KR20220158149A - 총핵산을 추출하고 등온 증폭하여 표적 핵산 검출 방법 및 장치 - Google Patents

총핵산을 추출하고 등온 증폭하여 표적 핵산 검출 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시료에서 DNA와 RNA를 포함한 총핵산을 추출하고 등온 증폭하여 표적핵산을 검출하는 방법 및 장치를 제안한다. 본 발명에 따른 유사한 임상증상을 제공하는 병원체의 검출 방법 및 장치는 높은 민감도와 특이성으로 신속하게 특정 병원체 감염 여부를 검출할 수 있어 편리성이 증대된다.

Description

총핵산을 추출하고 등온 증폭하여 표적 핵산 검출 방법 및 장치{Method and apparatus for target nucleic acid detection by extracting total nucleic acid and isothermally amplifying}
본원은 시료로부터 DNA 및 RNA를 포함하는 총핵산을 추출하고 이를 등온 증폭하여 표적핵산 검출 방법 및 장치와 관련된 기술이다.
핵산, RNA 및 DNA는 모든 유전 정보를 담고 있다. 시료에서 고순도의 핵산을 정량적으로 추출하는 것이 효율적인 핵산 분석 분석을 위한 전제 조건이다. 추출 효율이 낮으면 지수 증폭 중에 신호가 나빠져 잘못된 음성 결과를 초래할 수 있다. 낮은 추출 품질에는 다양한 PCR 억제제가 포함되어있어 증폭 중에 신뢰할 수 없는 판독 값을 제공한다.
핵산 추출의 전통적인 방법은 원심분리와 연계된 실리카 막 또는 유리 섬유가 핵산에 결합하기 위해 적용되는 실리카 기반 스핀 칼럼 핵산 추출 방법이다. 이들 전통적인 방법에서, 시료는 칼럼 막에 결합하기 전에 바이러스 입자로부터 핵산을 방출하기 위해 적절한 완충액에서 예비-용해를 필요로 하고 추출된 핵산의 결합, 세척 및 용출을 가능하게 하기 위해 다중 원심 분리 단계가 필요하다. 또한, 다양한 부식성 카오트로픽 염 및 독성 유기 용매가 용해 및 결합 단계에 관여하기 때문에, 용출된 제품에서 가능한 PCR 억제 효과를 제거하기 위해 몇 가지 순차적 세척 단계가 필요하다. 전체 공정은 다수의 원심 분리 및 컬럼 전달 단계를 포함하며, 이는 힘들고 시간 소모적이며 오염 또는 컬럼 막힘에 취약하다.
더 중요한 것은 스핀 컬럼 기반 접근 방식은 처리량이 많고 자동화된 작업에는 적합하지 않다. 갑작스런 감염병 발생에 대한 모니터링 및 제어에서 이러한 전통적인 방법은 많은 수의 작업자를 소비하지만 진단 효율성은 낮고 교차 감염 위험이 높다. 따라서, 빠르고 편리하며 자동화된 핵산 추출 방법은 감염 병원체의 분자 진단뿐만 아니라 다른 감염성 질환의 모니터링 및 예방에도 매우 바람직하다.
대안으로, 자성 나노 입자(Magnetic nano particle, MNP) 기반 추출 방법은 원심 분리가 없으며 작동이 쉽고 자동화 및 고 처리량 작업dl 가능할 수 있다. 기존의 MNP 기반 방법에서는 용해된 핵산 다양한 표면-개질된 작용기로 인해 시료가 MNP에 특이적으로 흡수될 수 있다.
자기장이 존재할 때, 핵산은 상층액의 대부분 불순물과 빠르게 분리할 수 있다. 미량의 불순물을 제거하기 위한 빠른 세척 단계 후에, 변경된 이온 강도를 갖는 용출 완충액에 의해 정제된 핵산이 MNP의 표면으로부터 추가로 방출될 수 있다.
스핀 컬럼 기반 방법보다 훨씬 간단하고 빠르지만 대부분의 MNP 기반 추출 전략에는 여전히 용해, 결합, 세척 및 용리와 같은 여러 처리 단계가 포함되어있어 실제 임상 진단에서 운영상의 어려움이 증가할 수 있다.
핵산 검사는 진단에서 중요한 도구이며, 특히 민감하고 구체적이며 신속한 방법론을 사용하여 미생물 검출을 향상시키는 데 중요하다. 등온 핵산 증폭 방법의 출현으로 현장검사(Point-of-care, POC) 응용 분야에 대한 테스트가 가능하게 되었다.
핵산 검사는 최근에 등온 핵산 증폭의 발전으로 열적 사이클링보다는 일정한 온도만을 요구하는 핵산 증폭을 위한 단순한 반응조건에서 가능하다. 단일 온도 반응은 장비 요구 사항을 줄여 현장 검사도 가능한 새로운 방법, 또한, 반복된 가열 및 냉각 단계의 제거는 또한 증폭 시간 단축을 통해 짧은 검사시간을 제공하고 있다. 잘 확립된 등온 증폭 방법은 핵산 서열-기반 증폭(NASBA, 전사 매개 증폭, TMA로도 알려져 있음), 신호-중재 증폭의 리보 핵산(RNA) 기술 (SMART), 헬리케이스-의존적 증폭 (HDA), 재조합효소 중합효소 증폭 (RPA), 롤링 서클 증폭 (RCA), 다중 변위 증폭 (MDA), 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 및 가닥 변위 증폭 (SDA) 등이다. 특히, RPA(Recombinase Polymerase Amplification)는 장비 요구 사항이 간소화되고 반응 시간이 빠르기 때문에 비교적 늦은 도입에도 불구하고 빠른 개발과 시장 점유율 증가를 하고 있다.
특히, RPA는 낮은 반응 온도(37~42℃)를 사용하여 핵산의 적은 양을 검출하기 때문에 POC 응용 분야에서 가장 유망한 후보 중 하나이다. RPA와 LFD(lateral flow device) 검출의 조합은 LFD가 휴대 가능하고 해석하기 쉬운 분석 데이터를 제공하므로 POC 진단에 매우 적합하다.
POC 사용을 위한 기존 측면 유동 장치(Lateral flow device, LFD)의 문제는 다중분석에 대한 제한이다. 다중 POC 검출로의 확장은 (i) 발견된 바이오마커의 수가 증가함에 따라 효율적인 감염성 질환 진단; (ii) 단일 바이오마커가 하나 이상의 질병을 나타낼 수 있는 경우에 위양성 또는 음성 보고의 축소; (iii) 여러 번의 단일 분석을 수행하는 것과 비교하여 진단 시간과 비용의 감소를 할 수 있다.
다중 LFD는 하나의 장치 내에 통합된 선 또는 점의 수를 증가시켜 특정 분석물의 검출을 할 수 있다. 그러나, 다중 LFD의 경우, 흡수 패드로부터의 거리에 따라 유량이 감소하고 라인 또는 도트의 수가 증가될 때 해석이 어려워지기 때문에 검출 용량 확장에 물리적 한계가 있다. 다중 분석 능력의 검출을 위한 POC 핵산 시험의 확장은 진단 효율을 개선하기 위해 필수적이다. 다중능 용량의 증가는 분석 시간 및 비용의 감소와 함께 더 높은 정보 밀도를 가능하게 할 수 있다.
감염 질환의 검사실 진단은 전통적인 배양이 표준 방법으로 널리 이용되고 있으나 생화학, 면역학적 방법 및 다양한 분자 진단법이 도입되어 이용되고 있다. 최근 검사법의 진단능 향상과 검사시간 단축을 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으며, 이를 바탕으로 다양한 신속 진단법이 개발되어 현장 검사(point-of-care, POC)로 활용되고 있다. 감염 질환의 현장 검사는 기존의 종이 어레이 검사법에서 미세유체 기반의 핵산증폭법에 이르기까지 발전하였다.
핵산증폭기반 검사는 낮은 민감도를 향상시키기 위해 꾸준히 발전하고 있으며, 장비의 소형화 및 개별 검사로 일선 진료 현장에서의 활용 증가 및 3차 의료기관에서의 검사 행태에도 큰 변화를 가져올 것이다. 현장 검사는 신속하고 취급이 용이한 장점이 있어 이의 활용은 향후 지속적으로 증가할 것으로 기대되며, 새로운 생체분자 분석기술의 개발로 더욱 향상된 검사법으로 발전하게 될 것이다.
감염 초기에 유사 임상 증상을 제공하는 병원균들이 있는 호흡기 감염질환에 대한 빠르고 정확한 병원균의 규명은 환자의 적절한 치료에 도움을 줄 뿐 아니라 지역사회에서의 감염의 전파 방지 및 의료 관련 감염의 관리에도 필수적이다. 질병의 원인은 증상과 징후로만 파악하기 어려우므로 감염의 원인 병원체를 규명할 수 있는 진단법의 개발이 요구된다.
본 발명은 시료로부터 DNA 및 RNA를 포함하는 총핵산을 추출하고 총핵산 시료를 등온 증폭하여 표적핵산 검출 방법 및 장치, 그리고 이를 이용한 신속하고 간편하게 감염 초기에 유사 임상 증상을 제공하는 병원체의 감염 여부를 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 시료로부터 DNA 및 RNA를 포함하는 총핵산을 추출하고 이를 등온 증폭하여 표적핵산 검출 방법 장치를 제공하며, 시료 중에 존재하는 표적 핵산에 상응하는 병원체를 등온 증폭으로 검출이 기능하여, 시료에서 감염 초기에 유사 임상 증상을 제공하는 병원균을 신속하고 간편하게 검출을 가능하게 하는 방법을 제공하기 위해, 본 발명의 표적핵산 검출 방법 및 장치는 a) 시료에 용해용액 및 결합용액을 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출하여 형성된 총핵산-자성나노입자(MNP) 복합체를 세척용액으로 정제하는 단계(S100), 여기서, 또는 추가적으로 용출 용액을 첨가하여 용출된 총핵산 용액을 획득하며; b) 상기 정제된 총핵산-자성나노입자 복합체 또는, 상기 획득한 총핵산이 있는 반응 용액을 등온 증폭하는 단계(S200); 및 c) 상기 증폭용액을 검출하는 단계(S300);를 포함할 수 있다.
본 발명의 표적핵산 검출 방법 장치는 단순한 DNA와 RNA를 공동 추출한 총핵산 시료의 정제 및 등온 증폭 반응은 표적 핵산을 포함하는 시료와 그렇지 않은 시료의 증폭의 속도의 차이를 변별할 수 있는 시간으로 수행되며, 상기 소정의 시간은 약 30분 동안 수행될 수도 있다.
본 발명의 표적핵산 검출 방법 장치에 따른 DNA와 RNA를 공동 추출한 총핵산 시료의 등온 증폭 반응 결과 분석은 (a) 단일검사는 비색분석; 및 (b) 다중검사는 상기 반응물의 측면 유통 장치 또는 능동유동 종기 어레이 여과를 이용한 측정을 통해 결정될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 표적핵산 검출 방법 장치는 또한 검출대상 핵산에 대한 DNA와 RNA를 공동 추출한 총핵산 시료의 등온 증폭 산물을 검출할 수 있는 포획 프로브가 부착된 종기 어레이를 제공한다.
본 발명의 표적핵산 검출 방법 장치는 또한 하나 이상의 병원체에 상응하는 DNA와 RNA를 포함하는 총핵산 시료에 대한 등온 증폭산물 검출용 조성물을 제공한다.
*본 발명의 표적핵산 검출 방법 장치에 따라 단순한 DNA와 RNA를 포함하는 총핵산을 추출하고 핵산 시료를 등온 증폭하여 표적핵산 검출이 가능하며, 이 핵산 검출 기술은 감염 초기에 유사 임상증상을 제공하는 하나 이상의 병원체를 높은 민감도와 특이성으로 신속하게 검출할 수 있어 특정 병원체 감염여부를 검출할 수 있으며, 특히 등온 증폭 과정 및 증폭종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 병원체 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.
도 1은 표적핵산 검출 방법의 간단한 순서이고,
도 2는 총핵산 시료를 자동 추출하고 등온 증폭하여 분석하는 표적핵산 검출 장치(1000)의 구성도이고.
도 3은 총핵산 시료를 자동 추출하고 등온 증폭하여 다중 분석하는 표적핵산 다중 검출 장치(2000)의 구성도이고,
도 4는 합성한 다양한 표적핵산을 주형으로 제조한 T7 프로모터가 있는 DNA를 전기영동한 이미지이고,
도 5는 바이러스 입자가 있는 시료에서 용출된 DNA 및 RNA 공동 추출한 핵산시료(LT)와 음성 대조구(H2O)에서, (a)는 β-actin, GFP 및 VSV-G를 RT-PCR 및 (b)는 PCR를 실시하여 아가로스 젤에 전기영동한 결과의 이미지이고,
도 6은 음성 대조구(a) 및 표적핵산 KX289874(b)에 대한 RPA 반응하고 SYBR 녹색 염료를 추가하여 얻은 색상 변화이고,
도 7은 다양한 표적핵산에 대해 RPA 증폭 산물을 에티디움 브로마이드로 염색된 2 % 아가로스-겔 전기영동하여 분석한 이미지이고,
도 8은 5x3 양식으로 표기된 5종류의 포획 프로브가 고정된 종이 어레이에 한 튜브에서 5종류 표적 핵산으로 구성된 스톡 DNA 주형을 단계적 희석 방법으로 준비된 주형들을 RPA하여 얻은 증폭산물을 혼합한 혼성화 용액으로 핵산 혼성화 기반 AFPA 결과를 스폿 강도를 GenePix Pro 5.0 마이크로 어레이 분석 소프트웨어 분석을 진행하는 이미지이고,
도 9는 3x3 양식(a)으로 표기된 표적핵산의 NCBI 접속번호에 상응하는 리간드가 고정된 종이 어레이에 바이오틴이 표지된 표적 프로브 증폭산물 용액을 분자 인코드 혼성화 기반 AFPF 실시하고 Streptavidin-coated AuNPs을 처리하여 형성된 스폿들로 구성된 종이 어레이의 이미지(b의 상단)이고, 추가적으로 은 나노 입자로 신호를 증폭하여 육안으로 민감도가 더 높은 스폿들로 구성된 종이 어레이의 이미지(b의 하단)이며, 여기서 가로 축은 바이러스 입자의 수이며 세로 축은 은 입자에 의한 신호증강 유무를 구분한 것이며,
도 10은 표적핵산 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 RT-RPA-Cas13 증폭 산물을 AFPF 실시한 종이 어레이에 Streptavidin-coated AuNPs를 처리한 결과로 상응하는 포획 프로브가 있는 위치는 빨간색 스폿을 형성하고 음 대조구는 반응이 없어 무색인 어레이이고,
도 11은 (a)는 RT-LAMP 반응산물에 SYBR 녹색 염료을 첨가하여 얻은 색상 변화 이미지로 표적핵산이 1000 카피/μL 이상 양성 반응구에서 녹색형광이 육안으로 명확하게 관찰되는 반면, 음성 대조군에서는 분홍색으로 유지되었으며, (b)는 (a)에 상응하는 반응 산물을 아게로즈 젤에 전기영동한 이미지이다.
본 발명은 (a) 시료에 용해용액 및 결합용액을 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출한 총핵산 시료를 세척용액으로 정제하는 단계(S100), 여기서, 또는 추가적으로 용출용액을 첨가할 수 있으며; 상기 정제된 총핵산-자성나노입자 복합체 또는, 상기 획득한 총핵산이 있는 반응 용액을 등온 증폭하는 단계(S200); 및 (c) 상기 증폭용액을 검출하는 단계(S300);를 포함하는 것을 특징으로 표적 핵산 검출 방법 및 장치를 제안하고 있다.
본 발명의 시료는 물, 토양, 동물, 식물, 곰팡이, 세균 및 바이러스를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 한 개체 이상에서 얻어지는 핵산을 포함하는 것을 의미한다. 핵산은 유전자를 포함하며 유전자의 특징으로 개체의 특징을 확인할 수 있으며, 생물학적 의미가 있는 핵산을 분석하여 결정할 수 있다.
생물학적 시료는 전형적으로 인간을 포함하는 포유류의 액상 또는 세포 또는 조직 시료이다. 본원에서 사용될 수 있는 시료는 예를 들면 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 코인두 분비물, 모유를 포함하나 이로 제한하는 것이다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.
이런 핵산 분석은 병원체의 검출 및 특징규명에 사용하는 중요한 단서이며 이상적으로는 병인 물질(병원체)의 동정으로부터 시작하는 복잡한 과정에서 매우 중요한 근거일 수 있다.
본 발명의 "검출"은 병원체의 감염 여부, 또는 감염된 대상체의 예후를 판정하는 것, 감염 후 치료 후 재발 여부 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 "프라이머"도 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 압타머(aptamer) 등을 포함하는 것이다.
본 발명의 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 재조합효소 또는 증폭효소를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3‘ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 RPA 분석 또는 RT-RPA 분석에 사용되는 것이다.
본 발명의 "핵산"은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 임의의 형태의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것이다. 본 발명의 “총핵산”은 시료에 있는 모든 DNA와 RNA를 포함하는 의미이다. 또한 본 발명에 따른 프라이머 세트가 사용되는 인플루엔자 바이러스의 핵산은 인플루엔자 바이러스 유래의 RNA, 예를 들면 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 또는 이에 상응하는 DNA를 포함하는 것이다.
본 발명의"종이"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 나무 펄프 또는 다른 섬유성 식물 물질로부터의 얇은 시트에 제한되지 않지만, 특정 실시형태에서 본 명세서에 기술된 장치에서 이러한 종이의 사용이 고려된다. 종이는 보다 일반적으로는 유체가 유동-통과하는 것을 허용하는 보통 시트 형태(하지만 이것으로 제한되지 않음)의 다공성 재료를 지칭한다.
본 발명에서 바람직하게, 상기 종이, 다공성 매트릭스는 증폭산물 혼합 상 용액을, 능동유동 종이 어레이 여과 검정법(Active Flow Paper array Filter Assay, AFPF)) 및 측방-유동 검정법(lateral-flow assay)을 포함하는 유동-통과 검정법은 유동-통과하는 것을 허용하기에 충분한 다공성이다.
다공성 매트릭스는 증폭산물 혼합 용액이, 유동-통과(스폿) 검정법 장치를 통해서 수직 및/또는 수평으로 유동하기에 충분하게 충분히 길고/길거나 깊다. 유동-통과(스폿) 검정법에서 다공성 매트릭스는 특히 유리 세라믹(scintered glass ceramic), 미네랄, 셀룰로스, 섬유유리, 나이트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 전하 개질된 나일론, 폴리에터설폰, 이들의 조합물등과 같은 재료를 포함한다.
다공성 재료, 예컨대 나이트로셀룰로스, 나일론, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유 및 다른 다공성 중합체가 고체상 면역검정법에서 고체 지지체로서 사용되어 왔다. 소위 측방-유동 검정법(lateral-flow assay)에서, 분석물이 검출될 유체는 다공성 막 층의 한 단부에 적용되고, 이것은 모세관력의 작용 하에서 막을 통해서 측 방향으로 유동하여 검출하고자 하는 분석물에 결합할 수 있는 고정된 "수용체"에 의해서 포획된다.
본 발명의 "dot blot", "어레이" 및 " 마이크로어레이" 는 어느정도 상호 교환 가능한 것으로 사용되며 일반적인 크기에서만 상이하다. 본 발명은 이들 중 어느 것을 제작하고 사용하기 위한 동일한 방법에 관한 것이다. dot blot은 전형적으로 1~100개의 스폿을 함유하며, 어레이 또는 마이크로어레이는 전형적으로 많은 스폿(전형적으로 100~1,000,000+)을 함유하며, 여기서, 각각의 스폿은 공지된 위치에 존재하고 관심있는 특이적인 성분을 함유한다. 그러므로 각각의 어레이는 수많은 상이한 관심있는 성분을 함유한다.
본 발명의 "표적" 또는 "표적 핵산"은 본원의 프라이머 세트가 결합하여 본원에 따른 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함하는 것이다.
본 발명의 "상보적" 또는 "상보성"은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성(perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 핵산에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본 발명의 "교잡" 또는 "혼성화"는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본원에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적 핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다.
교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있다.
본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적 핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 엄격도 조건에서 본원에 따른 표적인 인플루엔자 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에서 프로브(probe)는 표적 프로브(target probe)와 포획 프로브(capture probe)로 구분할 수 있다. 여기서 표적 프로브는 표적 분석물에 대한 증폭산물로 포획 프로브에 결합하여 이중가닥 표적-포획 복합체를 형성할 수도 있다. 또는 표적 프로브에 표지된 태그와 포획 프로브를 구성하는 리간드 사이의 복합체를 형성할 수도 있다.
실시되는 검정법은 1개의 포획 프로브를 이용할 수도 있다. 실시되는 검정법은 적어도 2개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 3개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 4개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 5개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 7개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 10개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 15개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 20개의 상이한 포획 프로브를 이용할 수도 있다.
바람직하게, 포획 프로브는 종이에 고정될 수 있다. 다공성 나이트로 셀룰로오스 막은 다공성 물질로서, 직접적인 물리적 흡수에 의해 단백질 및/또는 핵산과 같은 기질을 고정화할 수 있다. 고정화 접근법은 마이크로 어레이 및 셀룰로오스 기반 분석법 및 미세 유체 장치에서 입증되었다.
본 발명에서 나이트로 셀룰로오즈 막은 작은 포어 크기 (0.1~0.45μm)와 높은 결합력 (80~100 μg/cm2)으로 인해 이러한 모든 특성으로 인해 능동유동 종이 어레이 마이크로어레이에 사용하기에 적합한 기질이 될 수 있다.
표적 프로브는 합성 중합체, 금속, 미네랄, 유리, 석영, 세라믹, 생물학적 중합체, 플라스틱, 및 /또는 이들의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 표적 프로브는 금, 은, 백금, 타이타늄, 스테인리스강, 알루미늄 또는 이들의 합금 중 하나 이상을 포함하는 금속을 포함한다. 표적 프로브는 나노입자(예를 들어, 금 나노입자, 은 나노입자 등)를 포함한다.
표적 프로브는 코팅을 추가로 포함한다. 코팅은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 폴리프로필렌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 덱스트란을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 친수성 단백질을 포함한다.
표적 프로브는 검출 가능한 표지를 포함한다. 검출 가능한 표지는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학 수단에 의해서 검출 가능한 임의의 조성물을 포함한다. 유용한 표지는 형광 나노입자(예를 들어, 양자점(quantum dot: Qdot)), 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 금속 나노입자, 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인(fluorescein), 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등(예를 들어, 몰레큘러 리간드즈(Molecular Probes), 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, 호스 래디쉬퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것), 다양한 표색 표지, 자성 또는 상자성 표지(예를 들어, 자성 및/또는 상자성 나노입자), 스핀 표지, 방사선-비투과 표지(radio-opaque label) 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
표적 프로브는 검출 가능한 표지를 포함하는 또 다른 입자에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리간드는 검출 대역(시험선, 대조선, 시험 영역, 대조 영역)에서 검출 가능한 신호를 제공한다. 검출 가능한 표지/특성은 표색 표지/특성, 형광 표지/특성, 효소 표지/특성, 색상 표지(colorigenic label)/특성, 및/또는 방사성 표지/특성을 포함한다. 리간드는 금 나노입자이고, 검출 가능한 특성은 색상이다. 일부 실시형태에서, 색상은 오렌지색, 적색 또는 자색이다.
본 발명의 방법을 사용하여 검출될 시료는 생물학적 시료를 포함한다. 생물학적 시료는 생물유체, 예컨대 혈액 또는 혈액 분획, 림프, 뇌척수 유체, 정액 유체, 소변, 구강유체, 질 유체 등, 조직 시료, 플라크 시료, 질 스왑 시료, 자궁경관내 스왑 시료, 세포 시료, 조직 또는 기관생검물 또는 흡입물, 조직학적 시편 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
생물학적 시료가 조직을 포함하는 경우, 조직은 용해, 균질화 및/또는 분쇄될 수 있고, 임의로 시료 용액 중에 현탁될 수 있다. 생물학적 시료가 생물학적 유체를 포함하는 경우, 유체는 직접 검정되거나 또는 검정법 전에 시료 용액 중에 현탁될 수 있다. 시료 용액은 생물학적 시료 또는 이의 성분을 보존 또는 안정화시키도록 작용할 수 있고/있거나 생물학적 시료 또는 이의 성분을 추출 또는 농축시키도록 작용할 수 있다. 시료 용액은 임의로 보존제 및/또는 효소(프로테아제, 뉴클레아제등), 및/또는 계면활성제를 함유하는 완충액을 포함할 수 있다.
특히 현장 진단에서, 시료는 검정법 장치에 즉시 또는 약간의 시간 간격 후에 적용될 수 있다. 시료는 검정법이 실시되는 원격 시험 설비에 전달될 수 있다.
생물학적 시료를 수집하기 위한 방법 및 장치는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
동물로부터 얻어진 시료는 상기 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나로 부터 얻어진 핵산일 수 있다.
본 발명의 게놈은 동물, 식물, 곰팡이, 세균 및 바이러스를 포함하는 군에서 유전자 집합체를 의미한다. 본 발명에서 게놈 유형은 게놈을 구성하는 유전자의 유형과 유사한 의미로 사용하고 있다. 일반적으로 종의 아형은 분자 생물학적 방법으로 결정할 수 있다. 보편적으로 사용하는 방법은 분류학적 의미가 있는 핵산 유형으로 결정할 수도 있다.
이런 핵산 유형 결정은 감염성 질환의 검출 및 특징규명에 사용하는 중요한 단서이며 이상적으로는 병인 물질(병원체)의 동정으로부터 시작하는 복잡한 과정에서 매우 중요한 근거일 수 있다.
바람직하게, 표적핵산은 동물 병원체로부터 얻어진 것일 수도 있다. 동물 병원체는 단일-가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스, 또는 단일-가닥 RNA 바이러스일 수도 있다. 또는 동물 병원체는 박테리아일 수도 있다.
표적 핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 또는 RNA일 수 있다.
표적 핵산은 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA 또는 합성 단일-가닥 DNA일 수 있다.
본 발명의 병원체는 세균 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 한 유형(subtypes) 병원체일 수 있다.
상기 바이러스는 호흡기 바이러스의 한 유형(subtypes) 이상의 바이러스로 아데노 바이러스; 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(중증급성호흡기증후군). 중동호흡기기증후군 코로나 바이러스(중동호흡기증후군) 및 SARS-CoV-2(COVID-19)을 포함하는 코로나 바이러스; 인플루엔자바이러스 A형/B형/C형/D형, 인플루엔자 및 조류 인플루엔자를 포함하는 오르토믹 소바이러스; 및 사람 파라인플루엔자 바이러스(사람 파라인플루엔자), 호흡기세포융합 바이러스 사람 및 메타뉴모 바이러스를 포함하는 파라믹소 바이러스;로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 한 유형(subtype) 병원체를 특징으로 한다.
본 발명에서 방법 및/또는 장치는 열 사이클링 없이 표적 핵산의 증폭을 제공한다(등온 증폭). 핵산 증폭의 등온 방법은 이중 가닥 DNA에 적용될 수 있다. 그러나, 표적 핵산 분자는 이중 가닥 DNA 표적에 제한될 필요는 없다. 본 발명에서 등온 증폭 방법에서 사용하기 위한 이중 가닥 DNA는 역전사효소에 의해서, 바이러스 RNA, 또는 mRNA, 또는 다른 단일 가닥 RNA 표적 공급원으로부터 제조할 수 있다. 본 발명에 기술된 비-순환식 증폭 방법에서 사용하기 위한 이중 가닥 DNA는 RNA로부터 제조할 수 있다. 이러한 방법은 하기에 논의된 등온 증폭 방법의 적용 이전에, 초기 단계로서 적용될 수 있다.
본 발명에서 적합한 증폭 방법은 증폭을 수행하기에 충분한 시약을 폴리뉴클레오타이드와 조합하는 단계로 시작하여 증폭이 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 증폭산물의 정성적 또는 정량적 결정을 허용하기에 충분한 양까지 진행될 때 종결되는 총 시간(T)에 수행되는 증폭 방법을 포함한다. 총 시간(T)은 약 45분 이하, 약 30분 이하, 약 20분 이하, 또는 약 15분 이하일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 폴리뉴클레오타이드를 적어도 약 106배, 적어도 약 107 배, 적어도 약108배, 적어도 약 109배, 적어도 약 1010배, 적어도 약 1011배, 또는 적어도 약 1012배까지 증폭시키는 것을 포함한다. 이러한 증폭은 시간 T 내에 수행될 수 있다.
본 방법에서 적합한 증폭 방법은 "실시간" 또는 "정량적" 폴리뉴클레오타이드 증폭 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 반응이 진행함에 따라 실시간으로 각 증폭 사이클 후에 폴리뉴클레오타이드 증폭 산물의 축적을 검출할 수 있다. 실시간 방법은, 증폭된 산물의 특정 문턱값 농도에 도달하는 시간(사이클 횟수)이 직접적으로 표적 뉴클레오타이드의 초기 카피 수에 관한 것이기 때문에 정량적이다.
등온 증폭 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은, 자가-유지 서열 반응(3SR), 핵산 기반 전사 검정법(NASBA), 전사 매개 증폭(TMA), 가닥 치환 증폭(SDA), 헬리카제-의존성 증폭(HDA), 루프-매개 등온 증폭(LAMP), 스템-루프 증폭, RNA 기술의 신호 매개된 증폭(SMART), 등온 다중 치환 증폭(IMDA), 단일 프라이머 등온 증폭(SPIA), 및 순환식 헬리카제-의존성 증폭(cHDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
1. 총핵산 시료의 정제
본 발명은 (a) 시료에 용해용액 및 결합용액을 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출하여 형성된 총핵산-자성나노입자(MNP) 복합체를 세척용액으로 정제하는 단계(S100), 여기서, 또는 추가적으로 용출 용액을 첨가하여 용출된 총핵산 용액을 획득하며; (b) 상기 정제된 총핵산-자성나노입자 복합체 또는, 상기 획득한 총핵산이 있는 반응 용액을 등온 증폭하는 단계(S200); 및 (c) 상기 증폭용액을 검출하는 단계(S300);를 포함하는 것을 특징으로 표적 핵산 검출 방법 및 장치를 제안하고 있다.
본 발명의 단계 S100의 핵산 정제는 기능화 자성 나노 입자(MNP)이 중요하며 이는 상기 결합용액에 포함된다. 기능화 자성 나노 입자(MNP)의 특성은 고체상 가역적 고정화(solid-phase reversible immobilisation, SPRI)로 용액의 이온강도를 이용하여 핵산과의 흡착 및 탈착을 가역적으로 조절할 수 있으며, 강한 자석이 있는 경우 다중 세척 및 조작 단계가 용이하며, 자기 입자 프로토콜은 원심 분리와 무관하고 실험실 환경에서 구매 및 제조하는 데 필요한 재료가 매우 저렴하여 확장성이 높다.
자성 입자 플랫폼의 필수 구성 요소는 입자 자체와 이를 고정시킬 만큼 강한 자석이다. 첫째, 자성 입자는 두 가지 주요 형태, 즉 고체 페라이트(ferrite) 코어로 구성된 비교적 작은 입자 (50 nm ~ 2 μm) 또는 더 큰 페라이트-고분자 조합 (1~5 μm)로 나눌 수 있다. 두 가지 입자 유형 모두 핵산 정제 및 조작에 효과적이나 물리적, 화학적 특성이 다르다. 예를 들어, 더 큰 페라이트-중합체 입자 내의 중합체는 입자의 밀도를 효과적으로 낮추어 취급 단계 동안 현탁액으로부터 침전될 가능성이 적다. 더 작은 고체 코어 페라이트 입자는 결합을 위한 상대 표면적이 더 크며 쉽게 만들 수 있다.
자성 입자는 산화철(Fe3O4 - 마그네타이트)로 구성된 초상 자성 입자(superparamagnetic particles)이며, RNA, DNA, 단백질, 효소 및 유기 소분자를 포함한 생체분자와 결합, 추출 및 정제에 사용하는 소재이다.
Tetraethyl orthosilicate(TEOS), 실릴화된 성분 및 철 (II, III) 산화물 입자와의 반응 비를 조절하여 표면 기능성을 조정할 수 있다. 이 제조 방법에서, 산화철 (Fe3O4) 나노 입자는 계면 활성제없이 아르곤 하에서 염화 제1 철 및 염화 제2 철 수용액의 고전적인 알칼리 방법으로 제조할 수 있다(화학식 1).
2 Fe3 + (aq) + Fe2 + (aq) + 8 OH- → Fe3O4 (s) + 4 H2O (화학식 1)
초상 자성 입자의 다양성은 산화철 코어(일반적으로 Fe3O4)와 다양한 코팅 재료의 조합으로 제조할 수 있다. 자기 특성은 외부 자기장에 의해 입자 이동을 제어할 수 있다. 자기장이 제거되면, 초상 자성 입자는 더 이상 자화되지 않으며 자기 메모리가 없다. 그러나, Fe3O4는 헤마타이트 (Fe2O3)로 쉽게 산화되어 자기를 초상 자성에서 강자성으로 변화시키고 포화 자화(saturation magnetization)를 감소시켜 자기 특성이 약화될 수 있다.
산화를 피하고 금속 코어를 보호하기 위해, 자성 입자를 코팅하기 위해 천연 및 합성 중합체 및 실리카를 사용한다. 코팅 표면에 다양한 화학 작용기가 도입되어 다양한 응용 분야에 대한 안정성, 습윤 특성 및 결합 유연성을 향상시킬 수 있다. 아민, 카르복실 산, 에폭시 및 알데히드에 의한 화학적 관능화는 일반적으로 공유 결합을 통해 표면에 단백질, 효소, RNA, DNA 생체 분자를 고정시키는 데 사용할 수 있다.
공유 결합을 위한 기능성을 도입하는 것과 대조적으로, Fe3O4 마이크로 입자의 실리카 코팅에서 핵산 분자의 비공유 결합을 한다. 비공유 결합의 장점은 (1) 시료 준비 후 핵산 분자의 빠르고 간단한 방출과 Fe3O4 @ Silica 입자의 쉬운 제거, (2) 핵산 표면과 입자 표면 사이의 강한 이온 결합을 가능하게 한다. 시료 제조 공정은 시료 유체에 존재하는 핵산 분자에 신속하게 결합할 수 있는 흡수제 물질 또는 자성 실리카 입자를 필요하고, 이어서 시료 유체로부터 핵산 결합 입자를 분리하기 위해 외부 자기장을 적용한다. 분리 후, 핵산 분자는 후속 핵산 증폭 반응을 위해 자성 입자 또는 담체로 부터 탈착된다.
핵산, RNA와 DNA 분자와 빠른 흡착과 탈착이 필요했기 때문에 Fe3O4 나노 입자는 실리카로 코팅할 수 있다. DNA 및 RNA 분리를 위한 기존의 방법은 일반적으로 에탄올 또는 이소프로판올 침전을 사용한다. 이 추출 방법은 처리량이 많은 스크리닝 및 진단 테스트를 위해 시료 크기 및 작업단계의 축소를 제한한다. DNA와 RNA의 실리카 표면 흡착은 이러한 한계를 해결할 수 있다.
핵산 정제에 사용되는 자성 입자의 주요 측면은 크기에 관계없이 화학적으로 코팅해야 한다. 이를 수행하는 첫 번째 이유는 입자에 안정성을 제공하기 위한 것이다. 코팅이 없으면 페라이트의 산화로 인해 잠재적으로 민감한 시료가 철 이온으로 오염될 수 있으며 입자는 시간이 지남에 따라 자기 특성을 잃게 된다.
화학 코팅으로 자성 입자를 기능화 자성 입자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 실리카- 또는 카르복실-폴리머 코팅은 입자 안정성을 제공할 뿐만 아니라 화학적으로 불활성(실리카) 또는 음으로 하전(카르복실) 기능화 나노 입자는 용출 단계 동안에 입자로부터 음으로 하전된 핵산의 탈착을 촉진한다. 이 과정에서 실리카 또는 카르복실 코팅 입자를 준비하고 그들의 고정에 적합한 자기랙을 사용할 수 있다.
핵산 처리를 위해 시중에 판매되는 자기 나노 입자(MNP)를 사용하는 것이 가장 경제적인 방법이며, 본 발명에서 사용한 MNP는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles(GE Healthcare, 미국)이다.
MNP는 자기장 안팎으로 움직여서 쉽게 고정하고 재현탁할 수 있어 매우 유용하다. 가장 간단한 방법은 마이크로 튜브 또는 마이크로 플레이트 형식의 자석 배열로 구성된 고정화 랙을 사용하는 것이다. 랙의 가장 중요한 구성 요소는 자석 자체이다. 빠른 분리를 위해서는 N42 등급 이상의 고품질 네오디뮴 자석을 사용할 수 있다.
프로토콜 # 1 : 페라이트 코어 자성 입자의 합성
페라이트 나노 입자는 다양한 프로토콜을 사용하여 합성할 수 있다. 특수 장비가 필요하지 않고 단순성과 효율성으로 인해 널리 사용되는 공침법(coprecipitation method)을 사용한다. FeCl3 및 FeCl2 용액을 1 : 2 몰비로 혼합하고 예열된 알칼리 용액에 천천히 적하하여 블랙 페라이트 (Fe3O4) 침전물을 형성시킨다. 이 접근법을 사용하여 합성된 페라이트 입자는 직경이 약 5 내지 20 nm이다. 산소는 페라이트 침전 반응을 방해함으로 사용된 알칼리 용액은 질소가스로 충전하고 80 ℃ 이상으로 가열되어야 한다. 합성 후, 코어 입자는 탈 이온수로 강력하게 세척한다. 페라이트의 산화를 방지하기 위해 합성 직후 입자를 코팅하는 것이 좋다. 그러나 올레산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP) 또는 기타 화학 물질을 포함하는 세제를 사용하여 단기간에 이들을 안정화시킬 수 있으며, 동결 건조하여 질소가 충전된 밀폐된 곳에 보관할 수 있다.
프로토콜 # 2 : 실리카로 MNP 코팅
실리카로 페라이트 나노 입자를 코팅하면 자기 입자 산화 및 철 이온의 누출을 방지할 수 있다. 실리카 코팅은 안전한 핵산 침전을 위한 불활성 표면을 제공한다. 페라이트 나노 입자를 실리카로 코팅하기 위해, 기본 환경에서 TEOS가 가수 분해되어 자기 코어를 둘러싸는 SiO2 층을 형성하는 변형된 스토버 (St
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ber) 방법을 사용한다. TEOS의 증가로 실리카 코트의 두께 (따라서 입자의 크기)를 조절할 수 있다. 표준 코팅 프로토콜은 대략 400nm 크기의 실리카 코팅 입자를 생성하며, 이는 광범위한 핵산 정제 및 조작 실험에 사용할 수 있다.
프로토콜 # 3 : 메타크릴 산(methacrylic acid)으로 MNP 코팅 (카르복실 코팅)
자성 입자를 안정화시키는 다른 방법은 카르복실 변성 폴리머로 코팅하는 것이다. 잠재적으로 실리카와 동일한 안정성을 제공하지는 않지만 카르복실 코팅은 페라이트 코어에 약한 음전하를 부여하여 핵산과의 정전기적 상호 작용을 변경하고 궁극적으로 입자 기능에 영향을 미친다. 다른 반응식도 가능하지만, MNP의 상부에서 메타크릴 산 단량체를 중합하여 음으로 하전된 카르복실 코트를 제공하였다. 이를 위해 페라이트 코어 입자를 세제 (나트륨 도데실설페이트)와 함께 분산시키고 폴리메타크릴 산 (PMAA) 층을 자유 라디칼 역행 석출 중합 반응에 의해 입자의 표면에 침착시킨다.
프로토콜 # 4 : 정제 및 크기에 따른 분리
용해 반응 후 핵산의 분리 및 정제는 다양한 생화학 분석에서 필요한 절차이며 원래는 염과 알코올로 침전하여 수행할 수도 있다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 작은 절편의 핵산에 대해 상용 입자 컬럼 또는 자성 입자 SPRI를 이용하는 빠른 방법보다 최대 몇 시간의 긴 처리 단계가 필요하다.
자성 입자 SPRI 방법의 주요 장점은 하나의 튜브에서 용해 반응 후 순차적 세척할 수 있다는 것이다. 또한, 친수성 조건에서 더 큰 단편이 작은 것보다 더 효율적으로 자기 입자에 결합하기 때문에, 결합 조건을 변화시킴으로써 특정 크기의 핵산을 선택하거나 크기에 따라 분리할 수 있다.
카르복실 또는 실리카 코팅된 자성 입자를 사용하여 세척 및 크기에 따른 분리를 할 수 있다. DNA는 고농도의 PEG-8000 및 NaCl에서 분자 군집 형태로 카르복실 입자에 결합하는 반면, 실리카 입자에 카오트로픽 염이 있는 상태에서 실리카 표면에 음전하된 DNA 백본의 친화성으로 결합할 수 있다.
바람직하게, 포집을 위해 실리카 코팅 자성 입자와 Guanidinium thiocyanate(GTC) 를 사용할 수 있다. 결합 완충액의 양에 따라 100 bp와 3,000 bp 사이의 단편을 선택적으로 분리하면서 입력 DNA의 최대 95 %를 회수할 수 있다.
프로토콜 # 5 : DNA 또는 RNA의 전형적인 정제
박테리아 및 진핵 세포로부터 총핵산(TNA), 게놈 DNA 또는 총 RNA의 분리는 분자 생물학 실험의 출발점이다. 대부분의 정제 키트는 게놈 DNA 또는 RNA를 분리하도록 설계 및 판매되고 있다.
DNA의 정제 방법은 Proteinase K와 세제를 사용하여 저염 버퍼에서 세포를 용해시킨 다음 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전을 하는 것이다. RNA의 경우 RNase 활성을 억제하고 RNA가 실리카 입자에 결합하는 것을 촉진하는 강력한 변성제로서 GTC를 사용하는 것이다.
DNA 및 RNA 용으로도 많은 상용 키트를 이용할 수 있으며, 종종 에탄올을 첨가하여 DNA 또는 RNA를 실리카 컬럼에 결합시키고 원심 분리기를 사용하여 연속 세척을 수행한다. 플로우 스루 컬럼 시스템은 96- 웰 형식에 쉽게 적용되지 않는다. 따라서 대부분의 실험실에서는 많은 수의 시료를 사용한 실험이 불가능하다.
다양한 세포외 단백질이 없는 박테리아 및 포유 동물 세포의 경우, 단백질 변성 및 세포 용해를 위해 sarkosyl 및 GTC 기반 버퍼만 사용하여 TNA를 효율적으로 정제할 수 있다. 정자 또는 비장과 같은 일부 세포 유형의 경우, 2 % β- 머캅토에탄올의 첨가는 각각 염색질 변성을 보조하고 RNA 분해를 억제할 수도 있다. 용해 후, 이소프로판올을 사용하여 핵산을 자성 입자로 침전시키는 데 사용하다. 카르복실 입자와 같이 실리카 입자가 포획에 적합하다. 각 성분의 상대적인 양은 입자:용액:이소프로판올 (2:3:4)을 항상 즉 사용할 수 있다. 핵산 및 입자가 자석에 고정되면, 이소프로판올 및 80 % 에탄올 세척으로 잔류 단백질, GTC 및 기타 염이 제거되어 정제된 TNA의 후속 용출이 가능하다. 효소 DNase 또는 RNase 처리는 초기 입자 정제 전에, 이후에 각각 RNA 또는 DNA만을 생성하기 위해 입자에서 재정제할 수 있다.
근육 및 심장과 같은 고형 조직 및 기관으로부터 직접 유래된 세포는 기계적 파괴없이 GTC에서 쉽게 용해되지 않는다. 이 경우, 저염 버퍼에서 먼저 Proteinase K를 사용하여 단백질 분해를 수행한 다음 보다 농축된 (1.5x) GTC 버퍼에서 추가로 변성을 수행할 수 있다. 이 처리량 방법을 사용하면 RNA는 잘 보존되지는 않지만, DNA 정제가 전통적인 페놀-클로로포름 추출과 비교하여 다양한 포유 동물 조직 (실리카 또는 카르복실 입자)에서 효율적으로 작동한다.
매우 다양한 시료로부터 핵산을 정제하기 위해 초기 용해 단계에 대한 추가 변형이 추가할 수 있다. 예를 들어, 소량의 사전 기계적 파괴로 총핵산은 GTC 용해를 사용하여 설비에서 쉽게 추출하거나 저염 단백질 분해 효소와 결합할 수 있다. 총핵산은 GTC 완충액 단독으로 용해된 세포를 사용하여 효과적으로 정제할 수 있지만, 일부 사용자는 초기 변성을 위해 산-GTC- 페놀 용액을 선호할 수 있다.
프로토콜 # 6 : 총핵산의 효율적인 공동정제
본 발명은 빠르고 고 처리량이며 비용 효율적인 RNA와 DNA 총핵산 공동 추출 방법을 사용하였다.
총핵산, RNA와 DNA의 공동 추출을 위한 용해 과정에서 사용하는 주요 화학 시약은 Guanidinium thiocyanate(GTC), Dithiothreitol(DTT), sodium dodecyl sulfate(SDS), β-mercaptoethanol 및 핵산 침전 보조제를 포함한다. 이러한 화학 시약은 자성 입자와 결합하여 시료에서 DNA 또는 RNA를 더 효율적으로 추출할 수 있도록 한다.
또 다른 용해 용액은 1 M NaI, 2.5 M NaCl, 10% Triton X-100, 40% polyethylene glycol 8000 및 25 mM EDTA를 포함하며 이를 사용할 수도 있다.
바이러스 용해 완충제를 합성하기 위해 SDS와 β-mercaptoethanol을 사용할 수도 있다. 그러나 SDS는 결정을 쉽게 형성할 수 있어 시료 처리 중에 불편을 초래할 수 있으며 β- 메르캅토에탄올은 특이한 냄새가 있으며 인체 건강 및 환경오염 물질의 위험이 있다.
본 발명에서 바람직하게, GTC, DTT, 글리코겐 및 구연산 나트륨은 시료로부터 DNA 및 RNA를 공동 추출하기에 충분하고 용해 완충액의 적절한 성분임을 확인하였다.
GTC는 RNase 및 DNase 활성을 억제하고 핵산 및 핵 단백질을 분리하여 RNA 및 DNA 무결성을 보존할 수 있는 강력한 변성제이다. 용해 완충액에 GTC가 없으면 DNA 나 RNA가 자기 입자의 표면에 흡착되지 않는다. DNA와 RNA 공동 추출 수율은 2.0 M GTC 농도에서 가장 높은 추출 효율이다. 다른 GTC 농도는 추출 효율에 거의 영향을 미치지 않았다. 특히 GTC의 농도가 6.0M 일 때 결정화되어 시료 처리 과정에서 불편이 있다.
DTT는 단백질이 추가적인 활동을 잃게 할뿐만 아니라 가래를 액화시키는 잘 알려진 능력을 가지고 있다. 따라서, 가래는 DTT가 핵산 추출 과정에 포함될 때 전처리를 요구하지 않는다.
본 발명에서 기능화 자성 입자가 DNA와 RNA을 흡수하는 능력을 가지고 있으며 GTC를 포함한 일부 용매의 적절한 농도로 흡착 능력이 크게 향상될 수 있다. 음이온은 자성 입자와 핵산의 표면에 존재하고, GTC 또는 암모늄은 핵산과 자성 입자 사이의 가교 역할을 할 수 있다. 수화된 이온을 형성함으로써 핵산 및 자성 입자 둘 모두의 표면상의 수층-자성 입자가 핵산을 흡착하게 한다. GTC는 단일 가닥 DNA의 기본 그룹과 자기 입자 표면의 하이드록실 그룹이 접착력을 강화시키는 화학적 결합을 형성하기 때문에 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 만든다. 따라서 DNA와 RNA는 GTC없이 자기 입자 표면에 거의 흡착되지 않는다.
실온보다 높은 온도에서 더 많은 DNA 및 RNA가 추출할 수 있으며, 60~100℃에서도 RNA 분해가 없으며 반면, 많은 핵산 추출 방법이 실온에서 수행하고 있으나, 실온에서 RNA 추출 효율이 상대적으로 낮아질 수 있다.
본 발명에서 바람직하게 80℃ 전후에서 총핵산을 추출할 수도 있다.
기능화 자성 나노 입자를 이용한 총핵산의 공동 추출에서 반응요액의 pH가 중요한 역할을 한다. 알칼리성 조건에서 자성 입자의 흡착 능력에서 거의 차이가 관찰되지 않았지만, 산성 조건에서, 특히 pH가 5 미만 경우 흡착 능력이 급격히 감소할 수 있다. 이러한 결과는 기능화 자성 나노 입자의 작용기 때문에 발생할 수 있다. pH는 너무 낮을 때 양전하를 띠는 자기 입자의 표면에 산이 부착되어 자기 입자에 대한 핵산 결합에 영향을 미쳤다.
일반적으로 액체 시료에서 DNA와 RNA를 회수하여 저온에서 에탄올을 용액에 첨가하는 회수율이 낮아서 30 % 이상의 핵산 손실이 발생한다. 액체 시료의 핵산 농도가 너무 낮거나 DNA <200bp인 경우 에탄올 침전은 아마도 DNA와 RNA의 약 50%를 회복할 수도 있다.
본 발명의 핵산 침전 보조제는 Acryl Carrier, 글리코겐 및 tRNA를 포함하며 모두 DNase 및 RNase 활성이 없다. 아크릴 운반체는 핵산 침전 수율을 향상시키고, 미량 DNA의 회수율을 95~ 98%로 만들 수 있으며, 침전 복구 및 프로브를 위해 짧은 프라이머 (<22bp) 단편과 dNTP를 선택적으로 제거할 수 있는 분자 수준의 아크릴 중합체 용액이다. 아크릴 담체는 핵산 침전 보조제의 가장 일반적인 용도가 된다.
핵산 침전 보조제가 없는 자기 입자에 기초한 이 공동 추출 방법은 다중 RT-qPCR 분석의 요건을 충족시킬 수 있다. 핵산 침전 보조제의 첨가는 RNA 및 DNA 둘 다에 대한 상용 키트의 추출 효율보다 크게 추출 효율을 개선하고 더 높은 수준에 도달할 수 있으며, 이는 아마도 핵산 침전 보조제가 핵산 침전에 우수한 영향을 미쳤기 때문이다.
본 발명에서 한 튜브를 사용하여 시료로부터 용해 과정 및 자성 입자와 핵산 결합 과정으로 DNA 및 RNA 총핵산 시료를 공동 추출할 수 있으며, 여기서 또는 추가적인 용출과정을 실시할 수 있으며 자성 입자와 핵산 결합 과정 및 용출과정으로 총핵산 시료 정제를 할 수도 있다.
본 발명에서는 용해용액과 결합용액을 함께 처리하거나 순차적으로 처리할 수 있다.
한 튜브에서 시료에서 DNA 및 RNA 총핵산 시료를 정제하고 정제되거나 또는 정제되고 용출된 총핵산 시료를 대상으로 등온 증폭을 할 수 있다.
본 발명에, 시료로부터 DNA 와 RNA 총핵산 시료의 고도로 민감한 추출 및 등온 증폭 검출을 위해 추가로 단순화되고 업데이트된 MNP 기반 총핵산 시료 추출 방법을 제공한다.
MNP는 간단한 프로토콜 #1을 통해 합성되고, 프로토콜 #3 단계에 의해 다중-카르 복실기를 갖는 중합체로 작용화한다. 카르복실기와 핵산 사이의 강한 상호 작용으로 인해, 폴리 카르복실-기능화된 MNP는 총핵산 시료의 빠르고 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 총핵산 시료 추출에서, 복잡한 시료의 핵산 추출 및 정제를 위해서는 하나의 용해/결합 단계 및 하나의 세척 단계가 필요하다.
더욱 중요하게는, 추출된 총핵산 시료는 용출 단계없이 MB와 함께 후속 등온 증폭에 도입될 수 있으며, 이는 작동 시간 및 오염 위험을 크게 줄인다. 빠른 추출 방법은 수동 작동과 자동화 시스템 모두에서 검증되었다. 단순성, 만족스러운 성능 및 견고성으로 인해 이 방법은 현재 등온 증폭 기반 핵산 분석 진단에서 노동 강도를 줄이고 부정적 결과의 가능성을 줄이는 유망한 대안을 제공할 것이다.
한 튜브에서 시료에서 DNA 및 RNA 총핵산 시료를 정제하고 정제되거나 또는 정제되고 용출된 총핵산 시료를 대상으로 등온 증폭을 할 수 있다.
2. 등온 증폭
본 발명의 단계 S200의 등온 증폭은 비교적 간단한 실험적 방법을 통해서 표적핵산을 초고 감도로 검출할 수 있어 의학 진단, 식품 분석 및 환경 안전에 매우 중요하다. 등온 증폭법(isothermal amplification)을 적용하여 빠르고 민감하게 표적을 검출하는 방법 및 특이적이고 정확하며 상용화한 제품들이 개발되고 있다.
본 발명의 핵산 증폭 기술(Nucleic acid amplification technology)은 소량의 핵산을 검출하고 분석하는 방법을 일컬으며 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 표적 핵산을 단시간에 대량으로 증폭할 수 있어 전염병, 유전 질환 등을 검출하고 동정하기 위해 널리 사용되고 있다.
일반적인 PCR은 반응 온도를 수십 회 이상 조절함으로써 표적 핵산을 증폭하고 검출하기 때문에 thermocycler(온도조절장치/유전자증폭기)가 필요한데, 이 장비는 고온과 저온 사이의 온도 전환을 수십 초 내에 안정적으로 구현해야 한다. 또한 신속한 진단에 대한 요구로 개발된 실시간 검출 모니터링이 가능한 PCR(Real-time PCR)은 더 고도의 기술을 요구하므로 경제적인 부담이 큰 단점을 가지고 있다.
본 발명의 등온 증폭법은 반응 온도를 변화시킬 필요 없이, 단일 온도(상온 또는 65 ℃ 이하의 고온)에서 표적 핵산의 증폭이 가능하므로 고가의 온도조절장치를 필요로 하지 않으며 일반적 PCR에서는 구현이 어려운 현장진단에 용이하다는 장점이 있다.
이 방법의 종류를 세분화하면, transcription mediated amplification(TMA), nucleic acid sequence-based amplification(NASBA), signal mediated amplification of RNA technology(SMART), strand displacement amplification(SDA), rolling circle amplification(RCA), loop-mediated isothermal amplification(LAMP), isothermal multiple displacement amplification(IMDA), helicase dependent amplification(HDA), recombinase polymerase amplification(RPA) single primer isothermal amplification(SPIA) 등이 있다.
2-1. Transcription mediated amplification(TMA)/Nucleic acid sequence based amplification(NASBA)
TMA와 NASBA는 모두 RNA 전사(transcription)에 관여하는 효소를 응용한 증폭기술로써 RNA가 표적물질이다. 이 방법들은 공통적으로 세 종류의 효소들(RNase H, reverse transcriptase, RNA polymerase)이 반응에 참여하는데, NASBA는 독립적인 RNase H를, TMA는 RNase H 활성을 지닌 다른 효소를 사용하는 점에서 차이가 있다. 이 방법의 장점은 반응에 관여하는 RNase H가 열 변성 단계 없이 cDNA에서 RNA를 제거할 수 있어 단일 온도 (41 ℃)에서 2 시간 내에 표적의 양을 ~109 배 증폭할 수 있다는 점이다.
2-2. Signal mediated amplification of RNA technology(SMART)
SMART는 한 가닥의 표적 핵산과 두 종류의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 프로브(single stranded oligo-nucleotide probe)가 결합하여 three way junction(3WJ) 구조를 이루고, 41 ℃ 등온에서 RNA promoter 부위를 포함한 프로브에 의해 표적 RNA 서열의 반복적 합성을 유도하는 기술이다. 이 반응은 표적 특이적인 3WJ 구조 형성 단계와 표적물질 증폭 반응은 서로 분리된 chamber에서 실행해야 하는 단점이 있다.
2-3. Strand displacement amplification(SDA)
핵산내부 가수분해효소(restriction endonuclease)가 표적 DNA 서열을 부분적으로 절단하면 가닥 치환활성(strand displacement activity)이 있는 중합효소(polymerase)가 절단 부위에서부터 앞서 상보 결합되어 있는 DNA 가닥을 제거하면서 새로운 상보적 DNA 가닥을 합성한다. 반응 온도는 37~49℃이며, 2 시간 내에 표적 유전자의 양을 ~109 배로 증폭할 수 있으나 표적 DNA 가닥이 길 때는 효율적이지 않은 방법이다.
2-4. Rolling circle amplification(RCA)
원형의 단일 가닥 DNA를 표적 유전자의 프로브(circular DNA probe)로 사용하며, DNA 가닥 치환활성(strand displacement activity)이 있는 Φ29 DNA 중합효소가 30 ℃에서 이 원형 DNA 프로브와 표적 유전자가 결합한 부위를 인식하여 DNA 중합반응을 시작하며, 원형 프로브의 구조상 3’ 말단이 없으므로 Φ29 DNA 중합효소가 원형 프로브를 따라 DNA 중합반응을 장시간 반복하여 수천 개의 염기서열을 지닌 긴 단일 가닥의 DNA를 합성한다.
2-5. Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)
표적이 되는 DNA 가닥에서 6 개의 부분을 선택하여 조합한 4 개의 프라이머(primer)로부터 프라이머 결합 부위에 루프 구조(stem-loop DNA)를 만들어 사슬치환반응을 통해 DNA를 증폭한다. 60~65 ℃ 등온에서 표적 ssDNA와 결합하여 증폭할 수 있는데 너무 짧은 표적에는 적용할 수 없는 방법으로 몇 백 개의 염기로 이루어진 표적에 가능하다. 상보적인 결합을 방해하는 DNA 가닥이 있어도 한 시간 내에 시료의 양을 ~108 배 증폭할 수 있다.
2-6. Isothermal multiple displacement amplification(IMDA)
시료의 양이 제한적일 때, genome을 복제하는데 유용한 방법으로 random hexamer와 Φ29 DNA 중합효소를 통해 ~100 kb의 DNA 절편을 얻을 수 있다. Φ29 DNA 중합효소는 proofreading이 가능하며 보편적으로 사용되는 Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR의 전체 genome 복제보다 1000 배 정확하다.
2-7. Helicase dependent amplification(HDA)
DNA를 가열하는 대신 DNA helicase를 사용하여 DNA 이중가닥을 분리하므로 온도조절장치 없이 DNA 증폭이 가능하다. 3 시간 내에 표적 물질을 ~106 배까지 증폭할 수 있다.
2-8. Single primer isothermal amplification(SPIA)
5’-ribonucleotide와 3’-deoxyribonucleotide로 이루어진 하나의 chimeric 프라이머를 사용하여 반복적인 증폭 반응을 통해 표적 핵산을 증폭하므로 시료의 양이 제한적일 때 유용하게 사용되는 방법이다.
2-9. Recombinase polymerase amplification(RPA)
프라이머와 재조합효소(recombinase)로 이루어진 복합체가 DNA 이중가닥에 결합하면서 만들어진 공간에서 DNA 가닥 치환 활성이 있는 중합효소가 새로운 DNA 가닥을 합성한다. 25 ℃에서 42 ℃까지의 비교적 낮은 온도에서 20분내의 짧은 반응 시간 동안 표적 핵산의 양을 1011 배까지 증폭할 수 있으나 반응 조건이 까다로워서 표적 핵산에 대한 다양한 응용이 어렵다.
등온 증폭법은 복잡한 부대장비 없이 빠르고 쉽게 표적 핵산을 검출할 수 있어 다양한 의료 진단, 환경 센서 분야 등 다방면에서 활발히 연구되고 있다. 특히 현장 진단에 대한 요구가 높아지며 더욱 정확하고 빠른 진단과 손쉽게 사용할 수 있는 장치의 개발에 박차가 가해지고 있으나 소량의 시료를 실험실 밖 환경에서 전처리하고 검출하는데 있어 아직 보완해야 할 점이 많다.
등온 증폭법에 자주 등장하는 Φ29 polymerase는 핵산 가닥을 합성하는 속도가 매우 빠르지만, base mismatch의 비율이 상대적으로 높은 편이며, RPA의 경우 높은 증폭율을 보이지만 반응 조건이 엄격한 편이라 개별 실험의 재현성이 떨어지는 단점이 있다. 개별적인 등온 증폭 방법에는 각각의 단점이 존재함에도 불구하고 분자진단의 영역을 1회용/현장용 POCT 분야로 넓힐 수 좋은 플랫폼이 될 수 있다. 또한 등온 증폭법은 MEMS 기술과의 결합을 통해서 헬스케어 산업과 원격의료 지원 등에서 무한한 가능성을 가지고 있을 수도 있다.
3. 재조합효소 중합효소 증폭
본 발명의 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)은 복잡한 실험실 장비없이 핵산을 신속하게 검출할 수 있는 등온 증폭 방법이다. 20분 이내에 매우 낮은 농도의 병원체 특이적 DNA 및 RNA를 검출할 수 있는 수많은 RPA 기반 분석법이 개발되었으며, 이는 다른 등온 분석법 또는 PCR보다 훨씬 더 빠른 것이다. RPA는 이러한 신속하고 민감한 증폭을 허용하기 위해 많은 생화학적 메커니즘을 사용한다.
기본 RPA는 이중 가닥 DNA 분자 내에서 그들의 상보적 서열에 올리고뉴클레오티드 프라이머의 삽입 및 결합을 용이하게 하기 위해 재조합 효소를 이용한다. 반대 프라이머는 PCR과 유사한 방식으로 정의된 DNA 영역의 지수 증폭을 할 수 있게 한다. 특이적 비염기성 뉴클레오티드 유사체를 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 엔도뉴클레아제 IV (nfo) 또는 엑소 뉴클레아제 III (exo)에 의해 인식되고 절단되지만, 프로브가 그의 상보적인 표적 서열에 결합될 때에만 가능하다. 이를 통해 nfo를 통한 면역 크로마토 그래피 스트립 (ICS) 또는 exo 프로브를 사용한 실시간 형광 검출을 통한 증폭 검출이 가능하다.
본 발명의 기본 RPA에 사용하는 표준 RPA 반응 시약은 3 개의 핵심 단백질(재조합효소, 재조합효소 로딩 인자 및 단일가닥결합 단백질)을 포함하며, 추가적으로 DNA 중합효소, 군집 시약 crowding agent(일반적으로 PEG), 에너지/연료 성분(예: 삼인산(ATP) 및 염 분자과 같은 RPA 반응 메커니즘을 수행하기 위한 보조 성분을 포함한다.
RPA 조성물은 재조합효소를 함유하며, 재조합효소는 RecA 및 UvsX(예를 들어, 임의의 종으로부터 얻어진 RecA 단백질 또는 UvsX 단백질), 및 이들의 단편 또는 돌연변이, 및 이들의 조합을 포함한다. RecA 및 UvsX 단백질은 임의의 종으로부터 얻어질 수 있다. RecA 및 UvsX 단편 또는 돌연변이 단백질은 또한, 이용 가능한 RecA 및 UvsS 단백질 및 핵산 서열, 및 분자 생물학 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 추가적인 예시적 재조합효소 단백질은 아르카에박테리아 RADA 및 RADB 단백질 및 진행 생물(예를 들어, 식물, 포유류 및 진균) Rad51 단백질(예를 들어, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, 및 recA)을 포함한다.
DNA 중합효소는 진핵생물 또는 원핵생물 중합효소일 수 있다. 진핵생물 중합효소의 예는 pol-알파, pol-베타, pol-델타, pol-엡실론, 및 이들의 돌연변이체 또는 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 원핵생물 중합효소의 예는 대장균 DNA 중합효소 I(Klenow 단편), 박테리오파지 T4 gp43 DNA 중합효소, 바실러스 스테아로테로모필루스 중합효소 I 큰 단편, Phi-29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 바실러스수 브틸리스(Bacillus subtilis) Pol I, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Pol I, 대장균 DNA 중합효소 I, 대장균 DNA 중합효소 II, 대장균 DNA 중합효소 III, 대장균 DNA 중합효소 IV, 대장균 DNA 중합효소 V, 및 이들의 돌연변이체 또는 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 부족하다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 가닥-변위 성질, 예를 들어, 부류 pol I 또는 pol V의 원핵생물 중합효소의 큰 단편을 갖는다.
하나 이상의 단일-가닥 DNA 결합 단백질은 반응에서 진행 중인 다양한 교환 반응 동안에 핵산을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 단일-가닥 DNA 결합 단백질은 임의의 종으로부터, 예를 들어, 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 종으로부터 유래되거나 얻어질 수 있다.
증폭을 촉진하기 위해, RPA 과정은 군집 시약의 존재 하에서 수행될 수 있다. 군집 시약는 효소 촉매 활성의 향상을 포함하여 다양한 생화학적 공정의 효율을 조절한다. PCR 및 RT-PCR에서 첨가제로 사용될 때, 군집 시약은 효율성, 특이성 및 감도를 향상시킨다. 군집 시약은 점성이 있으며 RPA는 증폭을 위해 상대적으로 낮은 온도 (37-42 ℃)를 사용하여 반응용액에서 열대류의 혼합 효과를 줄인다. 두 현상은 RPA 활성이 높은 영역에서 시약의 국소적인 고갈을 유발하여 증폭 단계는 억제될 수 있다.
군집 시약은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드 폴리비닐 알코올, 폴리스티렌, Ficoll, 덱스트란, 폴리(비닐피롤리돈)(PVP), Triton-X, 및 알부민 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또는, 군집 시약은 200,000 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 조성물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, Triton-X, 및 Ficoll로 이루어진 군으로부터 선택된 군집 시약을 포함한다.
본 발명에서 군집 시약으로 고 분자량 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 RPA 반응의 시약으로 사용할 수 있다.
3-1. 템플릿, 프라이머, 프로브 및 디자인
본 발명의 기본 RPA는 DNA에 대한 핵산증폭 방법이고, RNA는 동일한 반응 튜브에 역전사 효소를 추가하여 제조된 cDNA를 주형으로 사용할 수 있다.
핵산 주형 유형의 경우, 효과적인 증폭을 위해 권장되는 RPA 증폭산물 길이는 500 뉴클레오티드 미만이다. 대부분의 100 ~ 250 개의 뉴클레오티드 길이의 증폭산물 길이를 적합하며, 일반적으로 빠르고 효율적인 증폭이 가능하다.
본 발명에서 기본 RPA 프라이머의 길이는 비교적 길다(권장된 최소 30개 뉴클레오티드, 그러나 일반적으로 32 내지 35개 뉴클레오티드). 보다 짧은 PCR 프라이머 (일반적으로 18 내지 25 개의 뉴클레오티드)가 RPA 반응에도 사용될 수 있지만 반응 속도 및 감도를 감소시킬 수 있다. RPA에 사용된 PCR 프라이머가 PCR에서의 검출 감도보다 더 높을 수도 있다.
본 발명에서 상기 기본 RPA 반응에 추가적으로 새로운 효소를 사용하여 특이도를 향상시키고 반응결과 시각화를 도모할 수 있다.
상기 효소는 exo(E. coli exonuclease III), fpg(glycosylase/lyase E. coli fpg) 및 nfo(nfo endonucleases IV)플 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 추가하는 것을 특징으로 할 수도 있다.
상용화된 RPA 시약인 TwistDx™는 RPA 반응 중에 통합할 수 있는 추가 프로브를 제공한다(TwistDx, 영국). TwistAmp™ 엑소프로브 (일반적으로 46 내지 52 개의 뉴클레오티드) 및 TwistAmp® fpg 프로브 (일반적으로 32 내지 35 개의 뉴클레오티드)는 형광성 실시간 검출에 사용할 수 있다.
이 두 프로브는 일반적으로 형광단, 형광 신호에 근접하여 형광 신호를 일시적으로 억제하는 소광제(Black Hole Quencher) 및 3'- 말단으로부터 폴리머라제 연장을 방지하는 역할을 하는 3' 말단에 차단제 (예를 들어, C3- 스페이서, 포스페이트, 비오틴 -TEG 또는 아민)을 포함할 수 있다.
실시간 검출은 abasic site(DNA에서 (Purine이나 pyrimidine base를 갖지 않는 DNA에서 apurinic/apyrimidinic site라고도 함)에서 fluorogenic probe의 절단을 기반으로 한다. 형광단 및 소광제. 염기성 부위는 테트라하이드로푸란 (THF) 또는 dSpacer (THF의 유도체) 또는 dR 기 (C-O-C 링커를 통한 염기성 부위의 데옥시리보스) 일 수 있다.
대장균 엑소뉴클레아제 III는 THF 또는 dSpacer 부위에서 TwistAmp™ 엑소 프로브를 절단하는 반면, 글리코실라제/리아제 대장균 fpg는 dR 위치에서 TwistAmp™ fpg 프로브를 절단한다.
효소 절단 후, TwistAmp® 엑소 프로브는 정방향 프라이머로서 기능할 수 있다. 그러나, TwistAmp™ fpg 프로브는 확장 가능한 3'-OH기를 생성하지 않고 3'- 포스페이트를 생성하는 글리코실라제/라이아제 대장균 fpg 단백질의 상이한 촉매 모드(베타-제거)로 인해 프라이머로서 기능할 수 없다.
세 번째 프로브인 TwistAmp™ nfo (일반적으로 46-52 개의 뉴클레오티드)가 TwistAmp™ nfo 프로브는 능동유동 종이여과(AFPF) 분석법으로 감지하도록 설계할 수 있다. 이 프로브는 5'- 말단 (예를 들어, 플루오레세인)으로 표지되고, 3'- 말단에 차단제 및 내부 기본 위치 (THF 또는 dSpacer)를 갖는다. TwistAmp™ nfo 일반적으로 46-52 개의 뉴클레오티드 길이이며, 그 중 30 개 이상은 THF(테트라히드로 푸란) 부위에 5' 지역 및 적어도 15 개는 3' 지역에 위치한다. THF 잔기는 상보적 서열과 정상적으로 염기쌍을 이루는 뉴클레오티드를 대체한다. 해당 증폭 프라이머에 대한 주어진 프로브의 최상의 위치를 *?**?*설명하는 고정된 규칙은 없다.
TwistAmp™ nfo 프로브와 동일한 방향을 갖는 정방향 프라이머가 5 '부분과 겹칠 수 있지만,이 겹침은 TwistAmp™ nfo 의 기본 부위까지 확장되어서는 안 된다 (즉 프라이머의 겹침은 5'- TwistAmp™ nfo 의 뉴클레오티드 최고 30으로 제한함). 이것은 프라이머에 의해 TwistAmp™ nfo 의 민감한 서열 요소에 대한 혼성화 표적의 우연한 생성을 방지할 것이다. 역방향 프라이머는 프라이머와 TwistAmp™ nfo 이량체의 발생을 피하기 위해 겹치지 않아야한다. 역방향 증폭 프라이머에는 항원 그룹, 일반적으로 비오틴이 표시되어야한다.
Nfo 엔도뉴클레아제 IV는 TwistAmp™ nfo 프로브의이 염기성 부위에서 절단되어 중합을 위해 확장 가능한 3'-OH기를 생성한다. 그러나 RPA 반응 중 대부분의 증폭산물을 분해하는 대장균 엑소뉴 클레아제 III과 달리 Nfo 엔도뉴클레아제 IV는 증폭산물 분해를 피하기 위해 더 느린 신호와 불완전한 절단을 생성한다 따라서, TwistAmp™ nfo 프로브는 겔 전기 영동 (GE)이 검출 방법으로 선택된 경우에도 사용할 수 있다.
상기 중합효소의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 통상적인 프라이머이다. 실제로, 표지물질을 사용하는 방식, 즉 어떤 표지가 TwistAmp™ nfo 에 있는지, 어느 표지가 역방향 프라이머에 있는지는 차이는 없다.
추가적인 시험 개발을 용이하게 하기 위해, 표적 프로브에 대한 신호를 발생하는 물질(reporter)이나 또는 리포터와 결합할 수 있는 표지물질을 역방향 프라이머에 두는 것이 유용할 수 있다.
본 발명에서 표지물질은 바이오틴(biotin)일 수 있다.
2 개의 프라이머에 의해 촉진된 증폭 반응은 TwistAmp™ nfo 프로브의 어닐링에 대한 표적으로부터 시작한다. 생성된 이중 가닥에는 THF 잔기는 nfo(엔도뉴클레아제 IV)에 대한 기질을 제공한다. nfo는 THF 위치에서 프로브를 절단하여 중합효소 확장을 위한 프라이밍 사이트로 작용할 수 있는 새로운 3'말단 하이드록실 그룹을 생성하여 TwistAmp™ nfo 프로브는 프라이머로 변형한다.
가공된 프로브와 5' 말단에 표지된 역방향 증폭 프라이머에 의해 생성된 증폭산물의 이증 가닥은 단일 가닥으로 전환되고 표지물질이 있는 표적 프로브의 염기서열과 종이 어레이에 있는 포획 프로브의 염기서열이 상보적 결합에 의해 이중 가닥을 형성한다. 이 단일 표지 증폭산물은 핵산 혼성화 방식의 AFPF 분석 형식 (일반적으로 증폭 후, 즉 엔드 포인트 감지)으로 감지할 수 있다.
핵산 검출을 위한 핵산 혼성화 방식의 AFPF 분석 형식은 표지물질이 표지된 역방향 프라이머를 이용하여 제조되는 단일가닥을 표적 프로브로 사용하여 기본 RPA 및 TwistAmp™ nfo 반응 메커니즘은 증폭 반응과 동시에 단일 표지된 리포터 분자를 생성하며 증폭 후 처리를 최소화할 수도 있다.
반면, 분자 인코드 방식에서는 증폭반응을 하는 중합효소의 정방향 프라이머는 TwistAmp™ nfo 프로브가 분해된 5'말단에 표지물질이 있는 5'영역으로 이루어진 올리고뉴클레오티드이며, 역방향 프라이머는 5'말단에 태그가 있는 RPA 역방향 증폭 프라이머일 수 있다.
5'말단에 표지물질이 있는 가공된 프로브와 5' 말단에 태그가 있는 역방향 증폭 프라이머를 사용한 중합효소의 증폭산물은 표지물질과 태그가 효과적으로 결합된다. 이 이중 표지 증폭산물은 표적 프로브로 분자 인코드 방식의 AFPF 분석 형식 (일반적으로 증폭 후, 즉 엔드 포인트 감지)으로 감지할 수 있다.
핵산 검출을 위한 분자 인코드 방식은 일반적으로 사용하는 태그와 리간드를 활용하도록 하고 있다. TwistAmp™ nfo 반응 메커니즘은 증폭 반응과 동시에 이중 표지된 리포터 분자를 생성하며 증폭 후 처리를 최소화할 수도 있다.
적합한 RPA 템플릿을 선택하고 프라이머 및 프로브를 디자인하기 위해 TwistAmp ™ 반응 키트 매뉴얼에 제안된 기준을 참조할 수 있다. 요약하면, (1) DNA 템플릿의 GC 함량은 40 % ~ 60 % 사이이고 긴 호모 폴리머 트랙, 직접/반복된 반복 및 palindromes을 피해야 하며, (2) 프라이머의 GC 함량은 30 %와 70 % 사이이고, 5 '말단에서 구아닌의 긴 흔적을 피해야 하지만 시티딘을 권장하고 (3) 개선된 성능을 위해 프라이머의 3'- 말단에서 구아닌 및 시티딘을 권장된다.
이들 올리고 뉴클레오티드 중 용융 온도, 혼성화 안정성, 2 차 구조 및 이량체 형성을 평가할 것을 권장한다. BioEdit 버전 7.0. Primer3, UNAFold, mFOLD, PrimerQuest 소프트웨어 및 PrimerQuest 소프트웨어 그리고 RPA 올리고 뉴클레오티드 특성을 분석하기 위해 Visual OMP (DNA 소프트웨어, MI, USA)를 사용할 수 있다.
프라이머 이량체 형성을 피하는 효과적인 방법은 SAMRS 뉴클레오타이드 2-아미노푸린-2' 데옥시리보시드(A*), 2'-데옥시-2-티오티미딘 (T*), 프라이머에 2'- 데옥시이노신(G*) 및 N4-틸-2'- 데옥시시티딘(C*)이 포함되어 있다.
이 SAMRS 뉴클레오티드를 포함하면 자연 A와 T 및 G와C이 수소 결합쌍이며 자연 T와 SAMRS A* 쌍, 자연 A와 SAMRS T* 쌍, 자연 C와 SAMRS G* 쌍, 자연 G와 SAMRS C* 쌍은 유사하나, SAMRS A*와 SAMRS G* 뉴클레오티드는 SAMRS T* 및 SAMRS C* 뉴클레오티드는 각각 농도에 상관없이 핵산 증폭 동안 프라이머 이량체를 형성하지 못하여 원하지 않는 생성물을 피할 수 있다. 이러한 SAMRS 시스템은 RPA 인위적인 요소를 성공적으로 제거할 수 있다.
종합적으로 말하면, RPA 올리고 뉴클레오티드 후보 물질의 silico 최적 디자인을 위한 출발점으로서 설명된 지침을 따르는 것으로 충분하다. 결과적인 후보 물질은 RPA 반응을 통해 선별되어 특정 RPA 분석에 적용 가능한 바람직한 최종 올리고 뉴클레오티드 세트를 선택해야 한다. TwistDx ™ Ltd는 5 개의 정방향 및 역방향 프라이머와 3 개의 프로브를 설계할 것을 권장한다.
3-2. RPA 반응의 고려 요소
RPA 반응의 최적의 효율과 분석 감도를 달성하기 위해, 표적 서열의 선택 및 상응하는 프라이머 및 프로브의 설계가 중요하나, RPA 반응 동안의 반응 온도 및 교반은 가장 중요한 기여 외부 요인일 수 있다.
본 발명의 권장 RPA 반응 온도는 37℃~42℃이며 체온을 사용하여 RPA 반응을 수행할 수 있으며 현장에서 유리하게 사용할 수도 있다. 그러나 권장 범위를 벗어난 RPA 반응 온도를 연구할 수도 있다. 가장 큰 온도 범위는 15℃와 50℃ 사이이다. 양성 결과를 생성하기 위한 최적 반응 온도는 30℃보다 커야 한다. 그러나 RPA 증폭 후에도 25℃의 낮은 온도에서도 여전히 양의 신호를 생성할 수 있다. 또한, 대기 온도가 RPA 반응에도 영향을 미친다는 것을 보여 주었다. 대기 온도가 10℃ 미만이면 RPA 반응이 불안정하지만 반응 시간을 연장하면 긍정적인 결과를 얻을 수 있다. 이러한 반응 온도 범위 연구에 따르면 RPA 반응에는 정확한 온도 제어가 필요하지 않다.
반응 온도가 RPA 효소에 적합한 작업 환경을 제공하는 동안, 진동 또는 교반은 균질 반응 용액에서 RPA 성분 사이의 상호 작용을 증가시킨다. 일반적으로 RPA 반응을 위해 두 단계의 혼합 단계를 수행할 수 있다.
하나는 공정의 시작 단계에 있고 다른 하나는 반응의 4분 후이다. 전자는 모든 RPA 시약을 혼합하여 반응을 개시하는 것이고, 후자는 반응 시약의 국부적 고갈을 방지하여 반응 속도를 증가시키는 것이다. 또한, 일정한 교반을 통한 RPA 반응 속도를 더욱 가속화시키고, 보다 안정한 양성 결과를 달성하며, 특히 주형 농도가 검출 한계에 근접할 때 감도를 개선시킬 수 있다. 또한, 마이크로 방울의 지속적인 혼합이 더 빠른 결과 시간, 형광 증가 및 감도 개선을 가져 올 수도 있다.
사용자 간 변동을 제거하고 일관된 정량적 실험 결과를 얻기 위해 수동 교반보다 기계적 교반이 더 낫다. 그러나 이상적인 교반 정도는 분석법에 따라 다를 수 있다. 교반 또는 진동을 사용할 수 없는 경우, 증폭에 필요한 시약과 올리고뉴클레오티드 간의 상호 작용의 감소를 방지하기 위해, 반응 부피의 감소(예 : 50 μL에서 5 μL) 방법으로 진동 효과를 보완할 수도 있다.
온도 및 교반 외에도 주형 DNA와 프라이머 또는 RPA 프로브의 비특이적 결합, 억제제 및 비표적 DNA에 대한 문제는 효율적이고 민감한 RPA 반응에 중요한 요소이다. RPA는 비특이적 결합, 저해제 및 비표적 DNA의 존재에도 불구하고 중합반응이 일어나는 능력이 있으며 이를 “내성”이라고 한다,
비특이적 결합 범위는 주형 DNA와 프라이머 또는 RPA 프로브 결합 부위에 걸친 9개의 뉴클레오티드 염기쌍까지 허용한다. 프라이머의 5'-말단 및 중앙 부위는 RPA 반응에 경미한 영향을 주지만 프라이머의 3'- 말단에 위치한 비특이적 결합은 반응에 크게 영향을 미친다. 이것은 중합효소가 프라이머와 RPA 프로브를 연장하기 때문에 RPA 반응 메커니즘과 일치한다. 3'-말단에서 이러한 비특이적 결합에 대한 유용한 적용은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 구별하는 것이다.
DNA 중합효소 연장은 프라이머의 3'-말단 염기가 특이적 결합일 때 효과적이었으나, DNA 중합효소 연장은 3'-말단 염기가 비특이적 결합일 때 비효율적이거나 발생하지 않는. 또한, 일반적인 RPA 프라이머의 3'- 말단 이외의 비특이적 결합 내성은 보존된 긴 표적 영역에 있는 높은 다형성 표적에 대한 프라이머 디자인에 약간의 유연성을 가능하게 하여 유리할 수 있다.
반대로, RPA의 이러한 비특이적 결합 내성의 문제는 중합효소 연장이 비특이적 결합에 의한 비표적 DNA를 주형으로 증폭산물의 제조 및 검출 가능성이 생긴다.
임상 또는 현장 시료를 테스트할 때, 수많은 물질(예: 억제제)이 존재하거나 시료 준비 및 처리 단계 중에 도입되어 잠재적으로 핵산 증폭을 방해할 수 있다. RPA는 (1) 헤모글로빈 (20 g L-1), 헤파린 (0.5 U) 및 소변 (1.25 %)을 포함하여 RPA 반응에 영향을 미치지 않아 특정 PCR 억제제를 견딜 수 있는 것으로 입증되었다; 및 (2) 헤모글로빈 (50g L-1), 에탄올 (4 % v/v) 및 소변 (최대 5 %). (0.05 % v/v) 및 소변 (10 %) 또한 DNA 주형 농도가 검출 한계에 가까울 때 RPA 반응이 억제제에 더 취약한 것으로 관찰되었다. 그러나, RPA 반응은 SDS (0.05 % v/v) 및 소변 (10 %)의 존재 하에서 완전히 억제되었다.
RPA는 억제제 외에 비표적 DNA가 있을 때에도 표적 핵산을 증폭할 수 있다. 400ng의 비표적 인간 DNA가 존재할 때 RPA 반응이 유의하게 억제되지만 200ng의 비표적 인간 DNA가 존재할 때 훨씬 덜 억제된다. *?**?*
4. 등온 증폭 산물의 검출
본 발명에서 표적핵산의 등온 증폭산물을 검출하는 단계(S300)는 전기영동, 비색반응, 염기서열결정, 혼성화 및 PCR를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 할 수 있다.
상기 비색반응은 나노 금 입자가 이중가닥 핵산이 있는 용액에 0.2 M NaCl을 포함하는 염과 함께 첨가할 때 발생하는 색상의 변화가 있다.본 색상의 변화는 이중가닥 DNA의 양과 관계가 있다.
상기 비색반응은 인터킬레이팅 제제를 사용하는데, SYBR 그린, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열, TOTO계열, 악티노마이신, 아드리아마이신, 안트라센, 벤조피렌, 프로피디움 디이오다이드-인터트위닝(propidium diiodide-intertwining), 디스타마이신, 네트롭신과 아크리딘, 프소랄렌, 베르베린(berberine), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신, 독소루비신, 탈리도마이신, 시아닌 염료 및 LDS 751를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명에서 표적핵산의 등온 증폭산물을 혼성화로 검출하기 위해, 본 발명의 단계 S200의 등온 증폭 반응은 표지물질을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 증폭산물의 내부를 표지하거나 또는, 표지물질이 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭산물을 표지할 수 있다.
상기 표지물질은 바이오틴, 형광 나노입자, 양자점(quantum dot: Qdot), 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 금속 나노입자, 형광 염료, 방사성 동위원소, 효소, 다양한 표색 표지, 자성 또는 상자성 표지(예를 들어, 자성 및/또는 상자성 나노입자), 스핀 표지, 방사선-비투과 표지(radio-opaque label)를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 하나 이상일 수 있다.
다양한 다운 스트림 RPA 적용(능동유동 종이 어레이 여과, 측면 유동 스트립 검출 및 효소 연결 면역 흡착 분석)을 위한 중요한 과정 중 하나는 RPA 반응 동안 신호가 발생하는 표적 프로브를 증폭 과정에서 RPA 분석의 생성 신호를 포착, 검출 및/또는 보조할 수 있도록 하는 것이다.
이러한 핵산 표지는 5'-말단 표지된 프라이머를 사용하여 말단에 또는 내부적으로 표지된 뉴클레오티드를 통해 달성될 수 있다. 핵산 표지에 사용된 표지는 형광물(예: 플루오레세인), 리간드(예: 비오틴) 또는 뉴클레오티드의 짧은 세그먼트(오버행)이다. RPA를 사용한 대부분의 말단 핵산 표지는 5'- 표지된 정방향 및 역방향 프라이머 모두를 사용하므로, 표적 프로브는 다운 스트림 분석에서 상응하는 인식 분자에 의해 포획 및 검출될 수 있는 이중-표지를 갖는다.
본 발명에서 RPA 중 내부 핵산 표지의 경우, 반응 혼합물에 주로 digoxigenin-dUTP를 사용하여 표지된 뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 이는 중합 효소 연장 동안 dTTP를 무작위로 대체하여 표지된 표적 프로브를 생성한다. 더 많은 표지가 단일 핵산 주형에 통합되어, 다운 스트림 분석에서 더 많은 결합 기회를 갖는다.
본 발명의 단계 S300의 다중분석의 다운 스트림 방법이 샌드위치 분석에 사용될 때 말단 표지가 더 나은 선택이 될 수 있으며, 말단 표지를 통해 통합된 2개의 라벨이 더 멀리 떨어져 있기 때문에(표적 프로브의 길이로 분리됨), 표지물질이 너무 가까이 있으면 바인딩의 입체 장애를 방지할 수 있다.
상기 언급된 요소는 RPA 반응 전 및 동안에 모두 결정할 수 있다. 또한, 반응 후 절차는 성공적인 RPA 신호 검출에 중요하며, RPA 증폭산물의 의도된 용도에 따라 결정할 수 있다. RPA 증폭산물의 생성은 재조합효소 증폭 후 중합효소 증폭에 의해 결정된다.
본 발명의 중합효소 증폭은 기본 RPA 프라이밍된 주형 DNA에 대한 DNA 중합효소 활성으로 인해 증폭산물이 생성된다.
또한, 본 발명의 중합효소 증폭은 TwistAmp™ nfo 프라이밍된 주형 DNA에 대한 DNA 중합효소 변위 활성으로 인해 두 가지 유형의 증폭산물이 생성된다. 프로브와 프라이머들에 의해 생성되고 상대적으로 길이가 짧은 증폭산물이며, 반면 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 생성된 것은 길이가 긴 증폭산물이다.
본 발명에서 상기 단계 S200의 표지물질이 있는 증폭산물로부터 단일가닥 표적 프로브를 포함하는 증폭용액을 제조하는 단계(S400); 상기 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 측면유동 스트립 장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500); 상기 종이 어레이에 있는 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 단계(S700);를 포함ㄹ할 수 있다.
바람직하게, 상기 두 개의 증폭산물은 표적 프로브로 종이에 있는 포획 프로브와 상보적인 결합을 하고 신호를 발생하여 스폿을 형성할 수 있다.
RPA 증폭산물은 초기에 단백질 및 군집 시약과 복합체를 형성하며, 생성된 DNA-단백질-군집 시약 복합체는 검출을 위해 RPA 반응용액의 직접적인 사용을 방해한다. 이는 이러한 복합체가 증폭산물의 적절한 이동에 영향을 미치기 때문이다.
검출 전에 RPA 증폭산물을 처리하는 여러 방법에는 가열에 의한 단백질 변성(65℃ 또는 95℃에서 10 분 동안), 세제 처리(예: 나트륨 도데실설페이트, SDS), 효소 소화(Proteinase K 처리) 및 고속 원심분리를 통한 단백질 침전 및 상업용 DNA 세척 키트를 사용한 정제가 포함할 수도 있다.
측면 유동 스트립 감지에서도 마찬가지로, RPA 증폭산물의 직접 사용이 가능하지만 스트립에서 실행하기 전에 증폭산물을 실행 버퍼 (예: 1/100 희석)로 희석하여 (1) 모세관 현상을 향상시키고 (2) "고스트 밴드" 효과를 방지해야 한다.
RPA 시약에서 5.5 % 고 분자량 PEG (35kDa)를 6.5 % 저 분자량 PEG (3kDa)로 대체하여 측면 유동 스트립의 점액상 모세관 문제를 완화할 수 있다.
측면 유동 스트립 검출을 위한 희석 단계는 완화하는 방법일 수도 있다. 측면 유동 스트립의 시험 라인에 결합하기 위한, RPA 증폭산물이 PEG와 밀접한 관련으로 형성되는“RPA 소구체”(핵산 증폭의 핵심인 국소화된 RPA 시약을 포함하는 군집체)에서 사용할 수 없을 수도 있다.
본 발명의 단계 300의 정량적 등온 증폭은 시스템에서 단일 표적핵산의 양을 측정하나, 본 발명의 단계 300의 다중적 등온 증폭 검사는 다양한 표적핵산의 평가로 생물학적 시스템에 대한 이해도를 높이거나 질병 검출 및 모니터링에 중요할 수 있다.
본 발명의 단계 300의 다중적 등온 증폭 검사는 정의된 분석 처리 시간 내에 단일 검사와 비교하여 시료 입력 당 결과 출력을 크게 증가시키기 때문에 시간과 검사의 정확성을 고려해야 한다.
본 발명의 단계 300의 다중적 등온 증폭 반응은 단일 튜브 (균질) 또는 병렬 방식(때로는 이종을 나타냄)으로 진행될 수 있다. 단일튜브 다중 RPA는 단일 또는 다중 표적핵산 주형을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 단계 300의 다중적 등온 증폭 반응은 반응 공간과 부피를 모두 절약할 수 있다. 다중능을 증가시키는 것은 매우 어려운 과정일 수 있다. 단일 표적핵산 주형을 사용하는 경우, 다중능은 주로 특정 길이의 염기서열 내에서 다수의 표적핵산을 수용하는 능력에 의해 제한될 수 있다.
본 발명의 다중 표적핵산 주형을 사용할 때 주된 제한 요소는 다수의 올리고뉴클레오티드(프라이머, 프로브 및 핵산 주형) 사이의 비특이적 상호 작용이다.
상기 제한을 완화하는 방법으로 1단계 RPA 및 2단계 LAMP 방법을 사용할 수도 있다. 즉, 1 단계 반응에서 생성된 정확한 RPA 증폭산물이 거의 없고 동시에 생성된 비특이적 증폭산물이 있는 경우에도 불구하고, 이들 올바른 RPA 증폭산물은 2차 LAMP를 통해 구체적으로 더 증폭하는 것이다. 2단계 LAMP 반응은은 여전히 1 단계 RPA 반응에서 프라이머 농도의 용량에 의해 제한된다.
본 발명에서 다증화를 극대화하기 위해, 다수의 올리고뉴클레오티드(프라이머, 프로브 및 핵산 주형) 사이의 비특이적 상호 작용을 최소화할 수 있다.
바람직하게, 상기 목적을 달성하고 프라이머 이량화를 최소화하는 self-avoiding molecular recognition systems (SAMRS)을 사용할 수도 있다.
SAMRS 뉴클레오타이드는 2-아미노푸린-2' 데옥시리보시드 (A*), 2'-데옥시 -2- 티오티미딘 (T*), 2'-데옥시이노신 (G*) 및 N4-틸-2'- 데옥시시티딘 (C*) 2-aminopurine-2′deoxyriboside (A*), 2′-deoxy-2-thiothymidine (T*), 2′-deoxyinosine (G*) and N4-thyl-2′-deoxycytidine (C*)이다.
SAMRS 뉴클레오티드를 포함하면 자연적 수소 결합단위는 A와 T 쌍 및 G와 C 쌍이며, 자연 T와 SAMRS A* 쌍, 자연 A와 SAMRS T* 쌍, 자연 C와 SAMRS G* 쌍, 자연 G와 SAMRS C* 쌍과 유사하지만, SAMRS A*와 SAMRS G* 뉴클레오티드는 SAMRS T*와 SAMRS C* 뉴클레오티드는 각각 농도에 상관없이 핵산 증폭 동안 프라이머 이량체로 인한 원하지 않는 생성물을 피할 수 있다. 따라서 SAMRS 시스템은 프라이머 이량체의 형성에 따른 인위적인 등온 증폭 산물을 성공적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 단일 튜브 다중 증폭과 달리, 다중 등온 증폭을 병렬 방식으로 수행하면 다중 올리고뉴클레오티드 간의 비특이적 상호 작용을 피할 수도 있다. 이는 (1) 각각의 단일검사 증폭 반응이 서로 옆에 발생하지만 서로 독립적 (균질 분석으로 수행됨) 또는 (2) 증폭 반응이 비대칭적인 방식(이종성 분석)으로 수행되기 때문이다. 등온 증폭 프라이머는 매트릭스 상에 미리 고정된 반면, 다른 등온 증폭 프라이머는 DNA 주형 (및 프로브)과 함께 용액에 남아 있으며, 이러한 방식으로 등온 증폭 증폭산물만이 검출을 위해 매트릭스 상에 포획될 것이다.
균질 분석 형식을 채택한 병렬 RPA는 용액 또는 고체상으로 수행될 수 있다. 동종 분석 형식을 채택하는 병렬 등온 증폭과 달리, 이종 분석을 채택하는 병렬 다중 등온 증폭은 고체 표면에서만 발생한다. 이러한 분석의 대부분은 마이크로 어레이에서 비대칭 방식으로 다중 등온 증폭을 수행할 수 있다.
다중 등온 증폭은 병렬 방식으로 훨씬 더 높은 분석 처리량을 가지며, 교차 반응 (올리고 뉴클레오티드 중에서) 문제를 해결하고, 단일 튜브 다중 등온 증폭에 비해 더 높은 다중검사 용량을 갖을 수 있다.
병렬 방식 다중 등온 증폭 다중 정도는 (1) 특정 검출을 가능하게 하는 다수의 핵산 주형에 접합된 이용 가능한 고유 표직의 수; (2) 반응 표면의 크기; 및 (3) 효과적인 반응을 허용하는 스폿의 최소 부피에 의해 제한될 수 있다.
5. 능동 유동 종이 어레이 여과(AFPF)
본 발명에서 단일 튜브 다증화를 극대화하기 위해, 등온 증폭 반응에서 군집 시약 등의 다양한 원인에 따른 등온 증폭 산물 검출에 발생하는 노이즈를 최소화하는 핵산 혼성화 방법을 기반으로 한 능동유동 종이 어레이 여과를 실시할 수도 있다.
상기 핵산 혼성화 방법은 등온 증폭 반응물에 있는 표적 프로브의 염기서열을 인지하여 상보적 결합을 하는 포획 프로브 방법으로 즉, 다중의 표적 프로브의 염기서열에 100% 상보적인 염기서열로 구성된 포획 프로브로 종이 어레이를 제조하여 실시할 수 있다.
본 발명의 등온 증폭 산물의 핵산 혼성화 방법은 능동유동 종이 어레이 여과(AFPF) 장치의 AFPF 플랫폼에서 실시하는 것일 수 있다.
본 발명에서 능동유동 종이 어레이 여과(AFPF) 장치의 AFPF 플랫폼을 최적화하기 위해 고려할 필요가 있는 다수의 요소가 있다.
AFPF의 종이 어레이의 면적은 크지만 소량의 반응용액을 처리하여 종이 어레이에 있는 감지 지점의 크기를 줄일 수 있다. 이것은 종이 어레이에 공간적으로 독립적인 스폿을 생성하는 서로 다른 포획 프로브들을 통합함으로써 다중 검출을 가능하게 한다.
유속은 능동유동으로 분석을 수행하는 데 필요한 시간에 영향을 미치기 때문에 중요한 요소이다. 본 발명의 AFPF 플랫폼에서, 시료 유속을 조절하여 단위 면적당 시료 부피를 직접 증가시켜 AFPF 기반 분석의 감도를 향상시킬 수 있다. AFPF 장치의 유로는 LFI에서 수 센티미터의 유로와 비교하여 막의 두께로 극적으로 감소될 수 있다. 이는 ㎛ 미만의 포어 크기를 갖는 막의 이용을 가능하게 한다. 결과적으로 나노 포어 막의 사용이 AFPF 분석의 감도를 상당히 개선시킬 수 있다.
5-1. AFPF의 분석
본 발명에서 제안된 AFPF 포맷의 능동유동 종이 어레이 여과 장치의 원리는 다음과 같다. 종이 어레이의 다공성 구조물은 이송 과정을 돕기 위해 구조이다. 포어 반경(d)을 갖는 다공성 물질에서, 액체는 막의 검출 가능한 두께인 유량의 속도 및 감지 길이(Ls)로 막을 통해 흐른다. 또한, 막 표면은 상부 표면 (Av), 예를 들어 반경 (Rm)을 갖는 원형인 제 1 표면이고; 제 2 표면은 막 두께로 분리된 막의 바닥 (관찰할 수 없는) 측에 있다. 다공성 구조물의 내부 표면은 포획 프로브로 코팅된 부분이다. 표적 프로브의 확산도는 D이고, 단일가닥핵산-단일가닥핵산 쌍은결합 상수 및 질량 전달 계수를 갖는다.
AFPF 시스템에는 두 가지 중요한 요소가 있다. 첫 번째는 흡착 속도와 운반 속도의 관계를 나타내는 Damkohler 수 (Da)이다, 두 번째는 대류 속도와 확산 속도를 비교하는 데 사용하는 Peclet 수 (Pe)이다.
저농도로 표적 프로브를 포획하기 위해, 2 가지 조건이 중요하다. 포획 프로브와 표적 프로브 결합 속도가 감지표면으로의 표적 프로브 분자 이동 속도보다 빠른 효율적인 포획 반응(Da≫1)을 할 수 있다. 다공성 구조의. 유속이 높으면 이동 속도가 증가하고 Da가 감소하며 포집 효율이 감소한다. 그러나 이것은 빠른 결합 속도를 이용하여 상쇄할 수 있다. 포획 프로브 높은 밀도가 저농도 표적 프로브 검출에 중점을 두어 포획이 Da >> 1을 보장하기에 충분히 빠르다고 할 수 있다. 비확산-제한 검정 (Pe <1)은 전달된 모든 표적 프로브는 능동유동으로 감지 영역을 통과하기 전에 감지표면으로 확산할 수 있다. Pe <1을 유지하면 > 90 %의 캡처 효율이다. 포어 크기를 감소시키는 것은 AFPF에 의해 더 많은 표적 프로브가 검출될 수 있도록 최대 유량 속도를 증가시키는 효과적인 방법이다. 이론적 분석에 기초하여, 높은 유속 속도 및 작은 막 세공 크기를 갖는 장치에 대한 AFPF 설계가 분석 감도를 개선시킬 수 있다.
5-2. AFPF 플랫폼의 구성
장치의 AFPF 플랫폼은 스테인레스 스틸 필터 홀더 (Swinny Filter Holder 13 mm, Millipore, MA, USA)에 캡슐화된 13 mm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크 (실제 통과 면적은 10 mm 직경)을 포함할 수 있다. 액체 통로를 밀봉하고 누출을 방지하기 위해 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 개스킷 및 O-링이 각각 종이 디스크의 하부 및 상부에 배치할 수 있다. 주사기 및 펌프 (New Era Pump Systems, Inc., NY, USA)는 제어된 유량 속도로 종이 디스크를 통해 시료 및 시약을 능동 유동할 수 있다.
상업적인 스테인레스 스틸 디스크 지지체가 사용된 능동 유동 시스템에서, 0.1 ㎛보다 큰 포어 크기를 갖는 막에서 큰 신호 변화가 있다. 이 변형은 스테인레스 스틸 지지대의 유연성으로 인해 부분적으로 발생할 수도 있다. 따라서, 지지체는 딥 에칭 법을 사용하여 스테인리스보다 높은 영률을 갖는 실리콘으로 제조할 수 있다. 실리콘 그리드는 변형이 적은 유동에 대해 막을 기계적으로 지지하여 신호 변화를 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 제공된 임의의 장치는 실리콘 그리드를 포함하여 스테인레스 스틸보다 높은 영률을 갖는 재료로 형성된 지지체를 사용할 수 있다.
장치의 종이 어레이는 높은 단일가닥 핵산-결합 능력 및 작은 포어 크기의 범위에서의 이용 가능성으로 인해 니트로셀룰로오스 막을 사용하여 제조될 수 있다. 4 개의 니트로셀룰로오스 막, Amersham Protran 0.1 ㎛ NC, 0.2 ㎛ NC, 0.45 ㎛ NC 및 Whatman AE98 (포어 크기 5 ㎛) (GE Healthcare Life Sciences, PA, USA)을 시험하고 비교하였다. 막은 CO2 레이저 (VersaLaser 2.30, Universal Laser Systems, AZ, USA)를 사용하여 13 mm 직경 디스크로 절단할 수 있다.
포획 프로브가 고정되는 종이 어레이는 1 나노 리터의 방울 부피를 갖는 마이크로 솔레노이드 로봇 디스펜서 (AD1520 마이크로 디스펜서, 미국)를 사용하여 종이 디스크 상에 분배되어, 직경이 220 ㎛인 원형 고정 부위를 제조할 수 있다.
5-3. AFPF 작동 워크 플로우
표적 프로브는 바이오틴이 표지된 단일가닥 핵산일 수 있다. 결과적으로, 종이 어레이의 포획 프로브 고정 부위는 동일한 포획 프로브가 표적 프로브의 포획 및 검출에 사용될 수 있다.
AFPF 워크플로우에서 바이오틴이 표지된 표적 프로브를 종이 어레이의 포획 프로브에 결합시키고, Streptavidin Coated AuNP를 시각화 시약로 사용하여 스폿을 형성할 수 있다. Streptavidin Coated AuNP 원액은 40 nm 직경 콜로이드 금의 수동 흡수를 통해 제조할 수 있다. 세척한 후, Streptavidin Coated AuNP 용액을 540 nm에서 OD = 9로 농축하며, 이는 1.5 nM의 농도와 동일하다. 표적 프로브 및 Streptavidin Coated AuNP가 AuNP-표적-포획 프로브 복합체는 형성하여 종이 어레이에서 스폿을 형성할 수 있다.
실험 후, 막을 탁상 스캐너로 스캔하여 금 나노 입자에 의해 생성된 비색 신호를 확인할 수 있다. AFPF 테스트 절차는 30 분 이내에 완료할 수 있다.
먼저, 막을 평형화하기 위해 막을 통해 1 ml의 혼성화 용액을 능동유동할 수 있다.
순차적 프로토콜 : 표적 프로브 스파이크 분석 완충액 용액을 장치에 능동 유동으로 표적 프로브가 종이 어레이의 포획 프로브에 결합되도록 할 수 있다. Streptavidin Coated AuNP 용액을 장치에 능동 유동으로 처리하여 Streptavidin Coated AuNP는 이미 막의 포획 프로브에 포획된 표적 프로브에 결합하도록 할 수 있다.
예비 혼합 프로토콜 : 표적 프로브가 스파이킹된 분석 완충액을 Streptavidin Coated AuNP와 10 분간 예비 혼합할 수 있다. 이 예비 혼합 단계는 Streptavidin Coated AuNP가 유리 표적 프로브를 용액에서 결합하여 복합체를 형성하는 추가 시간을 제공할 수 있다. 이어서, 이 혼합물을 장치에 능동 유동 처리하며 종이 어레이의 포획 프로브는 Streptavidin Coated AuNP-표적 프로브 복합체를 포획할 수 있다.
시료를 처리한 후, 막을 통해 1.5 ml 블랭크 분석 완충액을 능동유동으로 종이 어레이를을 세척하여 비특이적이거나 느슨하게 결합된 단일가닥핵산 및 과량의 Streptavidin Coated AuNP를 제거할 수 있다. AFPF 장치를 해체하고 종이 어레이는 탁상용 스캐너를 사용하여 스캔하기 전에 빠른 건조 단계로서 여과지 (Whatman 정성 여과지, Grade 1, GE Healthcare Life Sciences, PA, USA)에 5분 동안 처리할 수 있다. 전체 AFPF 테스트 프로세스는 30분 이내에 완료할 수 있다.
5-4. AFPF 반응
초기 분석은 더 작은 세공 크기 및 높은 시료 유속을 갖는 종이 어레이를 포함하는 AFPF가 전통적인 LFI보다 우수한 감도를 제공할 수 있다.
순차적 접근법은 스폿은 종이 어레이의 포획 프로브에 의한 표적 프로브 포획에 의존하고, 이어서 Streptavidin Coated AuNP 용액이 장치에 능동 유동할 때 포획된 표적 프로브에 Streptavidin Coated AuNP의 결합이 이어졌다.
예비 혼합 접근법은 표적 프로브는 포획되기 전에 Streptavidin Coated AuNP와 상호 작용 및 결합하고, Streptavidin Coated AuNP-표적 프로브와 종이 어레이의 포획 프로브가 결합하여 종이 어레이의 스폿을 형성하는 과정을 제공할 수 있다.
상기 포획 프로브가 고정된 종이 어레이에 표적 프로브를 스파이킹한 혼성화 완충액을 첨가하고 분석한 결과, 예비 혼합 프로토콜은 순차적 프로토콜보다 강한 신호를 갖는 스폿 위치를 산출할 수 있다. 예비 혼합 접근법의 개선된 감도는 표면 반응과 비교할 때 표적 프로브와 Streptavidin Coated AuNP 사이의 결합 시간의 증가 및 액체 반응보다 우수한 효율에 기인한다고 여겨진다. 모든 후속 실험은 예비 혼합 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
바이오틴이 표지된 표적 프로브의 검출은 나노 다공성 니트로셀룰로스 막에 통합 장치를 사용하여 Streptavidin Coated AuNP 처리로 비색 신호를 생성한다. AFPF 장치기술은 표적 프로브 탐지를 위한 단순하고 소형화된 빠른(30분 미만 시간) 플랫폼을 제공할 수 있다.
유량의 영향을 테스트할 때, 일반적인 실험 방식은 시료 부피를 일정하게 유지하고 유량을 변경하는 것이다. 이는 제한된 시료량을 높은 처리 속도로 분석을 수행하는 데 효과적할 수 있다. 유량이 증가함에 따라 검출 지점으로부터의 신호가 향상할 수 있다.
막의 다공성 구조는 다발 나노 튜브로 모델링되었고, 유동 속도와 신호 강도 사이의 이러한 관계는 표면 면역 센서를 통한 유동에 대한 고전적 모델로 설명할 수 있다. 유량이 증가함에 따라, 표적 프로브가 종이 어레이의 포획 프로브에 의해 포획될 수 있는 스폿 구역의 두께가 감소할 수 있다.. 그러나, 증가된 유량은 또한 더 많은 시료를 막으로 전달하고, 이는 감소된 스폿 구역 두께로 인한 결합 손실을 상쇄할 수 있다. AFPF 장치는 고정된 포획 프로브를 갖는 영역을 통해 가압된 시료만이 검출할 수 있다. 다른 지역을 통과한 나머지 시료는 낭비할 수 있다. 따라서, 검출 영역으로 전달되는 시료의 양을 결정하는 것은 전체 시료 부피가 아니라 단위 면적당 시료 부피이다. 단위 면적당 시료 부피가 클수록 포획 프로브에 의해 포획될 수 있는 표적 프로브의 양이 더 많아진다. AFPF 장치는 단위 면적당 훨씬 더 많은 시료량을 갖어 결과적으로 AFPF의 감도가 향상할 수 있다.
막에 걸친 평균 변동계수는 10%인 것으로 계산되었다. 여과지 홀더 내부의 유동 프로파일을 조사하기 위해 유체 시뮬레이션을 수행하고, 막에 걸친 균일성을 확인할 수 있다..
특히, Si 지지체를 사용할 때 높은 변동계수 값 (변동계수> 0.85)은 더 큰 포어 막에서도 관찰되지 않을 수 있다.. 제조된 Si 그리드 지지대는 상업적으로 이용 가능한 스테인레스 스틸 그리드보다 높은 영률(Young Modulus)을 가질 수 있다. 변형에 덜 영향을 받아 불균일한 유동이 발생하는 것을 방지할 수 있다.
이론적 모델에 기초하여 예측되고 AFPF의 이점은 주로 2 개의 요인, 즉 단위 면적당 시료 부피 및 막 포어 크기로부터 발생할 수 있다.
기존의 LFI는 모세관 력에 의존하여 반응용액을 긴 막(~ 40mm)을 통해 운반하는데, 이는 막 포어 크기에 제한을 준다. LFI 막 포어 크기의 일반적인 범위는 3~12㎛이다. 그러나, AFPF는 서브 마이크론 포어 크기를 갖는 막이 사용될 수 있도록 짧은 막 유동 경로(~130 ㎛)를 갖는다. 더 작은 포어 크기는 다공성 구조물 내부에 더 많은 결합 부위를 생성하는 더 높은 표적 프로브 로딩 용량을 제공한다. 또한 포어 크기가 작을수록 표적 프로브가 막 표면상의 포획 프로브에 의해 포획되는 필요한 확산 거리를 감소시킨다. LFI 시스템에서 막 포어 크기를 감소시키는 것이 분석 감도를 증가시키는 효과적인 방법일 수 있다. 이러한 이유로, 0.1 ㎛ 포어 크기를 갖는 니트로셀룰로오스 막을 표적 프로브 분석을 위한 최적화된 기질로 선택할 수 있다.
더 우수한 감도를 얻는 것을 방해하는 주요 장애물 중 하나는 낮은 Streptavidin Coated AuNP 농도일 수 있다. 현재 AFPF는 단위 면적당 높은 시료 량을 달성하기 위해 큰 총 시료 량을 필요로 한다. 대량의 시료를 차례로 사용하려면 결합 효율을 높이기 위해 상당한 양의 표지된 나노 입자가 필요하다. 이 문제를 해결하기 위해 한 가지 가능한 해결책은 단위당 높은 시료량을 유지하면서 시료의 총량을 줄이는 것이다. 이에 대한 하나의 접근법은 더 작은 표면적을 갖는 소형화된 화상 장치를 사용하는 것이다.
AuNP에 의한 스폿의 신호를 증강하기 위해 추가적으로 나노 은을 첨가할 수도 있다.
상기 화상 장치는는 서로 구별될 수 있는 많은 스폿, 30분 미만의 분석 시간 및 일반적인 탁상용 스캐너로 금 나노 입자 매개 비색 판독할 수 있어야 한다.
5-5. 화상 처리 및 데이터 분석
건조 처리 후, AFPF의 종이 어레이를 48 비트 RGB를 갖는 스캐너 (CanonScan 9000F II) 및 Scan IJ Utility (CanonScan의 기본 소프트웨어)로 스캔할 수 있다. 2400dpi 해상도가 압축되지 않은 TIFF 파일 형식으로 내보낸다. 48 비트 RGB 이미지는 Matlab (매사추세츠, MA, USA)의 내장 함수 rgb2gray를 사용하여 16 비트 그레이 스케일 이미지로 변환한다. 결과 이미지를 ImageJ로 가져 왔고, 스폿은 마이크로 어레이 그리드를 사용하여 분석되어 로컬 배경을 빼는 스폿에서 평균 그레이 스케일 값을 계산한다. 데이터 처리 및 분석은 Excel 2016 (Microsoft, WA, USA)을 사용하여 수행한다.
6. 핵산 혼성화 방식 AFPF
하나 이상의 표적 핵산의 신속한 검출은 등온 증폭 산물, 능동 유동 종이 여과(AFPF) 및 핵산 혼성화 분석의 조합으로 실시할 수 있다. 설계한 프라이머 세트 및 표적 특이적 포획 프로브를 사용하여 감염 초기에 유사 임상증상을 제공하는 병원체를 검출할 수 있는지 확인할 수 있다.
AFPF의 종이 어레이에서 표적 프로브와 포획 프로브의 반응 단계는 (i) 표지물질이 있는 표적 프로브의 염기서열과 포획 프로브의 염기서열의 상보적 결합으로 형성되는 복합체를 이용하는 핵산 혼성화 방법, 및 (ii) 표적 프로브의 태그와 포획 프로브인 리간드가 형성하는 표적-태그-리간드 복합체를 이용하는 분자 인코드 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 한 방법으로 실시할 수도 있다.
본 발명의 핵산 혼성화 방법에서 종이 어레이는 포획 프로브가 단순하게 핵산 단일 가닥이거나 한쪽 말단에 아민기와 같은 기능기가 부착된 핵산 단일 가닥을 지지체 종이에 부착하여 제조할 수 있다. 반면에 분자 인코드 방법에서 종이 어레이는 표적 프로브에 있는 태그에 상응하는 리간드를 포획 프로브로 종이에 부착하여 제조할 수 있다.
상기 종이는 하나 이상의 재료로 셀룰로스, 섬유유리, 나이트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하 개질된 나일론, 폴리에터 설폰 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종이는 HI-FLOW PLUS(등록상표) 막이다. 또는 종이는 제직 종이로 와트만(Whatman) 종이이다. 와트만 종이는 와트만 S17, 와트만 MF1, 와트만 VF1, 와트만 퓨전(Fusion) 5, 와트만 GF/DVA, 와트만LF1, 와트만 CF1, 및/또는 와트만 CF4이다.
바람직하게, 하나 이상의 표적 핵산에 대해 RPA로 얻어진 증폭산물를 인지하여 결합할 수 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 포획 프로브로 구성된 종이 어레이거나, 또는 하나 이상의 리간드 포획 프로브가 고정된 종이 어레이를 사용하여 하나 이상의 표적 핵산의 다중검사를 달성할 수 있어 RPA와 AFPF의 통합 방법은 다중검사 진단 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명은 등온성 증폭, 핵산 혼성화 및 비색 판독으로 올리고뉴클레오티드 어레이의 고처리량 스크리닝을 연결하는 AFPF으로 구성할 수 있다. 이에 대한 살펴보면 다음과 같다.
본 발명은 바람직하게, 분석 원리는 능동 유동 방식으로 여과 홀더 내의 종이 어레이 상의 포획 프로브 염기서열과 용액상의 표적 프로브 염기서열 사이에 일반적인 단순 확산 혼성화가 아니고 능동-유동 혼성화를 통한 상보적 결합에 기초할 수 있다. 이 홀더 내에서, 용액 내 증폭된 표적 프로브는 니트로셀룰로오스 조각에 고정된 포획 프로브에 결합하고 일반 평판 스캐너를 사용하여 후속 비색 표지 및 검출할 수 있다.
핵산 혼성화에 사용하는 종이 어레이는 핵산 종이 어레이이며, 프로브의 길이 및 특이성, 어닐링 시간, 혼성화 온도 및 완충액 조성과 같은 다수의 요인이 분석 신호에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 다음과 같이 분석 감도를 개선하기 위해 여러 매개 변수를 체계적으로 최적화할 수 있다.
핵산은 UV 조사에 의해 니트로셀룰로오스에 공유적으로 부착될 수 있다. 이들에만 제한적인 것은 아니다. 비표지된 포획 프로브 및 5'-아미노-표지된 포획 프로브를 사용할 수 있다. UV 노출 후의 결과는 표지가 없는 프로브와 5'-아미노-표지된 포획 프로브의 비교한 결과는 후자의 감도가 더 높다. 가교 메커니즘은 아직 완전히 이해되지는 않았지만, 막의 표면에 위치한 것들과 반응하는 DNA 염기 내에서 반응성 작용기의 생성으로 인해 공유 결합이 형성된다. 포획 프로브의 5'- 말단에 스페이서와 결합된 아미노기의 존재는 니트로 셀룰로스에의 고정을 선호하고 프로브가 입체적으로 방해받지 않기 때문에 개선된 혼성화를 가능하게 하여, 분석의 감도를 향상시킨다.
포획 프로브가 고정된 종이 어레이는 사용할 때까지 실온. 또한, 인쇄 버퍼는 신호 대 비표적 값뿐만 아니라 인쇄 조건을 개선하기 위해 첨가제를 보충할 수 있다.
혼성화 성능은 또한 스폿의 형태에 따라 달라지며, 이는 상대 습도, 포획 프로브 밀도, 인쇄 버퍼 및 인쇄 방법과 같은 인쇄 조건의 영향을 받을 수 있다. 유리 슬라이드의 전형적인 DNA 마이크로 어레이 인쇄 공정에서, 방울의 증발 속도를 늦추기 위해 권장되는 상대 습도는 약 50~65 %이다. 그러나, 이 작업에서, 사용하는 지지체 (니트로셀룰로오스)은 높은 상대 습도 조건에 노출될 때 말리는 경향이 있어 인쇄시 어려움이 있다. 결과적으로 상대 습도의 건조기 환경이 필요했으며 35~40 % 범위의 수준이 최적이다.
스폿 형태는 상대 습도 및 방울의 증발을 지연시키는 시약의 첨가에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 포획 프로브는 낮은 상대 습도 수준에서 순수한 TBS 완충액으로 인쇄되었으며, "커피링 효과"가 있다. 이러한 고리 모양의 반점에서, 신호 축적은 DNA 축적으로 인해 가장자리에서 더 높으며, 용매의 증발에 의해 생성 될 수 있으며, 이는 DNA 분자가 유체 유동과 함께 바깥쪽으로 흘러 증발 손실을 보상하게 한다.
낮은 상대 습도에서 글리세롤 20 % 및 베타인 1.5M에서 낙하 증발을 지연시키기 위해 인쇄 버퍼 (TBS)에서 두 가지 첨가제를 사용할 수 있다. 글리세롤과 베타인은 단백질과 DNA 마이크로 어레이에서 인쇄 용액의 점도를 높이기 위해 사용되어 방울의 증발 속도를 감소시킨다.
언급된 첨가제, 특히 베타인의 첨가가 스폿의 형태를 개선하고 신호 강도를 증가 시켰다. 베타인은 혼성화 동안 AT와 GC 염기쌍의 안정성 사이의 갭을 감소시켜 GC 함량에 관계없이 용융 온도를 낮춘다. 인쇄 용액의 점도를 증가시키는 능력과 함께 이 효과는 유리 슬라이드에서 매우 균일한 DNA 마이크로 스폿을 생성할 수 있도록 한다. 1.5 M 베타인이 보충된 TBS를 인쇄 완충액으로 사용하였다.
포획 프로브 농도는 AFPF 분석의 비색 신호 강도를 최대화하도록 최적화할 수 있다. 높은 농도에서, 혼성화는 고정된 프로브의 입체 장애 및 정전기력에 의해 영향을 받을 수 있고, 결과적으로 불완전한 혼성화가 발생하여 오 탐지 신호를 초래할 수 있다.
한편, 낮은 포획 프로브 농도에서 신호 강도는 분석의 감도 및 동적 범위에 영향을 미치며 비특이적 흡착으로 인해 비표적이 증가할 수 있다. 따라서, 최적화된 조건에 기초하여, 1 내지 80 μM 범위의 여러 포획 프로브 농도, 및 합성 DNA 표적의 연속 희석을 사용하여 교정 곡선을 수행하여 최적 포획 프로브 농도를 확립하고 가능한 최저 검출 한계를 달성할 수 있다.
종래의 핵산 마이크로어레이는 대부분 유리 슬라이드 마이크로어레이를 사용하였다. 기존의 마이크로어레이 프로토콜은 또한 포획 리간드로 표적 프로브의 느린 확산으로 인해 몇 시간의 긴 반응 시간을 사용하였다. DNA 마이크로어레이에서, 특히 표적 프로브의 능동 유동을 위한 교반 또는 펌핑이 없는 정적 마이크로어레이 시스템에서 표적 프로브 유동의 한계에 의해 표적 프로브-포획 프로브 혼성화가 방해받을 수 있다.
핵산 종이 어레이는 일반적으로 진단 분석을 위한 저렴한 플랫폼으로 사용되며 가장 일반적으로 사용되는 종이 어레이 분석 형식 중 하나는 측면 유동(LF) 검사이다. 횡류에 기초한 종이 핵산 바이오센서는 최근 박테리아, 기생충 및 바이러스와 같은 표적을 포함한 다른 전염병 인자의 검출을 위한 PCR 및 등온 증폭 생성물을 검출하기 위해 개발되고 있다.
LF 설정에서, 시료는 종이에 고정된 포획 프로브에 의해 결합될 때까지 시료의 표적 프로브가 종이 막을 따라 모세관 힘에 의해 이송되는 종이 스트립의 시작 부분에 처리된다. LF 검사의 검출은 일반적으로 하나의 표적으로 제한되지만, 새로 개발된 검사는 하나의 스트립에 여러 개의 표적을 포함할 수 있다. 여전히 개선이 필요한 종이 진단 테스트의 주요 과제 중 하나는 더 큰 다중검사 패널을 동시에 측정하는 것이며. LF에서 여러 표적의 다중 검출은 표적 프로브와 포획 프로브 사이의 교차 반응성에 의해 차단될 수 있다.
LF 설정에서, 표적 프로브를 포함하는 유체의 증발 또는 종이를 따른 유속의 변화와 같은 몇 가지 문제가 있을 수도 있다. 업스트림 표적에 의한 시료의 시약 고갈 및/또는 변경은 다운 스트림 스폿의 스폿 강도를 낮출 수 있다.
LF 설정에서, 많은 종이 어레이는 신호 향상없이 *?**?*충분히 잘 작동하지만 필요한 감도와 감지 한계를 달성하기 위해 추가 신호 향상 단계가 필요한 경우가 있다. 신호 향상 전략을 설계할 때 저 자원 환경의 한계를 고려해야 한다. 예를 들어 효소의 사용은 RT에서 저장될 때 효소의 제한된 안정성으로 인해 문제가 될 수 있다. 이전에 효소가 없는 금 증착법에 기반한 신호 향상 전략을 개발했으며, RT에서 장기간 보관할 수 있는 시약을 사용하여 POC 상황에 적합하게 만들었다.
AFPF는 표적 프로브를 포함하는 RPA 증폭산물 용액이 다공성 기질(예를 들어, 종이)을 통해서 능동 유동할 때 표적 프로브를 분리할 수 있으며, 이것을 "능동 유동 시의 농축"이라 칭하였다. 더욱이, 종이를 통한 능동 유동은 농축 공정을 상당히 빠르게 할 수 있다. 이러한 현상을 기반으로, 본 명세서에 기술된 능동 유동 장치 및 스폿 검정 장치가 조합된 다중검사 기술은 농축을 위한 필수적인 성분으로 포획 프로브가 있는 종이 지지체를 포함할 수 있다. RPA 증폭산물 용액이 특정 종이 지지체에 적용되는 경우, 용액이 능동 유동함에 따라서 표적 프로브 분리 및 농축이 일어날 수 있다.
표적 프로브의 능동 유동에 기초한 AFPF가 유리할 수 있다. AFPF 설정에서 시료는 용지 센서 표면을 향하여 수직으로 능동유동을 한다. 따라서 표적 프로브는 일반적으로 펌프, 진공 또는 원심 분리기와 같은 외력에 의해 구동되는 포획 프로브의 위치로 능동 유동에 의해 실행될 수 있다.
RPA 시약의 주성분인 PEG 군집 시약과 밀접한 관련이 있는 “RPA 소구체”(핵산 증폭의 핵심으로 국소화된 RPA 시약 군집체)가 RPA 반응용액에서 형성될 수 있으며 이 경우는 LFD에 사용할 수 없게 될 수도 있다. 이는 이러한 복합체가 LFD에서 표적 프로브의 적절한 이동에 영향을 미쳐서 편향된 신호가 생길 수 있기 때문이다.
AFPF에서 종이는, RPA 소구체가 있는 RPA 반응용액에 포함된 표적 프로브가 희석 단계를 경유하고 "능동유동 시의 농축"-기반 장치를 통해서 능동 유동할 때 표적 프로브를 농축시킬 수 있다. 종이는 RPA 반응용액이 종이 어레이 여과 장치를 통해서 수평 또는 수직으로 유동할 때 표적 프로브를 RPA 소구체에서 유출시키고 농축시킬 수 있다.
AFPF는 종이를 지지체로 사용할 수 있다. 종이는 유체가 그것을 능동유동-통과하는 것을 허용하는 다공성 재료의 시트를 포함한다. 종이는 유체가 그것을 유동-통과하는 것을 허용하는 다공성 재료의 복수의 시트를 포함한다.
본 발명에서 하나 이상의 표적핵산의 다중분석 POC기술로 RPA 및 LFD의 다중분석에 대한 한계를 해결하기 위해, RPA 반응용액의 이동 단계 및 종이 어레이의 반응 단계를 새로이 구성한 핵산 종이 어레이의 다중 분석기술을 완성하였다.
본 발명의 등온 증폭용액의 이동 단계는 (i) 등온 증폭 반응용액이 측면유동 장치(LFD)를 구성하는 종이의 모세관 힘에 의한 수동 유동으로 이동하는 방법 및 (ii) 증폭용액이 종이 어레이 여과(AFPF)장치를 구성하는 종이 어레이에 능동 유동으로 이동하는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 한 방법으로 실시할 수도 있다.
바람직하게, 등온 증폭용액 이동 단계 및 핵산 종이 어레이의 적절한 조합으로 이상적인 다중검사 방법을 개발할 수 있다.
표적 프로브를 포함하는 등온 반응용액은 초기에 단백질 및 PEG 군집 시약과 관련되어 있으며, 생성된 DNA-단백질-군집 시약 복합체는 LFD 검출을 위해 상기 등온RPA 반응용액의 직접적인 사용을 어렵게 할 수도 있다. 이는 이러한 복합체가 LFD에서 표적 프로브의 적절한 이동에 영향을 미쳐서 편향된 신호가 생길 수 있기 때문이다.
RPA 시약의 주성분인 PEG와 밀접한 관련이 있는 “RPA 소구체”( 핵산 증폭의 핵심인 국소화된 RPA 시약의 군집체)가 RPA 반응용액에서 형성될 수 있으며 이 경우는 LFD에 사용할 수 없게 될 수도 있다.
LFD 검출 전에 RPA 반응용액을 처리하는 여러 방법이 가열에 의한 단백질 변성 (65℃ 또는 95℃에서 10 분 동안) 및 세제 처리(나트륨 도데실 설페이트, SDS), 효소 소화(Proteinase K 처리), 고속 원심분리를 통한 단백질 침전 및 상업용 DNA 세척 키트를 사용한 정제가 포함된다.
LFD 감지는 RPA 반응용액의 직접 사용도 가능하지만 스트립에서 실행하기 전에 RPA 반응용액을 실행 버퍼(예: 1/100 희석)로 희석하여 (1) 표적 프로브의 모세관 현상을 향상시키고 (2) "고스트 밴드"효과를 최소화해야 한다. 특히 RPA 시약에서 5.5 % 고 분자량 PEG (35kDa)를 6.5 % 저 분자량 PEG (3kDa)로 대체하여 LFD의 점액성 모세관 현상 문제를 완화할 수 있다. 또한, LFD 검출을 위한 희석 단계를 LFD의 시험 라인에 결합하기 위한 완화하는 방법일 수도 있다.
바람직하게, 본 발명의 AFPF 검출 전에 RPA 반응용액을 단순 희석하여 다음 단계로 바로 진행할 수 있다. 즉, AFPF 검출을 적용하면 희석 후 “RPA 소구체”에서 탈출할 수 있어 표적 프로브가 다운 스트림 시각 분석 검출을 할 수 있다.
능동유동 종이여과(AFPF)의 사용은 측면 유동 분석(LFA)에 비해 몇 가지 장점이 있다. 주사기 내 반응구 설계를 통해 능동 유동은 보다 정밀하게 제어되고, 표적화되고, 더 빠른 표적 프로브 유동을 포획 프로브에 제공하고 세척 단계를 쉽게 포함할 수 있으므로 다양한 분석 형식에 보다 유연하게 적응할 수 있다. 또한, AFPF 형식은 종이의 개별 지점으로 여러 대상에 대한 포획 프로브를 포함시켜 높은 다중검사를 가능하게 하여 다중 병원체 탐지를 위한 간단하고 빠른 플랫폼을 가능하게 한다.
동일한 반응 혼합물에서 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하는 다중 핵산분석은 표적 패널이 작은 경우에 널리 사용되며 제시된 설정으로 다중 핵산분석의 증폭 산물을 AFPF에서 직접 실행할 수 있다. 다중 핵산분석이 교차 반응 경향이 높은 대형 표적 패널 또는 프라이머 쌍으로 인해 불편하거나 불가능한 경우 여러 병렬 반응을 수행한 후 AFPF에서 실행되는 최종 제품을 개발할 수도 있다.
AFPF를 사용한 신호 검출은 <10 분 내에 수행될 수 있으며, 방법의 전체 시간은 현재 ~ 1 시간이며 RPA를 사용한 증폭 및 시료 준비 단계가 포함될 수 있다. AFPF 전 시료 준비를 단순화하여 분석 조건을 추가로 최적화하고 단축하면 전체 분석 시간이 줄어들 수 있다. 신호 증폭을 위한 잠재적으로 추가된 단계는 향상된 감도를 위해 고려 될 수 있다. 향후 연구는 또한 다른 호흡기 바이러스를 검출 패널에 통합하고 임상 환자 시료를 사용한 검출 한계 연구와 같은 방법의 추가 특성 분석을 수반할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서는 항체결합 금 나노 입자(AuNPs)를 이용한 비색 검출 방식으로 AFPF (Active-Flow Paper array Filter) 형식을 사용할 수 있다. AFPF의 사용은 LF 기반 분석과 비교할 때 더 큰 다중검사 기능에 대한 가능성이 있는 것으로 나타났으며, 따라서 다중검사 POC 테스트에 더 나은 옵션이 될 수 있다.
최근에, DNA 검출을 위한 핵산 증폭 시험(NAAT)을 현장 진단 친화적으로 설계하려는 노력이 행해졌지만, 이것은 종종 지나친 단순화로 인해서 감도가 결여되거나 또는 시험 정확성을 유지하기 위해서 사용 용이성이 희생된다. 더욱이, 현재 현장 진단(POC) NAAT는 여전히 전형적으로 시료를 분석 및 처리하기 위한 장비가 필요하다. 따라서, 완전 독립형 또는 휴대용인 상업화된 POC NAAT는 존재하지 않는다.
여기서, AFPF 검출은 하나의 종이의 상이한 복수 표적 핵산에 상보적인 포획 프로브 패널을 포함하는 미래의 목표와 함께 유사 임상증상을 제공하는 병원체-검출에 사용되었다. 이 설정을 사용하면 호흡기 감염의 원인 물질에 대한 첫 번째 지표로 임상 시료를 AFPF 형식으로 실행할 수 있다. 또한 필요한 경우 종별 포획 프로브를 사용하여 다른 병원체 종의 유전자형을 이 설정에 적용할 수도 있다.
혼성화 용액은 염 농도의 변경 또는 변성제의 첨가에 의해 혼성화에 영향을 줄 수 있다. 두 가지 유형의 버퍼인 SSC와 Tris-buffered salin(TBS)의 혼성화 용액을 사용할 수 있다.
SSC 버퍼는 혼성화 분석을 위한 가장 일반적인 완충제 중 하나임에도 불구하고, 이 제형은 여전히 실험에서 높은 비표적 신호 (즉, 분홍빛 비표적)를 초래하여 TBS가 대안으로 고려할 수 있다.
*본 발명에서 두 버퍼를 비교할 때, 핵산 구조를 보존하고 분해를 피하기 위해 사용되는 TBS가 2XSSC와 비교한 결과 더 낮은 비표적 신호가 있어 TBS에서 더 낮은 SBR 값이 얻을 수 있다.
주사기 펌프로 유량을 제어하고 감도를 증가시키도록 최적화할 수 있다.
포획 프로브가 인쇄된 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크를 1 mL 주사기와 결합된 폴리프로필렌 필터 홀더(Sterlitech, USA)에 넣고, 주사기 펌프를 사용하여 상이한 분석 용액의 유량을 제어할 수 있다.
상기 분석용액은 표적 프로브가 있는 RPA 반응용액에 혼성화 용액을 첨가하여 희석 단계를 수행할 수 있다.
바람직하게, AFPF 분석 동안 혼성화 및 비색 표지, 두 가지 주요 단계는 둘 다 실온 (약 23-25 °)에서 수행할 수 있다. 마지막으로, 결합되지 않은 나노 입자를 제거하기 위한 마지막 세척 단계가 수행될 수 있다.
AFPF 분석이 완료되면, 막을 실온에서 10 분 동안 건조시킨 다음, 평판 스캐너에서 16 비트 그레이 스케일로 스캔할 수 있다.
이미징 후, 종이 어레이를 10 mM MES, pH 6 및 1 M H2O2 및 10 mM HAuCl4*3H2O로 구성된 신호 향상 용액에 담근다. 7 분 후, 어레이를 용액으로부터 제거하고, 증류수에서 간단히 헹구고, 실온에서 건조시킨다. 이어서, 건조된 어레이를 최종 시간 1회 이미지화하고, 사전 강화된 어레이와 동일한 방법을 사용하여 이미지 분석을 수행한다. 신호 대 잡음비는 복제 리간드 스폿으로부터의 평균 신호 강도를 복제 음성 대조군 스폿으로부터의 평균 신호 강도로 나눈 값으로 계산할 수 있다.
가시적인 신호 강도는 검출 검정법의 정확도를 개선시키기 위해서 향상될 수 있다. 이것은 초기 검출 검정법 이후에 반응 패드에 추가 시약을 도입함으로써 수행될 수 있다. 신호 향상시약은 표색 지시계의 표면 상에 부착된 효소와 반응하여 강한 시각적인 생성물을 형성하는 기질을 포함할 수 있다. 예의 방식으로, 표색 지시계가 금 리간드를 포함하면, 신호 향상은 은-향상 표지에 의해서 달성될 수 있고, 여기서 은 이온을 함유하는 향상 시약은 반응 패드에 적용될 수 있고, 여기서 금 리간드는 고정된 선/스폿에 결합된다. 이러한 시나리오에서, 금 리간드는, 은이 입자상에 침착될 수 있도록 핵화 자리로서 작용할 수 있어서, 증가된 신호 강도를 생성한다. 이러한 예에서, 신호 향상 시약은 초기 검출 검정법 이후에 별개로 첨가되거나 또는 종이 장치 상에 저장/탈수되어 자동/수동으로 방출될 수 있다.
7. 분자 인코드 방법
본 발명은 등온성 증폭, 분자 인코드 반응 및 비색 판독으로 리간드 종이 어레이의 고처리량 스크리닝을 연결하는 AFPF으로 구성할 수 있다. 이에 대한 살펴보면 다음과 같다.
분석하고자 하는 표적핵산에 특이적인 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 특정한 태그로 지시할 수 있으며, 특정 리간드는 특정 태그만을 인지하여 비공유결합으로 복합체를 형성할 수 있다. 이와 같은 원리를 이용하여 리간드로 표적핵산을 지시하는 방법은 “분자 인코드”이다.
분자 인코딩은 다중 분자 표지의 사용을 의미하며, 결합하면 바코드와 같은 식별을 제공할 수 있다. 시스템은 바이오마커의 일반적인 샌드위치 분석 검출을 위해 태그-리간드 반응을 사용하기 때문에 증폭 반응 중에 표지된 프라이머와 프로브에 통합하여 핵산 검사에 적용할 수 있다.
본 발명의 리간드는 표적 프로브에 있는 태그(tag)에 결합하는 분자일 수 있다. 리간드는 특정물질에 특이적으로 결합하는 분자이다. "특이적으로 결합한다"는 분자가 특정물질에 우세하게 결합하거나 또는 다른 분자보다 특정물질에 더 큰 친화도로 결합한다는 것은 나타낸다. 비제한적인 예의 방식으로, 항체는 그것과 작용하는 항원에 선택적으로 결합할 것이다. 또한, 비제한적인 예의 방식으로, DNA 분자는 엄격한 조건 하에서 유사성이 낮은 서열이 아니라 실질적으로 상보 서열에 결합할 것이다. "특이적 결합"은 분자(예를 들어, 단백질 및 다른 생물물질)의 균질한 집단에서 표적 분석물의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭할 수 있다. 리간드는 이의 특정물질에 결합하고, 시료 중에 존재하는 다른 분자에 유의한 양으로 결합하지 않는다.
태그는 바이오틴, 렉틴, 단백질, 펩티드, 당단백질, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 소분자, 중합체, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 및 지질 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하며 리간드와 결합 쌍을 형성할 수 있는 분자이다.
리간드는 항체, 렉틴, 단백질, 당단백질, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 압타머, 중합체, 렉틴, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 지질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하며 태그와 결합 쌍을 형성할 수 있는 분자이다.
리간드는 항체 또는 항체 단편이며 이들로 제한되는 것은 아니다.
리간드는 압타머를 포함한다. 압타머는 핵산으로부터 형성된 항체-유사체를 포함한다. 리간드는 압타자임을 포함한다. 압타자임은 핵산으로부터 형성된 효소를 포함한다. 압타자임은 제2의 특이적 분석물의 존재 하에서만, 특이적 분자를 포획하도록 구성을 변화시키는 기능을 한다.
태그와 리간드
Tag (sequences) Ligand
His Tag (HHHHHH) Anti-His Tag Antibody
HA Tag (YPYDVPDYA) Anti-HA Tag Antibody
Myc Tag (EQKLISEEDL) Anti-Myc Tag Antibody
DYKDDDDK (DYKDDDDK) Anti-DYKDDDDK (FLAG® epitope Tag) Antibody
V5 Tag (GKPIPNPLLGLDST) Anti-V5 Tag Antibody
S Tag (KETAAAKFERQHMDS) Anti-S Tag Antibody
E Tag (GAPVPYPDPLEPR) Anti-E Tag Antibody
Anti-GCN4 (HLENEVARLKK) Anti-GCN4
Anti-Podoplanin [MAP tag] (GDGMVPPGIEDKIT) Anti-Podoplanin (MAP tag)
Anti-Tag54 [mAK54-1] (KHIKDWEHLEEF) Anti-Tag54 [mAK54-1
Anti-RAP tag [㎛ab-2]
(GDDMVNPGLEDRIEC)		 Anti-RAP tag [㎛ab-2]
Anti-Protein C [HPC-4] (EDQVDPRLIDGK) Anti-Protein C [HPC-4]
Digoxigenin Anti-Digoxigenin
Texas Red Anti-Texas Red
FITC Anti-FITC
Cascade Blue Anti-Cascade Blue antibody
TAMRA Anii-TAMRA antibody
DinitrophenoI Anti-Dinitrophenol antibody
Cy5 Anti-Cy5 antibody
Dansyl Anti-Dansyl antibody
Streptavidin Anti-Sirepiavidin antibody
Biotin Anti-Biotin antibody
Biotin Strepatividm
분자 인코드 방법은 표적 프로브는 포획 프로브인 리간드에 결합하는 태그를 포함한다. 포획 프로브는 리간드를 포함한다. 표적 프로브는 검출 가능한 특성(표색, 형광, 방사능 등)을 포함한다. 리간드는 표적 프로브의 태그와 상호작용하는 리간드(예를 들어, 항체)를 포함한다. 이중 표지된 표적 프로브를 포함하는 반응용액는 AFPF에 의해 종이 어레이에 있는 리간드에 첨가되고, 태그-리간드 반응으로 표적 프로브가 결합하여 표적 프로브-포획 프로브 복합체를 형성한다.
바람직하게, 본 발명에서 분자 인코드 방식을 이용한 하나 이상의 표적핵산을 AFPF로 검출하는 과정은 a) 표적핵산을 분석하고자하는 총핵산 시료를 준비하는 정제 단계; b) 상기 정제된 시료에 하나 이상의 표적 핵산을 대상으로 설계된 올리고뉴클레오티드 세트 1, 재조합효소(Recombinase), 중합효소(Polymerase) 및 nfo(nfo endonucleases IV)를 포함하는 시약집단 1을 첨가하는 단계, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트 1은 표지물질을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 리간드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 최소한 포함하며; c) 상기 반응 용액에 있는 표적핵산에서 상기 태그와 표지물질이 포함된 표적 프로브를 제조하는 단계; d) 상기 표적 프로브가 있는 용액을 희석하여 하나 이상 리간드(capture)가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과 장치에 능동 유동 하에서 첨가하여 상기 종이에서 상기 표적 프로브의 태그와 상기 리간드가 분자 인코드 복합체를 형성하는 단계; e) 상기 능동 유동 하에서 상기 종이에 형성된 복합체로부터 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계; 및 f) 상기 종이 어레이에 형성된 복합체를 구성하는 증폭 산물의 표지 물질을 측정하는 단계;;를 포함할 수 있다.
8. RPA-CRISPR nuclease 반응
본 발명의 크리스퍼 유전자가위를 이용한 차세대 분자진단 기술의 개발은 크게 신호 증폭(signal amplification), 신호 변환(signal transducing), 신호 발생(signal reporting)으로 구성되어 있다. 신호 증폭을 위해 주로 사용되는 기술은 RPA(recombinase polymerase amplification)이며, 신호 변환을 위해서는 크리스퍼 유전자가위 기술이 이용된다. 신호 발생을 위해서는 다양한 형광 단백질들이 많이 이용되고 있다. 또한 현장 적용성을 높이기 위해 시료에서 핵산을 추출할 필요없이 바로 분자진단에 이용할 수 있게 해주는 허드슨(HUDSON, Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases)도 개발되어 이용되고 있다.
크리스퍼 단백질인 Cas13a(이전에는 C2c2라 불림)가 표적 RNA 또는 DNA에 결합했을 경우 주변에 존재하는 비표적 RNA를 무작위적으로 절단하는 활성을 이용한다. 좀더 자세히 살펴보면 시료에 포함된 목적 DNA 혹은 RNA를 RPA와 RT-RPA (reverse transcription-RPA)로 각각 증폭하는 단계와 CRISPR-Cas13a 시스템에 의해 증폭된 목적 RNA가 존재할 때 주변의 리포터 RNA(reporter RNA)가 절단되어 형광 신호를 방출하는 단계로 구성된다. 극미량의 바이러스 혹은 암 유래의 DNA/RNA 시료를 RPA/RT-RPA로 증폭한 후 T7 RNA 중합효소로 전사시킬 경우 피코몰(㎛ = 10-12 M)의 감도가 아토몰(aM = 10-18 M)로 증가된다. 전사된 RNA에 Cas13a가 결합할 수 있는 목적 RNA가 존재하면 Cas13a가 활성화된다. 활성화된 Cas13a는 주변의 리포터 RNA를 무작위로 절단하여 형광 신호를 나타낸다. 이는 제6형 CRISPR-Cas13a 시스템이 제2형 CRISPR-Cas9 시스템과 다르게 DNA 대신에 RNA를 절단하고, 또한 목적 RNA를 결합한 후에 비특이적으로 주변의 RNA를 절단하는 특성(collateral cleavage activity)이 존재하기 때문이다.
크리스퍼 단백질인 Cas13과 더불어 클래스 II의 제5형 Cas12a(이전에는 Cpf1이라 불림) 크리스퍼 단백질도 부수적인 절단 활성(또는 트랜스 절단 활성, trans-cleavage activity)을 갖는다. 그러나 RNA를 표적으로 하는 Cas13과 달리 Cas12a는 DNA를 표적으로 하고 주변에 존재하는 ssDNA를 무작위적으로 절단한다. Cas12a는 gRNA에 의해 표적 DNA에 결합하면 부수적인 절단 활성이 활성화되어 주변에 존재하는 ssDNA를 무작위적으로 절단한다. 이러한 Cas12a의 부수적인 트랜스 절단 활성을 이용하여 개발된 핵산 검출기술이 바로 홈즈(HOLMES, one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)이다.
크리스퍼 유전자가위는 계통학적으로 2개의 클래스(class)와 6개의 유형(type)으로 분류되고 각 유형은 다양한 구조와 기능을 갖고 있지만, 분자진단에 이용되는 크리스퍼 단백질은 제2형 Cas9, 제5형 Cas12a, Cas12b, 제6형 Cas13a, Cas13b가 대표적이다.
크리스퍼 단백질인 Cas9, Cas13, Cas12는 각각 RCH(Rolling circle amplification-CRISPR-split-HRP)의 개발에 이용되었다. 이들은 모두 핵산 분해효소(nuclease)이나 Cas9의 경우 dsDNA(double-stranded DNA) 분해활성이 결여된 dCas9(dead Cas9)을 이용하기도 한다. Cas13과 Cas12의 경우 표적 핵산에 서열 특이적으로 결합하면 주변에 있는 RNA와 ssDNA(singlestranded DNA)를 각각 분해할 수 있는 부수적인 핵산 분해 활성이 이용되었다.
현재까지 개발된 크리스퍼 유전자가위 기반 분자진단 기술은 간단한 시각 신호로 표적에 대한 정량 및 다중 감지가 가능하다. 또한 아토몰 수준의 초고 감도로 표적만을 선택적으로 검출할 수 있으며, 1~2 시간 이내에 검출 결과를 얻을 수 있다. 이는 이상적인 분자진단 기술의 많은 부분을 충족시키고 있다. 따라서 크리스퍼 유전자가위를 이용한 분자진단은 기존에 사용되던 현장진단기술(POC, 예: PCR, hybridization)과 동등한 또는 더 우수한 성능의 현장진단 기술 개발을 가속화시킬 것이다. 또한 더 신속하고 저렴한 진단이 가능해지면 현재 저개발국가를 중심으로 급속하게 퍼지는 바이러스에 의한 감염병의 통제가 가능해질 것이다.
9. 표적핵산 자동 검출 장치
도 2는 본 발명의 표적핵산 자동 검출 장치(1000)의 구성도이다.
본 발명의 표적핵산 자동 검출 장치(1000)는 케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 정제에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100);
상기 시료와 상기 시약으로 구성된 반응용액에서 총핵산 시료를 준비하는 반응튜브(210). 상기 반응용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 자성 입자를 포획하는 자기장 인가부(240), 등온 증폭 과정을 수행하는 증폭 튜브(250)를 포함하는 반응 모듈(200), 여기서 비색반응으로 시각화할 수 있으며; 및
각각 구성 모듈 사이에 공기 또는 유체 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500);를 포함할 수 있다.
상기 반응튜브(210) 및 증폭튜브(240)는 온도 계측할 수도 있다. 본 발명의 용해/결합 단계는 80℃ 및 등온 증폭은 38~40℃에서 실시할 수도 있다.
상기 케이스는 본 발명의 표적핵산 자동 검출 장치(1000)를 구성하는 기본 몸체로서, 골격과 외부 커버를 포함하여 형성될 수 있다.
본 발명의 표적핵산 등온 자동 검출 장치(1000)는 케이스 하면을 효율적으로 냉각할 수 있으며, 냉각 효율을 높이기 위하여 상기 케이스 하면은 열전도도가 높은 재질(예를 들어 알루미늄 소재)로 구성될 수 있다.
상기 시약모듈(100)는 생체시료에 포함된 핵산을 정제, 증폭 및 분석에 필요한 시약을 저장하는 구성요소이며, 상기 시약모듈(100)는 복수개의 저장소(110)이 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 생체시료, 정제에 필요한 하나 이상의 시료 또는 시약이 내장된다.
더욱 상세하게, 상기 시약모듈(100)는 가로 방향으로 복수개 구비된 저장소(110)들이 복수개의 열을 형성하는데, 상기 제1열 내지 제N열 각각에 시료, 정제에 필요한 하나 이상의 시료 효소, 또는 시약이 내장된다.
더욱 상세하게, 상기 정제에 필요한 시료 그리고 세포용해용액, 핵산결합용액, 세척용액, 등온 증폭 시약, 시각화 용액을 포함하는 저장소(110)로 구성될 수 있다, 이 때, 상기 시약모듈(100)의 일부 열은 비어있는 상태일 수도 있다.
상기 시약모듈(100)는 생체시료와, 정제에 필요한 시약 또는 시료가 내장된 상태로, 상기 이송모듈(500)의 순환부(510)가 구비됨으로써, 사용자는 정제를 위하여 시약모듈(100)를 장착하는 것외에 별도의 공정이 필요치 않아 사용이 매우 편리한 장점이 있다.
상기 반응모듈(200)는 생체시료로부터 표적 핵산을 정제하고 등온 증폭하는 구성요소이다. 상기 반응모듈(200)는 반응튜브(210), 혼합부(220), 가열부(230) 자기장 인가부(240),및 증폭튜브(250)가 포함된다. 여기서 반응튜브(210)와 증폭튜브(250)은 동일할 수도 있다.
상기 반응튜브(210)는 상기 시약부(100)의 시료 저장소(110) 및 시약 저장소(120)에서 이송모듈(500)의 펌프(530를 )작동하여 분배부(520)의 관리로 순환부(510)를 통해 이송되고 혼합하여 반응하는 장소이다.
상기 혼합부(220)는 상기 반응튜브(210) 특정 열에 진탕 또는 진동을 부가하여 용해를 촉진하기 위한 혼합을 일으키는 역할을 수행한다.
상기 자기장 인가부(230)는 자기장을 조절할 수 있는 전기력 자석(231)을 포함하여 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210) 특정 열에 진동을 부가하여 용해를 촉진하기 위한 혼합을 일으키는 혼합부(220), 자기장을 인가하여 표적핵산이 부착된 자기 입자를 용액에서 분리하는 역할을 수행한다.
상기 가열부(230)는 각종 반응을 가속화하여 정제 효율을 더욱 높일 수 있도록 할 수 있다.
상기 혼합부(220), 상기 가열부(230) 및 상기 자기장 인가부(240)는 서로 인접하게 형성되어 동일한 반응튜브(210)를 가열하는 구성이다.
상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의한 관리되는 공기 순환부(514)에 의해 형성되어 동일한 특정 열, 반응튜브를 건조하는 구성을 할 수도 있다.
상기 동일한 특정 열이란, 시약모듈(100)에 형성되는 제1열 내지 제N열 중 선택되는 열을 의미하는 것으로서, 상기 반응튜브(210), 혼합부(220), 가열부(230), 자기장 인가부(240), 및 증폭튜브(250)는 특정 열에 각각 자기장을 가하거나 또는 자기장, 가열 및 건조를 동시에 인가할 수 있다.
상기 순환부(510)는 시약모듈(100)의 생체시료 저장소(111)에 있는 생체시료를 반응모듈(200)의 반응튜브(210)로 이송하는 시료 순환부(511), 시약모듈(100)의 시료 저장소(112)에 있는 시약들을 반응모듈(200)로 이송하는 시료 순환부(512), 각 구성 모듈의 중간산물을 각 구성 모듈로 이송하는 중간산물 순환부(513) 및 공기를 각각 구성 모듈로 이송하는 공기 순환부(514)으로 구성할 수 있다.
상기 혼합부(220)은 반응튜브에 반응물의 혼합을 위해 진탕 또는 진동을 부가하는 수단일 일 수 있으며, 상기 가열부(230)는 특정 열을 가열하는 다양한 형태로 형성될 수 있으나, 자기장 인가부(240)는 반응튜브(210)에 있는 핵산-자성입자 복합체를 수확할 수 있도록 자기장을 인가하는 수단이고 상기 특정 열에 진동, 자기장 인가 및 가열을 행할 수 있어 정제효율을 더욱 높일 수 있는 장점이 있다.
상기 반응모듈(200)는 상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의해 관리되는 순환부(510)와 연결되고, 이송모듈(500)의 펌프(530)의 흡입 및 토출에 의해, 상기 시약모듈(100)에 내장된 생체시료, 정제에 필요한 시료 또는 시약이 이송되어 혼합되며, 혼합부(220)에 의해 진동이 반응튜브(210)에 부가되고, 상기 가열부(230)에 의해 가열되고, 상기 자기장 인가부(240)에 의해 자기장이 인가되며, 용해/결합 단계가 이행된다. 상기 시약모듈(100)에 있는 세척용액이 상기 순환부(610))에 의해 용해/결합딴계가 종료된 반응튜브(210)에 이송됨으로써 세척을 수행하여 정제가 이루어진다.
아울러, 상기 반응모듈(200)는 핵산을 추출하기 위한 생체시료를 넣어주는 반응튜브(210)를 포함하는 생체시료 순환부(510)를 더 포함할 수 있으며, 상기 생체시료 순환부(510)는 이송이 용이하도록 상기 이송모듈(500)에 연결하는 것이 바람직하다.
상기 이송모듈(500)는 상기 시약모듈(100)의 시료 및 시약 저장소에서 반응모듈(200)로 안정적으로 유체 유동을 하기 위하여, 상기 이송모듈(500)와 시약모듈(100)가 있는 복수개의 저장소(110) 사이에 위치한 순환부(510) 및 상기 순환부(610)에서 유체유동을 조절하기 위해 분배기(520)가 더 설치될 수 있다.
상기 분배기(520)은 이송모듈(500)의 펌프(530)에 고정된 구성으로서, 반응에 필요한 적절한 용량을 배분하여 제공한다.
본 발명의 표적핵산 자동 등온 검사 장치(1000)는 상기 시약모듈(100)에 시약 및 상기 반응모듈(200)에 시료가 정확한 장착되며 이송모듈(500)의 제어가 용이하며, 이에 따라 정제 작업을 용이하게 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 표적핵산 자동 등온 검사 장치(1000)는 상기 이송모듈(500)의 펌프(630)에 순환부(510)을 탈부착 가능하게 구비되며, 상기 순환부(510)은 하나의 분석이 완료되면 교체되거나, 세척 후 재사용할 수 있다.
상기 순환부(610)는 시약모듈(100)의 시료 저장소(111)에 있는 시료를 반응모듈(200)의 반응튜브(210)로 이송하는 시료 순환부(621), 시약모듈(100)의 시료 저장소(112)에 있는 시약들을 반응모듈(200)로 이송하는 시료 순환부(522), 반응튜브(210)의 중간산물을 각 증폭튜브(250)로 이송하는 중간산물 순환부(523) 및 공기를 각각 구성 모듈로 이송하는 공기 순환부(524)으로 구성할 수 있다.
또한, 상기 반응모듈(200)는 세척효율을 높이기 위하여 반응튜브(210)의 특정 열을 공기를 배기하는 순환부(514)를 더 추가할 수 있다.
순환부(510)의 공기 순환부(514)와 연결되는 진공펌프(610)를 포함하여 형성된다. 상기 진공펌프(510)의 작동에 의해 상기 특정 열에 공기를 배기시킨다.
상기 진공펌프(510)가 작동되면 상기 반응모듈(200)의 특정 열 내부에 잔존하는 세척용매가 빠르게 제거되며, 건조가 완료된다.
또한, 본 발명의 표적핵산 자동 검출 장치(1000)는 상기 건조기능이 구비됨으로써 정제된 표적핵산 내부에 세척용매를 건조시키는 시간을 대폭적으로 줄여서 증폭 과정에 악영향을 미치는 세척용매를 빠르게 제거할 수 있는 장점이 있다.
상기 반응튜브(240)는 상기 표적핵산을 등온 증폭하는 구성요소이며, 상기 반응튜브(210)과 동일할 수 있다. 상기 등온 증폭 산물이 있는 반응튜브(240)에 저장모듈(100)에 있는 시각화 시약을 순환부(510)로 이송되고, 그 반응결과를 시각화한다.
본 발명의 표적핵산 등온 자동 검사 장치(1000)의 분석 방법을 상술하면,
시료에 용해 용액 및 결합용액 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출하여 혈성된 총핵산-자성나노입자 복합체를 세척용액으로 정제하는 단계(S100), 여기서, 또는 추가적으로 상기 복합체에 용출 용액을 첨가하여 총핵산을 용출하여 획득하며;
상기 상기 정제도니 총핵산-자성나노입자 복합체 또는 용출된 총핵산을 등온 증폭한 증폭용액을 제조하는 단계(S200);
상기 증폭용액에서 표적핵산을 검출하는 단계(S300);를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 표적핵산 등온 자동 검사 장치(1000)의 분석 방법에서 상기 정제 단계(S100), 증폭용액 제조 단계(S200) 및 검출 단계(S300)는 이상적으로 한 튜브에서 실시할 수 있다. 상기 정제단계에 용출과정을 추가하여 증폭용액을 다른 튜브에서 준비하여 등온 증폭을 실시할 수도 있다.
상기 이송모듈(600)에 의해 상기 시약모듈(100)의 시료 저장소에 포함된 시료 및 시약모듈(100)의 제1열 내지 제N열에 각각 내장된 정제에 필요한 하나 이상의 시약을 반응튜브(210)로 이송/혼합/결합/세척/등온 증폭하여 DNA와 RNA 공동 추출 총핵산 시료를 정제하고 등온 증폭하여 표적핵산을 분석하는 단계;일렬 연속적으로 수행할 수 있다.
상기 정제 단계는 핵산을 포함하고 있는 생체시료를 융해시켜 핵산을 용출하는 시료 용해 단계; 생체시료의 균질화된 용액에 포함되어 있는 핵산을 기능화 자기 입자에 부착시키고 기타 생체물질 용액을 제거하는 핵산 결합단계; 핵산이 부착된 자기 입자의 기타 불순물을 제거해주는 자기 입자 세척단계;로 구성할 수 있으며, 추가적으로 자기 입자에 함유된 세척용 용매를 제거하는 자기입자 건조 단계; 자기입자에 부착된 핵산을 떼어내기 위해 용출용액을 가해주는 획득 단계;를 실시할 수 있다.
이 때, 상기 정제 단계(S100)에서, 필요에 따라 혼합부(220)에서 반응튜브(210) 특정 열에 진탕 또는 진동을 인가하고, 자기장 인가부(240)에 의해 상기 반응튜브(210) 특정 열에 자기장을 인가하는 자기장 인가 단계; 가열부(230)에 의해 상기 반응튜브(210)의 특정 열을 가열하는 가열 단계가 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 자기 입자 건조 단계는 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210)에 상기 이송모듈(600)의 노즐 순환부(610)을 이용하여 진공모듈(630)을 작동한 후, 상기 반응모듈(200)의 자기 입자를 포함하고 있는 반응튜브(210)의 내부에 접촉되지 않게 이동시킨 후 펌프(610)로 공기를 흡입하여 배출하는 것이다. 동시에 열들을 가열부(230)에 의해 가열하여 줌으로서 세척용매의 건조시간을 단축할 수도 있다.
또한, 상기 증폭 단계(S200)는 상기 표적핵산 함유 핵산용액이 있는 반응튜브(210)에 시약모듈(100)에 있는 등온 증폭시약이 이송부(600)을 통해 이송되고 혼합부(220)으로 혼합하는 혼합 단계; 및 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 등온 증폭하는 온도 조절 단계; 를 포함할 수 있다. 여기서, 등온 증폭 검사에 필요한 올리고뉴클레오티드를 첨가할 수도 있다. 상기 반응튜브(210)과 증폭튜브(250)은 동일할 수도 있다.
더욱 상세하게 증폭 단계(S200)를 설명하면, 상기 혼합 과정은 이송모듈(600)가 상기 정제 단계(S100)를 통해 획득된 표적핵산 함유용액을 증폭튜브(250)에 이송시키고, 혼합부(220)을 통해 반응액과 혼합시키는 단계이다.
상기 온도 조절 단계는 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 증폭하는 단계이다. 이 때, 상기 증폭 단계(S200)가 수행되는 반응(200)는 2열까지의 증폭튜브(250)를 장착할 수 있어, 1열의 반응튜브(251)를 사용하거나, 2열의 반응튜브(252)를 사용하여 추후 다른 분석용 사용할 수도 있다.
더욱 상세하게, 본 발명의 단계 S200에서 상기 등온 증폭의 예시로 RT/RPA의 경우, 증폭튜브(250)의 1열에 역전사반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고, 이송모듈(500)의 중간산물 순환부(613)를 통해 반응튜브(210)의 2열에 이송되고; 증폭튜브(250)의 2열에 이송모듈(500)의 시약 순환부(511)를 통해 시약모듈(100)에 있는 RPA 반응용액이 이송되어 있어 역전사반응물과 혼합하여 RPA 반응을 수행할 수 있다. 또는 RT 반응과 RPA 반응 한 튜브에서 실시할 수 있다. 본 발명에서 두 반응을 한 튜브에 실시하였다. 상기 증폭튜브(250)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S200에서 상기 다중 등온 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-nfo의 경우, 증폭튜브(250)의 1열에 역전사반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고, 이송모듈(500)의 중간산물 순환부(513)를 통해 증폭튜브(250)의 2열에 이송되고; 증폭튜브(250)의 2열에 이송모듈(500)의 시약 순환부(511)를 통해 시약모듈(100)에 있는 RPA-nfo 반응용액이 이송되어 있어 역전사반응물과 혼합하여 RPA-nfo 반응을 수행할 수 있다. 또는 RT 반응과 RPA-nfo 반응 한 튜브에서 실시할 수 있다. 본 발명에서 두 반응을 한 튜브에 실시하였다. 상기 증폭튜브(250)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S200에서 상기 다중 등온 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-CRISPR nuclease의 경우, 증폭튜브(250)의 1열에 1차 RT/RPA 반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 재조합효소 증폭 반응을 수행하고, 증폭튜브(250)의 2열에 CRISPR nuclease 반응용액이 들어 있어 1차 RT/RPA반응의 반응물을 혼합하여 RT/RPA-CRISPR nuclease 반응을 수행할 수 있다. 상기 증폭튜브(250)은 상기 반응튜브(210)과 동일할 수도 있다.
상기 검출 단계(S300)는 상기 증폭산물이 있는 증폭튜브(250)에 이송모듈(500)을 통해 시약모듈(100)에 있는 시각화 시약을 이송하여 비색 반응을 하는 검출 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 공동 추출한 DNA와 RNA 총핵산 시료를 등온 증폭하여 표적핵산을 자동 검출하는 장치(1000)를 상기와 같이 제작하여 운영할 수 있다.
도 3은 본 발명의 표적핵산 등온 자동 다중검사 장치(2000)의 구성도이다.
표적핵산 등온 자동 다중검사 장치(2000)는 케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 정제에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100);
상기 시료와 상기 시약으로 구성된 반응용액에서 총핵산 시료를 준비하는 반응 튜브(210). 상기 반응용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 자성 입자를 포획하는 자기장 인가부(240),를 포함하는 반응모듈(200), 여기서 정제되거나 또는 정제되고 용출된 총핵산 시료가 있는 반응튜브(210)은 증폭 과정을 수행하고 표적 프로브를 포함하는 용액을 제조하는 증폭튜브(250)일 수 있으며;
상기 표적 프로브가 있는 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이(310)에서 표적-포획 복합체를 형성하는 여과장치(320), 시각화 시약으로 스폿이 형성되는 종이 어레이(310)를 포함하는 AFPF 모듈(300);
상기 종이 어레이(310)에 있는 스폿을 스캔하는 스캔너(410), 이미지를 중강하는 증강부(420) 및 상기 이미지를 분석하는 소프트웨어(430)를 포함하는 영상화 모듈(400); 및
각각 구성 모듈 사이에 공기 또는 유체 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500);를 포함할 수 있다.
상기 반응모듈은 상기 시료와 상기 시약으로 구성된 반응용액에서 총핵산 시료를 준비하는 반응튜브(210). 상기 반응용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 자성 입자를 포획하는 자기장 인가부(240),를 포함하는 반응모듈; 및 상기 정제되거나 또는 정제되고 용출된 총핵산 시료로부터 증폭 과정을 수행하고 표적 프로브를 포함하는 용액을 제조하는 증폭튜브 및 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부를 포함하는 증폭모듈;로 나눌 수도 있다.
상기 케이스는 본 발명의 표적핵산 자동 다중검사 장치(2000)를 구성하는 기본 몸체로서, 골격과 외부 커버를 포함하여 형성될 수 있다.
본 발명의 표적핵산 등온 자동 다중 검사 장치(2000)는 케이스 하면을 효율적으로 냉각할 수 있으며, 냉각 효율을 높이기 위하여 상기 케이스 하면은 열전도도가 높은 재질(예를 들어 알루미늄 소재)로 구성될 수 있다.
상기 시약모듈(100)는 생체시료에 포함된 핵산을 정제 및 분석에 필요한 시약을 저장하는 구성요소이다. 상기 시약모듈(100)는 복수개의 저장소(110)이 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 생체시료, 정제에 필요한 하나 이상의 시료 또는 시약이 내장된다. 더욱 상세하게, 상기 시약모듈(100)는 가로방향으로 복수개 구비된 저장소(110)들이 복수개의 열을 형성하는데, 상기 제1열 내지 제N열 각각에 생체시료, 정제에 필요한 하나 이상의 시료 또는 시약이 내장된다. 더욱 상세하게, 상기 정제에 필요한 시료 또는 시약은 효소, 세포용해용액, 핵산결합용액, 자성입자 수분산액, 및 세척용액을 포함할 수 있으며, 이 때, 상기 시약모듈(100)의 일부 열은 비어있는 상태일 수도 있다.
상기 시약모듈(100)는 시료와, 정제에 필요한 시약 또는 시료가 내장된 상태로, 상기 이송모듈(500)의 유체 순환부(510)이 구비됨으로써, 사용자는 정제를 위하여 시약모듈(100)를 장착하는 것외에 별도의 공정이 필요치 않아 사용이 매우 편리한 장점이 있다.
상기 반응모듈(200)는 생체시료로부터 표적 핵산을 정제하는 구성요소이다. 상기 반응모듈(200)는 반응튜브(210), 혼합부(220), 가열부(230) 및 자기장 인가부(240)) 및 증폭튜브(250)가 포함된다. 반응튜브(210)와 증폭튜브(250)은 동일할 수도 있다.
상기 반응튜브(210)는 상기 시약부(100)의 시료 저장소(110) 및 시약 저장소(120)에서 이송모듈(500)의 펌프(530)작동하여 분배부(520)의 관리로 노즐 순환부(510)를 통해 이송되고 혼합하여 반응하는 장소이다.
상기 혼합부(220)는 상기 반응튜브(210) 특정 열에 진동을 부가하여 용해를 촉진하기 위한 혼합을 일으키는 역할을 수행한다.
상기 가열부(230)는 동일한 반응튜브(210, 250)를 가열하는 구성이다. 또한, 상기 반응모듈(200)는 가열부(230)를 포함하여 각종 반응을 가속화하여 정제 효율을 더욱 높일 수 있도록 할 수 있다.
상기 자기장 인가부(240)는 자기장을 조절할 수 있는 전기력 자석(241)을 포함하여 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210, 250)특정 열에 자기장을 인가하여 표적핵산이 부착된 자기 입자를 용액에서 분리하는 역할을 수행한다.
상기 건조기능은 상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의한 관리되는 노즐 순환부(510)에 의해 공기를 이송함으로써 동일한 특정 열을 건조하는 것이다.
상기 동일한 특정 열이란, 시약모듈(100)에 형성되는 제1열 내지 제N열 중 선택되는 열을 의미하는 것으로서, 상기 혼합부(220), 가열부(230) 및 자기장 인가부(240)와 건조기능이 특정 열에 각각 진동하거나, 자기장을 가하거나, 가열 및 건조를 인가할 수 있다.
상기 시약모듈(100)의 특정 열에 상기 이송모듈(500)의 분배부(620)에 의한 관리되는 순환부(510)에 의해 반응모듈(200), AFPF모듈(300) 및 영상화 모듈(400)로 이송될 수 있다.
상기 순환부(510)는 시약모듈(100)의 시료 저장소(111)에 있는 시료를 반응모듈(200)의 반응튜브(210)로 이송하는 시료 순환부(521), 시약모듈(100)의 시료 저장소(112)에 있는 시약들을 각각의 모듈(200, 300 또는 400)로 이송하는 시료 순환부(522), 각 구성 모듈의 중간산물을 각 구성 모듈로 이송하는 중간산물 순환부(522) 및 공기를 각각 구성 모듈로 이송하는 공기 순환부(524)으로 구성할 수 있다.
상기 가열부(230)는 특정 열을 가열하는 다양한 형태로 형성될 수 있으나, 자기장 인가부(240)가 금속재질로 형성되고, 상기 자기장 인가부(240)를 가열하는 수단일 수 있다.
본 발명의 표적핵산 자동 다중 검출(2000)의 상기 자석 인가부(220)가 금속재질로 형성되고, 가열부(230)가 상기 자석 인가부(240)를 가열하는 수단일 경우에, 상기 특정 열에 자기장 인가 및 가열을 동시에 행할 수 있어 정제효율을 더욱 높일 수 있는 장점이 있다.
상기 반응모듈(200)는 상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의해 관리되는 노즐 순환부(510)와 연결되고, 이송모듈(500)의 펌프(530)의 흡입 및 토출에 의해, 상기 시약모듈(100)에 내장된 생체시료, 정제에 필요한 시료 또는 시약이 이송되어 혼합되며, 위 과정 중에 상기 자기장 인가부(220)에 의해 자기장이 인가되고, 상기 가열부(230)에 의해 가열됨으로써 정제가 이루어진다.
아울러, 상기 반응모듈(200)는 핵산을 추출하기 위한 생체시료를 넣어주는 반응튜브(210)를 포함하는 생체시료 노즐 순환부(510)를 더 포함할 수 있으며, 상기 생체시료 노즐 순환부(510)는 이송이 용이하도록 상기 이송모듈(600)에 연결하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나 이상의 표적핵산 자동 다중 검출(2000)의 상기 반응모듈(200)에 자기장을 인가하고 열을 가하는 공정을 수행하기 위하여 상기 자기장 인가부(240) 및 가열부(230)가 상기 반응모듈(200)에 인접하게 위치될 수 있는데, 이 때, 상기 이송모듈(600)는 상기 시약모듈(100)의 시료 및 시약 저장소에서 반응모듈(200)로 안정적으로 유체 유동을 하기 위하여, 상기 이송모듈(500)와 시약모듈(100)가 있는 복수개의 저장소(110) 사이에 위치한 노즐 순환부(510) 및 상기 순환부(610)에서 유체유동을 조절하기 위해 분배기(520)가 더 설치될 수 있다.
상기 분배기(520)은 이송모듈(500)의 펌프(530)에 고정된 구성으로서, 반응에 필요한 적절한 용량을 배분하여 제공한다.
본 발명의 표적핵산 자동 다중 검사 장치(2000)는 상기 시약모듈(100)에 시약 및 상기 반응모듈(200)에 시료가 정확한 장착되며 이송모듈(600)의 제어가 용이하며, 이에 따라 정제 작업을 용이하게 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 표적핵산 자동 다중검사 장치(2000)는 상기 이송모듈(500)의 펌프(530)에 순환부(510)을 탈부착 가능하게 구비되며, 상기 순환부(510)은 하나의 분석이 완료되면 교체되거나, 세척 후 재사용할 수 있다.
또한, 상기 반응모듈(200)는 세척효율을 높이기 위하여 반응튜브(210)의 특정 열을 공기를 배기하는 건조 기능이 더 형성될 수 있다.
상기 건조 기능은 순환부(510)의 공기 순환부(514)와 연결되는 진공펌프(510)를 포함하여 형성된다. 상기 진공펌프(510)의 작동에 의해 상기 특정 열에 공기를 배기시킨다.
상기 진공펌프(510)가 작동되면 상기 반응모듈(200)의 특정 열 내부에 잔존하는 세척용매가 빠르게 제거되며, 건조가 완료된다.
또한, 본 발명의 표적핵산 자동 다중 검사 장치(2000)는 상기 건조기능이 구비됨으로써 정제된 표적핵산 내부에 세척용매를 건조시키는 시간을 대폭적으로 줄여서 증폭 과정에 악영향을 미치는 세척용매를 빠르게 제거할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 표적핵산 자동 다중 검사 장치(2000)는 상기 반응모듈(200)의 등온 증폭 반응시약이 있는 반응튜브(210)가 있으며, 상기 정제단계 S200의 세척된 핵산용액이 이송되는 노즐 순환부(510)의 중간산물 순환부(523) 구비하며, 일정한 온도를 유지할 수 있는 가열부(230)를 부가적으로 설치할 수 있다.
상기 증폭단계 S300이 종결된 반응튜브(210)의 반응용액에 단계 S400을 위해, 증폭산물을 단일가닥을 전환시키는 변성용액과 단일가닥을 포함하는 용액을 중화시키는 중성화 용액을 반응튜브에 이송하는 노즐 순환부(510)의 시약 순환부(512)을 추가할 수 있다.
상기 AFPF 모듈(300)는 상기 표적 프로브를 포함하는 증폭산물을 분석하는 구성요소이다. 상기 AFPF 모듈(300)는 종이 어레이(310) 및 여과장치(330)가 포함된다.
본 발명의 표적핵산 자동 다중검사 장치(2000)의 상기 AFPF모듈(300)은 능동유동 핵산 혼성화를 수행하고 포획 프로브가 고정된 종이 어레이(310)가 장착된 여과장치(320), 상기 능동유동을 유지하는 이송모듈(500)의 펌프(510)에 의해 공기 순환부(514) 및 상기 반응모듈(200)에서 획득한 중화된 단일가닥 표적 프로브를 포함하고 희석된 용액을 여과장치(320)에 이송하는 상기 노즐 순환부(510)의 중간산물 순환부(513)를 구비한다.
상기 영상화 모듈(400)는 상기 분석 결과를 시각하는 구성요소이며, 상기 영상화 모듈(400)는 영상장치(410), 이미지 증강부(420) 및 소프트웨어(430)가 포함된다.
본 발명의 표적핵산 등온 다중검사 장치(2000)의 상기 영상화 모듈(400)는 상기 반응이 종결된 종이 어레이(310)가 장착된 여과장치(320)에서 분리된 종이 어레이(310)의 이미지를 스캔하여 정량하는 스캔너(410), 상기 종이 어레이(310)은 하나의 분석이 완료되면 시각 증강 시약을 사용하여, 신호가 증강된 이미지를 획득하여 분석하는 증강부(420) 및 획득한 이미지를 분석하는 소프트웨어(430)을 구비한다.
본 발명의 표적핵산 등온 다중 검사 장치(2000)의 분석 방법을 상술하면,
시료에 용해 용액 및 결합용액 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출하여 혈성된 총핵산-자성나노입자 복합체를 세척용액으로 정제하는 단계(S100), 여기서, 또는 추가적으로 상기 복합체에 용출 용액을 첨가하여 총핵산을 용출하여 획득하며; 상기 상기 정제도니 총핵산-자성나노입자 복합체 또는 용출된 총핵산을 등온 증폭하고 표지물질이 있는 증폭산물을 포함하는 증폭용액을 제조하는 단계(S200); 상기 증폭산물로부터 단일가닥 표적 프로브를 포함하는 증폭용액을 제조하는 표적프로브 준비 단계(S400); 상기 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 능동 유동 하에서 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500); 상기 능동 유동 하에서 상기 종이 어레이에 형성된 표적-포획 프로브 복합체와 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계(S600); 및 상기 종이 어레이에 있는 세척된 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 단계(S700);를 포함할 수 있다.
본 발명의 표적핵산 등온 다중검사 장치(2000)의 분석 방법에서 상기 정제 단계(S100), 증폭용액 준비 단계(S200) 및 표적 프로브 준비 단계(S400)는 이상적으로 한 튜브에서 실시할 수 있다. 상기 정제단계(S100)에 용출과정을 추가하여 증폭용액을 다른 튜브에서 준비하여 등온 증폭을 실시할 수도 있다.
상기 이송모듈(500)에 의해 상기 시약모듈(100)의 시료 저장소에 포함된 시료 및 시약모듈(100)의 제1열 내지 제N열에 각각 내장된 정제에 필요한 하나 이상의 시약을 이송모듈(500)을 통해 반응튜브(210)로 이송하고 혼합하여 용해과정을 걸쳐 총핵산 시료를 정제하는 단계(S100), 상기 정제 총핵산 시료를 등온 증폭하는 단계(S200) 및 상기 증폭산물로부터 표적 프로브를 준비하는 단계(S400);를 일렬 연속적으로 수행할 수 있다.
상기 정제 단계는 핵산을 포함하고 있는 생체시료를 융해시켜 핵산을 용출하는 시료 용해 단계; 생체시료의 균질화된 용액에 포함되어 있는 핵산을 기능화 자기 입자에 부착시키고 기타 생체물질 용액을 제거하는 핵산 결합단계; 핵산이 부착된 자기 입자의 기타 불순물을 제거해주는 자기 입자 세척단계;로 구성할 수 있으며, 추가적으로 자기 입자에 함유된 세척용 용매를 제거하는 자기입자 건조 단계; 자기입자에 부착된 핵산을 떼어내기 위해 용출용액을 가해주는 획득 단계;를 실시할 수 있다.
이 때, 상기 정제 단계(S100)에서, 필요에 따라 혼합부(220)에서 반응튜브(210) 특정 열에 진탕 또는 진동을 인가하고, 자기장 인가부(240)에 의해 상기 반응튜브(210) 특정 열에 자기장을 인가하는 자기장 인가 단계; 가열부(230)에 의해 상기 반응튜브(210)의 특정 열을 가열하는 가열 단계가 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 자기 입자 건조 단계는 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210)에 상기 이송모듈(500)의 노즐 순환부(510)을 이용하여 진공모듈(530)을 작동한 후, 상기 반응모듈(200)의 자기 입자를 포함하고 있는 반응튜브(210)의 내부에 접촉되지 않게 이동시킨 후 펌프(510)로 공기를 흡입하여 배출하는 것이다. 동시에 열들을 가열부(230)에 의해 가열하여 줌으로서 세척용매의 건조시간을 단축할 수도 있다.
또한, 상기 증폭 단계(S200)는 상기 정제 단계(S100)를 통해 획득된 표적핵산 함유 핵산용액이 있는 반응튜브(210)에 시약모듈(100)에 있는 등온 증폭시약이 이송부(500)을 통해 이송되고 혼합부(220)으로 혼합하는 혼합 단계; 및 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 등온 증폭하는 온도 조절 단계; 를 포함할 수 있다. 여기서, 등온 증폭 검사에 필요한 올리고뉴클레오티드를 첨가할 수도 있다. 상기 반응튜브(210)과 증폭튜브(250)은 동일할 수도 있다.
더욱 상세하게 증폭 단계(S200)를 설명하면, 상기 혼합 과정은 이송모듈(500)가 상기 정제 단계(S100)를 통해 획득된 표적핵산 함유용액을 증폭튜브(250)에 이송시키고, 혼합부(220)을 통해 반응액과 혼합시키는 단계이다.
상기 온도 조절 단계는 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 핵산 추출 수율 향상시키거나, 정제 총핵산 시료를 등온 증폭하는 단계이다.
이 때, 상기 증폭 단계(S200)가 수행되는 반응(200)는 2열까지의 반응튜브(210)를 장착할 수 있어, 1열의 반응튜브(251)를 사용하거나, 2열의 반응튜브(210)를 사용하여 추후 다른 분석용 사용할 수도 있다.
본 발명에서 등온 다중검사를 위해서, 본 발명의 단계 S200에서 추가적인 표적핵산에 대해 설게된 올리고뉴클레오티드 세트를 첨가하여 다중 표적핵산 등은 증폭할 수 있다.
더욱 상세하게, 본 발명의 단계 S200에서 상기 다중 등온 증폭의 예시로 RT/RPA의 경우, 반응튜브(210)의 1열에 역전사반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고, 이송모듈(500)의 중간산물 순환부(513)를 통해 반응튜브(210)의 2열에 이송되고; 반응튜브(210)의 2열에 이송모듈(500)의 시약 순환부(511)를 통해 시약모듈(100)에 있는 RPA 반응용액이 이송되어 있어 역전사반응물과 혼합하여 RPA 반응을 수행할 수 있다. 또는 RT 반응과 RPA 반응 한 튜브에서 실시할 수 있다. 본 발명에서 두 반응을 한 튜브에 실시하였다. 상기 반응튜브(210)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S200에서 상기 다중 등온 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-nfo의 경우, 반응튜브(210)의 1열에 역전사반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고, 이송모듈(500)의 중간산물 순환부(513)를 통해 반응튜브(210)의 2열에 이송되고; 반응튜브(210)의 2열에 이송모듈(500)의 시약 순환부(511)를 통해 시약모듈(100)에 있는 RPA-nfo 반응용액이 이송되어 있어 역전사반응물과 혼합하여 RPA-nfo 반응을 수행할 수 있다. 또는 RT 반응과 RPA-nfo 반응 한 튜브에서 실시할 수 있다. 본 발명에서 두 반응을 한 튜브에 실시하였다. 상기 반응튜브(210)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S200에서 상기 다중 등온 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-CRISPR nuclease의 경우, 반응튜브(210)의 1열에 1차 RT/RPA 반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 재조합효소 증폭 반응을 수행하고, 반응튜브(210)의 2열에 CRISPR nuclease 반응용액이 들어 있어 1차 RT/RPA반응의 반응물을 혼합하여 RT/RPA-CRISPR nuclease 반응을 수행할 수 있다.
상기 등온 다중검사의 단계 S400을 위해, 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210)에 있는 표적프로브 함유용액에 이송모듈(500)의 시약 순환부(512)을 통해 단일화 용액을 첨가하여 이중가닥을 단일가닥으로 전환시키는 단일화시키고, 추가적으로 중화 용액을 이송하여 중화 용액을 제공할 수 있다.
상기 단계 S500는 상기 이송모듈(500)의 중간산물 순환부(513)을 통해 상기 증폭 단계 S300를 통해 획득된 표적 프로브 함유용액을 단계 S400으로 단일가닥 표적 프로브로 전환된 증폭산물 용액이 종이 어레이가 장착된 AFPA 몸체에 능동유동으로 이송하여 표적 프로브를 농축하는 혼성화 단계를 상기 이송모듈(500)의 시약 순환부(512)을 통해 상기 핵산 혼성화 방법으로 할 수도 있다.
상기 단계 S600은 상기 S500을 통해 획득된 종이어레이(310)가 장착된 AFPA 여과장치(320)에 세척용액을 능동유동으로 이송하여 포획 프로브와 비특이적 결합하거나 미결합한 증폭반응물을 선택적으로 구분하여 제거하는 세척을 할 수도 있다.
상기 영상화 단계 S700은 상기 이송모듈(500)의 노즐 순환부(510)을 통해 상기 세척을 통해 획득된 종이어레이(310)를 시약모듈(100)의 시각 시약을 이송하여 이미지 획득하고 분석할 수도 있다.
또한, 상기 영상화 단계 S700은 상기 단계 S600을 통해 획득된 종이 어레이를 시각 장치로 이미지를 획득하는 과정; 및 상기 시약모듈(100)의 시약 저장소에 있는 이미지 증강 시약을 이송모듈(500)의 노즐 순환부(510)를 통해 상기 종이 어레이(310)에 첨가하는 이미지 증강하는 과정을 포함할 수 있다.
본 발명의 공동 추출한 DNA와 RNA 총핵산 시료를 등온 증폭하여 표적핵산을 자동 검사 장치(1000)를 상기와 같이 제작하여 운영할 수 있다.
10. 키트.
본 발명에 기술된 장치 및/또는 방법의 실시를 사용하기 위한 키트가 제공된다. 하나 이상의 표적핵산의 검출 및/또는 정량분석을 위한 키트가 제공되며, 여기서 키트는 본 발명에 기술된 바와 같은 검정법 장치를 포함하는 용기를 포함한다.
키트는 시료를 수집하기 위한 수집 장치를 추가로 포함한다. 수집 장치는 구강 유체를 수집하기 위한 장치, 혈액을 수집하기 위한 장치, 소변 수집 장치, 질 스왑으로부터 또는 자궁경관내 스왑으로부터 질 유체를 수집하기 위한 장치, 또는 환경 시료를 수집하기 위한 장치를 포함한다.
키트는 시약, 예컨대 완충액, 용매, AFPF 시스템의 성분, 검출 시약 등을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 정성 또는 정량분석을 통해 감염 여부를 판별할 수 있으며, 음성 대조군과 비교하여 그 양이 증가한 경우, 또는 음성 대조군에는 검출되지 않았으나, 시료에서 양성 반응이 나온 경우, 또는 일정한 양 이상으로 검출이 된 경우 이를 감염으로 판정할 수 있을 것이다. 판정 또는 판단 기준은 당업계의 기준을 고려하여 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
본원의 방법에 사용되는 시료, 시약, 증폭 방법 및 반응 조건 등은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.
상기 성분 및 검정법 포맷은 예시적이며, 비-제한적이다. 본 명세서에 제공된 교시 및 예를 사용하면, 다수의 다른 검정법 장치 및 구성은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 사용 가능할 것이고, 일부 추가 설계 고려사항 및 성분이 하기에 기술된다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
*실시예 1: 핵산혼성화 방식의 AFPF
1.1. 표적핵산 영역 올리고뉴클레오티드
감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 호흡기 바이러스의 게놈, 즉, Adenovirus JS201501 바이러스의 염기서열(Sequence ID: KX289874), MERS-CoV 바이러스의 염기서열 (Sequence ID: MN723544.1), H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 염기서열 HA 유전자(Sequence ID: MF630405.1), NA 유전자 (Sequence ID: MK453330.1) 및 2019-nCoV 바이러스의 염기서열(Sequences ID MT276598.1)에 대해 표적핵산 영역을 선정하여 각각 DNA로 합성하였다(바이오니아, 한국).
Human adenovirus 55 isolate JS201501게놈의 표적핵산은 하기의 KX289874의 염기서열 뉴클레오티드 20701~21060(길이 360bp)를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 20,761~21,025 (길이: 265bp)이다.
gggttacatg gctccgacca tgcgccaagg tcaaccctat cccgctaact atccctatcc actcattgga acaactgccg taaatagtgt tacgcagaaa aagttcttgt gtgacagaac catgtggcgc ataccgttct cgagcaactt catgtctatg ggggccctta cagacttggg acagaacatg ctttatgcca actcagctca tgctctggac atgacctttg aggtggatcc catggatgag cccaccctgc tttatcttct cttcgaagtt ttcgacgtgg tcagagtgca tcagccacat cgcggcatca tcgagacagt ctacctgcgt acaccgttct cggccggtaa
Middle East respiratory syndrome-related coronavirus strain Hu/Riyadh-KSA-18013832/2018 게놈의 표적핵산은 하기의 Sequence ID: MN 723544.1의 염기서열 뉴클레오티드 28981~29220 (길이 240bp)를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 28981~29220(길이 111bp)이다.
accctaacaa tgattcagct attgttacac aattcgcgcc cggtactaag cttcctaaaa acttccacat tgaggggact ggaggcaata gtcaatcatc ttcaagagcc tctagcgcaa gcagaaactt ttccagatct agttcacaag gttcaagatc aggaaactct acccgcagca cttctccagg tccatctgga atcggagcag taggaggtga tttactttac cttgatcttc
Influenza A virus (A/chicken/Zhejiang/S4079/2013(H7N9)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene의 표적핵산은 하기 Sequence ID: MF630405.1의 염기서열 뉴클레오티드 421~600 (길이: 180bp)를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 421~600<길이: 98bp>이다.
aatggagcaa ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg ctcctgtcaa acacagataa tgctgtattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca agaaaaagcc cagctttaat agtatggggg atccatcatt ccgtatcaac tgcagagcaa
Influenza A virus (A/chicken/Guangxi/97/2017(H7N9)) segment 6 neuraminidase (NA) gene의 표적핵산은 하기 Sequence ID: MK453330.1의 염기서열 뉴클레오티드 841~1140 <길이 300bp>를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 841~1140 (길이: 122bp)이다.
cgaacaggga ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt cagatagacc cagtagcaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgtccttaca gacagtcccc gaccgaatga cccaaatata ggtaagtgta atgaccctta tccaggtaat aataacaatg gagtcaaggg attctcatac ctggatggag ctaacacttg gctagggagg acaataagca cagcatcgag gtctggatac gagatgttaa aagtgccaaa tgcattgaca
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate SARS-CoV-2의 표적핵산은 하기 Sequence ID: MT276598.1 염기서열 뉴클레오티드 28237~28536 <길이 300 bp>를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 28261~286000 (길이: 150 bp)이다.
taaacgaaca aactaaaatg tctgataatg gaccccaaaa tcagcgaaat gcaccccgca ttacgtttgg tggaccctca gattcaactg gcagtaacca gaatggagaa cgcagtgggg cgcgatcaaa acaacgtcgg ccccaaggtt tacccaataa tactgcgtct tggttcaccg ctctcactca acatggcaag gaagacctta aattccctcg aggacaaggc gttccaatta acaccaatag cagtccagat gaccaaattg gctactaccg aagagctacc agacgaattc
합성된 DNA를 주형으로 <T7 프로모터+GG> 염기서열이 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭산물을 확보하였다. 상기 증폭산물을 주형으로 체외 전사하여 RNA를 합성하고 -20 ℃에서 저장하였다.
표적핵산(KX289874, MN723544.1, MF630405.1, MK453330.1 및 MT276598.1)을 으로 제조하는 T7 프로모터가 있는 DNA는 100 nM 주형 DNA, 0.25 μM 5'-프라이머, 0.25 μM 3'-프라이머, 10X PCR 버퍼, 및 100 μM dNTP의 혼합물을 혼합하여 처음 95℃의 5분에서 Taq 폴리머라제(Promega)를 2.5 유닛 첨가하였다. 그리고 PCR 사이클로 95℃의 30초, 55℃의 30초 및 72℃의 1분의 조건으로 20 사이클 반복한 뒤, 마지막으로 72℃의 8분 30초 처리하는 과정을 포함하는 방법으로 제조하였다(도 4).
PCR을 통하여 만들어진 T7 프로모터가 있는 DNA 주형으로 T7 RNA 폴리머라제(Takara)를 이용하여 시험관 내에서 전사를 통하여 RNA 풀을 제조하였다.
본 발명에서는 RNA 분해 효소에 저항성 있는 2′-F modified Pyrimidine을 포함하는 RNA를 제조하기 위하여 2'-데옥시-2'-플루오로 CTP와 UTP(Epicentre Technologies) 및 정상적인 GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용하여, 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 피리미딘 뉴클레오티드의 매 2번 위치가 플루오르기로 변형되어진 RNA를 합성하였다.
구체적으로, DNA 라이브러리, 5X 전사 버퍼, 50 mM DTT, 0.5 mM ATP, GTP, 2'-F CTP, 2'-F UTP, T7 RNA 폴리머라제(Takara), DEPC-H2O로 50 μl로 구성된 반응용액을 37℃ 에서 3시간 동안 반응시켰다.
본 발명에서는 RNA 분해 효소에 저항성 없는 RNA를 제조하기 위하여 정상적인 CTP, UTP, GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용하여, 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 RNA를 합성하였다.
체외전사체 단편의 연속 희석을 사용하여, 10-100 카피 /㎕의 합성 표적핵산 RNA 서열의 존재를 검출을 확인하는 시험을 하였다.
1.2. 등온 증폭 올리고뉴클레오티드
시료에서 DNA와 RNA 공동 추출한 총핵산 시료를 등온 증폭으로 표적핵산을 검출하기 위해, 감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 4종류의 호흡기 바이러스 게놈의 합성 표적핵산 및 올리고뉴클레오티드 세트를 합성하여 진행하였다.
4종류의 바이러스 게놈의 표적핵산에서 결정된 표적영역을 선정하여 기본 RPA를 위한 RPA 증폭 프라이머 및 추가적인 RPA-exo 반응 또는 RPA-nfo 반응을 위한 exo-프로브 또는 TwistAmp™ nfo 를 특정 검출을 위해 설계하였다.
상기 프라어머 및 프로브는 TwistAmp 분석 설계 매뉴얼 지침 (www.twistdx.co.uk)을 사용하여 ‘표적핵산’의 특정 영역을 증폭시키기 위해 설계하였다.
상기 프라이머 및 프로브를 설계하기 위해, 감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 호흡기 바이러스의 게놈, 즉, Adenovirus JS201501 바이러스의 염기서열(Sequence ID: KX289874), MERS-CoV 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MN723544.1), H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MF630405.1) 및 2019-nCoV 바이러스의 염기서열(Sequences ID MT276598.1)를 NCBI 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 수집하여 이용 가능한 다른 염기서열과 함께 표적핵산의 뉴클레오티드 BLAST를 수행함으로써 가장 안정적이고 보존적인 영역을 선택하여 표적핵산 영역을 결정하였다.
상기에서 선정된 표적핵산의 서열을 블라스트 Blast로 스크리닝한 다음, 생체정보 도구인 Jalview를 사용하여 정렬시켰다. 다중 정렬 서열 multi-aligned sequence(즉, 가장 보존 된 영역)에 기초하여, 기본 RPA 목적 정방향 및 역방향 프라이머는 PrimerBLAST를 사용하여 설계하였다.
RPA- exo 또는 RPA nfo 증폭을 위해, 제조사의 지침에 따라 표적핵산의 선택된 염기서열로 exo 프로브 또는 TwistAmp™ nfo 를 설계하였다.
RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 경우 표준 매개 변수 즉. 증폭산물 크기, 프라이머 길이, GC 함량, 5' 말단의 피리미딘 및 G/C 클램프를 고려하였다. 제작되는 올리고뉴클레오티드는 <표 2>, <표 3>, <표 4> 및 <표 5>와 같다.
HAdV 55 아데노 바이러스 106.9 kDa protein L3 hexon(accession no.*?*KX289874) 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA, RT-RPA-nfo 및 RT-RPA-exo반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
ADV-RF GCT CAT TGG AAC AAC TGC CGT AAA TAG TGT 30
ADV-RR-Bio [Biotin]GGC CGA GAA CGG TGT ACG CAG GTA GAC TGT C 31
ADV-RP-nfo CTC GAT GAC GCC GCG GTG TGG CTG GTG CAC [THF]CT GAC CAC GTC GAA GA[phosphate] 47
ADV-RF GCT CAT TGG AAC AAC TGC CGT AAA TAG TGT 30
ADV-RR GGC CGA GAA CGG TGT ACG CAG GTA GAC TGT C 31
ADV-RP-exo CAG GTA GAC TGT CTC GAT GAC GCC GCG GTG T[FAM]G[THF] CT[BHQ]G GTG CAC GCT GAC C-SpC3 49
MERS-CoV 바이러스 nucleoprotein 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA 및 RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
MCV-RF AAC TTC CAC ATT GAG GGG ACT GGA GGC AA 29
MCV-RR-Bio [Biotin]AGA GTT TCC TGA TCT TGA ACC TTG TGA ACT 30
MCV-RP-nfo TCT TCA AGA GCC TCT AGC TTA AGC AGA AAC [THF]TC CAG ATC TAG TTC[phosphate] 45
H7N9 조류 인플루엔자 바이러스 H7 및 N9 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA 및 RT-RP-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
H7-RF TTC TAT GCA GAA ATG AAA TGG CTC CTG TCA A 31
H7-RR-Bio [Biotin]AGC TGG GCT TTT TCT TGT ATT TTT ATA TGA CTT AG 35
H7-RP-nfo AAA TGA AAT GGC TCC TGT CAA ACA CAG ATA [THF]TG CTG CAT TCC CGC A[phosphate] 46
N9-RF ATA GAC CCA GTA GCA ATG ACA CAC ACT AGT CA 32
N9-RR Bio [Biotin]TTA TTA TTA CCT GGA TAA GGG TCA TTA CAC T 31
N9-RP-nfo CAC TAG TCA ATA TAT ATG CAG TCC TGT TCT A[THF]A GAC AGT CCC CGA CCG A[phosphate] 49
2019-nCoV 바이러스 nucleocapsid phosphoprotein 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA 및 RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
CoV-RF TTT GGT GGA CCC TCA GAT TCA ACT GGC AGT AAC 33
CoV-RR-Bio [Biotin]GAA TTT AAG GTC TTC CTT GCC ATG TTG AGT GAG 33
CoV-RP-nfo GCG ATC AAA ACA ACG TCG GCC CCA AGG TTT ACC [THF]AA TAA TAC TGC GTC T[phosphate] 49
AFPF 방식으로 RPA의 증폭산물인 표적 프로브를 검출하기 위해, 포획 프로브를 설계하였다. 포획 프로브는 기본 RPA 및 RPA-nfo 반응에 의한 증폭산물을 인지하고 상보적 결합하는 올리고뉴클레오티드이며, 포획 프로브의 이차 구조는 실험 조건을 시뮬레이션하는 웹 기반 소프트웨어인 Mfold (25℃; 0.150μM [Na+])에 의해 계산되었다. 아래 <표 6> 내용을 고려하였다.
포힉 프로브의 고려 사항
Probe characteristics Probe specificity
Probe length (mers) T m range
(℃)		 Single nucleotide stretch length (complexity) Maximal degeneracy Maximal consecutive match with non-target Maximal identity with non-target (%) BLASTClust option (-S)(%) BLASTClust option (-L)(%)
50 64-79 10 1 or 32 15 75 90 0
(-L)=0 indicates that sequence length is not considered for the clustering.1.3. 올리고뉴클레오티드의 변형
시료에서 DNA와 RNA 공동 추출한 총핵산 시료를 등온 증폭으로 표적핵산을 검출하기 위해, 감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 4종류의 호흡기 바이러스 게놈의 합성 표적핵산을 검출하기 위한 프라이머와 프로브의 변형을 실시하였다(IDT, 미국).
재조합효소가 선정된 표적핵산의 특정지역을 증폭하도록 하기 위해, RPA 정방향 프라이머와 RPA 역방향 프라이머는 천연 뉴클레오티드를 사용하여 제조하였다(IDT, 미국).
AFPF의 핵산 혼성화 방식의 표적 프로브는 5‘ 말단에 바이오틴 부분이 표지된 사슬이다, 이를 위해 기본 RPA 반응의 역방향 프라이머의 5’말단에 표지물질 특히, 바이오틴을 부가하였다.
ADV-RP-exo는 형광단 FAM-T-뉴클레오타이드를 대체하는 내부 비염기성 뉴클레오타이드 유사체 THF-G-소광제 BHQ, 및 3' 말단에 SpC3 폴리머라제 연장 차단 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(IDT, 미국).
TwistAmp™ nfo 프로브는 뉴클레오타이드를 대체하는 내부 비염기성 뉴클레오타이드 유사체 THF, 및 3' 말단에 phosphate를 폴리머라제 연장 차단 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(IDT, 미국).
다중검사에 따른 사용하는 프라이머들을 포함한 올리고뉴클레오티드들 사이 이중량체 형성을 최소화하기 위해, self-avoiding molecular recognition systems(SAMRS) 뉴클레오티드를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 제조하였다(IDT, 미국).
포획 프로브는 중합효소에 의해 기본 RPA 및 RPA-nfo 반응산물은 5‘ 말단에 바이오틴이 표지된 RPA 역방향 프라이머을 사용하여 표적핵산의 특정영역을 증폭한 절편의 이중가닥으로 5’말단에 바이오틴이 표지된 표적 프로브과 상보적인 결합을 하는 아민기가 표지된 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(바이오니아, 한국).
1.4. 종이 어레이 제조
등온 증폭 산물의 다중검사를 위한, 핵산 혼성화를 기반으로 한 능동유동 종이 어레이 여과(AFPA)를 실시하였다.
본 발명의 종이 어레이를 제조하는 니트로셀룰로스 막은 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스(3M 사, 미국) 디스크를 사용하였다. 특정 실험에 따라 GE (FF60 또는 FF80HP, GE Healthcare, Amersham, UK) 또는 Millipore (HFB135, Millipore, Billerica, MA)의 니트로셀룰로오스 막을 시험에 사용 하였다.
제작된 아민기가 있는 포획 프로브를 여러 농도로 제조한 4nL(10 방울/스폿) 올리고뉴클레오티드 TBS 용액을 piezoelectric printer sciFLEXARRAYER S3(Scienion AG, 독일)을 사용하여 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크 상에 스폿팅하였다.
스폿팅 후, 막을 실온에서 건조시키고, 125 mJ/cm2의 총 에너지를 가하여 254 nm UV 광에 노출시켰다. 비특이적 결합을 최소화하기 위해, 15 분 동안 BSA 3 % 수용액에 침지시켜 막을 차단한 다음, 0.05 % 트윈-20을 함유한 TBS로 2 회 세척 단계를 각각 15 분 동안 2 회 세척하고, 사용할 때까지 실온에 보관하였다.
인쇄 버퍼는 신호 대 비표적 값뿐만 아니라 인쇄 조건을 개선하기 위해 첨가제로 보충되었다. 상동성이 없는 비오티닐화 서열을 양성 대조군으로 사용하였다. 비오틴 대신에 아민기를 갖는 동일한 서열을 음성 대조군으로 사용하였다.
종이 어레이 제조시 고려 조건: 인쇄 버퍼는 신호 대 비표적 값뿐만 아니라 인쇄 조건을 개선하기 위해 첨가제로 보충할 수 있다. 언급된 첨가제, 특히 베타인의 첨가가 스폿의 형태를 개선하고 신호 강도를 증가시킬 것이다. 베타인은 혼성화 동안 AT와 GC 염기쌍의 안정성 사이의 갭을 감소시켜 GC 함량에 관계없이 용융 온도를 낮춘다. 인쇄 용액의 점도를 증가시키는 능력과 함께 이 효과는 종이 어레이에서 매우 균일한 DNA 마이크로 스폿을 생성할 수 있도록 할 것이다. 1.5 M 베타인이 보충된 TBS를 인쇄 완충액으로 사용하였다.
혼성화 성능은 또한 스폿의 형태에 따라 달라지며, 이는 상대 습도, 포획 프로브 밀도, 인쇄 버퍼 및 인쇄 방법과 같은 인쇄 조건의 영향을 받을 수 있다. 유리 슬라이드의 전형적인 DNA 마이크로 어레이 인쇄 공정에서, 방울의 증발 속도를 늦추기 위해 권장되는 상대 습도는 약 50~65 %이다. 그러나, 종이 어레이에서, 사용하는 지지체(니트로셀룰로오스)은 높은 상대 습도 조건에 노출될 때 말리는 경향이 있어 인쇄시 어려움이 있을 수 있다. 결과적으로 상대 습도의 건조기 환경이 필요하며 35~40 % 범위의 수준이 최적일 수 있다.
스폿 형태는 상대 습도 및 방울의 증발을 지연시키는 시약의 첨가에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 포획 프로브는 낮은 상대 습도 수준에서 순수한 TBS 완충액으로 인쇄하며, "커피링 효과"가 있다. 이러한 고리 모양의 반점은 신호 축적은 DNA 축적으로 인해 가장자리에서 더 높으며, 용매의 증발에 의해 생성될 수 있으며, 이는 DNA 분자가 유체 유동과 함께 바깥쪽으로 흘러 증발 손실에 따른 것이다. 글리세롤과 베타인은 단백질과 DNA 마이크로어레이에서 인쇄 용액의 점도를 높이기 위해 사용되어 방울의 증발 속도를 감소시킨다. 낮은 상대 습도에서 글리세롤 20 % 및 베타인 1.5M에서 낙하 증발을 지연시키기 위해 인쇄 버퍼(TBS)에서 두 가지 첨가제를 사용할 수도 있다.
포획 프로브 농도는 AFPF 분석의 비색 신호 강도를 최대화하도록 최적화될 수 있다. 높은 농도에서, 혼성화는 고정된 프로브의 입체 장애 및 정전기력에 의해 영향을 받을 수 있고, 결과적으로 불완전한 혼성화가 발생하여 오 탐지 신호를 초래할 수 있다.
한편, 낮은 포획 프로브 농도에서 신호 강도는 분석의 감도 및 동적 범위에 영향을 미치며 비특이적 흡착으로 인해 비표적이 증가할 수 있다. 따라서, 최적화된 조건에 기초하여, 1 내지 80 μM 범위의 여러 포획 프로브 농도, 및 합성 DNA 표적의 연속 희석을 사용하여 교정 곡선을 수행하여 최적 포획 프로브 농도를 확립하고 가능한 최저 검출 한계를 달성할 수 있다.
1.5. 총핵산 시료의 공동 추출
VSV-G psuedotyped lentivirus(타카라, 일본)가 첨가된 혼합 가래 표본에 용해 용액 및 결합용액을 첨가하고 세척하여 DNA와 RNA를 공동 추출한 총핵산 시료를 준비하였다, 여기서, 부가적으로 용출용액을 첨가할 수도 있다.
1.5.1. VSV-G pseudotyped lentivirus 획득
Lenti-X™ Packaging single shots(타카라, 일본)에서 Lenti-X™ 293T Cell Line(타카라, 일본)은 Glutamax와 high glucose, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM으로 배양하였다.
293T cell이 flask의 70~80%가 차면 기존의 배지를 버리고 PBS 10㎖로 조심스럽게 씻어 주었다. 0.25% trypsin (Gibco)를 1 ㎖ 넣어주고 37℃ 세포 배양기에 1분 정도 넣어 주었다. 세포가 flask 바닥에서 다 떨어지면 최종 1:4의 비율이 되게 배지를 넣어주고 피펫팅을 통해 세포를 잘 섞은 후 그 중 1 ㎖만 다른 flask에 옮기고 새로운 배지 14 ㎖를 채워 37℃, 5% CO2 세포 배양기에 넣어서 배양하였다.
293T cell은 형질전환하기 전날 confluent 10 ㎝ plate에 4x106 cells/plate가 되게 배양해서 다음날 plate에 세포가 70~80%가 찰 수 있게 준비하였다.
OptiMEM 200 ㎕에 4 mg/ml Polybrene reagent(타카라, 일본) 18 ㎕를 tube 벽에 닿지 않게 OptiMEM에 바로 넣어주고 손가락으로 tube를 가볍게 쳐서 잘 섞어준 후 실온에서 5분간 방치하였다. 5분후 미리 준비해 둔 lentiviral stock(타카라, 일본) 15 ㎕를 첨가하고 손가락으로 tube를 가볍게 쳐서 섞어준 후 실온에서 다시 15분간 방치하였다. 그 동안 cell plate를 꺼내서 기존에 있던 DMEM을 버리고 새로운 DMEM 8 ㎖를 채워주고,15분이 지나면 혼합액을 cell plate에 떨어뜨리고 배지와 잘 섞이게 조심스럽게 흔들어 준 후 37℃ 세포 배양기에 넣었다.
다음날 새로운 DMEM 8 ㎖로 갈아 준 뒤에 Neuraminidase (Sigma) 1unit을 넣어 준 다음 24시간 후 상층액은 걷어서 0.45-㎕ filters로 filtering하고, 1 ㎖씩 분주하여 -80℃에 보관하였다. cell plate에 cell이 바닥에서 떨어지 않도록 조심스럽게 새로운 DMEM 8 ㎖을 채워주고 Neuraminidase 1 unit을 넣어주고 다시 24시간 후에 이 과정을 2번 반복하여 수확-1,2,3 바이러스 입자를 준비하였다.
벡터 저장 용액 중의 바이러스성 RNA를 NucleoSpin RNA 바이러스 키트(Clontech, 미국)로 분리하고, RNA 게놈의 카피 수는 Lenti-X™ Provirus Quantitation KitC(타카라, 일본)를 사용하여 결정하였다.
제조 지침. 바이러스 RNA를 42 ℃에서 20 분 동안 역전사하고, 다음 조건 하에서 StepOne 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, 미국)을 사용하여 중복 샘플에 대해 정량적 PCR을 수행하였다. 95 °의 1 사이클 3 분 동안 C에이어서 15 초 동안 95 ℃ 및 30 초 동안 60 ℃의 40 회 사이클. 105 내지 108 카피 범위의 바이러스 RNA 제어 주형의 일련의 희석에 기초하여 표준 곡선을 결정하였다.
1.5.2. 총핵산 시료의 공동 추출 방법
본 발명에서 알려진 카피 수의 VSV-G psuedotyped lentivirus 입자(10 카피 이하)를 갖는 200㎕ 혼합 가래 표본을 4℃에서 5 분 동안 12,000 × g에서 원심 분리하고, 상층액을 버리고 300 μl의 용해 완충제(2 M GTC, 80 mM DTT, 25 mM 시트르산 나트륨 및 20 μg/ml의 글리코겐, pH 6)을 튜브에 즉시 첨가하고 격렬하게 15 초 동안 와동시켰다. 여기서, 핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 이어서 상기 용해물을 80℃에서 10 분 동안 처리하였다. 실온으로 냉각한 후, 등가 부피의 100 % 에탄올 및 20 μl의 자성 입자 (10 mg/ml)를 튜브에 첨가하고 잘 혼합한 다음, 혼합물을 실온에서 5분 동안 보관하였다.
또는, 본 발명에서 다른 실시례로 알려진 카피 수의 VSV-G psuedotyped lentivirus 입자(10 카피 이하)를 갖는 200㎕ 혼합 가래 표본을 4℃에서 5 분 동안 12,000 × g에서 원심 분리하고, 상층액을 버리고 300 μl의 용해 완충제(2 M GTC, 80 mM DTT, 25 mM 시트르산 나트륨 및 20 μg/ml의 글리코겐, pH 6) 및 20 μl의 자성 입자 (10 mg/ml)을 튜브에 즉시 첨가하고 격렬하게 15초 동안 와동시켰다. 여기서, 핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 이어서 상기 용해물을 80℃에서 10분 동안 처리하였다. 실온으로 냉각한 후, 동일한 부피의 100% 에탄올를 튜브에 첨가하고 잘 혼합한 다음, 혼합물을 실온에서 5분 동안 보관하였다.
용해 완충액 중의 GTC 농도는 1.0M 내지 6.0M의 범위이며 DTT 농도는 0 mM 내지 160 mM 범위에서 설정할 수 있다.
상층액을 버리고, 핵산을 흡수한 자성 입자를 DynaMagTM-2 자석 (Life Technologies, USA)을 사용하여 수집하였다. 자성 입자를 70 % 에탄올로 2 회 세척하였다. 입자로부터 핵산의 용출은 50 ㎕의 RNase-free water를 첨가한 후, 자성 입자 혼합물을 5 분 동안 보관하였다. 마지막으로, 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 -30 ℃에서 보관하였다.
상기 용출된 DNA 및 RNA 공동 추출한 총핵산 시료에서, RNA는 DNase 소화 (DNA-free; Ambion)에 의해 제조되었고 Superscript II 역전사 효소 (Gibco), 1 μM deoxynucleoside triphosphates 및 10 μM hexanucleotides (Gibco)를 사용하여 역전사되었다. DNA 및 cDNA는 각각 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 60 초로 이루어진 30 개의 PCR 사이클을 사용하여 증폭되었다(도 5).
프라이머의 서열은 다음과 같았다.
5' VSV-G, GAAGTGCCTTTTGTACTTAG;
3' VSV-G, GATCGGATGGAATGTGTTAT;
5' GFP, GGCCACAAGTTCAGCGTGTC;
3' GFP, TTGCCGTCCTCCTTGAAGTC;
5' β- 액틴, GTTTGAGACCTTCAACACCCC; 및
3' β- 액틴, GTGGCCATCTCCTGCTCGAAGTC.
<도5>를 살펴보면, 상기 정제되거나 또는 정제되고 용출된 총핵산 시료를 주형으로 RNA를 분석하는 RT-PCR 과 DNA를 분석하는 PCR를 각각 수행한 결과로 상기 정제한 총핵산 시료에는 분석 가능할 정도의 양질의 DNA와 RNA가 함께 존재함을 알 수 있었다.
추출된 MNP-핵산 복합체가 등온 증폭에 직접 사용될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 동일한 추출이 수행되었고, 여기서 전체 복합체는 용리 단계없이 PCR 튜브로 옮겼다. 구체적으로, 15 μL의 TE 완충액, 7.5 μL의 4 × 반응 완충액, 1.5 μL 효소 혼합물, 및 최적 농도의 프라이머 (각각 1 μM) 및 프로브 (1 μM)로 구성된 30 μL의 반응 용액을 MNP-핵산와 혼합 하였다. 간단한 볼 텍싱에 의해 복합체를 형성하고, 상기 언급 된 것과 동일한 절차를 사용하여 RT-PCR 용 PCR 튜브로 직접 옮겼다.
1.6. 기본 RPA, RPA-exo 및 RPA-nfo 증폭
혼합 가래 표본의 핵산 추출에서 바이러스 RNA의 존재를 확인하기 위해, 바이러스 게놈에서 표적핵산을 선택하였다. 기본 RPA 증폭 프라이머, exo 프로브 및 TwistAmp™ nfo 는 특정 검출을 위해 설계하였다.
본 발명에서 사용하는 DNA 주형은 Human adenovirus JS201501 염기서열(Sequence ID: KX289874), MERS-CoV 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MN723544.1), H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MF630405.1) 및 2019-nCoV 바이러스의 염기서열(Sequences ID MT276598.1)에 대해 표적핵산 부위를 선정하여. 상기 실시례 1.2항에서 합성된 DNA이다.
합성 바이러스 표적핵산 RNA 단편의 연속 희석을 사용하여, 마이크로 리터당 10-100 카피 범위의 합성 바이러스 RNA 서열의 존재를 검출하였다.
합성된 DNA를 주형으로 <T7 프로모터+GG염기서열>가 연결된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR하여 얻은 증폭산물을 확보하였다. 6 nmol DNA 주형, 0.25 μM 정방향 프라이머, 0.25 μM 역방향 프라이머, 10X PCR 버퍼, 및 100 μM dNTP의 혼합물을 혼합하여 처음 95℃의 5분에서 Taq 폴리머라제(Promega)를 2.5 유닛 첨가하였다. 그리고 PCR 사이클로 95℃의 30초, 55℃의 30초 및 72℃의 1분의 조건으로 20 사이클 반복한 뒤, 마지막으로 72℃의 8분 30초로 T7 프로모터가 있는 PCR 산물을 얻었다.
상기 증폭산물을 주형으로 체외전사하여 RNA를 합성하여 -20 ℃에서 저장하였다. 1x전사 완충액 (40mM Tris-HCL pH7.5, 6mM MgCl2, 5mM NaCl 및 10mM spermidine)의 총 부피 90㎕에서 이중 가닥 DNA 주형 5㎍을 사용하여 전사하여 제조하였다. 반응 혼합물에 5mM 또는 2mM NTP 혼합물 (ATP, UTP, GTP, 및 CTP)을 갖는 돌연변이 T7 효소를 함유하는 Durascribe T7 효소 믹스(Epicentre)의 10㎕을 첨가하여 37 ℃에서 12시간 반응시켰다.
사용하기 직전에 107 내지 101 개의 RNA 분자 ㎕로 희석 범위로 희석하고 시험에 사용하였다.
탐지 접근 방식을 단순화하거나 집에서도 수행할 수 있도록 탐지를 위해 한 튜브 RT-RPA, RT-RPA-exo 및 RT-RPA-nfo 반응을 할 수 있도록 상기 실시례 1.3항에서 언급된 올리고뉴클레오티드 세트를 합성하였다.
표적핵산 내에서 표적 프로브(증폭산물)를 증폭시키기 위해 쌍을 이룰 수 있는 RPA 정방향 프라이머 및 바이오틴이 표지된 RPA 역방향 프라이머를 제작하였다.
또한 THF 부위를 중심으로 5' 부위 33bp, 3‘ 부위에 15bp를 포함하는 TwistAmp™ nfo 를 제작하였다. RT-RPA-nfo 반응에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 <표 2>, <표 3>, <표 4> 및 <표 5>에 나타내었고, 최적 반응 조건은 39 ℃에서 20 분이다.
한 튜브 RT-RPA, 한 튜브 RT-RPA-exo 및 한 튜브 RT-RPA-nfo 반응을 TwistAmp 키트 (TwistDX, 영국)를 사용하여 수행하였다.
반응 주형은 DNA 바이러스(본 실험에서 아데노 바이러스)의 게놈 및 RNA 바이러스는 역전사한 cDNA를 사용하였다.
상기 키트는 역전사 효소를 함유하지 않았기 때문에, cDNA의 합성은 제조사의 지시에 따라 전사체 제 1 가닥 cDNA 합성 키트 (Roche, Germany)를 사용하여 수행하였다. RPA 키트에 제공된 29.5ul의 재수화 완충액을 사용하여 각 동결 건조된 RPA 펠렛을 재현탁하였다.
또한, 합성 바이러스 단편을 사용하여 표적 프로브에 대한 양성 대조군을 설정할 수 있다. 테스트 시료를 추가하지 않은 음성 대조군도 설정해야 한다.
4종류의 바이러스의 표적핵산들에 대한 한 튜브 RT-RPA, 한 튜브 RT-RPA-exo 및 한 튜브 RT-RPA-nfo 반응은 <표 7>과 같이 설정될 수 있다.
하기 <표 7>의 4항은 한 튜브 RT-RPA은 ddH2O를, 한 튜브 RT-RPA-exo는 RPA exo Probe를 및 한 튜브 RT-RPA-nfo 반응은 RPA nfo Probe (0.3 uM)를 사용하였다.
하기 <표 7>의 7항의 시료는 4 종류의 바이러스의 합성 표적핵산에서 제조된 총핵산 시료를 실험 목적에 따라 1종류 이상을 선택하고 혼합하여 제조하였다.
한 튜브 RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 시약 및 올리고뉴클레오티드
1. Resuspended RPA solution 5.9 ul
2. RPA-Forward_v1 (10 uM) 0.5 ul
3. RPA-Reverse_v1 (10 uM) 0.5 ul
4. ddH2O 0.5 ul
RPA exo Probe (0.3 uM)
RPA nfo Probe (0.3 uM)
5. ProtoScript RT (100,000U/mL) 0.2 ul
6. ddH2O 0.9 ul
7. Sample 1 ul
8. MgAc (supplied in RPA kit) 0.5 ul
Total 10 ul
상기 모든 반응은 TwistAmp (TwistDx Ltd., UK)를 사용하여 39℃에서 35분 동안 수행하였다. 단일 표적핵산을 검출할 목적인 기본 RPA 반응, RPA-exo 반응 및 RPA-nfo 반응 종결과 동시에 비색반응으로 결과를 확인하였다.
RPA 탐지 기능을 더욱 확장하기 위해 SYBR 녹색 염료(1:10000 저장 용액, Thermo Fisher의 S7563)를 반응 혼합물에 추가하고 색상 변화를 확인했다(도 6).
또한 형광 신호와 감도가 향상된 새로운 유형의 핵산 염료 GeneFinderTM (Bridgen의 D039)를 선택했다. 청색광 하에서 노출시킴으로써, 녹색 형광이 μL 당 100 카피로 양성 반응에서 육안으로 명확하게 관찰되는 반면, 음성 대조군에서는 분홍색으로 유지되었다.
또는 시험 결과를 추가로 확인하기 위해 PCR clean-up Kit (Qiagen, 독일)로 정제한 후 에티디움 브로마이드로 염색된 2 % 아가로스-겔 전기영동에서 증폭산물을 분석하였다(도 7).
표적핵산의 다중검사를 위해, 기본 RPA 반응 및 RPA-nfo 반응의 증폭산물은 핵산 혼성화 기반 AFPF를 실시할 목적으로, 하기 실시례 1.6항을 실시한다.
1.7. ssDNA 생성
상기 기본 RPA 반응 및 RPA-nfo 반응에서 증폭된 표적 프로브가 포함된 반응용액에 동일한 부피의 변성 용액 (0.5N NaOH, 1.5M NaCl)을 첨가하여 변성혼합용액을 제조하고 실온에서 1분 동안 변성시킨다. 변성혼합 용액에 동일한 부피의 중화용액 (1M tris-Cl, pH7.4)을 첨가하여 1 분 동안 중화시킨다.
1.8. 핵산 혼성화 기반 능동 유동 종이 어레이 여과
완충제 조성물은 염 농도의 변경 또는 변성제의 첨가에 의해 혼성화에 영향을 줄 수 있다. 두 가지 유형의 버퍼인 SSC와 TBS의 혼성화 용액을 사용할 수 있다. 완충용액은 0.1% SDS 및 5 % 탈이온화된 포름 아미드가 보충된 여러 농도 (즉, 1X, 2X, 4X, 8X 및 16X)에서 SSC로 구성할 수 있다. SSC를 완충용액으로 사용했을 때, 더 낮은 농도에서 더 높은 SBR(signal to background ratio)이 얻어졌고 2X는 최적의 농도이다. SSC는 혼성화 분석을 위한 가장 일반적인 완충제 중 하나임에도 불구하고, 이 제형은 여전히 실험에서 높은 비표적 신호 (즉, 분홍빛 비표적)를 초래하여 TBS가 대안으로 고려할 수 있다.
본 발명에서 두 버퍼를 비교할 때, TBS가 2XSSC와 비교한 결과 더 낮은 비표적 신호가 있어 TBS에서 더 낮은 SBR 값이 얻을 수 있었다. Tris-buffered salin(TBS)는 핵산 구조를 보존하고 분해를 피하기 위해 분자 생물학에서 일반적으로 사용되는 버퍼이다.
주사기 펌프로 유량을 제어하고 감도를 증가시키도록 최적화할 수 있다. 1000, 150 및 45 μL/min의 3 가지 다른 유속을 테스트하여 각각 30 초, 3 분 및 10 분의 혼성화 시간을 나타냈다. 높은 유속은 낮은 혼성화 신호를 나타내는 표적과 포획 프로브 사이의 적절한 혼성화를 허용하지 않았다. 한편, 150 및 45 μL/min의 낮은 유속에서 수행된 분석은 각각 3 분 및 10 분의 혼성화 시간이 길어짐에 따라 더 높은 신호를 나타냈다. 상이한 유속에 의해 생성된 감도에 대한 효과는 매우 낮은 포획 프로브 농도에서 크게 나타났다. 그러나, 더 높은 포획 프로브 농도에서, 150 및 45 μL/분의 유속은 유사한 신호 강도를 발생시켰다. 따라서, 분석 감도의 저하를 피하기 위해 나머지 실험의 혼성화 단계에 대해 150 μL/min의 유속을 선택할 수 있다.
포획 프로브가 인쇄된 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크를 1 mL 주사기와 결합된 폴리프로필렌 필터 홀더(Sterlitech, USA)에 넣고, 주사기 펌프를 사용하여 상이한 분석 용액의 유량을 제어할 수 있다.
상기 분석용액은 표적 프로브가 있는 RPA 반응용액에 완충용액을 첨가하여 희석 단계를 수행할 수 있다.
바람직하게, AFPF 분석 동안 혼성화 및 비색 표지, 두 가지 주요 단계는 둘 다 실온 (약 23-25 ℃)에서 수행할 수 있다. 먼저, 1 mL/분으로 선택된 완충액 500 μL를 첨가하여 종이 어레이를 습윤시킬 수 있다. 그 후, 150 μL/분으로 450 μL RPA 증폭산물 용액을 여러 농도(증폭된 생성물의 경우, 500 μL 실행 완충액 중 50 μL 분해된 dsDNA)에서 150 μL/분으로 혼성화를 하였다.
그 후, 세척단계는 다음과 같이 실시할 수 있으며, 선택된 1 mL 완충용액로 1 mL/분의 완충액으로 세척하였다.
다음으로 Streptavidin coated AuNPs의 용액(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 비색 표지 (450 μL, 1 mL/분)로 사용할 수 있다. 마지막으로, 결합되지 않은 나노 입자를 제거하기 위한 마지막 세척 단계가 수행하였다.
사용된 AuNP(Thermo Fisher Scientific, 미국)는 Streptavidindl 코팅된 40-nm 입자이다. 표적 시료 (표적 프로브가 있는 RPA 반응물)을 1xTBS (pH 7.5) 내로 500 μL로 추가로 희석시켰다. 유사하게, Streptavidin coated AuNPs의 용액을 1 xTBS에서 500 μL의 최종 부피로 1 : 4로 희석하였다. 막 슬라이드로부터 어레이의 원형 컷 아웃을 Swinnex 13-mm 폴리 프로필렌 필터 홀더 (Sterlitech, USA)에 넣었다. 표적 및 세척 완충액 (0.05 % 트윈-20으로 보충된 1xTBS)을 주사기 펌프 (PHD 2000, 하버드 장치)를 사용하여 막을 통해 수직으로 첨가하였다.
먼저, 1 mL의 세척 완충액을 통과시키고 (1 mL min-1), 이어서 표적 시료 (0.45 mL, 150 μL min-1), 이어서 세척 (1 mL min-1) 하였다. 이어서, AuNP 컨쥬게이트를 함유하는 검출 용액을 첨가하고 (0.45 mL, 1 mL min-1), 이어서 최종 1 mL 세척 단계 (1 mL min-1)를 수행하였다.
1.9. 영상화
상기 세척이 완료되면, 평판 스캐너 CanoScan 9000F Mark II (Canon)를 16 비트 그레이 스케일 TIFF 파일로 스캔하기 전에 어레이를 5-10 분 동안 건조했다.
<도 8>에 표기된 5x3 양식으로 5종류의 포획프로브가 고정된 종이 어레이에 한 튜브에서 5종류 표적핵산으로 구성된 스톡 DNA 주형을 단계적 희석 방법으로 준비 주형 DNA에 대해 RPA를 실시하여 얻은 증폭산물을 혼합한 혼성화 용액을 핵산 혼성화 기반 AFPA 결과의 이미지로 분석 목적을 위해 스폿 강도를 GenePix Pro 5.0 마이크로 어레이 분석 소프트웨어 (Molecular Devices, USA) 분석을 진행하는 이미지이다.
수득된 미가공 강도는 각각의 스폿의 중간 강도였으며, 이어서 인쇄 버퍼 스폿 (신호 비표적)의 중간 비표적 강도로 정규화되고 GraphPad Prism 7 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., USA)를 사용하여 플롯팅하였다.
실시예 2: 분자 인코드 방식기반 AFPF
TwistDx사(영국) 지침에 따라 .AFPF의 분자 인코드 방식을 위한 프라이머와 프로브의 변형은 다음과 같다.
기본 RPA 반응 경우, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 재조합효소가 선정된 표적핵산의 특정지역을 증폭할 수 있도록, 전자는 변형이 없고 바이오틴이 표지된 올리고뉴클레오티드, 후자는 태그가 표지된 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(IDT., 미국)
TwistAmp™ nfo 경우, nfo 프로브가 바이오틴이 표지된 5' 말단, 뉴클레오타이드를 대체하는 내부 비염기성 뉴클레오타이드 유사체 THF, 및 3' 말단에 phosphate를 폴리머라제 연장 차단 그룹으로 이루어진 올리고뉴클레오티드이고 역방향 프라이머는 태그가 표지된 올리고뉴클레오티드이다(IDT, 미국).
종이 어레이에 고정된 포획 프로브는 기본 RPA 반응 경우, 중합효소가 5‘말단에 바이오틴이 표지된 정방향 프라이머, TwistAmp™ nfo 경우, 5‘말단에 바이오틴이 표지된 TwistAmp™ nfo 의 5’측면 올리고뉴클레오티드 및 5‘말단에 태그가 표지된 RPA 역방향 프라이머로 표적핵산의 특정영역을 증폭한 표적 프로브의 태그와 비공유 결합을 하는 항체를 포함하는 리간드로 제조하였다.
2.1. 태그와 리간드
역방향 프라이머 5' 말단에서 태그가 부가되며 상기 태그는 6-카르복시 플루오레세인(6-FAM), Biotin, CY5Sp, Digoxigenin_N, 6-TAMRASp, Alexa 488 C6-NH, BODIPY FL C5 C6-NH, Cascade Blue C6-NH, DNP-X C6-NH, Dansyl-X C6-NH, Texas Red-XN, 루시퍼 옐로우 또는 벤조피렌를 포함한다.
포획 프로브로 사용되는 항체 또는 리간드는 (i) streptavidin (New England Biolabs, 미국); (ii) 단일클론 anti-Cy5 항체 (Sapphire Bioscience Pty. Ltd., 미국); (iii) 다클론 anti-Digoxigenin 항체 (Roche Diagnostics, 스위스); (iv) 단일클론 anti-TAMRA 항체 (Thermo Fisher Scientific, 미국); (v) 단일클론 anti-Texas Red 항체 (Invitrogen Corporation, 미국); (vi) 다클론 488 anti-Alexa Fluor® 488 항체 (Life Technologies, 미국); (vii) 다클론 항-BODIPY® FL 항체 (Life Technologies, 미국); (viii) 다클론 항-Alexa Fluor® 405/Cascade Blue174; 항체 (Life Technologies, 미국); (ix) 다클론 anti-Dinitrophenyl-KLH 항체 (Life Technologies, 미국); (x) 다클론 anti-Dansyl 항체 (Life Technologies, 미국); (xi) 다클론 Lucifer Yellow 항체 (Life Technologies 사, 미국); 및 (xii) 단일클론 항-벤조 (xiii) 피렌 anti-Benzo(a)pyrene 항체 (Biorbyt 사, 영국을 포함한다.
이들 항체를 니트로셀룰로오스 막의 시험 구역에 침착시켰다. 또한, 다클론 토끼 항-마우스 항체 (Sapphire Bioscience 사, 미국)를 대조군에 침착시켰다.
시각화 용액은 Streptavidin coated AuNP 용액(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하였다.
2.2. 리간드 어레이 제조
리간드가 부착된 종이 어레이의 니트로셀룰로스 막은 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스(3M 사, 미국) 디스크를 사용하였다. 특정 실험에 따라 GE (FF60 또는 FF80HP, GE Healthcare, Amersham, UK) 또는 Millipore (HFB135, Millipore, Billerica, MA)의 니트로셀룰로오스 막을 시험에 사용하였다.
시판되는 항체는 언급된 바와 같이 제조자로부터 구입하였다. 달리 언급되지 않는 한 모든 단백질을 압전 프린터 piezoelectric printer sciFLEXARRAYER S3(Scienion AG, 독일)를 사용하여 막 디스크 상에 3x3 양식으로 <표 8>와 같이 스폿하였다.
분자 인코드
표적핵산의 NCIBI 접속번호 태그 리간드 스폿의 위치
KX289874 CY5Sp 단일클론 anti-Cy5 항체 1x1, 1x2
MN723544.1 Digoxigenin_N 다클론 anti-Digoxigenin 항체 1x3, 2x1
MF630405.1_H7 6-TAMRASp 단일클론 anti-TAMRA 항체 2x2
MF630405.1_N9 Texas Red-XN 단일클론 anti-Texas Red 항체 2x3
MT276598.1 Alexa 488 C6-NH 다클론 anti-Alexa Fluor® 488 항체 3x1, 3x2, 3x3
달리 언급되지 않는 한, 20 μg/mL 단백질을 HBS (10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4) 또는 PBS (10mM 인산 나트륨, 138mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)에서 100μM에서 제조하였다. 시료로부터의 미립자로 프린터 노즐을 막는 것을 피하기 위해, 모든 단백질 용액을 스포팅 전에 5 분 동안 6000g에서 0.2-μm 나일론 막 (VWR, Radnor, PA)을 갖는 원심 필터 장치를 통해 여과하였다.
한 종이 어레이에서 스폿 구성은 250 μm 간격으로 스폿 (스폿 당 30 방울)을 제조하였으며, 막 영역을 포화시키기 위해 각 동일한 스폿을 2 개 이상 제작할 수도 있다.
니트로셀룰로스-결합 단백질 스크리닝을 위해, 원형 스폿은 방울 당 450-500 pL에서 1000 방울을 사용하여 총 ~ 500 nL이 스폿되었다. 스포팅 후, 막을 사용 전 적어도 밤새, 최대 1 주일 동안 건조하에 보관하였다.
2.3. RPA 증폭 및 분자 인코드 혼성화
분자 인코드 방식에서 RPA는 총핵산 시료의 표적핵산의 등온증폭 산물을 암호화하는 단계를 통해 RPA 반응은 제조사(TwistDx, 영국) 지침에 따라 하였다.
분자 인코드 혼성화는 실시례1의 1.7 및 1.8항에 따라 진행하였다. 상기 2.3항에서 준비된 태그와 바이오틴이 표지된 표적 프로브와 종이 어레이의 리간드가 선택적 특이적 결합하여 복합체를 형성하며 상기 형성된 복합체의 말단은 5'- 바이오틴으로 표지되었다. 혼성화 결과는 <도 9>와 같다.
<도9. a> 3x3 양식으로 표기된 표적핵산의 NCBI 접속번호에 상응하는 리간드 포획 프로브가 고정된 종이 어레이에 바이오틴이 표지된 표적프로브 증폭산물 용액을 분자 인코드 혼성화기반 AFPF를 실시하고 시각화 시약 Streptavidin-coated AuNPs(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 처리하여 <도 9. b>와 같이 육안으로 빨간색 스폿을 확인하였으며, 추가적으로 은 나노 입자로 신호를 증폭하여 육안으로 민감도가 더 높은 확인 가능한 스폿을 형성하도록 하였으며 <도 9. b>에서 가로 축은 바이러스 입자의 수이며 세로 축은 은 입자에 의한 신호증강 유무를 구분한 것이다,
실시예 3: RPA -Cas13 증폭 및 핵산혼성화 방식의 AFPF
표본의 핵산 추출에서 COVID-19 RNA의 존재를 확인하기 위해, S 유전자 및 Orf1ab 유전자의 COVID-19 게놈에서 2 개의 하기 표적핵산이 선정허여 합성하였다(바이오니아, 한국).
- S gene fragment:
5’-TAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGC-3’
- Orf1ab gene fragment:
5’-TGAGTGTAATGTGAAAACTACCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACCAGCAAATAATAGTTTAAAAATTACAGAAGAGGTTGGCCACACAGATCTAATGGCTGCTTATGTAGACAATTCTAGTCTTACTATTAAGAAACCTAATGAATTATCTAG-3’
합성 COVID-19 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 RNA 단편의 연속 희석을 사용하여, 마이크로 리터당 10-100 카피 범위의 합성 COVID-19 RNA 서열의 존재를 검출할 수 있다.
COVID-19 PCR 표준은 COVID-19 Wuhan-Hu-1 완전 게놈 (MN908947)의 뉴클레오티드 2941-3420 DNA 절편으로부터 설계하였다. COVID-19 ssDNA 대조군 단편은 IDT 사(미국)를 통해 합성하였다. COVID-19 대조군 DNA 절편은 상업적 공급원이 없었기 때문에 GenBank MN908947.3의 염기서열을 사용하여 제조하였다(IDT 사, 미국).
3.1. 시약 및 올리고뉴클레오티드
RT-RPA 등온 증폭은 TwistAmp® Basic(TwistDx사, 영국) 및 ProtoScript® II 역전사 효소(New England BioLabs 사, 미국)으로 수행했다. 그리고 Cas13을 사용한 바이러스 RNA의 검출는 절단 완충액 (ddH2O 중 400mM Tris pH 7.4), SUPERase
Figure pat00002
n™ RNase 억제제(ThermoFisher Scientific 사, 미국), NxGen® T7 RNA 폴리머라제(루시겐 사, 미국), 리보뉴클레오티드 용액 세트(New England BioLabs 사, 미국), 염화 마그네슘 용액(시그마 알드리치사, 미국), Cas13 단백질 스톡 희석용 저장 완충액 (2.5M의 1M Tris pH 7.4, 6mL의 5M NaCl, 및 2.5mL의 글리세롤 및 100μL의 1M DTT), LwaCas13a 단백질(2mg/mL, ThermoFisher Scientific 사, 미국)를 사용하여 수행하였다.
RPA 프라이머 및 LwaCas13a CRISPR 가이드 RNA는 특정 검출을 위해 제작하였다(IDT 사, 미국).. RPA 프라이머의 정방향 프라이머는 T7 프로모터+GG 염기서열이 부가된 올리고뉴클레오티드이다.
COVID-19 게놈의 RPA 프라이머는 <표 9>과 같으며, IDT에서 주문 제작하였다.
COVID-19 게놈의 RPA-Cas13증폭 반응에서 RPA에 사용하는 올리고뉴클레오티드
프라이머 염기서열
S 유전자 RPA-Forward 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA-3'
RPA-Reverse 5'-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3'
Orf1ab RPA-Forward 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACC-3';
RPA-Reverse 5'-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3
Cas13을 사용한 바이러스 RNA의 검출에 사용하는 올리고뉴클레오티드이며 다음과 같으며 IDT에서 주문 제작하였다.- S 유전자 검출을 위한 LwaCas13a crRNA (S-crRNA : 5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3'
- Orf1ab 유전자 검출용 LwaCas13a crRNA (Orf1ab-crRNA : 5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU-3'
3.2. RT-RPA-Cas13 증폭
단계 (1) - 사전 증폭 작업 영역에서 수행되는 등온 증폭 :
각 시료를 테스트하기 위해 COVID-19 게놈의 S 유전자 표적과 Orf1ab 표적 핵산을 검출하기 위해 한 튜브 RPA 반응을 하였였다. 또한, 합성 바이러스 단편을 사용하여 S 유전자 및 Orf1ab에 대한 양성 대조군을 설정할 수 있다. 테스트 시료를 추가하지 않은 음성 대조군도 설정해야 한다. RPA 키트에 제공된 29.5ul의 재수화 완충액을 사용하여 각 동결 건조된 RPA 펠렛을 재현탁하였다.
COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산의 한 튜브 RPA 반응은 <표 10>과 같이 설정하였다.
COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산의 한 튜브 RPA 반응의 조성
1. Resuspended RPA solution 5.9 ul
2. S-RPA-Forward_v1 (10 uM) & 0.5 ul
3. Orf1ab-RPA-Forward_v1 (10 uM) 0.5 ul
4. S-RPA-Reverse_v1 (10 uM) & 0.5 ul
5. Orf1ab-RPA-Reverse_v1 (10 uM) 0.5 ul
6. ProtoScript RT (100,000U/mL) 0.2 ul
7. ddH2O 0.4 ul
8. Sample 1 ul
9. MgAc (supplied in RPA kit) 0.5 ul
Total 10 ul
완전히 혼합하고 예열된 수조에서 42℃에서 25 분 동안 각 반응을 실시하였다. 반응 후, 단계 (2)에서 반응에 첨가 할 준비가 될 때까지 반응물을 즉시 얼음 상에 다시 놓았다.단계 (2) - RPA 산물에 Cas13 처리하여 바이러스 RNA 서열의 검출
122.5 uL의 저장 완충액을 사용하여 재현탁된 스톡 LwaCas13a 단백질(2 mg/mL, 4 ul)의 분취량을 취하였다.
상기 COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산 RPA 반응산물의 한 튜브 Cas13 감출 반응은 <표 11>과 같이 설정하였다.
COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산 RPA 반응산물의 한 튜브 Cas13 감출 반응의 조성
1. Cleavage Buffer (400mM Tris pH 7.4) 2 ul
2. ddH2O 9.6 ul
3. LwaCas13a protein (resuspended) 2 ul
4. S-crRNA_v1 (10 ng/ul) 1 ul
5. Orf1ab-crRNA_v1 (10 ng/ul) 1 ul
6. SUPERase
Figure pat00003
n RNase Inhibitor 		1 ul
7. Lucigen T7 Polymerase 0.6 ul
8. Ribonucleotide Solution 0.8 ul
9. MgCl2 (120mM) 1 ul
10. RPA reaction from Step (1) 1 ul
Total 20 ul
반응 조성물의 Ribonucleotide 용액은 Biotin-11-UTP, rATP, rGTP 및 rCTP로 구성되어 증폭산물을 바이오틴으로 표지하였다. 모든 반응을 설정한 후, 와류를 완전히 혼합하고 원심 분리기에서 스핀 다운하고 예열된 수조에서 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 반응한 후, 반응 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 AFPF 검사를 위해 단계 (3)으로 진행하였다.단계 (3) - AFPF를 통한 검출 결과의 시각적 판독
종이 어레이는 <실시례 1의 1.3항>에 따라 제조하였다. 단계 (2) 후에, 80ul의 분석 완충제를 각 20ul 반응에 첨가하고 완전히 혼합하였다. <실시례 1의 1.7 및 1.8항>에 따라 상기 희석된 표적 프로브가 있는 반응 증폭산물을 AFPA 여과장치에 넣고 AFPF를 실시하여 종이 어레이의 포획 프로브 염기서열과 표적 프로브의 염기서열의 상보적 결합으로 복합체를 형성하였다.
본 발명의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산에 상응하는 포획프브와 처리한 표적 프로브가 형성하는 복합체 시각화 시약인 Streptavidin-coated AuNPs(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 처리하며 복합체의 바이오틴과 시각화 시약이 결합하여 육안으로 빨간색 스폿을 형성하고 음 대조구는 반응이 없어 무색이다(도 10).
양성 대조군 시료에는 두 줄이 표시되고 음성 대조군 시료에는 스폿만 표시되어야 한다. 각각의 시험 시료에 대해, 양의 COVID-19 결과를 나타내는 2 개의 스폿이 S 및 Orf1ab 유전자 둘 다에 나타나는지 확인하였다.
또한 본원에 따른 증폭산물의 검출은 기존의 경우 아가로즈 전기영동 또는 별도의 장비를 이용한 것이 아닌, 증폭반응 후에 색변화로 바로 결과 확인이 육안으로 검출가능하여 그 편리성이 월등히 향상된다.
실시예 4: RT-LAMP
SARS CoV-2의 빠른 탐지를 위한 RT-LAMP (등온선 램프 기반 방법 COVID-19)라는 램프 기반 방법을 개발하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
표적핵산으로 ORF1ab의 단편을 선택하고 온라인 소프트웨어 Primer Explorer V5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)를 사용하여 RT-LAMP 프라이머를 설계하였다. NCBI BLAST 도구를 사용하여 9 개의 코로나 및 2 개의 인플루엔자 바이러스를 포함한 다른 바이러스 게놈과 표적 서열을 비교하여 프라이머 특이성이 있다.
SARS CoV-2의 빠른 탐지를 위한 RT-LAMP에 사용할 외부프라어머 (F3와 B3)가 위치할 수 있는 DNA의 절편은 SARS CoV-2의 게놈(Sequence ID: MT385497.1) 염기서열 15162~15372(길이 211 nt)이며 하기 실험을 수행하기 위해 SARS CoV-2의 게놈(Sequence ID: MT385497.1)에 대한 염기서열 15212~15422(길이 311 nt)의 DNA 절편을 제조하였다(IDT,미국).
표적 RNA의 제조는 <T7 프로모터+GG>와 표적핵산의 5‘말단의 20개 염기서열로 구성된 정방향 프라이머와 표적핵산의 3’말단의 20개의 상보적인 염기서열인 역방향 프라이머로 PCR하여 T7 프로모터가 있는 DNA를 제조하였다. 상기 제조된 T7 프로모터가 있는 DNA 절편으로 체외전사하여 RNA를 제조하였다.
상기 제조된 RNA가 첨가된 가래 표준 시료에서 실시례 1.5항에 따라 DNA와 RNA 공동 추출한 총핵산 시료를 사용하여하여 RT-LAMP를 검증했다. 65 ℃에서 20 분 동안 반응한 후 반응 튜브에서 분홍색에서 담황색으로 변하는 색상을 관찰하였다. 전기 영동을 사용하여 DNA 증폭 산물의 크기를 추가로 확인하였다. 본 발명의 방법에 사용된 프라이머의 농도는 다음과 같았다.
각각의 외부 프라이머 0.2μM (F3 5'-CCACTAGAGGAGCTACTGTA-3 '및 B3 5'-TGACAAGCTACAACACGT-3'), 각 내부 프라이머 1.6μM (FIP 5'- AGGTGAGGGTTTTCTACATCACTATATTGGAACAAGCAAATTCTATGG-3 '및 BIP 5'-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGTGCGAGCAAGAACAAGTG-3'), 각 루프 프라이머의 0.4 μM iLACO는 SARS-CoV-2 RNA 또는 cDNA의 샘플을 비교할 때 비슷한 성능을 보여 1 단계 등온 증폭이 충분하였다.
잠재적인 현장 및 병상 사용을 위해 반응 프로토콜을 더욱 최적화했다. 65˚ (WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix, M1800; NEB, 미국)에서 수조에서 배양된 1.5 ml 튜브에서 RT-LAMP의 효율성을 검증했으며 바이러스 RNA를 사용한 색 변화에 20 분의 반응 시간이 충분하였다. μL 당 1000 카피의 농도 (즉, 총 20 μL 반응에서 1μL 샘플 사용). 증발을 피하기 위해 필요한 모든 솔루션을 추가한 후 20 μL의 미네랄 오일을 추가하는 것이 이상적이다. RT-LAMP의 검출 한계를 확인하기 위해 합성된 ORF1ab 유전자의 연속 희석 (μL 당 1,000,000 ~ 0.1 카피)을 수행했다. RT-LAMP는 ORF1ab 유전자의 10 개 복제본을 탐지할 수 있다. 사본 수가 10/μL 미만인 샘플은 최대 2 시간 동안 배양 시간이 연장된 경우에도 색상을 변경하지 못했다.
RT-LAMP 탐지 기능을 더욱 확장하기 위해 SYBR 녹색 염료(1:10000 저장 용액, Thermo Fisher의 S7563)를 반응 혼합물에 추가하고 Gel 이미징 시스템으로 색상 변화를 확인했다. 또한 형광 신호와 감도가 향상된 새로운 유형의 핵산 염료 GeneFinderTM (Bridgen의 D039)를 사용할 수도 있다.
<도 11>의 상단은 청색광 하에서 노출시킴으로써, 녹색 형광이 μL 당 1000 카피로 양성 반응에서 육안으로 명확하게 관찰되는 반면, 음성 대조군에서는 분홍색으로 유지된 이미지이며, 하단은 상단에 상응하는 반응산물을 아게로즈 젤에 전기영동한 이미지이다.
이것은 사용된 버퍼의 농도를 조정함으로써 최적화 될 수 있다. 환자 RNA 분리에 사용된 것과 동일한 완충액에 재현탁된 양성 및 음성 대조군 샘플을 항상 사용하는 것이 좋다.
이상에서 본 발명의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

*1000: 표적핵산 자동 검출 장치 100: 시약모듈
110: 저장소 111: 시약저장소
112: 시료 저장소 200: 반응모듈
210: 반응튜브 220: 혼합부
230: 가열부 240: 자기장 인가부
250: 증폭튜브 300: AFPF 모듈
310: 종이어레이 320: 여과장치
400: 영상화모듈 410: 스캔너
420: 증강부 430: 소프트웨어
500: 이송모듈 510: 순환부
511: 시약순환부 512: 시료순환부
513: 중간산물순환부 514: 공기 순환부
520:분배부 530: 펌프
540: 제어부 2000: 표적핵산 자동 다중 검출 장치

Claims (49)

  1. 시료에 용해용액 및 결합용액을 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출하여 형성된 총핵산-자성나노입자(MNP) 복합체를 세척용액으로 정제하는 단계(S100), 여기서, 또는 추가적으로 용출용액을 첨가하여 용출된 총핵산 용액을 획득하며;
    상기 정제된 총핵산-자성나노입자 복합체 또는, 상기 획득한 총핵산이 있는 반응 용액을 등온 증폭하는 단계(S200);
    상기 증폭용액에서 표적핵산을 검출하는 단계(S300);를 포함하는 것을 특징으로 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시료는
    물, 공기, 토양, 동물, 식물, 곰팡이, 세균 및 바이러스를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치 ,
  3. 제2항에 있어서, 상기 동물로부터 얻어진 시료는
    상기 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물 및 소변을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  4. 제2항에 있어서, 상기 바이러스는
    아데노 바이러스;
    중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(중증급성호흡기증후군). 중동호흡기기증후군 코로나 바이러스(중동호흡기증후군) 및 SARS-CoV-2(COVID-19)을 포함하는 코로나 바이러스;
    인플루엔자바이러스 A형/B형/C형/D형, 인플루엔자 및 조류 인플루엔자를 포함하는 오르토믹 소바이러스; 및
    사람 파라인플루엔자 바이러스(사람 파라인플루엔자), 호흡기세포융합 바이러스 사람 및 메타뉴모 바이러스를 포함하는 파라믹소 바이러스;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 한 유형(subtype) 이상을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산은
    게놈 DNA, 게놈 RNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA, 합성 단일-가닥 DNA, 및 합성 단일-가닥 RNA를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단계 S100의 용해 용액은
    Guanidinium thiocyanate(GTC), Dithiothreitol(DTT), Dodium Dodecyl Dulfate(SDS) 및 β-Mercaptoethanol을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  7. 제6항에 있어서, 상기 용해 용액은
    tRNA, Glycogen 및 Acryl Carrier를 포함하는 핵산 침전 보조제에서 선택되어진 어느 하나 이상을 첨가하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법 및 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 S100의 상기 결합용액은
    자성 입자에 음이온 코팅 또는 실리카 코팅된 자성 입자(기능화 자성 입자)를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치
  9. 제7항에 있어서, 상기 음이온 코팅은
    수산기, 아민, 카르복실 산, 에폭시 및 알데히드를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 용출 용액은
    고체상 가역적 고정화(solid-phase reversible immobilisation, SPRI)를 수행하는 용액을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 총핵산이 용출된 자성입자가 있는 용출용액에 자기막대를 넣어 상기 총핵산이 용출된 자성입자를 수확하여 제거하고 정제되거나 또는 정제되고 용출된 총핵산을 수확하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검출 방법 및 장치.
  12. 제1항에 있어서
    상기 단계 S200의 증옥 증폭은 Transcription mediated amplification(TMA), Nucleic acid sequence-based amplification(NASBA), Signal mediated amplification of RNA technology(SMART), Strand displacement amplification(SDA), Rolling circle amplification(RCA), Loop-mediated isothermal amplification(LAMP), Isothermal multiple displacement amplification(IMDA), Helicase dependent amplification(HDA), Single primer isothermal amplification(SPIA) 및 Recombinase polymerase amplification(RPA)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 TMA/NASBA는
    제1항의 반응용액은 RNase H, Reverse transcriptase 및 RNA polymerase를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  14. 제12항에 있어서, 상기 SMART는
    제1항의 반응용액은 DNA Polymerase 및 RNA Polymerase를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  15. 제12항에 있어서, 상기 SDA는
    제1항의 반응용액은 Nicking enzyme 및 DNA polymerase를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  16. 제12항에 있어서, 상기 RCA는
    제1항의 반응용액은 DNA ligase 및 DNA polymerase를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  17. 제12항에 있어서, 상기 LAMP는
    제1항의 반응용액은 DNA polymerase를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  18. 제12항에 있어서, 상기 IMDA는
    제1항의 반응용액은 DNA polymerase 및 Φ29 DNA 중합효소를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  19. 제12항에 있어서, 상기 HDA는
    제1항의 반응용액은 Helicase 및 polymerase를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  20. 제12항에 있어서, 상기 SPIA는
    제1항의 반응용액은 Reverse transciptase, DNA polymerase 및 RNase H를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  21. 제12항에 있어서, 상기 RPA는
    제1항의 반응용액은 Recombinase 및 polymerase를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 효소군에 역전사효소(Reverse transcriptase)를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  23. 제21항 내지 제22항에 있어서,
    상기 효소군에 exo(E. coli exonuclease III), fpg(glycosylase/lyase E. coli fpg) 및 nfo(nfo endonucleases IV)플 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 추가하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  24. 제21항 내지 제22항에 있어서,
    상기 효소군에 CRISPR nuclease를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  25. 제24항에 있어서, 상기 CRISPR nuclease는
    Cas9, Cas 12 및 Cas 13를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  26. 제21항 내지 제25항에 있어서,
    상기 효소군에 RPA 증폭 정방향 프라이머, RPA 역방향 프리이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 첨가하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  27. 제26항에 있어서, 상기 RPA 역방향 프리이머는
    표지물질이 부착된 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치
  28. 제26항 내지 제27항에 있어서, 상기 프라이머를
    2- 아미노푸린-2 '데옥시리보시드 (A*), 2'- 데옥시 -2- 티오티미딘 (T*), 프라이머에 2'- 데옥시이노신 (G*) 및 N4- 틸 -2'- 데옥시시티딘 (C*)를 포함하는 self-avoiding molecular recognition systems (SAMRS) 뉴클레오티드에서 선택된 어느 하나 이상으로 제조하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  29. 제1항에 있어서, 상기 단계 S200의 등온 증폭 반응은
    표지물질을 포함하는 뉴클레오티드 유사체 또는 한 쪽 말단에 표지물질이 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 검출 방법 및 장치.
  30. 제29항에 있어서, 상기 표지물질은
    바이오틴, 형광 나노입자, 양자점(quantum dot: Qdot), 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 금속 나노입자, 형광 염료, 방사성 동위원소, 효소, 다양한 표색 표지, 자성 또는 상자성 표지(예를 들어, 자성 및/또는 상자성 나노입자), 스핀 표지, 방사선-비투과 표지(radio-opaque label)를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  31. 제1항에 있어서, 상기 증폭산물을 검출하는 단계(S300)은
    전기영동, 비색반응, 염기서열결정, 혼성화, 측면 유동 스트립(Lateral-flow strip) 및 능동 유동 종이어레이 여과(Active flow paper array fiter, AFPF))를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  32. 제31항에 있어서, 상기 비색반응은
    나노 금 입자 및 인터킬레이팅 제제를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  33. 제32항에 있어서, 상기 인터킬레이팅 제제는
    SYBR 그린, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열, TOTO계열, 악티노마이신, 아드리아마이신, 안트라센, 벤조피렌, 프로피디움 디이오다이드-인터트위닝(propidium diiodide-intertwining), 디스타마이신, 네트롭신과 아크리딘, 프소랄렌, 베르베린(berberine), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신, 독소루비신, 탈리도마이신, 시아닌 염료 및 LDS 751를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  34. 제32항에 있어서, 상기 나노 금 입자는 상기 등온 증폭하여 형성된 이중가닥 DNA 용액에 NaCl를 첨가하여 발생하는 색상의 변화를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치
  35. 제31항에 있어서, 상기 능동유동 종이 어레이 여과는
    시료에 용해용액 및 결합용액을 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출하여 형성된 총핵산-자성나노입자(MNP) 복합체를 세척용액으로 정제하는 단계(S100), 여기서, 또는 추가적으로 용출 용액을 첨가하여 용출된 총핵산 용액을 획득하며;
    상기 정제도니 총핵산-자성나노입자 복합체 또는, 상기 획득한 총핵산이 있는 반응 용액을 등온 증폭하고 표지물질이 있는 증폭산물을 포함하는 증폭용액을 제조하는 단계(S200);
    상기 증폭산물로부터 단일가닥 표적 프로브를 포함하는 증폭용액을 제조하는 표적프로브 준비 단계(S400);
    상기 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 능동 유동 하에서 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500);
    상기 능동 유동 하에서 상기 종이 어레이에 형성된 표적-포획 프로브 복합체와 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계(S600); 및
    상기 종이 어레이에 있는 세척된 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 단계(S700);를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  36. 제35항에 있어서, 상기 표적 프로브의 단일가닥을 제조하는 방법은
    상기 표적핵산에서 제조된 증폭산물을 포함하는 용액에 효소, 가열 및 pH를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  37. 제36항에 있어서, 상기 효소는
    RNA poymerase 및 Exonuclease를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  38. 제37항에 있어서, 상기 RNA polymeras는
    T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase 및 SP RNA polymerase를 를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  39. 제38항에 있어서, 상기 T7 RNA polymerase를 사용하기 위해서,
    상기 올리고뉴크레오티드 세트에서 선택된 어느 하나에 <T7 프로모터+GG> 염기서열이 부가한 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  40. 제35항에 있어서,
    상기 종이는 셀룰로스, 섬유유리, 나이트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하 개질된 나일론 및 폴리에터 설폰을 포함하는 다공성 재료의 시트에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치
  41. 제35항에 있어서, 상기 능동 유동은
    펌프, 진공 및 원심 분리기를 포함하는 외력에서 선택되어진 어느 하나로 상기 반응용액을 이동시키는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  42. 제35항에 있어서, 상기 여과장치는
    상기 종이 어레이를 포함하는 필터 홀더;
    액체 통로를 밀봉하고 누출을 방지하는 개스킷;
    상기 종이 어레이의 하부 및 상부에 배치하는 O-링;
    액체 통로를 제공하는 주시기; 및
    펌프;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  43. 제31항에 있어서, 상기 측면유동 스트립(Lateral-flow strip)은
    제 33항에 있는 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 측면유동 스트립 장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500); 및
    상기 종이 어레이에 있는 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 단계(S700);를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  44. 시료에 용해용액 및 결합용액을 첨가하여 DNA와 RNA를 공동 추출하여 형성된 총핵산-자성나노입자(MNP) 복합체를 세척용액으로 정제하는 단계, 여기서, 또는 추가적으로 용출 용액을 첨가하여 용출된 총핵산 용액을 획득하며;
    상기 정제된 총핵산-자성나노입자 복합체 또는, 상기 획득한 총핵산이 있는 반응 용액에 하나 이상의 표적 핵산을 대상으로 설계된 올리고뉴클레오티드 세트 1, 재조합효소(Recombinase), 중합효소(Polymerase) 및 nfo(nfo endonucleases IV)를 포함하는 시약집단 1을 첨가하는 단계, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트 1은 표지물질을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 리간드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 최소한 포함하며;
    상기 반응 용액에 있는 표적핵산에서 상기 태그와 표지물질이 포함된 표적 프로브를 제조하는 단계;
    상기 표적 프로브가 있는 용액을 희석하여 하나 이상 리간드(capture)가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과 장치에 능동 유동 하에서 첨가하여 상기 종이에서 상기 표적 프로브의 태그와 상기 리간드가 분자 인코드 복합체를 형성하는 단계;
    상기 능동 유동 하에서 상기 종이에 형성된 복합체로부터 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계; 및
    상기 종이 어레이에 형성된 복합체를 구성하는 증폭 산물의 표지물질을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  45. 제44항에 있어서, 상기 제조된 표적 프로브가
    상기 표적 프로브가 있는 용액을 희석하여 하나 이상 리간드(ligand)가 측면 유동 스트립 장치(Lateral-flow strip device)에 첨가하여 상기 종이에서 상기 표적 프로브의 태그와 상기 리간드가 분자 인코드 복합체를 형성하는 단계;
    상기 능동 유동 하에서 상기 종이에 형성된 복합체로부터 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계; 및
    상기 종이 어레이에 형성된 복합체를 구성하는 증폭 산물의 표지물질을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  46. 제44항 내지 제45항에 있어서, 상기 태그는
    바이오틴, 렉틴, 단백질, 펩티드, 당단백질, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 소분자, 중합체, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 및 지질을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치
  47. 제44항 내지 제45항에 있어서, 상기 리간드는
    아비틴, 항체, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 압타머, 중합체, 렉틴, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 지질을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치
  48. 본 발명의 표적핵산 자동 검출 장치(1000)는
    케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 정제에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100);
    상기 시료와 상기 시약으로 구성된 반응용액에서 총핵산 시료를 준비하는 반응튜브(210). 상기 반응용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 자성 입자를 포획하는 자기장 인가부(240), 등온 증폭 과정을 수행하는 반응 튜브(250)를 포함하는 반응 모듈(200), 여기서 비색반응으로 시각화할 수 있으며; 및
    각각 구성 모듈 사이에 공기 또는 유체 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500);를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치.
  49. 본 발명의 표적핵산 자동 다중 검출 장치(2000)는
    케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 정제에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100);
    상기 시료와 상기 시약으로 구성된 반응용액에서 총핵산 시료를 준비하는 반응 튜브(210). 상기 반응용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 자성 입자를 포획하는 자기장 인가부(240)를 포함하는 반응모듈(200), 여기서 상기 총핵산-자성나노입자 복합체 또는 상기 용출된 총핵산 시료가 있는 반응튜브(210, 250)는 증폭 과정을 수행하고 표적 프로브를 포함하는 용액을 제조하는 반응튜브(210, 250)일 수 있으며;
    상기 표적 프로브가 있는 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이(310)에서 표적-포획 복합체를 형성하는 여과장치(320), 시각화 시약으로 스폿이 형성되는 종이 어레이(310)를 포함하는 AFPF 모듈(300);
    상기 종이 어레이(310)에 있는 스폿을 스캔하는 스캔너(410), 이미지를 중강하는 증강부(420) 및 상기 이미지를 분석하는 소프트웨어(430)를 포함하는 시각화 모듈(400); 및
    각각 구성 모듈 사이에 공기 또는 유체 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500);;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 핵산 검출 방법 및 장치
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