JP5816094B2 - 核酸の増幅のおよび/または検出の方法、キット及びこの方法の使用 - Google Patents
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Description
a)興味がある前記核酸の1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的にまたは酵素で処理する工程;
b)興味がある前記変換された核酸を特異的に増幅することを目的とする増幅プライマーであって、各プライマーが異なる3種類の塩基で構成されている増幅プライマーを添加する工程;
c)前もって合成された前記プライマーと、水溶液、溶媒、ヌクレオチド、酵素のような増幅のために必要な試薬を、これらの処理後に、生物学的サンプルに添加する工程;
d)増幅および/または変換された核酸の検出ができるような条件下に前記溶液と試薬を置く工程を含む方法に関する。
a)興味がある前記核酸の少なくとも1つの種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的にまたは酵素で処理する工程;
b)興味がある核酸の増幅により生じたアンプリコンを特異的に増幅すること及び検出することをそれぞれ目的とする増幅プライマー及び検出プローブであって、各プライマー及びプローブが異なる3種類の塩基で構成されている増幅プライマー及び検出プローブを添加する工程;
c)前もって合成された前記プライマー及びプローブと、水溶液、溶媒、ヌクレオチド、酵素のような増幅及び検出のために必要な試薬を、これらの処理後に、生物学的サンプルに添加する工程;
d)変換された核酸の増幅および/または生成されたアンプリコンの検出ができるような条件下に前記溶液と試薬を置く工程を含む方法に関する。
a)興味がある前記核酸の少なくとも1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる薬剤;
b)変換された興味の核酸又は生成されたアンプリコンに適した増幅プライマー及び場合により検出プローブであって、これらの配列が3つの異なる種類の塩基で構成されている増幅プライマー、及び場合により検出プローブ;
c)水溶液、溶媒、ヌクレオチド、酵素のような増幅及び場合により検出に必要とされる試薬を含むキットに関する。
キットのある実施態様によれば、変換剤は、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)、亜硫酸水素アンモニウム(NH4HSO3)、亜硫酸水素マグネシウム(MgHSO3)、メタ重亜硫酸ナトリウム(Na2S2O5)、亜硫酸水素ナトリウムまたはスルフィン酸を含む群から選択される。
キットの別の実施態様によれば、薬剤はアデノシンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼを含む群から選択される。
本発明は、最終的に、真正細菌および/または菌類および/またはウイルスおよび/またはイーストの標的を増幅するために、上記方法の使用又はキットの使用に関する。変形の使用によれば、増幅プライマーは細菌の属に特異的であり、各々の検出プローブは少なくとも一つの細菌の種に特異的である。
以下の用語は、単数形又は複数形で区別なしに使用することができる。
さらに、核酸は、場合により、少なくとも一つのイノシンおよび/または少なくとも一つの修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。
さらに、核酸は、ヌクレオチド間結合のレベル、例えばホスホロチオネート、H−ホスホネート、アルキルホスホネートでの修飾でもよく、例えばα−オリゴヌクレオチド(FR−A−2607507)またはポリアミド核酸(PMA)(Egholm M. et al.; J. Am. Chem. Soc.; 1992; 114; 1895-97)または2’−O−アルキル−リボヌクレオチドおよび/または2’−O−フルオロヌクレオチドおよび/または2’−アミンヌクレオチドおよび/またはアラビノースヌクレオチド及びLNA(Sun B.W. et al., Biochemistry; 2004; Apr 13; 43 (14): 4160-69)のような主鎖レベルの修飾でもよい。2’−O−アルキル−リボヌクレオチドの中で、2’−O−メチルリボヌクレオチドが好ましいが、5−プロピニルピリミジンオリゴヌクレオチドもまた使用することができる (Seitz O., Angewandte Chemie International Edition 1999; 38(23); Dec: 3466-69)。
「ヌクレオチド」なる用語は、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドを規定する。
特許US−A−4683195、US−A−4683202及びUS−A−4800159に記載されているPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、特許EP−B−0569272にて記載されている、特に1段階様式の派生的なRT−PCR(逆転写PCR)。
好ましくは、PCRは、一本鎖について、単一のプライマー対で実施される。
例えば特許出願EP−B−0201184に開示されているLCR(リガーゼ連鎖反応)、
特許出願WO−A−90/01069に記載されているRCR(修復連鎖反応)、
特許出願WO−A−90/06995の3SR(自家持続配列複製法)、
特許出願WO−A−91/02818のNASBA(核酸配列ベース増幅)、
特許US−5399491のTMA(転写介在増幅)及び
特許US−6576448に記載されているRCA(ローリングサークル増幅)。
RT−PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)。
「溶液」なる用語は、均質又は不均一な水溶液を示す。「固体支持体」は粒子を意味し、ラテックス、ガラス(CPG)、シリカ、ポリスチレン、アガロース、セファロース、ナイロン等であってもよい。これらの材料は、場合により磁性材料のカプセル化を許可してもよい。更に、それはフィルター、フィルム、メンブレンまたはストリップであってもよい。これらの材料は、当業者によく知られている。標的は、DNAおよび/またはRNAの一本鎖又は二本鎖の形態の、混合物中に存在するウイルス、細菌、菌類、または酵母核酸であってもよい。通常は、標的は50から10000ヌクレオチドの長さであるが、多くの場合、100から1000ヌクレオチドである。
アンチセンス3塩基プライマー(P3B2)は、センスプライマーから合成される核酸のヌクレオチド配列の少なくとも部分に相補的である。これらのプライマーは、10から100ヌクレオチドのサイズであり、好ましくは12から50であり、より好ましくは、15から30ヌクレオチドである。使用される増幅技術に従い、プライマーは、変換された標的へハイブリダイズする配列に加えて、NASBAまたはTMA型の転写後増幅の場合、プロモーター(例えばT3、T7またはSP6)のヌクレオチド配列を含むことができる。これらの転写後増幅の場合、プライマーが、4種類の異なる塩基のヌクレオチドから成るヌクレオチド配列である配列(プロモータ配列)及び3種類の異なる塩基のヌクレオチドから成るヌクレオチド配列である配列(変換された標的へのプライマーのハイブリダイズができるような配列)の部分から構成されることは、当業者によく知られている。
プローブのこれらの最後の3種類は、当業者にとってよく知られている。これらのプローブは、場合により修飾されたヌクレオチドから、完全にまたは部分的に構成されてもよい。各々のプローブは、マーカーと、場合によりクエンチャーを有する。
従って、C3BはC3Bcに相補的である:
これは、CNTに比較して完全に異なる:
(1)初めに、変換は水酸化ナトリウム(NaOH)による標的の変性から開始し、次に、亜硫酸水素ナトリウムとハイドロキノン(後者は、亜硫酸水素塩の酸化を制限することができる)の付加。
(2)次に 標的はカラム濾過によって精製される。
(3)標的は、塩基性媒体中で脱スルホン酸化される。
(4)終わりに、最後のカラム精製は、増幅される準備ができている変換された標的を与える。
1)そのなかにはShapiro及びHayatsuを含む最初期の仕事がある:
・「Reaction of Cytosine and Uracil with sodium bisulfite" Shapiro R. et al., J. Biol. Chem.; 1973; Jun; 248: 4060-64」及び
・「The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine" Hayatsu H. et al., J. Am. Chem. Soc.; 1970; 40(26): 724-26」。
これは、多数の文献がこの分野で出版されているが、その時点では、診断法においての意味を実際には定義していないことを証明する。
2)同一起源の種に属している一組の核酸を増幅するために、一群の非縮重プライマーを使用する、亜硫酸水素塩によるDNAの処理の技術に関する特許出願:
・細菌(WO-A-2006/058393及びWO-A-2007/140506)、及び
・ウイルス(WO-A-2007/030882)。
3)DNAのゲノム配列のメチル化のモティーフを検出するための亜硫酸水素塩による核酸の処理方法方法の改良:Clark S.J., Nucleic. Acids Res.; 1994 August 11; Vol. 22 (15): 2990-97の「High Sensitivity mapping of methylated cytosines」。
4)亜硫酸水素塩による核酸の処理方法、固体支持体に取り付けられる核酸に適している処理方法の新規開発(EP−B−1590362及びEP−A−1394173)。
5)ゲノムDNAの配列決定のための亜硫酸水素塩による核酸の処理とメチル化されたシトシンのモティーフの同定の最高水準の技術をまとめたする刊行物。この概要は、亜硫酸水素塩技術の開発者によって記載された:Hayatsu H., Mut. Research; 2008; 659: 77-82。
従って、目的は、以下の有利な条件を有する方法を提供することである:
1)単純且つ迅速、
2)増幅工程の直前に使用できる、
3)高収率で標的を変換することができる、
4)PCR及びいわゆる転写後増幅(NASBAとTMA)を含む多数の増幅技術と互換性を持つ。
5)自動化することができ、強力なおよび/または磁気支持体に適用することができる。
(目的)
亜硫酸水素塩によって、4種類の塩基A、T、G、C、すなわちA(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)とC(シトシン)を有する生物学的標的を、4つの塩基A、T、GとU(ウラシル)を有する標的に変換することを例証するためである。
(手順)
変換は、市販キットZYMO―EZ DNAメチル化−GoldTMキット、ZYMOリサーチ、#D5005(Orange、CA 92867−アメリカ合衆国)によって、キットと共に提供されたプロトコルに従って行われる。変換される標的は、細菌の大腸菌O157、#IRMM449-1EA、Sigma-Aldrich Chimie(L'Isle d'Abeau Chesnes−フランス)から抽出される500〜4000の二本鎖ヌクレオチドのゲノムDNAの市販のサンプルである。
亜硫酸水素塩による変換:キットのプロトコルに従って、130μlのCT変換試薬を20μlの試料(大腸菌から抽出したゲノムDNAの200ngに相当する)に添加する。混合物は、標的の大腸菌ゲノムの変性のために、98℃で10分間、次に64℃で150分、4℃で5分間インキュベートする。これは、変換された標的を含む溶液を生じる。
精製:キットの結合バッファーと呼ばれている固定バッファーの600μlは、変換された標的を含む150μlの溶液に加える。混合物は、キットで供給されているカラムに置かれて、10000xgで30秒間遠心分離機にかけられる。洗浄バッファーの容量100μlはカラムに置かれて、12000xgで30秒間遠心分離機にかけられる。
脱スルホン化:脱スルホン・バッファーの容量200μlは同じカラムに置かれて、室温で15分間インキュベートされて、次に12000xgで30秒間遠心分離機にかけられる。次に、カラムは、洗浄バッファーの200μlを加えることによって二回洗われて、12000xgで30秒間遠心分離機にかけられる。
溶出:カラムは、きれいなチューブに置かれる。溶出バッファー(M−Elutionバッファーと呼ばれている)の容量10μlはカラムの中央に置かれ、12000xgで30秒間遠心分離機にかけられる。10μlの溶出液は、亜硫酸水素塩によって変換されるDNAを含み、増幅のために使われる準備ができる。次に、大腸菌由来のgDNAの変換された試料は、ヌクレアーゼP1(13U)(N8630-1VL、Sigma Aldrich、St Louis, U.S.A.)とアルカリホスファターゼ(3U)(P7923-2KU、Sigma Aldrich, St Louis, U.S.A.)の混合物は、一晩37℃で加水分解される。次に、加水分解されたゲノムDNAは、HPLCによって分析される。
HPLCの条件とエレクトロスプレー・イオン化質量分析による検出:
このために、以下を使用する:
・WATERS Alliance 2795 HPLC チェーン (Milford, Connecticut (CT) USA),
・WATERS XTerra MS C18カラム (Milford, CT, USA) 4.6 x 30 2.5μm, 30℃で1ml/分の流速で、pH7の10mMの蟻酸アンモニウム中でアセトニトリルの以下の直線的勾配によって使用:0%〜5%(4分);5%〜12%(5分);12%〜90%(2分)及び90%〜0%(3分)。
・PDA 996ダイオードアレイ検出器、ソフトウェア・エンパワーバージョン2(Milford, CT, USA)、質量検出器(ZQ Electrospray WATERS (Milford, CT, USA))。
図3(a)は、亜硫酸水素塩によって変換されない大腸菌由来の加水分解されたgDNAの組成物の、エレクトロスプレー・イオン化質量分析(ESI)による解析の結果を示す。ヌクレオシドの4つの種類に対応する4つのメインピークを見ることができる:デオキシアデノシンdA、デオキシチミジンdT、デオキシグアノシンdG、デオキシシトシンdC及びデオキシイノシンdIの痕跡。デオキシイノシンは、アデノシンデアミナーゼがデオキシアデノシンに及ぼす酵素作用から来る。アデノシンデアミナーゼは、アルカリホスファターゼの市販の調製物の痕跡レベルで見いだされる混入物である。
図3(b)は、亜硫酸水素塩による変換後に大腸菌由来の加水分解されたgDNAの組成物の解析を示す。デオキシウリジンdUに対応する新規な溶出ピーク(ピーク7)の出現とdCのピーク(ピーク2)の準消失である。他の溶出ピーク(ピーク3、4及び5)は変わらず、dG、dT及びdAの存在に対応する。このクロマトグラムはこのDNAが4つのヌクレオシドdU、dA、dT及びdGから成ることを示す。この例では、これらの実験条件の変換効率は80%である。この効率は、処理される興味のDNAのサイズの関数である。変換率(または効率のレベル)は、短い断片のDNAの、非常に高くなる。この実験条件において、処理されたDNAは、大腸菌由来のゲノムDNAであり、すなわち大きな長さの標的DNAであり、変性して変換するのが非常に困難である。しかしながら、大部分のdCのdUへの変換が証明されている。
(目的)
発想の証明、すなわち、3塩基プライマー(P3B1とP3B2)と塩基プローブ(S3B)を使用して行われる真正細菌のNASBAは、混入細菌標的のような天然標的(CNT)を増幅することなしに、3塩基合成標的の増幅と特異的な検出ができることを実証することである。検出は、4塩基検出プローブまたはプローブ(S3B)を検出している3−塩基検出プローブによってリアルタイムにおいて遂行される。
(手順)
このテストは、真正細菌のNASBAを実施することによって、増幅を行う:一方では
−CNTと呼ばれる4−塩基オリゴヌクレオチド標的の希釈シリーズ、4塩基プライマー(PNT1とPNT2と呼ばれる)及び4塩基検出プローブ(SNT)、A、T、GとCである4種類の塩基;
一方では:
−C3Bと呼ばれる3−塩基オリゴヌクレオチド標的の希釈度シリーズ、プライマー(P3B1とP3B2)及びC3Bとハイブリダイズできる3−塩基検出プローブ。希釈シリーズは、テストにつき0から107コピーの標的である。
オリゴヌクレオチド標的、プライマー及びプローブをEurogentec(Seraing, Belgium)に注文し、それらは亜硫酸水素塩の変換なしに、以下の配列を有する:
これらの配列において、プロモータT7の配列は小文字に対応する;検出プローブが分子ビーコンである時は、ループの配列はステムの大文字で示され、ステムの配列は太字の小文字で示される。NASBA増幅は、キットNASBA NucliSENS EasyQ HIV−1 v1.2(ref. 285036、ビオメリュー、Marcy l'Etoile, France)で供給される製造業者の指示に従って行われる。簡潔には、増幅混合物(ミックス)と酵素混合物は、以下の通りに調製される:
増幅混合物(8チューブ用の量):
・NASBA等級の水(NASBA水と呼ばれている):11.2μl
・試薬希釈液:64μl
・KCl:12.8μl、
・試薬の粒子:1粒、及び
・プライマーとプローブの混合物:8μl
酵素混合物(8チューブ用の量):
・酵素希釈剤:45μl(8チューブ用)、及び
・試薬の粒子:1粒、
4塩基標的のNASBA増幅の場合、標的CNTのNASBA増幅は、図4の曲線(a)に対応し、混入している核酸は非常に強く増幅されているが、4塩基標的のNASBA増幅の場合、図4の曲線(b)のシグナルは非常に弱いままであることが分かる。これは、プライマーP3B1とP3B2による混入物の増幅はほとんどないこと、及びプローブS3Bによるそれらの検出はほとんどないことを証明するものである。
図6Aは、プライマーPNT1及びPNT2によって実施されるNASBA増幅がネガティブコントロール(テストにつき0コピー)から特異的な標的CNTを区別しないことを示す(テストにつき0から107コピーの濃度)。反対に、3塩基標的C3B(図6B)上のプライマーP3B1とP3B2によって行われるNASBA増幅は、良好な検出感度を有する特異的な標的C3Bの希釈シリーズを与える。この例では、感受性は、テストにつき103コピーである。
結論:
この実験は、約4つのログの標的の検出感度の増加ができるようにするように、3−塩基標的上のこの増幅によって提供される有利な条件を明確に示す。標的CNTのNASBA増幅の実験において、ネガティブコントロールは、約10e7コピー/テストに対応するシグナルと同定され、一方でこのシグナルは標的C3BのNASBA増幅において10e3コピー/テストより下である。
目的:
4塩基プライマー(PNT)と4塩基プローブ(SNT)による天然標的(CNT)上の真正細菌のPCRによる増幅に比較した、3塩基標的(C3B)に特異的な3塩基プライマー(P3B)を使用した真正細菌のPCRによる増幅後の3塩基合成細菌の標的(C3B)の検出感度の増加を示すことである。
手順:
真正細菌のPCR増幅は、Taqman(登録商標)、SNTまたはS3Bと呼ばれる蛍光検出プライマーとプローブを使用して実施される。標的は、4塩基配列(CNTのためのA、T、G、C;配列番号8)または3塩基配列(C3BのためのA、T、G;配列番号12)を有する92ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドである。増幅は、テストにつき0から105コピーの範囲の標的の希釈度で実施される。
増幅は、キット・ロシュLightCycler FastStart DNAマスターHyprobe、#030003248001(Basle, Switzerland)で供給される製造業者の指示書に従って行われる。使用するプライマー及びプローブの配列は、以下の通りである:
ヌクレオチド2’−O−Meは、3塩基プローブの配列のC塩基の消失と連結されたハイブリダイゼーション温度の減失に補うことを可能にする。このTaqMan(登録商標)プローブの設計のウラシル(この場合、修飾したウラシル)の点導入は、アンプリコンによるハイブリダイゼーションを改良することを可能にする。
増幅混合物:(1チューブ用)
・PCR用の水:10.4μl
・プライマーP1(10μM):1μl
・プライマーP2(10μM):1μl
・プローブ(2.5μM):2μl
・MgCl2(25mM):1.6μl及び
・増幅混合物(10xマスターミックス):2μl。
最終的な増幅混合物は95℃で10分間プレインキュベートし、次に95℃10秒の変性段階、50℃15秒のハイブリダイゼーション段階、60℃15秒で伸長段階からなる45サイクルで増幅される。増幅は、95℃で5分間のインキュベーションによって止められる。伸長サイクルの間、蛍光は、530nmで読みとられる。
従って、CNT標的の真正細菌PCRの感受性は、テストにつき103コピーである。
図7Bにおいて、3−塩基オリゴヌクレオチド標的(C3B)上の真正細菌のPCR増幅は、優れた感受性を示し、ネガティブコントロールでは水平のままである曲線を有し、テストにつき10コピーより大きい感受性を有する。
結論:
この実験は、3−塩基合成標的C3B上の真正細菌のPCR増幅を使用することが4つのログの感受性の増加を与えることを示す。
3塩基標的の増幅の感受性は、増幅技術及び使用する検出の手段とは独立している。これらの実験は、増幅技術及び使用した3塩基の検出プローブの形態を問わず、本発明の3塩基標的の増幅の感受性は、天然標的(CNT)の従来の増幅のそれよりはるかに大きいことを示す。
目的:
合成モデル上の例証後(実施例2と3)、アッセイは、亜硫酸水素塩によって実験的に変換される現実の生物学的モデルについて行われる。目的は、変換されて次に変換された標的に特異的なP3B増幅プライマーを使用してPCRによって増幅された細菌標的の検出感度の増加を示すことである。
手順:
この例証は、市販の変換キットZymo Researchを使用して、キットの供給元の指示書に従って行われる(実施例1を参照)。変換は、50〜4000ヌクレオチドの核酸から成る大腸菌(O157、シグマIRMM449-1EA)由来のゲノムDNAの抽出物について行われる。真正細菌のPCR増幅は、実施例3に記載されているものと同じ実験条件、同じプライマーと同じ検出プローブにより、実施される。蛍光は、伸長サイクルの間、530nmで読みとられる。
図8Bは、大腸菌由来のDNAが亜硫酸水素塩による処理後に変換された実験条件に対応する。この変換されたDNA(4−塩基が変換された標的)は、4種類の異なる塩基(すなわち、A、T、G、U)を有するヌクレオチド配列から成る。本発明によるプライマー(3−塩基プライマー)によって変換されたこのDNAの増幅は、3種類の異なる塩基を有するヌクレオチド配列で構成されるアンプリコンを生成する:A、T、CまたはA、T、G。
図8Aで示したように、大腸菌由来の変換されていないDNAの真正細菌のPCR増幅の場合、感受性のレベルは、テストにつき1000Ceqである。テストにつき0Ceqのネガティブコントロールは、テストにつき100Ceqと区別がつかない。この図は、標的DNAの100000コピーの閾値以下で、使用するさまざまな試薬に存在する混入DNA由来の標的DNAを区別することが可能でないことを示す。
図8Bは亜硫酸水素塩による試料の変換及び真正細菌のPCR増幅後に、得られた感受性のレベルはテストにつき0.1から1Ceqまでであることを示す。ネガティブコントロールは、非常に弱いシグナルを与える。この実験は、本発明による方法が、全ての混入成分を避けることを可能にし、感受性の非常に有意な増加を得ることを可能にすることを示す。
さらに、我々の実験条件の大腸菌由来のゲノムDNAの変換の効率が80%(上記を参照)であるにもかかわらず、検出感度は比較的高く、変換されなかった大腸菌由来のゲノムDNAの20%に影響を受けているように見えない。ゲノムDNAのこの20%が塩基の種類のレベルで変化しなかった場合、それはその事実自体によって混入となり、本発明の方法によって増幅されない。
結論:
亜硫酸水素塩によって変換された細菌DNAの標的上の真正細菌のPCR増幅のこの実施例は、試料のこの処理が提供することができる感受性の増加を明らかに示す。実際には、感受性の増加は、4つのログの中である。変換処理の効率のレベルが100%近くでない場合であっても、亜硫酸水素塩による前処理を伴う増幅を使用することによって、ネガティブコントロール由来の信号は、消されることができる。
従って、抽出試薬、精製試薬及び増幅試薬に存在する細菌性の混入成分を完全に避けるための選択肢の方法である。
Claims (33)
- 興味の核酸を含む生物学的サンプル中の興味の核酸を特異的に増幅する方法であって、
a)前記興味の核酸の少なくとも1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的にまたは酵素的に処理する工程、
b)前記変換された興味の核酸を含む生物学的サンプルに、増幅プライマー及び増幅試薬を添加する工程であって、各プライマーが3つの異なる種類の塩基で構成されており、プライマーがα−オリゴヌクレオチド、PNA、LNA、及び2’−O−アルキルリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一の修飾ヌクレオチドを含み、増幅試薬は塩基変換のために化学的又は酵素的に処理されていない、工程、及び
c)変換された興味の核酸を増幅する工程を含み、
混入核酸の供給源である増幅試薬を生物試料に添加する前に、1種類の核酸塩基を別の種類の塩基に変換することによって、混入核酸の増幅が回避され、且つ
該方法により、核酸増幅のために使用される試薬や器材に存在する混入核酸を回避することができ、試薬及び器材を汚染除去することを不必要とする、方法。 - 興味の核酸を含む生物学的サンプル中の興味の核酸を特異的に検出する方法であって、
a)前記興味の核酸の少なくとも1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させるために生物学的サンプルを化学的に又は酵素的に処理する工程、
b)生物学的サンプルに、増幅プライマー、少なくとも一の検出プローブ、及び増幅試薬を添加する工程であって、各プライマー及びプローブが異なる3種類の塩基で構成されており、プライマーがα−オリゴヌクレオチド、PNA、LNA、及び2’−O−アルキルリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一の修飾ヌクレオチドを含み、増幅試薬は塩基変換のために化学的又は酵素的に処理されていない、工程、
c)前記変換された興味の核酸を増幅し、アンプリコンを得る工程、及び
d)増幅の結果物として得られたアンプリコンを検出する工程を含み、
混入核酸の供給源である増幅試薬を生物試料に添加する前に、1種類の核酸塩基を別の種類の塩基に変換することによって、混入核酸の増幅が回避され、且つ
該方法により、核酸増幅のために使用される試薬や器材に存在する混入核酸を回避することができ、試薬及び器材を汚染除去することを不必要とする、方法。 - 精製の少なくとも一の工程が工程a)とb)との間で実施されることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 生物学的サンプルに含まれる核酸を抽出する少なくとも一の工程が工程a)の前に実施されることを特徴とする請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 増幅プライマーが、変換された興味の核酸に又はそれらに相補的な核酸に特異的であることを特徴とする請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 少なくとも一の検出プローブが変換された標的及びアンプリコンに特異的であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 異なる3種類の塩基で構成されるプローブが少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項2から6の何れか一項に記載の方法。
- 修飾されたヌクレオチドがα−オリゴヌクレオチド、PNA、LNA、2’−O−アルキルリボヌクレオチドを含む群から選択されることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 修飾されたヌクレオチドが2’−O−メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- 前記プライマーが2’−O−メチルリボヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1から9の何れか一項に記載の方法。
- 1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる化学処理が、硫黄含有化学物質の作用によって遂行されることを特徴とする請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる化学剤が、亜硫酸水素イオン(HSO3 −)を含むことを特徴とする請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる化学剤が、亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)、亜硫酸水素アンモニウム(NH4HSO3)、亜硫酸水素マグネシウム(MgHSO3)、メタ重亜硫酸ナトリウム(Na2S2O5)、亜硫酸水素ナトリウム及びスルフィン酸からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる酵素の薬剤がシトシンデアミナーゼであることを特徴とする請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 化学処理又は酵素処理が1種類の塩基をウラシル(U)に変換することから成ることを特徴とする請求項1から14の何れか一項に記載の方法。
- 化学処理又は酵素処理がシトシン(C)をウラシル(U)に変換することから成ることを特徴とする請求項1から15の何れか一項に記載の方法。
- 変換された興味の核酸にハイブリダイズする第1のプライマーが、アデニン(A)、シトシン(C)及びチミン(T)から形成され、前記第1のプライマーの伸長から生じた鎖にハイブリダイズする第2のプライマーが、アデニン(A)、グアニン(G)及びチミン(T)から形成されることを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる酵素の薬剤がアデノシンデアミナーゼであることを特徴とする請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- 酵素処理がアデニン(A)をヒポキサンチンに変換することからなることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 変換された興味の核酸にハイブリダイズする第1のプライマーが、アデニン(A)、シトシン(C)及びグアニン(G)から形成され、前記第1のプライマーの伸長から生じた鎖にハイブリダイズする第2のプライマーがシトシン(C)、グアニン(G)及びチミン(T)から形成されることを特徴とする請求項18又は19に記載の方法。
- 実施される増幅がRT−PCR増幅であることを特徴とする請求項1から20の何れか一項に記載の方法。
- 実施される増幅が一本鎖上のPCR増幅であることを特徴とする請求項1から20の何れか一項に記載の方法。
- 実施される増幅が二本鎖上のPCR増幅であることを特徴とする請求項1から20の何れか一項に記載の方法。
- 増幅が変換された興味の核酸の各々の鎖に特異的な2対の増幅プライマーによって遂行されることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 実施される増幅が転写後増幅であることを特徴とする請求項1から20の何れか一項に記載の方法。
- 転写後増幅がNASBAまたはTMAである、請求項25に記載の方法。
- 興味の核酸がデオキシリボ核酸(DNA)および/またはリボヌクレイン酸(RNA)であることを特徴とする請求項1から26の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1から27の何れか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
a)前記興味の核酸の少なくとも1種類の塩基を別の種類の塩基に変換させる薬剤;及び
b)異なる3種類の塩基で構成されており、α−オリゴヌクレオチド、PNA、LNA、及び2’−O−アルキルリボヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも一の修飾ヌクレオチドを含む増幅プライマー、及び増幅試薬
を含むキット。 - 前記キットは、更に
c)形成されたアンプリコンに適合している少なくとも一の検出プローブであって、3種類の塩基で構成されている検出プローブ;及び
d)検出に必要とされる試薬
を含む、請求項28に記載のキット。 - 前記薬剤が亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)、亜硫酸水素アンモニウム(NH4HSO3)、亜硫酸水素マグネシウム(MgHSO3)、メタ重亜硫酸ナトリウム(Na2S2O5)、亜硫酸水素ナトリウム及びスルフィン酸からなる群から選択されることを特徴とする、請求項28又は29に記載のキット。
- 薬剤がアデノシンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼを含む群から選択されることを特徴とする請求項28又は29に記載のキット。
- 真正細菌および/または菌類および/またはウイルスおよび/またはイースト標的を増幅し検出するための請求項1から27の何れか一項に記載の方法の使用、または請求項28から31の何れか一項に記載のキットの使用。
- 増幅プライマーが細菌の属に特異的であり、各々の検出プローブが少なくとも一つの細菌の種に特異的であることを特徴とする請求項32に記載のキットの使用。
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