CN114410837A - 检测hpv18的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因检测技术领域，公开了检测HPV18的试剂、试剂盒及应用。该检测HPV18的试剂，可以实现同管一步法稳定、高灵敏地检测HPV18，可检测到个位数的基因拷贝数：无需对RT‑RPA扩增产物实行移液操作，从而去除了移液操作产生的扩增产物气溶胶污染的风险，适合于规模化检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及检测HPV18的试剂、试剂盒及应用。
背景技术
宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，由单一亚型高危型人类乳头瘤病毒(HumanPapilloma virus，简称HPV)持续感染引起的。HPV属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤劲膜的鳞状上皮增殖。HPV包括六个早期调控基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和两个晚期基因(L1、L2)。早期基因参与病毒DNA的复制、转录、翻译和细胞转化等功能，而晚期基因的功能是编码病毒的衣壳蛋白。其中E6、E7两个早期基因分别抑制了肿瘤的抑癌基因P53和Rb而与宫颈癌的发生、发展存在直接关系。HPV按照危险程度可以分为低危型和高危型，高危型易造成宫颈癌。研究表明，99.7％的宫颈癌与高危型HPV感染有关，其中80％的高危型HPV感染为无致癌风险的一过性感染，两年内将自行消退；20％高危型HPV感染为有潜在致癌风险的持续性/整合感染，但只有伴随持续性E6、E7 mRNA转录，产生E6、E7癌蛋白，才会最终致癌。E6、E7 mRNA是目前宫颈癌最佳的风险评估指标。在感染的潜伏期或宫颈癌前病变阶段检测出高危型HPV并采取适当的治疗措施，可以有效地阻断宫颈癌的发生。因此，检测高危型HPV的E6、E7基因的核酸(包括DNA或mRNA)，特别是mRNA的检测，对于宫颈癌的早期防治，具有重要的临床意义。已知的HPV亚型16型和18型两种病毒造成75％以上的宫颈癌病例。
HPV的持续感染是宫颈癌发生的必要条件，通过在宫颈脱落细胞中检测HPV核酸已经成为筛查宫颈癌及癌前病变的重要手段。目前HPV DNA检测技术按照技术原理主要分为杂交法，实时定量PCR法，第二代杂交捕获法，焦磷酸测序法及飞行质谱技术，并且HPV DNA分型检测技术也越发受到关注。以杂交法为基础建立的检测HPV DNA的方法主要有：原位杂交，荧光原位杂交，Southern Blot，微阵列技术，导流杂交基因芯片，荧光探针标记的侧向层析技术和反向点杂交等。以上方法可在一定程度上检测到HPV感染并可应用于分型检测，但是也存在灵敏度较低，步骤多，操作繁琐，费时耗力，需要特殊的仪器设备，检测成本昂贵，通量低，不适合大通量临床样品的筛查等缺点。并且杂交法需要与多重聚合酶链反应相结合，检测分析至少需要两步以上反应所得产物，无疑增加了操作，污染和检测时间。实时定量PCR作为高灵敏度，高准确性和定量的核酸检测技术，在HPV DNA分型定量检测中得到广泛应用，具有操作简单，快速，灵敏度高和可定量等优点，商品化的试剂盒也已经广泛应用于临床检测。然而该方法通量低，成本较高，需要依赖精细温控变化的仪器与专业操作人员等。第二代杂交捕获技术检测是一种将HPV DNA与溶液中标记的RNA探针杂交并利用非同位素信号放大系统进行检测的方法，其扩增的是检测信号，而不是靶片段DNA的量，因此不需要与多重聚合酶链反应结合。但是该方法不能对HPV进行分型，灵敏度与准确度不如结合PCR的方法，并且步骤较多，操作繁琐，耗时长。焦磷酸测序是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标DNA片段，可用于HPV分型，定量性能好，准确性高，但是该技术需要与巢式PCR结合，操作步骤多，通量较低，检测成本也较高。飞行质谱技术是一种定量检测不同荷质比的技术，具有高灵敏度，高特异性，高通量的优点，但是检测成本昂贵，依赖高尖端质谱仪器，高通量筛查也易造成资源浪费。
HPV mRNA检测是目前宫颈癌最佳的风险评估指标，2006年欧洲生殖器感染及肿瘤研究组织认为HPV E6/E7 mRNA检测可以作为HPV相关的分子标记物之一进行研究。而随着分子生物学与生物信息学的快速发展和有机结合,基于核酸扩增的技术也得到了快速的发展。如RT-PCR技术、核酸杂交技术、双链RNA(dsRNA)电泳技术、环介导等温扩增技术等在病毒检测中的应用日趋广泛。目前商业化的HPV E6/E7 mRNA检测方法主要有美国Hologic公司的Aptima HPV检测技术、美国Diacarta公司的QuantiVirus HPV检测技术、法国BioMerieux公司的NucliSENS Easy HPV检测技术以及挪威PreTectAS公司的Pre-TectHPV-Proofer HPV检测技术。这些技术涉及基于转录介导等温扩增技术(TMA)原理、基于分支链DNA信号放大技术(bDNA)原理以及基于实时多重核酸序列依赖性扩增技术(Real-TimeNASBA)原理。我国HPV mRNA检测方法比较繁多，常用RT-PCR和杂交捕获法。以上所提方法均可有效检测临床样本中存在的高危型HPV E6/E7 mRNA，但专业性强，依赖专业仪器，操作步骤繁琐且成本较高，不利于高危型HPV筛查工作的大范围开展。临床急需一种检测速度快且灵敏度高的检测技术，更有利于患者的及时诊治。
发明内容
本发明的第一方面的目的，在于提供一种检测HPV18的试剂。
本发明的第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂的应用。
本发明的第三方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的检测HPV18的试剂的试剂盒。
本发明的第四方面的目的，在于提供第三方面的试剂盒的应用。
本发明的第五方面的目的，在于提供一种非诊断目的的HPV或HPV18检测方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种检测HPV18的试剂，包含：检测HPV18-E6的试剂和/或检测HPV18-E7的试剂；
所述检测HPV18-E6的试剂包含扩增HPV18-E6的引物对和检测HPV18-E6的CrRNA；
所述扩增HPV18-E6的引物对用于扩增HPV18-E6基因特定片段；
所述HPV18-E6基因特定片段的序列如HPV18基因的第414～561位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E6的引物对包括扩增HPV18-E6的正向引物和扩增HPV18-E6的反向引物；
所述扩增HPV18-E6的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E6的反向引物1；
所述检测HPV18-E6的CrRNA(HPV18-E6-CrRNA)包含HPV18-E6-CrRNA的锚定序列和HPV18-E6-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E6-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E6-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第501～528位核苷酸序列特异性识别；
所述检测HPV18-E7的试剂为(1)、(2)或(3)：
(1)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对用于扩增HPV18-E7基因特定片段；
所述HPV18-E7基因特定片段的序列如HPV18基因的第690～838位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E7的反向引物1；
所述检测HPV18-E7的CrRNA(HPV18-E7-CrRNA)包含HPV18-E7-CrRNA的锚定序列和HPV18-E7-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E7-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E7-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第772～799位核苷酸序列特异性识别；
(2)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对用于扩增HPV18-E7基因特定片段；
所述HPV18-E7基因特定片段的序列如HPV18基因的第721～842位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E7的反向引物2；
所述检测HPV18-E7的CrRNA包含HPV18-E7-CrRNA的锚定序列和HPV18-E7-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E7-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E7-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第772～799位核苷酸序列特异性识别；
(3)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对用于扩增HPV18-E7基因特定片段；
所述HPV18-E7基因特定片段的序列如HPV18基因的第772～894位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E7的反向引物3；
所述检测HPV18-E7的CrRNA包含HPV18-E7-CrRNA的锚定序列和HPV18-E7-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E7-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E7-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第809～836位核苷酸序列特异性识别。
优选地，所述HPV18基因的登录号为NC_001357.1。
优选地，所述T7 RNA聚合酶识别区的序列为GAAATTAATACGACTCACTATAGGG(SEQ IDNO.24)。
优选地，所述Cas蛋白为Cas13a；进一步为LwaCas13a。
优选地，所述HPV18-E6-CrRNA的锚定序列和HPV18-E7-CrRNA的锚定序列为GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC(SEQ ID NO.25)。
优选地，所述扩增HPV18-E6的反向引物1的序列如SEQ ID NO.26所示。
优选地，所述扩增HPV18-E7的反向引物1的序列如SEQ ID NO.27所示。
优选地，所述扩增HPV18-E7的反向引物2的序列如SEQ ID NO.28所示。
优选地，所述扩增HPV18-E7的反向引物3的序列如SEQ ID NO.29所示。
优选地，所述检测HPV18-E6的试剂包含扩增HPV18-E6的引物对和检测HPV18-E6的CrRNA；
所述扩增HPV18-E6的引物对包括扩增HPV18-E6的正向引物和扩增HPV18-E6的反向引物；
所述扩增HPV18-E6的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述检测HPV18-E6的CrRNA的序列如SEQ ID NO.21所示；
所述检测HPV18-E7的试剂为(4)、(5)或(6)：
(4)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的正向引物的序列如SEQ ID NO.13所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.14所示；
所述检测HPV18-E7的CrRNA的序列如SEQ ID NO.22所示；
(5)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的正向引物的序列如SEQ ID NO.17所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.18所示；
所述检测HPV18-E7的CrRNA的序列如SEQ ID NO.22所示；
(6)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的正向引物的序列如SEQ ID NO.19所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.20所示；
所述检测HPV18-E7的CrRNA的序列如SEQ ID NO.23所示。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的试剂在(7)～(12)中任一种中的应用；
(7)制备检测HPV的产品中的应用；
(8)制备检测HPV18的产品中的应用；
(9)制备筛选HPV感染者的产品中的应用；
(10)制备筛选HPV18感染者的产品中的应用；
(11)非诊断目的的HPV检测；
(12)非诊断目的的HPV18检测。
本发明的第三方面，提供一种包含本发明第一方面的试剂的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括Cas蛋白。
优选地，所述Cas蛋白为Cas13a；进一步为LwaCas13a。
优选地，所述试剂盒还包括RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁、氯化镁和Tris。
进一步优选地，所述试剂盒还包括(13)或(14)：
(13)RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁和氯化镁；
(14)RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、氯化镁和Tris。
优选地，所述试剂盒用于荧光法检测时，所述试剂盒还包括：信号报告探针A；
所述信号报告探针A包含核酸序列，所述核酸序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。
优选地，所述信号报告探针A的核酸序列为rUrUrUrUrU。
优选地，所述试剂盒用于免疫层析法检测时，所述试剂盒还包括：信号报告探针B及免疫层析试纸条；
所述信号报告探针B包含核酸序列，所述核酸序列的5’端标记第一标记物，3’端标记第二标记物；
所述免疫层析试纸条按样品流动方向依次包括样品垫、含有T线(测试线)和C线(质控线)的层析垫和吸水垫；
所述样品垫含有信号物质标记的抗第二标记物的抗体；
所述T线由能够特异结合抗第二标记物抗体的二抗形成；
所述C线由能够特异结合第一标记物的物质形成。
优选地，所述信号报告探针B的核酸序列为rUrUrUrUrU。
优选地，所述第一标记物为生物素。
优选地，所述第二标记物为FITC。
优选地，所述信号物质为胶体金、荧光团、比色标记、量子点和生物素中的至少一种；进一步为胶体金。
优选地，所述能够特异结合抗第二标记物抗体的二抗为兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗等通用二抗。
优选地，所述能够特异结合第一标记物的物质为链霉亲和素。
本发明的第四方面，提供本发明第三方面的试剂盒在(7)～(12)中任一种中的应用；
(7)制备检测HPV的产品中的应用；
(8)制备检测HPV18的产品中的应用；
(9)制备筛选HPV感染者的产品中的应用；
(10)制备筛选HPV18感染者的产品中的应用；
(11)非诊断目的的HPV检测；
(12)非诊断目的的HPV18检测。
本发明的第五方面，提供一种非诊断目的的HPV或HPV18检测方法，包括如下步骤：
(1)样本提取：取待测样本，提取核酸；
(2)如M1)、M2)或M3)：
M1)：荧光法一步检测：将步骤(1)提取的核酸与上述扩增引物对、CrRNA、Cas蛋白、信号报告探针A、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁、氯化镁混合，进行RT-RPA扩增和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得；
M2)：荧光法两步检测：
M21)RT-RPA扩增：将步骤(1)提取的核酸与上述扩增引物对、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液混合，进行RT-RPA扩增，得到扩增产物；
M22)CRISPR检测：将步骤M21)得到的扩增产物与上述CrRNA、Cas蛋白、信号报告探针A、NTPs、氯化镁、Tris混合，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得；
M3)：免疫层析法两步检测：
M31)RT-RPA扩增：将步骤(1)提取的核酸与上述扩增引物对、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液混合，进行RT-RPA扩增，得到扩增产物；
M32)CRISPR检测：将步骤M21)得到的扩增产物与上述CrRNA、Cas蛋白、信号报告探针B、NTPs、氯化镁、Tris混合，进行CRISPR反应检测，插入上述免疫层析试纸条，即得。
优选地，所述核酸包含DNA和/或mRNA。
优选地，步骤M1)检测的条件为36～38℃下恒温反应15～90min。
优选地，步骤M21)、M31)中RT-RPA扩增的条件为36～38℃下恒温反应25～30min。
优选地，步骤M22)、M32)中检测的条件为36～38℃下恒温反应25～30min。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测HPV18的试剂，可以实现同管一步法稳定、高灵敏地检测HPV18，可检测到个位数的基因拷贝数：无需对RT-RPA扩增产物实行移液操作，从而去除了移液操作产生的扩增产物气溶胶污染的风险，适合于规模化检测；
本发明提供的非诊断目的的HPV18检测方法，反应全程在37℃左右的温度下进行，不需要如PCR扩增那样需要精细的温控元件及复杂的温度变化，非常适合基层单位用相对廉价的即时检测(POCT)设备进行检测，同时，其检测速度快，可在15min～90min有检测结果。
附图说明
图1是实施例2中HPV18-E6-CrRNA与HPV18型E6基因候选引物对(No.1和No.3)组合两步法(荧光法)检测HPV18型的E6基因的扩增曲线图。
图2是实施例2中HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对(No.7和No.9)组合、HPV18-E7-CrRNA2与HPV18型E7基因候选引物对(No.10)组合两步法(荧光法)检测HPV18型的E7基因的扩增曲线图。
图3是实施例3中HPV18型E6基因候选引物对No.1与HPV18-E6-CrRNA组合一步法(荧光法)检测HPV18型的E6基因的扩增曲线图。
图4是实施例3中HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对No.7组合一步法(荧光法)检测HPV18型的E7基因的扩增曲线图。
图5是实施例4中免疫层析试纸条的示意图。
图6是实施例5中HPV18型E6基因候选引物对No.1与HPV18-E6-CrRNA组合一步法(荧光法)检测不同拷贝数的HPV18型的E6基因的扩增曲线图。
图7是实施例5中HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对No.7组合一步法(荧光法)检测不同拷贝数的HPV18型的E7基因的扩增曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1恒温扩增引物对(RPA引物对)的设计与筛选
(1)RPA引物的设计
根据HPV18型的E6和E7基因的序列选择需扩增的目标序列，所选的目标序列应与其他非目标基因同源性较低，分别设计5对候选引物(HPV18型的E6基因的候选引物对为No.1～5，HPV18型的E7基因的候选引物对为No.6～10，具体如表1、2所示)。设计原则一般为：RPA引物长度为28bp～35bp，包括正向引物和反向引物，反向引物的特征在于5’端增加了T7 RNA聚合酶识别区；RPA扩增产物的长度为100bp～200bp；引物的GC含量在30％～70％；避免引物出现连续多个重复碱基；避免引物自身发夹结构和引物间形成二聚体。
表1 HPV18型的E6基因特定片段的候选扩增引物RPA引物对信息
注：下划线为T7 RNA聚合酶识别区；靶序列位置根据NCBI的HPV18基因(NCBI登录号：NC_001357.1)(长度:7857bp)的序列进行确定。
表2 HPV18型的E7基因特定片段的候选扩增引物RPA引物对信息
注：下划线为T7 RNA聚合酶识别区；靶序列位置根据NCBI的HPV18基因(NCBI登录号：NC_001357.1)(长度:7857bp)的序列进行确定。
(2)筛选引物
分别采用杭州众测生物科技有限公司的RT-RPA试剂盒(50μL体系)用HPV18型的E6基因的候选引物对(No.1～5)，HPV18型的E7基因的候选引物对(No.6～10)对人乳头瘤病毒16、18型脱氧核糖核酸液体室内质控品(阳性质控品，购于广州邦德盛生物科技有限公司)进行RT-RPA扩增(以水溶液代替核酸样本进行同样实验作为空白对照)，分别按表3中各组分含量添加各试剂，添加完毕后闭管上下颠倒5次并且短暂离心混匀，37℃反应30min，得到扩增产物。得到的扩增产物进行核酸电泳检测，判定是否有扩增条带以及比对大小是否与目的片段一致。
表3 RT-RPA扩增体系
注：50μL体系用量为1管。
(3)筛选结果
HPV18型E6基因、E7基因扩增引物RPA引物对的筛选结果如表4、5所示：候选引物对No.1、No.3可作为HPV18型E6基因恒温扩增RPA引物对，候选引物对No.7、No.9、No.10可作为HPV18型E7基因恒温扩增RPA引物对。
表4 HPV18型E6基因扩增引物RPA引物对的筛选结果
| 候选引物对 | No.1 | No.2 | No.3 | No.4 | No.5 |
| 空白对照 | - | - | - | - | - |
| 阳性质控品 | + | - | + | - | - |
注：“-”表示核酸电泳检测结果无与目的片段大小一致的扩增条带，“+”表示核酸电泳检测结果有与目的片段大小一致的扩增条带。
表5 HPV18型E7基因扩增引物RPA引物对的筛选结果
| 候选引物对 | No.6 | No.7 | No.8 | No.9 | No.10 |
| 空白对照 | - | - | - | - | - |
| 阳性质控品 | - | + | - | + | + |
注：“-”表示核酸电泳检测结果无与目的片段大小一致的扩增条带，“+”表示核酸电泳检测结果有与目的片段大小一致的扩增条带。
实施例2不同引物/CrRNA组合两步法(荧光法)检测效果
(1)CrRNA序列及探针设计
根据实施例1筛选得到的可作为HPV18型E6基因恒温扩增RPA引物对(No.1、No.3)、可作为HPV18型E7基因恒温扩增RPA引物对(No.7、No.9、No.10)设计对应的特异性CrRNA，CrRNA包含锚定序列和向导序列，锚定序列与Cas蛋白(本实施例为LwaCas13a)特异性识别，向导序列与HPV16型的E6、E7基因特定片段的负链特异性识别，各引物对对应的CrRNA如表6所示。
表6针对HPV18型的E6、E7基因特定片段的CrRNA信息
注：CrRNA序列中，下划线标记的序列为锚定序列，未标记下划线的序列向导序列；靶序列位置根据NCBI的HPV18基因(NCBI登录号：NC_001357.1)(长度:7857bp)的序列进行确定。
委托广州博徕斯生物科技股份有限公司合成ssRNA报告探针，序列信息如表7所示。
表7 LwaCas13a蛋白酶使用的ssRNA报告探针(荧光法)具体序列信息
注：rU表示尿嘧啶核苷酸。
(2)两步法(荧光法)检测HPV18型E6基因、E7基因
1)RT-RPA扩增：分别采用杭州众测生物科技有限公司的RT-RPA试剂盒(50μL体系)用HPV18型的E6基因的候选引物对(No.1、No.3)，HPV18型的E7基因的候选引物对(No.7、No.9、No.10)对人乳头瘤病毒16、18型脱氧核糖核酸液体室内质控品(阳性质控品，购于广州邦德盛生物科技有限公司)进行RT-RPA扩增(以水溶液代替核酸样本进行同样实验作为空白对照)，分别按表3中各组分含量添加各试剂，添加完毕后闭管上下颠倒5次并且短暂离心混匀，37℃反应30min，得到扩增产物。
2)CRISPR检测：分别按表8中各组分含量添加试剂(各组加入对应的CrRNA，具体如表6所示)，添加各试剂完毕后闭管短暂离心混匀，置于恒温荧光检测仪(型号Dhehix-Q5，购于广州双螺旋基因技术有限公司)中，37℃恒温孵育，读取检测6-FAM荧光信号，即得。
表8 LwaCas13a CRISPR检测体系
| 组分 | 加入量(μL) | 终浓度 | 来源 |
| ddH<sub>2</sub>O | 10.6μL | - | - |
| 400mM Tris(pH＝7.4) | 2μL | 40mM | - |
| LwaCas13a | 1μL | 45nM | - |
| RNA酶抑制剂 | 1μL | - | NEB公司(M03145) |
| 1.25μM各组CrRNA溶液 | 1μL | 62.5nM | 广州博徕斯合成 |
| 12.5μM ssRNA报告探针母液 | 1μL | 0.625uM | 广州博徕斯合成 |
| NTPs | 0.8μL | 800nM | NEB公司(N0450S) |
| T7RNA聚合酶 | 0.6μL | - | NEB公司(M0251S) |
| 120mM MgCl<sub>2</sub>溶液 | 1μL | 6mM | - |
| 步骤1)得到的RT-RPA产物 | 1μL | - | - |
3)筛选结果
HPV18-E6-CrRNA与HPV18型E6基因候选引物对(No.1和No.3)组合两步法(荧光法)检测HPV18型的E6基因的荧光检测结果如图1所示：HPV18型E6基因候选引物对No.1与HPV18-E6-CrRNA组合对于阳性质控品的检测荧光值增长最快，检测灵敏度最高，效果最好，而HPV18型E6基因候选引物对No.3与HPV18-E6-CrRNA组合与空白对照相当，检测荧光值基本无增长。因此，以HPV18型E6基因候选引物对No.1与HPV18-E6-CrRNA组合作为HPV18型E6基因检测的恒温扩增RPA引物对和CrRNA。
HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对(No.7和No.9)组合、HPV18-E7-CrRNA2与HPV18型E7基因候选引物对(No.10)组合两步法(荧光法)检测HPV18型的E7基因的荧光检测结果如图2所示：HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对(No.7和No.9)组合、HPV18-E7-CrRNA2与HPV18型E7基因候选引物对(No.10)组合对于阳性质控品的检测荧光值均有增长，其中HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对No.7组合对于阳性质控品的检测荧光值增长最快，检测灵敏度最高，效果最好。选用HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对(No.7和No.9)组合、HPV18-E7-CrRNA2与HPV18型E7基因候选引物对(No.10)组合作为HPV18型E7基因检测的恒温扩增RPA引物对和CrRNA。
实施例3引物/CrRNA组合一步法(荧光法)检测效果
取杭州众测生物科技有限公司的RT-RPA试剂盒(100μL体系)及不同的引物对及其对应CrRNA(HPV18型E6基因候选引物对No.1与HPV18-E6-CrRNA、HPV18-E7-CrRNA1与HPV18型E7基因候选引物对No.7组合)按表9中各组分含量配置检测混合液，充分混匀后取24μL混合液，加入1μL核酸样品(以序列如HPV18基因(NCBI登录号：NC_001357.1)的第105～581位核苷酸序列所示的HPV18型E6基因、序列如HPV18基因(NCBI登录号：NC_001357.1)的第590～907位核苷酸序列所示的HPV18型E7基因作为阳性质控品；以水溶液代替核酸样本进行同样实验作为空白对照，阴性对照为HPV16型基因(NCBI登录号：NC_001526.4)，阳性质控品、阴性对照的核酸浓度为2.0ng/μL)，混匀后，置于37℃恒温孵育，进行RT-RPA扩增和CRISPR反应检测，同时读取检测荧光信号，结果如图3、4所示：靶向HPV18型E6基因的荧光检测结果图中，空白对照与阴性对照未见明显荧光扩增信号，阳性质控品中产生明显荧光扩增信号，若将阈值定为2000，则约25min左右可得检测结果；靶向HPV18型E7基因的荧光检测结果图中，空白对照与阴性对照未见明显荧光扩增信号，阳性质控品中产生明显荧光扩增信号，若将阈值定为2000，则约30min左右可得检测结果。
表9检测反应液体系
注：终浓度*按配制后加入待检样本(4μL)后总体积为100μL的体积计算；本体系用杭州众测RT-RPA试剂盒中RT-RPA酶制剂冻干粉的100μL体系用量构建100μL检测反应液体系，100μL体系用量为1管。
实施例4引物/CrRNA组合两步法(免疫层析试纸条法)检测效果
1)探针设计
委托广州博徕斯生物科技股份有限公司合成ssRNA报告探针，其核酸序列的5’端标记第一标记物(本实施例为生物素)，3’端标记第二标记物(本实施例为FITC)，序列信息如表10所示。
表10 LwaCas13a蛋白酶使用的ssRNA报告探针(免疫层析试纸条法)具体序列信息
2)免疫层析试纸条
本实施例中免疫层析试纸条选取Milenia Biotec公司的HybriDetect侧向流动试纸条(产品编号MGHD1)，免疫层析试纸条按样品流动方向依次包括含有信号物质标记抗体的样品垫(本实施例中的信号物质为胶体金，抗体为抗ssRNA报告探针的第二标记物FITC的抗体--anti-FITC抗体)、含有T线和C线的层析垫(质控线(C线)包被过量的能够特异结合探针第一标记物的物质(本实施例为生物素配基—链霉亲和素)，测试线(T线)包被能够特异结合抗探针第二标记物抗体的二抗(本实施例为兔抗鼠二抗))和吸水垫(示意图如图5所示)。
当检测结果为阴性时，C线显色而T线不显色；当检测结果为阳性时，C线与T线均显色或者C线不显色T线显色。
3)引物/CrRNA组合两步法(免疫层析试纸条法)检测效果
S1：RT-RPA扩增：方法同实施例2，区别仅在于：引物分别为：HPV18型E6基因候选引物对No.1与HPV18型E7基因候选引物对No.7；还包括阴性对照(使用HPV16型基因(NCBI登录号：NC_001526.4)作为核酸样本)；
S2：CRISPR检测：方法同实施例2，区别仅在于：CrRNA分别为HPV18-E6-CrRNA、HPV18-E7-CrRNA1)，37℃恒温孵育30min后，加入80μL Milenia Biotec公司的HybriDetect试剂盒缓冲液，并插入免疫层析试纸条泳动显色。
4)试纸条显色结果
靶向HPV18型E6基因、E7基因的免疫层析试纸条检测结果分别如表11、12所示：本实施例提供的试剂盒(试纸条、RT-RPA反应体系、CRISPR反应体系)可以准确检测HPV18型E6基因、E7基因。
表11靶向HPV18型E6基因的免疫层析试纸条检测结果
| 质控线C线 | 测试线T线 | |
| 空白对照 | + | - |
| 阴性对照 | + | - |
| 阳性质控品 | + | + |
注：“-”表示免疫层析试纸条对应区域无显色，“+”表示免疫层析试纸条对应区域有显色。
表12靶向HPV18型E7基因的免疫层析试纸条检测结果
| 质控线C线 | 测试线T线 | |
| 空白对照 | + | - |
| 阴性对照 | + | - |
| 阳性质控品 | + | + |
注：“-”表示免疫层析试纸条对应区域无显色，“+”表示免疫层析试纸条对应区域有显色。
实施例5引物/CrRNA组合一步法(荧光法)检测效果
本实施例的方法与实施例3相同，区别仅在于：核酸样品为含不同HPV18型E6、E7基因(HPV18型E6基因的序列如HPV18基因(NCBI登录号：NC_001357.1)的第105～581位核苷酸序列所示、HPV18型E7基因的序列如HPV18基因(NCBI登录号：NC_001357.1)的第590～907位核苷酸序列所示)拷贝数的检测样品，以水溶液代替核酸样本进行同样实验作为空白对照。结果如图6、7及表13、14所示：靶向HPV18型E6基因不同拷贝数的荧光检测结果图/表中，空白对照未见明显荧光扩增信号，阳性质控品中检测到明显的荧光扩增信号，根据所设置的不同荧光阈值，可在15～85min内检测到阳性结果，并且可检测到个位数(4)的基因拷贝数(10拷贝数以内)，具有高灵敏度；靶向HPV18型E7基因不同拷贝数的荧光检测结果图/表中，空白对照未见明显荧光扩增信号，阳性质控品中检测到明显的荧光扩增信号，根据所设置的不同荧光阈值，可在34～69min内检测到阳性结果，并且可检测到个位数(6)的基因拷贝数(10拷贝数以内)，具有高灵敏度。
表13靶向HPV18型E6基因不同拷贝数的荧光检测结果
表14靶向HPV18型E7基因不同拷贝数的荧光检测结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州白云山拜迪生物医药有限公司
<120> 检测HPV18的试剂、试剂盒及应用
<130>
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggtgcctgc ggtgccagaa accgttgaat 30
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaattaata cgactcacta taggggtcgt tggagtcgtt cctgtcgtgc tcggt 55
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatttattaa taaggtgcct gcggtgccag 30
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<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaattaata cgactcacta taggggttgg agtcgttcct gtcgtgctcg gttgc 55
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccagaaacc gttgaatcca gcagaaaaac 30
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<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaaattaata cgactcacta taggggttgg agtcgttcct gtcgtgctcg gttgc 55
<210> 7
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<212> DNA
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gtgccagaaa ccgttgaatc cagcagaaaa 30
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<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaaattaata cgactcacta tagggttgtg tttctctgcg tcgttggagt cgttc 55
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agctacctga tctgtgcacg gaactgaaca 30
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaaattaata cgactcacta taggggcaaa ttcaaatacc tctgtaagtt ccaat 55
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agaggaagaa aacgatgaaa tagatggagt 30
<210> 12
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaaattaata cgactcacta tagggcgaag gtcgtctgct gagctttcta ctact 55
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cagaggaaga aaacgatgaa atagatggag 30
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaaattaata cgactcacta tagggaaggt cgtctgctga gctttctact actagc 56
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagaggaaga aaacgatgaa atagatggag 30
<210> 16
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaaattaata cgactcacta tagggctttc tactactagc tcaattctgg cttcac 56
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
taatcatcaa catttaccag cccgacgagc c 31
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaaattaata cgactcacta tagggctcga aggtcgtctg ctgagctttc tactac 56
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gttgtgtatg tgttgtaagt gtgaagcc 28
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gaaattaata cgactcacta taggggcaca ccacggacac acaaaggaca ggg 53
<210> 21
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 21
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccacu auagaggcca gugccauucg 60
ugcu 64
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<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 22
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacguug uguauguguu guaaguguga 60
agcc 64
<210> 23
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 23
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccuag uaguagaaag cucagcagac 60
gacc 64
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gaaattaata cgactcacta taggg 25
<210> 25
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 25
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaac 36
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtcgttggag tcgttcctgt cgtgctcggt 30
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<212> DNA
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aaggtcgtct gctgagcttt ctactactag c 31
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<213> 人工序列
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ctcgaaggtc gtctgctgag ctttctacta c 31
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gcacaccacg gacacacaaa ggacaggg 28
Claims (10)
1.一种试剂，包含：检测HPV18-E6的试剂和/或检测HPV18-E7的试剂；
所述检测HPV18-E6的试剂包含扩增HPV18-E6的引物对和检测HPV18-E6的CrRNA；
所述扩增HPV18-E6的引物对用于扩增HPV18-E6基因特定片段；
所述HPV18-E6基因特定片段的序列如HPV18基因的第414～561位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E6的引物对包括扩增HPV18-E6的正向引物和扩增HPV18-E6的反向引物；
所述扩增HPV18-E6的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E6的反向引物1；
所述检测HPV18-E6的CrRNA包含HPV18-E6-CrRNA的锚定序列和HPV18-E6-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E6-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E6-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第501～528位核苷酸序列特异性识别；
所述检测HPV18-E7的试剂为(1)、(2)或(3)：
(1)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对用于扩增HPV18-E7基因特定片段；
所述HPV18-E7基因特定片段的序列如HPV18基因的第690～838位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E7的反向引物1；
所述检测HPV18-E7的CrRNA包含HPV18-E7-CrRNA的锚定序列和HPV18-E7-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E7-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E7-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第772～799位核苷酸序列特异性识别；
(2)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对用于扩增HPV18-E7基因特定片段；
所述HPV18-E7基因特定片段的序列如HPV18基因的第721～842位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E7的反向引物2；
所述检测HPV18-E7的CrRNA包含HPV18-E7-CrRNA的锚定序列和HPV18-E7-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E7-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E7-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第772～799位核苷酸序列特异性识别；
(3)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对用于扩增HPV18-E7基因特定片段；
所述HPV18-E7基因特定片段的序列如HPV18基因的第772～894位核苷酸序列所示；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的反向引物包含T7 RNA聚合酶识别区和扩增HPV18-E7的反向引物3；
所述检测HPV18-E7的CrRNA包含HPV18-E7-CrRNA的锚定序列和HPV18-E7-CrRNA的向导序列，所述HPV18-E7-CrRNA的锚定序列与Cas蛋白特异性识别，所述HPV18-E7-CrRNA的向导序列与所述HPV18基因的负链的第809～836位核苷酸序列特异性识别。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：
所述T7 RNA聚合酶识别区的序列为GAAATTAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO.24)；
优选地，所述Cas蛋白为Cas13a；
优选地，所述HPV18-E6-CrRNA和HPV18-E7-CrRNA的锚定序列为GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC(SEQ ID NO.25)；
优选地，所述扩增HPV18-E6的反向引物1的序列如SEQ ID NO.26所示；
优选地，所述扩增HPV18-E7的反向引物1的序列如SEQ ID NO.27所示；
优选地，所述扩增HPV18-E7的反向引物2的序列如SEQ ID NO.28所示；
优选地，所述扩增HPV18-E7的反向引物3的序列如SEQ ID NO.29所示。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：
所述检测HPV18-E6的试剂包含扩增HPV18-E6的引物对和检测HPV18-E6的CrRNA；
所述扩增HPV18-E6的引物对包括扩增HPV18-E6的正向引物和扩增HPV18-E6的反向引物；
所述扩增HPV18-E6的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述检测HPV18-E6的CrRNA的序列如SEQ ID NO.21所示；
所述检测HPV18-E7的试剂为(4)、(5)或(6)：
(4)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的正向引物的序列如SEQ ID NO.13所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.14所示；
所述检测HPV18-E7的CrRNA的序列如SEQ ID NO.22所示；
(5)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的正向引物的序列如SEQ ID NO.17所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.18所示；
所述检测HPV18-E7的CrRNA的序列如SEQ ID NO.22所示；
(6)所述检测HPV18-E7的试剂包含扩增HPV18-E7的引物对和检测HPV18-E7的CrRNA；
所述扩增HPV18-E7的引物对包括扩增HPV18-E7的正向引物和扩增HPV18-E7的反向引物；
所述扩增HPV18-E7的正向引物的序列如SEQ ID NO.19所示，所述扩增HPV18-E6的反向引物的序列如SEQ ID NO.20所示；
所述检测HPV18-E7的CrRNA的序列如SEQ ID NO.23所示。
4.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1～3中任一种所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Cas蛋白；
优选地，所述Cas蛋白为Cas13a；
优选地，所述试剂盒还包括RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁、氯化镁和Tris。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括：信号报告探针A；
所述信号报告探针A包含核酸序列，所述核酸序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括：信号报告探针B及免疫层析试纸条；
所述信号报告探针B包含核酸序列，所述核酸序列的5’端标记第一标记物，3’端标记第二标记物；
所述免疫层析试纸条按样品流动方向依次包括样品垫、含有测试线和质控线的层析垫和吸水垫；
所述样品垫含有信号物质标记的抗第二标记物的抗体；
所述测试线由能够特异结合抗第二标记物抗体的二抗形成；
所述质控线由能够特异结合第一标记物的物质形成。
8.权利要求1～3中任一项所述的试剂或权利要求4～7中任一项所述的试剂盒在(7)～(12)中任一种中的应用；
(7)制备检测HPV的产品中的应用；
(8)制备检测HPV18的产品中的应用；
(9)制备筛选HPV感染者的产品中的应用；
(10)制备筛选HPV18感染者的产品中的应用；
(11)非诊断目的的HPV检测；
(12)非诊断目的的HPV18检测。
9.一种非诊断目的的HPV或HPV18检测方法，包括如下步骤：
(1)样本提取：取待测样本，提取核酸；
(2)如M1)、M2)或M3)：
M1)：荧光法一步检测：将步骤(1)提取的核酸与权利要求6中所述的引物对、CrRNA、Cas蛋白、信号报告探针A、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、NTPs、醋酸镁、氯化镁混合，进行RT-RPA扩增和CRISPR反应检测，读取检测信号，即得；
M2)：荧光法两步检测：
M21)RT-RPA扩增：将步骤(1)提取的核酸与权利要求6中所述的引物对、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液混合，进行RT-RPA扩增，得到扩增产物；
M22)CRISPR检测：将步骤M21)得到的扩增产物与权利要求6中所述的CrRNA、Cas蛋白、信号报告探针A、NTPs、氯化镁、Tris混合，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，即得；
M3)：免疫层析法两步检测：
M31)RT-RPA扩增：将步骤(1)提取的核酸与权利要求7中所述的引物对、RT-RPA酶制剂、RT-RPA缓冲液混合，进行RT-RPA扩增，得到扩增产物；
M32)CRISPR检测：将步骤M21)得到的扩增产物与权利要求7中所述的CrRNA、Cas蛋白、信号报告探针B、NTPs、氯化镁、Tris混合，进行CRISPR反应检测，插入权利要求7中所述的免疫层析试纸条，即得。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
步骤M1)检测的条件为36～38℃下恒温反应15～90min；
优选地，步骤M21)、M31)中RT-RPA扩增的条件为36～38℃下恒温反应25～30min；
优选地，步骤M22)、M32)中检测的条件为36～38℃下恒温反应25～30min。
Priority Applications (1)
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