KR20210130612A - 핵산을 단순하게 추출하고 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치 - Google Patents

핵산을 단순하게 추출하고 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시료에서 핵산을 단순하게 추출하고 증폭하여 표적핵산을 검사하는 방법 및 장치를 제안한다. 본 발명에 따른 유사한 임상증상을 제공하는 병원체의 검사 방법 및 장치는 높은 민감도와 특이성으로 신속하게 특정 병원체 감염 여부를 검사할 수 있어 편리성이 증대될 수 있다.

Description

핵산을 단순하게 추출하고 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치{Method and apparatus for target nucleic acid detection by simply extracting and analyzing nucleic acid}
본원은 시료로부터 핵산을 단순하게 추출하고 이를 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치와 관련된 기술이다.
감염병은 전 세계적으로 사망의 주요 원인으로서 인간 건강에 주요 위협이다. 인간의 감염병은 세균, 바이러스, 곰팡이, 원생동물, 벌레 및 프리온과 같은 미생물이 집단으로 병원체라고 불리는 통제 불능 상태에 의해 발생한다. 박테리아와 바이러스는 감염병의 70~88%를 차지한다. 2010년 홍역, 콜레라 및 수막 구균성 질병과 같은 전염병은 1,500만 명이 사망했으며 2030년까지 매년 1,500만 명의 사망을 예상한다. 최근의 예상치 못한 감염병은 감염병 원균이 인간의 전 지구적 이동성이 크게 향상되어 넓은 지리적 거리에서도 빠르게 확산하여 전 세계적으로 전염될 새로운 위험성을 보여 주고 있으며 감염병 발생을 예방하고 치료할 전 세계 의료 시스템의 준비 부족에 대한 깊은 우려가 있다.
통제되지 않은 감염병 확산을 억제하기 위해서는 감염된 개체의 신속한 식별, 검역 및 치료가 필수적이다. 효율적인 치료는 감염성 병원체를 정확하게 식별한 후에만 시작할 수 있다. 심각한 전염병의 경우 감염된 개인의 회복 가능성을 극대화하려면 조기 식별이 중요하다. 감염병 상황에서 발병관리에 대한 모든 지연은 노출과 지리적 확산을 통해 인구에 감염될 위험을 기하급수적으로 높일 것이다. 전염병을 예방하기 위해 정확한 선별, 검역 및 치료를 받아야 하는 사람들의 수가 급격히 증가할 경우, 지역 검사 및 검역 관리자원이 이를 감당할 수 없어 전염병이 통제 불능으로 확산할 수도 있다.
감염원은 감염된 개체의 생물학적 시료(타액, 혈액, 소변 또는 대변)에서 확인할 수 있다. 병원체의 분석은 ELISA, 전자 현미경, 미생물 배양 또는 분자 방법을 사용한 형태학을 이용한 혈청 학적 검사에 의해 전문화된 실험실에서 수행될 수 있다. ELISA에서, 병원성 항원은 효소에 연결된 특정 항체에 결합하여 효소에 부착된 물질의 색 변화로 검사된다. 박테리아와 바이러스는 혈청형내에서 많은 특징을 공유하기 때문에 혈청학적 방법과 형태학적 검사에는 특이성과 감도가 부족하다. 미생물 배양은 병원균이 접종된 세포에서 유도된 특성 변화에 의해 검사되는 특수한 방법이고 시간 소모적이며 연구 기반의 방법이다. 핵산검사는 병원체 DNA 또는 RNA의 추출이 필요하며, 이는 이후 증폭하여 민감하고 특이적인 표적프로브에 의해 확인할 수 있다. 실험실에서 분자 분석법은 시간이 많이 걸리고 특수한 장비와 프로토콜이 필요하다.
시간이 중요한 감염병 관리에서 현재 실험실 기반 검사는 병원체의 적시 식별 요구를 충족시킬 수 없다. 이는 실험실의 처리 능력이 치료 시점에서 환자로부터 채취된 생물학적 시료가 실험실로 이송되고, 고도로 훈련된 직원이 분석을 감독, 실시해야 하며, 그 결과는 일반적으로 24시간 이상이 지난 후에야 얻을 수 있기 때문이다. 자원이 제한된 환경에서는 이 인프라 중 어느 하나도 충족되지 못하며, 치료에 대한 약물치료 옵션이 제한되어있어 전염병 감염에 대한 적시 조치의 필요성이 더 심각하다. 병원체의 진단은 의료 전문가의 증상 관찰만으로 근거할 수 없다. 감염된 개인은 증상이 나타날 때까지 다양한 지연이 있을 수 있으며 많은 감염성인 박테리아와 바이러스는 발열, 체중 감량 및 호흡기 문제와 유사한 증상을 유발한다. 이러한 문제로 감염원을 빠르고 정확하게 식별하기 위해 현장검사가 매우 중요함을 의미한다.
세계 보건기구 (WHO)는 현장검사 장비에 ① 민감성; ② 구체적; ③ 사용자 친화적; ④ 빠르고 강력함; ⑤ 장비 불필요; 그리고 ⑥ 최종 사용자에게 전달 가능의 기준을 고려하고 있다.
현장검사는 항원 및 항체 검사 원리를 이용하는 진단 스트립으로서 상업적으로 널리 사용되기는 하지만 이 스트립 검사는 스트립 당 한 가지 유형의 병원체만 테스트한다는 점에서 주요한 한계가 있다. 올바른 현장검사를 선택하려면 검사 전에 관심있는 병원체를 확인해야 한다. 이런 방식으로는 새로운 발병시 문제가 되는 병원체를 빠르고 비용 효율적으로 식별할 수 없다. 같은 이유로, 스트립은 감염성 병원체를 식별하기 위한 저비용의 신속한 진단 도구로서 일상적인 의료 실무에도 적합하지 않다. 일부 질병의 경우, 진단 스트립은 치료에 정보를 제공하기에 충분한 특이성 (즉, 혈청형)을 제공하지 못하며 심지어 감염된 개체에서도 음성일 수도 있다. 따라서, 높은 특이성이 있는 핵산검사 및 단일검사에서 다중검사도 가능한 차세대 현장검사 장비가 분명히 필요하며, 이들은 전염병 검사는 일반적인 질병 진단과 달리 신속한 질병 확인을 위해 현장검사 장비를 널리 사용하도록 하는 이유이기도 하다. 미세유체 기술은 생물학적 시료 및 시약 부피 감소, 진단 처리 속도 향상 및 단순화, 시료 오염으로 인한 진단 오류 감소 등의 이점으로 칩에서 핵산 다중검사를 자동화하는 유망한 기술일 수 있다. 개발되고 있는 현장검사 장비는 휴대 가능하고 일회용이며 현장검사 장비에 대한 WHO 기준을 충족할 수도 있다.
핵산 진단 기술의 최근 발전은 혁신적이다. 생물학적 시료에서 병원체로부터의 데옥시 리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 추출물의 검사를 통해, 감염성 병원체를 높은 특이성으로 확인할 수 있다. 이 과정에는 몇 가지 주요 단계는 ① 용해 (유전 물질을 노출하기 위해 세포 또는 바이러스 벽의 붕괴); ② 핵산 추출 (다른 세포 내 성분으로부터 DNA/RNA의 분리 및 세척); ③ 특이적 DNA/RNA의 증폭; 및 ④ 병원체 서열을 기준으로 유전 물질을 매칭시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 이러한 4가지 구성요소 단계의 각각 또는 조합으로 간단하고 편리한 표적핵산 검사 방법 및 장치를 제공하고자 한다.
본 발명은 시료로부터 핵산을 단순하게 추출하고 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치, 그리고 이를 이용한 신속하고 간편하게 감염 초기에 유사 임상 증상을 제공하는 병원체의 감염 여부를 검사하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 시료로부터 핵산을 단순하게 추출하고 분석하여 표적핵산 검사 방법 및 장치를 제공하며, 시료에 존재하는 표적핵산에 상응하는 병원체를 증폭으로 검사가 기능하여, 시료에서 감염 초기에 유사 임상 증상을 제공하는 병원균을 신속하고 간편하게 검사를 가능하게 하는 방법을 제공하기 위해,
본 발명의 표적핵산 검사 방법 및 장치는 시료, 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제를 포함하는 혼합용액에서 시료를 용해하여 핵산-결합물질 복합체를 형성하는 용해/추출 단계(S100); 여기서, 또는 상기 혼합용액에서 결합촉진제를 제외하며; 상기 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액을 이용한 세척으로 증폭저해물질을 제거하는 세척 단계(S200), 여기서, 또는 세척된 핵산-결합물질복합체에 용출용액을 사용하여 핵산을 용출하는 과정을 추가하며; 및 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체 또는 용출된 핵산을 포함하는 반응용액에서 표적핵산을 분석하며 동시에 시각화하는 분석 단계(S300);를 포함하거나, 추가적으로 다른 공간에서 상기 증폭된 핵산을 검사하는 방법을 포함할 수 있다.
상기 시료의 용해는 기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로웨이브 방법으로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상으로 실시할 수 있다.
본 발명의 표적핵산 검사 방법 및 장치는 시료에서 추출한 핵산 시료의 세척 및 증폭 반응은 표적핵산을 포함하는 시료와 그렇지 않은 시료를 단순하게 변별할 수 있는 시각화를 실시할 수도 있다.
본 발명의 표적핵산 검사 방법 및 장치에서 시료에서 추출한 핵산 시료의 증폭 반응 결과 분석은 (a) 검사는 비색반응 분석; 또는 (b) 다중검사는 상기 반응물의 측면 유동 장치 또는 능동유동 종기 어레이 여과를 이용한 측정을 통해 결정될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 표적핵산 검사 방법 및 장치는 표적핵산 분석을 위하여 시료에서 추출한 핵산 시료의 증폭산물에 포함된 표적프로브를 검사할 수 있는 포획 프로브가 부착된 종기 어레이를 제공한다.
본 발명의 표적핵산 검사 방법 및 장치는 고감도 및 특이성이 있어 우수한 병원체 진단 기술이다. 전염성 병원체는 분자 방법을 사용하여 높은 특이도로 식별할 수 있다. 본 발명에서 전염병 관리에 사용할 수 있는 휴대 가능하고 강력하고 정확하며 민감한 핵산 진단장치를 개발하였다. 본 발명으로 사람들의 전염성 병원체, 특히 전염성이 높은 균주를 정확하고 시기적절하게 검사하고 전염성 질병을 치료할 목적으로 매우 민감하고 구체적인 병원체 진단의 필수적인 요소들 즉 자원 제한 설정에서의 처리 시간, 다중검사, 검사 감도 및 검사 한계, 특이성 및 용이한 배치를 해결할 수 있어 현장 진료 병원체 진단에서 질병 발생 및 일상적인 의료 환경을 관리하는 데 큰 도움이 될 것이다.
도 1은 표적핵산 검사 방법의 간단한 순서이고,
도 2는 핵산 시료를 단순하게 추출하고 분석하여 분석하는 표적핵산 검사 장치(1000)의 구성도이고.
도 3은 핵산 시료를 단순하게 추출하고 분석하여 다중 분석하는 표적핵산 다중검사 장치(2000)의 구성도이고,
도 4는 바이러스 입자가 있는 시료(LT)에서 얻은 핵산-결합물질 복합체 및 음성 대조구(H2O)를 주형으로, (a)는 β-actin, GFP 및 VSV-G를 RT-PCR 및 (b)는 PCR를 실시하여 아가로스 젤에 전기영동한 결과의 이미지이고,
도 5는 NuncTM 96- Well Polypropylene MicroWellTM 플레이트 및 Whatman No.1 paper를 사용하여 조립된 여과지 기반 96-웰 스핀 플레이트이고,
도 6는 박테리아 세포에서 얻은 핵산-결합물질 복합체를 주형으로 16S rRNA 유전자의 PCR한 결과이고,
도 7은 배양한 암세포에서 다양한 조건에서 분리한 핵산을 주형으로 actin 유전자의 PCR 증폭한 산물을 전기영동한 결과이고. 핵산 분리 조건은 결합물질로 Filter paper 또는 카르복실기 코팅된 자성입자, 결합촉진제로 이소프로판올(IPA), 세척용액은 70% EtOH 또는 증류수(H2O)를 사용하였으며, 그림 상단은 선택된 실험 조건으로 특정물질의 첨가한 경우는 O, 미첨가한 경우는 X로 표시하였으며,
도 8은 다양한 세포 수를 포함하는 시료, 용해물질로 2M GTC, 결합물질로 Whatman No.1 paper 또는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles, 세척용액으로 10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20을 포함하는 TT 버퍼를 사용하고 결합촉진제로 이소프로판올의 첨가(a) 또는 미첨가(b) 실험 조건에서 분리한 핵산을 주형으로 GAPDH 유전자로 PCR한 결과로 세포수(0, 5, 10, 및 100)는 도에 표기하였으며,
도 9는 암세포에서 얻은 핵산-결합물질 복합체에서 용출된 핵산을 주형으로 액틴 유전자의 실시간 PCR한 결과이고,
도 10은 합성한 다양한 표적핵산을 주형으로 제조한 T7 프로모터가 있는 DNA를 전기영동한 이미지이고,
도 11은 음성 대조구(a) 및 표적핵산 KX289874(b)을 주형으로 RPA 반응하고 SYBR 녹색 염료를 추가하여 얻은 색상 변화이고,
도 12는 다양한 표적핵산에 대해 RPA 증폭 산물을 에티디움 브로마이드로 염색된 2 % 아가로스-겔 전기영동하여 분석한 이미지이고,
도 13은 5x3 양식으로 표기된 5종류의 포획 프로브가 고정된 종이 어레이에 한 튜브에서 5종류 표적핵산으로 구성된 스톡 DNA 주형을 단계적 희석 방법으로 준비된 주형들을 RPA하여 얻은 증폭산물을 혼합한 혼성화 용액으로 핵산 혼성화 기반 AFPA 결과를 스폿 강도를 GenePix Pro 5.0 마이크로 어레이 분석 소프트웨어 분석을 진행하는 이미지이고,
도 14는 3x3 양식(a)으로 표기된 표적핵산의 NCBI 접속번호에 상응하는 리간드가 고정된 종이 어레이에 바이오틴이 표지된 표적 프로브 증폭산물 용액을 분자 인코드 혼성화 기반 AFPF 실시하고 Streptavidin-coated AuNPs을 처리하여 형성된 스폿들로 구성된 종이 어레이의 이미지(b의 상단)이고, 추가적으로 은 나노 입자로 신호를 증폭하여 육안으로 민감도가 더 높은 스폿들로 구성된 종이 어레이의 이미지(b의 하단)이며, 여기서 가로 축은 바이러스 입자의 수이며 세로 축은 은 입자에 의한 신호증강 유무를 구분한 것이며,
도 15는 표적핵산 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 RT-RPA-Cas13 증폭 산물을 AFPF 실시한 종이 어레이에 Streptavidin-coated AuNPs를 처리한 결과로 상응하는 포획 프로브가 있는 위치는 빨간색 스폿을 형성하고 음 대조구는 반응이 없어 무색인 어레이이고,
도 16은 (a)는 RT-LAMP 반응산물에 SYBR 녹색 염료을 첨가하여 얻은 색상 변화 이미지로 표적핵산이 1000 카피/μL 이상 양성 반응구에서 녹색형광이 육안으로 명확하게 관찰되는 반면, 음성 대조군에서는 분홍색으로 유지되었으며, (b)는 (a)에 상응하는 반응 산물을 아게로즈 젤에 전기영동한 이미지이다.
본 발명의 표적핵산 검사 방법 및 장치는 <도 1>에 제시한 바와 같이, 시료, 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제를 포함하는 혼합용액에서 시료를 용해하여 핵산-결합물질 복합체를 형성하는 용해/추출 단계(S100); 여기서, 또는 상기 혼합용액에서 결합촉진제를 제외하며; 상기 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액을 이용한 세척으로 증폭저해물질을 제거하는 세척 단계(S200), 여기서, 또는 세척된 핵산-결합물질복합체에 용출용액을 사용하여 핵산을 용출하는 과정을 추가하며; 및 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체 또는 용출된 핵산을 포함하는 반응용액에서 표적핵산을 분석하며 동시에 시각화하는 분석 단계(S300);를 포함하거나, 상기 핵산을 분석하는 방법을 포함할 수도 있다.
본 발명의 시료는 물, 토양, 동물, 식물, 곰팡이, 세균 및 바이러스를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 한 개체 이상에서 얻어지는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 유전자를 포함하며 유전자의 특징으로 개체의 특징을 확인할 수 있으며, 생물학적 의미가 있는 핵산을 분석하여 결정할 수 있다.
생물학적 시료는 전형적으로 인간을 포함하는 포유류의 액상 또는 세포 또는 조직 시료이다. 본원에서 사용될 수 있는 시료는 예를 들면 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 코인두 분비물, 모유를 포함하나 이로 제한하는 것이다. 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.
이런 핵산 분석은 병원체의 검사 및 특징규명에 사용하는 중요한 단서이며 이상적으로는 병인 물질(병원체)의 동정으로부터 시작하는 복잡한 과정에서 매우 중요한 근거일 수 있다.
본 발명의 "검사"는 병원체의 감염 여부, 또는 감염된 대상체의 예후를 판정하는 것, 감염 후 치료 후 재발 여부 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 "프라이머"도 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 압타머(aptamer) 등을 포함하는 것이다.
본 발명의 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 재조합효소 또는 증폭효소를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3‘ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 PCR, RPA 분석 또는 RT-RPA 분석에 사용되는 것이다.
본 발명의 "핵산"은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 임의의 형태의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것이다. 본 발명의 “총핵산”은 시료에 있는 모든 DNA와 RNA를 포함하는 의미이다. 또한 본 발명에 따른 프라이머 세트가 사용되는 인플루엔자 바이러스의 핵산은 인플루엔자 바이러스 유래의 RNA, 예를 들면 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 또는 이에 상응하는 DNA를 포함하는 것이다.
본 발명의 "종이"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 나무 펄프 또는 다른 섬유성 식물 물질로부터의 얇은 시트에 제한되지 않지만, 특정 실시형태에서 본 명세서에 기술된 장치에서 이러한 종이의 사용이 고려된다. 종이는 보다 일반적으로는 유체가 유동-통과하는 것을 허용하는 보통 시트 형태(하지만 이것으로 제한되지 않음)의 다공성 재료를 지칭한다.
본 발명에서 바람직하게, 상기 종이, 다공성 매트릭스는 증폭산물 혼합 상 용액을, 능동유동 종이 어레이 여과 검정법(Active Flow Paper array Filter Assay, AFPF)) 및 측방-유동 검정법(lateral-flow assay)을 포함하는 유동-통과 검정법은 유동-통과하는 것을 허용하기에 충분한 다공성이다.
다공성 매트릭스는 증폭산물 혼합 용액이, 유동-통과(스폿) 검정법 장치를 통해서 수직 및/또는 수평으로 유동하기에 충분하게 충분히 길고/길거나 깊다. 유동-통과(스폿) 검정법에서 다공성 매트릭스는 특히 유리 세라믹(scintered glass ceramic), 미네랄, 셀룰로스, 섬유유리, 나이트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 전하 개질된 나일론, 폴리에터설폰, 이들의 조합물 등과 같은 재료를 포함한다.
다공성 재료, 예컨대 나이트로셀룰로스, 나일론, 셀룰로스 아세테이트, 유리 섬유 및 다른 다공성 중합체가 고체상 면역검정법에서 고체 지지체로서 사용되어 왔다. 소위 측방-유동 검정법(lateral-flow assay)에서, 분석물이 검사될 유체는 다공성 막 층의 한 단부에 적용되고, 이것은 모세관력의 작용 하에서 막을 통해서 측 방향으로 유동하여 검사하고자 하는 분석물에 결합할 수 있는 고정된 "수용체"에 의해서 포획된다.
본 발명의 "dot blot", "어레이" 및 " 마이크로어레이" 는 어느정도 상호 교환 가능한 것으로 사용되며 일반적인 크기에서만 상이하다. 본 발명은 이들 중 어느 것을 제작하고 사용하기 위한 동일한 방법에 관한 것이다. dot blot은 전형적으로 1~100개의 스폿을 함유하며, 어레이 또는 마이크로어레이는 전형적으로 많은 스폿(전형적으로 100~1,000,000+)을 함유하며, 여기서, 각각의 스폿은 공지된 위치에 존재하고 관심있는 특이적인 성분을 함유한다. 그러므로 각각의 어레이는 수많은 상이한 관심있는 성분을 함유한다.
본 발명의 "표적" 또는 "표적핵산"은 본원의 프라이머 세트가 결합하여 본원에 따른 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함하는 것이다.
본 발명의 "상보적" 또는 "상보성"은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성(perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적핵산에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본 발명의 "교잡" 또는 "혼성화"는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본원에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다.
교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있다.
본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 엄격도 조건에서 본원에 따른 표적인 인플루엔자 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에서 프로브(probe)는 표적 프로브(target probe)와 포획 프로브(capture probe)로 구분할 수 있다. 여기서 표적 프로브는 표적 분석물에 대한 증폭산물로 포획 프로브에 결합하여 이중가닥 표적-포획 복합체를 형성할 수도 있다. 또는 표적 프로브에 표지된 태그와 포획 프로브를 구성하는 리간드 사이의 복합체를 형성할 수도 있다.
실시되는 검정법은 1개의 포획 프로브를 이용할 수도 있다. 실시되는 검정법은 적어도 2개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 3개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 4개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 5개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 7개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 10개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 15개의 상이한 포획 프로브, 또는 적어도 20개의 상이한 포획 프로브를 이용할 수도 있다.
바람직하게, 포획 프로브는 종이에 고정될 수 있다. 다공성 나이트로 셀룰로오스 막은 다공성 물질로서, 직접적인 물리적 흡수에 의해 단백질 및/또는 핵산과 같은 기질을 고정화할 수 있다. 고정화 접근법은 마이크로 어레이 및 셀룰로오스 기반 분석법 및 미세 유체 장치에서 입증되었다.
본 발명에서 나이트로 셀룰로오즈 막은 작은 포어 크기(0.1~0.45μm)와 높은 결합력(80~100 μg/cm2)으로 인해 이러한 모든 특성으로 인해 능동유동 종이 어레이 마이크로어레이에 사용하기에 적합한 기질이 될 수 있다.
표적 프로브는 합성 중합체, 금속, 미네랄, 유리, 석영, 세라믹, 생물학적 중합체, 플라스틱, 및 /또는 이들의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 표적 프로브는 금, 은, 백금, 타이타늄, 스테인리스강, 알루미늄 또는 이들의 합금 중 하나 이상을 포함하는 금속을 포함한다. 표적 프로브는 나노입자(예를 들어, 금 나노입자, 은 나노입자 등)를 포함한다.
표적 프로브는 코팅을 추가로 포함한다. 코팅은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 폴리프로필렌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 덱스트란을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코팅은 친수성 단백질을 포함한다.
표적 프로브는 검사 가능한 표지를 포함한다. 검사 가능한 표지는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학 수단에 의해서 검사 가능한 임의의 조성물을 포함한다. 유용한 표지는 형광 나노입자(예를 들어, 양자점(quantum dot: Qdot)), 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 금속 나노입자, 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인(fluorescein), 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등(예를 들어, Molecular Probes, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, 호스 래디쉬퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것), 다양한 표색 표지, 자성 또는 상자성 표지(예를 들어, 자성 및/또는 상자성 나노입자), 스핀 표지, 방사선-비투과 표지(radio-opaque label) 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
표적 프로브는 검사 가능한 표지를 포함하는 또 다른 입자에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리간드는 검사 대역(시험선, 대조선, 시험 영역, 대조 영역)에서 검사 가능한 신호를 제공한다. 검사 가능한 표지/특성은 표색 표지/특성, 형광 표지/특성, 효소 표지/특성, 색상 표지(colorigenic label)/특성, 및/또는 방사성 표지/특성을 포함한다. 리간드는 금 나노입자이고, 검사 가능한 특성은 색상이다. 일부 실시형태에서, 색상은 오렌지색, 적색 또는 자색이다.
본 발명의 방법을 사용하여 검사될 시료는 생물학적 시료를 포함한다. 생물학적 시료는 생물유체, 예컨대 혈액 또는 혈액 분획, 림프, 뇌척수 유체, 정액 유체, 소변, 구강유체, 질 유체 등, 조직 시료, 플라크 시료, 질 스왑 시료, 자궁경관내 스왑 시료, 세포 시료, 조직 또는 기관생검물 또는 흡입물, 조직학적 시편 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
생물학적 시료가 조직을 포함하는 경우, 조직은 용해, 균질화 및/또는 분쇄될 수 있고, 임의로 시료 용액 중에 현탁될 수 있다. 생물학적 시료가 생물학적 유체를 포함하는 경우, 유체는 직접 검정되거나 또는 검정법 전에 시료 용액 중에 현탁될 수 있다. 시료 용액은 생물학적 시료 또는 이의 성분을 보존 또는 안정화하도록 작용할 수 있고/있거나 생물학적 시료 또는 이의 성분을 추출 또는 농축시키도록 작용할 수 있다. 시료 용액은 임의로 보존제 및/또는 효소(프로테아제, 뉴클레아제 등), 및/또는 계면활성제를 함유하는 완충액을 포함할 수 있다.
특히 현장 진단에서, 시료는 검정법 장치에 즉시 또는 약간의 시간 간격 후에 적용될 수 있다. 시료는 검정법이 실시되는 원격 시험 설비에 전달될 수 있다.
생물학적 시료를 수집하는 방법 및 장치는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
동물로부터 얻어진 시료는 상기 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나로부터 얻어진 핵산일 수 있다.
본 발명의 게놈은 동물, 식물, 곰팡이, 세균 및 바이러스를 포함하는 군에서 유전자 집합체를 의미한다. 본 발명에서 게놈 유형은 게놈을 구성하는 유전자의 유형과 유사한 의미로 사용하고 있다. 일반적으로 종의 아형은 분자 생물학적 방법으로 결정할 수 있다. 보편적으로 사용하는 방법은 분류학적 의미가 있는 핵산 유형으로 결정할 수도 있다.
이런 핵산 유형 결정은 감염성 질환의 검사 및 특징규명에 사용하는 중요한 단서이며 이상적으로는 병인 물질(병원체)의 동정으로부터 시작하는 복잡한 과정에서 매우 중요한 근거일 수 있다.
바람직하게, 핵산은 동물 병원체로부터 얻어진 것일 수도 있다. 동물 병원체는 단일-가닥 DNA 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스, 또는 단일-가닥 RNA 바이러스일 수도 있다. 또는 동물 병원체는 박테리아일 수도 있다.
핵산은 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 DNA, 또는 RNA일 수 있다. 핵산은 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA 또는 합성 단일-가닥 DNA일 수 있다.
본 발명의 병원체는 세균 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 한 유형(subtypes) 병원체일 수 있다.
상기 바이러스는 호흡기 바이러스의 한 유형(subtypes) 이상의 바이러스로 아데노 바이러스; 중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(중증급성호흡기증후군). 중동호흡기기증후군 코로나 바이러스(중동호흡기증후군) 및 SARS-CoV-2(COVID-19)을 포함하는 코로나 바이러스; 인플루엔자바이러스 A형/B형/C형/D형, 인플루엔자 및 조류 인플루엔자를 포함하는 오르토믹 소바이러스; 및 사람 파라인플루엔자 바이러스(사람 파라인플루엔자), 호흡기세포융합 바이러스 사람 및 메타뉴모 바이러스를 포함하는 파라믹소 바이러스;로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 한 유형(subtype) 병원체를 특징으로 한다.
본 발명에서 방법 및/또는 장치는 열 사이클링 없이 표적핵산의 증폭을 제공한다(등온 증폭). 핵산 증폭의 등온 방법은 이중 가닥 DNA에 적용될 수 있다. 그러나, 표적핵산 분자는 이중 가닥 DNA 표적에 제한될 필요는 없다. 본 발명에서 등온 증폭 방법에서 사용하기 위한 이중 가닥 DNA는 역전사효소에 의해서, 바이러스 RNA, 또는 mRNA, 또는 다른 단일 가닥 RNA 표적 공급원으로부터 제조할 수 있다. 본 발명에 기술된 비-순환식 증폭 방법에서 사용하기 위한 이중 가닥 DNA는 RNA로부터 제조할 수 있다. 이러한 방법은 하기에 논의된 등온 증폭 방법의 적용 이전에, 초기 단계로서 적용될 수 있다.
본 발명에서 언급하는 핵산의 분석은 증폭, 메칠화 분석 및 염기서열 결정을 포함하며 특히, 염기서열 결정은 Sanger 방법 및 NGS 기술을 포함할 수도 있다.
적합한 증폭 방법은 증폭을 수행하기에 충분한 시약을 폴리뉴클레오타이드와 조합하는 단계로 시작하여 증폭이 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 증폭산물의 정성적 또는 정량적 결정을 허용하기에 충분한 양까지 진행될 때 종결되는 총 시간(T)에 수행되는 증폭 방법을 포함한다. 총 시간(T)은 약 45분 이하, 약 30분 이하, 약 20분 이하, 또는 약 15분 이하일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 폴리뉴클레오타이드를 적어도 약 106배, 적어도 약 107배, 적어도 약108배, 적어도 약 109배, 적어도 약 1010배, 적어도 약 1011배, 또는 적어도 약 1012배까지 증폭시키는 것을 포함한다. 이러한 증폭은 시간 T 내에 수행될 수 있다.
본 방법에서 적합한 증폭 방법은 "실시간" 또는 "정량적" 폴리뉴클레오타이드 증폭 방법을 포함한다. 이러한 방법은, 반응이 진행함에 따라 실시간으로 각 증폭 사이클 후에 폴리뉴클레오타이드 증폭 산물의 축적을 검사할 수 있다. 실시간 방법은, 증폭된 산물의 특정 문턱값 농도에 도달하는 시간(사이클 횟수)이 직접적으로 표적 뉴클레오타이드의 초기 카피 수에 관한 것이기 때문에 정량적이다.
핵산 진단 기술의 최근 발전은 혁신적이다. 생물학적 시료에서 병원체로부터 추출한 데옥시리보 핵산(DNA) 또는 리보 핵산(RNA)의 검사를 통해, 감염성 병원체를 높은 특이성으로 확인할 수 있다. 이 과정에는 몇 가지 주요 단계는 ① 용해(핵산을 노출하기 위한 세포 또는 바이러스 벽의 붕괴); ② 핵산 추출(다른 세포 내 성분으로부터 핵산의 분리 및 세척); ③ 특이적 핵산의 증폭; 및 ④ 병원체 서열을 기준으로 유전 물질을 매칭시키는 단계를 포함한다. 이러한 4가지 구성요소 단계의 각각 또는 조합을 입증한 다양한 미세유체 방법을 개발할 수 있다.
본 발명의 표적핵산 검사 방법 및 장치는 <도 1>에 제시한 바와 같이, 시료, 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제를 포함하는 혼합용액에서 시료를 용해하여 핵산-결합물질 복합체를 형성하는 용해/추출 단계(S100); 여기서, 또는 상기 혼합용액에서 결합촉진제를 제외하며; 상기 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액을 이용한 세척으로 증폭저해물질을 제거하는 세척 단계(S200); 여기서, 세척된 핵산-결합물질복합체에 용출용액을 사용하여 핵산을 용출하는 과정을 추가하며, 및 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체 또는 용출된 핵산을 포함하는 증폭용액에서 표적핵산을 증폭하며 동시에 시각화하는 증폭 단계(S300);를 포함하거나, 상기 증폭된 핵산을 분석하는 방법을 추가적으로 더 포함할 수도 있다.
본 발명은 시료의 용해 및 핵산의 추출을 동시에 수행하고 추출된 핵산을 세척하여 직접 표적핵산을 분석하여 핵산을 검사하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
1. 생물학적 시료의 용해, 핵산 세척 및 증폭
본 발명에서 <도 1>에 제시한 바와 같이, 시료의 용해 및 핵산-결합물질 복합체 형성하는 용해/추출 단계(S100), 상기 형성된 핵산-결합물질 복합체에서 증폭저해물질을 제거하는 세척 단계(S200) 및 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체에서 증폭하여 시각화하는 증폭 단계(S300)를 일정한 공간에서 연속적으로 일렬 단계로 진행할 수 있다. 또한, 상기 단계(S100)를 수행하여 형성된 핵산-결합물질 복합체 또는 단계(S100)과 단계(S200)을 수행하여 세척된 핵산-결합물질 복합체를 다른 공간으로 이송하여 후속 과정을 수행할 수 있다.
1.1. 용해 기법
Lysis는 병원균 식별을 위한 핵산 물질을 추출하기 위해 세포막 또는 세포벽을 파괴하는 첫 번째이자 가장 중요한 단계이다. 용해는 화학적, 기계적, 전기적 또는 열적 수단을 통해 수행될 수 있다. 방법의 선택은 병원체 외피의 구조에 달려있다. 포유 동물 세포의 핵산은 세포질 막에 둘러 싸여있다. 바이러스에서, 핵산은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)라 불리는 단백질 쉘 내에 포함되고, 헤르페스 바이러스 또는 플라비바이러스 (Flavivirus)와 같은 일부 바이러스 패밀리에서, 뉴클레오캡시드는 당 단백질 외피 내에 추가로 포함된다. 박테리아 핵산은 세포벽 내부에 존재하는 세포질 막 내에 둘러 싸여있다. 박테리아의 일부 종에는 추가 외부 다당류 캡슐이 있다. 그람 음성 박테리아는 내부 및 외부 지질 막 사이에 얇은 층의 펩티도 글리 칸을 포함하는 세포벽을 갖는다. 그람 양성 박테리아는 단일 지질 막을 둘러싸는 두꺼운 층의 펩티도글리칸 및 리포테이코산으로 구성된 세포벽을 갖는다. 추가 세포벽으로 인해 박테리아 세포에 비해 포유 동물 세포를 용해시키는 것이 상대적으로 더 쉽다.
생물학적 시료는 다양한 화학적 환경과 함량을 가지고 있다. pH, 이온 강도, 전도도 및 분자 억제제의 존재는 용해를 방해할 수 있다. 또한, 용해 과정은 세포 또는 바이러스로부터 방출된 핵산의 완전성을 손상시킬 수 있다. 게놈 물질의 과도한 분해를 피하기 위해 용해 과정을 조정하도록 주의를 기울여야 한다. 이는 정확한 식별을 방해한다.
1.1.1. 화학 용해
화학적 용해는 병원성 세포의 막 또는 벽을 용해시키기 위해 용액 또는 효소에 의존한다. 완충액 및 효소의 선택은 세포 및 시료 배지의 유형에 의존한다. 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 데옥시 콜레이트, 노닐 페녹시 폴리에톡실 에탄올 (NP-40) 또는 트리톤 -X와 같은 세제는 포유류 세포막의 구성요소 인지질을 용해시키는 일반적인 솔루션이다, 예를 들어, 전형적인 완충제 혼합물은 프로테아제와 혼합된 Tris-HCL, Triton X-100 및 Tween-20을 포함할 수 있다. Triton-X와 EDTA가 포함된 완충액을 사용하여 용해를 위해 최대 3개의 HeLa 세포를 포획하는 일련의 마이크로 웰을 제조하여. 용해 과정은 12초 이내에 완료하였다. 세제 외에도 카오트로픽제는 인지질의 소수성 영역을 용해시켜 포유류 막을 용해시켜 막의 파괴를 유발하는 데에도 사용된다.
박테리아 및 효모 세포벽은 셀룰로오스, 펙틱 다당류 및 페놀 화합물과 같은 다른 생물학적 중합체로 구성되며 에틸렌 디아민 테트라 아세테이트 (EDTA)와 혼합된 리소자임 효소에 의해 용해될 수 있다. 리소자임은 글리코 시드 결합을 끊음으로써 펩티도 글리칸을 소화하는 반면, EDTA는 금속 양이온과 결합하여 세포 효소의 활성을 억제함으로써 DNA 분해로부터 보호한다. 1 % Triton X-100 및 5 % Chelex를 사용하여 온라인 박테리아 세포 용해 및 DNA 추출을 위한 연속 흐름 바이오칩을 개발하였다. DNA를 DNase에 의한 분해로부터 보호하기 위해 졸 렉스를 용해 완충액에 첨가하였다. Achromopeptidase(ACP)는 그람 음성 박테리아의 세포벽과 함께 두꺼운 외막을 용해하기 위해 리소자임 대신에 사용된다. 세포는 때때로 조직으로 클러스터링되고 프로테아제 효소(트립신 또는 콜라게나제)는 개별 세포를 분해하고 제거하는데 사용된다. 세척된 ACP를 사용하여 ACP 효소의 비활성화를 제어하기 위해 일회용 화학 히터를 사용하여 1분 내에 그람 양성 박테리아(Staphylococcus aureus)와 RNA 바이러스(호흡기 세포 융합 바이러스)를 용해시킬 수 있다.
DNA 및 RNA의 완전성을 분해로부터 보호하도록 설계된 용해 완충액은 PureZOL™ RNA 분리 시약과 같이 시판되고 있다. DNA 추출을 위해, 완충액은 수산화나트륨 및 SDS를 함유할 수 있다. 하이드록 사이드 이온은 세포막에서 인지질의 지방산-글리세롤 에스테르 결합을 슬라이스하여 세포 내 물질을 방출한다. 일례에서, 식염수 용액의 전기 분해에 의해 수산화물 이온이 전기 화학적으로 생성된다. RNA 백본은 알칼리 환경에서 가수 분해되기 때문에 이 방법은 RNA 추출에 적합하지 않다. 대신에, RNA 추출 용 완충제는 페놀, 구아니딘 이소티오시아 네이트 및 RNase 억제제를 함유할 수 있다. DNA/RNA 분리를 위한 isotachophoresis와 같은 일부 다운 스트림 방법과의 호환성을 위해 특정 전해질 함량, pH, 이온 강도 및 용액 전도도를 유지하기 위해 특수 용해 버퍼가 필요할 수 있다.
다양한 생물학적 시료에서 특정 병원체 그룹에서만 핵산 물질을 추출하기 위한 선택적 용해를 위한 방법은 거의 없다. 1 % 사포닌을 사용하여 모든 혈액 세포를 용해 시켰으나 박테리아 세포는 Triton X-100 및 사포닌에 의해 영향을 받지 않기 때문에 분석을 위해 박테리아 세포를 그대로 있다. 부착 배양에서 세포를 선택적으로 용해하는 주사 미세 유체 프로브를 개발하였다.
미세 유체 화학 용해는 용해 화학 물질을 세포 내로 확산시키기 위해 추가적인 혼합 단계를 요구한다. 유체 혼합은 미세 유체 규모에서 자연적으로 발생하지 않으며 미세 유체 믹서로 강제적으로 해야한다. 후속 추출 및 증폭 과정의 억제를 피하기 위해 후속 핵산 분석 전에 용해 화학 물질을 제거해야 한다. 예를 들어, SDS 용해 시약의 0.01 %는 시료 증폭 동안 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 공정을 억제한다. 추출 공정에서 세척 및 용리 단계와 같은 용해성 화학 물질을 제거하거나 희석하기 위해서는 추가 단계가 필요하다. 화학 물질의 희석은 게놈 식별의 검사 감도를 감소시키기 때문에 좋지 않은 선택이다.
1.1.2. 기계적 용해
기계적 용해 기술은 날카로운 첨단 또는 고압의 적용으로 세포막을 천공한다. 기계적 용해는 전단, 충격, 연삭 또는 박동의 4가지 유형의 절삭 동작을 통해 이루어진다.
전단 메커니즘을 사용한 용해는 나노바 및 나노 스파이크를 사용할 수 있다. 세포막이 날카로운 개구부를 통과할 때 세포막이 파괴된다. 결정질 실리콘을 습식 에칭함으로써 2μm 스포크 간격 및 10nm의 팁 직경을 갖는 나노-스포크 어레이를 제조하여 2분 이내에 단백질 추출을 위해 세포를 용해시켰으며, 이는 종래의 화학적 용해와 비교할 만하다. 세포는 예리한 산화 아연(ZnO) 팁과 유체 유도 전단력으로 인해 막을 파열함으로써 고정되고 용해된다. 그러나, 직경이 10μm인 Jurkat 세포는 15μm의 갭으로 나노 와이어로부터 빠져나와 비효율적인 용해를 일으킨다. 나노-스포크 어레이는 직경이 13μm 이상인 더 큰 포유 동물 세포의 용해에 매력적이다. 그러나 박테리아 또는 나노 미터 크기의 바이러스는 ㎛ 스포크 간격을 통해 쉽게 벗어날 수 있다.
다공성 중합체 모노리스(Porous polymer monoliths, PPM)는 또한 세포가 미세한 세공을 통과함에 따라 세포벽 및 막의 파괴에서 전단 메커니즘을 이용한다. PPM은 박테리아 세포를 용해하거나 폴리 디메틸 실록산(PDMS) 장치에 형성된 PPM을 이용하여 백혈구를 용해하는 단계가 있다. 대장균 및 B. 서브틸리스의 용해는 PPM과 함께 항균성 중합체를 사용할 수 있다. 항균성 중합체는 미생물을 죽여서 미생물을 억제하는 능력이 있다. 나중에 PPM의 소수성-친수성을 조절함으로써 용해 효율 (89 %)을 향상시킬 수 있다. PPM의 사용이 PCR 증폭 과정을 방해하지 않는다.
기계 용해에서 비드 기반 세포 용해는 비드와의 충돌로 인한 마찰력을 사용하여 막을 파괴할 수 있다. 이 칩은 폴리메틸메타 크릴레이트(PMMA)의 가공된 슬라이드를 사용하여 제조되며 용해 챔버에서 고체 마이크로 비드와 함께 금속 디스크를 견고하게 한다. 자기력은 용해를 위해 세포와 마이크로 비드를 충돌시킴으로써 세포막에 충돌 및 마찰력을 유도하기 위해 디스크를 작동시키는 용해 공정으로 용해할 수 있다. 유사하게, 포도상 구균 표피 박테리아의 세포벽 파괴를 위해 비드 및 자기 교반기를 사용하고 비드 크기, 비드 품질, 사용된 트윈 20 및 유속의 4가지 요소에 기초하여 용해 효율이 변할 수 있다. 작은 구슬과 50%의 양을 사용하면 방출되는 DNA의 양이 증가하였다. 트윈 20의 사용은 세포벽을 변성시켜 DNA 회수를 증가시킨다. 또한, 낮은 유속에서, 용해 효율이 증가한다.
최근 온칩 마이크로 펌프를 사용한 세포 파괴 및 시료 운반을 하는데, 세포 파괴는 PDMS 막의 연동 변형을 사용하여 수행된다. 변형된 막은 환형 채널을 폐쇄하고 충돌 및 마찰력을 이용하여 세포를 파괴할 수 있다.
음향 용해에서, 초음파 캐비테이션을 사용하여 (캐비테이션) 버블이 생성되고, 붕괴된 버블로부터 충격파는 세포벽 및 막을 용해시킬 수 있다. 음향 스트리밍에서 고강도 음향 장은 시간에 독립적인 흐름(수직 흐름)을 생성하여 세포벽/막에 점성 항력을 생성하고 증가시킨다. 인간 암 세포주를 표면 음향파 (SAW)로 용해할 수 있다. 세포 현탁액을 유지하는 20μL 액적이 배치되고 전단 유도 유동이 SAW를 사용하여 액적에서 생성되어 용해를 초래한다.
기계적 용해 기술은 시약이 없지만 세포 크기에 따라 적용이 제한된다. 나노 스포크와 PPM 기공 직경 사이의 간격은 바이러스 용해에이 기술의 사용을 제한한다. 또한, 샤프 스케일 바를 구성하려면 복잡한 제조 공정이 필요하다. 대안적으로, 비드-기반 용해는 비드의 충돌이 핵산을 손상시킬 것이기 때문에 핵산의 완전성을 위협한다.
1.1.3. 전기 용해
전기분해는 전지의 유전 파괴를 유도하기 위해 높은 전기장을 이용한다. 전기 용해의 원리는 외부 전기장이 세포를 향해 인가될 때, 전위차, 즉 유도 막 횡단 전위가 세포막을 가로 질러 발생한다. 이 유도 막 횡단 전위가 임계값을 초과하면, 막상의 인지질은 투과성 및 전기 쌍극자 모멘트(포스페이트 그룹-전기 양성 및 수소 사슬-전기 음성)로 인해 재할당되어 막이 파괴된다.
거시적 전기 용해와 관련된 문제는 전지를 용해하기 위해 고전압이 필요하다. 미세 제조 기술로 미세 전극을 제조하고 전극 사이의 간격을 줄일 수 있으므로 휴대용 배터리 공급 장치를 사용하여 최대 MV/m까지의 전기장을 쉽게 생성할 수 있으며 이러한 전기장은 세포막을 파괴하기에 충분하다. 또한 전기분해를 실현하기 위해 채널의 특정 부분에서 채널 구조를 조작하여 전기장을 강화할 수 있다. 그러나 매력적인 점은 3D 미세전극을 사용하여 전기장을 강화하는 것이다. 나노 스케일 특징으로 장식된 3D 구조적으로 최적화된 미세전극을 사용하여 95%의 효율로 4V로 대장균 세포를 용해시킬 수 있다.
전기 분해의 주요 문제점은 핵산을 변성시키는 줄열 (Joule Heating)이다. 줄 가열은 미세 가공된 전극에서 맥동 직류 (DC) 필드 및 교류 (AC) 필드를 사용함으로써 감소될 수 있다. DC 전압은 전극-전해질 경계에서 원하지 않는 전기 화학 반응을 일으킨다. 예를 들어, 용해 프로세스 동안 생성된 가스 및 기포는 채널을 차단할 수 있다. 또한, 목표 생물학적 분자는 전극-전해질 계면에서 산화 환원 반응의 전기 화학 생성물에 의해 분해될 것이다. 또한 산화 환원 반응은 전극을 손상시킬 수 있다. 용해물의 pH 및 이온 조성은 급격히 변화한다. 이 문제를 해결하기 위해 원치 않는 산화 환원 반응을 피할 수 있는 표면 강화 차단 전극(SEBE)이 개발되었다. 원칙은 전극과 전해질 계면에 얇은 유전체 코팅을 사용하여 차단 전극을 설정하는 것이다. SEBE는 또한 세포 현탁 배지에서 급속한 괴롭힘 전기장을 억제하기 위해 사용되었다. 유사하게, 인듐 주석 산화물(ITO) 전극은 세포에서 원치 않는 패러데이 반응 효과를 발생시킨다. ITO는 그래 핀으로 대체될 수 있다.
맥동 전기장의 사용은 줄열을 감소시키지만, 용해하는 데 필요한 전기장의 양이 셀 크기에 따라 달라짐에 따라 저비용 나노초 맥동 회로의 설계 및 구성에 어려움이 있다. 동일한 장치 구성에서 나노 스케일 바이러스를 용해시키는 데 필요한 전압은 마이크로 스케일 박테리아보다 높다. 또한, 금 및 ITO 전극의 재사용 가능성에 대해서는 논란이 있어 POC 장치의 비용이 증가하고 있다.
1.1.4. 열 용해 기법
열 용해는 고온 (90~100℃)에 의존하여 세포막의 단백질을 변성시킨다. 미세 유체에서, 열 용해는 옴 가열 또는 칩을 핫 플레이트 상에 위치시킴으로써 수행된다. 구불구불한 미세 유체 열 용해 장치는 65℃에서 60초 미만의 대장균 용해. 그들은 간단한 저항 히터를 부착하고 외부 온도를 제어하였다. 그들은 온도 강도와 지속 시간이 증가하면 용해율이 증가할 것이라고 제안하였다. 그러나, 승온은 세포 내에서 대부분의 비-DNA 생체 분자와 RNA를 변성시킨다. DNA는 약 95℃에서 변성되고 RNA는> 65℃에서 분해된다. 선택적 포획 및 용해는 그들은 세포를 포획하기 위해 플라즈마 나노 텍스쳐링된 세포 포획 모듈에 미리 코팅된 항-살모넬라 항체 (80~100%의 효율로)를 사용하였고, 10개의 박테리아 세포까지 온칩 열 용해를 보여 주었다.
1.2. 핵산 추출
용해 후, 막 파편 및 다양한 다당류, 대사산물 및 이온과 함께 세포 또는 바이러스 내의 게놈 물질이 방출된다. 용 해물은 핵산 증폭 억제제, 핵산을 분해하는 뉴클레아제(포스포디에스테르 결합을 절단함으로써)를 포함하며, 최상의 결과를 위해서는 증폭 및 검사 전에 DNA와 RNA를 용해물에서 분리해야 한다. 다운 스트림 프로세싱 및 검사 감도의 성공은 증폭을 위해 추출된 핵산의 양과 순도에 달려있다.
1.2.1. 고상 추출
본 발명에서 핵산의 추출은 시료의 용해와 함께 수행되며 시료가 용해되는 과정 중 또는 후에 용액으로 노출된 핵산이 핵산 결합물질과 복합체를 형성하는 과정을 통해 진행할 수 있다. 상기 핵산 결합물질은 음이온 코팅 또는 실리카 코팅된 자성 입자, 폴리머(polymer) 및 막을 포함하는 군; 및 aluminium oxide, cellulose-based Flinders Technology Associates(FTA) cards, cellulose-based paper 및 silica-based Fusion filters을 포함하는 막을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 막은 핵산결합 화합물을 코팅한 막을 사용할 수 있으며 대표적인 핵산결합 화합물은 호스페르민, PVP 40 및 PEI, 도파민, 3- 아미노 프로필 트리 메톡시실란(APTMS) 및 키토산을 포함하는 양이온성 중합체에서 잠재적인 DNA 결합능을 갖는 다수의 화학 물질일 수도 있다. 또한, Whatman No.1 및 No.4 (GE Life sciences, 미국), Whatman DEAE-cellulose (GE Life sciences, 미국), filter paper (Invitrogen, 미국), blotting filter paper (Immobilon, 미국), FL PVSF (Immobilon, 미국), Hybond N 및 N+ (Amersham, 미국), nylon 및 nylon plus (Qiabrane, 미국), hybond-C extra (Amersham, 미국), bleached & unbleached photocopy paper (Australian paper, 호주), Scott Optimum hand towel (Kimberly-Clark, 미국)를 포함하여 다양한 시판되는 막을 구입하여 상기의 목적으로 사용할 수도 있다.
고체상 추출(SPE) 시스템은 핵산 물질을 수집하기 위한 기능성 표면을 운반체로 활용한다. SPE는 실리콘 미세 기둥, 실리카 비드 또는 기능화된 자성 비드를 사용하여 핵산을 포획한다. 비드는 크기가 더 크고 조작하기 쉽습니다. 핵산 추출은 3 단계 공정을 통해 진행된다. 핵산이 기능화된 비드에 결합하고, DNA와 RNA가 비드에 고정되어있는 동안 불순물이 세척되고, 비드에서 핵산이 용리된다.
실리카 비드 SPE 시스템에서, 실리카 입자는 다공성 중합체 모놀리식으로 배열된다. 실리카계 SPE의 원리는 카오트로픽제에 의해 촉매된 실리카와 핵산의 결합 특성에 기초하여 제형화될 수 있다. 결합을 위해 염 가교가 핵산과 실리카 입자 사이에 형성된다. 이어서, 핵산을 에탄올 및 고농도 염으로 세척하고 저농도 염으로 용출시킨다. 구아니딘은 자연에서 독성이 있고 구아니딘 폐기물이 환경 오염 물질임에도 불구하고 고효율 DNA 추출을 위한 카오트로픽제로 널리 사용된다. 또한, 구아니딘은 PCR 증폭에서 억제제로서 작용하여 생물학적 시료에서 게놈 DNA를 추출하는 염화나트륨(NaCl) 기반 추출 방법을 제안하고 있다. NaCl은 구아니딘을 대체하는 자연스럽고 저렴하며 독성이 없는 녹색 시약이다. 구아니딘과 비교하여 NaCl은 30분 안에 랫트의 전혈에서 667.1~1181.1 ng/mL DNA를 추출할 수 있다. 유사하게, 핵산 추출을 위해 키토산 기반 RNA 결합상을 사용할 수 있다. 키토산은 구아니딘 및 이소프로판올로 인한 PCR 억제 효과를 피하기 위해 사용할 수 있다.
미세 유체 실리카 SPE의 도전적인 절차는 미세 채널 내부에 균일한 비드를 조작하는 것이다. 비드를 조작하기 위해 내장된 유연한 PDMS 멤브레인을 사용할 수 있다. 플렉서블 멤브레인은 다양한 비드 양으로 패킹된 비드의 SVR(Surface-to-Volume Ratio)을 제어하여 안정적인 작동과 셀 포집 효율 향상에 사용된다. 이 장치는 코 면봉의 메티실린 내성 황색 포도상 구균(MRSA)에서 핵산을 전체 추출 과정은 20분 미만에 할 수 있다.
비드가 외부 자기장을 통해 수집되거나 위치될 수 있고, 우수한 내열성을 가지며, 용해 동안 사용된 다양한 화학 물질과 반응하지 않기 때문에 자기 비드가 널리 사용된다. 실리카 코팅된 자성 비드, 올리고(dT) 코팅된 비드 및 서열-특이성 자성 비드가 사용될 수 있다. 실리카-코팅된 자성 비드는 본질적으로 비특이적이며 실리카-기반 SPE와 동일한 원리로 작동하지만, 카오트로픽제의 요구 때문에 다운 스트림 적용에는 제한이 있다.
자성 비드의 추출 효율은 비드의 표면에 결합하는 핵산의 특이성에 달려있다. 올리고 dT 비드는 특정 집단의 활성에 관한 유용한 정보를 포함하는 mRNA를 추출하는 데 특히 바람직하다. poly-A 꼬리는 mRNA에 특이적으로 존재하고 올리고 dT는 일반적인 핵산이 아닌 poly-A 꼬리에만 결합한다. 생물학적 시료의 용해물에서 mRNA를 추출하기 위해 마이크로 채널에 자성 올리고-dT 비드로 구성된 마이크로 칩을 사용한다. 자기 비드 및 mRNA는 피펫팅 단계를 사용하여 칩으로부터 결합된다. 이 장치는 강자성 와이어 어레이를 추가하여 mRNA에 의해 감겨진 자기 비드로부터 용해물을 분리하기 위해 높은 경사 자기장을 생성한다. 유사하게, 서열-특이적 비드에서, 정확한 추출을 위해 정확한 올리고 뉴클레오티드 서열이 비드 표면상에 코팅된다. 짧은 서열 때문에 마이크로 RNA의 추출에는 서열 특이적 비드가 바람직하다.
그러나, 고체상 추출은 작동을 위해 자성 비드, 모놀리 식 다공성 구조 및 패킹 비드의 특수 코팅이 필요하다. SPE는 잘 확립되어 있지만 여러 세척 단계 및 영구 자석의 사용을 위해 펌핑 시약이 필요하므로 칩 면적이 증가한다. 또한, SPE 결합능은 단백질 흡수로 제한된다. 이소프로필 알코올, 구아니디늄 티오시아네이트(GuCN), 구아니디늄 클로라이드(GuHCl) 또는 에탄올을 사용하면 억제 효과로 인해 POC 장치의 작동이 제한된다. 또한, 자성 비드는 비용이 많이 들며, 자원 제한 설정에서의 사용을 제한한다.
Aluminium oxide, cellulose-based Flinders Technology Associates(FTA) cards, 및 silica-based Fusion filters를 포함한 다양한 유형의 막을 사용하여 신속한 핵산 추출할 수 있다. 막으로부터 핵산을 직접 증폭시킴으로써 별도의 핵산 용출 단계에 대한 필요성을 제거함으로써 핵산 정제 공정을 단순화시켰다. 이는 매트릭스의 표면 화학 물질 또는 이에 부착된 잔류 시약(예를 들어, 에탄올, 카오트로픽 염)이 DNA 증폭을 억제하기 때문에 다른 많은 고체상 추출 기술에 비해 유리하다. 그러나, 용출 단계를 제거함에도 불구하고, 이들 모든 방법은 핵산 정제를 돕기 위해 비교적 복잡한 제조 또는 실험 설정, 다중 피펫 팅 단계 또는 전기 장비를 필요로 하며, 이는 다시 현장 기반 분석에 대한 유용성을 제한한다.
셀룰로오스 기반 DNA 결합은 저렴하고 휴대 가능하며 일회용이며 쉽게 변형되므로 분자진단에 이상적이다.
셀룰로오스 정제 시스템은 상업적으로 이용 가능하고 공개된 핵산 추출 절차의 방대한 배열에 비해 수 많은 장점이 있다. 가장 명백한 장점은 일반적인 액체 기반 DNA 추출 방법(예: 페놀/클로로포름, 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드[CTAB] 또는 구아니디늄 염) 또는 실리카 또는 자성입자에 관련된 고체상 DNA 추출 방법보다 훨씬 빠르고 단계가 적다는 것이다. 이 방법은 실리카 기반 Whatman Fusion 5 및 셀룰로스 기반 Whatman FTA 카드를 포함하여 시판되는 필터를 사용하는 최근에 개발된 많은 DNA 추출 방법과 더 밀접한 관계가 있다. 그러나 사용 가능한 멤브레인 기반 절차보다 훨씬 간단하고 빠르다. 예를 들어, FTA 카드에는 세포를 용해시키고 DNA가 분해되는 것을 방지하는 화학 물질이 포함되어 있다. 이러한 화학 물질은 DNA 증폭을 억제하므로 FTA 카드에서 DNA를 증폭하기 전에 여러 세척 및 건조 단계를 거쳐 제거해야 한다. 또한, DNA만 캡처할 수 있는 2분 Fusion-5 기반 정제 방법(2-minute Fusion-5-based purification method)과 달리 Whatman No.1을 사용한 방법을 사용하여 역전사 및 후속 DNA 증폭에 적합한 RNA를 추출할 수도 있다.
DNA 정제를 위한 셀룰로오스의 사용은 상업적으로 이용가능한 실리카계 DNA 정제 방법에 비해 개선된 성능을 갖는다. 셀룰로스를 사용한 DNA 정제는 카오트로픽 염, 에탄올 및 높은 염 농도를 포함한 다양한 화학 물질 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 혼잡제를 포함하는 다양한 화학 물질의 존재하에서 DNA를 셀룰로스에 응집 또는 흡착시킬 수 있다. DNA 구조와 셀룰로오스 섬유와의 상호 작용을 촉진한다. 이들 시스템에서, 이어서 셀룰로오스로부터 DNA를 용출시키기 위해 물 또는 저염 용액이 필요하다. 대조적으로, 셀룰로오스가 순수한 물에서 DNA를 포획할 수 있고, 또한 24시간 동안 많은 양의 물이 있는 상태에서 DNA를 유지할 수 있다. 또한, 셀룰로오스를 이용한 방법은 특정 버퍼에 의존하지 않지만 guanidine 염산염 기반, SDS 기반 또는 트윈 20 기반 추출 버퍼으로 융해 추출물에서 핵산을 성공적으로 추출할 수 있다. 핵산 결합의 정확한 메카니즘은 불분명하지만, 염의 존재하에 핵산 결합된 양이 향상될 수 있다. 이것은 셀룰로오스와 핵산 표면의 음전하가 중화되어 그들 사이의 발수성 정전기력이 제거되기 때문일 수 있다.
핵산 정제를 위한 셀룰로오스 기반 방법은 4 가지 주요 셀룰로오스 특성을 활용한다. 첫째, 셀룰로오스 종이는 모세관 작용을 통해 질량에 비해 비교적 많은 양의 DNA 및/또는 RNA를 빠르게 흡수할 수 있다. 둘째, 핵산은 셀룰로오스 섬유에 의해 신속하게 포획되거나 이에 결합된다. 셋째, 다량의 물에서 장시간 배양한 후에도 충분한 양의 핵산이 셀룰로스에 유지되는 반면 Proteinase K 및 셀룰로오스 및 페놀 화합물을 포함한 억제제는 빠르게 용출된다. 마지막으로, 양으로 하전된 막과 달리, 셀룰로오스는 충분한 양의 결합된 핵산을 증폭 믹스 내로 빠르게 용출할 수 있게 한다. 셀룰로오스로부터의 이러한 빠른 용출은 다른 시스템에 대해 보고된 바와 같이 증폭 믹스에 존재하는 dNTP에 의해 촉매될 가능성이 있다. 종합적으로, 이들 특성은 셀룰로오스를 원치 않는 오염 물질 및 억제제를 핵산으로부터 쉽게 분리하는 동시에 재현 가능한 양의 핵산을 증폭 믹스 내로 전달하는 빠르고 간단한 핵산 정제 시스템에 이상적인 물질로 사용할 수 있게 한다.
기능화 자성 나노 입자
본 발명의 단계 S100의 핵산 세척은 기능화 자성 나노 입자(MNP)이 중요하며 이는 상기 결합용액에 포함된다. 기능화 자성 나노 입자(MNP)의 특성은 고체상 가역적 고정화(solid-phase reversible immobilisation, SPRI)로 용액의 이온강도를 이용하여 핵산과의 흡착 및 탈착을 가역적으로 조절할 수 있으며, 강한 자석이 있는 경우 다중 세척 및 조작 단계가 용이하며, 자기 입자 프로토콜은 원심분리와 무관하고 실험실 환경에서 구매 및 제조하는 데 필요한 재료가 매우 저렴하여 확장성이 높다.
자성 입자 플랫폼의 필수 구성 요소는 입자 자체와 이를 고정시킬 만큼 강한 자석이다. 첫째, 자성 입자는 두 가지 주요 형태, 즉 고체 페라이트(ferrite) 코어로 구성된 비교적 작은 입자 (50 nm ~ 2 μm) 또는 더 큰 페라이트-고분자 조합 (1~5 μm)로 나눌 수 있다. 두 가지 입자 유형 모두 핵산 세척 및 조작에 효과적이나 물리적, 화학적 특성이 다르다. 예를 들어, 더 큰 페라이트-중합체 입자 내의 중합체는 입자의 밀도를 효과적으로 낮추어 취급 단계 동안 현탁액으로부터 침전될 가능성이 적다. 더 작은 고체 코어 페라이트 입자는 결합을 위한 상대 표면적이 더 크며 쉽게 만들 수 있다.
자성 입자는 산화철(Fe3O4 - 마그네타이트)로 구성된 초상 자성 입자(superparamagnetic particles)이며, RNA, DNA, 단백질, 효소 및 유기 소분자를 포함한 생체분자와 결합, 추출 및 세척에 사용하는 소재이다.
Tetraethyl orthosilicate(TEOS), 실릴화된 성분 및 철 (II, III) 산화물 입자와의 반응 비를 조절하여 표면 기능성을 조정할 수 있다. 이 제조 방법에서, 산화철 (Fe3O4) 나노 입자는 계면 활성제없이 아르곤 하에서 염화 제1 철 및 염화 제2 철 수용액의 고전적인 알칼리 방법으로 제조할 수 있다(화학식 1).
2 Fe3 + (aq) + Fe2 + (aq) + 8 OH- → Fe3O4 (s) + 4 H2O (화학식 1)
초상 자성 입자의 다양성은 산화철 코어(일반적으로 Fe3O4)와 다양한 코팅 재료의 조합으로 제조할 수 있다. 자기 특성은 외부 자기장에 의해 입자 이동을 제어할 수 있다. 자기장이 제거되면, 초상 자성 입자는 더 이상 자화되지 않으며 자기 메모리가 없다. 그러나, Fe3O4는 헤마타이트 (Fe2O3)로 쉽게 산화되어 자기를 초상 자성에서 강자성으로 변화시키고 포화 자화(saturation magnetization)를 감소시켜 자기 특성이 약화될 수 있다.
산화를 피하고 금속 코어를 보호하기 위해, 자성 입자를 코팅하기 위해 천연 및 합성 중합체 및 실리카를 사용한다. 코팅 표면에 다양한 화학 작용기가 도입되어 다양한 응용 분야에 대한 안정성, 습윤 특성 및 결합 유연성을 향상시킬 수 있다. 아민, 카르복실 산, 에폭시 및 알데히드에 의한 화학적 관능화는 일반적으로 공유 결합을 통해 표면에 단백질, 효소, RNA, DNA 생체 분자를 고정하는 데 사용할 수 있다.
공유 결합을 위한 기능성을 도입하는 것과 대조적으로, Fe3O4 마이크로 입자의 실리카 코팅에서 핵산 분자의 비공유 결합을 한다. 비공유 결합의 장점은 (1) 시료 준비 후 핵산 분자의 빠르고 간단한 방출과 Fe3O4 @ Silica 입자의 쉬운 제거, (2) 핵산 표면과 입자 표면 사이의 강한 이온 결합을 가능하게 한다. 시료 제조 공정은 시료 유체에 존재하는 핵산 분자에 신속하게 결합할 수 있는 흡수제 물질 또는 자성 실리카 입자를 필요하고, 이어서 시료 유체로부터 핵산 결합 입자를 분리하기 위해 외부 자기장을 적용한다. 분리 후, 핵산 분자는 후속 핵산 증폭 반응을 위해 자성 입자 또는 담체로 부터 탈착된다.
핵산, RNA와 DNA 분자와 빠른 흡착과 탈착이 필요했기 때문에 Fe3O4 나노입자는 실리카로 코팅할 수 있다. DNA 및 RNA 분리를 위한 기존의 방법은 일반적으로 에탄올 또는 이소프로판올 침전을 사용한다. 이 추출 방법은 처리량이 많은 스크리닝 및 진단 테스트를 위해 시료 크기 및 작업단계의 축소를 제한한다. DNA와 RNA의 실리카 표면 흡착은 이러한 한계를 해결할 수 있다.
핵산 세척에 사용되는 자성 입자의 주요 측면은 크기에 관계없이 화학적으로 코팅해야 한다. 이를 수행하는 첫 번째 이유는 입자에 안정성을 제공하기 위한 것이다. 코팅이 없으면 페라이트의 산화로 인해 잠재적으로 민감한 시료가 철 이온으로 오염될 수 있으며 입자는 시간이 지남에 따라 자기 특성을 잃게 된다.
화학 코팅으로 자성 입자를 기능화 자성 입자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 실리카- 또는 카르복실-폴리머 코팅은 입자 안정성을 제공할 뿐만 아니라 화학적으로 불활성(실리카) 또는 음으로 하전(카르복실) 기능화 나노 입자는 용출 단계 동안에 입자로부터 음으로 하전된 핵산의 탈착을 촉진한다. 이 과정에서 실리카 또는 카르복실 코팅 입자를 준비하고 그들의 고정에 적합한 자기랙을 사용할 수 있다.
핵산 처리를 위해 시중에 판매되는 자기나노입자(MNP)를 사용하는 것이 가장 경제적인 방법이며, 본 발명에서 사용한 MNP는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles(GE Healthcare, 미국)이다.
MNP는 자기장 안팎으로 움직여서 쉽게 고정하고 재현탁할 수 있어 매우 유용하다. 가장 간단한 방법은 마이크로 튜브 또는 마이크로 플레이트 형식의 자석 배열로 구성된 고정화 랙을 사용하는 것이다. 랙의 가장 중요한 구성요소는 자석 자체이다. 빠른 분리를 위해서는 N42 등급 이상의 고품질 네오디뮴 자석을 사용할 수 있다.
프로토콜 # 1 : 페라이트 코어 자성입자의 합성
페라이트 나노입자는 다양한 프로토콜을 사용하여 합성할 수 있다. 특수 장비가 필요하지 않고 단순성과 효율성으로 인해 널리 사용되는 공침법(coprecipitation method)을 사용한다. FeCl3 및 FeCl2 용액을 1:2 몰비로 혼합하고 예열된 알칼리 용액에 천천히 적하하여 블랙 페라이트 (Fe3O4) 침전물을 형성시킨다. 이 접근법을 사용하여 합성된 페라이트 입자는 직경이 약 5 내지 20 nm이다. 산소는 페라이트 침전 반응을 방해함으로 사용된 알칼리 용액은 질소가스로 충전하고 80℃ 이상으로 가열되어야 한다. 합성 후, 코어 입자는 탈 이온수로 강력하게 세척한다. 페라이트의 산화를 방지하기 위해 합성 직후 입자를 코팅하는 것이 좋다. 그러나 올레산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP) 또는 기타 화학 물질을 포함하는 세제를 사용하여 단기간에 이들을 안정화시킬 수 있으며, 동결 건조하여 질소가 충전된 밀폐된 곳에 보관할 수 있다.
프로토콜 # 2 : 실리카로 MNP 코팅
실리카로 페라이트 나노입자를 코팅하면 자기입자 산화 및 철 이온의 누출을 방지할 수 있다. 실리카 코팅은 안전한 핵산 침전을 위한 불활성 표면을 제공한다. 페라이트 나노입자를 실리카로 코팅하기 위해, 기본 환경에서 TEOS가 가수 분해되어 자기 코어를 둘러싸는 SiO2 층을 형성하는 변형된 스토버 (St
Figure pat00001
ber) 방법을 사용한다. TEOS의 증가로 실리카 코트의 두께 (따라서 입자의 크기)를 조절할 수 있다. 표준 코팅 프로토콜은 대략 400nm 크기의 실리카 코팅 입자를 생성하며, 이는 광범위한 핵산 세척 및 조작 실험에 사용할 수 있다.
프로토콜 # 3 : 메타크릴 산(methacrylic acid)으로 MNP 코팅 (카르복실 코팅)
자성 입자를 안정화시키는 다른 방법은 카르복실 변성 폴리머로 코팅하는 것이다. 잠재적으로 실리카와 동일한 안정성을 제공하지는 않지만 카르복실 코팅은 페라이트 코어에 약한 음전하를 부여하여 핵산과의 정전기적 상호 작용을 변경하고 궁극적으로 입자 기능에 영향을 미친다. 다른 반응식도 가능하지만, MNP의 상부에서 메타크릴 산 단량체를 중합하여 음으로 하전된 카르복실 코트를 제공하였다. 이를 위해 페라이트 코어 입자를 세제 (나트륨 도데실 설페이트)와 함께 분산시키고 폴리메타크릴 산(PMAA) 층을 자유 라디칼 역행 석출 중합 반응에 의해 입자의 표면에 침착시킨다.
프로토콜 # 4 : 세척 및 크기에 따른 분리
용해 반응 후 핵산의 분리 및 세척은 다양한 생화학 분석에서 필요한 절차이며 원래는 염과 알코올로 침전하여 수행할 수도 있다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 작은 절편의 핵산에 대해 상용 입자 컬럼 또는 자성입자 SPRI를 이용하는 빠른 방법보다 최대 몇 시간의 긴 처리 단계가 필요하다.
자성입자 SPRI 방법의 주요 장점은 하나의 튜브에서 용해 반응 후 순차적 세척할 수 있다는 것이다. 또한, 친수성 조건에서 더 큰 단편이 작은 것보다 더 효율적으로 자기 입자에 결합하기 때문에, 결합 조건을 변화시킴으로써 특정 크기의 핵산을 선택하거나 크기에 따라 분리할 수 있다.
카르복실 또는 실리카 코팅된 자성입자를 사용하여 세척 및 크기에 따른 분리를 할 수 있다. DNA는 고농도의 PEG-8000 및 NaCl에서 분자 군집 형태로 카르복실 입자에 결합하는 반면, 실리카 입자에 카오트로픽 염이 있는 상태에서 실리카 표면에 음전하된 DNA 백본의 친화성으로 결합할 수 있다.
바람직하게, 포집을 위해 실리카 코팅 자성 입자와 Guanidinium thiocyanate(GTC) 를 사용할 수 있다. 결합 완충액의 양에 따라 100 bp와 3,000 bp 사이의 단편을 선택적으로 분리하면서 입력 DNA의 최대 95 %를 회수할 수 있다.
1.2.2. 이소타코포레시스
Isotachophoresis (ITP)는 DNA, RNA 및 기타 용해물 간의 전기영동 이동성의 차이를 사용하여 게놈 물질을 추출 및 농축하는 전기 동력학적 접근 방식이다. 외부 전계가 미세 유체 채널을 가로 질러 적용되어 용해액의 운동을 유도하며, 이는 리딩 용액 (LE, 선행용액)과 트레일링 전해질 (TE, 후행 전해질) 사이에 배치된다. 선행 및 후행 전해질의 선택은 핵심 설계 매개 변수이다. 핵산의 전기영동 이동성은 두 전해질의 이동성 사이에 있어야 하며, 다른 용해물은 TE보다 이동성이 낮아야 한다. 전기영동 이동성은 전하량과 핵산의 유체 역학적 크기에 따라 달라진다. Isotachophoresis와 다양한 용해물의 특성에 대한 포괄적인 고려를 해야 한다. LE 및 TE 이동성의 값은 Peak Master, SIMUL, SPRESSO, Buffer Calculator, STEEP 및 Ionise와 같은 시뮬레이션 소프트웨어에서 할 수 있다. 그러나, 마이크로 칩의 설계 및 분리 길이는 억제제에 대한 지식을 필요로 하며, 이는 복잡한 시료의 농도 및 그의 희석에 따라 변하므로 다양한 시료에서 동일한 디자인의 사용을 제한한다.
6 개의 카르복실 산의 온칩 ITP 분리를 하였으며, 핵산 추출의 ITP 추출을 하였다. ITP는 다양한 용해 및 증폭 방법과 통합되어 다양한 유형의 병원체에 적용되었다. 핵산은 전혈, 세포 배양 및 소변 용해물에서 추출되었다. 이 설계에는 시료 분산을 줄이기 위해 최적화된 회전 형상이 포함되어 있다. 또한, pH를 유지함으로써 추출 효율을 돕기 위해 버퍼링 TE 및 LE가 첨가된다.
본 발명은 빠르고 고-처리량이고 비용 효율적인 시료 용해 및 RNA와 DNA 핵산 추출 단계(S100) 및 세척단계(S200)을 제공한다.
상기 단계 S100 및 단계 S200은 튜브 및 미세채널(microchannel)에서 실시할 수도 있다,
상기 단계 S100에서 시료에 용해물질, 결합물질 및 핵산 결합촉진제를 포함한 용액을 첨가한 혼합용액의 혼합은 diffusion driven 및 chaotic advection를 포함하는 수동 방법 그리고 thermal, optical, magnetic, electrokinetic, hydrodynamic 및 acoustic-based mixing를 포함하는 능동 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 단계 S100에서 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제를 함께 처리하거나 순차적으로 처리할 수 있다. 한 튜브에서 시료에서 DNA 및 RNA 핵산 시료를 세척하고 세척되거나 또는 세척되고 용출된 핵산 시료를 대상으로 증폭을 할 수 있다.
본 발명에서 용해/추출 단계(S100)는 상기 혼합용액에서 DNA와 RNA를 추출하여 형성된 핵산-자성나노입자(MNP) 복합체를 형성하는 공정일 수 있다.
본 발명의 단계 S100에서 한 튜브를 사용하여 시료로부터 용해 과정 및 자성 입자와 핵산 결합 과정으로 DNA 및 RNA 핵산 시료를 공동 추출할 수 있으며, 여기서 또는 추가적인 용출과정을 실시할 수 있으며 자성 입자와 핵산 결합 과정 및 용출과정으로 핵산 시료 세척할 수도 있다.
본 발명의 단계 S100에서 시료로부터 DNA 와 RNA 핵산 시료의 고도로 민감한 추출 및 증폭 검사를 위해 추가로 단순화되고 업데이트된 MNP 기반 핵산 시료 추출 방법을 제공한다.
MNP는 간단한 프로토콜 #1을 통해 합성되고, 프로토콜 #3 단계에 의해 다중-카르 복실기를 갖는 중합체로 작용화한다. 카르복실기와 핵산 사이의 강한 상호 작용으로 인해, 폴리 카르복실-기능화된 MNP는 핵산 시료의 빠르고 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 핵산 시료 추출에서, 복잡한 시료의 핵산 추출 및 세척을 위해서는 하나의 용해/결합 단계 및 하나의 세척 단계가 필요하다.
더욱 중요하게는, 추출된 핵산 시료는 용출 단계없이 복합체와 함께 후속 증폭에 도입될 수 있으며, 이는 작동 시간 및 오염 위험을 크게 줄인다. 빠른 추출 방법은 수동 작동과 자동화 시스템 모두에서 검증되었다. 단순성, 만족스러운 성능 및 견고성으로 인해 이 방법은 현재 등온 증폭 기반 핵산 분석 진단에서 노동 강도를 줄이고 부정적 결과의 가능성을 줄이는 유망한 대안을 제공할 것이다.
본 발명에서 용해물질은 sodium iodide(요오드화 나트륨), sodium perchlorate(과염소산 나트륨), guanidine thiocyanate(구아니딘 티오시아네이트), guanidine isothiocyanate(구아니딘 이소티오시아네이트) 및 guanidine hydrochloride(구아니딘 히드로클로라이드)를 포함하는 카오트로픽 염 및 lithium chloride(염화 리튬), sodium chloride(염화나트륨), potassium chloride(염화칼륨), sodium acetate(아세트산 나트륨), urea(우레아) 및 이들의 혼합물과 같은 다른 물질을 포함하는 군; 및 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 데옥시 콜레이트, 노닐 페녹시 폴리에톡실 에탄올(NP-40) 및 트리톤-X를 포함하는 세제; 및 핵산 침전 보조제를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 특징으로 하며 이들에 국한된 것은 아니다. 이러한 화학 시약은 자성 입자와 결합하여 시료에서 DNA 또는 RNA를 더 효율적으로 추출할 수 있도록 한다.
바이러스 용해 완충제를 합성하기 위해 SDS와 β-mercaptoethanol을 사용할 수도 있다. 그러나 SDS는 결정을 쉽게 형성할 수 있어 시료 처리 중에 불편을 초래할 수 있으며 β-메르캅토에탄올은 특이한 냄새가 있으며 인체 건강 및 환경오염 물질의 위험이 있다.
GTC는 RNase 및 DNase 활성을 억제하고 핵산 및 핵 단백질을 분리하여 RNA 및 DNA 무결성을 보존할 수 있는 강력한 변성제이다. 용해 완충액에 GTC가 없으면 DNA 나 RNA가 자기 입자의 표면에 흡착되지 않는다. DNA와 RNA 공동 추출 수율은 2.0 M GTC 농도에서 가장 높은 추출 효율이다. 다른 GTC 농도는 추출 효율에 거의 영향을 미치지 않았다. 특히 GTC의 농도가 6.0M 일 때 결정화되어 시료 처리 과정에서 불편이 있다.
DTT는 단백질이 추가적인 활동을 잃게 할 뿐만 아니라 가래를 액화시키는 잘 알려진 능력을 가지고 있다. 따라서, 가래는 DTT가 핵산 추출 과정에 포함될 때 전처리를 요구하지 않는다.
본 발명에서 결합물질용액의 주요 구성성분은 기능화 자성 입자로 DNA와 RNA을 흡수하는 능력을 가지고 있으며 GTC를 포함한 일부 용매의 적절한 농도로 흡착 능력이 크게 향상될 수 있다. 음이온은 자성 입자와 핵산의 표면에 존재하고, GTC 또는 암모늄은 핵산과 자성 입자 사이의 가교 역할을 할 수 있다. 수화된 이온을 형성함으로써 핵산 및 자성 입자 둘 모두의 표면상의 수층-자성 입자가 핵산을 흡착하게 한다. GTC는 단일 가닥 DNA의 기본 그룹과 자기 입자 표면의 하이드록실 그룹이 접착력을 강화시키는 화학적 결합을 형성하기 때문에 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 만든다. 따라서 DNA와 RNA는 GTC없이 자기 입자 표면에 거의 흡착되지 않는다.
실온보다 높은 온도에서 더 많은 DNA 및 RNA가 추출할 수 있으며, 60~100℃에서도 RNA 분해가 없으며 반면, 많은 핵산 추출 방법이 실온에서 수행하고 있으나, 실온에서 RNA 추출 효율이 상대적으로 낮아질 수 있다.
본 발명에서 10~90℃ 전후에서 핵산을 추출할 수도 있다. 바람직하게는 30~80℃일 수 있다.
본 발명에서 기능화 자성 나노입자를 이용한 핵산의 추출에서 반응용액의 pH가 중요한 역할을 한다. 알칼리성 조건에서 자성 입자의 흡착 능력에서 거의 차이가 관찰되지 않았지만, 산성 조건에서, 특히 pH가 5 미만 경우 흡착 능력이 급격히 감소할 수 있다. 이러한 결과는 기능화 자성 나노 입자의 작용기 때문에 발생할 수 있다. pH는 너무 낮을 때 양전하를 띠는 자기 입자의 표면에 산이 부착되어 자기 입자에 대한 핵산 결합에 영향을 미쳤다.
본 발명의 핵산 침전 보조제는 Acryl Carrier, 글리코겐, glycoblue(glycogen 과 blue dye가 공유결합한 구조체; Thermo Fisher Scientific 사, 미국) 및 tRNA를 포함하며 모두 DNase 및 RNase 활성이 없다. 아크릴 운반체는 핵산 침전 수율을 향상시키고, 미량 DNA의 회수율을 95~ 98%로 만들 수 있으며, 침전 복구 및 프로브를 위해 짧은 프라이머 (<22bp) 단편과 dNTP를 선택적으로 제거할 수 있는 분자 수준의 아크릴 중합체 용액이다. 아크릴 담체는 핵산 침전 보조제의 가장 일반적인 용도가 된다.
핵산 침전 보조제가 없는 자기 입자에 기초한 이 공동 추출 방법은 다중 RT-qPCR 분석의 요건을 충족시킬 수 있다. 핵산 침전 보조제의 첨가는 RNA 및 DNA 둘 다에 대한 상용 키트의 추출 효율보다 크게 추출 효율을 개선하고 더 높은 수준에 도달할 수 있으며, 이는 아마도 핵산 침전 보조제가 핵산 침전에 우수한 영향을 미쳤기 때문이다.
본 발명에서 핵산결합촉진제로 GTC 및 이소프로판올(isopropanol)을 사용하여 핵산을 자성입자로 침전시키는 데 사용하다. 카르복실 입자와 같이 실리카 입자가 포획에 적합하다. 각 성분의 상대적인 양은 입자:용액:이소프로판올 (2:3:4)을 사용할 수 있다. 핵산 및 입자가 자석에 고정되면, 이소프로판올 및 80 % 에탄올 세척으로 잔류 단백질, GTC 및 기타 염이 제거되어 세척된 핵산의 후속 용출이 가능하다. 효소 DNase 또는 RNase 처리는 초기 입자 세척 전에, 이후에 각각 RNA 또는 DNA만을 생성하기 위해 입자에서 재세척할 수 있다.
박테리아 및 포유동물 세포의 경우, 단백질 변성 및 세포 용해를 위해 sarkosyl 및 GTC 기반 버퍼만 사용하여 핵산을 효율적으로 세척할 수 있다. 정자 또는 비장과 같은 일부 세포 유형의 경우, 2 % β- 머캅토에탄올의 첨가는 각각 염색질 변성을 보조하고 RNA 분해를 억제할 수도 있다.
근육 및 심장과 같은 고형 조직 및 기관으로부터 직접 유래된 세포는 기계적 파괴없이 GTC에서 쉽게 용해되지 않는다. 이 경우, 저염 버퍼에서 먼저 Proteinase K를 사용하여 단백질 분해를 수행한 다음 보다 농축된 (1.5x) GTC 버퍼에서 추가로 변성을 수행할 수 있다. 이 처리량 방법을 사용하면 RNA는 잘 보존되지는 않지만, DNA 세척이 전통적인 페놀-클로로포름 추출과 비교하여 다양한 포유동물 조직 (실리카 또는 카르복실 입자)에서 효율적으로 추출할 수 있다.
본 발명의 세척 단계 S200을 하기 위해, 매우 다양한 시료로부터 초기 용해/추출 단계에 대한 추가 변형이 추가할 수 있다. 예를 들어, 소량의 사전 기계적 파괴로 핵산은 GTC 용해를 사용하여 설비에서 쉽게 추출하거나 저염 단백질 분해 효소와 결합할 수 있다. 핵산은 GTC 완충액 단독으로 용해된 세포를 사용하여 효과적으로 세척할 수 있지만, 일부 사용자는 초기 변성을 위해 산-GTC-페놀 용액을 선호할 수 있다.
본 발명의 세척 단계 S200에서 결합물질에 결합된 DNA 또는 RNA를 갖는 핵산-결합물질 복합체는 1회 이상 세척될 수 있다. 바람직하게는, 세척 용액은 1 내지 100 v/v %의 에탄올 또는 이소프로판올을 함유한다. 또한, 세척 용액은 1 내지 100 v/v %의 에탄올 또는 이소프로판올을 함유한다. 보다 바람직하게는, 세척용액은 수중 1 내지 50 v/v %의 에탄올 또는 이소프로판올의 혼합물이다. 다른 매우 바람직한 세척용액은 40-80 v/v %의 에탄올 또는 이소프로판올과 물의 혼합물이다. 다른 매우 바람직한 세척 용액은 50-99 v/v %의 에탄올 또는 이소프로판올과 물의 혼합물이다. 세척 용액이 약 70 v/v %의 에탄올 또는 이소프로판올과 물의 혼합물인 것이 더욱 바람직하다. 또한 에탄올 또는 이소프로판올이 세척에 바람직하다. 즉, 상업적 공급 업체로부터 얻은 순수한 액체 화합물은 또한 "세척 용액"이라는 용어에 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 단계 S200에서 핵산이 결합물질 표면으로부터 방출되지 않게 하고 바람직하지 않은 오염물을 가능한 철저하게 세척하는 세척용액이 사용된다. 이 세척 단계(S200)는 바람직하게는 핵산-결합물질 복합체를 세척용액과 함께 혼합함으로써 일어난다. 핵산-결합물질 복합체는 바람직하게는 이 단계 동안 재현탁될 수 있다. 또한, 결합물질이 컬럼내의 패킹된 경우, 세척 단계는 컬럼을 세척용액으로 헹구어 발생한다. 바람직하게는, 세척용액은 압력, 흡입, 원심력 또는 중력을 가함으로써 칼럼을 통과한다. 에탄올 또는 이소프로판올이 순수한 형태로 사용될 때 상기도 동일하게 적용된다.
본 발명의 단계 S200에서 오염된 세척용액은 바람직하게는 전술한 단계로 제거할 수 있다. 마지막 세척 단계 후, 물질을 진공에서 잠시 건조시키거나 유체를 증발시킬 수 있다.
카오트로픽제 또는 에탄올 또는 이소프로판올의 농도는 물질에 결합된 DNA 또는 RNA를 용출시키기 위해 감소된다. 바람직하게는, 예를 들어 결합물질을 분리하는 공정은 시료의 나머지 부분으로부터의 결합물질은 고정된 생물학적 물질, 예를 들어 펠렛화함으로써 수행된다. 결합물질 자력 유리 입자의 경우에 중력 또는 자석을 사용하고 상층액을 제거함으로써. 이어서, 고정화된 생물학적 물질을 갖는 자성 유리 입자는 적은 양의 카오트로픽제 및/또는 에탄올 또는 이소프로판올을 갖거나 갖지 않는 다수의 용액에 재현탁된다. 대안적으로, 현탁액은 적은 양의 카오트로픽제 및/또는 에탄올 또는 이소프로판올을 갖지 않거나 또는 적은 용액으로 희석될 수 있다. 염 함량이 낮은 용리 완충액은 특히 0.2 mol/l 미만의 함량을 갖는 완충액이다. 바람직하게는, 용출용액은 완충 목적으로 물질 트리스를 함유할 수 있다. 또한, 용출용액은 탈염수이다. 세척된 DNA 또는 RNA를 포함하는 용액은 이제 다른 반응에 사용될 수 있다. 선택적으로, 핵산 (들)은 예를 들어 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하여 용액으로부터 침전될 수 있다. 침전물은 또한 추가 세척 단계를 거칠 수 있다. 이러한 종류의 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3 판, CSHL Press, 2001에 상세하게 설명되어있다.
DNA 및 RNA 용으로도 많은 상용 키트를 이용할 수 있으며, 에탄올을 첨가하여 DNA 또는 RNA를 실리카 컬럼에 결합시키고 원심 분리기를 사용하여 연속 세척을 수행한다. 플로우스루 컬럼 시스템은 96-웰 형식에 쉽게 적용되지 않는다. 따라서 대부분의 실험실에서는 많은 수의 시료를 사용한 실험이 불가능하다.
박테리아 및 진핵 세포로부터 핵산, DNA 또는 RNA의 분리는 분자 생물학 실험의 출발점이다. 대부분의 세척 키트는 DNA 또는 RNA를 분리하도록 설계 및 판매되고 있다.
Proteinase K와 세제를 사용하여 저염 버퍼에서 세포를 용해시킨 다음 페놀-클로로포름 추출과 에탄올 침전을 하는 것이다. RNA의 경우 RNase 활성을 억제하고 RNA가 실리카 입자에 결합하는 것을 촉진하는 강력한 변성제로서 GTC를 사용하는 것이다.
1.3. 핵산 증폭
본 발명에서 증폭단계(S300)는 추출된 핵산의 농도는 일반적으로 직접 검사에 불충분하기 때문에 검사 전에 꼭 필요하다. 플라즈몬 감지, 반공진 반사광 도파관 (ARROW), 전기 화학적 감지와 같은 증폭이 없는 검사기술이 있지만, 이러한 방법은 절차, 표적 표지에 대한 의존성 및 낮은 검사 감도, 복잡한 제조로 인해 POC 응용에 적합하지 않다. 핵산 증폭에는 온도 조절이 필요한다. 등온 증폭은 단일 온도에서 작동하는 반면, 비등온 증폭에는 다른 처리 단계에서 여러 온도 영역이 필요하다. 증폭의 민감성 및 특이성은 프라이머의 디자인 및 프라이머와 주형의 결합에 따라 달라진다.
1.3.1. 사이클로 열 증폭
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 특정 DNA의 증폭을 위한 가장 보편적인 기술이다. PCR 시약의 주요 성분은 DNA 중합 효소, 2 세트의 프라이머 (올리고뉴클레오티드) 및 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP)이다. DNA 폴리머라제는 새로운 DNA 가닥을 주형 DNA로 중합시키는 효소이다. 프라이머의 두 세트가 있다. 주형 ssDNA에 혼성화하는 역방향 프라이머 및 상보적 ssDNA에 혼성화되는 정방향 프라이머이며 프라이머는 DNA 폴리머라제에 필요한 결합 부위를 제공한다. dNTP는 DNA 중합 효소가 새로운 DNA 가닥을 생성하기 위한 기본 단위이다. DNA를 시작 주형으로 사용하면 PCR은 3단계 열 사이클링을 포함한다. 95℃에서 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 단일 가닥 DNA (ssDNA)로 변성, ~ 55℃에서 프라이머를 ssDNA로 어닐링 및 효소는 72℃에서 어닐링된 프라이머의 신장이 이루어진다. 이러한 열 사이클은 검사를 위한 핵산의 충분한 카피가 있을 때까지 반복된다. 고정 챔버에서 온도를 순환시키거나 PCR 용액을 다른 온도에서 유지되는 반응 챔버를 통해 지속적으로 흐르게 할 수 있다(펌프 또는 대류). 따라서 이론적으로 10억배가 넘는 DNA 분자가 단일 이중 표준 DNA 표적 영역에서 30회 주기 후에 생성할 수 있다. RNA를 증폭시키기 위해, 먼저 상보성 DNA (cDNA)로 전환된 후 역전사 PCR (RT-PCR)을 할 수 있다. 형광 염료를 PCR 용액에 혼합하여 실시간으로 복사 진행을 모니터링하고 초기 DNA 카피 수 (정량적 RT-PCR)를 결정하는 유용한 정보를 제공할 수 있다. 디지털 PCR (dPCR)에서, PCR 용액은 표적 카피 수의 절대 정량을 위해 사용하기 위해 몇 개의 작은 부피의 반응 챔버로 분할될 수 있다.
고정 챔버 중합효소 연쇄 반응 (PCR)
고정 챔버 기반 PCR 칩인 정지형 PCR에서의 속도-제한 단계는 열 사이클 사이의 전이에 대한 가열 및 냉각 속도이다. 고정 챔버와 연속 유동 PCR (CF-PCR) 장치를 비교한 시뮬레이션 연구에서 정지형 PCR이 온도 전이로 인해 CF-PCR에 비해 더 긴 처리 시간(최대 2배)을 필요하다. 고정형 PCR의 최근 개발은 특수 프라이머, 신규 가열 방법 및 다중 게놈 검사 방법 (멀티플렉싱 PCR)의 통합하여 열 사이클링 시간을 줄이는 데 중점을 두고 있다. 감지 감도를 잃지 않고 미세 유체 칩에서 예열된 액체를 순환시켜 초고속 실시간 PCR (2분에 30회 주기)을 개발하였다. 온도 순환에 필요한 시간이 프라이머 및 폴리머라제 농도에 반비례하지만 오판 가능성이 높기 때문에 감도 및 특이성이 감소할 수 있다. 그들은 온도 사이클링을 위한 간단한 핫 배스 (hot bath)로 10~20 배의 농도를 증가시킴으로써 사이클링 시간 (0.4~2초)이 감소된 모세관 기반 고속 PCR을 할 수 있다. 그들은 단일주기 감도와 91.7~95.8 %의 증폭 효율을 달성하면서 35주기로 14.7초에 60bp 게놈 표적을 증폭할 수도 있다.
광학 가열 방법을 통해 빠른 열 제어를 할 수 있다. RT-PCR 증폭을 위해 적외선(IR) 매개 가열을 사용하여 증폭 시간을 줄였다. RNA 기반 인플루엔자 A 바이러스에 대한 분석 시간은 5배(39분) 감소하였다. 플라즈몬 보조광 흡수를 통해 입사 LED 빛을 열로 변환하는 얇은 Au 필름을 사용하여 5 분 내에 55℃ (어닐링)에서 95℃ (변성)까지 열 램핑을 할 수 있다. PCR 반응 어레이에서 온도 제어를 위해 선택적으로 조절되는 단일 복사 열원인 레이저 다이오드를 사용하여 다중화된 PCR에 대한 열 다중화를 할 수 있다. 이 시스템은 500bp 및 600bp amplicon 동시 증폭에 적합한 단일 마이크로 칩에서 다양한 어닐링 온도를 생성할 수 있다. λ- 파지 (68℃에서 500bp 동안 어닐링) 및 EBV 주형 (48℃에서 600bp 동안 어닐링) DNA의 증폭은 110분내에 수행될 수 있다.
딥 스틱 분석에서 H1N1 바이러스의 빠른 분자 검사를 위한 대류 폴리머라제 연쇄 반응(CPCR)을 할 수도 있다. 고정식 온도에서 바닥에서 모세관을 가열하기 위해 완전히 일회용 화학 가열식 열 프로세서가 설치되어 전력이 필요하지 않다. 35분내에 1.0 TCID 50/mL의 감도를 갖는 측면 흐름 스트립을 사용하여 검사를 수행할 수 있다. 셀룰로오스 막은 기계적 용해 및 핵산 여과에 사용된다. 예비 세척 단계가 필요없는 특수 PCR 프라이머를 설계하였다. 특수 프라이머는 주 프라이머 서열 및 폴리 (에틸렌 글리콜) 분자를 통해 주 프라이머에 추가로 연결된 "태그 서열"을 함유한다. 이러한 특수 프라이머는 이중가닥 증폭(ds-PCR)을 생성하는 데 사용된다. 이 프라이머 시스템을 통해 세척되지 않은 ds-PCR 제품과 PDMS 표면에 고정된 캡처 프로브를 혼성화할 수 있다.
미세 유체 기술의 휴대성의 이점에도 불구하고 신중하게 해결해야 할 특정 장애가 있을 수 있다. 특히, RT-PCR의 효율은 생체 분자와 장치의 채널 표면 사이의 상호 작용에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 이는 POC 구현의 작은 부피와 증가된 표면-대 부피 비율에 의해 악화될 수 있다. 성공적인 미세 유체 RT-PCR을 위해서는 모든 장치의 내부 표면을 적절히 보호해야 한다. 코팅 용액으로서 소 혈청 알부민(BSA)을 PCR 용액에 혼합하면 친수성 및 소수성 표면 모두에서 단백질 및 세포 흡착이 억제할 수 있다. BSA와 Tween을 혼합하면 표면에 DNA 및 Taq 중합 효소의 흡착이 최소화시킬 수 있다. 최적의 농도로 PCR 효율이 두 배가 되었다. 마이크로 챔버 표면에 파릴렌 C 코팅을 사용할 수 있다.
다중 표적화 유전자를 동시에 증폭시키기 위해 다중 PCR을 할 수 있다. 그러나, 다중화는 하나의 표적 서열이 다른 표적 서열의 증폭으로 인해 프라이머-프라이머 상호 작용을 통해 발생하는 프라이머-프라이머의 형성으로 제한된다. 이러한 개입을 최소화하기 위해, 고체 프라이머는 PCR 프라이머 중 하나 또는 둘 다를 고체 표면에 임베드할 수 있으며, 다른 PCR 성분은 액체상에 존재한다. 고상 마이크로 챔버 PCR 칩은 조류 인플루엔자 바이러스 RNA의 증폭을 할 수 있다. 액체상 증폭 대신 고상이 사용되어 증폭이 10배 향상된다. 시료 부피는 또한 마이크로 어레이를 증폭 챔버에 통합함으로써 10배만큼 감소되며 이 증폭 과정은 1시간 이내에 완료된다.
지능적인 프라이머 디자인은 감도, 특이성 및 검사 견고도를 지속적으로 향상시켜 프라이머-프라이머 희미한 형성을 피할 수 있어 다중 검사에 중요하다. 허위 프라이밍을 피하기 위한 게놈 정렬 기반 프라이머 디자인으로 102 개 카피/μL의 분석 감도로 7가지의 다른 모기-전염성 뇌척수염 뇌염 바이러스의 동시 검사를 할 수도 있다.
연속 흐름 PCR
연속 흐름 기반 PCR(CF-PCR) 증폭에서, 핵산 및 시약은 고정 히터로 흘러 처리 시간을 단축시킨다. 모세관 과도-기반 CF-PCR은 3개의 열 안정성 구리 블록을 갖는 구불구불한 채널 CF-PCR을 포함하는 것이 CF-PCR에 널리 사용된다. 유량 제어 펌프는 증폭 사이클에서 모든 단계의 처리 시간을 조절하며 증폭 시간을 단축하기 위해 다양한 최적화를 하였다. 이러한 유형의 압력 구동 흐름은 에너지를 소비하며 (정적 PCR보다 2-4배 더 높음) 외부 에너지원과 정밀 펌프가 필요하기 때문에 휴대성이 부족하다. 예를 들어, 고속 상용 열 사이 클러 (SpeedCycler2 및 Philisa)가 사용되었다. 그들은 15분 54 초 내에 종이 펀치로부터 직접 다중화된 STR 증폭을 수행하였다. 마이크로 유체 증폭 챔버 내에서 열을 생성 및 분배하기 위해 누설 표면 탄성파 (SAW) 장치를 사용하였다. 밀폐된 저장소에 주사기 펌프가 있는 공기 압력 메커니즘을 사용하여 유체 플러그를 앞뒤로 빠르게 이동시켜 초고속 미세 유체 PCR 모듈 (6분에 30번의 PCR 사이클)을 개발하였다. 상이한 어닐링 온도를 달성하기 위해 PCR에 대한 열 구배를 달성하기 위해 균일한 저항과 마이크로 히터로 점차적으로 변경된 저항을 결합시켰다. 로타 바이러스의 식별을 위한 연속 흐름 역전사 (RT-PCR) 미세 유체 시스템 및 온라인 형광 분석을 통합하였다. 온도 구역은 원형으로 배열하였다. 그러나, RNA 검사 한계는 종래의 면역 전자 현미경(> 104~105/mL)과 비교하여 6.4 × 104 카피 μL-1이다.
증폭 속도를 높이거나 에너지 소비를 줄이는 패시브 방법을 사용하여 설계가 보다 큰 휴대성이 있는 POC 장치로 발전하고 있다. 고속 효소는 Taq 효소와 같은 감도를 유지하면서 증폭 속도를 높이도록 설계되어 PCR 시간을 2.5시간에서 16분 미만으로 줄였다. CF-PCR용 단일 히터만을 사용하기 위해 삼각 프리즘에 새로운 3D 배열을 개발하였다. 모세관 흐름을 사용하여 CF-PCR 단계를 통해 게놈 용액을 수동적으로 추진하였다. 모세관 유동을 촉진하기 위해, 비이온성 계면 활성제의 코팅으로 장치 표면을 친수성으로 만들어 증폭이 14분 이내에 완료될 수 있게 하였다.
CF-PCR의 검사 감도는 유전체 시료가 장치 채널 내에서 유동하는 동안 축 방향으로 분산되고 희석되기 때문에 좋지 않다. 반복적인 고속 온도 전이로 인해 용액이 증발하거나 기포가 형성될 수 있다. 또한, 상이한 열 증폭 단계에서의 유속 요건은 상이 할 수 있고 유속은 또한 초기 양의 게놈 물질에 의해 제한된다. 유입구와 배출구 모두에 파라핀 오일 플러그를 사용하여 기포의 가능한 핵 생성 위치를 제거하고 다양한 온도 영역에서 시료의 안정적인 유량을 유지하는 데 도움을 준다. 그러나, 오일은 원심분리에 의해 증폭 후 반응 혼합물로부터 분리되어야 한다.
나노 리터 및 펨토 리터의 부피로 표적 DNA 시료를 태깅함으로써 분석물 농도를 증가시킴으로써 PCR의 감도를 향상시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, 의도하지 않은 프라이머 결합 부위의 증폭으로 인한 표적의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 PCR에 대한 수정, 중첩된 PCR이 사용된다. 중첩된 PCR은 두 세트의 프라이머(외부 프라이머 및 중첩 된 프라이머)로 구성된다. 표적 서열은 외부 프라이머를 사용한 1 차 PCR 증폭 과정을 거친다. 두 번째 라운드에서 첫 번째 라운드의 곱은 중첩 프라이머의 템플릿 역할을 한다. 0.2 카피/μL의 감도로 연속 흐름 형식으로 중첩된 PCR을 보여 주었다.
연속 흐름 PCR은 고속 증폭의 이점을 제공하지만 다음과 같은 단점으로 제한된다. CF-PCR은 채널 유동장에서 축 방향 분산의 영향으로 인한 시료의 희석으로 인해 검사 감도가 낮다. 연속 흐름 PCR 증폭 속도는 핵산의 초기 염기 쌍의 양에 의존한다. 또 다른 일반적인 문제는 PCR 용액의 다른 유량을 해당 온도 영역으로 조절하여 다른 증폭 요구 사항을 충족시키는 방법이다.
MALBAC (다중 어닐링 및 루핑 기반 증폭주기)
MALBAC은 균일하고 선형적인 전체 게놈 증폭 방법이다. 원리는 PCR 증폭 전에 핵산의 균일한 준 선형 사전 증폭을 사용한다. 간략하게, 랜덤 프라이머는 단일 표준 주형 DNA에 하이브리드화할 수 있다. 중합 효소는 세미 앰플리콘을 생성하는 데 사용되며, 녹은 후 처리되어 상보적인 끝이 있는 완전한 앰플리콘을 형성한다. 이러한 풀 앰플리콘은 루프 구조로 배열되고 후속 사이클 동안 주형 풀에서 분리되어 선형 증폭을 초래한다. 결국, 이 방법은 완전 앰플리콘의 PCR 지수 증폭으로 전환되었다. MALBAC은 최대 서열 범위를 위해 개별 세포의 카피 수 변이 및 단일점 돌연변이 둘 다의 정확한 검사를 위해 독특한 균일성을 제공한다. MALBAC 기술을 사용하여 다중, 단일 세포, 전체 게놈 증폭(WGA)을 수행할 수 있다. 단일 장치를 사용하여 최대 8개의 단일 셀 MALBAC 반응을 병렬로 수행한다. 세포 용해 및 예비 증폭 및 PCR 증폭을 포함하는 2단계 MALBAC 공정을 포함한 전체 WGA 공정은 최소의 시간은 4시간 이내일 수 있다.
1.3.2. 등온 증폭
처리를 단순화하기 위해, 단일 조절된 온도에서 게놈 물질을 증폭시키기 위한 다양한 새로운 반응이 발명되었다. 이러한 등온 방법은 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 재조합 효소 중합 효소 증폭(RPA), 헬리 케이스-의존적 증폭(HDA), 롤링 서클 증폭(RCA), 프라이머 생성 롤링 서클 증폭(PG-RCA), 스트랜드 변위 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA), 분지형 DNA 신호 증폭(bDNA) 및 단일 프라이머 등온 증폭 (SPIA) 등이 있다. 이러한 등온 증폭 중에서 대표적인 기술은 NASBA, LAMP, RPA, HDA 및 RCA이다.
핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)
NASBA는 mRNA, rRNA, tmRNA, 게놈 RNA 또는 단일 가닥 DNA의 증폭을 위해 핵산 전사로부터 실시할 수 있다. 반응은 역전사 효소를 배제함으로써 시간을 절약하고, DNA로부터의 간섭이 감소된다(증폭은 41℃에서 발생하며, 이는 DNA 변성에 대한 온도 임계치보다 낮다). 고온에서 초기 변성 단계를 거치면 NASBA를 수정하여 dsDNA를 증폭시킬 수 있다. NASBA는 90-120분 안에 109 배 증폭을 한다. 프라이머가 초기 어닐링을 필요함으로 NASBA 공정은 완전히 등온성이 아니며 반응 효소의 민감도를 손상될 수 있다.
루프 매개 등온 증폭 (LAMP)
LAMP는 4개의 표적 특이적 프라이머를 사용하여 주형 DNA 서열의 각 측면에 위치한 6개의 별개의 부위를 인식한다. 간단히 말해서, 루프 영역을 통해 발생하는 두 종류의 신장 반응의 반복을 통해 증폭이 계속된다. 먼저, 3'- 말단에 형성된 줄기-루프 구조로부터 주형이 신장 후, 새로운 프라이머를 루프 영역에 결합 및 신장시킨다. 증폭은 60 내지 65℃에서 진행된다. 대상의 109 카피는 1시간 내에 증폭할 수 있다. LAMP는 증폭 기능과 검사 기능을 통합하고 다양한 판독 옵션을 허용한다. 표적화된 핵산의 존재는 육안으로 반응 챔버에서 탁도 또는 형광 염료의 변화로서 가시화할 수 있거나 겔 전기 영동 또는 전기 화학적 측정에 의해 검사할 수 있다. LAMP 탐지는 PCR과 비교하여 불순한 시료에 대해 더 강력한다. 이는 자원이 고갈된 환경에서 POC 장치로 배치할 경우 또 다른 이점으로, 탐지 감도가 향상되거나 시료 준비 절차가 간소화된다. 미세 유체 LAMP 칩은 매우 적은 양의 초기 핵산 주형으로 미세 유체 기반 LAMP 증폭의 가능성을 보여 주었다. LAMP는 반응 분석에서 4 개의 프라이머로 인해 증폭 동안 올리고 뉴클레오티드의 자체 프라이밍 (self-priming)을 겪고 있으며, 이는 분석 조건 (프라이머의 농도, 마그네슘 이온의 농도 및 데옥시 뉴클레오티드 및 폴리머 라제 )및 차단 시간을 최적화함으로써 LAMP의 위양성 결과를 완화할 수 있다. 불행하게도, 액체 시약은 냉동 형태로 운송 및 보관된다. POC 환경에서의 배치를 용이하게 하기 위해 LAMP 시약은 56 ℃에서 최대 30 일의 저장 수명으로 건조 된 형태로 보관할 수 있다. 장기 보관을 위해 4 ℃로 유지 된 저 융점 아가 로스 겔 내에 시약을 저장할 수 있었다.
LAMP 기반 방법은 POC 장치에 사용하고 사용 편의성 및 분석 견고성을 향상시키기 위한 연구를 활발하게 하고 있다. 인간 전혈 또는 우유에서 박테리아 세포막을 용해시키고 PCR 억제제를 불활성화할 수 있는 PCR 완충액을 이용함으로써 게놈 추출 공정을 제거하기 위한 직접 LAMP 기술을 할 수 있다. 최근 가장 가능성 있는 수(MPN)를 가진 통합 LAMP인 MPN-LAMP는 시료 처리 단계 및 관련 핵산 손실을 제거하는 직접 세포 기반 기술이다. 다중화된 램프 증폭은 또한 간단한 미세 유체 모세관을 사용하여 입증된다. 다중 장치의 감도는 전형적인 PCR보다 100배 더 우수한 것으로 밝혀졌고, 실시간 PCR의 감도와 비교될 수 있다. 또한 아가로스 겔 예비 저장으로 3개의 카피/μL의 검사 감도로 4개의 박테리아 DNA 표적의 다중 검사를 하였다.
재조합효소 중합효소 증폭 (RPA)
RPA은 단백질과 효소의 정확한 조합, 즉 재조합 효소, 단일 가닥 결합 단백질 (SSB) 및 가닥 치환 DNA 중합효소를 사용하는 빠른 증폭 기술이다. 재조합 효소는 이중가닥 DNA에서 상동성 서열을 갖는 한 쌍의 프라이머 및 올리고 뉴클레오티드와 복합체를 형성한다. 이 시점에서 SSB는 변위된 DNA 가닥에 결합하여 생성된 D 루프를 안정화시킨다. 마지막으로 DNA 중합 효소가 증폭 과정을 시작한다. RPA 반응은 37 내지 41℃에서 발생하고 104 배 증폭; RPA 증폭은 높은 특이성으로 10 분 이내에 실시된다. RPA는 프로브 기반 검사 방법이며 실시간 미세 유체 RPA 칩으로 20분 동안 1000 DNA 카피 (1fg에 해당)의 검사 한계를 갖는 클로스트리디움 디피실레의 동정을 할 수 있다. RPA 시약은 45℃에서 최대 3주 동안 안정적이며 냉동하지 않고 운반할 수 있다. 이것은 특히 자원 제한 영역에서 사용하기 위한 휴대성의 주요 이점이다. 프라이머 이량체의 형성을 최소화하고 다중 증폭에서 비특이적 생성물의 양을 줄이기 위해 고상 RPA 증폭을 사용할 수 있다. 온칩 RPA는 게놈 DNA의 10개 사본을 증폭할 수 있어 특히 민감한 방법이다. RPA는 빠른 증폭 기술이지만, 개시 시약이 핵산 시료와 사전 혼합될 때 실온에서 원치 않는 예비 증폭이 발생할 수 있다. 예비 증폭은 잘못된 양성 결과를 초래하는데, 이는 핵산 주형을 더 일찍 섹션으로 나누고 개시 시약을 첨가함으로써 방지할 수 있다. RPA의 또 다른 단점은 잘 설계된 프라이머 간의 상호 작용이다. 이는 시료의 증폭 및 양자화를 방해할 수 있다. SAMA(Self-Avoiding Molecular Recognition System)를 사용하여 이를 피할 수 있다. 이 SAMRS는 DNA에만 결합하고 다른 뉴클레오티드 서열에는 결합하지 않는 뉴클레오티드 서열이다. 이 외에도 RPA는 전혈 및 큰 배경 DNA에 의해 억제된다.
헬리케이스 종속 증폭(HDA)
HDA는 sDNA를 단일 가닥 주형으로 변성시키기 위해 승온 대신에 DNA 헬리케이스를 사용하여, 최대 수 킬로베이스 길이의 주형 지향 등온 증폭을 가능하게 한다. 긴 핵산 서열을 증폭시키는 능력 외에, HDA의 작동 온도는 또한 장치를 단순화시키는 이점이 있다. 2 개의 프라이머 및 DNA 폴리머라제는 37℃에서 어닐링된다. 연속 흐름 HDA 증폭을 위한 히터로 PCB의 구리를 사용할 수 있다. HDA는 증폭 혼합물의 DNA가 비정규 접힘 또는 프라이머 이량체를 쉽게 형성할 수 있어 검사 감도가 낮아지고 위양성 및 위음성 결과가 높아질 수 있다는 점에서 RPA 및 LAMP와의 일반적인 단점을 공유한다. 이러한 문제는 SAMRS 또는 블로머-프라이머 헬리 케이트-의존적 증폭(bpHDA)에 의해 완화될 수 있다. bpHDA에서, 차단된 프라이머는 프라이머 연장을 피하기 위해 차단된 3'- 말단에 4 개의 염기 상류에 도입된 단일 리보 뉴클레오티드 연결로 설계된다. 이 bpHDA는 직접 확장할 수 없다. 대신, RNase H2를 사용한 핫 스타트가 필요하므로 bpHDA가 RNA 표적에 부적합하다.
롤링 서클 증폭(RCA)
RCA 공정은 뉴클레오티드를 주형에 첨가하여 원형 핵산 주형을 증폭시켜 DNA 또는 RNA 중합 효소의 영향 하에서 반복적인 탠덤을 갖는 긴 ssDNA를 생성한다. 증폭은 37 ℃에서 선형이며 1 시간 내에 103배 증가할 수 있다. HRCA (hyper-branched RCA) (또는 증폭 증폭)는 RCA 생성물이 제 2 또는 제 3 세트의 프라이머로 추가 증폭을 위한 주형으로 사용되는 지수 증폭 변형이다. HRCA는 60℃에서 활성화해야하며 90분 내에 109배 증폭을 달성한다. 촉매 hemin/G-quadruplex의 도움으로, RCA는 탁월한 감도를 달성하고 단일 DNA 분자를 검사하고 단일 염기쌍 분해능을 갖는 DNA를 구별 할 수 있다. 자동화된 RCA 미세 유체 시스템과 HeLa 세포에서 단일 DNA 분자 계수를 하였다. 질병 감지를 위한 단백질 트롬빈 0.083 pg/mL의 초 민감성 검사할 수 있다. 그러나 POC 기술로 RCA를 채택하는 데 몇 가지 단점이 있다. 고순도 및 고품질 원형 주형이 필요하며 저농도의 선형 DNA의 엑소뉴클레아제-보조 분해에 의해 제조될 수 있다. RCA 생성물은 비특이적 결합으로 인해 응집되기 쉬우며, 이는 HRCA 검사에 합병증을 유발한다.
1.3.3. 디지털 증폭
“디지털 PCR(Digital polymerase chain reaction, Digital PCR)”은 핵산을 탐지하고 정량하는 새로운 접근법으로서 기존 qPCR에 비해 정확한 정량 분석과 표적 핵산 분자의 고감도 탐지가 가능하다. 샘플 내에 단일 반응을 수행하나, 샘플은 다수의 분할 내에 분리되며, 반응은 개별적으로 각각의 분할에서 수행된다. 이 분리는 핵산 양의 민감한 측정을 가능하게 한다. qPCR에 비해 dPCR은 10~1,000피코리터(pico liter)의 극소량 시료로도 분석이 가능하며, 많은 수의 시료를 동시에 처리할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 정확한 정량 분석과 타겟 핵산 분자의 고감도 탐지, 병원균 탐지 등 다양한 방면에서 활용이 가능하다. 기존의 qPCR의 결과 분석 방식이 아날로그 방식인 점에 반해, 결과 신호가 "0" 또는 "1"의 값을 가져 분석 방식이 디지털 방식인 디지털 PCR 방법은 대용량 시료의 분석, 한번에 다양한 시료의 검사 그리고 다양한 검사 항목을 한번에 수행할 수 있는 장점이 있다.
디지털 PCR (digital PCR) 기술은 DNA 시료를 표준 곡선이 필요 없는 단일 분자 계수법을 적용하여 절대정량이 가능한 기술로서, 하나의 웰 당 하나의 액적(droplet)에 대한 PCR 반응으로 보다 정확한 절대 정량을 수행할 수 있는 장점이 있다(Gudrun Pohl and le-Ming Shih, Principle and applications of digital PCR, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1), 41-47 (2004) 참조).
디지털 PCR은 평균 0.5개 내지 1개의 카피수로 희석되도록 준비된 시료 유전자 주형, 증폭 프라이머 및 형광 프로브를 포함하는 각 액적을 하나의 웰에 분배하고 에멀젼 PCR을 수행한 후, 형광 신호가 나타나는 웰은 1개의 유전자 카피수의 시료가 분배되어 증폭 후 신호를 나타내는 것이므로 "1"의 값으로 카운트하고 형광 신호가 없는 웰은 0개의 카피수의 시료가 분배되어 증폭이 일어나지 않아 신호가 없는 것이므로 "0"으로 카운트함으로써 절대 정량을 할 수 있다.
디지털 PCR에서는 형광 신호가 나타나는 웰 당 유전자 카피수가 1개인 경우에만 데이터의 신뢰성이 보장된다. 즉, 디지털 PCR에서의 정량은 프아송 분포(poisson distribution)를 통해 웰 당 신호가 있거나 없는 경우 이를 디지털 값 1 또는 0으로 보고 포지티브(1의 값)와 네가티브(0의 값)의 비율을 계산하는데, 전체 포지티브와 네가티브 합에 대한 포지티브의 비율이 프아송 분포의 유전자 카피수 1개를 크게 벗어나는 경우에는 확률적으로 웰 당 유전자 카피수가 1개를 초과하는 것을 의미하는 것이므로 데이터의 신뢰성을 담보할 수 없게 된다. 이러한 이유로 디지털 PCR에서는 증폭 후 정량한 값이 프아송 분포를 만족시키지 않아 웰 당 유전자 카피수가 1개를 크게 초과하는 경우에는 유전자 시료를 희석하여 프아송 분포를 만족시키도록 하는 것이 중요하고 웰 당 유전자 카피수 1개에 근접한 경우에는 보정된 값으로 정량하는 것이 중요하다(예를 들어, Poisson 9 프로그램을 이용하여 보정가능).
그러나, 디지털 PCR 방법은 정량 분석의 용이성, 대용량 분석, 다량의 시료 처리 능력 등에도 불구하고 현재까지는 디지털 PCR의 데이터 신뢰성 확보를 위한 정량 분석의 보정 기술이 요구되고 있고, 웰 당 유전자 카피수를 1개로 맞추는데 기술적인 어려움이 존재하고 있다. 또한, 디지털 PCR에 있어서 오일 에멀젼을 통한 DNA 용액 분할 기술 등의 종래 기술들은, 제품을 패키징하는 과정에서 발생하는 높은 소요 비용과 분할 기술 등에서 소요되는 긴 검출 시간이 한계점으로 인식되고 있다. 따라서, 이러한 디지털 PCR의 한계점을 극복하기 위한 개발이 지속되고 있다.
2. 재조합효소 중합효소 증폭(RPA)
본 발명의 RPA는 복잡한 실험실 장비없이 핵산을 신속하게 검사할 수 있는 등온 증폭 방법이다. 20분 이내에 매우 낮은 농도의 병원체 특이적 DNA 및 RNA를 검사할 수 있는 수많은 RPA 기반 분석법이 개발되었으며, 이는 다른 등온 분석법 또는 PCR보다 훨씬 더 빠른 것이다. RPA는 이러한 신속하고 민감한 증폭을 허용하기 위해 많은 생화학적 메커니즘을 사용한다.
기본 RPA는 이중 가닥 DNA 분자 내에서 그들의 상보적 서열에 올리고뉴클레오티드 프라이머의 삽입 및 결합을 용이하게 하기 위해 재조합 효소를 이용한다. 반대 프라이머는 PCR과 유사한 방식으로 정의된 DNA 영역의 지수 증폭을 할 수 있게 한다. 특이적 비염기성 뉴클레오티드 유사체를 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브는 엔도뉴클레아제 IV (nfo) 또는 엑소 뉴클레아제 III (exo)에 의해 인식되고 절단되지만, 프로브가 그의 상보적인 표적 서열에 결합될 때에만 가능하다. 이를 통해 nfo를 통한 면역 크로마토 그래피 스트립 (ICS) 또는 exo 프로브를 사용한 실시간 형광 검사를 통한 증폭 검사가 가능하다.
본 발명의 기본 RPA에 사용하는 표준 RPA 반응 시약은 3 개의 핵심 단백질(재조합효소, 재조합효소 로딩 인자 및 단일가닥결합 단백질)을 포함하며, 추가적으로 DNA 중합효소, 군집 시약 crowding agent(일반적으로 PEG), 에너지/연료 성분(예: 삼인산(ATP) 및 염 분자과 같은 RPA 반응 메커니즘을 수행하기 위한 보조 성분을 포함한다.
RPA 조성물은 재조합효소를 함유하며, 재조합효소는 RecA 및 UvsX(예를 들어, 임의의 종으로부터 얻어진 RecA 단백질 또는 UvsX 단백질), 및 이들의 단편 또는 돌연변이, 및 이들의 조합을 포함한다. RecA 및 UvsX 단백질은 임의의 종으로부터 얻어질 수 있다. RecA 및 UvsX 단편 또는 돌연변이 단백질은 또한, 이용 가능한 RecA 및 UvsS 단백질 및 핵산 서열, 및 분자 생물학 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 추가적인 예시적 재조합효소 단백질은 아르카에박테리아 RADA 및 RADB 단백질 및 진행 생물(예를 들어, 식물, 포유류 및 진균) Rad51 단백질(예를 들어, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCC2, XRCC3, 및 recA)을 포함한다.
DNA 중합효소는 진핵생물 또는 원핵생물 중합효소일 수 있다. 진핵생물 중합효소의 예는 pol-알파, pol-베타, pol-델타, pol-엡실론, 및 이들의 돌연변이체 또는 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 원핵생물 중합효소의 예는 대장균 DNA 중합효소 I(Klenow 단편), 박테리오파지 T4 gp43 DNA 중합효소, 바실러스 스테아로테로모필루스 중합효소 I 큰 단편, Phi-29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, 바실러스수 브틸리스(Bacillus subtilis) Pol I, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Pol I, 대장균 DNA 중합효소 I, 대장균 DNA 중합효소 II, 대장균 DNA 중합효소 III, 대장균 DNA 중합효소 IV, 대장균 DNA 중합효소 V, 및 이들의 돌연변이체 또는 단편, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 부족하다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 가닥-변위 성질, 예를 들어, 부류 pol I 또는 pol V의 원핵생물 중합효소의 큰 단편을 갖는다.
하나 이상의 단일-가닥 DNA 결합 단백질은 반응에서 진행 중인 다양한 교환 반응 동안에 핵산을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 단일-가닥 DNA 결합 단백질은 임의의 종으로부터, 예를 들어, 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 종으로부터 유래되거나 얻어질 수 있다.
증폭을 촉진하기 위해, RPA 과정은 군집 시약의 존재 하에서 수행될 수 있다. 군집 시약는 효소 촉매 활성의 향상을 포함하여 다양한 생화학적 공정의 효율을 조절한다. PCR 및 RT-PCR에서 첨가제로 사용될 때, 군집 시약은 효율성, 특이성 및 감도를 향상시킨다. 군집 시약은 점성이 있으며 RPA는 증폭을 위해 상대적으로 낮은 온도 (37-42 ℃)를 사용하여 반응용액에서 열대류의 혼합 효과를 줄인다. 두 현상은 RPA 활성이 높은 영역에서 시약의 국소적인 고갈을 유발하여 증폭 단계는 억제될 수 있다.
군집 시약은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드 폴리비닐 알코올, 폴리스티렌, Ficoll, 덱스트란, 폴리(비닐피롤리돈)(PVP), Triton-X, 및 알부민 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또는, 군집 시약은 200,000 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 조성물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, Triton-X, 및 Ficoll로 이루어진 군으로부터 선택된 군집 시약을 포함한다.
본 발명에서 군집 시약으로 고 분자량 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 RPA 반응의 시약으로 사용할 수 있다.
2-1. RPA 주형, 프라이머, 프로브 및 디자인
본 발명의 기본 RPA는 DNA에 대한 핵산증폭 방법이고, RNA는 동일한 반응 튜브에 역전사 효소를 추가하여 제조된 cDNA를 주형으로 사용할 수 있다.
핵산 주형 유형의 경우, 효과적인 증폭을 위해 권장되는 RPA 증폭산물 길이는 500 뉴클레오티드 미만이다. 대부분의 100 ~ 250 개의 뉴클레오티드 길이의 증폭산물 길이를 적합하며, 일반적으로 빠르고 효율적인 증폭이 가능하다.
본 발명에서 기본 RPA 프라이머의 길이는 비교적 길다(권장된 최소 30개 뉴클레오티드, 그러나 일반적으로 32 내지 35개 뉴클레오티드). 보다 짧은 PCR 프라이머 (일반적으로 18 내지 25 개의 뉴클레오티드)가 RPA 반응에도 사용될 수 있지만 반응 속도 및 감도를 감소시킬 수 있다. RPA에 사용된 PCR 프라이머가 PCR에서의 검사 감도보다 더 높을 수도 있다.
본 발명에서 상기 기본 RPA 반응에 추가적으로 새로운 효소를 사용하여 특이도를 향상시키고 반응결과 시각화를 도모할 수 있다.
상기 효소는 exo(E. coli exonuclease III), fpg(glycosylase/lyase E. coli fpg) 및 nfo(nfo endonucleases IV)플 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 추가하는 것을 특징으로 할 수도 있다.
상용화된 RPA 시약인 TwistDx™는 RPA 반응 중에 통합할 수 있는 추가 프로브를 제공한다(TwistDx, 영국). TwistAmp™ 엑소프로브 (일반적으로 46 내지 52 개의 뉴클레오티드) 및 TwistAmp® fpg 프로브 (일반적으로 32 내지 35 개의 뉴클레오티드)는 형광성 실시간 검사에 사용할 수 있다.
이 두 프로브는 일반적으로 형광단, 형광 신호에 근접하여 형광 신호를 일시적으로 억제하는 소광제(Black Hole Quencher) 및 3'- 말단으로부터 폴리머라제 연장을 방지하는 역할을 하는 3' 말단에 차단제 (예를 들어, C3- 스페이서, 포스페이트, 비오틴 -TEG 또는 아민)을 포함할 수 있다.
실시간 검사는 abasic site(DNA에서 (Purine이나 pyrimidine base를 갖지 않는 DNA에서 apurinic/apyrimidinic site라고도 함)에서 fluorogenic probe의 절단을 기반으로 한다. 형광단 및 소광제. 염기성 부위는 테트라하이드로푸란 (THF) 또는 dSpacer (THF의 유도체) 또는 dR 기 (C-O-C 링커를 통한 염기성 부위의 데옥시리보스) 일 수 있다.
대장균 엑소뉴클레아제 III는 THF 또는 dSpacer 부위에서 TwistAmp™ 엑소 프로브를 절단하는 반면, 글리코실라제/리아제 대장균 fpg는 dR 위치에서 TwistAmp™ fpg 프로브를 절단한다.
효소 절단 후, TwistAmp® 엑소 프로브는 정방향 프라이머로서 기능할 수 있다. 그러나, TwistAmp™ fpg 프로브는 확장 가능한 3'-OH기를 생성하지 않고 3'- 포스페이트를 생성하는 글리코실라제/라이아제 대장균 fpg 단백질의 상이한 촉매 모드(베타-제거)로 인해 프라이머로서 기능할 수 없다.
세 번째 프로브인 TwistAmp™ nfo (일반적으로 46-52 개의 뉴클레오티드)가 TwistAmp™ nfo 프로브는 능동유동 종이여과(AFPF) 분석법으로 감지하도록 설계할 수 있다. 이 프로브는 5'- 말단 (예를 들어, 플루오레세인)으로 표지되고, 3'- 말단에 차단제 및 내부 기본 위치 (THF 또는 dSpacer)를 갖는다. TwistAmp™ nfo 일반적으로 46-52 개의 뉴클레오티드 길이이며, 그 중 30 개 이상은 THF(테트라히드로 푸란) 부위에 5' 지역 및 적어도 15 개는 3' 지역에 위치한다. THF 잔기는 상보적 서열과 정상적으로 염기쌍을 이루는 뉴클레오티드를 대체한다. 해당 증폭 프라이머에 대한 주어진 프로브의 최상의 위치를 *?**?*설명하는 고정된 규칙은 없다.
TwistAmp™ nfo 프로브와 동일한 방향을 갖는 정방향 프라이머가 5 '부분과 겹칠 수 있지만,이 겹침은 TwistAmp™ nfo 의 기본 부위까지 확장되어서는 안 된다 (즉 프라이머의 겹침은 5'- TwistAmp™ nfo 의 뉴클레오티드 최고 30으로 제한함). 이것은 프라이머에 의해 TwistAmp™ nfo 의 민감한 서열 요소에 대한 혼성화 표적의 우연한 생성을 방지할 것이다. 역방향 프라이머는 프라이머와 TwistAmp™ nfo 이량체의 발생을 피하기 위해 겹치지 않아야 한다. 역방향 증폭 프라이머에는 항원 그룹, 일반적으로 비오틴이 표시되어야 한다.
Nfo 엔도뉴클레아제 IV는 TwistAmp™ nfo 프로브의이 염기성 부위에서 절단되어 중합을 위해 확장 가능한 3'-OH기를 생성한다. 그러나 RPA 반응 중 대부분의 증폭산물을 분해하는 대장균 엑소뉴 클레아제 III과 달리 Nfo 엔도뉴클레아제 IV는 증폭산물 분해를 피하기 위해 더 느린 신호와 불완전한 절단을 생성한다 따라서, TwistAmp™ nfo 프로브는 겔 전기 영동 (GE)이 검사 방법으로 선택된 경우에도 사용할 수 있다.
상기 중합효소의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 통상적인 프라이머이다. 실제로, 표지물질을 사용하는 방식, 즉 어떤 표지가 TwistAmp™ nfo 에 있는지, 어느 표지가 역방향 프라이머에 있는지는 차이는 없다.
추가적인 시험 개발을 용이하게 하기 위해, 표적 프로브에 대한 신호를 발생하는 물질(reporter)이나 또는 리포터와 결합할 수 있는 표지물질을 역방향 프라이머에 두는 것이 유용할 수 있다.
본 발명에서 표지물질은 바이오틴(biotin)일 수 있다.
2 개의 프라이머에 의해 촉진된 증폭 반응은 TwistAmp™ nfo 프로브의 어닐링에 대한 표적으로부터 시작한다. 생성된 이중 가닥에는 THF 잔기는 nfo(엔도뉴클레아제 IV)에 대한 기질을 제공한다. nfo는 THF 위치에서 프로브를 절단하여 중합효소 확장을 위한 프라이밍 사이트로 작용할 수 있는 새로운 3'말단 하이드록실 그룹을 생성하여 TwistAmp™ nfo 프로브는 프라이머로 변형한다.
가공된 프로브와 5' 말단에 표지된 역방향 증폭 프라이머에 의해 생성된 증폭산물의 이증 가닥은 단일 가닥으로 전환되고 표지물질이 있는 표적 프로브의 염기서열과 종이 어레이에 있는 포획 프로브의 염기서열이 상보적 결합에 의해 이중 가닥을 형성한다. 이 단일 표지 증폭산물은 핵산 혼성화 방식의 AFPF 분석 형식 (일반적으로 증폭 후, 즉 엔드 포인트 감지)으로 감지할 수 있다.
핵산 검사를 위한 핵산 혼성화 방식의 AFPF 분석 형식은 표지물질이 표지된 역방향 프라이머를 이용하여 제조되는 단일가닥을 표적 프로브로 사용하여 기본 RPA 및 TwistAmp™ nfo 반응 메커니즘은 증폭 반응과 동시에 단일 표지된 리포터 분자를 생성하며 증폭 후 처리를 최소화할 수도 있다.
반면, 분자 인코드 방식에서는 증폭반응을 하는 중합효소의 정방향 프라이머는 TwistAmp™ nfo 프로브가 분해된 5'말단에 표지물질이 있는 5'영역으로 이루어진 올리고뉴클레오티드이며, 역방향 프라이머는 5'말단에 태그가 있는 RPA 역방향 증폭 프라이머일 수 있다.
5'말단에 표지물질이 있는 가공된 프로브와 5' 말단에 태그가 있는 역방향 증폭 프라이머를 사용한 중합효소의 증폭산물은 표지물질과 태그가 효과적으로 결합된다. 이 이중 표지 증폭산물은 표적 프로브로 분자 인코드 방식의 AFPF 분석 형식 (일반적으로 증폭 후, 즉 엔드 포인트 감지)으로 감지할 수 있다.
핵산 검사를 위한 분자 인코드 방식은 일반적으로 사용하는 태그와 리간드를 활용하도록 하고 있다. TwistAmp™ nfo 반응 메커니즘은 증폭 반응과 동시에 이중 표지된 리포터 분자를 생성하며 증폭 후 처리를 최소화할 수도 있다.
적합한 RPA 템플릿을 선택하고 프라이머 및 프로브를 디자인하기 위해 TwistAmp™ 반응 키트 매뉴얼에 제안된 기준을 참조할 수 있다. 요약하면, ① DNA 템플릿의 GC 함량은 40 % ~ 60 % 사이이고 긴 호모 폴리머 트랙, 직접/반복된 반복 및 palindromes을 피해야 하며, ② 프라이머의 GC 함량은 30 %와 70 % 사이이고, 5'말단에서 구아닌의 긴 흔적을 피해야 하지만 시티딘을 권장하고 ③ 개선된 성능을 위해 프라이머의 3'- 말단에서 구아닌 및 시티딘을 권장된다.
이들 올리고 뉴클레오티드 중 용융 온도, 혼성화 안정성, 2 차 구조 및 이량체 형성을 평가할 것을 권장한다. BioEdit 버전 7.0. Primer3, UNAFold, mFOLD, PrimerQuest 소프트웨어 및 PrimerQuest 소프트웨어 그리고 RPA 올리고 뉴클레오티드 특성을 분석하기 위해 Visual OMP(DNA 소프트웨어, MI, 미국)를 사용할 수 있다.
본 발명에서 다증화를 극대화하기 위해, 다수의 올리고뉴클레오티드(프라이머, 프로브 및 핵산 주형) 사이의 비특이적 상호 작용을 최소화할 수 있다.
바람직하게, 상기 목적을 달성하고 프라이머 이량화를 최소화하는 self-avoiding molecular recognition systems (SAMRS)을 사용할 수도 있다.
SAMRS 뉴클레오타이드는 2-아미노푸린-2' 데옥시리보시드 (A*), 2'-데옥시 -2- 티오티미딘 (T*), 2'-데옥시이노신 (G*) 및 N4-틸-2'- 데옥시시티딘 (C*) 2-aminopurine-2′deoxyriboside (A*), 2′-deoxy-2-thiothymidine (T*), 2'-deoxyinosine (G*) and N4-thyl-2′-deoxycytidine (C*)이다.
SAMRS 뉴클레오티드를 포함하면 자연적 수소 결합단위는 A와 T 쌍 및 G와 C 쌍이며, 자연 T와 SAMRS A* 쌍, 자연 A와 SAMRS T* 쌍, 자연 C와 SAMRS G* 쌍, 자연 G와 SAMRS C* 쌍과 유사하지만, SAMRS A*와 SAMRS G* 뉴클레오티드는 SAMRS T*와 SAMRS C* 뉴클레오티드는 각각 농도에 상관없이 핵산 증폭 동안 프라이머 이량체로 인한 원하지 않는 생성물을 피할 수 있다. 따라서 SAMRS 시스템은 프라이머 이량체의 형성에 따른 인위적인 등온 증폭 산물을 성공적으로 제거할 수 있다.
종합적으로 말하면, RPA 올리고 뉴클레오티드 후보 물질의 silico 최적 디자인을 위한 출발점으로서 설명된 지침을 따르는 것으로 충분하다. 결과적인 후보 물질은 RPA 반응을 통해 선별되어 특정 RPA 분석에 적용 가능한 바람직한 최종 올리고 뉴클레오티드 세트를 선택해야 한다. TwistDx ™ Ltd는 5 개의 정방향 및 역방향 프라이머와 3 개의 프로브를 설계할 것을 권장한다.
2.2. RPA 반응의 고려 요소
RPA 반응의 최적의 효율과 분석 감도를 달성하기 위해, 표적 서열의 선택 및 상응하는 프라이머 및 프로브의 설계가 중요하나, RPA 반응 동안의 반응 온도 및 교반은 가장 중요한 기여 외부 요인일 수 있다.
본 발명의 권장 RPA 반응 온도는 37℃~42℃이며 체온을 사용하여 RPA 반응을 수행할 수 있으며 현장에서 유리하게 사용할 수도 있다. 그러나 권장 범위를 벗어난 RPA 반응 온도를 연구할 수도 있다. 가장 큰 온도 범위는 15℃와 50℃ 사이이다. 양성 결과를 생성하기 위한 최적 반응 온도는 30℃보다 커야 한다. 그러나 RPA 증폭 후에도 25℃의 낮은 온도에서도 여전히 양의 신호를 생성할 수 있다. 또한, 대기 온도가 RPA 반응에도 영향을 미친다는 것을 보여 주었다. 대기 온도가 10℃ 미만이면 RPA 반응이 불안정하지만 반응 시간을 연장하면 긍정적인 결과를 얻을 수 있다. 이러한 반응 온도 범위 연구에 따르면 RPA 반응에는 정확한 온도 제어가 필요하지 않다.
반응 온도가 RPA 효소에 적합한 작업 환경을 제공하는 동안, 진동 또는 교반은 균질 반응 용액에서 RPA 성분 사이의 상호 작용을 증가시킨다. 일반적으로 RPA 반응을 위해 두 단계의 혼합 단계를 수행할 수 있다.
하나는 공정의 시작 단계에 있고 다른 하나는 반응의 4분 후이다. 전자는 모든 RPA 시약을 혼합하여 반응을 개시하는 것이고, 후자는 반응 시약의 국부적 고갈을 방지하여 반응 속도를 증가시키는 것이다. 또한, 일정한 교반을 통한 RPA 반응 속도를 더욱 가속화시키고, 보다 안정한 양성 결과를 달성하며, 특히 주형 농도가 검사 한계에 근접할 때 감도를 개선시킬 수 있다. 또한, 마이크로 방울의 지속적인 혼합이 더 빠른 결과 시간, 형광 증가 및 감도 개선을 가져 올 수도 있다.
사용자 간 변동을 제거하고 일관된 정량적 실험 결과를 얻기 위해 수동 교반보다 기계적 교반이 더 낫다. 그러나 이상적인 교반 정도는 분석법에 따라 다를 수 있다. 교반 또는 진동을 사용할 수 없는 경우, 증폭에 필요한 시약과 올리고뉴클레오티드 간의 상호 작용의 감소를 방지하기 위해, 반응 부피의 감소(예 : 50 μL에서 5 μL) 방법으로 진동 효과를 보완할 수도 있다.
온도 및 교반 외에도 주형 DNA와 프라이머 또는 RPA 프로브의 비특이적 결합, 억제제 및 비표적 DNA에 대한 문제는 효율적이고 민감한 RPA 반응에 중요한 요소이다. RPA는 비특이적 결합, 저해제 및 비표적 DNA의 존재에도 불구하고 중합반응이 일어나는 능력이 있으며 이를 “내성”이라고 한다,
비특이적 결합 범위는 주형 DNA와 프라이머 또는 RPA 프로브 결합 부위에 걸친 9개의 뉴클레오티드 염기쌍까지 허용한다. 프라이머의 5'-말단 및 중앙 부위는 RPA 반응에 경미한 영향을 주지만 프라이머의 3'- 말단에 위치한 비특이적 결합은 반응에 크게 영향을 미친다. 이것은 중합효소가 프라이머와 RPA 프로브를 연장하기 때문에 RPA 반응 메커니즘과 일치한다. 3'-말단에서 이러한 비특이적 결합에 대한 유용한 적용은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 구별하는 것이다.
DNA 중합효소 연장은 프라이머의 3'-말단 염기가 특이적 결합일 때 효과적이었으나, DNA 중합효소 연장은 3'-말단 염기가 비특이적 결합일 때 비효율적이거나 발생하지 않는. 또한, 일반적인 RPA 프라이머의 3'- 말단 이외의 비특이적 결합 내성은 보존된 긴 표적 영역에 있는 높은 다형성 표적에 대한 프라이머 디자인에 약간의 유연성을 가능하게 하여 유리할 수 있다.
반대로, RPA의 이러한 비특이적 결합 내성의 문제는 중합효소 연장이 비특이적 결합에 의한 비표적 DNA를 주형으로 증폭산물의 제조 및 검사 가능성이 생긴다.
임상 또는 현장 시료를 테스트할 때, 수많은 물질(예: 억제제)이 존재하거나 시료 준비 및 처리 단계 중에 도입되어 잠재적으로 핵산 증폭을 방해할 수 있다. RPA는 (1) 헤모글로빈 (20 g L-1), 헤파린 (0.5 U) 및 소변 (1.25 %)을 포함하여 RPA 반응에 영향을 미치지 않아 특정 PCR 억제제를 견딜 수 있는 것으로 입증되었다; 및 (2) 헤모글로빈 (50g L-1), 에탄올 (4 % v/v) 및 소변 (최대 5 %). (0.05 % v/v) 및 소변 (10 %) 또한 DNA 주형 농도가 검사 한계에 가까울 때 RPA 반응이 억제제에 더 취약한 것으로 관찰되었다. 그러나, RPA 반응은 SDS (0.05 % v/v) 및 소변 (10 %)의 존재 하에서 완전히 억제되었다.
RPA는 억제제 외에 비표적 DNA가 있을 때에도 표적핵산을 증폭할 수 있다. 400ng의 비표적 인간 DNA가 존재할 때 RPA 반응이 유의하게 억제되지만 200ng의 비표적 인간 DNA가 존재할 때 훨씬 덜 억제된다.
3. 시각화
본 발명에서 핵산의 증폭산물을 검사하는 시각화 방법은 전기영동, 비색반응, 염기서열결정, 혼성화 및 PCR를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 할 수 있다.
처리가 완료되면, 핵산 검사 방법 및 장치는 핵산 식별의 결과를 일반적으로 핵산 컨텐츠의 이진 결정 또는 정량적 값으로 이용 가능하게 해야 한다. 통상적으로, 이 정보는 반응 챔버 내의 변화 (일반적으로 색의 변화)를 시각화하거나 전기 화학적 측정에 의해 전달된다. 증폭 및 검사 단계는 종종 통합되며, 판독은 프로세싱의 종점에서 또는 증폭 단계 전체에서 실시간 신호로서 발생할 수 있다. 형광 검사는 높은 선택성, 감도 및 효율성으로 인해 미세 유체 공학에서 가장 널리 사용되는 기술이다. 형광 표시기는 표적핵산 서열에 결합하고 레이저 또는 발광 다이오드(LED) 여기에 응답하여 미리 설계된 파장의 광을 방출한다. 표적화된 핵산의 농도는 방출된 광의 강도로부터 얻을 수 있다.
장치 휴대성과 비용을 개선하기 위한 장치이 있으며 현미경에서 광학 검사 방법을 최소화했으며 유기 LED, 필터가 없는 포토 다이오드, 도파관과 같은 새로운 광원과 통합하여 주로 PCR 기반 시스템에서 신호 강도와 분석 감도를 향상시켰다. 고상 PCR과 함께 사용하기 위해 마이크로 렌즈 어레이를 이용한 초임계 각도 형광 (SAF) 검사를 개발하였다. 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1의 비색 검사를 위한 RT-PCR 마이크로 디바이스 및 면역 크로마토 그래피 스트립이 통합되었다. 금 나노 입자 (Au-NP)의 결과로서의 비색 검사 (자색)은 H1N1 표적 바이러스의 존재를 확인하기 위해 사용된다. 텍사스 레드 프라이머 및 비오틴 표지 뉴클레오티드가 증폭에 사용된다. 생성된 앰플리콘은 항체로 표지된 금 나노 입자와 접합된다.
POC 장치에 형광 표시기를 강력하게 배치하는 데 어려움이 있는데, 비용이 많이 들고 pH 및 온도에 민감하며, 민감한 검사기 및 수집 광학 장치가 필요하며, 시료 자가 형광의 간섭을 받으며 저온에서 보관해야 하기 때문이다. LAMP 기반 시스템에서, 증폭 반응은 피로인산 마그네슘을 침전시켜 용액을 탁하게 만든다. 미세 유체 칩은 용액에서 반사된 빛의 강도를 측정하여 변화를 감지할 수 있다. 장치의 먼지, 오물 및 제조 가변성으로 인한 신호의 가변성을 감소시키기 위해 광 전달 및 수집을 위해 광섬유를 사용하였다. 양성 LAMP 반응의 비색 검사를 위해 하이드록시 나프톨 블루 (HNB) 및 칼세인 염료를 사용하였으며 미세 유체 카세트로 1시간 이내에 대장균과 S. 아우레우스를 검사할 수 있다. 카세트에는 동시 분석을 위한 36개의 챔버가 있다. LAMP 시약은 POC 설정에 배치하기에 더욱 강력하다.
스마트 폰은 POC 설정에서 널리 사용되는 광학 감지 플랫폼으로 현미경 감지를 대체하고 있다. 광범위하게 사용 가능하고 저렴한 저비용 스마트 폰에는 24 비트 색상 해상도를 갖춘 민감한 이미저 및 광학 장치와 색상 감지를 위한 Bayer 필터 및 이미지 수집 및 처리를 관리하는 강력한 소프트웨어가 함께 제공된다. 많은 그룹이 LAMP 및 PCR 미세 유체 시스템의 형광 검사를 가능하게 하기 위해 필터 및 광섬유 어셈블리를 추가하는 등 상용 스마트 폰에 대한 작은 광학 확장을 개발하였다. 파워없는 LAMP 증폭 및 스마트 폰 검사는 스마트 컵이라고 한다. 증폭에 필요한 온도는 철의 존재하에 마그네슘과 물 사이의 발열 화학 반응을 사용하여 생성된다.
전기 화학 검사는 반응 및 부산물로 인한 시료 전도도의 변화를 측정하기 위해 시료 용액과 직접 인터페이스하는 전극을 사용한다. 미세 전극 또는 스크린 인쇄 전극은 저렴한 비용, 일회용 및 시료 내 반응을 방해하지 않는 이점을 제공한다. 검사는 시약이 필요없고, 서열에 따라 다르며, 다중 감지 어레이를 사용할 수 있으며, 이는 POC 장치에 중요한 이점이다. Salmonella enterica의 검사를 위해 미세 유체 LAMP를 전기 화학 DNA (IMED) 칩과 통합하였다. 미세 유체 칩은 증폭 챔버 및 검사 챔버를 포함한다. 검사 챔버는 증폭된 생성물의 전기 화학적 검사를 위한 서열-특이적, 다중화된(여기서는 이중) 감지 어레이로 구성된다. 장치의 LOD는 103 CFU/mL 미만이다.
일부 도전 과제는 POC의 강력한 배치, 즉 신호 측정이 온도, pH 및 이온 농도의 변화에 *?**?*크게 의존하여 측정 감도를 제한한다는 사실을 여전히 방해한다. 전극은 LAMP, RCA 및 HAD 시스템에서 DNA의 증폭으로 인해 반응에서 DNA 결합 메틸렌 블루의 농도가 감소함에 따라 산화 환원 전류의 감소를 측정한다. 산화 환원 활성 화합물은 dsDNA 또는 ssDNA와 바람직하지 않은 상호 작용을 가지고 판독 정확도를 방해할 수 있다. 이 문제를 피하기 위해 RuHex 산화 환원 분자를 사용하여 LAMP 증폭을 억제하지 않고 이중 가닥 앰플리콘에 결합시켰다. 대신 산화 환원 반응성 오스뮴 착물을 사용하였다. 다중화 LAMP는 전기 화학적 검사와 함께 μME-LAMP이다. 이 장치는 3가지 병원성 박테리아를 동시에 감지할 수 있다. 산화 환원 전류를 측정하기 위해 독립적인 챔버가 사용된다.
본 발명의 단계 S200의 시각화는 비색반응일 수 있으며, 비색반응은 나노 금 입자가 이중가닥 핵산이 있는 용액에 0.2 M NaCl을 포함하는 염과 함께 첨가할 때 발생하는 색상의 변화가 있다. 본 색상의 변화는 이중가닥 DNA의 양과 관계가 있다.
상기 비색반응은 인터킬레이팅 제제를 사용하는데, SYBR 그린, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열, TOTO계열, 악티노마이신, 아드리아마이신, 안트라센, 벤조피렌, 프로피디움 디이오다이드-인터트위닝(propidium diiodide-intertwining), 디스타마이신, 네트롭신과 아크리딘, 프소랄렌, 베르베린(berberine), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신, 독소루비신, 탈리도마이신, 시아닌 염료 및 LDS 751를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명에서 단계 S200의 시각화외에 추가적인 분석이 필요한 경우, 표적핵산의 증폭산물을 혼성화로 검사하기 위해, 본 발명의 단계 S200의 증폭 반응은 표지물질을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 증폭산물의 내부를 표지하거나 또는, 표지물질이 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭산물을 표지할 수 있다.
상기 표지물질은 바이오틴, 형광 나노입자, 양자점(quantum dot: Qdot), 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 금속 나노입자, 형광 염료, 방사성 동위원소, 효소, 다양한 표색 표지, 자성 또는 상자성 표지(예를 들어, 자성 및/또는 상자성 나노입자), 스핀 표지, 방사선-비투과 표지(radio-opaque label)를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 하나 이상일 수 있다.
다양한 다운 스트림 RPA 적용(능동유동 종이 어레이 여과, 측면 유동 스트립 검사 및 효소 연결 면역 흡착 분석)을 위한 중요한 과정 중 하나는 RPA 반응 동안 신호가 발생하는 표적 프로브를 증폭 과정에서 RPA 분석의 생성 신호를 포착, 검사 및/또는 보조할 수 있도록 하는 것이다.
이러한 핵산 표지는 5'-말단 표지된 프라이머를 사용하여 말단에 또는 내부적으로 표지된 뉴클레오티드를 통해 달성될 수 있다. 핵산 표지에 사용된 표지는 형광물(예: 플루오레세인), 리간드(예: 비오틴) 또는 뉴클레오티드의 짧은 세그먼트(오버행)이다. RPA를 사용한 대부분의 말단 핵산 표지는 5'- 표지된 정방향 및 역방향 프라이머 모두를 사용하므로, 표적 프로브는 다운 스트림 분석에서 상응하는 인식 분자에 의해 포획 및 검사될 수 있는 이중-표지를 갖는다.
본 발명에서 RPA 중 내부 핵산 표지의 경우, 반응 혼합물에 주로 digoxigenin-dUTP를 사용하여 표지된 뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 이는 중합 효소 연장 동안 dTTP를 무작위로 대체하여 표지된 표적 프로브를 생성한다. 더 많은 표지가 단일 핵산 주형에 통합되어, 다운 스트림 분석에서 더 많은 결합 기회를 갖는다.
본 발명의 단계 S300의 다중분석의 다운 스트림 방법이 샌드위치 분석에 사용될 때 말단 표지가 더 나은 선택이 될 수 있으며, 말단 표지를 통해 통합된 2개의 라벨이 더 멀리 떨어져 있기 때문에(표적 프로브의 길이로 분리됨), 표지물질이 너무 가까이 있으면 결합의 입체 장애를 방지할 수 있다.
상기 언급된 요소는 증폭 반응 전 및 동안에 모두 결정할 수 있다. 또한, 반응 후 절차는 성공적인 신호 검사에 중요하며, 증폭산물의 의도된 용도에 따라 결정할 수 있다. 증폭산물의 생성은 재조합효소 증폭 후 중합효소 증폭에 의해 결정된다.
본 발명의 중합효소 증폭은 기본 RPA 프라이밍된 주형 DNA에 대한 DNA 중합효소 활성으로 인해 증폭산물이 생성된다.
또한, 본 발명의 중합효소 증폭은 TwistAmp™ nfo 프라이밍된 주형 DNA에 대한 DNA 중합효소 변위 활성으로 인해 두 가지 유형의 증폭산물이 생성된다. 프로브와 프라이머들에 의해 생성되고 상대적으로 길이가 짧은 증폭산물이며, 반면 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 생성된 것은 길이가 긴 증폭산물이다.
본 발명에서 상기 단계 S200의 표지물질이 있는 증폭산물로부터 단일가닥 표적 프로브를 포함하는 증폭용액을 제조하는 단계(S400); 상기 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 측면유동 스트립 장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500); 상기 종이 어레이에 있는 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 단계(S700);를 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 두 개의 증폭산물은 표적 프로브로 어레이 특히, 종이에 있는 포획 프로브와 상보적인 결합을 하고 신호를 발생하여 스폿을 형성할 수 있다.
RPA 증폭산물은 초기에 단백질 및 군집 시약과 복합체를 형성하며, 생성된 DNA-단백질-군집 시약 복합체는 검사를 위해 RPA 증폭용액의 직접적인 사용을 방해한다. 이는 이러한 복합체가 증폭산물의 적절한 이동에 영향을 미치기 때문이다.
검사 전에 RPA 증폭산물을 처리하는 여러 방법에는 가열에 의한 단백질 변성(65℃ 또는 95℃에서 10 분 동안), 세제 처리(예: 나트륨 도데실설페이트, SDS), 효소 소화(Proteinase K 처리) 및 고속 원심분리를 통한 단백질 침전 및 상업용 DNA 세척 키트를 사용한 세척이 포함할 수도 있다.
측면 유동 스트립 감지에서도 마찬가지로, RPA 증폭산물의 직접 사용이 가능하지만 스트립에서 실행하기 전에 증폭산물을 실행 버퍼 (예: 1/100 희석)로 희석하여 ① 모세관 현상을 향상시키고 ② "고스트 밴드" 효과를 방지해야 한다.
RPA 시약에서 5.5 % 고 분자량 PEG (35kDa)를 6.5% 저 분자량 PEG (3kDa)로 대체하여 측면 유동 스트립의 점액상 모세관 문제를 완화할 수 있다.
측면 유동 스트립 검사를 위한 희석 단계는 완화하는 방법일 수도 있다. 측면 유동 스트립의 시험 라인에 결합하기 위한, RPA 증폭산물이 PEG와 밀접한 관련으로 형성되는“RPA 소구체”(핵산 증폭의 핵심인 국소화된 RPA 시약을 포함하는 군집체)에서 사용할 수 없을 수도 있다.
본 발명의 단계 S300의 정량적 증폭에서 시각화 단계는 시스템에서 단일 표적핵산의 양을 측정하나, 본 발명의 단계 300의 시각화단계는 다중 등온 증폭 검사에서 다양한 표적핵산의 평가로 생물학적 시스템에 대한 이해도를 높이거나 질병 검사 및 모니터링에 중요할 수 있다.
본 발명의 단계 S300의 다중 등온 증폭 검사의 시각화 단계는 정의된 분석 처리 시간 내에 단일 검사와 비교하여 시료 입력 당 결과 출력을 크게 증가시키기 때문에 시간과 검사의 정확성을 고려해야 한다.
본 발명의 단계 300의 다중 등온 증폭 반응의 시각화 단계는 단일 튜브 (균질) 또는 병렬 방식(때로는 이종을 나타냄)으로 진행될 수 있다. 단일튜브 다중 RPA는 단일 또는 다중 표적핵산 주형을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 단계 300의 다중 등온 증폭 반응의 시각화 단계은 반응 공간과 부피를 모두 절약할 수 있다. 다중능을 증가시키는 것은 매우 어려운 과정일 수 있다. 단일 표적핵산 주형을 사용하는 경우, 다중능은 주로 특정 길이의 염기서열 내에서 다수의 표적핵산을 수용하는 능력에 의해 제한될 수 있다.
본 발명의 다중 표적핵산 주형을 사용할 때 주된 제한 요소는 다수의 올리고뉴클레오티드(프라이머, 프로브 및 핵산 주형) 사이의 비특이적 상호 작용이다.
상기 제한을 완화하는 방법으로 1단계 RPA 및 2단계 LAMP 방법을 사용할 수도 있다. 즉, 1 단계 반응에서 생성된 정확한 RPA 증폭산물이 거의 없고 동시에 생성된 비특이적 증폭산물이 있는 경우에도 불구하고, 이들 올바른 RPA 증폭산물은 2차 LAMP를 통해 구체적으로 더 증폭하는 것이다. 2단계 LAMP 반응은은 여전히 1 단계 RPA 반응에서 프라이머 농도의 용량에 의해 제한된다.
본 발명의 단일 튜브 다중 증폭과 달리, 다중 등온 증폭을 병렬 방식으로 수행하면 다중 올리고뉴클레오티드 간의 비특이적 상호 작용을 피할 수도 있다. 이는 각각의 단일검사 증폭 반응이 서로 옆에 발생하지만 서로 독립적 (균질 분석으로 수행됨) 또는 증폭 반응이 비대칭적인 방식(이종성 분석)으로 수행되기 때문이다. 등온 증폭 프라이머는 매트릭스 상에 미리 고정된 반면, 다른 등온 증폭 프라이머는 DNA 주형 (및 프로브)과 함께 용액에 남아 있으며, 이러한 방식으로 등온 증폭 증폭산물만이 검사를 위해 매트릭스 상에 포획될 것이다.
균질 분석 형식을 채택한 병렬 RPA는 용액 또는 고체상으로 수행될 수 있다. 동종 분석 형식을 채택하는 병렬 등온 증폭과 달리, 이종 분석을 채택하는 병렬 다중 등온 증폭은 고체 표면에서만 발생한다. 이러한 분석의 대부분은 마이크로 어레이에서 비대칭 방식으로 다중 등온 증폭을 수행할 수 있다.
다중 증폭은 병렬 방식으로 훨씬 더 높은 분석 처리량을 가지며, 교차 반응 (올리고 뉴클레오티드 중에서) 문제를 해결하고, 단일 튜브 다중 등온 증폭에 비해 더 높은 다중검사 용량을 갖을 수 있다.
병렬 방식 다중 증폭 다중 정도는 특정 검사를 가능하게 하는 다수의 핵산 주형에 접합된 이용 가능한 고유 표직의 수; 반응 표면의 크기; 및 효과적인 반응을 허용하는 스폿의 최소 부피에 의해 제한될 수 있다.
4. 능동 유동 종이 어레이 여과(AFPF)
본 발명에서 단일 튜브 다증화를 극대화하기 위해, 등온 증폭 반응에서 군집 시약 등의 다양한 원인에 따른 등온 증폭 산물 검사에 발생하는 노이즈를 최소화하는 핵산 혼성화 방법을 기반으로 한 능동유동 종이 어레이 여과를 실시할 수도 있다.
상기 핵산 혼성화 방법은 등온 증폭 반응물에 있는 표적 프로브의 염기서열을 인지하여 상보적 결합을 하는 포획 프로브 방법으로 즉, 다중의 표적 프로브의 염기서열에 100% 상보적인 염기서열로 구성된 포획 프로브로 종이 어레이를 제조하여 실시할 수 있다.
본 발명의 등온 증폭 산물의 핵산 혼성화 방법은 능동유동 종이 어레이 여과(AFPF) 장치의 AFPF 플랫폼에서 실시하는 것일 수 있다.
본 발명에서 능동유동 종이 어레이 여과(AFPF) 장치의 AFPF 플랫폼을 최적화하기 위해 고려할 필요가 있는 다수의 요소가 있다.
AFPF의 종이 어레이의 면적은 크지만 소량의 반응용액을 처리하여 종이 어레이에 있는 감지 지점의 크기를 줄일 수 있다. 이것은 종이 어레이에 공간적으로 독립적인 스폿을 생성하는 서로 다른 포획 프로브들을 통합함으로써 다중 검사를 가능하게 한다.
유속은 능동유동으로 분석을 수행하는 데 필요한 시간에 영향을 미치기 때문에 중요한 요소이다. 본 발명의 AFPF 플랫폼에서, 시료 유속을 조절하여 단위 면적당 시료 부피를 직접 증가시켜 AFPF 기반 분석의 감도를 향상시킬 수 있다. AFPF 장치의 유로는 LFI에서 수 센티미터의 유로와 비교하여 막의 두께로 극적으로 감소될 수 있다. 이는 ㎛ 미만의 포어 크기를 갖는 막의 이용을 가능하게 한다. 결과적으로 나노 포어 막의 사용이 AFPF 분석의 감도를 상당히 개선시킬 수 있다.
4.1. AFPF의 분석
본 발명에서 제안된 AFPF 포맷의 능동유동 종이 어레이 여과 장치의 원리는 다음과 같다. 종이 어레이의 다공성 구조물은 이송 과정을 돕기 위해 구조이다. 포어 반경(d)을 갖는 다공성 물질에서, 액체는 막의 검사 가능한 두께인 유량의 속도 및 감지 길이(Ls)로 막을 통해 흐른다. 또한, 막 표면은 상부 표면 (Av), 예를 들어 반경 (Rm)을 갖는 원형인 제 1 표면이고; 제 2 표면은 막 두께로 분리된 막의 바닥 (관찰할 수 없는) 측에 있다. 다공성 구조물의 내부 표면은 포획 프로브로 코팅된 부분이다. 표적 프로브의 확산도는 D이고, 단일가닥핵산-단일가닥핵산 쌍은결합 상수 및 질량 전달 계수를 갖는다.
AFPF 시스템에는 두 가지 중요한 요소가 있다. 첫 번째는 흡착 속도와 운반 속도의 관계를 나타내는 Damkohler 수 (Da)이다, 두 번째는 대류 속도와 확산 속도를 비교하는 데 사용하는 Peclet 수 (Pe)이다.
저농도로 표적 프로브를 포획하기 위해, 2 가지 조건이 중요하다. 포획 프로브와 표적 프로브 결합 속도가 감지표면으로의 표적 프로브 분자 이동 속도보다 빠른 효율적인 포획 반응(Da≫1)을 할 수 있다. 다공성 구조의. 유속이 높으면 이동 속도가 증가하고 Da가 감소하며 포집 효율이 감소한다. 그러나 이것은 빠른 결합 속도를 이용하여 상쇄할 수 있다. 포획 프로브 높은 밀도가 저농도 표적 프로브 검사에 중점을 두어 포획이 Da >> 1을 보장하기에 충분히 빠르다고 할 수 있다. *?* 비확산-제한 검정 (Pe <1)은 전달된 모든 표적 프로브는 능동유동으로 감지 영역을 통과하기 전에 감지표면으로 확산할 수 있다. Pe <1을 유지하면 > 90 %의 캡처 효율이다. 포어 크기를 감소시키는 것은 AFPF에 의해 더 많은 표적 프로브가 검사될 수 있도록 최대 유량 속도를 증가시키는 효과적인 방법이다. 이론적 분석에 기초하여, 높은 유속 속도 및 작은 막 세공 크기를 갖는 장치에 대한 AFPF 설계가 분석 감도를 개선시킬 수 있다.
4.2. AFPF 플랫폼의 구성
장치의 AFPF 플랫폼은 스테인레스 스틸 필터 홀더 (Swinny Filter Holder 13 mm, Millipore, MA, 미국)에 캡슐화된 13 mm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크 (실제 통과 면적은 10 mm 직경)을 포함할 수 있다. 액체 통로를 밀봉하고 누출을 방지하기 위해 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 개스킷 및 O-링이 각각 종이 디스크의 하부 및 상부에 배치할 수 있다. 주사기 및 펌프 (New Era Pump Systems, Inc., NY, 미국)는 제어된 유량 속도로 종이 디스크를 통해 시료 및 시약을 능동 유동할 수 있다.
상업적인 스테인레스 스틸 디스크 지지체가 사용된 능동 유동 시스템에서, 0.1 ㎛보다 큰 포어 크기를 갖는 막에서 큰 신호 변화가 있다. 이 변형은 스테인레스 스틸 지지대의 유연성으로 인해 부분적으로 발생할 수도 있다. 따라서, 지지체는 딥 에칭 법을 사용하여 스테인리스보다 높은 영률을 갖는 실리콘으로 제조할 수 있다. 실리콘 그리드는 변형이 적은 유동에 대해 막을 기계적으로 지지하여 신호 변화를 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 제공된 임의의 장치는 실리콘 그리드를 포함하여 스테인레스 스틸보다 높은 영률을 갖는 재료로 형성된 지지체를 사용할 수 있다.
장치의 종이 어레이는 높은 단일가닥 핵산-결합 능력 및 작은 포어 크기의 범위에서의 이용 가능성으로 인해 니트로셀룰로오스 막을 사용하여 제조될 수 있다. 4 개의 니트로셀룰로오스 막, Amersham Protran 0.1 ㎛ NC, 0.2 ㎛ NC, 0.45 ㎛ NC 및 Whatman AE98 (포어 크기 5 ㎛) (GE Healthcare Life Sciences, PA, 미국)을 시험하고 비교하였다. 막은 CO2 레이저 (VersaLaser 2.30, Universal Laser Systems, AZ, 미국)를 사용하여 13 mm 직경 디스크로 절단할 수 있다.
포획 프로브가 고정되는 종이 어레이는 1 나노 리터의 방울 부피를 갖는 마이크로 솔레노이드 로봇 디스펜서 (AD1520 마이크로 디스펜서, 미국)를 사용하여 종이 디스크 상에 분배되어, 직경이 220 ㎛인 원형 고정 부위를 제조할 수 있다.
4.3. AFPF 작동 워크 플로우
표적 프로브는 바이오틴이 표지된 단일가닥 핵산일 수 있다. 결과적으로, 종이 어레이의 포획 프로브 고정 부위는 동일한 포획 프로브가 표적 프로브의 포획 및 검사에 사용될 수 있다.
AFPF 워크플로우에서 바이오틴이 표지된 표적 프로브를 종이 어레이의 포획 프로브에 결합시키고, Streptavidin Coated AuNP를 시각화 시약로 사용하여 스폿을 형성할 수 있다. Streptavidin Coated AuNP 원액은 40 nm 직경 콜로이드 금의 수동 흡수를 통해 제조할 수 있다. 세척한 후, Streptavidin Coated AuNP 용액을 540 nm에서 OD = 9로 농축하며, 이는 1.5 nM의 농도와 동일하다. 표적 프로브 및 Streptavidin Coated AuNP가 AuNP-표적-포획 프로브 복합체는 형성하여 종이 어레이에서 스폿을 형성할 수 있다.
실험 후, 막을 탁상 스캐너로 스캔하여 금 나노 입자에 의해 생성된 비색 신호를 확인할 수 있다. AFPF 테스트 절차는 30 분 이내에 완료할 수 있다.
먼저, 막을 평형화하기 위해 막을 통해 1 ml의 혼성화 용액을 능동유동할 수 있다.
순차적 프로토콜 : 표적 프로브 스파이크 분석 완충액 용액을 장치에 능동 유동으로 표적 프로브가 종이 어레이의 포획 프로브에 결합되도록 할 수 있다. Streptavidin Coated AuNP 용액을 장치에 능동 유동으로 처리하여 Streptavidin Coated AuNP는 이미 막의 포획 프로브에 포획된 표적 프로브에 결합하도록 할 수 있다.
예비 혼합 프로토콜 : 표적 프로브가 스파이킹된 분석 완충액을 Streptavidin Coated AuNP와 10 분간 예비 혼합할 수 있다. 이 예비 혼합 단계는 Streptavidin Coated AuNP가 유리 표적 프로브를 용액에서 결합하여 복합체를 형성하는 추가 시간을 제공할 수 있다. 이어서, 이 혼합물을 장치에 능동 유동 처리하며 종이 어레이의 포획 프로브는 Streptavidin Coated AuNP-표적 프로브 복합체를 포획할 수 있다.
시료를 처리한 후, 막을 통해 1.5 ml 블랭크 분석 완충액을 능동유동으로 종이 어레이를을 세척하여 비특이적이거나 느슨하게 결합된 단일가닥핵산 및 과량의 Streptavidin Coated AuNP를 제거할 수 있다. AFPF 장치를 해체하고 종이 어레이는 탁상용 스캐너를 사용하여 스캔하기 전에 빠른 건조 단계로서 여과지 (Whatman 정성 여과지, Grade 1, GE Healthcare Life Sciences, PA, 미국)에 5분 동안 처리할 수 있다. 전체 AFPF 테스트 프로세스는 30분 이내에 완료할 수 있다.
4.4. AFPF 반응
초기 분석은 더 작은 세공 크기 및 높은 시료 유속을 갖는 종이 어레이를 포함하는 AFPF가 전통적인 LFI보다 우수한 감도를 제공할 수 있다.
순차적 접근법은 스폿은 종이 어레이의 포획 프로브에 의한 표적 프로브 포획에 의존하고, 이어서 Streptavidin Coated AuNP 용액이 장치에 능동 유동할 때 포획된 표적 프로브에 Streptavidin Coated AuNP의 결합이 이어졌다.
예비 혼합 접근법은 표적 프로브는 포획되기 전에 Streptavidin Coated AuNP와 상호 작용 및 결합하고, Streptavidin Coated AuNP-표적 프로브와 종이 어레이의 포획 프로브가 결합하여 종이 어레이의 스폿을 형성하는 과정을 제공할 수 있다.
상기 포획 프로브가 고정된 종이 어레이에 표적 프로브를 스파이킹한 혼성화 완충액을 첨가하고 분석한 결과, 예비 혼합 프로토콜은 순차적 프로토콜보다 강한 신호를 갖는 스폿 위치를 산출할 수 있다. 예비 혼합 접근법의 개선된 감도는 표면 반응과 비교할 때 표적 프로브와 Streptavidin Coated AuNP 사이의 결합 시간의 증가 및 액체 반응보다 우수한 효율에 기인한다고 여겨진다. 모든 후속 실험은 예비 혼합 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
바이오틴이 표지된 표적 프로브의 검사는 나노 다공성 니트로셀룰로스 막에 통합 장치를 사용하여 Streptavidin Coated AuNP 처리로 비색 신호를 생성한다. AFPF 장치기술은 표적 프로브 탐지를 위한 단순하고 소형화된 빠른(30분 미만 시간) 플랫폼을 제공할 수 있다.
유량의 영향을 테스트할 때, 일반적인 실험 방식은 시료 부피를 일정하게 유지하고 유량을 변경하는 것이다. 이는 제한된 시료량을 높은 처리 속도로 분석을 수행하는 데 효과적할 수 있다. 유량이 증가함에 따라 검사 지점으로부터의 신호가 향상할 수 있다.
막의 다공성 구조는 다발 나노 튜브로 모델링되었고, 유동 속도와 신호 강도 사이의 이러한 관계는 표면 면역 센서를 통한 유동에 대한 고전적 모델로 설명할 수 있다. 유량이 증가함에 따라, 표적 프로브가 종이 어레이의 포획 프로브에 의해 포획될 수 있는 스폿 구역의 두께가 감소할 수 있다.. 그러나, 증가된 유량은 또한 더 많은 시료를 막으로 전달하고, 이는 감소된 스폿 구역 두께로 인한 결합 손실을 상쇄할 수 있다. AFPF 장치는 고정된 포획 프로브를 갖는 영역을 통해 가압된 시료만이 검사할 수 있다. 다른 지역을 통과한 나머지 시료는 낭비할 수 있다. 따라서, 검사 영역으로 전달되는 시료의 양을 결정하는 것은 전체 시료 부피가 아니라 단위 면적당 시료 부피이다. 단위 면적당 시료 부피가 클수록 포획 프로브에 의해 포획될 수 있는 표적 프로브의 양이 더 많아진다. AFPF 장치는 단위 면적당 훨씬 더 많은 시료량을 갖어 결과적으로 AFPF의 감도가 향상할 수 있다.
막에 걸친 평균 변동계수는 10%인 것으로 계산되었다. 여과지 홀더 내부의 유동 프로파일을 조사하기 위해 유체 시뮬레이션을 수행하고, 막에 걸친 균일성을 확인할 수 있다..
특히, Si 지지체를 사용할 때 높은 변동계수 값 (변동계수> 0.85)은 더 큰 포어 막에서도 관찰되지 않을 수 있다.. 제조된 Si 그리드 지지대는 상업적으로 이용 가능한 스테인레스 스틸 그리드보다 높은 영률(Young Modulus)을 가질 수 있다. 변형에 덜 영향을 받아 불균일한 유동이 발생하는 것을 방지할 수 있다.
이론적 모델에 기초하여 예측되고 AFPF의 이점은 주로 2 개의 요인, 즉 단위 면적당 시료 부피 및 막 포어 크기로부터 발생할 수 있다.
기존의 LFI는 모세관 력에 의존하여 반응용액을 긴 막(~ 40mm)을 통해 운반하는데, 이는 막 포어 크기에 제한을 준다. LFI 막 포어 크기의 일반적인 범위는 3~12㎛이다. 그러나, AFPF는 서브 마이크론 포어 크기를 갖는 막이 사용될 수 있도록 짧은 막 유동 경로(~130 ㎛)를 갖는다. 더 작은 포어 크기는 다공성 구조물 내부에 더 많은 결합 부위를 생성하는 더 높은 표적 프로브 로딩 용량을 제공한다. 또한 포어 크기가 작을수록 표적 프로브가 막 표면상의 포획 프로브에 의해 포획되는 필요한 확산 거리를 감소시킨다. LFI 시스템에서 막 포어 크기를 감소시키는 것이 분석 감도를 증가시키는 효과적인 방법일 수 있다. 이러한 이유로, 0.1 ㎛ 포어 크기를 갖는 니트로셀룰로오스 막을 표적 프로브 분석을 위한 최적화된 기질로 선택할 수 있다.
더 우수한 감도를 얻는 것을 방해하는 주요 장애물 중 하나는 낮은 Streptavidin Coated AuNP 농도일 수 있다. 현재 AFPF는 단위 면적당 높은 시료 량을 달성하기 위해 큰 총 시료 량을 필요로 한다. 대량의 시료를 차례로 사용하려면 결합 효율을 높이기 위해 상당한 양의 표지된 나노 입자가 필요하다. 이 문제를 해결하기 위해 한 가지 가능한 해결책은 단위당 높은 시료량을 유지하면서 시료의 총량을 줄이는 것이다. 이에 대한 하나의 접근법은 더 작은 표면적을 갖는 소형화된 화상 장치를 사용하는 것이다.
AuNP에 의한 스폿의 신호를 증강하기 위해 추가적으로 나노 은을 첨가할 수도 있다.
상기 화상 장치는는 서로 구별될 수 있는 많은 스폿, 30분 미만의 분석 시간 및 일반적인 탁상용 스캐너로 금 나노 입자 매개 비색 판독할 수 있어야 한다.
4.5. 시각화 및 데이터 분석
건조 처리 후, AFPF의 종이 어레이를 48 비트 RGB를 갖는 스캐너 (CanonScan 9000F II) 및 Scan IJ Utility (CanonScan의 기본 소프트웨어)로 스캔할 수 있다. 2400dpi 해상도가 압축되지 않은 TIFF 파일 형식으로 내보낸다. 48 비트 RGB 이미지는 Matlab (매사추세츠, MA, 미국)의 내장 함수 rgb2gray를 사용하여 16 비트 그레이 스케일 이미지로 변환한다. 결과 이미지를 ImageJ로 가져 왔고, 스폿은 마이크로 어레이 그리드를 사용하여 분석되어 로컬 배경을 빼는 스폿에서 평균 그레이 스케일 값을 계산한다. 데이터 처리 및 분석은 Excel 2016 (Microsoft, WA, 미국)을 사용하여 수행한다.
5. 핵산 혼성화 방식 AFPF
하나 이상의 표적핵산의 신속한 검사는 등온 증폭 산물, 능동 유동 종이 여과(AFPF) 및 핵산 혼성화 분석의 조합으로 실시할 수 있다. 설계한 프라이머 세트 및 표적 특이적 포획 프로브를 사용하여 감염 초기에 유사 임상증상을 제공하는 병원체를 검사할 수 있는지 확인할 수 있다.
AFPF의 종이 어레이에서 표적 프로브와 포획 프로브의 반응 단계는 (i) 표지물질이 있는 표적 프로브의 염기서열과 포획 프로브의 염기서열의 상보적 결합으로 형성되는 복합체를 이용하는 핵산 혼성화 방법, 및 (ii) 표적 프로브의 태그와 포획 프로브인 리간드가 형성하는 표적-태그-리간드 복합체를 이용하는 분자 인코드 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 한 방법으로 실시할 수도 있다.
본 발명의 핵산 혼성화 방법에서 종이 어레이는 포획 프로브가 단순하게 핵산 단일 가닥이거나 한쪽 말단에 아민기와 같은 기능기가 부착된 핵산 단일 가닥을 지지체 종이에 부착하여 제조할 수 있다. 반면에 분자 인코드 방법에서 종이 어레이는 표적 프로브에 있는 태그에 상응하는 리간드를 포획 프로브로 종이에 부착하여 제조할 수 있다.
상기 종이는 하나 이상의 재료로 셀룰로스, 섬유유리, 나이트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하 개질된 나일론, 폴리에터 설폰 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 종이는 HI-FLOW PLUS(등록상표) 막이다. 또는 종이는 제직 종이로 와트만(Whatman) 종이이다. 와트만 종이는 와트만 S17, 와트만 MF1, 와트만 VF1, 와트만 퓨전(Fusion) 5, 와트만 GF/DVA, 와트만LF1, 와트만 CF1, 및/또는 와트만 CF4이다.
바람직하게, 하나 이상의 표적핵산에 대해 RPA로 얻어진 증폭산물를 인지하여 결합할 수 있는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 포획 프로브로 구성된 종이 어레이거나, 또는 하나 이상의 리간드 포획 프로브가 고정된 종이 어레이를 사용하여 하나 이상의 표적핵산의 다중검사를 달성할 수 있어 RPA와 AFPF의 통합 방법은 다중검사 진단 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명은 등온성 증폭, 핵산 혼성화 및 비색 판독으로 올리고뉴클레오티드 어레이의 고처리량 스크리닝을 연결하는 AFPF으로 구성할 수 있다. 이에 대한 살펴보면 다음과 같다.
본 발명은 바람직하게, 분석 원리는 능동 유동 방식으로 여과 홀더 내의 종이 어레이 상의 포획 프로브 염기서열과 용액상의 표적 프로브 염기서열 사이에 일반적인 단순 확산 혼성화가 아니고 능동-유동 혼성화를 통한 상보적 결합에 기초할 수 있다. 이 홀더 내에서, 용액 내 증폭된 표적 프로브는 니트로셀룰로오스 조각에 고정된 포획 프로브에 결합하고 일반 평판 스캐너를 사용하여 후속 비색 표지 및 검사할 수 있다.
핵산 혼성화에 사용하는 종이 어레이는 핵산 종이 어레이이며, 프로브의 길이 및 특이성, 어닐링 시간, 혼성화 온도 및 완충액 조성과 같은 다수의 요인이 분석 신호에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 다음과 같이 분석 감도를 개선하기 위해 여러 매개 변수를 체계적으로 최적화할 수 있다.
핵산은 UV 조사에 의해 니트로셀룰로오스에 공유적으로 부착될 수 있다. 이들에만 제한적인 것은 아니다. 비표지된 포획 프로브 및 5'-아미노-표지된 포획 프로브를 사용할 수 있다. UV 노출 후의 결과는 표지가 없는 프로브와 5'-아미노-표지된 포획 프로브의 비교한 결과는 후자의 감도가 더 높다. 가교 메커니즘은 아직 완전히 이해되지는 않았지만, 막의 표면에 위치한 것들과 반응하는 DNA 염기 내에서 반응성 작용기의 생성으로 인해 공유 결합이 형성된다. 포획 프로브의 5'- 말단에 스페이서와 결합된 아미노기의 존재는 니트로 셀룰로스에의 고정을 선호하고 프로브가 입체적으로 방해받지 않기 때문에 개선된 혼성화를 가능하게 하여, 분석의 감도를 향상시킨다.
포획 프로브가 고정된 종이 어레이는 사용할 때까지 실온. 또한, 인쇄 버퍼는 신호 대 비표적 값뿐만 아니라 인쇄 조건을 개선하기 위해 첨가제를 보충할 수 있다.
혼성화 성능은 또한 스폿의 형태에 따라 달라지며, 이는 상대 습도, 포획 프로브 밀도, 인쇄 버퍼 및 인쇄 방법과 같은 인쇄 조건의 영향을 받을 수 있다. 유리 슬라이드의 전형적인 DNA 마이크로 어레이 인쇄 공정에서, 방울의 증발 속도를 늦추기 위해 권장되는 상대 습도는 약 50~65 %이다. 그러나, 이 작업에서, 사용하는 지지체 (니트로셀룰로오스)은 높은 상대 습도 조건에 노출될 때 말리는 경향이 있어 인쇄시 어려움이 있다. 결과적으로 상대 습도의 건조기 환경이 필요했으며 35~40 % 범위의 수준이 최적이다.
스폿 형태는 상대 습도 및 방울의 증발을 지연시키는 시약의 첨가에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 포획 프로브는 낮은 상대 습도 수준에서 순수한 TBS 완충액으로 인쇄되었으며, "커피링 효과"가 있다. 이러한 고리 모양의 반점에서, 신호 축적은 DNA 축적으로 인해 가장자리에서 더 높으며, 용매의 증발에 의해 생성 될 수 있으며, 이는 DNA 분자가 유체 유동과 함께 바깥쪽으로 흘러 증발 손실을 보상하게 한다.
낮은 상대 습도에서 글리세롤 20 % 및 베타인 1.5M에서 낙하 증발을 지연시키기 위해 인쇄 버퍼(TBS)에서 두 가지 첨가제를 사용할 수 있다. 글리세롤과 베타인은 단백질과 DNA 마이크로 어레이에서 인쇄 용액의 점도를 높이기 위해 사용되어 방울의 증발 속도를 감소시킨다.
언급된 첨가제, 특히 베타인의 첨가가 스폿의 형태를 개선하고 신호 강도를 증가 시켰다. 베타인은 혼성화 동안 AT와 GC 염기쌍의 안정성 사이의 갭을 감소시켜 GC 함량에 관계없이 용융 온도를 낮춘다. 인쇄 용액의 점도를 증가시키는 능력과 함께 이 효과는 유리 슬라이드에서 매우 균일한 DNA 마이크로 스폿을 생성할 수 있도록 한다. 1.5 M 베타인이 보충된 TBS를 인쇄 완충액으로 사용하였다.
포획 프로브 농도는 AFPF 분석의 비색 신호 강도를 최대화하도록 최적화할 수 있다. 높은 농도에서, 혼성화는 고정된 프로브의 입체 장애 및 정전기력에 의해 영향을 받을 수 있고, 결과적으로 불완전한 혼성화가 발생하여 오 탐지 신호를 초래할 수 있다.
한편, 낮은 포획 프로브 농도에서 신호 강도는 분석의 감도 및 동적 범위에 영향을 미치며 비특이적 흡착으로 인해 비표적이 증가할 수 있다. 따라서, 최적화된 조건에 기초하여, 1 내지 80 μM 범위의 여러 포획 프로브 농도, 및 합성 DNA 표적의 연속 희석을 사용하여 교정 곡선을 수행하여 최적 포획 프로브 농도를 확립하고 가능한 최저 검사 한계를 달성할 수 있다.
종래의 핵산 마이크로어레이는 대부분 유리 슬라이드 마이크로어레이를 사용하였다. 기존의 마이크로어레이 프로토콜은 또한 포획 리간드로 표적 프로브의 느린 확산으로 인해 몇 시간의 긴 반응 시간을 사용하였다. DNA 마이크로어레이에서, 특히 표적 프로브의 능동 유동을 위한 교반 또는 펌핑이 없는 정적 마이크로어레이 시스템에서 표적 프로브 유동의 한계에 의해 표적 프로브-포획 프로브 혼성화가 방해받을 수 있다.
핵산 종이 어레이는 일반적으로 진단 분석을 위한 저렴한 플랫폼으로 사용되며 가장 일반적으로 사용되는 종이 어레이 분석 형식 중 하나는 측면 유동(LF) 검사이다. 횡류에 기초한 종이 핵산 바이오센서는 최근 박테리아, 기생충 및 바이러스와 같은 표적을 포함한 다른 전염병 인자의 검사를 위한 PCR 및 등온 증폭 생성물을 검사하기 위해 개발되고 있다.
LF 설정에서, 시료는 종이에 고정된 포획 프로브에 의해 결합될 때까지 시료의 표적 프로브가 종이 막을 따라 모세관 힘에 의해 이송되는 종이 스트립의 시작 부분에 처리된다. LF 검사의 검사는 일반적으로 하나의 표적으로 제한되지만, 새로 개발된 검사는 하나의 스트립에 여러 개의 표적을 포함할 수 있다. 여전히 개선이 필요한 종이 진단 테스트의 주요 과제 중 하나는 더 큰 다중검사 패널을 동시에 측정하는 것이며. LF에서 여러 표적의 다중 검사는 표적 프로브와 포획 프로브 사이의 교차 반응성에 의해 차단될 수 있다.
LF 설정에서, 표적 프로브를 포함하는 유체의 증발 또는 종이를 따른 유속의 변화와 같은 몇 가지 문제가 있을 수도 있다. 업스트림 표적에 의한 시료의 시약 고갈 및/또는 변경은 다운 스트림 스폿의 스폿 강도를 낮출 수 있다.
LF 설정에서, 많은 종이 어레이는 신호 향상없이 충분히 잘 작동하지만 필요한 감도와 감지 한계를 달성하기 위해 추가 신호 향상 단계가 필요한 경우가 있다. 신호 향상 전략을 설계할 때 저 자원 환경의 한계를 고려해야 한다. 예를 들어 효소의 사용은 RT에서 저장될 때 효소의 제한된 안정성으로 인해 문제가 될 수 있다. 이전에 효소가 없는 금 증착법에 기반한 신호 향상 전략을 개발했으며, RT에서 장기간 보관할 수 있는 시약을 사용하여 POC 상황에 적합하게 만들었다.
AFPF는 표적 프로브를 포함하는 RPA 증폭산물 용액이 다공성 기질(예를 들어, 종이)을 통해서 능동 유동할 때 표적 프로브를 분리할 수 있으며, 이것을 "능동 유동 시의 농축"이라 칭하였다. 더욱이, 종이를 통한 능동 유동은 농축 공정을 상당히 빠르게 할 수 있다. 이러한 현상을 기반으로, 본 명세서에 기술된 능동 유동 장치 및 스폿 검정 장치가 조합된 다중검사 기술은 농축을 위한 필수적인 성분으로 포획 프로브가 있는 종이 지지체를 포함할 수 있다. RPA 증폭산물 용액이 특정 종이 지지체에 적용되는 경우, 용액이 능동 유동함에 따라서 표적 프로브 분리 및 농축이 일어날 수 있다.
표적 프로브의 능동 유동에 기초한 AFPF가 유리할 수 있다. AFPF 설정에서 시료는 용지 센서 표면을 향하여 수직으로 능동유동을 한다. 따라서 표적 프로브는 일반적으로 펌프, 진공 또는 원심 분리기와 같은 외력에 의해 구동되는 포획 프로브의 위치로 능동 유동에 의해 실행될 수 있다.
RPA 시약의 주성분인 PEG 군집 시약과 밀접한 관련이 있는 “RPA 소구체”(핵산 증폭의 핵심으로 국소화된 RPA 시약 군집체)가 RPA 반응용액에서 형성될 수 있으며 이 경우는 LFD에 사용할 수 없게 될 수도 있다. 이는 이러한 복합체가 LFD에서 표적 프로브의 적절한 이동에 영향을 미쳐서 편향된 신호가 생길 수 있기 때문이다.
AFPF에서 종이는, RPA 소구체가 있는 RPA 증폭용액에 포함된 표적 프로브가 희석 단계를 경유하고 "능동유동 시의 농축"-기반 장치를 통해서 능동 유동할 때 표적 프로브를 농축시킬 수 있다. 종이는 RPA 증폭용액이 종이 어레이 여과 장치를 통해서 수평 또는 수직으로 유동할 때 표적 프로브를 RPA 소구체에서 유출시키고 농축시킬 수 있다.
AFPF는 종이를 지지체로 사용할 수 있다. 종이는 유체가 그것을 능동유동-통과하는 것을 허용하는 다공성 재료의 시트를 포함한다. 종이는 유체가 그것을 유동-통과하는 것을 허용하는 다공성 재료의 복수의 시트를 포함한다.
본 발명에서 하나 이상의 표적핵산의 다중분석 POC기술로 RPA 및 LFD의 다중분석에 대한 한계를 해결하기 위해, RPA 증폭용액의 이동 단계 및 종이 어레이의 반응 단계를 새로이 구성한 핵산 종이 어레이의 다중 분석기술을 완성하였다.
본 발명의 등온 증폭용액의 이동 단계는 (i) 등온 증폭 반응용액이 측면유동 장치(LFD)를 구성하는 종이의 모세관 힘에 의한 수동 유동으로 이동하는 방법 및 (ii) 증폭용액이 종이 어레이 여과(AFPF)장치를 구성하는 종이 어레이에 능동 유동으로 이동하는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 한 방법으로 실시할 수도 있다.
바람직하게, 등온 증폭용액 이동 단계 및 핵산 종이 어레이의 적절한 조합으로 이상적인 다중검사 방법을 개발할 수 있다.
표적 프로브를 포함하는 등온 반응용액은 초기에 단백질 및 PEG 군집 시약과 관련되어 있으며, 생성된 DNA-단백질-군집 시약 복합체는 LFD 검사를 위해 상기 RPA 반응용액의 직접적인 사용을 어렵게 할 수도 있다. 이는 이러한 복합체가 LFD에서 표적 프로브의 적절한 이동에 영향을 미쳐서 편향된 신호가 생길 수 있기 때문이다.
RPA 시약의 주성분인 PEG와 밀접한 관련이 있는 “RPA 소구체”( 핵산 증폭의 핵심인 국소화된 RPA 시약의 군집체)가 RPA 반응용액에서 형성될 수 있으며 이 경우는 LFD에 사용할 수 없게 될 수도 있다.
LFD 검사 전에 RPA 반응용액을 처리하는 여러 방법이 가열에 의한 단백질 변성 (65℃ 또는 95℃에서 10분 동안) 및 세제 처리(나트륨 도데실 설페이트, SDS), 효소 소화(Proteinase K 처리), 고속 원심분리를 통한 단백질 침전 및 상업용 DNA 세척 키트를 사용한 세척이 포함된다.
LFD 감지는 RPA 반응용액의 직접 사용도 가능하지만 스트립에서 실행하기 전에 RPA 반응용액을 실행 버퍼(예: 1/100 희석)로 희석하여 (1) 표적 프로브의 모세관 현상을 향상시키고 (2) "고스트 밴드"효과를 최소화해야 한다. 특히 RPA 시약에서 5.5 % 고 분자량 PEG (35kDa)를 6.5 % 저 분자량 PEG (3kDa)로 대체하여 LFD의 점액성 모세관 현상 문제를 완화할 수 있다. 또한, LFD 검사를 위한 희석 단계를 LFD의 시험 라인에 결합하기 위한 완화하는 방법일 수도 있다.
바람직하게, 본 발명의 AFPF 검사 전에 RPA 반응용액을 단순 희석하여 다음 단계로 바로 진행할 수 있다. 즉, AFPF 검사를 적용하면 희석 후 “RPA 소구체”에서 탈출할 수 있어 표적 프로브가 다운 스트림 시각 분석 검사를 할 수 있다.
능동유동 종이여과(AFPF)의 사용은 측면 유동 분석(LFA)에 비해 몇 가지 장점이 있다. 주사기 내 반응구 설계를 통해 능동 유동은 보다 정밀하게 제어되고, 표적화되고, 더 빠른 표적 프로브 유동을 포획 프로브에 제공하고 세척 단계를 쉽게 포함할 수 있으므로 다양한 분석 형식에 보다 유연하게 적응할 수 있다. 또한, AFPF 형식은 종이의 개별 지점으로 여러 대상에 대한 포획 프로브를 포함시켜 높은 다중검사를 가능하게 하여 다중 병원체 탐지를 위한 간단하고 빠른 플랫폼을 가능하게 한다.
동일한 반응 혼합물에서 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하는 다중 핵산분석은 표적 패널이 작은 경우에 널리 사용되며 제시된 설정으로 다중 핵산분석의 증폭 산물을 AFPF에서 직접 실행할 수 있다. 다중 핵산분석이 교차 반응 경향이 높은 대형 표적 패널 또는 프라이머 쌍으로 인해 불편하거나 불가능한 경우 여러 병렬 반응을 수행한 후 AFPF에서 실행되는 최종 제품을 개발할 수도 있다.
AFPF를 사용한 신호 검사는 <10 분 내에 수행될 수 있으며, 방법의 전체 시간은 현재 ~ 1 시간이며 RPA를 사용한 증폭 및 시료 준비 단계가 포함될 수 있다. AFPF 전 시료 준비를 단순화하여 분석 조건을 추가로 최적화하고 단축하면 전체 분석 시간이 줄어들 수 있다. 신호 증폭을 위한 잠재적으로 추가된 단계는 향상된 감도를 위해 고려 될 수 있다. 향후 연구는 또한 다른 호흡기 바이러스를 검사 패널에 통합하고 임상 환자 시료를 사용한 검사 한계 연구와 같은 방법의 추가 특성 분석을 수반할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서는 항체결합 금 나노 입자(AuNPs)를 이용한 비색 검사 방식으로 AFPF (Active-Flow Paper array Filter) 형식을 사용할 수 있다. AFPF의 사용은 LF 기반 분석과 비교할 때 더 큰 다중검사 기능에 대한 가능성이 있는 것으로 나타났으며, 따라서 다중검사 POC 테스트에 더 나은 옵션이 될 수 있다.
최근에, DNA 검사를 위한 핵산 증폭 시험(NAAT)을 현장 진단 친화적으로 설계하려는 노력이 행해졌지만, 이것은 종종 지나친 단순화로 인해서 감도가 결여되거나 또는 시험 정확성을 유지하기 위해서 사용 용이성이 희생된다. 더욱이, 현재 현장 진단(POC) NAAT는 여전히 전형적으로 시료를 분석 및 처리하기 위한 장비가 필요하다. 따라서, 완전 독립형 또는 휴대용인 상업화된 POC NAAT는 존재하지 않는다.
여기서, AFPF 검사는 하나의 종이의 상이한 복수 표적핵산에 상보적인 포획 프로브 패널을 포함하는 미래의 목표와 함께 유사 임상증상을 제공하는 병원체-검사에 사용되었다. 이 설정을 사용하면 호흡기 감염의 원인 물질에 대한 첫 번째 지표로 임상 시료를 AFPF 형식으로 실행할 수 있다. 또한 필요한 경우 종별 포획 프로브를 사용하여 다른 병원체 종의 유전자형을 이 설정에 적용할 수도 있다.
혼성화 용액은 염 농도의 변경 또는 변성제의 첨가에 의해 혼성화에 영향을 줄 수 있다. 두 가지 유형의 버퍼인 SSC와 Tris-buffered salin(TBS)의 혼성화 용액을 사용할 수 있다.
SSC 버퍼는 혼성화 분석을 위한 가장 일반적인 완충제 중 하나임에도 불구하고, 이 제형은 여전히 실험에서 높은 비표적 신호 (즉, 분홍빛 비표적)를 초래하여 TBS가 대안으로 고려할 수 있다.
본 발명에서 두 버퍼를 비교할 때, 핵산 구조를 보존하고 분해를 피하기 위해 사용되는 TBS가 2XSSC와 비교한 결과 더 낮은 비표적 신호가 있어 TBS에서 더 낮은 SBR 값이 얻을 수 있다.
주사기 펌프로 유량을 제어하고 감도를 증가시키도록 최적화할 수 있다.
포획 프로브가 인쇄된 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크를 1 mL 주사기와 결합된 폴리프로필렌 필터 홀더(Sterlitech, 미국)에 넣고, 주사기 펌프를 사용하여 상이한 분석 용액의 유량을 제어할 수 있다.
상기 분석용액은 표적 프로브가 있는 RPA 반응용액에 혼성화 용액을 첨가하여 희석 단계를 수행할 수 있다.
바람직하게, AFPF 분석 동안 혼성화 및 비색 표지, 두 가지 주요 단계는 둘 다 실온 (약 23-25℃)에서 수행할 수 있다. 마지막으로, 결합되지 않은 나노 입자를 제거하기 위한 마지막 세척 단계가 수행될 수 있다.
AFPF 분석이 완료되면, 막을 실온에서 10 분 동안 건조시킨 다음, 평판 스캐너에서 16 비트 그레이 스케일로 스캔할 수 있다.
이미징 후, 종이 어레이를 10 mM MES, pH 6 및 1 M H2O2 및 10 mM HAuCl4*3H2O로 구성된 신호 향상 용액에 담근다. 7 분 후, 어레이를 용액으로부터 제거하고, 증류수에서 간단히 헹구고, 실온에서 건조시킨다. 이어서, 세척된 어레이를 최종 시간 1회 이미지화하고, 사전 강화된 어레이와 동일한 방법을 사용하여 이미지 분석을 수행한다. 신호 대 잡음비는 복제 리간드 스폿으로부터의 평균 신호 강도를 복제 음성 대조군 스폿으로부터의 평균 신호 강도로 나눈 값으로 계산할 수 있다.
가시적인 신호 강도는 검사 검정법의 정확도를 개선시키기 위해서 향상될 수 있다. 이것은 초기 검사 검정법 이후에 반응 패드에 추가 시약을 도입함으로써 수행될 수 있다. 신호 향상시약은 표색 지시계의 표면 상에 부착된 효소와 반응하여 강한 시각적인 생성물을 형성하는 기질을 포함할 수 있다. 예의 방식으로, 표색 지시계가 금 리간드를 포함하면, 신호 향상은 은-향상 표지에 의해서 달성될 수 있고, 여기서 은 이온을 함유하는 향상 시약은 반응 패드에 적용될 수 있고, 여기서 금 리간드는 고정된 선/스폿에 결합된다. 이러한 시나리오에서, 금 리간드는, 은이 입자상에 침착될 수 있도록 핵화 자리로서 작용할 수 있어서, 증가된 신호 강도를 생성한다. 이러한 예에서, 신호 향상 시약은 초기 검사 검정법 이후에 별개로 첨가되거나 또는 종이 장치 상에 저장/탈수되어 자동/수동으로 방출될 수 있다.
6. 분자 인코드 방법
본 발명은 등온성 증폭, 분자 인코드 반응 및 비색 판독으로 리간드 종이 어레이의 고처리량 스크리닝을 연결하는 AFPF으로 구성할 수 있다. 이에 대한 살펴보면 다음과 같다.
분석하고자 하는 표적핵산에 특이적인 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 특정한 태그로 지시할 수 있으며, 특정 리간드는 특정 태그만을 인지하여 비공유결합으로 복합체를 형성할 수 있다. 이와 같은 원리를 이용하여 리간드로 표적핵산을 지시하는 방법은 “분자 인코드”이다.
분자 인코딩은 다중 분자 표지의 사용을 의미하며, 결합하면 바코드와 같은 식별을 제공할 수 있다. 시스템은 바이오마커의 일반적인 샌드위치 분석 검사를 위해 태그-리간드 반응을 사용하기 때문에 증폭 반응 중에 표지된 프라이머와 프로브에 통합하여 핵산 검사에 적용할 수 있다.
본 발명의 리간드는 표적 프로브에 있는 태그(tag)에 결합하는 분자일 수 있다. 리간드는 특정물질에 특이적으로 결합하는 분자이다. "특이적으로 결합한다"는 분자가 특정물질에 우세하게 결합하거나 또는 다른 분자보다 특정물질에 더 큰 친화도로 결합한다는 것은 나타낸다. 비제한적인 예의 방식으로, 항체는 그것과 작용하는 항원에 선택적으로 결합할 것이다. 또한, 비제한적인 예의 방식으로, DNA 분자는 엄격한 조건 하에서 유사성이 낮은 서열이 아니라 실질적으로 상보 서열에 결합할 것이다. "특이적 결합"은 분자(예를 들어, 단백질 및 다른 생물물질)의 균질한 집단에서 표적 분석물의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭할 수 있다. 리간드는 이의 특정물질에 결합하고, 시료 중에 존재하는 다른 분자에 유의한 양으로 결합하지 않는다.
태그는 바이오틴, 렉틴, 단백질, 펩티드, 당단백질, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 소분자, 중합체, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 및 지질 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하며 리간드와 결합 쌍을 형성할 수 있는 분자이다.
리간드는 항체, 렉틴, 단백질, 당단백질, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 압타머, 중합체, 렉틴, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 지질, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하며 태그와 결합 쌍을 형성할 수 있는 분자이다.
리간드는 항체 또는 항체 단편이며 이들로 제한되는 것은 아니다.
리간드는 압타머를 포함한다. 압타머는 핵산으로부터 형성된 항체-유사체를 포함한다. 리간드는 압타자임을 포함한다. 압타자임은 핵산으로부터 형성된 효소를 포함한다. 압타자임은 제2의 특이적 분석물의 존재 하에서만, 특이적 분자를 포획하도록 구성을 변화시키는 기능을 한다.
태그와 리간드
Tag (sequences) Ligand
His Tag (HHHHHH) Anti-His Tag Antibody
HA Tag (YPYDVPDYA) Anti-HA Tag Antibody
Myc Tag (EQKLISEEDL) Anti-Myc Tag Antibody
DYKDDDDK (DYKDDDDK) Anti-DYKDDDDK (FLAG® epitope Tag) Antibody
V5 Tag (GKPIPNPLLGLDST) Anti-V5 Tag Antibody
S Tag (KETAAAKFERQHMDS) Anti-S Tag Antibody
E Tag (GAPVPYPDPLEPR) Anti-E Tag Antibody
Anti-GCN4 (HLENEVARLKK) Anti-GCN4
Anti-Podoplanin [MAP tag] (GDGMVPPGIEDKIT) Anti-Podoplanin (MAP tag)
Anti-Tag54 [mAK54-1] (KHIKDWEHLEEF) Anti-Tag54 [mAK54-1
Anti-RAP tag [㎛ab-2]
(GDDMVNPGLEDRIEC)		 Anti-RAP tag [㎛ab-2]
Anti-Protein C [HPC-4] (EDQVDPRLIDGK) Anti-Protein C [HPC-4]
Digoxigenin Anti-Digoxigenin
Texas Red Anti-Texas Red
FITC Anti-FITC
Cascade Blue Anti-Cascade Blue antibody
TAMRA Anii-TAMRA antibody
DinitrophenoI Anti-Dinitrophenol antibody
Cy5 Anti-Cy5 antibody
Dansyl Anti-Dansyl antibody
Streptavidin Anti-Sirepiavidin antibody
Biotin Anti-Biotin antibody
Biotin Strepatividm
분자 인코드 방법은 표적 프로브는 포획 프로브인 리간드에 결합하는 태그를 포함한다. 포획 프로브는 리간드를 포함한다. 표적 프로브는 검사 가능한 특성(표색, 형광, 방사능 등)을 포함한다. 리간드는 표적 프로브의 태그와 상호작용하는 리간드(예를 들어, 항체)를 포함한다. 이중 표지된 표적 프로브를 포함하는 반응용액는 AFPF에 의해 종이 어레이에 있는 리간드에 첨가되고, 태그-리간드 반응으로 표적 프로브가 결합하여 표적 프로브-포획 프로브 복합체를 형성한다.
바람직하게, 본 발명에서 분자 인코드 방식을 이용한 하나 이상의 표적핵산을 AFPF로 검사하는 과정은 a) 표적핵산을 분석하고자하는 총핵산 시료를 준비하는 세척 단계; b) 상기 세척된 시료에 하나 이상의 표적핵산을 대상으로 설계된 올리고뉴클레오티드 세트 1, 재조합효소(Recombinase), 중합효소(Polymerase) 및 nfo(nfo endonucleases IV)를 포함하는 시약집단 1을 첨가하는 단계, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트 1은 표지물질을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 리간드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 최소한 포함하며; c) 상기 반응 용액에 있는 표적핵산에서 상기 태그와 표지물질이 포함된 표적 프로브를 제조하는 단계; d) 상기 표적 프로브가 있는 용액을 희석하여 하나 이상 리간드(capture)가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과 장치에 능동 유동 하에서 첨가하여 상기 종이에서 상기 표적 프로브의 태그와 상기 리간드가 분자 인코드 복합체를 형성하는 단계; e) 상기 능동 유동 하에서 상기 종이에 형성된 복합체로부터 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계; 및 f) 상기 종이 어레이에 형성된 복합체를 구성하는 증폭 산물의 표지 물질을 측정하는 단계;;를 포함할 수 있다.
7. RPA-CRISPR nuclease 반응
본 발명의 크리스퍼 유전자가위를 이용한 차세대 분자진단 기술의 개발은 신호 증폭(signal amplification), 신호 변환(signal transducing), 신호 발생(signal reporting)으로 구성되어 있다. 신호 증폭을 위해 주로 사용되는 기술은 RPA(recombinase polymerase amplification)이며, 신호 변환을 위해서는 크리스퍼 유전자가위 기술이 이용된다. 신호 발생을 위해서는 다양한 형광 단백질들이 많이 이용되고 있다. 또한 현장 적용성을 높이기 위해 시료에서 핵산을 추출할 필요없이 바로 분자진단에 이용할 수 있게 해주는 허드슨(HUDSON, Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases)도 개발되어 이용되고 있다.
크리스퍼 단백질인 Cas13a(이전에는 C2c2라 불림)가 표적 RNA 또는 DNA에 결합했을 경우 주변에 존재하는 비표적 RNA를 무작위적으로 절단하는 활성을 이용한다. 좀더 자세히 살펴보면 시료에 포함된 목적 DNA 혹은 RNA를 RPA와 RT-RPA (reverse transcription-RPA)로 각각 증폭하는 단계와 CRISPR-Cas13a 시스템에 의해 증폭된 목적 RNA가 존재할 때 주변의 리포터 RNA(reporter RNA)가 절단되어 형광 신호를 방출하는 단계로 구성된다. 극미량의 바이러스 혹은 암 유래의 DNA/RNA 시료를 RPA/RT-RPA로 증폭한 후 T7 RNA 중합효소로 전사시킬 경우 피코몰(㎛ = 10-12 M)의 감도가 아토몰(aM = 10-18 M)로 증가된다. 전사된 RNA에 Cas13a가 결합할 수 있는 목적 RNA가 존재하면 Cas13a가 활성화된다. 활성화된 Cas13a는 주변의 리포터 RNA를 무작위로 절단하여 형광 신호를 나타낸다. 이는 제6형 CRISPR-Cas13a 시스템이 제2형 CRISPR-Cas9 시스템과 다르게 DNA 대신에 RNA를 절단하고, 또한 목적 RNA를 결합한 후에 비특이적으로 주변의 RNA를 절단하는 특성(collateral cleavage activity)이 존재하기 때문이다.
크리스퍼 단백질인 Cas13과 더불어 클래스 II의 제5형 Cas12a(이전에는 Cpf1이라 불림) 크리스퍼 단백질도 부수적인 절단 활성(또는 트랜스 절단 활성, trans-cleavage activity)을 갖는다. 그러나 RNA를 표적으로 하는 Cas13과 달리 Cas12a는 DNA를 표적으로 하고 주변에 존재하는 ssDNA를 무작위적으로 절단한다. Cas12a는 gRNA에 의해 표적 DNA에 결합하면 부수적인 절단 활성이 활성화되어 주변에 존재하는 ssDNA를 무작위적으로 절단한다. 이러한 Cas12a의 부수적인 트랜스 절단 활성을 이용하여 개발된 핵산 검사기술이 바로 홈즈(HOLMES, one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)이다.
크리스퍼 유전자가위는 계통학적으로 2개의 클래스(class)와 6개의 유형(type)으로 분류되고 각 유형은 다양한 구조와 기능을 갖고 있지만, 분자진단에 이용되는 크리스퍼 단백질은 제2형 Cas9, 제5형 Cas12a, Cas12b, 제6형 Cas13a, Cas13b가 대표적이다.
크리스퍼 단백질인 Cas9, Cas13, Cas12는 각각 RCH(Rolling circle amplification-CRISPR-split-HRP)의 개발에 이용되었다. 이들은 모두 핵산 분해효소(nuclease)이나 Cas9의 경우 dsDNA(double-stranded DNA) 분해활성이 결여된 dCas9(dead Cas9)을 이용하기도 한다. Cas13과 Cas12의 경우 표적핵산에 서열 특이적으로 결합하면 주변에 있는 RNA와 ssDNA(singlestranded DNA)를 각각 분해할 수 있는 부수적인 핵산 분해 활성이 이용되었다.
현재까지 개발된 크리스퍼 유전자가위 기반 분자진단 기술은 간단한 시각 신호로 표적에 대한 정량 및 다중 감지가 가능하다. 또한 아토몰 수준의 초고 감도로 표적만을 선택적으로 검사할 수 있으며, 1~2 시간 이내에 검사 결과를 얻을 수 있다. 이는 이상적인 분자진단 기술의 많은 부분을 충족시키고 있다. 따라서 크리스퍼 유전자가위를 이용한 분자진단은 기존에 사용되던 현장진단기술(POC, 예: PCR, hybridization)과 동등한 또는 더 우수한 성능의 현장진단 기술 개발을 가속화시킬 것이다. 또한 더 신속하고 저렴한 진단이 가능해지면 현재 저개발국가를 중심으로 급속하게 퍼지는 바이러스에 의한 감염병의 통제가 가능해질 것이다.
8. NGS
기존의 염기서열을 분석하는 방법인 Sanger 기반의 염기서열 분석법은 정확하게 염기서열 정보를 얻을 수는 있지만, 개인 유전체 분석(personal genome analysis) 등 대용량의 DNA 염기서열 정보를 얻어야 하는 연구 분야에 적용하는 것은 분석에 걸리는 시간, 노동력, 비용 측면에서 비효율적이다. 이 때문에 고효율과 저비용으로 대용량의 DNA 염기서열 정보를 얻을 수 있는 새로운 분석기법에 대한 요구가 있었다. 2000년대 중반에 주형 DNA를 대상으로 짧은 길이의 염기서열을 대용량으로 빠르게 생성시킬 수 있는 차세대 염기서열 분석법(next generation sequencing; NGS)이 소개되었다. 최근 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing: NGS)이 대중화되면서 많은 사람들의 관심을 받고 있으며, 차세대 염기서열 분석법을 이용한 기술은 비약적으로 발전하고 있고, 이를 이용한 유전자형 분석 가격은 저렴해지고 있다. NGS 장비의 개발과 시약의 개선이 이루어지고, 생물정보학적 기법이 발달함에 따라서 NGS 분석은 기존의 Sanger 기반의 방법을 대체할 수 있는 여러 가지 장점을 가지고 있어 많은 연구 분야에서 사용되고 있다.
차세대 염기서열 분석 기술은 기존의 방법과 달리 대용량의 데이터를 빠른 시간에 생산할 수 있으므로, 유전체 해독에 필요한 시간과 비용을 획기적으로 절감시킨 기술이다. 차세대 염기서열 분석 기술은 시간이 지남에 따라 시퀀싱 플랫폼은 발전하고 분석 가격은 점점 저렴해지고 있으며, 멘델성 유전질환과 희귀질환, 암 등에서 차세대 염기서열 분석법을 이용해 질병의 원인 유전자를 찾는데 성공하고 있다. 현재 가장 많이 이용되고 있는 illumina社의 차세대 염기서열 분석법은 검체로부터 DNA를 추출한 이후 기계적으로 조각화(fragmentation)을 시킨 이후 특정 크기를 가지는 라이브러리(library)를 제작하여 시퀀싱에 사용한다. 대용량 시퀀싱 장비를 사용하여 한 개의 염기단위로 4가지 종류의 상보적 뉴클레오타이드(nucleotide) 결합 및 분리 반응을 반복하면서 초기 시퀀싱 데이터를 생산하게 되고, 이후에 초기 데이터의 가공(Trimming), 매핑(Mapping), 유전체 변이의 동정 및 변이 정보의 해석(Annotation) 등 생물적보학(Bioinformatics)을 이용한 분석 단계를 수행하여 이루어진다.
이러한 차세대 염기서열 분석법은 질병 및 다양한 생물학적 형태(phenotype)에 영향을 미치거나 가능성이 높은 유전체 변이를 발굴하여 혁신적인 치료제 개발 및 산업화를 통한 새로운 부가가치 창출에 기여하고 있다. 차세대 염기서열 분석법은 DNA 뿐만 아니라 RNA 및 메틸화 (Methylation) 해독에도 응용될 수 있으며, 단백질을 코딩하는 엑솜(Exome) 영역만을 포획(Capture)하여 시퀀싱하는 전장 엑솜 시퀸싱(Whole-exome sequencing, WES)도 가능하다.
한편, NGS에서 라이브러리 제작(Library preparation)은 시료의 무작위적인 DNA 또는 cDNA 조각에서 5‘에서 3’방향의 어댑터(adapter)를 접합하여 서열 분석에 필요한 라이브러리를 준비하는 과정이다. 초기 NGS 라이브러리 제작은 DNA 또는 RNA 시료의 무작위 절단, 3‘ 및 5’ 말단 수리(repair), 어댑터 연결(ligation), PCR 증폭 및 정제 과정 등의 복잡한 과정과 하루 내지 이틀의 긴 시간이 필요하였다. illumina社에서는 이를 개선하여, “Nextera XT DNA library Preparation”과 같은 tagmentation 방법을 개발하였다. 이는, transposome에 tag(기존의 어댑터)를 결합시킨 복합체를 샘플 DNA에 처리하여, 절단과 어댑터 연결을 동시에 수행한 다음, PCR로 증폭하는 방법으로서, 8개의 샘플에서 라이브러리를 제작할 때 걸리는 시간을 3시간으로 줄이는 성과를 얻었다.
차세대 염기서열 분석법을 구현하는 차세대 게놈 시퀀서(NGS; Next Generation Sequencer)로 대표적인 것으로는 로슈(Roche)/454, 일루미나(Illumina)/Solexa 및 라이프 테크놀로지스(ABI)의 SOLiD가 있다. 로슈/454와 SOLiD는 고체상의 지지체나 비드 상의 DNA에 주형이 상보적으로 결합된 상태에서 에멀젼 PCR (Emulsion PCR; emPCR)을 수행하여 분석대상 시료 내의 주형을 증폭하는 방식을 채택하고 있다 (Michael L. Metzker, Aapplications of next-generation sequencing; Sequencing technologies the next generation, Nature Reviews Genetics, Vol.11, pp31-46, January 2010). 로슈/454의 최신형 모델로 GS FLX 티타늄 시퀀서(GS FLX Titanium sequencer)와, 이를 소형화한 GS 쥬니어 티타늄 시퀀서(GS Junior Titanium sequencer)가 있으며, 이들 장비는 7시간에 8,000만개 서열의 판독이 가능하다. 이러한 기술 발전으로 종래에는 막대한 검사 비용으로 인해 연구용으로만 사용되던 차세대 염기서열 분석법을 의료용 임상 검사에서 활용할 수 있게 되었다. 그러나, 차세대 염기서열 분석법을 이용하여 생성된 대용량의 염기서열 데이터에서 서열의 길이는 종래의 생거(Sanger) 방법으로 생성한 염기서열 데이터에 비하여 현저하게 짧은 문제점이 있다. 즉, 차세대 염기서열 분석법은 이러한 문제로 인해 짧은 서열들을 모아서 레퍼런스(reference)가 없는 새로운 게놈 염기서열 구성하거나, 동일종 또는 비슷한 종의 서열을 참고로 하여 게놈 염기서열을 구성하는 과정이 필요한 단점이 있다. 뿐만아니라, 로슈(Roche)/454 기반의 차세대 염기서열 분석용 시퀀서는 사전에 증폭되어 준비된 주형인 앰플리콘(amplicon)을 에멀젼 PCR 과정에서 고체상의 지지체나 비드 상에 결합된 DNA에 상보적으로 어닐링한 후 증폭시키는데 이때 주형만이 증폭되어는 것이 아니라 앰플리콘의 준비과정에서 소모되지 않은 프라이머들의 이량체들이 증폭되어 시퀀싱 결과에 악영향을 미치는 문제가 있다. 또한 상기 방법도 대량의 시료를 분석할 경우 다음과 같은 많은 단계들이 있어 실험자의 노동과 실험 시간이 소용된다. 우선 대량의 시료 각각의 DNA를 정량하여서 tagmentation하고 이후 tagmentaion된 산물의 크기를 확인하고 정제하는 과정을 거치고 이를 PCR 증폭하고 증폭된 PCR 산물을 정제하는 과정이 끝난 후 같은 양으로 라이브러리 평균화(library normalization)를 수행한 다음에야 시퀀싱 작업을 수행할 수 있는 단점이 있다.
9. 표적핵산 검사 장치
도 2는 본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)의 구성도이다.
본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)는 케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 세척에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100); 상기 시료와 상기 시약을 포함하는 혼합용액에서 핵산 시료를 준비하는 반응튜브(210). 상기 혼합용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 핵산-결합물질 복합체를 포획하는 포획부(240, 자기장 인가부)를 포함하는 반응모듈(200), 여기서, 상기 핵산-결합물질 복합체가 있는 반응튜브(210)는 증폭 과정을 수행하여 증폭산물을 포함하는 용액을 제조하고; 표적 프로브를 포함하는 용액을 제조할 수도 있으며; 증폭결과를 시각화하며; 추가적으로 시각 증강 시약을 사용하여, 신호가 증강된 비색반응을 획득할 수 있으며; 또는 상기 획득한 증폭결과를 분석하는 장비(410) 및 분석 소프트웨어(430)를 포함하는 시각화 모듈(400); 및 각각 구성 모듈 사이에 시료, 시약 및 공기 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500);를 포함할 수 있다.
상기 표적핵산 검사 장치(1000)는 미세채널(microchannel)을 이용하여 구현할 수도 있다. 상기 시료에서 핵산을 추출하고 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액으로 세척하고 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조하여 증폭저해물질을 제거한 후 증폭하여 시각화하는 반응튜브(210)은 미세유동 작동기의 독립된 공간을 유지할 수 있는 채널이거나 일정한 부피가 있는 홈일 수 있다. 상기 반응튜브(210)는 유체가 순환하면서 벽면과 충돌하여 혼합용액의 혼합과 시료의 융해를 촉진할 수 있는 정사각형 구조일 수도 있다.
상기 케이스는 본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)를 구성하는 기본 몸체로서, 골격과 외부 커버를 포함하여 형성될 수 있다.
본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)는 케이스 하면을 효율적으로 냉각할 수 있으며, 냉각 효율을 높이기 위하여 상기 케이스 하면은 열전도도가 높은 재질(예를 들어 알루미늄 소재)로 구성될 수 있다.
상기 시약모듈(100)는 생체시료에 포함된 핵산을 세척, 증폭 및 분석에 필요한 시약을 저장하는 구성요소이며, 상기 시약모듈(100)에 있는 복수개의 시료 저장소(110)이 있으며 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 검사할 시료가 내장된다. 상기 시약모듈(100)에 있는 복수개 구비된 시약 저장소(120)들이 복수개의 열을 형성하는데, 상기 제1열 내지 제N열 각각에 용해, 세척, 증폭 및 시각화에 필요한 하나 이상의 시료 효소, 또는 시약이 내장된다. 이 때, 상기 시약모듈(100)의 일부 열은 비어있는 상태일 수도 있다.
상기 시약모듈(100)는 시료와, 용해, 핵산결합, 세척, 증폭 및 시각화에 필요한 시약가 내장된 상태로, 상기 이송모듈(500)의 순환부(510)가 구비됨으로써, 사용자는 시료를 대상으로 표적핵산 검사를 위하여 시약모듈(100)를 장착하는 것외에 별도의 공정이 필요치 않아 사용이 매우 편리한 장점이 있다.
상기 반응모듈(200)는 시료의 용해 및 융해된 시료와 결합물질의 핵산-결합물질 복합체의 형성, 복합체의 세척용액으로 세척과 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조하여 증폭저해물질의 제거, 증폭 및 시각화 공정을 수행하는 구성요소이다. 상기 반응모듈(200)는 반응튜브(210), 혼합부(220), 가열부(230) 및 포획부(240, 자기장 인가부)를 포함할 수 있다.
상기 반응튜브(210)는 온도 계측할 수도 있다. 본 발명의 용해/결합 단계는 20~80℃, 증폭단계는, PCR은 4 ~95℃ 및 등온 증폭은 38~42℃에서 실시할 수도 있다. 상기 반응튜브(210)는 상기 시약부(100)의 시료 저장소(110) 및 시약 저장소(120)에서 이송모듈(500)의 펌프(530)가 작동하여 분배부(520)의 관리로 순환부(510)에 의해 이송되고 혼합하여 반응하는 장소이다.
상기 반응튜브(210)는 상기 혼합부(220), 상기 가열부(230) 및 상기 포획부(240, 자기장 인가부)는 서로 인접하게 장착된 구성일 수 있다.
상기 혼합부(220)는 상기 반응튜브(210) 특정 열에 상기 시료에 용해물질용액, 결합물질용액 및 결합촐진제용액을 포함하는 혼합용액의 혼합은 diffusion driven 및 chaotic advection를 포함하는 수동 방법 그리고 thermal, optical, magnetic, electrokinetic, hydrodynamic 및 acoustic-based mixing를 포함하는 능동 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 수행할 수 있다.
바람직하게, 상기 혼합부(220)는 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210) 특정 열에 진동을 부가하여 용해를 촉진하기 위한 혼합을 일으킬 수 있다.
상기 가열부(230)는 각종 반응을 가속화하여 효율을 더욱 높일 수 있도록 할 수 있다.
상기 포획부(240, 자기장 인가부)는 자기장을 조절할 수 있는 전기력 자석(241)을 포함하여 자기장을 인가하여 표적핵산이 부착된 자기 입자를 용액에서 분리하는 역할을 수행한다.
상기 동일한 특정 열이란, 시약모듈(100)에 형성되는 제1열 내지 제N열 중 선택되는 열을 의미하는 것으로서, 상기 반응튜브(210), 혼합부(220), 가열부(230) 및 포획부(240)는 특정 열에 각각 자기장을 가하거나 또는 자기장, 가열 및 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조를 동시에 인가할 수 있다.
상기 반응모듈(200)은 상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의해 관리되는 순환부(510)와 연결되고, 이송모듈(500)의 펌프(530)의 흡입 및 토출에 의해, 상기 시약모듈(100)에 내장된 생체시료, 세척에 필요한 시료 또는 시약이 이송되어 혼합되며, 혼합부(220)에 의해 진동이 반응튜브(210)에 부가되고, 상기 가열부(230)에 의해 가열되고, 상기 자기장 인가부(240)에 의해 자기장이 인가되며, 용해/결합 단계가 이행된다. 상기 시약모듈(100)에 있는 세척용액이 상기 시약 순환부(512)에 의해 용해/결합단계가 종료된 반응튜브(210)에 이송됨으로써 세척을 수행하여 세척이 이루어진다. 아울러, 상기 반응모듈(200)는 핵산을 추출하기 위한 생체시료를 넣어주는 반응튜브(210)를 포함하는 시료 순환부(511)를 더 포함할 수 있으며, 상기 시료 순환부(511)는 이송이 용이하도록 상기 이송모듈(500)에 연결하는 것이 바람직하다.
상기 시각화 모듈(400)은 상기 반응튜브(210)에 있는 증폭산물을 분석하는 소프트웨어(430)가 있는 분석장비(410)로 구성될 수 있다. 상기 분석장비(410)는 비색반응 또는 형광을 분석하는 기능이 있을 수 있다. 상기 증폭 산물이 있는 반응튜브(210)에 저장모듈(100)에 있는 시각화 시약을 시약 순환부(512)로 이송되고, 그 반응결과를 증강하여 시각화할 수도 있다.
상기 이송모듈(500)은 각각 구성 모듈 사이에 시료, 시약 및 공기 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 각각 구성모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함할 수 있다.
상기 순환부(510)는 시약모듈(100)의 시료 저장소(111)에 있는 시료를 반응모듈(200)의 반응튜브(210)로 이송하는 시료 순환부(511), 시약모듈(100)의 시약 저장소(112)에 있는 시약들을 반응모듈(200)로 이송하는 시료 순환부(512) 및 공기를 각각 구성 모듈로 이송하는 공기 순환부(513)으로 구성할 수 있다. 상기 시료 순환부(511), 시약 순환부(512) 및 공기 순환부(513)를 포함하는 순환부(510)에서 유체유동을 조절하기 위해 분배기(520)가 더 설치될 수 있다. 순환부(510)는 구성단위와 연결되는 진공펌프(530)를 포함하여 형성된다. 상기 진공펌프(530)의 작동에 의해 상기 특정 열에 공기를 배기시킨다. 상기 진공펌프(530)가 작동되면 상기 반응모듈(200)의 특정 열 내부에 잔존하는 세척용매가 빠르게 제거되며, 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조가 완료된다.
또한, 상기 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조기능이 구비됨으로써 세척된 표적핵산 내부에 세척용매를 건조시키는 시간을 대폭적으로 줄여서 증폭 과정에 악영향을 미치는 세척용매를 빠르게 제거할 수 있는 장점이 있다
상기 분배기(520)은 이송모듈(500)의 펌프(530)에 고정된 구성으로서, 반응에 필요한 적절한 용량을 배분하여 제공한다. 상기 분배기(520)의 제어에 의해, 상기 시약모듈(100)에 있는 시료 및 시약이 상기 반응모듈(200)에 정확하고 용이하게 장착되며 이에 따라 본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)의 핵산검사 작업을 용이하게 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)는 상기 이송모듈(500)의 펌프(530)에 순환부(510)을 탈부착 가능하게 구비되며, 상기 순환부(510)은 하나의 분석이 완료되면 교체되거나, 세척 후 재사용할 수 있다.
본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)의 분석 방법을 상술하면, <도 1>에 제시한 바와 같이, 시료, 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제를 포함하는 혼합용액에서 시료를 용해하여 핵산-결합물질 복합체를 형성하는 용해/추출 단계(S100); 여기서, 또는 상기 혼합용액에서 결합촉진제를 제외하며; 상기 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액을 이용한 세척으로 증폭저해물질을 제거하는 세척 단계(S200); 여기서, 세척된 핵산-결합물질복합체에 용출용액을 사용하여 핵산을 용출하는 과정을 추가하며, 및 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체 또는 용출된 핵산을 포함하는 증폭용액에서 표적핵산을 증폭하며 동시에 시각화하는 증폭 단계(S300);를 포함할 수 있다.
본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)의 분석 방법에서 상기 용해/추출 단계(S100), 세척 단계(S200) 및 증폭 단계(S300)는 이상적으로 한 튜브에서 실시할 수 있다. 상기 세척단계에 용출과정을 추가하여 증폭용액을 동일한 튜브에서 준비하여 증폭을 실시할 수도 있다.
상기 이송모듈(500)에 의해 상기 시약모듈(100)의 시료 저장소(110)를 구성하는 제1열 내지 제N열에 각각 내장된 하나 이상의 시료와 시약모듈(100)의 시약 저장소(120)에 내장된 하나 이상의 시약을 반응튜브(210)로 이송/혼합/결합/세척/증폭/시각화하여 핵산 시료를 세척하고 증폭하여 표적핵산을 분석하는 단계;일렬 연속적으로 수행할 수 있다.
상기 용해/추출 단계(S100)는 핵산을 포함하고 있는 시료를 융해시켜 핵산을 용출하는 시료 용해/추출 단계; 시료의 균질화된 용액에 포함되어 있는 핵산을 기능화 자기 입자에 부착시키고 기타 생체물질 용액을 제거하는 핵산 결합단계;를 포함할 수 있다
상기 세척 단계(S200)는 핵산이 부착된 자기 입자의 기타 불순물을 제거해주는 자기 입자 세척단계; 핵산-결합물질 복합체에 함유된 세척용 용매(에탄올)를 제거하도록 자기입자 건조 단계;를 포함할 수 있으며, 추가적으로 자기입자에 부착된 핵산을 떼어내기 위해 용출용액을 가해주는 획득 단계;를 실시할 수도 있다.
이 때, 상기 세척 단계(S200)에서, 필요에 따라 혼합부(220)에서 반응튜브(210) 특정 열에 진탕 또는 진동을 인가하고, 자기장 인가부(240)에 의해 상기 반응튜브(210) 특정 열에 자기장을 인가하는 자기장 인가 단계; 가열부(230)에 의해 상기 반응튜브(210)의 특정 열을 가열하는 가열 단계가 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 자기 입자 건조 단계는 상기 반응튜브(210)에 상기 공기 순환부(513)에 의해 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체를 포함하고 있는 반응튜브(210)에 펌프(530)로 세척용매(에탄올)가 증발하도록 공기를 흡입하여 배출하는 것이다. 동시에 열들을 가열부(230)에 의해 가열하여 줌으로서 세척용매의 건조시간을 단축할 수도 있다.
또한, 상기 증폭 단계(S300)는 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체가 있는 반응튜브(210)에 시약모듈(100)에 있는 증폭시약이 이송부(500)에 의해 반응튜브(210)으로 이송되고 혼합부(220)에 의해 혼합하는 혼합 단계; 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 증폭하는 온도 조절 단계; 및 증폭이 진행됨에 따라 이송된 시각화 시약에 의한 시각화 단계; 를 포함할 수 있다. 여기서, 증폭 검사에 필요한 올리고뉴클레오티드를 첨가한다.
더욱 상세하게 증폭 단계(S300)를 설명하면, 상기 혼합 과정은 이송모듈(500)가 상기 세척 단계(S100)를 통해 획득된 세척된 핵산-결합물질 복합체가 있는 반응튜브(210)로 시약모듈(100)의 증폭시약을 이송하고, 혼합부(220)에 의해 핵산복합체와 증폭시약의 혼합되면서 핵산이 용출되고 이송된 증폭시약과 혼합하여 증폭용액을 준비하는 단계이다.
상기 온도 조절 단계는 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 증폭하는 단계이다. 이 때, 상기 증폭 단계(S200)가 수행되는 반응(200)는 여러 종류의 시료가 있을 때 상응하는 반응튜브(210)를 장착할 수 있다.
더욱 상세하게, 본 발명의 단계 S300에서 상기 증폭의 예시로 RT/RPA의 경우, 1열의 반응튜브(210)에 역전사 반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고, 이송모듈(500)를 통해 1열의 반응튜브(210)로 RPA 시약을 이송하어 역전사반응물과 혼합하여 RPA 반응을 수행할 수 있다. 또는 RT 반응과 RPA 반응 한 단계로 동시에 한 튜브에서 실시할 수 있다. 본 발명에서 두 반응을 한 튜브에 실시하였다. 상기 반응튜브(210)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S300에서 상기 등온 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-nfo의 경우, 한 시료는 1열의 반응튜브(210)에 역전사 반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고; 1열의 반응튜브(210)에 이송모듈(500)의 시약 순환부(511)를 통해 시약모듈(100)에 있는 RPA-nfo 반응용액이 이송되어 있어 역전사반응물과 혼합하여 RPA-nfo 반응을 수행할 수 있다. 또는 RT 반응과 RPA-nfo 반응이 동시에 한 튜브에서 실시할 수 있다. 본 발명에서 두 반응을 동시에 한 튜브에 실시하였다. 다른 시료는 2열의 반응튜브(210)에서 상기와 함께 동일하게 반응을 수행하였다. 상기 반응튜브(210)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S300에서 상기 등온 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-CRISPR nuclease의 경우, 반응튜브(250)의 1열에 1차 RT/RPA 반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 재조합효소 증폭 반응을 수행하고, 반응튜브(250)의 1열에 CRISPR nuclease 반응용액이 들어 있어 1차 RT/RPA반응의 반응물을 혼합하여 RT/RPA-CRISPR nuclease 반응을 수행할 수 있다.
상기 단계 S300의 시각화 공정은 상기 건조 핵산복합체가 있는 반응튜브(210)에 시약순환부(512)를 포함하는 이송모듈(500)에 의해 시약모듈(120)에 있는 증폭시약을 반응튜브(210)에 이송할 때 시각화 시약을 함께 반응튜브(210)에 이송하여 증폭공정에 따라 비색 반응을 할 수 있도록 하는 공정;을 포함할 수 있다.
본 발명의 공동 추출한 핵산 시료를 증폭하여 표적핵산을 자동 검사하는 장치(1000)를 상기와 같이 제작하여 운영할 수 있다.
본 발명의 자동 검사 장치(1000)의 증폭반응은 PCR 또는 등온 증폭을 선택하여 실시할 수 있다.
도 3은 본 발명의 표적표적핵산 다중검사 장치(2000)의 구성도이다.
본 발명의 표적표적핵산 다중검사 장치(2000)는 케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 세척에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100); 상기 시료와 상기 시약으로 구성된 반응용액에서 핵산 시료를 준비하는 반응 튜브(210). 상기 반응용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 핵산-결합물질 복합체를 포획하는 포획부(240, 자기장 인가부)를 포함하는 반응모듈(200), 여기서 세척된 핵산-결합물질 복합체를 포함하는 반응튜브(210)은 증폭 과정을 수행하고 표적 프로브를 포함하는 용액을 제조하며; 상기 표적 프로브가 있는 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이(310)에서 표적-포획 복합체를 형성하는 여과장치(320), 시각화 시약으로 스폿이 형성되는 종이 어레이(310)를 포함하는 AFPF 모듈(300); 상기 종이 어레이(310)에 있는 스폿을 스캔하는 스캔너(410), 이미지를 중강하는 증강부(420) 및 상기 이미지를 분석하는 소프트웨어(430)를 포함하는 시각화 모듈(400); 및 각각 구성 모듈 사이에 공기 또는 유체 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500);를 포함할 수 있다.
상기 표적핵산 검사 장치(1000)는 미세채널(microchannel)을 이용하여 구현할 수도 있다. 상기 시료에서 핵산을 추출하고 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액으로 세척하고 건조하여 증폭저해물질을 제거한 후 증폭하여 시각화하는 반응튜브(210)은 미세유동 작동기의 독립된 공간을 유지할 수 있는 채널이거나 일정한 부피가 있는 홈일 수 있다. 상기 반응튜브(210)는 유체가 순환하면서 벽면과 충돌하여 혼합용액의 혼합과 시료의 융해를 촉진할 수 있는 정사각형 구조일 수도 있다.
상기 반응모듈(200)은 상기 시료와 상기 시약으로 구성된 반응용액에서 핵산 시료를 준비하는 반응튜브(210). 상기 반응용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 핵산-결합물질 복합체를 포획하는 포획부(240, 자기장 인가부)를 포함하는 반응모듈; 여기서 상기 반응튜브(210)는 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체로부터 증폭 과정을 수행하고 표적 프로브를 포함하는 용액을 제조한다. 또한 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체로부터 용출된 핵산시료를 사용할 수도 있다.
상기 케이스는 본 발명의 표적표적핵산 다중검사 장치(2000)를 구성하는 기본 몸체로서, 골격과 외부 커버를 포함하여 형성될 수 있다.
본 발명의 표적표적핵산 다중검사 장치(2000)는 케이스 하면을 효율적으로 냉각할 수 있으며, 냉각 효율을 높이기 위하여 상기 케이스 하면은 열전도도가 높은 재질(예를 들어 알루미늄 소재)로 구성될 수 있다.
상기 시약모듈(100)는 생체시료에 포함된 핵산을 세척, 증폭 및 분석에 필요한 시약을 저장하는 구성요소이며, 상기 시약모듈(100)에 있는 복수개의 시료 저장소(110)이 있으며 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 세척에 필요한 시료가 내장된다. 상기 시약모듈(100)에 있는 복수개 구비된 시약 저장소(120)들이 복수개의 열을 형성하는데, 상기 제1열 내지 제N열 각각에 용해, 세척, 증폭 및 시각화에 필요한 하나 이상의 시료 효소, 또는 시약이 내장된다. 이 때, 상기 시약모듈(100)의 일부 열은 비어있는 상태일 수도 있다.
상기 시약모듈(100)는 시료와, 세척에 필요한 시약 또는 시료가 내장된 상태로, 상기 이송모듈(500)의 유체 순환부(510)이 구비됨으로써, 사용자는 세척을 위하여 시약모듈(100)를 장착하는 것외에 별도의 공정이 필요치 않아 사용이 매우 편리한 장점이 있다.
상기 반응모듈(200)는 생체시료로부터 표적핵산을 세척하는 구성요소이다. 상기 반응모듈(200)는 반응튜브(210), 혼합부(220), 가열부(230) 및 자기장 인가부(240))가 포함된다.
상기 반응모듈(200)는 상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의해 관리되는 노즐 순환부(510)와 연결되고, 이송모듈(500)의 펌프(530)의 흡입 및 토출에 의해, 상기 시약모듈(100)에 내장된 시료, 용해 및 결합 및 세척에 필요한 시료 또는 시약이 이송되어 혼합부(220)에 의해 혼합되며, 위 과정 중에 가열부(230)에 의해 가열됨으로써 용해가 촉진되고,.상기 자기장 인가부(240)에 의해 자기장이 인가되어 형성된 핵산-결합물질 복합체를 수확하고 시약순환부(512)에 의해 세척용액로 세척하고 공기 순환부(513)에 의해 공기로 상기 핵산-결합물질 복합체를 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조하여 증폭저해물질을 제거할 수 있다. 상기 반응튜브(210)는 상기 시약부(100)의 시료 저장소(110) 및 시약 저장소(120)에서 이송모듈(500)의 펌프(530)를 작동하여 분배부(520)의 관리로 노즐 순환부(510)의 시료 순환부(511) 및 시약 순환부(512))를 통해 이송되고 혼합하여 반응하는 장소이다.
상기 혼합부(220)는 상기 반응튜브(210) 특정 열에 진동을 부가하여 용해를 촉진하기 위한 혼합을 일으키는 역할을 수행한다.
상기 가열부(230)는 동일한 반응튜브(210)를 가열하는 구성이다. 또한, 상기 반응모듈(200)는 가열부(230)를 포함하여 각종 반응을 가속화하여 세척 효율을 더욱 높일 수 있도록 할 수 있다. 상기 가열부(230)는 특정 열을 가열하는 다양한 형태로 형성될 수 있으나, 자기장 인가부(240)가 금속재질로 형성되고, 상기 자기장 인가부(240)를 가열하는 수단일 수 있다.
상기 자기장 인가부(240)는 자기장을 조절할 수 있는 전기력 자석(241)을 포함하여 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210)특정 열에 자기장을 인가하여 표적핵산이 부착된 자기 입자를 용액에서 분리하는 역할을 수행한다.
상기 건조기능은 상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의한 관리되는 노즐 순환부(510)의 공기 순환부(513)에 의해 공기를 이송함으로써 동일한 특정 열을 건조하는 것이다. 또한, 상기 반응모듈(200)는 세척효율을 높이기 위하여 반응튜브(210)의 특정 열을 공기를 배기하는 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조 기능이 더 형성될 수 있다. 상기 건조 기능은 순환부(510)의 공기 순환부(513)와 연결되는 진공펌프(510)를 포함하여 형성된다. 상기 진공펌프(510)의 작동에 의해 상기 특정 열에 공기를 배기시킨다.
상기 동일한 특정 열이란, 시약모듈(100)에 형성되는 제1열 내지 제N열 중 선택되는 열을 의미하는 것으로서, 상기 혼합부(220), 가열부(230) 및 자기장 인가부(240)와 건조기능이 특정 열에 각각 진동하거나, 자기장을 가하거나, 가열 및 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조를 인가할 수 있다.
상기 증폭산물이 있는 반응튜브(210)에 시약모듈(100)의 변성용액 및 중화용액을 시약 순환부(512)에 의해 유입하여 이중가닥 증폭산물에서 단일가닥 표적프로브를 제조할 수도 있다.
상기 반응튜브(210)에 있는 증폭산물이 상기 이송모듈(500)의 분배부(520)에 의한 관리되는 순환부(510)에 의해 AFPF모듈(300)로 이송될 수 있다.
상기 AFPF 모듈(300)는 상기 표적 프로브를 포함하는 증폭산물을 분석하는 구성요소이다. 상기 AFPF 모듈(300)는 종이 어레이(310) 및 여과장치(330)가 포함된다.
상기 AFPF모듈(300)은 능동유동 핵산 혼성화를 수행하고 포획 프로브가 고정된 종이 어레이(310)가 장착된 여과장치(320), 상기 능동유동을 유지하는 이송모듈(500)의 펌프(510)에 의해 공기 순환부(514) 및 상기 반응모듈(200)에서 획득한 중화된 단일가닥 표적 프로브를 포함하고 희석된 용액을 여과장치(320)에 이송하는 상기 노즐 순환부(510)의 중간산물 순환부(513)를 구비한다.
상기 시각화 모듈(400)는 상기 분석 결과를 시각하는 구성요소이며, 상기 시각화 모듈(400)는 영상장치(410), 이미지 증강부(420) 및 소프트웨어(430)가 포함된다.
상기 시각화 모듈(400)는 상기 반응이 종결된 종이 어레이(310)가 장착된 여과장치(320)에서 분리된 종이 어레이(310)의 이미지를 스캔하여 정량하는 스캔너(410), 상기 종이 어레이(310)은 하나의 분석이 완료되면 시각 증강 시약을 사용하여, 신호가 증강된 이미지를 획득하여 분석하는 증강부(420) 및 획득한 이미지를 분석하는 소프트웨어(430)를 구비한다.
상기 이송모듈(500)은 상기 순환부(510), 분배부(520),펌프(530) 및 관리부(540)으로 구성될 수 있다. 상기 순환부(510)는 시약모듈(100)의 시료 저장소(111)에 있는 시료를 반응모듈(200)의 반응튜브(210)로 이송하는 시료 순환부(511), 시약모듈(100)의 시료 저장소(112)에 있는 시약들을 각각의 모듈(200, 300 또는 400)로 이송하는 시료 순환부(512), 공기를 각각 구성 모듈로 이송하는 공기 순환부(513) 및 증폭산물을 이송하는 증폭산물 순환부(514)으로 구성할 수 있다.
상기 분배기(520)은 이송모듈(500)의 펌프(530)에 고정된 구성으로서, 반응에 필요한 적절한 용량을 배분하여 제공한다. 상기 진공펌프(530)가 작동되면 상기 반응모듈(200)의 특정 열 내부에 잔존하는 세척용매가 빠르게 제거되며, 건조가 완료된다.
또한, 본 발명의 표적핵산 자동 다중 검사 장치(2000)는 상기 건조기능이 구비됨으로써 세척된 표적핵산 내부에 세척용매를 건조시키는 시간을 대폭적으로 줄여서 증폭 과정에 악영향을 미치는 세척용매를 빠르게 제거할 수도 있는 장점이 있다.
본 발명의 표적핵산 자동 다중검사 장치(2000)는 상기 이송모듈(500)의 펌프(530)에 순환부(510)을 탈부착 가능하게 구비되며, 상기 순환부(510)은 하나의 분석이 완료되면 교체되거나, 세척 후 재사용할 수 있다.
본 발명의 표적핵산 다중검사 장치(2000)는 상기 시약모듈(100)에 시약 및 상기 반응모듈(200)에 시료가 정확한 장착되며 이송모듈(500)의 제어가 용이하며, 이에 따라 세척 작업을 용이하게 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 표적핵산 다중검사 장치(2000)의 분석 방법을 상술하면, 시료, 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제를 포함하는 혼합용액에서 시료를 용해하여 핵산-결합물질 복합체를 형성하는 용해/추출 단계(S100); 여기서, 또는 상기 혼합용액에서 결합촉진제를 제외하며; 상기 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액을 이용한 세척을 하여 증폭저해물질을 제거하는 세척 단계(S200); 여기서, 세척된 핵산-결합물질복합체에 용출용액을 사용하여 핵산을 용출하는 과정을 추가하며, 및 상기 세척된 핵산-결합물질 복합체 또는 용출된 핵산을 포함하는 증폭용액에서 표적핵산을 증폭하며 동시에 시각화하는 증폭 단계(S300); 및 상기 증폭산물로부터 단일가닥 표적 프로브를 포함하는 증폭용액을 제조하는 표적프로브 준비 단계(S400);를 실시하며, 이어서 상기 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 능동 유동 하에서 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500); 상기 능동 유동 하에서 상기 종이 어레이에 형성된 표적-포획 프로브 복합체와 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계(S600); 및 상기 종이 어레이에 있는 세척된 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 단계(S700);를 포함할 수 있다.
본 발명의 표적표적핵산 다중검사 장치(2000)의 분석 방법에서 상기 용출 단계(S100), 세척 단계(S200), 증폭 단계(S300) 및 표적 프로브 준비 단계(S400)는 이상적으로 한 튜브에서 실시할 수 있다. 상기 세척단계(S200)에 용출과정을 추가하여 증폭용액을 준비하여 증폭을 실시할 수도 있다.
상기 이송모듈(500)에 의해 상기 시약모듈(100)의 시료 저장소에 포함된 시료 및 시약모듈(100)의 제1열 내지 제N열에 각각 내장된 세척에 필요한 하나 이상의 시약을 이송모듈(500)을 통해 반응튜브(210)로 이송하고 혼합하여 용해단계(S100)을 걸쳐 핵산 시료를 세척하는 단계(S200), 상기 세척 핵산 시료를 증폭하는 단계(S300) 및 상기 증폭산물로부터 표적 프로브를 준비하는 단계(S400);를 일렬 연속적으로 수행할 수 있다.
상기 용해/추출 단계(S100)는 핵산을 포함하고 있는 생체시료를 융해시켜 핵산을 용출하는 시료 용해 단계; 생체시료의 균질화된 용액에 포함되어 있는 핵산을 기능화 자기 입자에 부착시키고 기타 생체물질 용액을 제거하는 핵산 결합물질 복합체를 형성하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 세척 단계(S200)는 핵산이 부착된 결합물질 복합체의 기타 불순물을 제거해주는 자기 입자 세척단계; 및 자기 입자에 함유된 세척용 용매를 제거하는 자기입자 건조 단계;를 포함하며 추가적으로, 자기입자에 부착된 핵산을 떼어내기 위해 용출용액을 가해주는 획득 단계;를 실시할 수도 있다.
이 때, 상기 용해단계(S100) 및 세척 단계(S200)에서, 필요에 따라 혼합부(220)에서 반응튜브(210) 특정 열에 진탕 또는 진동을 인가하고, 자기장 인가부(240)에 의해 상기 반응튜브(210) 특정 열에 자기장을 인가하는 자기장 인가 단계; 가열부(230)에 의해 상기 반응튜브(210)의 특정 열을 가열하는 가열 단계가 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 자기 입자 건조 단계는 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210)에 상기 이송모듈(500)의 노즐 순환부(510)을 이용하여 진공모듈(530)을 작동한 후, 상기 반응모듈(200)의 자기 입자를 포함하고 있는 반응튜브(210)의 내부에 접촉되지 않게 이동시킨 후 펌프(510)로 공기를 흡입하여 배출하는 것이다. 동시에 열들을 가열부(230)에 의해 가열하여 줌으로서 세척용매의 세척용매(에탄올)가 증발하도록 건조시간을 단축할 수도 있다.
또한, 상기 증폭 단계(S300)는 상기 세척 단계(S200)를 통해 획득된 표적핵산 함유 핵산용액이 있는 반응튜브(210)에 시약모듈(100)에 있는 다중검사 목적 다중의 프라이머를 포함하는 증폭시약이 이송부(500)을 통해 이송되고 혼합부(220)으로 혼합하는 혼합 단계; 및 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 등온 증폭하는 온도 조절 단계; 를 포함할 수 있다. 여기서, 증폭 검사에 필요한 올리고뉴클레오티드를 첨가할 수도 있다.
더욱 상세하게 증폭 단계(S300)를 설명하면, 상기 혼합 과정은 이송모듈(500)가 상기 세척 단계(S200)를 통해 획득된 표적핵산 함유용액을 반응튜브(210)에 이송시키고, 혼합부(220)을 통해 반응액과 혼합시키는 단계이다.
상기 온도 조절 단계는 가열부(230)에 의해 온도를 조절하여 핵산 추출 수율 향상시키거나, 세척 총핵산 시료를 등온 증폭하는 단계이다.
이 때, 상기 증폭 단계(S300)가 수행되는 반응(200)는 많은 반응튜브(210)를 장착할 수 있어, 1열의 반응튜브(211), 2열의 반응튜브(212) 등을 사용하여 추후 다른 분석용 사용할 수도 있다.
본 발명에서 다중검사를 위해서, 본 발명의 증폭 단계 S300에서 추가적인 표적핵산에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 세트를 첨가하여 다중 표적핵산 증폭할 수 있다.
더욱 상세하게, 본 발명의 단계 S300에서 상기 다중 등온 증폭의 예시로 RT/RPA의 경우, 1열의 반응튜브(210)에 역전사반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고; 동일한 1열의 반응튜브(210)에 이송모듈(500)의 시약 순환부(511)를 통해 시약모듈(100)에 있는 RPA 반응용액이 이송되어 있어 역전사반응물과 혼합하여 RPA 반응을 수행할 수 있다. 상기 반응튜브(210)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S300에서 상기 다중 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-nfo의 경우, 1열의 반응튜브(210)에 역전사반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 역전사반응을 수행하고; 동일한 1열의 반응튜브(210)에 이송모듈(500)의 시약 순환부(511)를 통해 시약모듈(100)에 있는 RPA-nfo 반응용액이 이송되어 있어 역전사반응물과 혼합하여 RPA-nfo 반응을 수행할 수 있다. 또는 RT 반응과 RPA-nfo 반응 한 튜브에서 실시할 수 있다. 본 발명에서 두 반응을 한 튜브에 실시하였다. 상기 반응튜브(210)은 가열부(230)에 의해 일정한 온도를 유지할 수도 있다.
본 발명의 단계 S300에서 상기 다중 등온 증폭의 또 다른 예시로 상기 RT/RPA-CRISPR nuclease의 경우, 1열의 반응튜브(210)에 1차 RT/RPA 반응액이 들어 있어 표적핵산 함유용액과 혼합하여 재조합효소 증폭 반응을 수행하고, 동일한 1열의 반응튜브(210)에 CRISPR nuclease 반응용액이 들어 있어 1차 RT/RPA반응의 반응물을 혼합하여 RT/RPA-CRISPR nuclease 반응을 수행할 수 있다.
상기 다중검사의 단계 S400을 위해, 상기 반응모듈(200)의 반응튜브(210)에 있는 표적프로브 함유용액에 이송모듈(500)의 시약 순환부(512)을 통해 단일화 용액을 첨가하여 이중가닥을 단일가닥으로 전환시키는 단일화시키고, 추가적으로 중화 용액을 이송하여 중화 용액을 제공할 수 있다.
상기 혼성화 단계 S500는 상기 이송모듈(500)의 중간산물 순환부(513)을 통해 상기 증폭 단계 S300를 통해 획득된 표적 프로브 함유용액을 단계 S400으로 단일가닥 표적 프로브로 전환된 증폭산물 용액이 종이 어레이가 장착된 AFPA 몸체에 능동유동으로 이송하여 표적 프로브를 농축하는 혼성화 단계를 상기 이송모듈(500)의 시약 순환부(512)을 통해 상기 핵산 혼성화 방법으로 할 수도 있다.
상기 세척 단계 S600은 상기 S400을 통해 획득된 종이어레이(310)가 장착된 AFPA 여과장치(320)에 세척용액을 능동유동으로 이송하여 포획 프로브와 비특이적 결합하거나 미결합한 증폭반응물을 선택적으로 구분하여 제거하는 세척을 할 수도 있다.
상기 시각화 단계 S700은 상기 이송모듈(500)의 노즐 순환부(510)을 통해 상기 세척을 통해 획득된 종이어레이(310)를 시약모듈(100)의 시각 시약을 이송하여 이미지 획득하고 분석할 수도 있다.
또한, 상기 시각화 단계 S700은 상기 단계 S500을 통해 획득된 종이 어레이를 시각 장치로 이미지를 획득하는 과정; 및 상기 시약모듈(100)의 시약 저장소에 있는 이미지 증강 시약을 이송모듈(500)의 노즐 순환부(510)를 통해 상기 종이 어레이(310)에 첨가하는 이미지 증강하는 과정을 포함할 수 있다.
본 발명의 공동 추출한 DNA와 RNA 핵산 시료를 증폭하여 표적핵산 다중검사 장치(2000)를 상기와 같이 제작하여 운영할 수 있다.
본 발명의 표적표적핵산 다중검사 장치(2000)의 증폭반응은 PCR 또는 등온증폭을 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에서 시료 용해, 핵산 추출, 증폭 및 검사를 위한 탁월한 방법 및 장치를 제공하였다. 일반적인 핵산 검사 방법 및 장치는 감염성 병원체에 대한 대규모 POC 진단이 불가능한다. POC에서 실제 적용하려면 단일 장치에서 광범위한 병원체의 엔드-투-엔드 핵산 자동 식별이 필요하다.
시료 용해, 핵산 추출, 증폭 및 검사를 위한 방법 및 장치의 문제는 주로 모든 공정 단계의 통합에 있으며, 프로세스 간 호환성 및 비 간섭을 보장하고 광범위한 병원체에 대한 특이성을 보장하고 최소 탐지 한계를 보장하기 위해 본 발명의 핵산 검사 방법 및 장치가 필요하다. 화학 물질을 사용한 용해는 화학 물질을 제거해야 한다. 그렇지 않으면 후속 추출 및 증폭 과정을 방해한다. 기계적 용해에는 복잡한 제조 단계가 필요하며 구조의 구조는 용해되는 병원체의 크기에 따라 다릅니다. 열 용해에는 히터 통합 및 열 사이클링 제어가 필요하다. 온도 조절 및 사이클링은 에너지를 소비하고 핵산을 저하시키며 처리 시간을 느리게 한다. 전기 분해는 배터리로 작동 할 수 있지만 줄 가열로 이어질 수 있으며 이는 핵산을 저하시킨다.
핵산 추출의 순도와 효율성은 높은 감도와 특이성을 달성하는 데 중요하다. 그렇지 않으면 증폭의 이점이 없을 수 있다. 그러나, 소수의 미세 유체 시스템 만이 충분히 견고하고 추출없이 용해 후 직접 증폭할 수도 있다. 여과 기반 추출은 부유자가 형광법에서 노이즈가 증가할 수 있다. 고상 추출 방법은 마이크로 비드를 채널 내부의 모놀리식 다공성 구조로 고정화해야 한다. 자기 비드 기반 추출에는 장치의 복잡성, 비용 및 고장 지점을 증가시키는 결합 및 세척 단계가 필요하다. Isotachophoresis는 전기장과 전해질을 적절히 선택하는 문제가 있다. 최근의 진보는 전해질이 증폭 기술과 호환될 수 있지만 전도성이 제한요소이다.
PCR은 널리 사용되는 증폭 기술이다. 고정 챔버 기반 PCR은 시간 유연성이 부족하고 다양한 온도를 조절하기 위해 정밀한 제어 회로가 필요하다. 연속 흐름 PCR은 유체 흐름 타이밍을 정밀하게 제어하고 시약 흐름을 조절해야 한다. 사이 클릭 시간 및 온도는 또한 염기 쌍, 앰플 리콘 및 프라이머의 길이에 의존한다. 등온 증폭은 억제 화학 환경에 매우 민감하고 더 강력하지만 프라이머-프라이머 상호 작용에 의한 오탐 및 가양성 경향이 있으나 PCR에 대한 새로운 대안이다.
육안으로 볼 수 있는 비색 검사는 매력적이지만 처리 시간의 정량화 또는 표준화를 하기 위해 시료들간에 충분한 검사를 할 필요가 있다. 형광 검사에는 특수하고 민감한 광학 검사 시스템, 광학적으로 투명한 소자 기판 및 소자 비용을 증가시키는 특수 지시 분자가 필요하다. 스마트 폰 기반 감지는 광학 감지를 위한 실용적인 방법으로 부상하고 있지만, 여전히 고가의 광학 필터가 필요하다. 전기 화학 검사는 온도, pH 및 이온 농도의 영향을 받으므로 감도가 제한된다.
종이 미세 유체는 장치가 수동적으로 작동될 수 있고 재료가 저렴하고, 일회용이며, 접을 수 있어 매력적이다. 그러나 장치의 감지 감도가 떨어지고 시료가 손실되거나 오염될 수 있다. 복잡한 미세 유체 구조와 복잡한 유체 조작의 제조 역시 해결해야 할 문제이다. 디지털 미세 유체는 정밀한 작동으로 복잡한 다중검사, 다단계 분석이 가능하다. 그러나, 장치는 재사용이 아닌 증발에 의한 클리닝 불량 시료 손익 시료 오염의 위험이 중요한 제한이다. 원심 미세 유체는 CD 플레이어의 회전 메커니즘을 사용하는데, 이는 일반적인 장치이며 수동으로도 쉽게 수행할 수 있다. 그러나, 설계는 복잡하고 POC 설정에서 강력하게 수행할 수 있는 세포 용해 및 핵산 추출을 통합하는 솔루션이 개발된 지 여부는 불분명하다.
미세 유체 분자 기법을 사용함으로써 얻을 수 있는 이점이 자동화된 처리 기능을 갖춘 단일 시료에서 저비용의 다중화, 고감도 및 특정 진단을 실현하는 데 큰 투자 회수를 제공하여 저전력 소비를 가능하게 할 것으로 예상한다. 기기는 복잡한 공급원(예: 혈액, 타액 및 소변)에서 DNA와 RNA를 동시에 추출하고 증폭하는 데 적합한 시료 준비 단계를 통합해야 한다. 증폭을 위해 설계된 프라이머는 광범위한 유전적 변이를 포괄하기 위해 보편적이고 특이적이어야 한다. 또한, 미세 유체 장치에 사용되는 시약은 저장 수명이 길어지고 실온에서 안정적이어야 한다. 오염의 위험을 피하기 전염병의 확산하도록 더욱이, 장치는 감염성 병원체에 따른 생분해성이어야 한다.
8.1. 미세 유체 작동기
PDMA 엘라스토머 및 PMMA, 폴리카보네이트 및 사이클릭 올레핀코 폴리머(COC)와 같은 열가소성 폴리머는 복잡한 채널 구조 및 미세 구조를 쉽게 제작할 수 있고 공정을 시각화하는 용이성 및 중합체의 광학적 투명성으로 인한 결과으로 미세 유체 장치 구성에 선호되는 재료이다. 이러한 폴리머를 사용하는 장치 설계는 채널 네트워크를 통해 제어된 유량을 이동시키기 위해 외부 펌핑 메커니즘이 필요하다. 펌프 및 유체 제어는 이러한 미세 유체 장치의 비용 또는 휴대성을 제한할 수 있다.
새로운 유체 작동 메커니즘은 셀룰로오스 종이 또는 이와 유사한 천 및 종이 시트는 외부 펌프 없이도 표면의 다공성 및 친수성이 모세관 유동을 생성하기 때문에 유체를 간단하게 이동할 수 있는 수동 메커니즘이다. 원심 분리 미세 유체는 원심력을 이용하여 미세 유체 채널 내에서 시료와 시약을 운반함으로써 동력의 유동 작동을 단순화할 수 있다. 펌프는 간단한 모터 또는 수동 회전 방법으로 교체할 수 있다. 디지털 미세 유체(DMF)는 또한 전기장 또는 자기장을 프로그래밍 방식으로 조작하여 개별 액적을 정확하게 재배치할 수 있기 때문에 펌프가 필요 없다. DMF는 유체 시료의 공간적 및 시간적 조작에서 재구성 성과 정확성을 제공한다.
9.1.1. 종이 기반 미세 유체
종이 기반 미세 유체는 POC 진단 장치용 기판으로서 독특하고 뚜렷한 장점을 가진 유체 취급을 위한 대체 시스템으로 작동할 수도 있다. 종이 기판은 접을 수 있고 휴대성이 뛰어나며 제조가 용이하며, 유체는 모세관력에 의해 종이 표면에서 수동적으로 작동된다. 종이에 규정된 경로를 따라 액체를 운반하기 위해 다양한 2D 및 3D 미세 유체 채널을 만들었다. 종이 미세 유체 기술은 POC 진단 장치를 위한 충분한 성숙도로 발전하고 있다. 용해, 추출, 증폭 및 검사 공정은 종이 미세 유체 장치에서 구현될 수도 있다. 또한, 종래의 미세 유체 제조에서 PDMS와 달리, 종이는 생체 적합성이며 세포에 무독성이다. 그러나, 종이 기판은 증발로 인한 시료 보유 및 손실 및 비색 결과를 식별하는데 있어서 검사 한계 및 모호성으로 인해 새로운 문제를 야기한다.
최근에 S. typhimurium을 추출하기 위한 5분의 처리 시간으로 화학적 용해, Tris-EDTA (TE) 버퍼를 사용한 용리 및 스마트 폰 감지를 하였다. DNA에 대한 종이 기반 ITP를 하였다. 이 장치는 종이 접기 기술 (일본 종이 접기의 전통 기술)을 사용하여 제작되었으며 2개의 9V 배터리로 작동한다. 니트로셀룰로오스 종이 장치에서 ITP를 하였다. 종이를 수화시켜 줄열과 시료 증발을 최소화하기 위해 십자형 디자인을 사용하였다. 추출은 60 ~ 80%의 효율로 900배의 농도 증가로 최대 100μL의 부피에서 수행되었다. 종이, 유리 섬유 및 플라스틱의 다층 장치와 함께 RPA를 사용하여 15분 이내에 HIV DNA 10개 사본의 증폭을 보여 주었다.
최근 병원체 탐지가 가능한 완전한 POC 시스템은 카오트로픽 용해, 여과를 통한 DNA 추출, RT-LAMP 증폭 및 폴리 (에테르 설폰) 여과지에 3 개의 분리된 모듈을 사용하여 인플루엔자 A (H1N1)의 검사를 성공적으로 하였다. 3가지 모듈 모두를 접을 수 있는 종이 미세 유체 칩에 통합하여 유두종 바이러스를 검사하였다. 그러나 수동 접힘 및 추출 과정으로 인해 시료가 오염될 위험이 있다. 각각의 처리 단계를 순차적으로 수행하기 위해 자기 슬라이딩 스트립을 사용하여 종이 기반 추출, 증폭 및 검사 단계를 연쇄시키는 "종이 기계"도 있다.
9.1.2. 원심력 기반 미세 유체
원심 미세 유체 또는 Lab-on-CD는 미세 유체 채널의 유체 제어를 위해 회전식 컴팩트 디스크(CD)의 원심력을 사용한다. 원심력은 유체 제어를 위해 외부 펌프가 필요하지 않는다. CD의 방사상 대칭은 단일 CD에서 다른 생물학적 유체에 대한 병렬 처리 채널을 허용한다. 밸브, 믹싱, 앨리 쿼팅 및 펌핑을 위한 디자인의 최근 발전으로 Lab-on-CD는 POC 게놈 검사를 위한 유망한 기술이 되었다.
용해물에서 추출, 증폭 및 검사를 수행하기 위한 다양한 디자인을 하였다. 인플루엔자 A H1N1 바이러스에 대한 비드 기반 RNA 세척 및 실시간 광학 검사가 개발되었다. 용해물은 화학적 용해에 의해 칩 외부에서 준비되고 RT-LAMP 방법을 사용하여 CD에서 증폭된다. 반자동 DVD에서 디스크 내 루프 매개 등온 증폭(iD-LAMP) 및 RPA를 하였다. 또한 오프 디스크 용해로 70분의 총 작동 시간 및 5 × 10-3 ng/μL의 검사 한계를 갖는 살모넬라 엔터티디스의 검사를 위해 디스크에서 LAMP 증폭을 위한 자동 펌핑, 혼합, 계량 및 밀봉을 시연하였다.
멀티 플렉스 검사가 가능한 디자인도 일반화되고 있다. 전혈에서 대장균, B. subtilis 및 Rift Valley fever virus의 핵산 추출을 자동화하였다. 총 용해 및 추출 시간이 30분인 디스크에 화학 용해 및 자기 비드 기반 추출을 통합하였다. 지그재그 채널을 최적화하고 시약의 순차적 로딩을 위한 속도 제어를 통해 25개 병원체 시료의 동시 유전자 분석을 위해 원심 LAMP를 하였다. 핵산의 용해 및 추출은 CD 외부에서 수행된다. 흐름 제어를 위해 코리올리 힘을 이용하는 B형 간염(HBV), C형 간염(HCV) 및 거대 세포 바이러스(CMV)의 검사를 위한 유사한 멀티 플렉스 LAMP 시스템을 개발하였다. LAMP를 이용한 유리 마이크로 비드 기반 DNA 추출과 박테리아 시료의 비색 측면 흐름 스트립 검사를 사용하여 멀티 플렉스 작동할 수 있는 다른 Lab-on-disc 시스템도 있다.
대부분의 Lab-on-disc 설계에는 여전히 용해 및 핵산 추출 단계의 통합이 결여하여 이는 휴대용 및 완전한 POC 기능을 구현하는 데 필요한 최종 요소이다. 또 다른 주요 어려움은 원심 분리하에서 작동하는 밸브의 설계 및 제작이다. 그러나 Lab-on-disc 기술은 완전히 통합된 CD 장치로 빠르게 발전하고 있다. 등온 RPA 증폭 동안 열 용해, 밸브 작동 및 비접촉 가열을 위해 단일 레이저 다이오드를 사용하여 살모넬라 검사용 통합 장치를 완성할 수 있다. 더 완벽하게 통합된 다중화 된 솔루션이 곧 제공될 수 있다.
9.1.3. 디지털 미세 유체 장치
디지털 미세 유체 장치(DMF, Digital Microfluidics) 장치는 전기장 또는 자기장 유도 운동을 통해 액적을 작동시켜 유체를 조작한다. 채널 내부의 흐름 대신 유체 방울이 전극 배열 또는 영구 자석 또는 전자석 네트워크 위에 배치되고 전기장 또는 자기장의 분포가 방울을 재배치, 혼합 또는 분배하도록 제어된다. DMF는 시약 혼합, 분리, 운반 및 분배를 위한 생물학적 응용 분야를 위한 강력한 플랫폼이다.
전기장 작동은 전기 습윤-유전(EWOD) 원리를 사용하는데, 여기서 전기장은 유전성 고체 표면에서 액 적의 습윤성을 수정하는 데 사용된다. 전계는 유전체 층 내의 패턴화된 전극에 의해 생성되고, 액 적은 유전체 전극 평면 위에 제조된 소수성 층 상에 위치된다. 전극의 2D 어레이는 잉크젯 인쇄에 의해 ITO 유리, 인쇄 회로 기판(PCB) 또는 종이 상에 제조된다. DMF 칩의 전혈에서 자기 구슬 기반 DNA 추출 프로토콜을 하였다. 추출 과정은 그림 14에 나와 있다. 세포막 용해, 자성 비드의 결합, 세척 및 용출 절차에 대한 한 쌍의 액적 조작 정책이 확립되었다. 심층 시퀀싱을 위한 cDNA를 준비하기 위해 액적 내의 단일 또는 소수 세포에서 RT-PCR을 사용하여 화학적으로 용해, 추출 (자기 비드 사용) 및 mRNA를 증폭하는 EWOD 칩을 개발하였다. RPA triplex assay를 사용하여 여러 유전자를 검사할 수 있는 EWOD 장치를 보고하였다. 이 장치는 전기장 제어를 사용하여 45개의 물방울에 DNA와 시약을 동시에 자동으로 분배하고 25분 동안 10개 사본의 LOD를 달성하였다. EWOD 장치는 액적 수송을 위해 전극의 정확한 패터닝이 필요하며 EWOD의 공차는 예상 정확도 범위 내에서 상당히 낮다.
자기장 작동은 유체 액적을 작동시키기 위해 기판으로서 자기 비드를 사용한다 유체 액적 내의 자기 비드는 자기장의 영향하에 이동하고 유체는 표면의 큰 표면적에 유체의 표면 접착 때문에 비드와 함께 운반된다). 비드 및 핵산 흡착용 인간의 혈액과 박테리아 배양에서 감염성 병원체를 검사하기 위한 액적 미세 유체 장치를 보고하였다. 액적은 영구 자석을 사용하여 작동되며 화학 용해, 자기 비드 기반 추출, 실시간 PCR 및 형광 검사를 통합한다. 이 장치는 표면 토포그래피 기능 (슬릿)을 통합하여 액적에서 자성 입자의 분리 효율을 높이다. 영구 자석의 사용은 비드 작동 전략을 제한하여 비효율적인 추출 공정을 초래한다. 또한, 영구 자석은 진단 절차의 자동화를 위해 부피가 큰 병진 단계가 필요하다. 나중에 같은 그룹은 액적 작동을 위한 평면 코일 어레이를 사용하는 전자기 액적 플랫폼을 제안하였다. 같은 그룹에서도 유전자 변이가 확인되었다.
POC 장치에 DMF 기술을 배포하기 전에 몇 가지 제한 사항을 극복해야 한다. 유체 방울이 노출된 표면에서 작동하기 때문에 유체의 빠른 증발이 주요 과제이다. 현재, 액적은 증폭 공정 동안 미네랄 오일로 캡슐화되어 증발을 최소화하고 EWOD의 전압을 감소시킨다. 그러나 오일을 사용하면 열 램핑 속도가 크게 느려지고 처리 시간이 길어집니다. 교차 오염 및 적절한 청소 절차의 필요성 또한 DMF 장치의 재사용성을 제한한다.
9.2. 멀티 플렉스 통합 장치
용해, 추출, 증폭 및 검사를 위한 다양한 방법에도 불구하고 POC 테스트를 위한 미세 유체 장치는 여전히 널리 사용하지 않고 있다. 이러한 기술을 빠른 처리 시간, 다양한 병원체에 대한 동시 테스트 (멀티 플렉스 감지) 및 충분히 민감한 감지 한계를 갖춘 현장 진단 장치에 통합하면 차세대 POC 진단 장치로 개발되고 있다. 다중 PCR, 다중 LAMP, 다중 HDA 및 다중 RCA와 같은 다중 증폭을 사용하여 다중 표적 진단을 수행할 수 있다. 다중 증폭에서, 단일 반응 마이크로 채널/챔버에서 다중 프라이머를 이용함으로써 여러 표적 DNA 서열이 동시에 증폭된다. 그러나, 다중 증폭은 프라이머 이량체를 제거하고 마스터 믹스에서 다른 성분의 최적화를 위해 신중한 프라이머 설계가 필요하다. 장치에서 여러 개의 병렬 감지 채널을 사용하여 다중 대상 진단을 수행할 수도 있다. 각 채널은 서로 다른 유형의 병원체를 검사한다.
단일 챔버에서 살모넬라의 자기 비드 기반 추출, LAMP 증폭 및 실시간 감지 기능을 통합하였다. 시료 및 자기 비드를 용해 완충제와 혼합하고 마이크로 칩으로 이동하였다. 세척 완충액 및 LAMP 시약을 운반하기 위해 다채널 펌핑이 사용되고 있다. 그러나, 다수의 시약 세척 단계 및 형광 검사기의 사용은 시스템을 단순하게 하여, POC 장치에서 사용하고 있다. 통합된 미세 유체 칩을 개발하여 화학적 용해, 막 여과 및 HDA 또는 RPA 증폭을 수행할 수도 있다.
다중검사를 위한 폴리머/종이 하이브리드 미세 유체 바이오칩을 개발하였다. 바이오칩에는 증폭 및 검사를 위한 8개의 병렬 LAMP 구역이 있다. 이 종이는 DNA 프라이머의 기질로 기능한다. 하이브리드 미세 유체 바이오칩은 다른 미세 유체 칩에 비해 3개월의 저장 수명을 갖는다.
원심 디스크 플랫폼은 화학적 용해, 실리카 코팅 자성 비드 기반 추출, 네 스팅 PCR 증폭 및 형광 검사를 통합한다. 용리된 DNA는 사전 증폭된 후 표적 특이적 증폭을 위해 13개의 반응 챔버로 분할된다. 인플루엔자 A H3N2 바이러스의 검사를 위해 필수 시약을 완전히 사전 저장 한 완전히 통합된 원심 LabDisk를 제시하였다. 저비용 열가소성 엘라스토머로 제작된 CD에 강력하고 통합된 미세 유체 실험실을 보여 주었다. 디스크는 기계적 용해, 액적 혼합, PCR 증폭 및 앰플리콘 분해 및 하이브리드화를 마이크로 어레이에 통합한다. 이 장치는 4개의 병렬 다중화 반응을 하였다. 그러나 Bacillus atrophaeus subsp globigii 포자.의 동정을 위해서는 15단계 과정이 필요하다.
미세 유체 연구에도 불구하고, 적은 수의 POC 진단 장치만이 상업적으로 도입되어 있다. 이런 POC 장치의 제한된 성공은 역사적으로 더 제한적이지만 더 저렴한 비 미세 유체 장치와 지적 재산 제한과 비교하여 통합된 일회용 구성요소를 개발하는 데 따른 비용 균형에 의존하기 때문으로 생각될 수도 있다. 많은 장치에서 온칩에서 시료 준비가 없어 실제 POC 장치로서의 사용성이 제한된다. 본 발명에서 이를 극복하는 방법을 제안하였다.
생물학적 시료에서 직접 핵산을 추출하고 처리할 수 있는 2개의 상용 시스템만 발견하였다. Micronics Inc.는 실시간 PCR 증폭을 사용하여 박테리아, 바이러스 및 병원체의 다중검사를 위한 처리 결과를 얻을 수 있는 분자진단 시스템인 PanNAT® 시스템을 발전시키고 있다. 이 시스템은 필요한 모든 시약이 사전 로드된 일회용 미세 유체 카트리지를 사용하며 약 60분 안에 결과를 제공한다. Q-POCTM은 QuantuMDx의 휴대용 분자 진단 장치로 혈액, 조직 (신선하고 FFPE), 얇은 가래 및 면봉에서 핵산을 검사할 수 *?**?*있다. 이 시스템은 기계적 용해, 추출용 필터, 연속 흐름 PCR 증폭, 감지용 나노 와이어 센서는 사전 로드된 건조 시약이 포함된 카트리지와 결핵, 말라리아, HPV, 클라미디아 및 임질용 프로브를 사용하며 시료 결과 시간은 20분 이내이다.
다른 여러 시스템은 장치에서 처리하기 전에 핵산 시료를 준비해야 한다. SRI International은 박테리아, 바이러스 및 mRNA의 저렴한 진단 검사를 위해 Sentinel Nucleic Acid Analysis System을 개발하였다. 단일 칩으로 단일 PCR 앰플리콘으로부터 57개의 아데노 바이러스과 바이러스를 구별할 수 있다. 다른 이용 가능한 시스템은 연구 전용 장치로서 일상적인 핵산 분석을 목표로 한다. BioMark (Fluidigm) 및 OpenArray (Life Technologies)는 처리량이 많은 유전자 발현을 위해 시료를 분할하는 디지털 미세 유체 장치이다. SmartChip 시스템 (Wafergen)은 고밀도 유전자 발현 프로파일링을 위한 PCR을 지원하는 나노 디스펜서 모듈, 열 사이 클러 및 데이터 수집 모듈을 포함한다. RainDrop 기기(RainDance Technologies)는 8 개의 시료를 처리할 수 있는 dPCR 플랫폼이다. Bio-Rad System의 QX200 액적 디지털 PCR (ddPCR ™)은 액적 형광 판독 값으로 20,000개의 수중 에멀젼 나노 액적을 생성한다.
10. 키트
본 발명에 기술된 장치 및/또는 방법의 실시를 사용하기 위한 키트가 제공된다. 하나 이상 핵산의 검사 및/또는 정량분석을 위한 키트가 제공되며, 여기서 키트는 본 발명에 기술된 바와 같은 검정 방법 및 장치를 포함하는 용기를 포함한다.
키트는 시료를 수집하기 위한 수집 장치를 추가로 포함한다. 수집 장치는 구강 유체를 수집하기 위한 장치, 혈액을 수집하기 위한 장치, 소변 수집 장치, 질 스왑으로부터 또는 자궁경관내 스왑으로부터 질 유체를 수집하기 위한 장치, 또는 환경 시료를 수집하기 위한 장치를 포함한다.
키트는 시약, 예컨대 완충액, 용매, AFPF 시스템의 성분, 검사 시약 등을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 방법은 정성 또는 정량분석을 통해 감염 여부를 판별할 수 있으며, 음성 대조군과 비교하여 그 양이 증가한 경우, 또는 음성 대조군에는 검사되지 않았으나, 시료에서 양성 반응이 나온 경우, 또는 일정한 양 이상으로 검사가 된 경우 이를 감염으로 판정할 수 있을 것이다. 판정 또는 판단 기준은 당업계의 기준을 고려하여 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
본원의 방법에 사용되는 시료, 시약, 증폭 방법 및 반응 조건 등은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.
상기 성분 및 검정법 포맷은 예시적이며, 비-제한적이다. 본 명세서에 제공된 교시 및 예를 사용하면, 다수의 다른 검정법 장치 및 구성은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 사용 가능할 것이고, 일부 추가 설계 고려사항 및 성분이 하기에 기술된다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시례 1: 바이러스로부터 핵산 추출
<도 1>에 제시한 바와 같이, VSV-G pseudotyped lentivirus(타카라, 일본)가 스파이킹한 혼합 가래 표본에 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제물질을 첨가한 혼합용액에서 형성된 핵산복합체를 세척용액으로 세척하고 공기로 건조한 핵산복합체를 제조하였다.
Lenti-X™ Packaging single shots(타카라, 일본)에서 Lenti-X™ 293T Cell Line(타카라, 일본)은 Glutamax와 high glucose, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin을 포함하는 DMEM으로 배양하였다.
제조 지침에 따라 배양액에서 준비된 바이러스 RNA를 42℃에서 20분 동안 역전사하고, 다음 조건하에서 StepOne 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, 미국)을 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. 95℃의 1 사이클 3분 동안에 이어서 15초 동안 95℃ 및 30초 동안 60℃의 30초 동안 72℃에 40 회 사이클을 하였다. 105 내지 108 카피 범위의 바이러스 RNA 주형의 일련의 희석에 기초하여 표준 곡선을 결정하였다.
본 발명의 <도 1>에 제시한 바처럼, 10배 단계 희석으로 알려진 카피 수의 VSV-G pseudotyped lentivirus 입자를 갖는 200㎕ 혼합 가래 표본 그리고 300 μl의 용해 완충제(2M GTC, 80 mM DTT, 25 mM 시트르산 나트륨 및 20 μg/ml의 글리코겐, pH 6), 및 20μl의 자성 입자 (10 mg/ml)를 튜브에 첨가하여 제조된 혼합용액을 잘 혼합한 다음, 격렬하게 15초 동안 와동시켰다.
핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 또한, 상기 혼합용액에 결합촉진제로 등가 부피의 이소프로판올을 추가적으로 첨가할 수도 있다. 상기 혼합용액은 GTC를 포함하는 용해물질, 카르복실기가 코팅된 자성입자 또는 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 결합물질, 글리코겐을 포함하는 침전보조제 및 GTC 및 이소프로판올을 포함하는 결합촉진제를 포함하고 있다.
상기 자성입자는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles(GE Healthcare, 미국)를 사용하였다. 또는 상기 자성입자 대신에 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국), cellulose-based Flinders Technology Associates(FTA) cards(GE Healthcare, 미국) 및 silica-based Fusion 5 filters(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 막에서 선택된 어느 하나를 이용할 수 있으며 Cellulose-based paper인 Whatman No.1 paper를 사용하였다.
상기 GTC 농도는 0.5M 내지 6.0M의 범위이며 DTT 농도는 0 mM 내지 160 mM 범위에서 설정할 수 있다.
상기 혼합용액에서 형성된 핵산-자성입자 복합체를 DynaMagTM-2 자석 (Life Technologies, 미국)을 사용하여 수집하였다. 상기 복합체를 세척용액으로 2회 세척하고 경우에 따라 공기 중에 건조하여 증폭저해물질을 제거하였다. 상기 세척된 핵산-자성입자 복합체로부터 핵산의 용출은 50㎕의 RNase-free water를 첨가하여 70~75℃에서 5분 동안 보관하였다.
상기 세척용액은 70% 에탄올 또는 10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20을 사용하였다.
상기 세척된 핵산-자성입자 복합체 시료에 대한 직접 핵산 증폭의 가능성을 조사하기 위해, RNA 경우는 상기 세척된 핵산-자성입자 복합체 시료, Superscript II 역전사 효소 (Gibco, 미국), 1 μM deoxynucleoside triphosphates 및 10 μM hexanucleotides (Gibco, 미국)를 포함하는 반응용액에서 역전사하여 cDNA 제조할 수 있는지를 검사할 수 있다. DNA 경우는 상기 세척된 핵산-자성입자 복합체, 15 μL의 TE 완충액, 7.5 μL의 4 × 반응 완충액, 1.5 μL 효소 혼합물, 및 최적 농도의 프라이머 (각각 1 μM) 및 프로브 (1 μM)로 구성된 30μL의 반응용액을 제조하여 PCR을 할 수 있다.
상기 cDNA 또는 DNA의 하기 표적유전자에 대한 PCR은 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 60초로 이루어진 30개의 PCR 사이클을 사용하여 수행하였다.
<도 4>를 살펴보면, 상기 세척된 핵산-자성입자 복합체 시료를 주형으로 RNA의 분석은 One-tube RT-PCR 및 DNA의 분석은 PCR를 각각 수행한 결과로 상기 세척한 핵산 시료에는 분석 가능할 정도의 양질의 DNA와 RNA가 함께 존재함을 알 수 있었다.
VSV-G, GFP 및 액틴 유전자에 대한 프라이머의 서열은 다음과 같았다.
5' VSV-G, 5'-GAAGTGCCTTTTGTACTTAG-3';
3' VSV-G, 5'-GATCGGATGGAATGTGTTAT-3';
5' GFP, 5'-GGCCACAAGTTCAGCGTGTC;-3'
3' GFP, 5'-TTGCCGTCCTCCTTGAAGTC-3';
5' β- 액틴, 5'-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3';
3' β- 액틴, 5'-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3'.
또 다른 핵산 추출 방법은 여과지 기반 96-웰 스핀 플레이트를 사용한 방법이며 자세히 살펴보면 다음과 같다.
스핀 플레이트는 450 ㎕ 용량의 96-well V-bottom storage plate인 NuncTM 96- Well Polypropylene MicroWellTM 플레이트 (Thermo Fisher Scientific, 미국) 및 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국)를 사용하여 조립하였다. 날카로운 도구를 사용하여 각 구멍의 바닥에 작은 구멍 (약 1mm 직경)을 뚫었다. 여과지를 5/16 인치 (약 8mm) 종이 펀처를 사용하여 디스크로 절단하고 각 웰에 넣었어 여과지 기반 96-웰 스핀 플레이트를 제조하였다(도 5).
상기 제조된 여과지 기반 96- 웰 플레이트에 용해 추출액은 처리하여 핵산을 용출하였으며 구체적인 방법은 다음과 같다.
상기 제조된 10배 단계 희석으로 알려진 카피 수의 VSV-G pseudotyped lentivirus 입자를 갖는 200㎕ 혼합 가래 표본 그리고 300 μl의 용해 완충제(2M GTC, 80 mM DTT, 25 mM 시트르산 나트륨 및 20 μg/ml의 글리코겐, pH 6)를 튜브에 첨가하여 제조된 혼합용액을 잘 혼합한 다음, 격렬하게 15초 동안 와동시켰다. 핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 또한, 상기 혼합용액에 결합촉진제로 등가 부피의 이소프로판올을 추가적으로 첨가할 수도 있다.
상기 혼합용액으로부터 핵산을 추출하기 위해, 상기 제조된 여과지 기반 96- 웰 플레이트를 수집 플레이트인 새로운 스핀 플레이트 위에 놓았다. 125 ㎕ 용해물을 여과지 기반 96-웰 스핀 플레이트의 웰로 옮기고 1분 동안 원심분리하고, 통과액을 버렸다.
여과지 디스크를 플레이트의 웰에 150㎕의 70% 에탄올을 첨가하여 2회 세척을 하였다. 96-웰 스핀 플레이트 및 수집 플레이트를 1분 동안 원심분리하고 통과액을 매 세척마다 버렸다.
두 번째 세척 후, 스핀 플레이트를 15분 이상 원심분리한 후, 수집 플레이트에 놓고 10분 동안 후드에 보관하여 잔류 에탄올을 증발시켰다.
여과지가 있는 웰에 100㎕ TE 완충제를 첨가하여 실온에서 5분 동안 유지한 다음, 1분 동안 원심 분리하여 수집 플레이트로 핵산을 용출시켰다.
실시예 2: 박테리아 세포로부터 핵산 추출
<도 1>에 제시한 바와 같이, 박테리아 세포에서 실시예 1항과 동일한 방법으로 세포용해, 핵산의 추출과 세척 및 Bacterial 16S rDNA에 대한 PCR 기반 증폭하였다.
분석목적으로 대장균(Escherichia coli), Mycobacterium gordonae Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus 및 Salmonella Typhimurium의 배양액을 얻었다.
실시예 1항에서 제시한 방법에 따라 10 μl의 박테리아 배양용액 그리고 300 μl의 용해 완충제(2M GTC, 80 mM DTT, 25 mM 시트르산 나트륨 및 20 μg/ml의 글리코겐, pH 6), 및 20μl의 자성 입자 (10 mg/ml)를 튜브에 첨가하여 제조된 혼합용액을 잘 혼합한 다음, 격렬하게 15초 동안 와동시켰다.
핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 또한, 상기 혼합용액에 결합촉진제로 등가 부피의 이소프로판올을 추가적으로 첨가할 수도 있다. 상기 혼합용액은 GTC를 포함하는 용해물질, 카르복실기가 코팅된 자성입자 또는 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 결합물질, 글리코겐을 포함하는 침전보조제 및 GTC 및 이소프로판올을 포함하는 결합촉진제를 포함하고 있다.
상기 자성입자는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles(GE Healthcare, 미국)를 사용하였다. 또는 상기 자성입자 대신에 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국), cellulose-based Flinders Technology Associates(FTA) cards(GE Healthcare, 미국) 및 silica-based Fusion 5 filters(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 막에서 선택된 어느 하나를 이용할 수 있으며 Cellulose-based paper인 Whatman No.1 paper를 사용하였다.
상기 GTC 농도는 0.5M 내지 6.0M의 범위이며 DTT 농도는 0 mM 내지 160 mM 범위에서 설정할 수 있다.
상기 혼합용액에서 형성된 핵산-자성입자 복합체를 DynaMagTM-2 자석 (Life Technologies, 미국)을 사용하여 수집하였다. 상기 복합체를 세척용액으로 2회 세척하고 경우에 따라 공기 중에 건조하여 증폭저해물질을 제거하였다. 상기 세척된 핵산-자성입자 복합체로부터 핵산의 용출은 50㎕의 RNase-free water를 첨가하여 70~75℃에서 5분 동안 보관하였다.
상기 세척용액은 70% 에탄올 또는 10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20을 사용하였다.
상기 세척된 핵산-자성입자 복합체를 주형으로 Bacterial 16S rDNA PCR Kit Fast(Takara, 일본)를 사용하여 세척된 핵산-자성입자 복합체에 1 × PCR 완충액, 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 각 프라이머 25 pmol, 및 Taq DNA 중합효소 1 유닛을 포함하는 총 반응 부피 25 ㎕를 사용하여 PCR하였다.
PCR 증폭물들은 PCR 생성물을 에티듐 브로마이드(EtBr)(시그마-알드리치, 미국)를 함유한 2% 아가로즈 젤 상에서 분리하는 젤 전기영동법으로 가시화되었다. 상기 젤은 Gel Doc System(Bio-Rad, 미국)을 사용하여 가시화하였다(도 6).
실시예 3: 진핵세포로부터 핵산 추출
<도 1>에 제시한 바와 같이, 진핵세포에서 실시예 1항과 동일한 방법으로 세포용해, 핵산추출과 세척 및 핵산 증폭을 하였다.
진핵세포는 5% CO2 분위기, 37℃ 습한 배양기에서 10% 태아우아혈청(fetal calf serumFCS)을 보충한 DMEM 배지(Dulbecco's modified eagle medium; DMEM Life Technology, 미국)의 플라스틱 배양 플레이트에서 배양하였다. 진핵 세포 Jurkat(말초 혈액))를 배양한 후, 실시예 1 항과 동일한 방법으로 핵산을 추출하였다. 단백질 분해효소인 프로테이나제 K를 처리할 수도 있다.
실시예 1항에서 제시한 방법에 따라 10 μl의 세포 배양용액 그리고 300 μl의 용해 완충제(2M GTC, 80 mM DTT, 25 mM 시트르산 나트륨 및 20 μg/ml의 글리코겐, pH 6), 및 20μl의 자성 입자 (10 mg/ml)를 튜브에 첨가하여 제조된 혼합용액을 잘 혼합한 다음, 격렬하게 15초 동안 와동시켰다.
핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 또한, 상기 혼합용액에 결합촉진제로 등가 부피의 이소프로판올을 추가적으로 첨가할 수도 있다. 상기 혼합용액은 GTC를 포함하는 용해물질, 카르복실기가 코팅된 자성입자 또는 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 결합물질, 글리코겐을 포함하는 침전보조제 및 GTC 및 이소프로판올을 포함하는 결합촉진제를 포함하고 있다.
상기 자성입자는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles(GE Healthcare, 미국)를 사용하였다. 또는 상기 자성입자 대신에 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국), cellulose-based Flinders Technology Associates(FTA) cards(GE Healthcare, 미국) 및 silica-based Fusion 5 filters(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 막에서 선택된 어느 하나를 이용할 수 있으며 Cellulose-based paper인 Whatman No.1 paper를 사용하였다.
상기 GTC 농도는 0.5M 내지 6.0M의 범위이며 DTT 농도는 0 mM 내지 160 mM 범위에서 설정할 수 있다.
상기 혼합용액에서 형성된 핵산-자성입자 복합체를 DynaMagTM-2 자석 (Life Technologies, 미국)을 사용하여 수집하였다. 상기 복합체를 세척용액으로 2회 세척하고 경우에 따라 공기 중에 건조하여 증폭저해물질을 제거하였다. 상기 세척된 핵산-자성입자 복합체로부터 핵산의 용출은 50㎕의 RNase-free water를 첨가하여 70~75℃에서 5분 동안 보관하였다.
상기 세척용액은 70% 에탄올 물, 또는 10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20을 사용하였다.
DNA의 양과 순도를 확인하기 위해 Actin 유전자에 대해 End-point PCR 및 실시간 PCR(real time-PCR)을 수행하였다.
End-point PCR은 세척된 핵산-자성입자 복합체, 1 × PCR 완충액(Qiagen, 독일), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 25 pmol의 각 실시례 1 항에 제시된 프라이머 및 Taq DNA 중합효소 1 유닛을 포함하는 총 부피 25 ㎕에서 증폭하였다.
<도 7>은 결합물질로 Whatman No.1 paper 또는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles, 결합촉진제로 이소프로판올, 세척용액으로 70% 에탄올 또는 증류수를 사용하여 다양한 실험 조건에서 분리한 핵산을 주형으로 실시례 1항에서 제시한 액틴 유전자에 대해 PCR한 결과이다. 결합물질로 상기 Magnetic Particles을 사용한 경우가 Whatman No.1 paper를 이용한 결과보다 더 많은 PCR 산물을 보였다. 세척용액을 70% 에탄올 또는 증류수(또는 10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20)로 세척하여 PCR한 경우 모두 양호 PCR 산물을 확인할 수 있었으며, 증류수를 사용하는 세척한 경우는 건조 단계를 생략하여 실시할 수도 있다.
<도 8>은 상기 다양한 암세포 수를 포함하는 용액에 용해물질로 2M GTC, 결합물질로 Whatman No.1 paper 또는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles, 세척용액으로 10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20을 포함하는 TT 버퍼를 사용하고 결합촉진제로 이소프로판올의 첨가 또는 미첨가 실험 조건에서 분리한 핵산을 주형으로 GAPDH 유전자에 대해 하기 프라이머 쌍으로 PCR한 결과로, 결합촉진제로 이소프로판올을 사용한 경우는 그렇지 않은 경우보다 많은 증폭산물을 합성함을 확인하였다.
5' GAPDH, 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3';
3' GAPDH, 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3'.
<도 9>는 상기 10배 단계로 희석된 용출된 핵산 용액을 주형으로 실시례 1항에서 제시된 액틴 유전자 프라이머 쌍으로 실시간 PCR(Real time-PCR)을 하여 분석한 결과이며, LightCycler 2.0(로슈 다이어그노스틱스, 스위스)에서 제공된 방법을 하기와 같이 변형하여 사용하였다. 2 ㎕의 상기 10 배 단계로 희석된 용출된 핵산 용액, 4 ㎕의 LightCycler FastStart DNA Master 믹스, 25 pmol의 각 프라이머, 2 ㎕의 10×PCR 완충액(큐아젠, 독일), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate) 및 증류수를 포함하는 총 반응 부피 20 ㎕에서 증폭하여 SYBR 녹색 신호를 가진 증폭된 생성물은 얻어 분석하였다.
실시예 4: 인간 체액으로부터 핵산 추출
<도 1>에 제시한 바와 같이, 인간의 체액으로 본 핵산 검사 방법 능력을 검증하기 위해, 체액 시료 100 ㎕(전혈 및 소변)에 실시예 1 항과 동일한 방법으로 핵산을 추출하였다. 먼저, 체액 시료가 있는 튜브에 100 ㎕ 용해 완충제(4M GTC, 160 mM DTT, 50 mM 시트르산 나트륨 및 40 μg/ml의 글리코겐, pH 6), 등가 부피의 이소프로판올 및 20μl의 자성 입자(10 mg/ml)를 첨가한 혼합용액을 잘 혼합한 다음, 격렬하게 15 초 동안 와동시켰다. 여기서, 핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 이어서 상기 혼합용액을 80℃에서 5분 동안 처리하였다.
핵산 침전 보조제 글리코겐 대신에 Acryl polymer 또는 tRNA를 추가할 수 있다. 또한, 상기 혼합용액에 결합촉진제로 등가 부피의 이소프로판올을 추가적으로 첨가할 수도 있다. 상기 혼합용액은 GTC를 포함하는 용해물질, 카르복실기가 코팅된 자성입자 또는 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 결합물질, 글리코겐을 포함하는 침전보조제 및 GTC 및 이소프로판올을 포함하는 결합촉진제를 포함하고 있다.
상기 자성입자는 Sera-Mag SpeedBead Carboxylate Modified Magnetic Particles(GE Healthcare, 미국)를 사용하였다. 또는 상기 자성입자 대신에 Whatman No.1 paper(GE Healthcare, 미국), cellulose-based Flinders Technology Associates(FTA) cards(GE Healthcare, 미국) 및 silica-based Fusion 5 filters(GE Healthcare, 미국)를 포함하는 막에서 선택된 어느 하나를 이용할 수 있으며 Cellulose-based paper인 Whatman No.1 paper를 사용하였다.
상기 GTC 농도는 0.5M 내지 6.0M의 범위이며 DTT 농도는 0 mM 내지 160 mM 범위에서 설정할 수 있다.
상기 혼합용액에서 형성된 핵산-자성입자 복합체를 DynaMagTM-2 자석 (Life Technologies, 미국)을 사용하여 수집하였다. 상기 복합체를 세척용액으로 2회 세척하고 경우에 따라 공기 중에 건조하여 증폭저해물질을 제거하였다. 상기 세척된 핵산-자성입자 복합체로부터 핵산의 용출은 50㎕의 RNase-free water를 첨가하여 70~75℃에서 5분 동안 보관하였다.
상기 세척용액은 70% 에탄올 또는 10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20을 사용하였다. 상기 세척된 추출된 핵산-결합물질 복합체 또는 용출된 핵산을 분석하였다.
실시예 5: 핵산혼성화 방식의 AFPF
5.1. 표적핵산 영역 올리고뉴클레오티드
감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 호흡기 바이러스의 게놈, 즉, Adenovirus JS201501 바이러스의 염기서열(Sequence ID: KX289874), MERS-CoV 바이러스의 염기서열 (Sequence ID: MN723544.1), H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 염기서열 HA 유전자(Sequence ID: MF630405.1), NA 유전자 (Sequence ID: MK453330.1) 및 2019-nCoV 바이러스의 염기서열(Sequences ID MT276598.1)에 대해 표적핵산 영역을 선정하여 각각 DNA로 합성하였다(바이오니아, 한국).
Human adenovirus 55 isolate JS201501게놈의 표적핵산은 하기의 KX289874의 염기서열 뉴클레오티드 20701~21060(길이 360bp)를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 20,761~21,025 (길이: 265bp)이다.
5‘-gggttacatg gctccgacca tgcgccaagg tcaaccctat cccgctaact atccctatcc actcattgga acaactgccg taaatagtgt tacgcagaaa aagttcttgt gtgacagaac catgtggcgc ataccgttct cgagcaactt catgtctatg ggggccctta cagacttggg acagaacatg ctttatgcca actcagctca tgctctggac atgacctttg aggtggatcc catggatgag cccaccctgc tttatcttct cttcgaagtt ttcgacgtgg tcagagtgca tcagccacat cgcggcatca tcgagacagt ctacctgcgt acaccgttct cggccggtaa-3’
Middle East respiratory syndrome-related coronavirus strain Hu/Riyadh-KSA-18013832/2018 게놈의 표적핵산은 하기의 Sequence ID: MN 723544.1의 염기서열 뉴클레오티드 28981~29220 (길이 240bp)를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 28981~29220(길이 111bp)이다.
5‘-accctaacaa tgattcagct attgttacac aattcgcgcc cggtactaag cttcctaaaa acttccacat tgaggggact ggaggcaata gtcaatcatc ttcaagagcc tctagcgcaa gcagaaactt ttccagatct agttcacaag gttcaagatc aggaaactct acccgcagca cttctccagg tccatctgga atcggagcag taggaggtga tttactttac cttgatcttc-3’
Influenza A virus (A/chicken/Zhejiang/S4079/2013(H7N9)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene의 표적핵산은 하기 Sequence ID: MF630405.1의 염기서열 뉴클레오티드 421~600 (길이: 180bp)를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 421~600<길이: 98bp>이다.
5‘-aatggagcaa ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg ctcctgtcaa acacagataa tgctgtattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca agaaaaagcc cagctttaat agtatggggg atccatcatt ccgtatcaac tgcagagcaa -3’
Influenza A virus (A/chicken/Guangxi/97/2017(H7N9)) segment 6 neuraminidase (NA) gene의 표적핵산은 하기 Sequence ID: MK453330.1의 염기서열 뉴클레오티드 841~1140 <길이 300bp>를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 841~1140 (길이: 122bp)이다.
5‘-cgaacaggga ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt cagatagacc cagtagcaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgtccttaca gacagtcccc gaccgaatga cccaaatata ggtaagtgta atgaccctta tccaggtaat aataacaatg gagtcaaggg attctcatac ctggatggag ctaacacttg gctagggagg acaataagca cagcatcgag gtctggatac gagatgttaa aagtgccaaa tgcattgaca-3’
Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate SARS-CoV-2의 표적핵산은 하기 Sequence ID: MT276598.1 염기서열 뉴클레오티드 28237~28536 <길이 300 bp>를 합성하였다(바이오니아, 한국). 본 발명에서 설계된 올리고뉴클레오티드 세트에 의한 등온 증폭 RPA의 산물은 염기서열 뉴클레오티드 28261~286000 (길이: 150 bp)이다.
5‘-taaacgaaca aactaaaatg tctgataatg gaccccaaaa tcagcgaaat gcaccccgca ttacgtttgg tggaccctca gattcaactg gcagtaacca gaatggagaa cgcagtgggg cgcgatcaaa acaacgtcgg ccccaaggtt tacccaataa tactgcgtct tggttcaccg ctctcactca acatggcaag gaagacctta aattccctcg aggacaaggc gttccaatta acaccaatag cagtccagat gaccaaattg gctactaccg aagagctacc agacgaattc -3’
합성된 DNA를 주형으로 <T7 프로모터+GG> 염기서열이 있는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭산물을 확보하였다. 상기 증폭산물을 주형으로 체외 전사하여 RNA를 합성하고 -20℃에서 저장하였다.
표적핵산(KX289874, MN723544.1, MF630405.1, MK453330.1 및 MT276598.1)을 으로 제조하는 T7 프로모터가 있는 DNA는 100 nM 주형 DNA, 0.25 μM 5'-프라이머, 0.25 μM 3'-프라이머, 10X PCR 버퍼, 및 100 μM dNTP의 혼합물을 혼합하여 처음 95℃의 5분에서 Taq 폴리머라제(Promega)를 2.5 유닛 첨가하였다. 그리고 PCR 사이클로 95℃의 30초, 55℃의 30초 및 72℃의 1분의 조건으로 20 사이클 반복한 뒤, 마지막으로 72℃의 8분 30초 처리하는 과정을 포함하는 방법으로 제조하였다(도 10).
PCR을 통하여 만들어진 T7 프로모터가 있는 DNA 주형으로 T7 RNA 폴리머라제(Takara)를 이용하여 시험관 내에서 전사를 통하여 RNA 풀을 제조하였다.
본 발명에서는 RNA 분해 효소에 저항성 있는 2′-F modified Pyrimidine을 포함하는 RNA를 제조하기 위하여 2'-데옥시-2'-플루오로 CTP와 UTP(Epicentre Technologies, 미국) 및 정상적인 GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용하여, 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 피리미딘 뉴클레오티드의 매 2번 위치가 플루오르기로 변형되어진 RNA를 합성하였다.
구체적으로, DNA 라이브러리, 5X 전사 버퍼, 50 mM DTT, 0.5 mM ATP, GTP, 2'-F CTP, 2'-F UTP, T7 RNA 폴리머라제(Takara, 일본), DEPC-H2O로 50 μl로 구성된 반응용액을 37℃ 에서 3시간 동안 반응시켰다.
본 발명에서는 RNA 분해 효소에 저항성 없는 RNA를 제조하기 위하여 정상적인 CTP, UTP, GTP와 ATP들과 T7 RNA 중합효소를 이용하여, 시험관에서 합성된 주형의 전사에 의해 RNA를 합성하였다.
5.2. 등온 증폭 올리고뉴클레오티드
시료에서 DNA와 RNA 공동 추출한 총핵산 시료를 등온 증폭으로 표적핵산을 검사하기 위해, 감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 4종류의 호흡기 바이러스 게놈의 합성 표적핵산 및 올리고뉴클레오티드 세트를 합성하여 진행하였다.
4종류의 바이러스 게놈의 표적핵산에서 결정된 표적영역을 선정하여 기본 RPA를 위한 RPA 증폭 프라이머 및 추가적인 RPA-exo 반응 또는 RPA-nfo 반응을 위한 exo-프로브 또는 TwistAmp™ nfo 를 특정 검사를 위해 설계하였다.
상기 프라어머 및 프로브는 TwistAmp 분석 설계 매뉴얼 지침 (www.twistdx.co.uk)을 사용하여 ‘표적핵산’의 특정 영역을 증폭시키기 위해 설계하였다.
상기 프라이머 및 프로브를 설계하기 위해, 감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 호흡기 바이러스의 게놈, 즉, Adenovirus JS201501 바이러스의 염기서열(Sequence ID: KX289874), MERS-CoV 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MN723544.1), H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MF630405.1) 및 2019-nCoV 바이러스의 염기서열(Sequences ID MT276598.1)를 NCBI 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 수집하여 이용 가능한 다른 염기서열과 함께 표적핵산의 뉴클레오티드 BLAST를 수행함으로써 가장 안정적이고 보존적인 영역을 선택하여 표적핵산 영역을 결정하였다.
상기에서 선정된 표적핵산의 서열을 Blast로 스크리닝한 다음, 생체정보 도구인 Jalview를 사용하여 정렬시켰다. 다중 정렬 서열(즉, 가장 보존 된 영역)에 기초하여, 기본 RPA 목적 정방향 및 역방향 프라이머는 PrimerBLAST를 사용하여 설계하였다.
RPA- exo 또는 RPA nfo 증폭을 위해, 제조사의 지침에 따라 표적핵산의 선택된 염기서열로 exo 프로브 또는 TwistAmp™ nfo 를 설계하였다.
RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 경우 표준 매개 변수 즉. 증폭산물 크기, 프라이머 길이, GC 함량, 5' 말단의 피리미딘 및 G/C 클램프를 고려하였다. 제작되는 올리고뉴클레오티드는 <표 2>, <표 3>, <표 4> 및 <표 5>와 같다.
HAdV 55 아데노 바이러스 106.9 kDa protein L3 hexon(accession no.KX289874) 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA, RT-RPA-nfo 및 RT-RPA-exo반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
ADV-RF GCT CAT TGG AAC AAC TGC CGT AAA TAG TGT 30
ADV-RR-Bio [Biotin]GGC CGA GAA CGG TGT ACG CAG GTA GAC TGT C 31
ADV-RP-nfo CTC GAT GAC GCC GCG GTG TGG CTG GTG CAC [THF]CT GAC CAC GTC GAA GA[phosphate] 47
ADV-RF GCT CAT TGG AAC AAC TGC CGT AAA TAG TGT 30
ADV-RR GGC CGA GAA CGG TGT ACG CAG GTA GAC TGT C 31
ADV-RP-exo CAG GTA GAC TGT CTC GAT GAC GCC GCG GTG T[FAM]G[THF] CT[BHQ]G GTG CAC GCT GAC C-SpC3 49
MERS-CoV 바이러스 nucleoprotein 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA 및 RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
MCV-RF AAC TTC CAC ATT GAG GGG ACT GGA GGC AA 29
MCV-RR-Bio [Biotin]AGA GTT TCC TGA TCT TGA ACC TTG TGA ACT 30
MCV-RP-nfo TCT TCA AGA GCC TCT AGC TTA AGC AGA AAC [THF]TC CAG ATC TAG TTC[phosphate] 45
H7N9 조류 인플루엔자 바이러스 H7 및 N9 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA 및 RT-RP-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
H7-RF TTC TAT GCA GAA ATG AAA TGG CTC CTG TCA A 31
H7-RR-Bio [Biotin]AGC TGG GCT TTT TCT TGT ATT TTT ATA TGA CTT AG 35
H7-RP-nfo AAA TGA AAT GGC TCC TGT CAA ACA CAG ATA [THF]TG CTG CAT TCC CGC A[phosphate] 46
N9-RF ATA GAC CCA GTA GCA ATG ACA CAC ACT AGT CA 32
N9-RR Bio [Biotin]TTA TTA TTA CCT GGA TAA GGG TCA TTA CAC T 31
N9-RP-nfo CAC TAG TCA ATA TAT ATG CAG TCC TGT TCT A[THF]A GAC AGT CCC CGA CCG A[phosphate] 49
2019-nCoV 바이러스 nucleocapsid phosphoprotein 유전자의 표적핵산에 대한 기본 RT-RPA 및 RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 올리고뉴클레오티드
Oligo name Sequence 5′-3’ Length (bp)
CoV-RF TTT GGT GGA CCC TCA GAT TCA ACT GGC AGT AAC 33
CoV-RR-Bio [Biotin]GAA TTT AAG GTC TTC CTT GCC ATG TTG AGT GAG 33
CoV-RP-nfo GCG ATC AAA ACA ACG TCG GCC CCA AGG TTT ACC [THF]AA TAA TAC TGC GTC T[phosphate] 49
AFPF 방식으로 RPA의 증폭산물인 표적 프로브를 검사하기 위해, 포획 프로브를 설계하였다. 포획 프로브는 기본 RPA 및 RPA-nfo 반응에 의한 증폭산물을 인지하고 상보적 결합하는 올리고뉴클레오티드이며, 포획 프로브의 이차 구조는 실험 조건을 시뮬레이션하는 웹 기반 소프트웨어인 Mfold (25℃; 0.150μM [Na+])에 의해 계산되었다. 아래 <표 6> 내용을 고려하였다.
포획 프로브의 고려 사항
Probe characteristics Probe specificity
Probe length (mers) T m range
(℃)		 Single nucleotide stretch length (complexity) Maximal degeneracy Maximal consecutive match with non-target Maximal identity with non-target (%) BLASTClust option (-S)(%) BLASTClust option (-L)(%)
50 64-79 10 1 or 32 15 75 90 0
(-L)=0 indicates that sequence length is not considered for the clustering.
5.3. 올리고뉴클레오티드의 변형
시료에서 DNA와 RNA 공동 추출한 총핵산 시료를 등온 증폭으로 표적핵산을 검사하기 위해, 감염초기에 유사한 임상증상을 제공하는 4종류의 호흡기 바이러스 게놈의 합성 표적핵산을 검사하기 위한 프라이머와 프로브의 변형을 실시하였다(IDT, 미국).
재조합효소가 선정된 표적핵산의 특정지역을 증폭하도록 하기 위해, RPA 정방향 프라이머와 RPA 역방향 프라이머는 천연 뉴클레오티드를 사용하여 제조하였다(IDT, 미국).
AFPF의 핵산 혼성화 방식의 표적 프로브는 5‘ 말단에 바이오틴 부분이 표지된 사슬이다, 이를 위해 기본 RPA 반응의 역방향 프라이머의 5’말단에 표지물질 특히, 바이오틴을 부가하였다.
ADV-RP-exo는 형광단 FAM-T-뉴클레오타이드를 대체하는 내부 비염기성 뉴클레오타이드 유사체 THF-G-소광제 BHQ, 및 3' 말단에 SpC3 폴리머라제 연장 차단 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(IDT, 미국).
TwistAmp™ nfo 프로브는 뉴클레오타이드를 대체하는 내부 비염기성 뉴클레오타이드 유사체 THF, 및 3' 말단에 phosphate를 폴리머라제 연장 차단 그룹을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(IDT, 미국).
다중검사에 따른 사용하는 프라이머들을 포함한 올리고뉴클레오티드들 사이 이중량체 형성을 최소화하기 위해, self-avoiding molecular recognition systems(SAMRS) 뉴클레오티드를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 제조하였다(IDT, 미국).
포획 프로브는 중합효소에 의해 기본 RPA 및 RPA-nfo 반응산물은 5‘ 말단에 바이오틴이 표지된 RPA 역방향 프라이머을 사용하여 표적핵산의 특정영역을 증폭한 절편의 이중가닥으로 5’말단에 바이오틴이 표지된 표적 프로브과 상보적인 결합을 하는 아민기가 표지된 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(바이오니아, 한국).
5.4. 종이 어레이 제조
등온 증폭 산물의 다중검사를 위한, 핵산 혼성화를 기반으로 한 능동유동 종이 어레이 여과(AFPA)를 실시하였다.
본 발명의 종이 어레이를 제조하는 니트로셀룰로스 막은 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스(3M 사, 미국) 디스크를 사용하였다. 특정 실험에 따라 GE FF60 또는 FF80HP(GE Healthcare, 미국) 또는 Millipore HFB135(Millipore, 미국)의 니트로셀룰로오스 막을 시험에 사용하였다.
제작된 아민기가 있는 포획 프로브를 여러 농도로 제조한 4nL(10 방울/스폿) 올리고뉴클레오티드 TBS 용액을 piezoelectric printer SCIFLEX ARRAYER S3(Scienion AG, 독일)을 사용하여 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크 상에 스폿팅하였다.
스폿팅 후, 막을 실온에서 건조시키고, 125 mJ/cm2의 총 에너지를 가하여 254 nm UV 광에 노출시켰다. 비특이적 결합을 최소화하기 위해, 15분 동안 BSA 3 % 수용액에 침지시켜 막을 차단한 다음, 0.05 % 트윈-20을 함유한 TBS로 2 회 세척 단계를 각각 15분 동안 2회 세척하고, 사용할 때까지 실온에 보관하였다.
인쇄 버퍼는 신호 대 비표적 값뿐만 아니라 인쇄 조건을 개선하기 위해 첨가제로 보충되었다. 상동성이 없는 비오티닐화 서열을 양성 대조군으로 사용하였다. 비오틴 대신에 아민기를 갖는 동일한 서열을 음성 대조군으로 사용하였다.
종이 어레이 제조시 고려 조건: 인쇄 버퍼는 신호 대 비표적 값뿐만 아니라 인쇄 조건을 개선하기 위해 첨가제로 보충할 수 있다. 언급된 첨가제, 특히 베타인의 첨가가 스폿의 형태를 개선하고 신호 강도를 증가시킬 것이다. 베타인은 혼성화 동안 AT와 GC 염기쌍의 안정성 사이의 갭을 감소시켜 GC 함량에 관계없이 용융 온도를 낮춘다. 인쇄 용액의 점도를 증가시키는 능력과 함께 이 효과는 종이 어레이에서 매우 균일한 DNA 마이크로 스폿을 생성할 수 있도록 할 것이다. 1.5 M 베타인이 보충된 TBS를 인쇄 완충액으로 사용하였다.
혼성화 성능은 또한 스폿의 형태에 따라 달라지며, 이는 상대 습도, 포획 프로브 밀도, 인쇄 버퍼 및 인쇄 방법과 같은 인쇄 조건의 영향을 받을 수 있다. 유리 슬라이드의 전형적인 DNA 마이크로 어레이 인쇄 공정에서, 방울의 증발 속도를 늦추기 위해 권장되는 상대 습도는 약 50~65 %이다. 그러나, 종이 어레이에서, 사용하는 지지체(니트로셀룰로오스)은 높은 상대 습도 조건에 노출될 때 말리는 경향이 있어 인쇄시 어려움이 있을 수 있다. 결과적으로 상대 습도의 건조기 환경이 필요하며 35~40 % 범위의 수준이 최적일 수 있다.
스폿 형태는 상대 습도 및 방울의 증발을 지연시키는 시약의 첨가에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 포획 프로브는 낮은 상대 습도 수준에서 순수한 TBS 완충액으로 인쇄하며, "커피링 효과"가 있다. 이러한 고리 모양의 반점은 신호 축적은 DNA 축적으로 인해 가장자리에서 더 높으며, 용매의 증발에 의해 생성될 수 있으며, 이는 DNA 분자가 유체 유동과 함께 바깥쪽으로 흘러 증발 손실에 따른 것이다. 글리세롤과 베타인은 단백질과 DNA 마이크로어레이에서 인쇄 용액의 점도를 높이기 위해 사용되어 방울의 증발 속도를 감소시킨다. 낮은 상대 습도에서 글리세롤 20 % 및 베타인 1.5M에서 낙하 증발을 지연시키기 위해 인쇄 버퍼(TBS)에서 두 가지 첨가제를 사용할 수도 있다.
포획 프로브 농도는 AFPF 분석의 비색 신호 강도를 최대화하도록 최적화될 수 있다. 높은 농도에서, 혼성화는 고정된 프로브의 입체 장애 및 정전기력에 의해 영향을 받을 수 있고, 결과적으로 불완전한 혼성화가 발생하여 오 탐지 신호를 초래할 수 있다.
한편, 낮은 포획 프로브 농도에서 신호 강도는 분석의 감도 및 동적 범위에 영향을 미치며 비특이적 흡착으로 인해 비표적이 증가할 수 있다. 따라서, 최적화된 조건에 기초하여, 1 내지 80 μM 범위의 여러 포획 프로브 농도, 및 합성 DNA 표적의 연속 희석을 사용하여 교정 곡선을 수행하여 최적 포획 프로브 농도를 확립하고 가능한 최저 검사 한계를 달성할 수 있다.
5.5. 기본 RPA, RPA-exo 및 RPA-nfo 증폭
혼합 가래 표본의 핵산 추출에서 바이러스 RNA의 존재를 확인하기 위해, 바이러스 게놈에서 표적핵산을 선택하였다. 기본 RPA 증폭 프라이머, exo 프로브 및 TwistAmp™ nfo 는 특정 검사를 위해 설계하였다.
본 발명에서 사용하는 DNA 주형은 Human adenovirus JS201501 염기서열(Sequence ID: KX289874), MERS-CoV 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MN723544.1), H7N9 조류 인플루엔자 바이러스의 염기서열(Sequence ID: MF630405.1) 및 2019-nCoV 바이러스의 염기서열(Sequences ID MT276598.1)에 대해 표적핵산 부위를 선정하여. 상기 실시례 5.1항에서 합성된 DNA이다.
합성 바이러스 표적핵산 RNA 단편의 연속 희석을 사용하여, 마이크로 리터당 10-100 카피 범위의 합성 바이러스 RNA 서열의 존재를 검사하였다.
합성된 DNA를 주형으로 <T7 프로모터+GG염기서열>가 연결된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR하여 얻은 증폭산물을 확보하였다. 6 nmol DNA 주형, 0.25 μM 정방향 프라이머, 0.25 μM 역방향 프라이머, 10X PCR 버퍼, 및 100 μM dNTP의 혼합물을 혼합하여 처음 95℃의 5분에서 Taq 폴리머라제(Promega)를 2.5 유닛 첨가하였다. 그리고 PCR 사이클로 95℃의 30초, 55℃의 30초 및 72℃의 1분의 조건으로 20 사이클 반복한 뒤, 마지막으로 72℃의 8분 30초로 T7 프로모터가 있는 PCR 산물을 얻었다.
상기 증폭산물을 주형으로 체외전사하여 RNA를 합성하여 -20 ℃에서 저장하였다. 1x전사 완충액 (40mM Tris-HCL pH7.5, 6mM MgCl2, 5mM NaCl 및 10mM spermidine)의 총 부피 90㎕에서 이중 가닥 DNA 주형 5㎍을 사용하여 전사하여 제조하였다. 반응 혼합물에 5mM 또는 2mM NTP 혼합물 (ATP, UTP, GTP, 및 CTP)을 갖는 돌연변이 T7 효소를 함유하는 Durascribe T7 효소 믹스(Epicentre)의 10㎕을 첨가하여 37℃에서 12시간 반응시켰다.
사용하기 직전에 107 내지 101 개의 RNA 분자 ㎕로 희석 범위로 희석하고 시험에 사용하였다.
탐지 접근 방식을 단순화하거나 집에서도 수행할 수 있도록 탐지를 위해 한 튜브 RT-RPA, RT-RPA-exo 및 RT-RPA-nfo 반응을 할 수 있도록 상기 실시례 5.3항에서 언급된 올리고뉴클레오티드 세트를 합성하였다.
표적핵산 내에서 표적 프로브(증폭산물)를 증폭시키기 위해 쌍을 이룰 수 있는 RPA 정방향 프라이머 및 바이오틴이 표지된 RPA 역방향 프라이머를 제작하였다.
또한 THF 부위를 중심으로 5' 부위 33bp, 3‘ 부위에 15bp를 포함하는 TwistAmp™ nfo 를 제작하였다. RT-RPA-nfo 반응에 사용된 프라이머 및 프로브의 서열을 <표 2>, <표 3>, <표 4> 및 <표 5>에 나타내었고, 최적 반응 조건은 39℃에서 20분이다.
한 튜브 RT-RPA, 한 튜브 RT-RPA-exo 및 한 튜브 RT-RPA-nfo 반응을 TwistAmp 키트(TwistDX, 영국)를 사용하여 수행하였다.
반응 주형은 DNA 바이러스(본 실험에서 아데노 바이러스)의 게놈 및 RNA 바이러스는 역전사한 cDNA를 사용하였다.
상기 키트는 역전사 효소를 함유하지 않았기 때문에, cDNA의 합성은 제조사의 지시에 따라 전사체 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Roche, 스위스)를 사용하여 수행하였다. RPA 키트에 제공된 29.5ul의 재수화 완충액을 사용하여 각 동결 세척된 RPA 펠렛을 재현탁하였다.
또한, 합성 바이러스 단편을 사용하여 표적 프로브에 대한 양성 대조군을 설정할 수 있다. 테스트 시료를 추가하지 않은 음성 대조군도 설정해야 한다.
4종류의 바이러스의 표적핵산들에 대한 한 튜브 RT-RPA, 한 튜브 RT-RPA-exo 및 한 튜브 RT-RPA-nfo 반응은 <표 7>과 같이 설정될 수 있다.
하기 <표 7>의 4항은 한 튜브 RT-RPA은 ddH2O를, 한 튜브 RT-RPA-exo는 RPA exo Probe를 및 한 튜브 RT-RPA-nfo 반응은 RPA nfo Probe (0.3 uM)를 사용하였다.
하기 <표 7>의 7항의 시료는 4 종류의 바이러스의 합성 표적핵산에서 제조된 총핵산 시료를 실험 목적에 따라 1종류 이상을 선택하고 혼합하여 제조하였다.
한 튜브 RT-RPA-nfo 반응에 사용하는 시약 및 올리고뉴클레오티드
시약 부피
1. Resuspended RPA solution 5.9 ul
2. RPA-Forward_v1 (10 uM) 0.5 ul
3. RPA-Reverse_v1 (10 uM) 0.5 ul
4. ddH2O 0.5 ul
RPA exo Probe (0.3 uM)
RPA nfo Probe (0.3 uM)
5. ProtoScript RT (100,000U/mL) 0.2 ul
6. ddH2O 0.9 ul
7. Sample 1 ul
8. MgAc (supplied in RPA kit) 0.5 ul
Total 10 ul
상기 모든 반응은 TwistAmp (TwistDx Ltd., UK)를 사용하여 39℃에서 35분 동안 수행하였다.
단일 표적핵산을 검사할 목적인 기본 RPA 반응, RPA-exo 반응 및 RPA-nfo 반응 종결과 동시에 비색반응으로 결과를 확인하였다.
RPA 탐지 기능을 더욱 확장하기 위해 SYBR 녹색 염료(1:10000 저장 용액, Thermo Fisher의 S7563)를 반응 혼합물에 추가하고 색상 변화를 확인했다(도 11).
또한 형광 신호와 감도가 향상된 새로운 유형의 핵산 염료 GeneFinderTM (Bridgen의 D039)를 선택했다. 청색광 하에서 노출시킴으로써, 녹색 형광이 μL 당 100 카피로 양성 반응에서 육안으로 명확하게 관찰되는 반면, 음성 대조군에서는 분홍색으로 유지되었다.
또는 시험 결과를 추가로 확인하기 위해 PCR clean-up Kit (Qiagen, 독일)로 세척한 후 에티디움 브로마이드로 염색된 2 % 아가로스-겔 전기영동에서 증폭산물을 분석하였다(도 12).
표적핵산의 다중검사를 위해, 기본 RPA 반응 및 RPA-nfo 반응의 증폭산물은 핵산 혼성화 기반 AFPF를 실시할 목적으로, 하기 실시례 5.6항을 실시한다.
5.6. ssDNA 생성
상기 기본 RPA 반응 및 RPA-nfo 반응에서 증폭된 표적 프로브가 포함된 반응용액에 동일한 부피의 변성 용액 (0.5N NaOH, 1.5M NaCl)을 첨가하여 변성혼합용액을 제조하고 실온에서 1분 동안 변성시킨다. 변성혼합 용액에 동일한 부피의 중화용액 (1M tris-Cl, pH7.4)을 첨가하여 1 분 동안 중화시킨다.
5.7. 핵산 혼성화 기반 능동 유동 종이 어레이 여과
완충제 조성물은 염 농도의 변경 또는 변성제의 첨가에 의해 혼성화에 영향을 줄 수 있다. 두 가지 유형의 버퍼인 SSC와 TBS의 혼성화 용액을 사용할 수 있다. 완충용액은 0.1% SDS 및 5 % 탈이온화된 포름 아미드가 보충된 여러 농도 (즉, 1X, 2X, 4X, 8X 및 16X)에서 SSC로 구성할 수 있다. SSC를 완충용액으로 사용했을 때, 더 낮은 농도에서 더 높은 SBR(signal to background ratio)이 얻어졌고 2X는 최적의 농도이다. SSC는 혼성화 분석을 위한 가장 일반적인 완충제 중 하나임에도 불구하고, 이 제형은 여전히 실험에서 높은 비표적 신호 (즉, 분홍빛 비표적)를 초래하여 TBS가 대안으로 고려할 수 있다.
본 발명에서 두 버퍼를 비교할 때, TBS가 2XSSC와 비교한 결과 더 낮은 비표적 신호가 있어 TBS에서 더 낮은 SBR 값이 얻을 수 있었다. Tris-buffered salin(TBS)는 핵산 구조를 보존하고 분해를 피하기 위해 분자 생물학에서 일반적으로 사용되는 버퍼이다.
주사기 펌프로 유량을 제어하고 감도를 증가시키도록 최적화할 수 있다. 1000, 150 및 45 μL/min의 3 가지 다른 유속을 테스트하여 각각 30 초, 3 분 및 10 분의 혼성화 시간을 나타냈다. 높은 유속은 낮은 혼성화 신호를 나타내는 표적과 포획 프로브 사이의 적절한 혼성화를 허용하지 않았다. 한편, 150 및 45 μL/min의 낮은 유속에서 수행된 분석은 각각 3 분 및 10 분의 혼성화 시간이 길어짐에 따라 더 높은 신호를 나타냈다. 상이한 유속에 의해 생성된 감도에 대한 효과는 매우 낮은 포획 프로브 농도에서 크게 나타났다. 그러나, 더 높은 포획 프로브 농도에서, 150 및 45 μL/분의 유속은 유사한 신호 강도를 발생시켰다. 따라서, 분석 감도의 저하를 피하기 위해 나머지 실험의 혼성화 단계에 대해 150 μL/min의 유속을 선택할 수 있다.
포획 프로브가 인쇄된 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스 디스크를 1 mL 주사기와 결합된 폴리프로필렌 필터 홀더(Sterlitech, 미국)에 넣고, 주사기 펌프를 사용하여 상이한 분석 용액의 유량을 제어할 수 있다.
상기 분석용액은 표적 프로브가 있는 RPA 반응용액에 완충용액을 첨가하여 희석 단계를 수행할 수 있다.
바람직하게, AFPF 분석 동안 혼성화 및 비색 표지, 두 가지 주요 단계는 둘 다 실온 (약 23-25 ℃)에서 수행할 수 있다. 먼저, 1 mL/분으로 선택된 완충액 500 μL를 첨가하여 종이 어레이를 습윤시킬 수 있다. 그 후, 150 μL/분으로 450 μL RPA 증폭산물 용액을 여러 농도(증폭된 생성물의 경우, 500 μL 실행 완충액 중 50 μL 분해된 dsDNA)에서 150 μL/분으로 혼성화를 하였다.
그 후, 세척단계는 다음과 같이 실시할 수 있으며, 선택된 1 mL 완충용액로 1 mL/분의 완충액으로 세척하였다.
다음으로 Streptavidin coated AuNPs의 용액(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 비색 표지 (450 μL, 1 mL/분)로 사용할 수 있다. 마지막으로, 결합되지 않은 나노 입자를 제거하기 위한 마지막 세척 단계가 수행하였다.
사용된 AuNP(Thermo Fisher Scientific, 미국)는 Streptavidindl 코팅된 40-nm 입자이다. 표적 시료(표적 프로브가 있는 RPA 반응물)을 1xTBS (pH 7.5) 내로 500 μL로 추가로 희석시켰다. 유사하게, Streptavidin coated AuNPs의 용액을 1 xTBS에서 500 μL의 최종 부피로 1 : 4로 희석하였다. 막 슬라이드로부터 어레이의 원형 컷 아웃을 Swinnex 13-mm 폴리 프로필렌 필터 홀더 (Sterlitech, 미국)에 넣었다. 표적 및 세척 완충액 (0.05 % 트윈-20으로 보충된 1xTBS)을 주사기 펌프(미국, Harvard Aparatus사의 PHD 2000)를 사용하여 막을 통해 수직으로 첨가하였다.
먼저, 1 mL의 세척 완충액을 통과시키고 (1 mL min-1), 이어서 표적 시료 (0.45 mL, 150 μL min-1), 이어서 세척 (1 mL min-1) 하였다. 이어서, AuNP 컨쥬게이트를 함유하는 검사 용액을 첨가하고 (0.45 mL, 1 mL min-1), 이어서 최종 1 mL 세척 단계 (1 mL min-1)를 수행하였다.
5.8. 시각화
상기 세척이 완료되면, 평판 스캐너 CanoScan 9000F Mark II (Canon, 일본)를 16 비트 그레이 스케일 TIFF 파일로 스캔하기 전에 어레이를 5-10 분 동안 건조했다.
<도 13>에 표기된 5x3 양식으로 5종류의 포획프로브가 고정된 종이 어레이에 한 튜브에서 5종류 표적핵산으로 구성된 스톡 DNA 주형을 단계적 희석 방법으로 준비 주형 DNA에 대해 RPA를 실시하여 얻은 증폭산물을 혼합한 혼성화 용액을 핵산 혼성화 기반 AFPA 결과의 이미지로 분석 목적을 위해 스폿 강도를 GenePix Pro 5.0 마이크로 어레이 분석 소프트웨어 (Molecular Devices, 미국) 분석을 진행하는 이미지이다. 수득된 미가공 강도는 각각의 스폿의 중간 강도였으며, 이어서 인쇄 버퍼 스폿 (신호 비표적)의 중간 비표적 강도로 정규화되고 GraphPad Prism 7 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., 미국)를 사용하여 플롯팅하였다.
실시예 6: 분자 인코드 방식기반 AFPF
TwistDx사(영국) 지침에 따라 .AFPF의 분자 인코드 방식을 위한 프라이머와 프로브의 변형은 다음과 같다.
기본 RPA 반응 경우, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 재조합효소가 선정된 표적핵산의 특정지역을 증폭할 수 있도록, 전자는 변형이 없고 바이오틴이 표지된 올리고뉴클레오티드, 후자는 태그가 표지된 올리고뉴클레오티드로 제조하였다(IDT. 미국)
TwistAmp™ nfo 경우, nfo 프로브가 바이오틴이 표지된 5' 말단, 뉴클레오타이드를 대체하는 내부 비염기성 뉴클레오타이드 유사체 THF, 및 3' 말단에 phosphate를 폴리머라제 연장 차단 그룹으로 이루어진 올리고뉴클레오티드이고 역방향 프라이머는 태그가 표지된 올리고뉴클레오티드이다(IDT, 미국).
종이 어레이에 고정된 포획 프로브는 기본 RPA 반응 경우, 중합효소가 5‘말단에 바이오틴이 표지된 정방향 프라이머, TwistAmp™ nfo 경우, 5‘말단에 바이오틴이 표지된 TwistAmp™ nfo 의 5’측면 올리고뉴클레오티드 및 5‘말단에 태그가 표지된 RPA 역방향 프라이머로 표적핵산의 특정영역을 증폭한 표적 프로브의 태그와 비공유 결합을 하는 항체를 포함하는 리간드로 제조하였다.
6.1. 태그와 리간드
역방향 프라이머 5' 말단에서 태그가 부가되며 상기 태그는 6-카르복시 플루오레세인(6-FAM), Biotin, CY5Sp, Digoxigenin_N, 6-TAMRASp, Alexa 488 C6-NH, BODIPY FL C5 C6-NH, Cascade Blue C6-NH, DNP-X C6-NH, Dansyl-X C6-NH, Texas Red-XN, 루시퍼 옐로우 또는 벤조피렌를 포함한다.
포획 프로브로 사용되는 항체 또는 리간드는 (i) streptavidin (New England Biolabs, 미국); (ii) 단일클론 anti-Cy5 항체 (Sapphire Bioscience Pty. Ltd., 미국); (iii) 다클론 anti-Digoxigenin 항체 (Roche Diagnostics, 스위스); (iv) 단일클론 anti-TAMRA 항체 (Thermo Fisher Scientific, 미국); (v) 단일클론 anti-Texas Red 항체 (Invitrogen Corporation, 미국); (vi) 다클론 488 anti-Alexa Fluor® 488 항체 (Life Technologies, 미국); (vii) 다클론 항-BODIPY® FL 항체 (Life Technologies, 미국); (viii) 다클론 항-Alexa Fluor® 405/Cascade Blue174; 항체 (Life Technologies, 미국); (ix) 다클론 anti-Dinitrophenyl-KLH 항체 (Life Technologies, 미국); (x) 다클론 anti-Dansyl 항체 (Life Technologies, 미국); (xi) 다클론 Lucifer Yellow 항체 (Life Technologies 사, 미국); 및 (xii) 단일클론 항-벤조 (xiii) 피렌 anti-Benzo(a)pyrene 항체 (Biorbyt 사, 영국을 포함한다.
이들 항체를 니트로셀룰로오스 막의 시험 구역에 침착시켰다. 또한, 다클론 토끼 항-마우스 항체 (Sapphire Bioscience 사, 미국)를 대조군에 침착시켰다.
시각화 용액은 Streptavidin coated AuNP 용액(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하였다.
6.2. 리간드 어레이 제조
리간드가 부착된 종이 어레이의 니트로셀룰로스 막은 1.3 cm 직경의 니트로셀룰로오스(3M 사, 미국) 디스크를 사용하였다. 특정 실험에 따라 GE FF60 또는 FF80HP(GE Healthcare, 미국) 또는 Millipore HFB135(Millipore, 미국)의 니트로셀룰로오스 막을 시험에 사용하였다.
시판되는 항체는 언급된 바와 같이 제조자로부터 구입하였다. 달리 언급되지 않는 한 모든 단백질을 압전 프린터 piezoelectric printer SCIFLEX ARRAYER S3(Scienion AG, 독일)를 사용하여 막 디스크 상에 3x3 양식으로 <표 8>과 같이 스폿하였다.
분자 인코드
표적핵산의 NCIBI 접속번호 태그 리간드 스폿의 위치
KX289874 CY5Sp 단일클론 anti-Cy5 항체 1x1, 1x2
MN723544.1 Digoxigenin_N 다클론 anti-Digoxigenin 항체 1x3, 2x1
MF630405.1_H7 6-TAMRASp 단일클론 anti-TAMRA 항체 2x2
MF630405.1_N9 Texas Red-XN 단일클론 anti-Texas Red 항체 2x3
MT276598.1 Alexa 488 C6-NH 다클론 anti-Alexa Fluor® 488 항체 3x1, 3x2, 3x3
달리 언급되지 않는 한, 20 μg/mL 단백질을 HBS (10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4) 또는 PBS (10mM 인산 나트륨, 138mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)에서 100μM에서 제조하였다.
시료로부터의 미립자로 프린터 노즐을 막는 것을 피하기 위해, 모든 단백질 용액을 스포팅 전에 5분 동안 6000g에서 0.2-μm 나일론 막 (VWR, Radnor, PA)을 갖는 원심 필터 장치를 통해 여과하였다.
한 종이 어레이에서 스폿 구성은 250 μm 간격으로 스폿 (스폿 당 30 방울)을 제조하였으며, 막 영역을 포화시키기 위해 각 동일한 스폿을 2 개 이상 제작할 수도 있다.
니트로셀룰로스-결합 단백질 스크리닝을 위해, 원형 스폿은 방울 당 450-500 pL에서 1000 방울을 사용하여 총 ~ 500 nL이 스폿되었다. 스포팅 후, 막을 사용 전 적어도 밤새, 최대 1 주일 동안 건조하에 보관하였다.
6.3. RPA 증폭 및 분자 인코드 혼성화
분자 인코드 방식에서 RPA는 총핵산 시료의 표적핵산의 등온증폭 산물을 암호화하는 단계를 통해 RPA 반응은 제조사(TwistDx, 영국) 지침에 따라 하였다.
분자 인코드 혼성화는 실시례 5항에 따라 진행하였다. 상기 실시례 6.2항에서 준비된 태그와 바이오틴이 표지된 표적 프로브와 종이 어레이의 리간드가 선택적 특이적 결합하여 복합체를 형성하며 상기 형성된 복합체의 말단은 5'- 바이오틴으로 표지되었다. 혼성화 결과는 <도 14>와 같다.
<도 14. a> 3x3 양식으로 표기된 표적핵산의 NCBI 접속번호에 상응하는 리간드 포획 프로브가 고정된 종이 어레이에 바이오틴이 표지된 표적 프로브 증폭산물 용액을 분자 인코드 혼성화기반 AFPF를 실시하고 시각화 시약 Streptavidin-coated AuNPs(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 처리하여 <도 14. b>와 같이 육안으로 빨간색 스폿을 확인하였으며, 추가적으로 은 나노 입자로 신호를 증폭하여 육안으로 민감도가 더 높은 확인 가능한 스폿을 형성하도록 하였으며 <도 14. b>에서 가로 축은 바이러스 입자의 수이며 세로 축은 은 입자에 의한 신호증강 유무를 구분한 것이다,
실시예 7: RPA-Cas13 증폭 및 핵산혼성화 방식의 AFPF
표본의 핵산 추출에서 COVID-19 RNA의 존재를 확인하기 위해, S 유전자 및 Orf1ab 유전자의 COVID-19 게놈에서 2 개의 하기 표적핵산을 선정하여 합성하였다(바이오니아, 한국).
- S gene fragment: 5'-TAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGC-3’
- Orf1ab gene fragment: 5'-TGAGTGTAATGTGAAAACTACCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACCAGCAAATAATAGTTTAAAAATTACAGAAGAGGTTGGCCACACAGATCTAATGGCTGCTTATGTAGACAATTCTAGTCTTACTATTAAGAAACCTAATGAATTATCTAG-3’
합성 COVID-19 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 RNA 단편의 연속 희석을 사용하여, 마이크로 리터당 10-100 카피 범위의 합성 COVID-19 RNA 서열의 존재를 검사할 수 있다.
COVID-19 PCR 표준은 COVID-19 Wuhan-Hu-1 완전 게놈 (MN908947)의 뉴클레오티드 2941-3420 DNA 절편으로부터 설계하였다. COVID-19 ssDNA 대조군 단편은 IDT 사(미국)를 통해 합성하였다. COVID-19 대조군 DNA 절편은 상업적 공급원이 없었기 때문에 GenBank MN908947.3의 염기서열을 사용하여 제조하였다(IDT 사, 미국).
7.1. 시약 및 올리고뉴클레오티드
RT-RPA 등온 증폭은 TwistAmp® Basic(TwistDx사, 영국) 및 ProtoScript® II 역전사 효소(New England BioLabs 사, 미국)으로 수행했다. 그리고 Cas13을 사용한 바이러스 RNA의 검사는 절단 완충액 (ddH2O 중 400mM Tris pH 7.4), SUPERase*n™ RNase 억제제(ThermoFisher Scientific 사, 미국), NxGen® T7 RNA 폴리머라제(루시겐 사, 미국), 리보뉴클레오티드 용액 세트(New England BioLabs 사, 미국), 염화 마그네슘 용액(시그마 알드리치사, 미국), Cas13 단백질 스톡 희석용 저장 완충액 (2.5M의 1M Tris pH 7.4, 6mL의 5M NaCl, 및 2.5mL의 글리세롤 및 100μL의 1M DTT), LwaCas13a 단백질(2mg/mL, ThermoFisher Scientific 사, 미국)를 사용하여 수행하였다.
RPA 프라이머 및 LwaCas13a CRISPR 가이드 RNA는 특정 검사를 위해 제작하였다(IDT 사, 미국).. RPA 프라이머의 정방향 프라이머는 T7 프로모터+GG 염기서열이 부가된 올리고뉴클레오티드이다.
COVID-19 게놈의 RPA 프라이머는 <표 9>과 같으며, IDT에서 주문 제작하였다.
COVID-19 게놈의 RPA-Cas13증폭 반응에서 RPA에 사용하는 올리고뉴클레오티드
프라이머 염기서열
S 유전자 RPA-Forward 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA-3'
RPA-Reverse 5'-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3'
Orf1ab RPA-Forward 5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCGAAGTTGTAGGAGACATTATACTTAAACC-3';
RPA-Reverse 5'-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3
Cas13을 사용한 바이러스 RNA의 검사에 사용하는 올리고뉴클레오티드이며 다음과 같으며 IDT에서 주문 제작하였다.
- S 유전자 검사를 위한 LwaCas13a crRNA (S-crRNA) : 5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3'
- Orf1ab 유전자 검사용 LwaCas13a crRNA (Orf1ab-crRNA) : 5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU-3'
7.2. RT-RPA-Cas13 증폭
단계 (1) - 사전 증폭 작업 영역에서 수행되는 등온 증폭 :
각 시료를 테스트하기 위해 COVID-19 게놈의 S 유전자 표적과 Orf1ab 표적핵산을 검사하기 위해 한 튜브 RPA 반응을 하였다. 또한, 합성 바이러스 단편을 사용하여 S 유전자 및 Orf1ab에 대한 양성 대조군을 설정할 수 있다. 테스트 시료를 추가하지 않은 음성 대조군도 설정해야 한다. RPA 키트에 제공된 29.5ul의 재수화 완충액을 사용하여 각 동결 세척된 RPA 펠렛을 재현탁하였다.
COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산의 한 튜브 RPA 반응은 <표 10>과 같이 설정하였다.
COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산의 한 튜브 RPA 반응의 조성
시약 부피
1. Resuspended RPA solution 5.9 ul
2. S-RPA-Forward_v1 (10 uM) & 0.5 ul
3. Orf1ab-RPA-Forward_v1 (10 uM) 0.5 ul
4. S-RPA-Reverse_v1 (10 uM) & 0.5 ul
5. Orf1ab-RPA-Reverse_v1 (10 uM) 0.5 ul
6. ProtoScript RT (100,000U/mL) 0.2 ul
7. ddH2O 0.4 ul
8. Sample 1 ul
9. MgAc (supplied in RPA kit) 0.5 ul
Total 10 ul
완전히 혼합하고 예열된 수조에서 42℃에서 25 분 동안 각 반응을 실시하였다. 반응 후, 단계 (2)에서 반응에 첨가 할 준비가 될 때까지 반응물을 즉시 얼음 상에 다시 놓았다.
단계 (2) - RPA 산물에 Cas13 처리하여 바이러스 RNA 서열의 검사
122.5 uL의 저장 완충액을 사용하여 재현탁된 스톡 LwaCas13a 단백질(2 mg/mL, 4 ul)의 분취량을 취하였다.
상기 COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산 RPA 반응산물의 한 튜브 Cas13 감출 반응은 <표 11>과 같이 설정하였다.
COVID-19 게놈의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산 RPA 반응산물의 한 튜브 Cas13 감출 반응의 조성
시약 부피
1. Cleavage Buffer (400mM Tris pH 7.4) 2 ul
2. ddH2O 9.6 ul
3. LwaCas13a protein (resuspended) 2 ul
4. S-crRNA_v1 (10 ng/ul) 1 ul
5. Orf1ab-crRNA_v1 (10 ng/ul) 1 ul
6. SUPERase RNase Inhibitor 1 ul
7. Lucigen T7 Polymerase 0.6 ul
8. Ribonucleotide Solution 0.8 ul
9. MgCl2 (120mM) 1 ul
10. RPA reaction from Step (1) 1 ul
Total 20 ul
반응 조성물의 Ribonucleotide 용액은 Biotin-11-UTP, rATP, rGTP 및 rCTP로 구성되어 증폭산물을 바이오틴으로 표지하였다. 모든 반응을 설정한 후, 와류를 완전히 혼합하고 원심 분리기에서 스핀 다운하고 예열된 수조에서 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 반응한 후, 반응 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 AFPF 검사를 위해 단계 (3)으로 진행하였다.
단계 (3) - AFPF를 통한 검사 결과의 시각적 판독
종이 어레이는 <실시례 5항>에 따라 제조하였다. 단계 (2) 후에, 80ul의 분석 완충제를 각 20ul 반응에 첨가하고 완전히 혼합하였다. <실시례 5항>에 따라 상기 희석된 표적 프로브가 있는 반응 증폭산물을 AFPA 여과장치에 넣고 AFPF를 실시하여 종이 어레이의 포획 프로브 염기서열과 표적 프로브의 염기서열의 상보적 결합으로 복합체를 형성하였다.
본 발명의 S 유전자 및 Orf1ab 유전자 표적핵산에 상응하는 포획프브와 처리한 표적 프로브가 형성하는 복합체 시각화 시약인 Streptavidin-coated AuNPs(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 처리하며 복합체의 바이오틴과 시각화 시약이 결합하여 육안으로 빨간색 스폿을 형성하고 음 대조구는 반응이 없어 무색이다(도 15).
양성 대조군 시료에는 두 줄이 표시되고 음성 대조군 시료에는 스폿만 표시되어야 한다. 각각의 시험 시료에 대해, 양의 COVID-19 결과를 나타내는 2 개의 스폿이 S 및 Orf1ab 유전자 둘 다에 나타나는지 확인하였다.
또한 본원에 따른 증폭산물의 검사는 기존의 경우 아가로즈 전기영동 또는 별도의 장비를 이용한 것이 아닌, 증폭반응 후에 색변화로 바로 결과 확인이 육안으로 검사가능하여 그 편리성이 월등히 향상된다.
실시예 8: RT-LAMP
SARS CoV-2의 빠른 탐지를 위한 RT-LAMP (등온선 램프 기반 방법 COVID-19)라는 램프 기반 방법을 개발하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
표적핵산으로 ORF1ab의 단편을 선택하고 온라인 소프트웨어 Primer Explorer V5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)를 사용하여 RT-LAMP 프라이머를 설계하였다. NCBI BLAST 도구를 사용하여 9 개의 코로나 및 2 개의 인플루엔자 바이러스를 포함한 다른 바이러스 게놈과 표적 서열을 비교하여 프라이머 특이성이 있다.
SARS CoV-2의 빠른 탐지를 위한 RT-LAMP에 사용할 외부프라어머 (F3와 B3)가 위치할 수 있는 DNA의 절편은 SARS CoV-2의 게놈(Sequence ID: MT385497.1) 염기서열 15162~15372(길이 211 nt)이며 하기 실험을 수행하기 위해 SARS CoV-2의 게놈(Sequence ID: MT385497.1)에 대한 염기서열 15212~15422(길이 311 nt)의 DNA 절편을 제조하였다(IDT,미국).
표적 RNA의 제조는 <T7 프로모터+GG>와 표적핵산의 5‘말단의 20개 염기서열로 구성된 정방향 프라이머와 표적핵산의 3’말단의 20개의 상보적인 염기서열인 역방향 프라이머로 PCR하여 T7 프로모터가 있는 DNA를 제조하였다. 상기 제조된 T7 프로모터가 있는 DNA 절편으로 체외전사하여 RNA를 제조하였다.
상기 제조된 RNA가 첨가된 가래 표준 시료에서 실시례 1항에 따라 DNA와 RNA 공동 추출한 총핵산 시료를 사용하여하여 RT-LAMP를 검증했다. 65 ℃에서 20 분 동안 반응한 후 반응 튜브에서 분홍색에서 담황색으로 변하는 색상을 관찰하였다. 전기 영동을 사용하여 DNA 증폭 산물의 크기를 추가로 확인하였다. 본 발명의 방법에 사용된 프라이머의 농도는 다음과 같았다.
각각의 외부 프라이머 0.2μM (F3 5'-CCACTAGAGGAGCTACTGTA-3 '및 B3 5'-TGACAAGCTACAACACGT-3'), 각 내부 프라이머 1.6μM (FIP 5'- AGGTGAGGGTTTTCTACATCACTATATTGGAACAAGCAAATTCTATGG-3 '및 BIP 5'-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGTGCGAGCAAGAACAAGTG-3'), 각 루프 프라이머의 0.4 μM iLACO는 SARS-CoV-2 RNA 또는 cDNA의 시료를 비교할 때 비슷한 성능을 보여 1 단계 등온 증폭이 충분하였다.
잠재적인 현장 및 병상 사용을 위해 반응 프로토콜을 더욱 최적화했다. 65˚ (WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix, M1800; NEB, 미국)에서 수조에서 배양된 1.5 ml 튜브에서 RT-LAMP의 효율성을 검증했으며 바이러스 RNA를 사용한 색 변화에 20분의 반응 시간이 충분하였다. μL 당 1000 카피의 농도 (즉, 총 20 μL 반응에서 1μL 시료 사용). 증발을 피하기 위해 필요한 모든 솔루션을 추가한 후 20 μL의 미네랄 오일을 추가하는 것이 이상적이다. RT-LAMP의 검사 한계를 확인하기 위해 합성된 ORF1ab 유전자의 연속 희석 (μL 당 1,000,000 ~ 0.1 카피)을 수행했다. RT-LAMP는 ORF1ab 유전자의 1 개 복제본을 탐지할 수 있다. 사본 수가 10/μL 미만인 시료는 최대 2시간 동안 배양 시간이 연장된 경우에도 색상을 변경하지 못했다.
RT-LAMP 탐지 기능을 더욱 확장하기 위해 SYBR 녹색 염료(1:10000 저장 용액, 미국, Thermo Fisher의 S7563)를 반응 혼합물에 추가하고 Gel 이미징 시스템으로 색상 변화를 확인했다. 또한 형광 신호와 감도가 향상된 새로운 유형의 핵산 염료 GeneFinderTM (독일, Bridgen의 D039)를 사용할 수도 있다.
<도 16>의 상단은 청색광 하에서 노출시킴으로써, 녹색 형광이 μL 당 1000 카피로 양성 반응에서 육안으로 명확하게 관찰되는 반면, 음성 대조군에서는 분홍색으로 유지된 이미지이며, 하단은 상단에 상응하는 반응산물을 아게로즈 젤에 전기영동한 이미지이다.
이것은 사용된 버퍼의 농도를 조정함으로써 최적화 될 수 있다. 환자 RNA 분리에 사용된 것과 동일한 완충액에 재현탁된 양성 및 음성 대조군 시료를 항상 사용하는 것이 좋다.
이상에서 본 발명의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
1000: 표적핵산 검사 장치 100: 시약모듈
110: 저장소 111: 시약저장소
112: 시료 저장소 200: 반응모듈
210: 반응튜브 220: 혼합부
230: 가열부 240: 자기장 인가부
300: AFPF 모듈 310: 종이어레이
320: 여과장치 400: 시각화모듈
410: 스캔너 420: 증강부
430: 소프트웨어 500: 이송모듈
510: 순환부 511: 시약순환부
512: 시료순환부 513: 공기 순환부
520:분배부 530: 펌프
540: 제어부 2000: 표적핵산 다중검사 장치

Claims (43)

  1. 시료, 용해물질, 결합물질 및 결합촉진제를 포함하는 혼합용액에서 시료를 용해하여 핵산-결합물질 복합체를 형성하는 용해/추출 단계(S100); 여기서, 또는 상기 혼합용액에서 결합촉진제를 제외하며;
    상기 형성된 핵산-결합물질 복합체를 세척용액을 이용한 세척으로 증폭저해물질을 제거하는 세척 단계(S200); 여기서, 또는 세척된 핵산-결합물질복합체에 용출용액을 사용하여 핵산을 용출하는 과정을 추가하며, 및
    상기 세척된 핵산-결합물질 복합체 또는 용출된 핵산을 포함하는 반응용액에서 표적핵산을 분석하고 동시에 시각화하는 분석 단계(S300);를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용해/추출 단계(S100)는
    상기 시료, 용해물질 및 결합촉진제를 포함하는 혼합용액에서 시료를 용해하고 상기 결합물질을 포함하는 스핀 플레이트(spin plate) 또는 컬럼(column)에 부가하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  3. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 시료는
    물, 공기, 토양, 동물, 식물, 곰팡이, 세균, 바이러스 및 이들의 분쇄액을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  4. 제3항에 있어서, 상기 동물로부터 얻어진 시료는
    상기 동물의 혈액, 가래, 점액, 타액, 눈물 및 소변을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  5. 제3항에 있어서, 상기 바이러스는
    아데노 바이러스;
    중증급성호흡기증후군 코로나 바이러스(중증급성호흡기증후군). 중동호흡기기증후군 코로나 바이러스(중동호흡기증후군) 및 SARS-CoV-2(COVID-19)을 포함하는 코로나 바이러스;
    인플루엔자바이러스 A형/B형/C형/D형, 인플루엔자 및 조류 인플루엔자를 포함하는 오르토믹 소바이러스; 및
    사람 파라인플루엔자 바이러스(사람 파라인플루엔자), 호흡기세포융합 바이러스 및 메타뉴모 바이러스를 포함하는 파라믹소 바이러스;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 한 유형(subtype) 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  6. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 핵산은
    게놈 DNA, 게놈 RNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 미토콘드리아 DNA, cDNA, 합성 이중-가닥 DNA, 합성 단일-가닥 DNA, 및 합성 단일-가닥 RNA를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  7. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 용해물질은
    기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로웨이브 방법으로 이루어진 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 실시할 수 있는 물질을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  8. 제1항, 제2항 및 제7항에 있어서, 상기 용해물질은
    나노바, 나노 스파이크 비드 열 용해 장치 및 미세전극을 포함하는 구조체;
    라소자임. Proteinase K 및 Achromopeptidase를 포함하는 효소;
    Sodium iodide(요오드화 나트륨), sodium perchlorate(과염소산 나트륨), guanidine thiocyanate(구아니딘 티오시아네이트), guanidine isothiocyanate(구아니딘 이소티오시아네이트) 및 guanidine hydrochloride(구아니딘 히드로클로라이드)를 포함하는 카오트로픽 염 및 lithium chloride(염화 리튬), sodium chloride(염화나트륨), potassium chloride(염화칼륨), sodium acetate(아세트산 나트륨), urea(우레아) 및 이들의 혼합물과 같은 다른 물질을 포함하는 군; 및
    나트륨 도데실 설페이트(SDS), 나트륨 데옥시 콜레이트, 노닐 페녹시 폴리에톡실 에탄올 (NP-40) 및 트리톤-X를 포함하는 세제;
    Dithiothreitol(DTT) 및 β-Mercaptoethanol를 포함하는 보조제;를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  9. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 결합물질은
    음이온 코팅 또는 실리카 코팅된 자성 입자, 폴리머(polymer) 및 막을 포함하는 군; 및
    Aluminium oxide, cellulose-based Flinders Technology Associates(FTA) cards, silica-based Fusion 5 filters 및 cellulose paper을 포함하는 막;을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 음이온 코팅은
    수산기, 아민, 카르복실 산, 에폭시 및 알데히드를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  11. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 결합촉진제는
    Sodium iodide(요오드화 나트륨), sodium perchlorate(과염소산 나트륨), guanidine thiocyanate(구아니딘 티오시아네이트), guanidine isothiocyanate(구아니딘 이소티오시아네이트) 및 guanidine hydrochloride(구아니딘 히드로클로라이드)를 포함하는 카오트로픽 염 및 lithium chloride(염화리튬), sodium chloride(염화나트륨), potassium chloride(염화칼륨), sodium acetate(아세트산 나트륨), urea(우레아) 및 이들의 혼합물과 같은 다른 물질을 포함하는 군;
    에탄올 및 이소프로판올을 포함하는 핵산 결합촉진제; 및
    tRNA, Glycogen 및 Acryl Carrier를 포함하는 핵산 침전 보조제를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  12. 제1항에 있어서, 상기 세척용액은
    60~90% 에탄올;
    10 mM Tris [pH 8.0] 및 0.1% Tween-20;
    증류수;를 포함하는 용액에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  13. 제1항에 있어서, 상기 핵산-결합물질 복합체는
    핵산-막 복합체; 또는 핵산-자석 입자 복합체를 특징으로 하는 핵산 검사 방법 및 장치.
  14. 제1항에 있어서, 상기 분석은
    PCR(Polymerase Chain Reaction), 등온 증폭(Isothermal Amplification), 메칠화 분석 및 NGS를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  15. 제14항에 있어서
    상기 단계 S200의 증옥 증폭은 Transcription mediated amplification(TMA), Nucleic acid sequence-based amplification(NASBA), Signal mediated amplification of RNA technology(SMART), Strand displacement amplification(SDA), Rolling circle amplification(RCA), Loop-mediated isothermal amplification(LAMP), Isothermal multiple displacement amplification(IMDA), Helicase dependent amplification(HDA), Single primer isothermal amplification(SPIA) 및 Recombinase polymerase amplification(RPA)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 RPA는
    제1항의 증폭용액은 Recombinase(재조합효소) 및 Polymerase(중합효소)를 포함하는 효소군을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 효소군에 역전사효소(Reverse transcriptase)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  18. 제16항 내지 제17항에 있어서,
    상기 효소군에 exo(E. coli exonuclease III), fpg(glycosylase/lyase E. coli fpg) 및 nfo(nfo endonucleases IV)를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 추가하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  19. 제16항 내지 제17항에 있어서,
    상기 효소군에 CRISPR nuclease를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  20. 제19항에 있어서, 상기 CRISPR nuclease는
    Cas9, Cas 12 및 Cas 13를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  21. 제16항 내지 제20항에 있어서,
    상기 효소군에 RPA 증폭 정방향 프라이머 및 RPA 역방향 프리이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 첨가하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  22. 제21항에 있어서, 상기 RPA 역방향 프리이머는
    표지물질이 부착된 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  23. 제21항 내지 제22항에 있어서, 상기 프라이머를
    2- 아미노푸린-2 '데옥시리보시드 (A*), 2'- 데옥시 -2- 티오티미딘 (T*), 프라이머에 2'- 데옥시이노신 (G*) 및 N4- 틸 -2'- 데옥시시티딘 (C*)를 포함하는 self-avoiding molecular recognition systems (SAMRS) 뉴클레오티드에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  24. 제1항에 있어서, 상기 단계 S300의 시각화는
    분자비콘 또는 taqman probes을 이용한 반응; 및
    나노 금 입자 및 인터킬레이팅 제제를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나에 의한 비색반응을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  25. 제24항에 있어서, 상기 나노 금 입자는
    상기 증폭하여 형성된 이중가닥 DNA 용액에 NaCl을 첨가하여 발생하는 색상의 변화를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  26. 제24항에 있어서, 상기 인터킬레이팅 제제는
    SYBR 그린, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), biotium gelred, biotium gelgreen, JOJO계열, POPO계열, SYTO계열, BOBO계열, TOTO계열, 악티노마이신, 아드리아마이신, 안트라센, 벤조피렌, 프로피디움 디이오다이드-인터트위닝(propidium diiodide-intertwining), 디스타마이신, 네트롭신과 아크리딘, 프소랄렌, 베르베린(berberine), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신, 독소루비신, 탈리도마이신, 시아닌 염료 및 LDS 751를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  27. 제1항에 있어서, 상기 단계 S300의 증폭 반응은
    표지물질을 포함하는 뉴클레오티드 유사체; 및
    한 쪽 말단에 표지물질이 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 검사 방법 및 장치.
  28. 제27항에 있어서, 상기 표지물질은
    바이오틴, 형광 나노입자, 양자점(quantum dot: Qdot), 금 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 금속 나노입자, 형광 염료, 방사성 동위원소, 효소, 다양한 표색 표지, 자성 또는 상자성 표지(예를 들어, 자성 및/또는 상자성 나노입자), 스핀 표지, 방사선-비투과 표지(radio-opaque label)를 포함하는 군에서 선택되어지는 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  29. 제28항에 있어서, 상기 단계 S300의 증폭반응으로 형성된 증폭산물을
    전기영동, 염기서열결정, 혼성화, 측면 유동 스트립(Lateral-flow strip), 능동 유동 종이어레이 여과(Active flow paper array fiter, AFPF)) 및 마이크로 어레이를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상으로 시각화하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  30. 제29항에 있어서, 상기 능동유동 종이 어레이 여과(AFPF)는
    제1항의 단계 S300의 증폭산물에서 표적프로브 단일가닥를 제조하는 단계(S400);
    상기 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 능동 유동 하에서 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500);
    상기 능동 유동 하에서 상기 종이 어레이에 형성된 표적-포획 프로브 복합체와 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계(S600); 및
    상기 종이 어레이에 있는 세척된 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 시각화 단계(S700);를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  31. 제30항에 있어서, 상기 단계 S300은
    제1항의 단계 S300의 증폭산물 및 RNA poymerase를 포함하는 반응; 및.
    제25항 내지 제26항에서 제조된 표지된 증폭산물을 포함하는 증폭용액에 가열 및는 pH 처리를 포함하는 군;를 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  32. 제31항에 있어서, 상기 RNA polymeras는
    T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase 및 SP RNA polymerase를 를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  33. 제32항에 있어서, 상기 T7 RNA polymerase를 사용하기 위해서,
    상기 올리고뉴크레오티드 세트에서 선택된 어느 하나에 <T7 프로모터+GG> 염기서열이 부가한 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  34. 제30항에 있어서, 상기 종이는
    셀룰로스, 섬유유리, 나이트로셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하 개질된 나일론 및 폴리에터 설폰을 포함하는 다공성 재료의 시트에서 선택되어진 어느 하나를 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  35. 제30항에 있어서, 상기 능동 유동은
    펌프, 진공 및 원심 분리기를 포함하는 외력에서 선택되어진 어느 하나로 상기 반응용액을 이동시키는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  36. 제29항에 있어서, 상기 여과장치는
    상기 종이 어레이를 포함하는 필터 홀더;
    액체 통로를 밀봉하고 누출을 방지하는 개스킷;
    상기 종이 어레이의 하부 및 상부에 배치하는 O-링;
    액체 통로를 제공하는 주시기; 및
    펌프;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  37. 제29항에 있어서, 상기 측면유동 스트립(Lateral-flow strip)은
    제31항에 있는 제조된 단일가닥 표적 프로브가 있는 증폭 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이가 장착된 측면유동 스트립 장치에 첨가하여 상기 표적 프로브 염기서열과 상기 포획 프로브 염기서열이 상보적 결합으로 표적-포획 복합체를 형성하는 혼성화 단계(S500); 및
    상기 종이 어레이에 있는 복합체를 구성하는 표적 프로브의 표지물질(reporter)을 측정하는 단계(S600);를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  38. 제1항의 단계 S200의 세척된 핵산-결합물질 복합체를 포함하는 용액에 하나 이상의 표적핵산을 대상으로 설계된 올리고뉴클레오티드 세트 1 및 재조합효소(Recombinase), 중합효소(Polymerase) 및 nfo(nfo endonucleases IV)를 포함하는 시약집단 1을 첨가하는 증폭용액를 제조하는 단계, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 세트 1은 표지물질을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 리간드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 최소한 포함하며;
    상기 증폭용액에 있는 표적핵산에서 상기 태그와 표지물질이 포함된 표적 프로브를 증폭하는 단계;
    상기 표적 프로브가 있는 용액을 희석하여 하나 이상 리간드(capture)가 부착된 종이 어레이가 장착된 여과 장치에 능동 유동 하에서 첨가하여 상기 종이에서 상기 표적 프로브의 태그와 상기 리간드가 분자 인코드 복합체를 형성하는 단계;
    상기 능동 유동 하에서 상기 종이에 형성된 복합체로부터 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계; 및
    상기 종이 어레이에 형성된 복합체를 구성하는 증폭 산물의 표지물질을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 표적 프로브가 있는 용액을 희석하여 하나 이상 리간드(ligand)가 측면 유동 스트립 장치(Lateral-flow strip device)에 첨가하여 상기 종이에서 상기 표적 프로브의 태그와 상기 리간드가 분자 인코드 복합체를 형성하는 단계;
    상기 능동 유동 하에서 상기 종이에 형성된 복합체로부터 비특이적으로 결합하거나 미결합한 표적 프로브를 구분하여 제거하는 세척 단계; 및
    상기 종이 어레이에 형성된 복합체를 구성하는 증폭 산물의 표지물질을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  40. 제38항 내지 제39항에 있어서, 상기 태그는
    바이오틴, 렉틴, 단백질, 펩티드, 당단백질, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 소분자, 중합체, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 및 지질을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  41. 제38항 내지 제39항에 있어서, 상기 리간드는
    아비틴, 항체, 단량체 핵산, 중합체 핵산, 압타머, 중합체, 렉틴, 탄수화물, 다당류, 당(sugar), 지질을 포함하는 군에서 선택되어진 어느 하나 이상을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  42. 본 발명의 표적핵산 검사 장치(1000)는
    케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 세척에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100);
    제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각에 상기 시료 및 시약을 포함하는 혼합용액에서 핵산-결합물질 복합체를 준비하는 반응튜브(210). 상기 혼합용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 상기 핵산-결합물질 복합체를 포획하는 포획부(240, 자기장 인가부)를 포함하는 반응모듈(200), 여기서, 상기 핵산-결합물질 복합체가 있는 반응튜브(210)는 증폭 과정을 수행하여 증폭산물을 포함하는 용액을 제조하고; 표적 프로브를 포함하는 용액을 제조할 수도 있으며; 증폭결과를 시각화하며; 추가적으로 시각 증강 시약을 사용하여, 신호가 증강된 비색반응을 획득할 수 있으며;
    또는 상기 획득한 증폭결과를 분석하는 장비(410) 및 분석 소프트웨어(430)를 포함하는 시각화 모듈(400); 및
    각각 구성 모듈 사이에 공기 또는 유체 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500); 을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
  43. 본 발명의 표적핵산 다중검사 장치(2000)는
    케이스 내부 제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각 시료 및 세척에 필요한 하나 이상의 시료를 포함하는 시료 저장소(111) 그리고 하기 반응에 필요한 시약 및 효소를 포함하는 시약 저장소(112)를 포함하는 복수 개의 저장소(110)를 포함하는 시약모듈(100);
    제1열 내지 제N열을 형성하되, 상기 제1열 내지 제N열 중 특정한 열에 각각에 상기 시료와 상기 시약을 포함하는 혼합용액에서 핵산-결합물질 복합체를 준비하는 반응 튜브(210). 상기 혼합용액의 혼합을 촉진하는 혼합부(220), 일정한 온도를 유지하도록 하는 가열부(230) 및 상기 핵산-결합물질 복합체를 포획하는 포획부(240, 자기장 인가부)를 포함하는 반응모듈(200), 여기서 상기 포획된 핵산-결합물질 복합체가 있는 반응튜브(210)는 증폭 과정을 수행하고 표적 프로브를 포함하는 증폭산물 용액을 제조하며;
    상기 표적 프로브가 있는 용액을 하나 이상의 포획 프로브가 부착된 종이 어레이(310)에서 표적-포획 복합체를 형성하는 여과장치(320), 시각화 시약으로 스폿이 형성되는 종이 어레이(310)를 포함하는 AFPF 모듈(300);
    상기 종이 어레이(310)에 있는 스폿을 스캔하는 스캔너(410), 이미지를 중강하는 증강부(420) 및 상기 이미지를 분석하는 소프트웨어(430)를 포함하는 시각화 모듈(400); 및
    각각 구성 모듈 사이에 공기 또는 유체 이송을 담당하는 노즐로 연결된 순환부(510), 상기 이송을 분배하는 분배부(520), 펌프(530) 및 상기 구성 모듈 및 상기 순환부를 제어하는 제어부(540)를 포함하는 이송모듈(500); 을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적핵산 검사 방법 및 장치.
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