된 기재의 표면과 용해물을 접촉시킴에 따라, 기재의 표면 상에 존재하는 (+) 전하와 핵산의 (-) 전하 간의 상호작용에 의하여 핵산이 기재의 표면에 효과적으로 고정 또는 포획될 수 있다.
이후, 핵산이 고정 또는 포획된 기재는 증폭 수단 또는 증폭 반응을 이용하여 유전학적 분석 과정을 거치게 된다. 구체적으로, 타겟 핵산(구체적으로, DNA)이 고정된 기재를 증폭용 혼합물(즉, PCR 혼합물) 내에 침지(immersion)시키는데, 이때 고정된 핵산은 증폭 과정 중 고온에 노출되어 분리되고, 유전 서열은 복제 준비 상태에 있게 된다. 증폭 반응을 위하여, 전술한 바와 같이 PCR(DNA 증폭 방식), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification; RNA를 이용한 등온 조건 하에서의 증폭 방식) 등과 같이 당업계에서 공지된 임의의 증폭 기술을 활용할 수 있다. 예를 들면, PCR 방식은 국내특허번호 제 593687호 등에 기재되어 있고, NASBA 방식은 EP 0 329 822 B1, 미국특허번호 제6,110,681호 등에 예시되어 있는 바, 전술한 선행문헌들은 본 발명의 참고자료로 포함된다. 또한, PCR 방식으로서, 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, RT(reverse transcription)-PCR 등을 예시할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 증폭 단계에 앞서 또는 증폭 과정 중 삽입 염료가 증폭 혼합물에 첨가될 수 있다. 이때, 핵산으로서 DNA를 증폭할 경우, 삽입 염료는 이중 스트랜드 DNA(dsDNA) 사이에 삽입되어, 추후 형광 검출에 따른 강도(intensity)를 측정함으로써 증폭 정도를 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 삽입 염료는 증폭 과정에서 이중 스트랜드 내로 삽입 가능한 염료로서, SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, SYTO 시리즈 등을 포함할 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 전형적으로는, SYBR Green, TOTO 시리즈 중 TOTO-3, POPO 시리즈 중 POPO-3, BOBO 시리즈 중 BOBO-3 등을 사용할 수 있다. 본 발명이 상술한 종류로 반드시 한정되는 것은 아니며, 증폭 반응 중 이중 스트랜드에 삽입되어 이로부터 유래하는 형광 특성을 검출할 수 있는 한, 다양한 종류를 사용할 수도 있다. 또한, 첨가되는 삽입 염료의 량은, 삽입 염료의 특성 등을 고려하여 적절히 조절할 수 있는 바, 예를 들면 약 0.1 내지 20 μM 중량%(구체적으로, 약 1 내지 5 μM) 범위일 수 있다. 다만, 본 개시 내용이 상기 수치 범위로 한정되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이 삽입 염료의 존재 하에서 증폭 반응이 수행될 경우, 증폭 생성물로부터 유래된 형광은, 예를 들면 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer) 등과 같이 당업계에 알려진 검출 수단(또는 장치)를 통하여 확인할 수 있는데, 형광의 유무 및 강도를 고려하여 타겟 핵산의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 삽입 염료로부터 유래하는 형광 검출을 위하여, 예를 들면 레이저-유도 공초점 형광 현미경을 이용할 수 있다. 이외에도, 핵산(표적 핵산)의 존재에 따른 형광 유무 및 형광 강도의 변화를 확인할 수 있는 장비라면 특별한 제한 없이 사용 가능한 바, 예를 들면 QuantaMaster PTI spectrofluorimeter (PTI), SPEX Fluorolog 3 (ISA) 등을 예시할 수 있다.
예시적 구체예에 따르면, 앞서 설명한 바와 같이 핵산이 고정된 고분자 코팅 기재를 증폭 반응 시 증폭용 혼합물에 침지시키고 PCR과 같은 증폭 반응시킬 경우, 고온에 의하여 핵산이 분리되며, 증폭 반응의 완료 후에는 증폭 생성물 내 핵산이 고분자 코팅 기재의 표면에 고정된다. 따라서, 증폭 생성물로부터 침지된 기재를 꺼내어 전술한 검출 수단을 통하여 간편하게 진단할 수 있는 바, 이는 본 구체예의 또 다른 장점에 해당된다.
택일적 구체예에 따르면, 증폭 생성물은 전술한 바와 같이 삽입 염료로부터 유래하는 형광 검출이외에도 당업계에서 알려진 다양한 방식에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들면, TaqMan 프로브(probe)를 이용한 실시간-PCR로 검출하는 방법, 전자 방출능을 갖는 인터칼레이터(intercalator; 이중 스트랜드의 핵산에 인터컬레이팅할 수 있는 임의의 물질로서 예를 들면 스트렙토마이신 설페이트, 젠타마이신 설페이트, 다우노루비신 하이드로크로라이드, 노갈라마이신, 독소루비신, 헤다마이신, 미토산트론, 틸로론, 퀴나크린, 아크리딘오렌지 등)를 사용한 전기화학적 검출 방식 등을 들 수 있다.
이와 관련하여, TaqMan 프로브 등의 형광을 이용한 검출 방법의 경우, 5'-말단은 형광체(FAM, JOE, TET, HEX, VIC 등)로, 3'-말단은 소광제(TAMRA, DABCYL, ROX, BHQ 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법으로서, TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시, Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3' 핵산말단분해효소(exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다.
전술한 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용하는데, 이와 같이 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성한다. 즉, 프로브와 타겟 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가한다. 따라서, 과량을 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용할 수 있다. 반면, 프로브의 량이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된 핵산에 비하여 불충분한 형광 특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다.
예시적 구체예에 따른 진단 시스템의 검출 한계(LOD)는, 예를 들면 약 102 내지 109 cells, 구체적으로 약 103 내지 105 cells 범위일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서 수행된 측정 방법은 하기와 같다:
(1) 코팅 전(uncoated) 기재로서 필터 구조물, PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물(coated), 그리고 DNA가 고정된 PDMAMS 코팅 필터 구조물 각각의 표면 상의 형태학적 특징은 주사전자 현미경(SEM) (Nova 230, FEI Inc.) 및 스캐닝 프로브 현미경(SPM; XE-100, Park Systems, Korea)을 이용하여 관찰하였다. SPM의 경우, 스캐닝 사이즈는 2 ㎛ × 2 ㎛로 고정하였다.
(2) PDMAMS 고분자의 균일한(conformal) 코팅 및 PDMAMS 고분자로 코팅된 기재 상에 DNA가 고정되어 있는지를 확인하기 위하여, X-선 광전자 스펙트로스코피(XPS) (Sigma Probe, Thermo VG Scientific Inc.) 및 라만 스펙트로스코피(NTEGRA Spectra spectrometer, NT-MDT, Russia)를 이용하여 기재의 화학적 특성을 분석하였다.
(3) 코팅 전(uncoated) 필터 구조물 기재, PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물(coated) 기재, 그리고 DNA가 고정된 PDMAMS 코팅 필터 구조물 기재 각각의 표면 전하의 변화를 관찰하기 위하여 일본, 오츠카엘사(Otsukael)의 ELS-Z2를 이용하여 제타 포텐셜을 측정하였다.
(4) PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물 기재 상에 포획된 DNA의 량은 Nanodrop UV-Vis 스펙트로포토미터(spectrophotometer) (Nanodrop 2000, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다.
필터 구조물(기재) 상에 기상 증착 공정( iCVD 공정)을 이용한 양이온성 고분자의 코팅(증착)
본 실시예에서는 기재로서 평면 형상의 스테인레스 스틸(SUS) 재질의 금속 메쉬 타입의 필터 구조물(메쉬의 포어 사이즈: 40 ㎛)을 사용하였다. 상기 메쉬 타입의 필터 구조물을 시판 중인 iCVD 반응기(대기 하이테크사)를 이용하여 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS)로 코팅하였다. 구체적으로, 모노머로서 2-디메틸아미노메틸 스티렌(DMAMS, Acros, 90%), 그리고 열 개시제로서 t-부틸 퍼옥사이드(TBPO, Aldrich, 98%)를 기화시켜 iCVD 챔버 내로 도입하였다. 충분한 증기 흐름을 얻기 위하여 DMAMS만을 45 ℃로 가열하였고, TBPO는 상온에서 유지하였다. iCVD 챔버 내 운전 압력, 기재 온도 및 필라멘트 온도는 각각 150 mTorr, 38 ℃, 및 200 ℃로 유지되는 조건 하에서 코팅을 수행하였다.
고분자 코팅 전 필터 구조물 기재의 표면에 대한 SEM 사진, iCVD 공정을 이용하여 양이온성 고분자(PDMAMS)로 표면이 코팅(개질)된 필터(메쉬) 구조물의 표면에 대한 SEM 사진, 그리고 양이온성 고분자로 코팅(개질)된 필터(메쉬) 구조물의 SEM 단면 사진 각각을 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다.
도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 코팅 전후에 있어서 외관상 메쉬 타입의 구조물 표면의 형태학적 특성은 손상되거나 변화되지 않았다. 또한, 도 3c의 코팅된 필터 구조물의 단면에 대한 SEM 사진에 따르면, PDMAMS 고분자가 메쉬를 구성하는 섬유 전체에 걸쳐 균일하게 코팅되어 있음을 알 수 있다. 이와 같이, 기상 증착 공정, 특히 iCVD 공정을 이용할 경우, 필터 구조물의 메쉬 표면을 완전히 코팅할 수 있어 핵산이 바인딩될 수 있는 면적을 증가시킬 수 있다.
도 4a 내지 도 4c는 PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 필터링 구조물의 접은 상태의 디지털 카메라 사진, 그리고 접힌 부위의 150 배율 SEM 사진 및 5000 배율 SEM 사진이다.
상기 도면에 따르면, 기상 증착 공정을 이용한 결과, 메쉬 표면 상에 PDMAMS 고분자를 코팅하는 동안, 표면 장력 효과를 제거할 수 있고, 메쉬 구조물을 완전히 접은 후에도 메쉬 구조물의 표면에 형성된 고분자 코팅 층이 손상되지 않음을 알 수 있다.
한편, PDMAMS 고분자, 코팅 전 필터 구조물 및 PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물 각각에 대한 라만 스펙트럼을 도 5a에 나타내었다. 상기 그래프는, 하측에서부터 상측 방향으로, PDMAMS 고분자, 코팅 전 스테인레스 스틸 재질의 필터 구조물, 및 PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물의 라만 스펙트럼을 각각 지시한다. PDMAMS 고분자의 특성 페닐 피크는 1180 cm-1 및 1600 cm-1에서 확인되었는 바, 이는 방향족 아민 내 C-N 스트레치(결합 라인을 따른 진동) 및 벤젠 링 내 C=C 스트레치를 각각 나타낸다. 이러한 특성 피크는 오직 벌크 형태의 PDMAMS 고분자 필름 및 PDMAMS 고분자로 코팅된 메쉬 구조물에서만 검출되었다.
또한, 필터 구조물 중 PDMAMS 고분자로 코팅된 부분 (i) 및 코팅되지 않은 부분, 즉 포어 부분 (ii) 각각에 대한 라만 스펙트럼을 도 5b에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 라만 스펙트럼은 오직 메쉬 상에서 측정될 때에만 관찰되었다. 반면, 메쉬의 포어 영역에서는 노이즈만이 검출되었다. 이처럼, 라만 스펙트로스코피 분석 결과, 기상 증착 공정에 의하여 기재 내 메쉬 구조가 PDMAMS 고분자로 균일하게 코팅(피복)되었고, 코팅 이후에도 메쉬 구조의 전체적인 형태학적 특성이 유지되고 있음을 알 수 있다.
양이온성 고분자로 코팅된 필터 구조물을 이용한 핵산의 고정(추출)
한국미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisoms)로부터 E. coli O157:H7 (ATCC 9637)을 구입하여, 37 ℃로 조절된 교반 인큐베이터를 이용하여 10mL의 Luria-Bertani (LB) 브로스 내에서 배양하여 109 CFU/mL의 세포 수를 얻었다. 배양된 세포를 0.1M PBS 완충액 10 mL로 3회에 걸쳐 세척하였다. 세포는 프로티나아제(proteinase) K 용액의 존재 하에서 QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)의 완충액 AL에 의하여 파괴시켰다. 이후, PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물을 상기 세포 용해물 용액에 60분 동안 침지하여 세포 용해물 내의 DNA가 필터 구조물의 표면에 바인딩되도록 하였다.
필터 구조물 상에 PDMAMS 고분자가 코팅되기 전, 코팅된 후, 그리고 DNA가 바인딩된 후의 필터 구조물 표면의 변화를 나타내는 AFM 사진을 도 6a에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 필터 구조물의 메쉬가 PDMAMS 고분자로 코팅되고, 추가적으로 이에 핵산이 고정됨에 따라, 필터 구조물의 메쉬 표면의 형태학적 특징이 변화함을 알 수 있다.
또한, 핵산이 필터 구조물의 표면 상에 성공적으로 바인딩되어 있는지 여부는 Texas Red 염료로 라벨링된 DNA를 이용하여 추가적으로 확인하였는 바, 이때 특정 고분자가 코팅된 기재에서만 형광을 확인할 수 있었으며, 형광 특성은 543 nm HeNe 레이저로 여기하여 관찰하였다. 이와 관련하여, 필터 구조물 상에 PDMAMS 고분자가 코팅되기 전, 코팅된 후, 그리고 DNA가 바인딩된 후의 필터 구조물에 대한 공초점 명시야(confocal bright field) 현미경 사진, 공초점 형광 현미경(confocalfluorescence) 사진 및 공초점 병합(confocal merged) 사진을 각각 도 6b 내지 도 6d에 나타내었다.
도 6b에 나타낸 바와 같이, 명시야 하에서 관찰할 경우, 모든 샘플(코팅되기 전, 코팅된 후, 그리고 DNA가 바인딩된 후)이 동일한 외관을 나타내었다. 그러나, 공초점 형광 현미경을 사용하여 543 nm HeNe 레이저 하에서 관찰한 경우에는 DNA-바인딩된 샘플만이 강한 형광 특성을 나타내었다.
이외에도, 필터 구조물 상에 PDMAMS 고분자의 코팅 전 및 코팅 후, 그리고 DNA가 고정된 후의 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy) 원소 분석 결과를 도 7a에 나타내었다. PDMAMS로 필터 구조물의 메쉬를 코팅한 후에는 산소에 대한 피크가 현저히 감소하는 한편, 질소에 대한 피크가 새롭게 관찰되었다. 산소 피크의 경우, 대기 중 산소가 iCVD 공정 후에도 종료되지 않은 라디컬과 반응하였음을 의미한다.
필터 구조물 상에 PDMAMS 고분자가 코팅된 후, 그리고 PDMAMS 고분자가 코팅된 필터 구조물 상에 DNA가 바인딩된 후의 P2p(peak for phosphorous) 고해상도 분석 결과를 도 7b 및 도 7c에 각각 나타내었다.
상기 도면에 따르면, DNA가 고정된 경우에는 인에 대한 피크(P2p)가 133 eV에서 새롭게 검출되었다(도 7c). 다만, 531 eV에서 산소 피크가 약간 증가하는 현상(8.42%에서 11.87%로 증가)은 DNA의 포스페이트 주쇄로부터 기인한 것으로 판단된다.
필터 구조물 상에 PDMAMS 고분자가 코팅되기 전, 코팅된 후, 그리고 DNA가 바인딩 또는 고정된 후에 각각 측정된 제타 포텐셜을 도 7d에 나타내었다.
상기 도면으로부터, (-)로 하전된 DNA 주쇄 역시 코팅된 필터 구조물의 표면 전하에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, DNA가 포획(고정)된 후, 코팅된 필터 구조물의 제타 포텐셜은 23 mV에서 -1.44 mV로 급격히 감소하였다. 이와 같이 DNA 포획 전후에 있어서 코팅된 필터 구조물의 제타 포텐셜 변화는 DNA의 포스페이트 주쇄 상에 고농도의 (-) 전하가 존재하기 때문이다. 이는 DNA가 포획된 필터 구조물의 표면이 PDMAMS의 양이온 특성을 충분히 스크리닝할 정도로 피복하고 있기 때문으로 판단된다.
이외에도, PDMAMS 고분자가 코팅된 필터 구조물과 접촉하는 E. coli O157:H7로부터 추출된 DNA 용액의 농도를 각각 달리하여 침지시킨 후(각각 5 ng/㎕, 10 ng/㎕ 및 20 ng/㎕), 면적 당 포획된 DNA 개수를 측정한 결과를 도 7e에 나타내었다. 이때, 코팅된 필터 구조물 상에 고정된 DNA의 량은 초기 용액 내의 전체 DNA 량으로부터 잔여 용액 내의 DNA 량을 차감하여 산출하였다. 상기 실험은 코팅된 필터 구조물의 핵산에 대한 포획능을 평가하기 위한 것으로서, DNA 용액의 농도가 증가할수록 코팅된 필터 구조물 상에 포획된 DNA 역시 점차적으로 증가하였다. 이는 동일 체적의 용액 내에 보다 많은 핵산이 존재할 경우에 코팅된 필터 구조물의 표면과 접촉할 기회가 증가하기 때문이다. 상기 실험 결과에 따르면, PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물의 최대 포획능은 3 ng/mm2이었다. 이러한 값은 E. coli O157:H7의 경우에 ∼5×105 copies/mm2의 핵산에 상당한 것으로, 병원체의 존재를 확인할 수 있는 수준이다.
PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물(기재)에 고정된 핵산의 증폭 및 검출
도 8은 본 실시예에 있어서 인위적으로 배양된 병원체, 즉 E. Coli O157:H7를 대상으로 세포 용해(lysis), PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 필터 구조물 상에 세포 용해물(lysate)로부터 추출된 DNA의 고정(포획), PCR 및 형광 검출을 수행하는 일련의 과정을 개략적으로 도시하는 도면이다.
상기 도시된 일련의 절차와 관련하여, 세포 용해 완충액에 배양된 병원체를 첨가하여 세포 용해를 실시한 후에 얻은 세포 용해물에 PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물을 침지시켜 DNA가 고정된 코팅 필터 구조물을 얻는 과정은 앞서 설명한 바와 같다. 후속 실험에서는 DNA가 고정된 코팅 필터 구조물에 대하여 PCR 증폭 및 형광 검출을 수행하였는 바, 이에 관한 전반적인 절차는 하기와 같다:
E. coli O157:H7의 stx2 gene을 표적하여 PCR 프라이머(forward primer: 5'- GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA-3'; reverse primer: 5'-TGT TGC CGT ATT AAC GAA CCC-3'를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 이때, SYBR® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio INC., Shiga, Japan)을 사용하여 PCR 혼합물을 제조하였다. PCR 혼합물의 전체 체적은 20 μL이었는데, 이는 10 ㎕의 2×SYBR Premix Ex Taq II, 2 ㎕의 프라이머 혼합물(0.3 μM의 E. coli O157:H7 프라이머), 및 DNA가 고정된 PMAMS 코팅 필터 구조물로 이루어졌다. 또한, PCR 증폭은 95℃에서 30초 동안 초기 변성시켰고, 5초 동안 95℃, 30초 동안 60℃, 30초 동안 72℃ 및 60초 동안 72℃의 열적 사이클을 40회 반복한 다음, 60초 동안 72℃에서 최종 연장 반응(final extension)을 수행하여 유전자 증폭 반응을 완료하였다.
배양된 E. Coli O157:H7의 시료 농도를 변화시키면서 PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 필터 구조물의 타겟 병원체로서 E. Coli O157:H7에 대한 검출 한계(limit of detection) 실험을 수행하여 검출 감도를 평가하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 이를 위하여, 유입(input) 세포 수가 각각 1.67×106, 1.67×105, 1.67×104, 1.67×103, 및 1.67×102가 되도록 순차적으로 희석하였으며, 이후 세포 용해 단계를 수행하였다. 코팅된 필터 구조물을 세포 용해물 용액 내로 투입하여 세포로부터 배출된 DNA를 분리한 후에 타겟 유전자의 증폭 반응을 수행하였다. 타겟 유전자를 증폭하는 동안 SYBR 삽입 염료를 첨가하여 이중 스트랜드 DNA 분자 사이에 삽입하였다.
PCR 이후, 코팅된 필터 구조물이 SYBR 염료를 갖는 타겟 앰플리콘을 재포획하게 되며, 이로부터 발생되는 형광 방출 시그널을 레이저-유도 공초점 형광 현미경 (LSM510 meta, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 검출하였다. 이때, 여기 파장으로서 488 nm의 아르곤 레이저 및 543 nm의 HeNe 레이저를 사용하였고, 10×Plan Neofluar objective (NA 0.3)로부터 측정되는 출력 강도는 각각 7.5 mW 및 1.0 mW이었다. 코팅된 필터 구조물 상에 스캐닝 면적(0.848 mm2)의 경계를 정하고, 3.2 μs/pixel의 스캐닝 속도로 이미지를 얻었다. SYBR Green II의 방출 시그널은 500-530 nm의 밴드 패스 필터를 통하여 검출하였다. 이처럼, 코팅된 필터 구조물의 표면에서의 형광 강도를 관찰함으로써 병원체의 존재를 확인하였고, 또한 형광 강도에 의하여 증폭 정도를 확인하였다.
도 9에 따르면, PDMAMS 고분자로 코팅된 필터 구조물 기재를 이용하여 세포 용해물 용액으로부터 DNA를 고정(회수)하고, 상기 고정된 DNA에 대한 증폭 반응이 성공적으로 이루어졌다. 더욱이, 상기 코팅된 필터 구조물 기재는 인-시튜로 DNA 증폭을 수행하고, 단일 튜브 상에서 검출할 수 있도록 한다. 특히, 1.67×103개의 E. Coli O157:H7 세포만으로도 타겟 병원체의 존재를 확인할 수 있었는 바, 이는 겔 전기영동법으로 달성 가능한 수준에 해당된다. 또한, 추가적인 장비(예를 들면, 원심분리 장치 및 히터)를 사용함이 없이 코팅된 필터 구조물만으로도 시료의 정제 및 DNA 용출(elution)을 포함하는 DNA 추출 단계를 간편화할 수 있다. 이처럼, 상기 실험을 통하여 특정 고분자로 코팅된 기재가 신규의 핵산 추출(고정) 플랫폼으로서 현장 진료 테스트 분야에서도 적용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2
본 실시예에서는 E. Coli O157:H7로 오염된 각종 식품의 시료를 대상으로 세포 용해(lysis), PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 기재 상에 세포 용해물(lysate)로부터 추출된 DNA의 고정(포획), PCR 및 형광 검출을 수행하였으며, 이에 대한 개략적인 과정을 도 10에 도시하였다. 즉, E. Coli O157:H7가 1차적인 식중독 원인 병원체 중 하나인 만큼, 실제 음식물 분석을 위하여 PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 기재의 검출능을 평가하기 위한 실험이다.
실제 시료 분석을 위하여 포크(pork), 레투스(lettuce) 및 피자와 같은 음식물 시료에 소정 량의 배양된 E. Coli O157:H7를 찔러 주입함으로써 식중독 시료를 모사하였다. 이후, 모사된 시료의 표면을 코튼 면봉(swab)으로 접촉하여 E. Coli O157:H7를 회수하였고, QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)의 완충액 AL을 사용하여 세포 용해시켰다. 그 다음, PDMAMS 고분자로 표면 코팅된 필터 구조물 기재를 세포 용해물 시료 내로 투입하여 1 시간 동안 인큐베이팅하여 상기 코팅된 필터 구조물 상에 DNA를 고정(포획)하였고, 후속적으로 DNA가 고정된 필터 구조물을 PCR 증폭 반응에 직접 적용하였다. 기타 실험 프로토콜은 실시예 1에서 기재된 바와 동일하게 진행하였다. 실험 결과를 도 11에 나타내었다.
상기 도면에 나타난 바와 같이, E. Coli O157:H7가 주입된 식품 시료에 대하여 코팅된 필터 구조물 상에서 형광 시그널을 검출할 수 있었다. E. Coli O157:H7가 주입된 포크 시료의 경우, 형광 시그널은 3,32의 평균 강도를 갖는 것으로 관찰되었는데, 이러한 형광 강도는 104개의 세포 수준에 상응한다. 또한, E. Coli O157:H7가 주입된 레투스 시료로부터 평균 강도 2.82의 녹색 방출 시그널이 검출되었으며, 이는 104개의 세포 수준이다. 피자를 면봉으로 접촉한 시료의 평균 형광 강도는 1.27이었으며, 이는 103개의 세포에 해당된다.
실시예 3
본 실시예에서는 복합 구조체의 기재로서 나일론 메쉬 및 Kimtech 페이퍼의 적용 가능성을 확인하기 위한 형광 검출 실험을 수행하였고, 스테인레스 스틸 메쉬 구조물을 사용한 실험 결과와 비교하였다. 본 실시예에서는 실시예 1에서와 동일한 방식으로 기재 상에 iCVD 공정을 통하여 PDMAMS 고분자 코팅층을 형성하였다. 이때, 형광 검출 실험을 위하여 코팅된 필터 구조물 기재 상에 Texas Red로 태그된 프라이머(tagged primer), 즉 Texas Red 염료로 라벨링된 DNA를 적용하였다. 이때, 543 nm HeNe 레이저를 이용하여 여기시켰고, Texas Red의 형광 방출 시그널은 565-615 nm의 밴드 패스 필터를 이용하여 검출하였다. 상기 형광 검출 실험 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12로부터 알 수 있듯이, 기재의 종류에 따라 Texas Red로부터 기인하는 형광 강도에 있어서 약간의 차이는 있으나, PDMAMS 고분자로 코팅된 기재의 표면 상에 프라이머가 효과적으로 고정(또는 포획)되어 있음을 알 수 있다. 따라서, 스테인레스 스틸 재질뿐만 아니라, 각종 섬유(합성/천연)류, 페이퍼류 등의 기재를 이용하는 경우에도 큰 문제없이 적용 가능함을 확인하였다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (24)

  1. 병원체 또는 병원성 세균으로부터 선택되는 바이오물질의 용해물(lysate)을 핵산에 대한 고정능을 갖는 기재와 접촉시켜 상기 용해물 중 바이오물질의 핵산을 상기 기재 상에 고정하는 단계;
    b) 상기 기재에 고정된 핵산을 증폭하는 단계; 및
    c) 상기 증폭된 핵산을 인-시튜(in-situ)로 검출하는 단계;
    를 포함하는 바이오물질의 검출 방법으로서,
    상기 바이오물질의 핵산에 대한 고정능을 갖는 기재는,
    3차원 형상을 갖는 기재; 및
    상기 기재의 표면에 기상 증착 방식에 의하여 형성된, 양이온성 고분자만으로 이루어진 코팅 층;
    을 포함하며,
    여기서, 상기 양이온성 고분자는 고분자 반복 단위의 측쇄 말단에 양전하의 질소를 갖는 3차 아민을 함유하고, 상기 바이오물질의 핵산과 전하 상호작용에 의하여 핵산에 대한 고정능 또는 포획능을 나타내는 것으로, 폴리-2-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(PDMAEMA), 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS), 폴리-1-비닐피롤리돈(p1-VP), 폴리 다이에틸아미노에틸아크릴레이트(pDEAEA), 폴리 다이메틸아미노에틸아크릴레이트(pDMAEA), 폴리 다이에틸아미노에틸메타크릴레이트(pDEAMA), 또는 이의 조합이고,
    상기 화학 기상 증착 방식은 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(iCVD)이고,
    상기 3차원 형상을 갖는 기재는 금속 메쉬 구조물, 섬유 메쉬 구조물 또는 페이퍼 구조물인 필터 구조물로 이루어지며, 상기 금속 메쉬 구조물 또는 섬유 메쉬 구조물의 메쉬 사이즈는 10 내지 50 ㎛ 범위이고, 그리고 상기 메쉬를 구성하는 금속 또는 섬유 스트랜드의 두께는 50 내지 100 ㎛ 범위인 바이오물질의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오물질의 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산은 DNA이고, 그리고 상기 단계 c)는 상기 단계 b)에 앞서 또는 상기 단계 b) 중 삽입 염료(intercalating dye)를 첨가하여 증폭된 핵산의 이중 스트랜드 내로 삽입 염료를 삽입함으로써, 상기 삽입 염료로부터 기인하는 형광을 검출하는 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단계 c)는 TaqMan 프로브(probe)를 이용한 실시간-PCR 또는 전자 방출능을 갖는 인터칼레이터를 사용한 전기화학적 검출 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 금속 메쉬 구조물은 스테인레스 스틸(SUS), 구리, 알루미늄 또는 티타늄 재질이고, 상기 섬유 메쉬 구조물은 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리에틸렌테레프탈레이트 또는 테플론(Teflon) 재질인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 폴리(2-디메틸아미노메틸 스티렌)(PDMAMS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 기재 상에 형성되는 양이온성 고분자 코팅 층의 두께는 1 내지 1000 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 상기 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(iCVD)은 10 내지 1000 mTorr의 압력, 10 내지 50 ℃의 기재 온도, 그리고 180 내지 300 ℃의 반응기 내 필라멘트의 온도 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 바이오물질은 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 바이오물질은 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 누수투 또는 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 또는 토스카나 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로시오 바이러스, 홍역 바이러스, 머레이 뇌염 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 림프구 무도수막염(lymphocytic choreomeningitis) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 크리미아-콩고 출혈 열 바이러스, 리사 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 또는 단순 포진 1형 및 2형 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 바이오물질의 용해물은,
    i) 바이오물질을 함유하는 시료를 제공하는 단계; 및
    ii) 상기 시료 내 바이오물질을 용해(lysis)하는 단계;
    를 포함하는 단계에 의하여 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단계 ii)는 용해 완충액을 사용하여 수행되며, 상기 용해 완충액에 함유된 버퍼는 HEPES((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산(Tricine), 트리스(히드록시메틸)메틸아민 산(Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼, 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 단계 a)는 10 내지 30 ℃의 온도에서 40 내지 120분 동안 인큐베이팅함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제3항에 있어서, 상기 삽입 염료는 SYBR Green, PicoGreen, Hoechst 시리즈(series), BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO-PRO, SYTO 시리즈, 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 삭제
  22. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)는 PCR을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 PCR은 어셈블리-PCR, 비대칭(asymmetric) PCR, 디지털(digital) PCR, 종점(endpoint) PCR, 인버스(inverse) PCR, 메틸화-특이성 PCR, 정성(qualitiative) PCR, 정량화(quantitative) PCR, 실시간(real-time) PCR, 또는 RT(reverse transcription)-PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 단계 c)는 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner) 또는 플로우사이토메터(flow cytometer)를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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