KR102041611B1 - 복합 나노구조체를 이용하여 유해바이오 물질을 포집 및 진단하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용의 구체예에 따르면, 제1 고분자 재질의 나노 필라(pillar) 어레이의 표면에 제2 고분자 재질의 나노 웹을 형성한 복합 나노구조체 상에 각종 병원체, 감염성 미생물 등의 바이오물질을 효율적으로 포집하여 이를 세포 용해(lysis)시켜 뉴클레아제를 방출시키고, 방출된 뉴클레아제에 대하여 응답성을 갖는 프로브의 절단에 의한 형광 신호를 검출함으로써 간편하면서 정확하게 시료 내 바이오물질의 포집 및 진단을 수행하는 시스템 및 방법이 기재된다.

Description

복합 나노구조체를 이용하여 유해바이오 물질을 포집 및 진단하기 위한 시스템 및 방법{System and Method for Capturing and Assaying Hazardous Biomaterials Using Hybrid Nano-structures}

본 개시 내용은 복합 나노구조체를 이용한 유해바이오물질의 포집/진단 시스템 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 제1 고분자 재질의 나노 필라(pillar) 어레이의 표면에 제2 고분자 재질의 나노 웹을 형성한 복합 나노구조체 상에 각종 병원체, 감염성 미생물 등의 유해바이오물질을 효율적으로 포집하여 이를 세포 용해(lysis)시켜 뉴클레아제를 방출시키고, 방출된 뉴클레아제에 대하여 응답성을 갖는 프로브의 절단에 의한 형광 신호를 검출함으로써 간편하면서 정확하게 시료 내 바이오물질의 포집 및 진단을 수행하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.

인간을 포함한 모든 온혈동물의 장 내에는 박테리아, 바이러스 등과 같은 다양한 병원체가 서식하는데 매우 좋은 환경이 제공되고 있다. 병원체는 주변 환경에서 널리 분포되어 있는 바, 구체적으로 박테리아 병원체는 흙, 동물 장기, 동물의 변에 의하여 오염된 물 주방, 주방도구, 책상, 식기 등 일상생활 속의 물건등에서 발견되고 있다. 인체 역시 평균적으로 인체 내외에 걸쳐 150 타입 이상의 박테리아를 갖고 있으며, 이중 많은 미생물들이 인체에 무해하기는 하나, 몇몇 종류는 식중독(botulism), 콜레라(cholera), 설사(diarrhea), 구토(emesis), 폐렴(pneumonia), 장티푸스(typhoid) 등을 포함하는 다양한 감염성 질환을 유발한다. 특히, 200 종류 이상의 질병이 음식 및 음용수 단독을 통하여 전염될 수 있다. 예를 들면, Escherichia Coli(또는 E.coli) 계열은 섭취시 큰 문제를 일으키지 않지만, 이중 몇몇은 설사 등을 유발하는 독소를 생성하는 병원체로 알려져 있다.

특히, 병원성 대장균 E.coli O157:H7은 장 출혈성 대장균으로서 식중독의 원인균으로 널리 알려져 있으며, 전세계적으로 문제시되고 있다. 또한, 감염 시 용혈성 요독 증후군, 출혈성 대장염, 설사, 신장부전, 발작 등을 유발하며, 심한 경우에는 사망에 이르도록 한다(Reisner, A. et al., 2006. Journal of Bacteriology. 188, 3572-3581; Barrientos, R. M. et al., 2009. Brain, Behavior, and Immunity. 23, 450-454; Schrag, S. J. et al., 2006. PEDIATRICS. 118, 570-576). 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium) 역시 식중독을 일으키는 대표적인 병원체로서 장티푸스 및 파라티푸스의 원인균이며, 다양한 가축 및 동물 등에 오염될 수 있다. 또한, 적절한 세척, 가공온도 및 저장조건이 지켜지지 못한다면, 살모넬라균이 번식할 수 있으며, 이렇게 오염된 식수, 식품 등을 통하여 다른 식품과 교차 오염될 수 있다.

병원체는 오염된 토양, 수질 환경, 식자재, 그리고 조리환경 등을 통해 쉽게 인간에게 감염될 수 있다. 통상의 조건 하에서 병원체의 번식속도는 매우 빠르기 때문에 아무리 적은 수의 병원체라도 일단 인체 내에 침입할 경우, 이의 생장환경에 매우 적합한 장 속에서 빠르게 성장하여 인간의 건강을 위협할 수 있는 수준까지 이르게 된다. 따라서, 오염된 환경으로부터 빠르고 간편하게 병원체(특히, E.coli)의 유무를 검출할 수 있는 진단 기술이 요구되고 있다. 이처럼, 유전학적 분석을 기반으로 하는 임상 진단 기술은 통상적으로 박테리아(bacteria), 균류(fungus) 또는 바이러스(virus)로부터 핵산을 회수하여 증폭 반응을 수행한 다음, 다양한 검출 수단(예를 들면, 광학적, 전기화학적 또는 기계적 바이오센서 디바이스)을 이용하여 앰플리콘(amplicon)을 분석하는 방식을 이용한다.

한편, 자연발생적으로 입수되는 환경 시료는 식수, 음식물(예를 들면, 우유, , 음식물 등), 식수, 혈액 등과 같은 다양한 오염 가능원으로부터 채취될 수 있는 바, 진단 대상인 특정(타겟) 박테리아 또는 바이러스와 같은 바이오물질이 미량으로 존재하는 경우가 일반적이다. 이와 같은 유해 바이오물질의 분석을 위하여는 해당 음식물 등을 물에 세척하고 배양한 후에 유해 바이오물질의 농도 또는 량을 측정하는 방식이 수행되고 있다. 그러나, 이러한 방식은 복잡한 과정을 수반하기 때문에 전문가만이 분석을 진행할 수 있고, 예를 들면, 약 3 내지 5일의 배양 과정을 거쳐 육안으로 분석하는 만큼, 검출에 소요되는 시간이 길고, 정확도 등에 있어서 결함을 갖고 있다

이에 대하여, E.coli 등과 같은 유해 바이오물질을 함유하는 환경 시료의 진단을 위하여, 근래에는 ATP(adenosine triphosphate) 및 루시페린(luciferin)/루시페라아제(luciferase)가 반응하여 발광하는 원리를 이용하는 ATP 측정법이 적용되고 있다.

ATP 측정법은 하기 반응식 1에서와 같이 발광 물질인 루시페린(Luciferin)이 ATP와 반응하여 활성화된 후에 발광 효소인 루시페라아제(luciferase)의 작용을 받아 산소에 의해 산화되면서 화학에너지를 빛에너지로 전환시켜 광을 방출한다.

[반응식 1]

즉, 발광물질인 루시페린은 ATP와 결합하여 루시페린-ATP의 복합물을 형성하면서 2개의 무기인산(H₃PO₄) 분자를 생성하는데, 이때 루시페린은 환원형이다. 상기 반응에서 생성된 환원형 루시페린-AMP는 산소와 반응하여 산화되면서 불안정한 에너지 상태에 있게 되고, 따라서 불안정한 상태의 산화 생성물은 신속하게 분해되어 산화형 루시페린과 AMP를 생성하면서 광(hv)을 방출하게 된다. 이때 방출되는 광의 량을 측정하여 수치화할 수 있는 바, ATP는 생물의 존재를 지시하는 지표에 해당된다. 즉, 미생물이 존재하면 세포 내에 필수적으로 함유된 ATP 역시 존재하므로 광을 방출할 수 있는 것이다. ATP 측정법을 통하여, ATP 소거처리, ATP 추출, 발광량 측정까지 소요되는 일련의 과정을 감축함으로써 신속한 진단 작업을 수행할 수 있다.

ATP 방법은 미생물뿐만 아니라 다른 유기물을 검출할 수 있는 장점을 갖고 있으나, 음식물과 같은 시료 내에도 소량의 ATP가 함유되어 있기 때문에 정확한 진단을 위하여는 음식물 등으로부터 유래하는 ATP를 제거하고, 검출 대상인 미생물-유래 ATP만을 측정해야 한다. 이처럼, APT 측정법 자체는 유해 바이오물질만을 포집하여 정확한 진단을 수행하는데 근본적인 한계를 갖고 있다. 특히, 시료 내에 진단하고자 하는 타겟 바이오물질의 농도가 낮은 경우에는 정확한 검출 및 진단의 곤란성은 더욱 악화될 수 있다.

따라서, 환경 시료로부터 정확한 진단을 위하여, 시료 내 바이오물질의 핵산을 효과적으로 회수하고, 이를 정확하게 진단할 수 있는 진단 플랫폼을 개발하는 것이 요구된다.

통상적으로, 바이오물질의 핵산은 페놀, 클로로포름, 구아니디늄 티오시아네이트 등을 이용하여 세포 용해물로부터 화학적으로 추출되고 있다. 그러나, 화학적 방법은 독성 화학 물질의 사용 및 숙련된 기술을 요구하는 복잡한 단계를 거쳐야 하기 때문에 용이하게 적용하기는 곤란하다. 핵산을 회수하기 위한 방안으로, 종래에는 주로 고상 추출법(SPE)이 이용되었으나, SPE-기반의 핵산 추출 공정 중 원심 분리(centrifuge), 볼텍싱(voltexing) 및 가열(heating)과 같은 다수의 복잡한 과정을 거치기 때문에 전염성 질환의 현장 진료(point-of-care) 테스트에 대한 요구를 충족할 수 없는 단점을 갖고 있다.

최근에는 이온 교환 메커니즘 또는 친화도에 의하여 핵산과 상호 작용할 수 있는 고분자를 개발하고자 하는 연구가 진행 중이다. 예를 들면, 키토산 미세입자를 기반으로 하면서 전하 상호작용을 이용하여 DNA를 포집하는 방법을 제안한 바 있으나, 여전히 불균일한 입자 및 고가의 장비 사용으로 인한 한계가 존재한다. 또한, DNA를 고정하기 위하여 다양한 기재 상에 카테콜계 고분자를 합성하여 코팅하는 기술을 제시하였고, 세포 용해물로부터 DNA를 효과적으로 추출하기 위하여 플라스틱 기재 상에 폴리(2-옥사졸린)의 다층 구조를 형성하고 RT-PCR(real-time PCR) 테크닉을 이용하여 유전적 진단을 수행하는 연구도 알려져 있다. 그러나, 이러한 방법들의 경우, 합성 고분자를 이용하여 어느 정도 핵산을 추출할 수 있었으나, 고분자 합성에 비교적 많은 시간을 요구하고, 또한 복잡한 절차를 수반하기 때문에 재현성 및 효율성 면에서 문제점이 있다. 더욱이, PCR을 수행하기 위하여는 제어된 온도 조절, 증폭 반응에 사용되는 각종 시약의 사용이 요구되므로 진단에 소요되는 비용은 비교적 높은 수준이다.

한편, 최근에는 감염성 유해 바이오물질로 인하여 인체의 손, 그리고 조리기구, 음식물의 표면 등으로부터 다양한 종류의 감염성 미생물이 전파되고 오염될 뿐만 아니라, 음식을 섭취하거나 소비하는 과정에서도 2차 오염이 발생하는 경우가 종종 일어난다. 상기의 점을 고려하여, 다양한 마이크로 또는 나노 구조체를 적용하여 표면 또는 용액에 포함된 감염성 미생물을 포집한 후에 분석하고자 하는 연구가 진행 중에 있으나, 다양한 형태의 표면을 누르고 문지르는 과정에서 나노 또는 마이크로미터 스케일의 구조가 붕괴되거나 손상되어 분석이 곤란하다.

따라서, 종래기술의 문제점을 해소하고, 특히 환경 시료와 같이 저 농도로 존재하는 유해 바이오물질(예를 들면, 병원체)를 함유하는 시료에 대하여도 표적 바이오물질을 용이하면서도 효과적으로 포집하고, 또한 정확하게 진단할 수 있는 방법에 대한 개발이 요구되고 있다.

본 개시 내용에 따른 구체예에서는 바이오물질(예를 들면, 각종 병원체 등의 유해 바이오물질)을 물리화학적 방식으로 직접 부착(또는 고정)하는 방식으로 포집하여 진단하는 방안을 제공하고자 한다.

또한, 본 개시 내용에 따른 구체예에서는 바이오물질에 대하여 효과적인 바인딩(고정 또는 포집) 특성을 갖는 복합 나노구조체 플랫폼을 이용하여 추가적인 장비, 후속 증폭 공정 또는 시약(또는 화학 물질)을 사용하지 않고도 바이오물질을 간편하게 검출할 수 있는 스마트 진단 방법을 제공하고자 한다.

이외에도, 현장 신속 검출이 요구되는 각종 식품, 식재료, 조리기구 등으로부터 식중독 균과 같은 유해 바이오물질을 고효율로 포집할 수 있고 신속 정확하게 진단할 수 있는 포집 및 진단 플랫폼을 제공하고자 한다.

본 개시 내용의 제1 면에 따르면,

a) 바이오물질을 함유하는 시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 시료에 비하여 증가된 밀도의 바이오물질을 상기 복합 나노구조체 상에 포집시키는 단계;

b) 상기 포집된 바이오물질을 세포 용해(lysis)시키는 단계;

c) 상기 바이오물질의 세포 용해물(lysate)을 소광 상태에 있는 프로브와 접촉시켜 상기 세포 용해에 의하여 방출되는 뉴클레아제에 의하여 상기 프로브 내 사슬을 절단하는 단계, 여기서 상기 프로브는 상기 방출되는 뉴클라아제에 대하여 응답성을 갖는 핵산 프로브로서, 상기 사슬에 의하여 연결된 각각 말단에 형광체 및 소광체를 포함하며, 사슬의 절단 전에는 소광체의 작용에 의하여 형광체의 발색이 억제되어 있음;

d) 상기 프로브의 절단에 따라 유리된 형광체로부터 생성된 형광에 대하여 정량적 분석 및 정성적 분석 중 적어도 하나를 수행하는 단계;

를 포함하며,

상기 복합 나노구조체는,

(i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 제1 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질용 금속층, 및 (iii) 상기 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된 제2 고분자 재질의 나노 웹 구조를 포함하는 시료 내 바이오물질의 포집 및 진단 방법이 제공된다.

본 개시 내용의 제2 면에 따르면,

시료 내 바이오물질의 포집 및 진단 시스템으로서,

a) (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 제1 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질용 금속층, 및 (iii) 상기 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된 제2 고분자 재질의 나노 웹 구조를 포함하는 복합 나노구조체;

b) 상기 바이오물질로부터 유래된 뉴클레아제에 대하여 응답성을 갖는 핵산 프로브, 여기서 상기 프로브는 사슬에 의하여 연결된 각각 말단에 형광체 및 소광체를 포함하며, 뉴클라아제에 의하여 사슬이 절단되기 전에는 소광체의 작용에 의하여 형광체의 발색이 억제되어 있음; 및

c) 상기 사슬의 절단에 의하여 상기 프로브로부터 유리되는 형광체의 형광 및 형광 세기(또는 형광 량) 중 적어도 하나를 검출하는 장치;

를 포함하는 포집 및 진단 시스템이 제공된다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 프로브는 이중 스트랜드(double strand)의 DNA 프로브일 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 제1 고분자는 폴리우레탄(Poly urethane, PU)계, 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS)계, NOA(Noland Optical Adhesive)계 및 에폭시(Epoxy)계로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 제2 고분자는 폴리에테르케톤(PEK), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리에테르에테르케톤케톤(PEEKK); 폴리설폰; 폴리에테르 설폰, 폴리페닐에테르설폰, 폴리페닐렌; 폴리이미다졸; 폴리이미드, 폴리아미드이미드; 폴리아닐린, 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리피롤(polypyrrole), 및 폴리티오펜(polythiophene)으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 나노 패턴 구조물의 표면 상에 Ti, V, Cr, Sc, Nb, Mo 및 W으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 금속 재질의 중간층(intermediate layer)이 형성되고, 상기 중간층 상에 Ni, Zn, Pd, Ag, Cd, Pt, Ga, In 및 Au로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 표면 개질용 금속층이 형성될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 나노 패턴 구조물 상에 Au/Ti의 2층(binary layer) 구조가 형성될 수 있다.

본 개시 내용의 구체예에 따라 제공되는 바이오물질의 포집 및 진단 시스템 및 방법은, 3차원적 섬유 상 형태의 구조를 제공하여 박테리아와 같은 바이오물질의 표면과 표면 지형학적 상호작용(topographical interaction)을 향상시켜 특별한 표면 처리 없이도 시료(구체적으로 환경 시료) 내에 함유된 타겟 바이오물질에 대하여 효과적인 선택적 고정력을 제공함과 동시에 타겟 바이오물질의 세포 용해로부터 방출되는 뉴클레아제에 대하여 응답성을 갖는 프로브를 이용하여 백그라운드 노이즈에 대한 시그널 특성이 양호하면서도 간편하고 정확한 정량적 및/또는 정성적 진단 시스템을 구현할 수 있다.

특히, 바이오물질에 대한 진단 과정에서 추가적인 단계(예를 들면, 세척 또는 정제 단계) 또는 장치, 및/또는 화학물질의 사용 없이도 간편하고 정확하게 바이오물질을 검출할 수 있는 방안을 제시한다. 특히, 환경 시료와 같이 저농도의 바이오물질(예를 들면, 식중독을 유발하는 각종 병원체 등)을 함유하는 시료에 대하여도 효과적으로 적용 가능하고, 더 나아가 유해 바이오물질을 인-시튜(in-situ)로 검출할 수 있는 신규 플랫폼을 제공한다. 따라서, 향후 임상 진단, 환경 모니터링, 약물 유전학 분석 등의 다양한 분야에서 광범위한 활용이 기대된다.

도 1은 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 제작된 복합 나노구조체 기반 필름 및 바이오물질로부터 유래된 뉴클라아제-응답성 프로브를 이용한 바이오물질의 포집 및 진단 원리를 개략적으로 보여주는 도면이고,
도 2는 예시적인 구체예에 있어서, 바이오물질의 검출용 프로브 말단에 부착되는 형광체 및 소광체의 조합 가능한 범위의 예를 도시하는 도면이고,
도 3은 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체의 제조 과정을 개념적으로 도시하는 도면이고;
도 4는 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 제1 고분자 재질의 복수의 나노필라가 형성된 나노 패턴 구조물을 제작하는 일련의 과정을 도시하는 도면이고;
도 5는 본 개시 내용의 일 구체예에 있어서 표면 개질용 금속층이 부착된 제1 고분자 재질의 나노 패턴 구조물에 형성되어 있는 나노필라에 제2 고분자의 나노 섬유 구조가 성장하여 웹 구조를 형성하는 원리를 도시하는 도면이고;
도 6은 실시예 1에 따라 복합 나노구조체를 제작하는 일련의 순서를 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 7은 실시예 1에서 제작된 (a) PUNO 재질의 나노 패턴 구조물, (b) Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 및 (c) PANI 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체 기반 필름 각각에 대한 외관 사진, 모식도 및 SEM 사진이고;
도 8은 실시예 1에서 (a) PUNO 재질의 나노 패턴 구조물, (b) Au/Ti 금속층 부착 이후, 그리고 (c) 나노 웹 형성 이후의 SEM 사진 및 표면상 EDS 분석 결과를 각각 나타내는 그래프이고;
도 9는 실시예 1에서 (a) PUNO 재질의 나노 패턴 구조물, (b) Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 및 (c) PANI 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체 각각에서의 수접촉각 테스트 결과를 보여주는 도면이고;
도 10a 내지 도 10c는 각각 실시예 1에서 제작된 복합 나노구조체의 수평 방향 외력 및 수직 방향 외력에 대한 내성 테스트 결과를, 그리고 복합 나노구조체를 다양한 물체의 표면에 문지르기 전후의 변화를 보여주는 도면이고,
도 11은 비교예 1에 따라 표면 개질용 금속층의 개재 없이 나노 패턴 구조물 상에 직접 나노 웹을 형성하여 제조된 복합 나노구조체 및 실시예 1에 따라 제조된 복합 나노구조체의 SEM 사진을 대비한 도면이고;
도 12는 비교예 2에 따라 나노 웹이 형성되지 않은 나노 패턴 구조물에 대하여 가해진 물리적 외력에 따른 나노필라의 형태 변화를 보여주는 SEM 사진이고;
도 13은 실시예 1에 따라 제작된 복합 나노구조체 기반 필름 상에 포집된 E. coli O157:H7의 SEM 사진(a), 그리고 상기 복합 나노구조체 기반 필름 상에 포집된 E. coli O157:H7을 확대한 SEM 사진(b, c)이고.
도 14는 비교예 3에 따라 제작된 베어 필름(bare film)에 포집된 E. coli O157:H7의 SEM 사진이고
도 15는 복합 나노구조체 기반 필름(실시예 1) 및 베어 필름(비교예 3) 각각에 포집된 E. coli O157:H7를 세포 용해시켜 이중 스트랜드의 DNA 프로브와 반응시켜 얻은 형광 스펙트럼 측정 결과를 나타내는 그래프이고,
도 16은 그람-음성 박테리아인 E. coli O157:H7, S. enteritidis 및 Y. enterocolitica에 대하여 각각 농도 별(각각의 박테리아 농도 범위는 0 내지 10⁷ CFU)로 복합 나노구조체 기반 필름으로 포집하여 얻은 형광 세기(a-c), E. coli O157:H7, S. enteritidis 및 Y. enterocolitica 박테리아에 대하여 각각 농도 별(각각의 박테리아 농도 범위는 0 내지 10⁷ CFU)로 베어 필름으로 포집하여 얻은 형광 세기(d-f), 그리고 생균 검출에 대한 특이성(specificity) 확인을 위하여 각각의 박테리아(각각의 박테리아 수는 1 x 10⁷ CFU/rxn)에 대하여 복합 나노구조체 기반 필름으로 포집한 생균 및 사균의 형광 세기(g-i)를 나타내는 그래프이고,
도 17은 그람-양성 박테리아인 S. aureus, B. cereus 및 L. monocytognes에 대하여 각각 농도 별(각각의 박테리아 농도 범위는 0 내지 10⁷ CFU)로 복합 나노구조체 기반 필름으로 포집하여 얻은 형광 세기(a-c), S. aureus, B. cereus 및 L. monocytognes 박테리아를 각각 농도 별(각각의 박테리아 농도 범위는 0 내지 10⁷ CFU)로 베어 필름으로 포집하여 얻은 형광 세기(d-f), 그리고 생균 검출에 대한 특이성 확인을 위하여 각각의 박테리아(각각의 박테리아 수는 1 x 10⁷ CFU/rxn)에 대하여 복합 나노구조체 기반 필름으로 포집한 생균 및 사균의 형광 세기(g-i)를 나타내는 그래프이고, 그리고
도 18은 E. coli O157:H7(a, b, e 및 f; 농도: 10⁷ CFU/rxn) 및 S. aureus(c, d, g 및 h; 농도: 10⁷ CFU/rxn) 각각을 인위적으로 칼, 도마, 샐러드 및 식수를 오염시킨 후에 이를 복합 나노구조체 기반 필름, 베어 필름 및 습식 와이프(wet wipes)에 의하여 박테리아를 시료 표면에서 직접 포집하여 측정된 형광 세기를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다.

또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위하여 실제 층의 두께(또는 높이) 또는 다른 층과의 비율에 비하여 다소 과장되게 표현된 것일 수 있으며, 그 의미는 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.

"고분자"는 단일중합체 및 공중합체를 모두 포함하며, 공중합체는 랜덤 공중합체 및 블록 공중합체를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

"나노구조물" 또는 "나노구조체"는 나노 스케일(예를 들면, 약 0.1 내지 1000 nm, 구체적으로는 1 내지 100 nm)의 치수 또는 사이즈를 갖는 특징부(feature) 또는 텍스츄어(texture), 예를 들면 나노필라, 나노로드, 나노 벽(wall), 나노와이어, 나노 웹 등을 구비하는 임의의 나노 스케일의 객체를 의미할 수 있다.

"어레이(array)"는 지지체, 부재(member) 또는 백킹 부재(backing member)로부터 도출되거나 이에 부착(고정)된, 섬유, 컬럼, 필라, 루프, 튜브, 콘, 블록, 큐브, 헤미스페어, 스페어, 벽, 그리드, 홀 또는 이의 조합을 포함하는 형태학적 특징부, 텍스츄어 또는 표면을 의미하는 것으로 폭넓게 해석될 수 있다.

"부착(adhesion)" 또는 "고정(immobilization)"은 단백질, 세포 또는 기타 물질이 표면에 공유 또는 비공유 방식으로 결합 또는 연결되는 것을 의미할 수 있다.

"바이오물질"은 광의로는 임의 타입의 생물학적 유기체(biological organism)로부터 유래하는 물질을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 복수의 세포로 이루어질 수 있고 핵산일 필요는 없으며, 예를 들면 병원체(병원성 세포 또는 박테리아)일 수 있다.

"시료"는 검출하고자 하는 바이오물질를 함유할 수 있는 한, 특정 종류 또는 형태로 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 시료는 생물학적 시료, 예를 들면 생물학적 유체(fluid) 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 예로서, 뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 눈물, 점액, 양수 등을 들 수 있다. 생물학적 조직은 세포의 집합으로서, 대체적으로 인간, 동물, 식물, 세균, 진균 또는 바이러스 구조물의 구조적 물질의 하나를 형성하는 세포 내 물질들과 특정 종류의 집합으로서 연결 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 신경 조직 등이 이에 해당될 수 있다. 또한, 생물학적 조직의 예에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 개별적인 세포(들)도 포함될 수 있다. 이외에도, 시료는 바이오물질을 저농도로 함유하는 환경 시료(environmental sample)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 식수, 음식물 등과 같이 다양한 형태 및 종류를 포함할 수 있다.

"세포 용해(lysis)"는 세포의 분해에 따라서 세포막이 파열되는 동시에 세포 내용물이 노출되는 현상을 의미할 수 있는 바, 통상적으로 PCR과 같은 증폭 과정의 전단계에서 DNA 또는 RNA를 분리하기 위하여 많이 사용되고 있다.

“핵산”은 유기 염기(사이토신, 티미딘 또는 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나 아덴 또는 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 복수의 뉴클레오티드를 의미할 수도 있다. 즉, 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, cRNA, miRNA, siRNA, 압타머(aptamer) 등을 예시할 수 있고, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두 포함하는 개념일 수 있다. 다만, 보다 전형적으로는 DNA, RNA 등일 수 있다.

"뉴클라아제"는 핵산(예를 들면, DNA 또는 RNA)의 뉴클레오티드 서브유닛 간의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소를 의미할 수 있는 바, 핵산말단 분해효소(exo-nuclease)는 말단에서부터 절단하는 바, 주로 뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소인 반면, 핵산내부 가수분해효소(endo-nuclease)는 뉴클레오티드 결합 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소이다.

"프로브"는 협의로는 표적 핵산 내에 함유된 특정 염기 서열과 상보적 염기 서열을 포함하고 있어, 적절한 조건 하에서 혼성화되는 성분 또는 바이오분자를 의미할 수 있으나, 광의로는 특정 성질 또는 량을 측정하기 위하여 표적 성분과 선택적이고 미리 정해진 방식으로 상호 작용하는 성분을 의미할 수 있다.

"용해 완충액 또는 세포용해 완충액(lysis buffer)"은, 예를 들면 25℃에서 약 6 내지 약 9의 pKa로, pH 값을, 예를 들면 6 내지 9(구체적으로 약 7.5 내지 9, 보다 구체적으로 약 7.8 내지 8.5)로 효과적으로 유지할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 이때, 완충액은 전형적으로 효소 활성의 기능과 조화되고, 생물학적 분자의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 생리학적으로 조화 가능한(physiologically compatible) 완충액을 의미할 수 있다.

"박테리아"는 외막(bacterial envelope)은 구조에 따라 그람(Gram) 염색반응이 구별되는 바, 그람 음성 박테리아(얇은 뮤레인(murein) 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 외막의 지질 이중층을 가짐)와 그람 양성 박테리아(두꺼운 뮤레인 또는 펩티도글리칸 층을 가지며 이로써 Crystal violet을 보유함)로 구분된다. 그람 음성 박테리아의 세포막은 포스포리피드(phospholipid)와 기타 글리코프로테인(glycoprotein)으로 이루어져 있으며, 포스포리피드의 대부분은 (-)의 하전을 띄고 있다(net negative charge). 그 종류로는 살모넬라균, 수막염균, 스피로헤타 콜레라균, 페스트균, 티푸스균, 이질균, 대장균, 임균 등이 있다. 반면, 그람 양성 박테리아의 경우, 세포벽은 주로 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 타이코산(teichoic acid)으로 구성되는 바, 그 표면은 거의 중성에 가까운 하전 특성을 갖고 있으며, 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 디프테리아균, 파상풍균, 폐렴균 등을 들 수 있다.

"접촉한다"는 협의로는 2개의 대상 간의 직접적인 접촉을 의미하기는 하나, 광의로는 임의의 추가 구성 요소가 개재될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

"형광(fluorescence)"이라는 용어는 전자기적 여기에 의하여 짧은 시간 동안 생성되는 발광 타입을 의미할 수 있다. 즉, 형광은 특정 물질이 짧은 파장에서 광 에너지를 흡수한 후에 보다 긴 파장에서 광 에너지를 방출할 때 생성되는 현상을 의미한다. 예시적으로, 흡수와 방출 간의 시간 길이는 통상적으로 비교적 짧은데, 예를 들면 약 10^-9 내지 10^-8 초 수준일 수 있다.

"상에" 및 "위에"라는 표현은 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른 층(중간층) 또는 구성 요소가 개재되거나 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, "하측에", "하부에" 및 "아래에"라는 표현 및 "사이에"라는 표현 역시 위치에 대한 상대적 개념으로 이해될 수 있을 것이다. 또한, "순차적으로"라는 표현 역시 상대적인 위치 개념으로 이해될 수 있다.

전체적인 개시 내용

도 1은 본 개시 내용의 일 구체예에 따라 제작된 복합 나노구조체 기반 필름 및 바이오물질로부터 유래된 뉴클라아제-응답성 프로브를 이용한 바이오물질의 포집 및 진단 원리를 개략적으로 보여준다.

상기 도면을 참조하면, 먼저 특정 형태학적 특성을 갖는 복합 나노구조체 기반의 필름(필름 구조물)을 제작하여 바이오물질, 특히 박테리아와 같은 유해 바이오물질의 포집 수단으로 제공한다(a).

본 명세서에서 적용 가능한 바이오물질은 전형적으로는 병원체 또는 병원성 세균을 포함할 수 있다. 병원체는 동식물의 생체에 침입하여 기생하면서 병을 일으키거나 위해를 주는 모든 미생물을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 바이오물질은 그람-양성균 및 그람-음성균을 포함할 수 있는 바, 구체적으로 구체적으로 대장균 E. coli O157:H7, 살모넬라속균(Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium), 황색포도상구균, 리스테리아속균(Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi), 콜레라균, 적리균, 백일해균, 디프테리아균, 장티푸스균, 페스트균, 용혈성 연쇄구균 또는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으며, 보다 구체적으로는 E.coli O157:H7, Salmonella choleraesuis, Salmonella bongori, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria murrayi, S. enteritidis, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, L. monocytognes 등일 수 있다. 이외에도, 바이러스 종류로서 인플루엔자 바이러스, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, G형 간염 바이러스, HIV 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 누수투 또는 웨스트 나일 바이러스, 리프트 계곡 열 또는 토스카나 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 로시오 바이러스, 홍역 바이러스, 머레이 뇌염 바이러스, 베셀스브론 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 림프구 무도수막염(lymphocytic choreomeningitis) 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 크리미아-콩고 출혈 열 바이러스, 리사 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 광견병 바이러스, 루벨라(rubella) 바이러스, 수두 대상 포진 바이러스, 단순 포진 1형 및 2형 바이러스, 보다 전형적으로 알파바이러스, 아데노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 플라비바이러스, 리노바이러스, 오쏘부냐바이러스(orthobunyavirus), 폴리오바이러스, 인간 파보바이러스, 엔테로바이러스, 코로나바이러스, 인간 파필로마바이러스, 인간 시토메갈로바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 1, 2 및 3형의 파라인플루엔재 바이러스, 또는 임의의 확인된 바이러스를 포함할 수 있다. 상기 나열된 종류는 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 반드시 특정 종류로 한정되는 것은 아니다.

이러한 바이오물질은 다양한 방식, 즉 각종 기상, 액상 및/또는 고상 매질 또는 매개체(medium)를 통하여 전파될 수 있으며, 경우에 따라서는 인체 접촉(예를 들면, 손 접촉)을 통하여 전파될 수 있다.

그 다음, 바이오물질을 함유하는 시료를 복합 나노구조체 기반의 필름에 접촉시키는 바, 이때 복합 나노구조체는 나노 웹에 의한 물리적 또는 비특이적 고정(또는 포집) 원리를 이용하도록 구성된다(b).

일반적으로, 박테리아와 같은 바이오물질과 고체 표면 간의 상호 작용에는 전하에 의한 상호작용(정전기적 결합), 수소 결합 및 소수성 결합(hydrophobic interaction)이 관여된다. 한편, 바이오물질 간의 상호 작용에 있어서도 이러한 3가지 힘이 작용한다. 고체 표면의 친수성이 높은 경우에는 소수성 상호작용이 우세하게 되어 바이오물질(구체적으로 그람-음성 및 그람-양성 박테리아)이 모두 비교적 용이하게 친수성 고체 표면에 흡착 고정될 수 있다. 특히, 고농도 시료에서는 바이오물질의 표면 전하에 관계없이 소수성 결합에 의하여 서로 용이하게 응집될 수 있다. 반면, 저농도 시료에 있어서는 바이오물질 간의 거리가 크기 때문에 수소 결합 및 소수성 상호작용이 감소하게 된다. 따라서, 저농도 시료에서는 고체 표면과 바이오물질 간의 상호 작용뿐만 아니라, 바이오물질들 간의 상호 작용과 관계되는 힘을 증가시킬 필요가 있다. 상기의 점에서 후술하는 바와 같이 복합 나노구조체는 효과적인 포집 효과를 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 구체예에서는 화학적 방식 또는 항원-항체의 생화학적 방식을 이용하는 대신에, 나노 웹 구조 표면의 나노 섬모 구조와 병원체 등의 유해 바이오물질 표면의 섬모 구조와의 상호 작용을 이용하여 물리적으로 바이오물질을 고정하는 원리를 이용한다. 더 나아가, 복합 나노구조체의 제작 과정 중 나노필라의 길이, 직경 및 필라 사이의 간격을 자유롭게 조절할 수 있기 때문에, 박테리아뿐만 아니라, 보다 작은 사이즈의 바이러스까지도 포집 및 검출하는데 적용 가능성이 있다.

예시적 구체예에 따르면, 병원체와 같은 바이오물질은 다양한 방식으로 또는 다양한 매개체를 통하여, 예를 들면 인체(예를 들면, 피부) 접촉, 액상(예를 들면, 기침 중 타액) 및/또는 기상(예를 들면, 공기)를 통하여 복합 나노구조체와 접촉하여 고정될 수 있다. 특히, 피부 전염으로 전파는 병원체의 경우, 손 접촉만으로도 용이하게 고정시킬 수 있다.

이와 같이 복합 나노구조체 상에 고정된 바이오물질(구체적으로 박테리아)에 대하여 세포 용해(lysis) 단계가 수행되는 바, 그 과정에서 표적 바이오물질로부터 뉴클라아제를 방출한다(c). 통상적으로, 세포 용해는, 예를 들면 (i) 조절된 온도 조건 하에서 바이오물질 함유 시료를 약 70 내지 95 ℃(구체적으로 약 80 내지 90 ℃)에서 가열하는 방법. (ii) 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 펄스 온(pulse on) 및 펄스 오프(pulse off)를 교대로 실시하는 방법, 그리고 (3) 세포용해 완충액(lysis buffer)을 사용하여 수행될 수 있다.

일 구체예에서는 세포용해 완충액을 이용한 세포 용해 단계를 수행할 수 있다. 이때, 세포용해 완충액은 세포용해 중 바이오물질 내 단백질의 손상을 최소화하고, 이와 동시에 바이오물질로부터 뉴클라아제를 방출하도록 기능하는 조성을 가질 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 세포용해 완충액은 예를 들면 리소자임(lysozyme), 리소스타핀(lysostaphin) 등과 같이 그람-음성 및 그람-양성 박테리아를 일거에 세포용해시킬 수 있는 성분을 함유할 수 있고, 또한 CHAPS(3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) 및 Triton x-100와 같이 박테리아 단백질의 손상을 최소화시킬 수 있는 성분을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 리소스타핀은 포도상 구균의 세포벽에서 가교 펜타를리신 브릿지(pentaglycine bridge)를 절단하는 항균 효소로 널리 알려져 있다. 이외에도, 추가적으로 반코마이신(Vancomycin), HEPES, SDS 등을 단독으로 또는 조합하여 추가적으로 함유할 수 있다.

본 구체예에서 사용 가능한 세포용해 완충액의 예시적 조성은 하기 표 1과 같다.

성분	농도
리소자임	약 0.1 내지 2mg/ml(구체적으로 약 0.5 내지 1.5 mg/ml, 보다 구체적으로 약 0.8 내지 1.2 mg/ml)
리소스타핀	약 0.05 내지 1mg/ml(구체적으로 약 0.2 내지 0.8 mg/ml, 보다 구체적으로 약 0.3 내지 0.6 mg/ml)
EDTA	약 0.05 내지 0.2 mM(구체적으로 약 0.07 내지 0.15 mM, 보다 구체적으로 약 0.09 내지 0.12 mM)
프로타아제 억제제 칵테일	약 0.1 내지 1X(구체적으로 약 0.2 내지 0.8X, 보다 구체적으로 약 0.3 내지 0.6X)
Tris-HCl(pH 7.4)	약 0.3 내지 1.5 M(구체적으로 약 0.5 내지 1.3 M, 보다 구체적으로 약 0.8 내지 1.2 M)
NaCl	약 3 내지 8 M(구체적으로 약 4 내지 7 M, 보다 구체적으로 약 4.5 내지 6 M)
Triton X-100	약 10 내지 25 중량%(구체적으로 약 15 내지 22 중량%, 보다 구체적으로 약 18 내지 20 중량%)
CHAPS	약 0.5 내지 1.5 중량%(구체적으로 약 0.7 내지 1.3 중량%, 보다 구체적으로 약 0.9 내지 1.2 중량%)

상술한 바와 같이 세포용해 완충액을 이용한 세포 용해를 통하여 바이오물질로부터 뉴클레아제가 방출된다. 일 구체예에 있어서, 바이오물질의 세포용해 과정 중 온도는 사용되는 효소의 종류 등을 고려하여 적절한 범위로 조절할 수 있는데, 예를 들면 약 30 내지 95 ℃(전형적으로 약 40 내지 80 ℃, 보다 전형적으로 약 55 내지 72 ℃) 범위 내에서 정하여질 수 있다. 상기 온도 범위는 예시 목적으로 기술되는 바, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

이와 별도로, 본 구체예에 따른 진단 시스템에서는 방출된 뉴클라아제 대하여 응답성(responsive)을 나타내는 핵산 프로브, 구체적으로 이중 스트랜드를 갖는 DNA 프로브가 제공된다. 표적 바이오물질-유래 뉴클라아제를 프로브와 접촉시킨 결과, 뉴클라아제에 의하여 프로브 내 사슬(결합)이 절단된다. 이와 같이 프로브와 뉴클라아제의 접촉은 세포용해를 거친 적어도 일부의 완충액에 프로브(구체적으로 이중 스트랜드를 갖는 DNA 프로브)를 첨가하는 방식으로 수행될 수 있다.

상기 프로브는 사슬(결합)에 의하여 연결된 각각 말단에 형광체(fluorophore) 또는 염료(dye), 및 소광체(quencher)를 포함한다. 뉴클라아제에 의하여 프로브 내 사슬이 절단되기 전에는 형광체와 소광체가 인접하여 위치함에 따라 형광공명에너지전(FLET) 현상에 의하여 형광체의 발색 또는 형광 신호가 최소화된다. 즉, 소광체의 작용에 의하여 형광체의 발색이 억제되어 있는 상태(소광 상태)에 있다. 예시적 구체예에 따르면, 상기 프로브의 5'-말단에 형광체가 부착되어 있고, 3'-말단에 소광체가 부착되어 있다. 이러한 소광체는 전형적으로 비형광성 분자일 수 있고, 구체적으로 DABCYL, ROX, Black Hole Quencher^ㄾ(BHQ^ㄾ), Eclipse, TAMRA, QSY-6 및 금 나노입자(Gold nano-particle) 등일 수 있다. 보다 구체적으로는 BHQ, 특히 구체적으로는 BHQ-1을 소광체로 사용할 수 있다.

한편, 형광체로서 FAM(fluorecein amidite), HEX, JOE, TET, MAX, VIC 등과 같이 당업계에서 알려진 종류를 프로브 말단(구체적으로 5'-말단)에 부착한다. 프로브 내 형광체와 소광체 간 거리(즉, 염기 서열 또는 사슬 길이)는, 예를 들면 약 25 내지 60개, 구체적으로 약 31 내지 50개, 보다 구체적으로 약 35 내지 40개의 염기(base)로 이루어질 수 있다. 이와 관련하여, 최적의 성능을 얻기 위하여는 소광체의 흡수 스펙트럼이 가능한 한 형광체의 방출 스펙트럼과 가깝게 매칭되는 것이 바람직할 수 있다. 바이오물질의 검출용 프로브 말단에 부착되는 형광체 및 소광체의 조합 가능한 범위의 예를 도 2에 나타내었고, 이에 근거하여 선정된 형광체와 소광체의 예시적인 조합은 하기 표 2와 같다.

형과체(염료)	최대여기 파장(nm)	최대방출 파장(nm)	소광체
FAM	494	515	BHQ-1
JOE	520	548	BHQ-1
TET	521	536	BHQ-1
HEX	535	555	BHQ-1

상기 표에 기재된 형광체-소광체 조합은 예시적인 것으로서 본 발명이 이에 한정되는 것으로 이해되지 않아야 한다. 다만, FAM/BHQ-1 조합이 검출 정확성 면에서 유리할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 구체예에서 사용 가능한 프로브는 뉴클라아제(구체적으로, 타겟 바이오물질로부터 유래하는 뉴클라아제)에 대한 응답성을 나타내야 하는 바, 구체적으로 뉴클라아제와 반응하여 형광체와 소광체 사이의 사슬(결합)을 절단할 수 있는 염기 서열을 갖는 것일 수 있다. 이를 위하여, 사슬(염기 서열) 내에 적어도 하나의 미스매치 또는 불일치(mismatch) 부위를 갖도록 프로브 내 염기서열을 교정할 수 있다.

복합 나노복합체에 고정된 바이오물질로부터 유래하는 뉴클라아제를 이용하여 프로브를 절단함에 따라 소광 상태의 프로브 내 형광체가 회복되어 발색하게 되고, 형광 량 또는 세기에 따라 시료 내 바이오물질, 구체적으로 표적 바이오물질을 정성적 및/또는 정량적으로 검출할 수 있다. 즉, 시료 내 바이오물질의 농도에 따른 형광 신호의 유무 및 세기를 측정하는 방식으로 진단을 수행할 수 있는 것이다. 예시적 구체예에 따르면, 프로브의 사용량은, 예를 들면 약 5 내지 30 ㎕, 구체적으로 약 8 내지 25 ㎕, 보다 구체적으로 약 10 내지 20 ㎕ 범위일 수 있으나, 이는 예시적인 의미로 이해되어야 한다.

예시적 구체예에 있어서, 프로브 절단에 따라 방출되는 형광은, 예를 들면 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer), 광전자증폭관(photo multiplier tube), 포토다이오드(photo diode) 등과 같이 당업계에 알려진 검출 수단(또는 장치)를 통하여 확인할 수 있는데, 형광의 유무 및 강도를 고려하여 표적 바이오물질의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 예시적 구체예에 따르면, 레이저-유도 공초점 형광 현미경을 이용할 수 있다. 이외에도, 표적 바이오물질의 존재에 따른 형광 유무 및 형광 강도의 변화를 확인할 수 있는 장비라면 특별한 제한 없이 사용 가능한 바, 예를 들면 QuantaMaster PTI spectrofluorimeter (PTI), SPEX Fluorolog 3 (ISA) 등을 예시할 수 있다.

예시적 구체예에 따른 진단 시스템의 검출 한계(LOD)는, 예를 들면 약 10³ 내지 10⁷ CFU, 구체적으로 약 10⁴ 내지 10⁵ CFU 범위일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

복합 나노구조체의 제작

일 구체예에 따르면, 전술한 바와 같이 시료 내 바이오물질의 포집(고정) 복합 나노구조체는 도 3에 도시된 바와 같이 제작될 수 있다.

도시된 구체예에 있어서, 복합 나노구조체는 복수의 나노필라가 구비된 고분자 재질의 나노 패턴 구조물 상에 표면 개질용 금속층이 형성되고, 상기 나노 패턴 구조물에 고분자 재질의 웹 구조를 성장시켜 제조된다.

상기 나노 패턴 구조물은 평면에 복수의 나노필라(나노 스케일을 갖는 필라 구조)가 돌출되어 있는 형태로서, 제1 고분자 재질로 이루어질 수 있다. 이때, 제1 고분자는 최종 목적물인 복합 나노구조체의 적용 분야를 고려하여 적절히 선택될 수 있다. 특히, 나노 패턴 구조물을 제작하는 과정 중 도포(코팅)가 용이하고, 주형 몰드로부터 비교적 쉽게 분리(탈착) 가능하고, 형성되는 나노필라의 치수 또는 배열을 용이하게 조절할 수 있는 등의 특성을 갖는 고분자를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 제1 고분자는 유연성, 광 감광성, 기계적 안정성, 열적 안정성, 화학적 안정성 등의 물성이 양호한 종류를 선택하여 사용하는 것이 유리할 수 있다.

이를 위하여, 제1 고분자는 나노 패턴 조절의 용이성을 위하여, 상온에서 비경화(유체) 상태의 점도가, 예를 들면 약 300 내지 5000 cps, 구체적으로 약 500 내지 3000 cps, 보다 구체적으로 약 800 내지 2000 cps 범위일 수 있다. 또한, 제1 고분자는 전형적으로 플라스틱 재질에 대한 접착력이 금속에 대한 접착력과 동일하거나, 또는 그 이상인 것이 유리할 수 있다. 이는 후술하는 바와 같이 금속 재질의 마스터 몰드를 사용하여 나노 패턴을 형성할 경우, 몰딩 및 경화(예를 들면, UV 경화) 이후, 마스터 몰드로부터 나노패턴 구조물을 분리(이형)할 때, 플라스틱보다 금속에 대한 접착력이 강할 경우에는 제1 고분자 층을 마스터 몰드로부터 분리하기 곤란할 수 있기 때문이다.

예시적 구체예에 따르면, 제1 고분자는 폴리우레탄(Poly urethane, PU)계, 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS)계, NOA(Noland Optical Adhesive)계 및 에폭시(Epoxy)계로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택될 수 있다. 이와 관련하여, NOA 계 고분자(예를 들면, Norland Products사에서 시판 중이며 상품명 NOA 61, NOA 63, NOA 65, NOA 68 등이 있음)는 다관능성 티올 및 다관능성 알릴(allyl) 모노머를 포함하는 액상 UV 경화성 모노머 혼합물이다.

특정 구체예에 따르면, 폴리우레탄 아크릴레이트(PU)와 상품명 NOA 68과 같은 NOA계 접착제의 블렌드를 사용할 수 있다. 이때, 블렌드 중 폴리우레탄 아크릴레이트(PU) 및 NOA계 접착제 각각의 함량은, 예를 들면 약 20 내지 80 중량%(구체적으로 약 30 내지 70 중량%, 보다 구체적으로 약 40 내지 60 중량%) 및 약 80 내지 20 중량%(구체적으로 약 70 내지 30 중량%, 보다 구체적으로 약 60 내지 40 중량%) 범위일 수 있다. 이하에서는 상기 PU 및 NOA계 접착제의 블렌드로부터 제조되는 고분자를 "PUNO"라고 지칭한다.

이와 관련하여, NOA 63은 NOA 61 약 70 내지 75 중량% 및 우레탄 성분 약 25 내지 30 중량%를 함유하며, NOA 61은 실질적으로 하기 화학식 I로 표시되는 테트라티올 약 55 내지 57 중량% 및 트리알릴 이소시아누레이트 약 43 내지 45 중량%로 이루어진다.

[화학식 1]

상술한 나노 패턴 구조물은 특정 제조방법으로 한정됨이 없이 당업계에 공지된 방식을 이용할 수 있다.

도 4는 본 개시 내용의 예시적 구체예에 따라 제1 고분자 재질의 복수의 나노필라가 형성된 나노 패턴 구조물을 제조하는 일련의 과정을 도시하는 도면이다.

먼저, 복수의 나노 스케일의 홀(12)이 형성된 마스터 몰드(11)를 제공한다. 상기 마스터 몰드는, 예를 들면 실리콘(Si) 웨이퍼, PDMS(Polydimethylsiloxane), 글래스(Glass), 석영(Quartz), PET(polyethylene terephthalate), PC(polycarbonate), PE(polyethylene), PU(polyurethene), COC(cyclic olefin copolymer) 등과 같이 다양한 재료로부터 선택하여 사용할 수 있다. 이때, 마스터 몰드(11)의 재질과 제1 고분자는 전형적으로는 상이할 것이나, 경우에 따라서는 상이할 수 있다.

이와 관련하여, 마스터 몰드(11) 내에 형성된 나노 스케일의 홀 또는 나노 홀(12)은 추후 형성되는 제1 고분자 재질의 나노필라에 대응되는 형상 및 치수를 갖고 있는 바, 원형, 타원형, 사각형 등의 다양한 형태를 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는 원형일 수 있다. 이러한 나노 스케일의 홀(12)은 포토리소그래피법, 이온 밀링, e-beam 리소그래피법 등과 같이 당업계에 알려진 가공 기술에 의하여 형성될 수 있다. 본 발명이 특정 가공 기술로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 포토리소그래피법을 이용한 선택적 에칭 공정을 적용할 수 있다. 또한, 포토리소그래피법에서 이용 가능한 에칭 방법으로는 건식 에칭법, 예를 들면 반응성 이온 에칭법(reactive ion etching; RIE), 유도 결합 플라즈마 반응성 이온 에칭(inductively coupled plasma reactive ion etching; ICP-RIE), 화학적 이온 빔 에칭(chemically assisted ion beam etching; CAIBE) 등을 이용할 수 있으나, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

예시적 구체예에 따르면, 나노 스케일의 홀(12)의 직경은 약 100 내지 1000 nm(구체적으로 약 300 내지 900 nm, 보다 구체적으로 약 400 내지 700 nm), 그리고 홀(12)의 깊이는 약 100 내지 1500 nm(구체적으로 약 300 내지 1000 nm, 보다 구체적으로 약 500 내지 900 nm) 범위일 수 있다. 또한, 복수의 홀(12) 사이의 간격은 약 100 내지 3500 nm, 구체적으로 약 300 내지 2500 nm 범위, 보다 구체적으로 약 500 내지 1500 nm 범위일 수 있다. 본 발명이 전술한 나노 스케일의 홀(12)의 수치 범위로 한정되는 것은 아니며, 고분자(제1 고분자 및 후술하는 제2 고분자)의 재질, 복합 나노구조체의 용도 등을 고려하여 적절하게 조절될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

마스터 몰드(11)가 제공되면, 선택적으로 이물질을 제거하기 위한 세정 단계가 수행될 수 있다. 이러한 세정을 위하여, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 이소프로판올 등이 사용 가능하며, 경우에 따라서는 표면에 잔류하는 유기 물질을 제거하기 위하여 플라즈마 처리가 수행될 수도 있다.

상기 마스터 몰드(11) 상에 제1 고분자(또는 제1 고분자 형성용) 용액을 도포하여 고분자 층(13)을 형성한다(일종의 나노 캐스팅 또는 나노 몰딩 방식일 수 있음). 이때 도포 방식은 당업계에서 알려진 도포 방법, 예를 들면 스핀 코팅, 회전 코팅, 스프레이 코팅 등을 적절히 선정하여 적용할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 제1 고분자 층(13)을 도포한 후에 선택적으로 약 1 내지 500 μm(구체적으로 약 5 내지 300 μm, 보다 구체적으로 약 20 내지 200 μm) 두께의 고분자 재질의 연성 지지 필름층(14)을 부착하고 롤링함으로써 제1 고분자가 마스터 몰드 내 나노 스케일의 홀에 충분히 주입되도록 하는 것이 유리할 수 있다. 이때, 지지 필름층의 재질로는 예를 들면, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 사이클로올레핀 고분자(cyclo olefin polymer; COC), 폴리에틸렌(PE), 폴리카보네이트(PC), 폴리에테르에틸케톤(PEEK), 폴리아미드(PA), 폴리우레탄(PU) 등을 예시할 수 있다. 이러한 지지 필름층(14)은 유연성이 양호한 것이 바람직하며, 또한 후속 단계에서 이루어질 수 있는 UV 조사를 원활히 수행할 수 있도록 투명성을 갖추는 것도 바람직할 수 있다.

또한, 지지 필름층(14)의 부착(도포) 이후에 수행되는 롤링 과정이, 전형적으로 상온 내지 90 ^oC의 온도 범위에서 수행될 수 있는 점, 그리고 나노 웹 구조가 비교적 저온(예를 들면, 약 10 ^oC 이하)에서 합성될 수 있는 점을 고려할 때, 이러한 온도 범위에서 내구성을 유지할 수 있는 종류를 선정하는 것이 유리할 수 있다. 이외에도, 나노 웹 구조가 산성 조건(예를 들면, 산 용액) 내에서 형성될 경우, 사용되는 산 성분을 비롯한 기타 화학 물질(예를 들면, 아세톤 등을 이용한 세척)에 대한 내화학성이 확보하는 것이 유리할 수도 있다.

선택적으로, 후속 과정에서 마스터 몰드(11)로부터 고분자 층(13)이 보다 용이하게 분리될 수 있도록 제1 고분자의 도포에 앞서 이형제(예를 들면, 플루오로알킬실란, 구체적으로 트리데카플루오로-(1,1,2,2)-테트라하이드로옥틸-트리클로로실란과 같은 저에너지 이형제)를 사용할 수도 있을 것이다.

이처럼, 형성된 고분자 층(13)은, 예를 들면 경화 과정을 통하여 일정한 탄성을 갖게 된다. 상기 경화 과정은 자외선(UV) 경화, 열 경화 등의 다양한 방식으로 이루어질 수 있는 바, 예를 들면 제1 고분자로서 실리콘계 탄성 고분자인 PDMS를 사용할 경우, 고분자와 함께 경화제를 함께 사용하여 고분자 용액을 제조하는데, 이때 고분자(PDMS) : 경화제의 중량 비는 당업계에서 통상적으로 사용되는 범위, 예를 들면 약 10 : 1 내지 약 11 : 1 범위일 수 있다. 경화제로서, 대표적으로는 Dow Corning사에 의하여 시판 중인 2액형의 Sylgard 184 키트(Sylgard A : Sylgard B=10:1)가 바람직하게 사용될 수 있다. 이와 같이 제조된 고분자 용액을 마스터 몰드 상에 도포한 후에 가열하여 경화시킴으로써 고분자 층(13)을 형성할 수 있다.

제1 고분자로서 폴리우레탄 아크릴레이트(PU)와 NOA계 접착제(예를 들면, 상품명 NOA 68)의 블렌드를 사용할 경우, 예를 들면, 약 1000 내지 2000 rpm 조건 하에서 마스터 몰드에 스핀코팅하고, 이후 그 위에 지지 필름으로서 예를 들면, PET 필름을 부착한 다음, 롤러를 이용하여 롤링한다. 후속적으로, UV 조사에 의하여 PUNO 고분자를 경화시키는 바, 이때, 자외선의 강도는, 예를 들면 약 100 내지 600 mJ/ cm², 구체적으로 약 200 내지 500 mJ/ cm², 보다 구체적으로 약 400 내지 480 mJ/ cm² 범위일 수 있다.

상기와 같이 경화된 제1 고분자 층(13)을 마스터 몰드(11)로부터 분리하여 나노 패턴 구조물(15)을 얻는다. 이러한 분리 방법으로, 예를 들면 용매 사용 방법, 습식 화학 에칭 방법, 박리(peeling) 방법 등 당업계에 알려진 다양한 방식이 채택될 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 나노 패턴 구조물은 전형적으로 소수성(또는 초소수성) 및 항박테리아성을 나타낼 수도 있다.

예시적 구체예에 있어서, 나노 패턴 구조물 중 나노필라의 종횡비(aspect ratio)는 용도, 재질 등을 고려하여 적절한 범위로 조절될 수 있는 바, 예를 들면 약 1 내지 10, 구체적으로 약 2 내지 7, 보다 구체적으로 약 3 내지 5의 범위일 수 있다. 이와 관련하여, PDMS의 기계적 물성(E < 10 MPa; σ_ult < 2.4 MPa)은 PUNO의 기계적 물성(E=24 MPa; σ_ult = 11.5 MPa)에 비하여 낮기 때문에 마스터 몰드로부터 분리하는 과정에서 손상될 수 있기 때문에 PUNO 재질의 나노필라에 비하여 낮은 종횡비를 가질 수 있다.

택일적 구체예에 따르면, 본 출원인의 국내특허공개번호 제2015-0053303호에 기재되어 있는 바와 같이 고분자 몰드를 이용하여 나노 패턴 구조물을 제작할 수 있는 바, 상기 특허문헌은 본 명세서의 참고자료로 포함된다. 이외에도, 복수의 나노 스케일의 필라(또는 로드) 형상을 갖는 나노 패턴 구조물을 제공할 수 있는 한, 특정 방법으로 한정됨이 없이 다양한 방식이 채택 가능하다.

표면 개질 금속층의 부착

일 구체예에 따르면, 상술한 바와 같이 제작된 나노 패턴 구조물(15) 상에 표면 개질용 금속층을 부착한다. 이러한 표면 개질용 금속층은 후술하는 나노 웹 구조의 형성 과정에서 제2 고분자의 성장을 촉진하는 촉매 역할을 한다. 물론, 이러한 표면 개질용 금속층의 부착 없이도 나노 패턴 구조물 상에 나노 웹 구조가 어느 정도 형성될 수는 있으나, 형성 정도 및 형성 시간 면에서 표면 개질용 금속층을 개재한 경우가 더욱 유리하다. 본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 이러한 금속층이 고분자와의 접착력을 향상시킬 뿐만 아니라, 촉매로 작용하여 후술하는 나노 웹 구조의 형성을 촉진시키는 역할을 하기 때문으로 판단된다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 표면 개질용 금속층의 예로서 Ni, Zn, Pd, Ag, Cd, Pt, Ga, In, Au 등, 보다 구체적으로는 Au, Ag 등을 들 수 있으며, 이들 금속을 단독으로 또는 조합하여(또는 합금 형태로) 형성할 수 있다.

특정 구체예에서는 표면 개질용 금속층의 재질로서 Au를 사용할 수 있는데, Au는 양호한 내산화성 및 내부식성, 생물학적 실험에서 사용시 비활성 표면을 제공할 수 있고, 전기전도성 및 열 전도성이 양호하며, 광 반사도(optical reflectivity)가 높고, 평활한 표면을 얻을 수 있는 등의 표면 특성을 갖고 있다. 이러한 특성을 이용하여, 예를 들면 생명과학 분야에서 유용한 기재로 사용되거나, 화학 및 생화학 센서에서 시그널 변환기(transducer)로 적용되고 있다. 또한, Au 박막은 비활성 특성을 이용하여 미세유체 디바이스에서 표면 강화 라만 산란(surface enhanced Raman scattering) 기재로도 사용될 수도 있다.

특정 구체예에 있어서, 표면 개질용 금속층은 당업계에서 알려진 방법, 열 증착(thermal vapor deposition), 스퍼터링, E-beam 증착 등을 이용하여 나노 패턴 구조물 상에 형성될 수 있다. 표면 개질용 금속층의 두께는, 예를 들면 약 1 내지 500 nm, 구체적으로 약 5 내지 300 nm, 보다 구체적으로 약 50 내지 200 nm 범위일 수 있다. 상기 나노 패턴 구조물에 대한 표면 개질용 금속층의 피복율(coverage)는, 예를 들면 적어도 약 70%, 구체적으로 적어도 약 80%, 보다 구체적으로 적어도 약 90%, 더 나아가 실질적으로 100%일 수 있다.

전술한 표면 개질 금속층, 특히 Au 층은 양호한 물리화학적 특성에도 불구하고, 하측의 고분자 기반의 나노 패턴 구조물의 표면과의 부착성이 좋지 않을 수 있다. 이는 고분자 또는 고분자 기반의 표면이 낮은 표면 에너지, 비상용성, 화학적으로 비활성이거나 약한 경계층(boundary layer)의 존재로 인하여 젖음성 및 결합성(bonding)이 낮기 때문이다. 이와 같이 하측의 나노 패턴 구조물의 표면에 대한 부착 곤란성을 완화할 목적으로, 특정 구체예에서는 나노 패턴 구조물과 표면 개질용 금속층 사이에 선택적으로 중간층(intermediate layer)을 개재할 수 있다(예를 들면, 표면 개질용 금속층/중간층의 2층 구조). 이러한 중간층으로서, 접착성이 양호한 금속, 예를 들면 Ti, V, Cr, Sc, Nb, Mo, W 등, 보다 구체적으로 Ti, Cr 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 금속은 나노 패턴 구조물의 표면 상에서 극성 원자와 화학적 결합을 형성할 수 있기 때문에 상면의 표면 개질용 금속층과 하면의 고분자 재질의 나노 패턴 구조물이 견고하게 부착될 수 있도록 하는 것으로 판단된다.

다만, 상기 나열된 중간층 형성용 금속 중 Cr은 Au 층의 접착성을 개선시킬 수는 있으나, Au 표면으로 확산하여 Au 층의 형태학적 특징 또는 전기적 물성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서는 중간층으로서 Ti, 그리고 표면 개질용 금속층으로서 Au를 사용한 Au/Ti의 2층(binary layer) 구조를 적용할 수 있다.

상술한 구체예에서, 중간층 역시 열 증착(thermal vapor deposition), 스퍼터링, E-beam 증착 등과 같은 공지의 방법을 이용하여 나노 패턴 구조물 상에 부착될 수 있다. 예를 들면 약 1 내지 500 nm, 구체적으로 약 5 내지 300 nm, 보다 구체적으로 약 10 내지 100 nm 범위일 수 있다. 이와 관련하여, 표면 개질 금속층/중간층의 두께 비는 전형적으로 약 1 내지 50, 구체적으로 약 3 내지 20, 보다 구체적으로 5 내지 10의 범위로 조절될 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 전술한 표면 개질용 금속층(및 중간층)의 형성 단계는, 예를 들면 50 ^oC의 챔버 온도에서 수행될 수 있고, 예를 들면 타겟(Au 등)에만 특이적으로 레이저를 조사하여 타겟의 유리 전이 온도까지 가열, 증착 대상인 나노 패턴 구조물에 증착시킬 수 있고, 이때 증착 두께는 증착 시간에 따라 조절할 수 있을 것이다.

나노 웹 구조의 형성

일 구체예에 따르면, 상술한 바와 같이 나노 패턴 구조물 상에 표면 개질용 금속층이 형성되면, 특히 상기 표면 개질용 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물에 대하여 제2 고분자를 성장시켜 나노 웹 구조를 형성한다.

도 5는 본 개시 내용의 일 구체예에 있어서 표면 개질용 금속층이 부착된 제1 고분자 재질의 나노 패턴 구조물의 나노필라에 제2 고분자의 나노 섬유 구조가 성장하여 웹 구조를 형성하는 원리를 도시하는 도면이다.

상기 도면에 도시된 바에 따르면, 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 중 나노필라의 표면은 제2 고분자의 성장 면으로 작용한다. 구체적으로, 나노필라의 측면의 적어도 일 지점(구체적으로 복수의 지점)으로부터 횡 방향(나노필라 측면 기준으로, 예를 들면 약 10 내지 170° 방향, 구체적으로는 약 30 내지 150° 방향, 보다 구체적으로는 약 60 내지 120° 방향, 특히 실질적으로는 약 90° 방향)으로 성장한 제2 고분자의 나노 섬유(예를 들면, 성장하는 섬유 스트랜드의 단부가 쐐기 또는 웨지 형상을 가짐)는 인접하는 나노필라의 적어도 일 지점(구체적으로 복수의 지점)으로부터 횡 방향으로 성장된 제2 고분자의 나노 섬유와 합쳐져 상호 연결됨으로써 웹(web) 또는 메쉬 구조와 유사한 네트워크(network)를 형성하게 된다. 또한, 제2 고분자의 섬유 구조는 나노필라의 상면에서도 성장할 수 있는 바, 이때 상면에서의 성장 방향은 배향 또는 비배향(예를 들면, 섬유 스트랜드가 상호 간에 랜덤 방향 또는 방사형으로 배열됨)일 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 복수의 나노필라 사이를 상호 연결하도록 성장하는 제2 고분자 섬유(스트랜드)의 직경은 약 10 내지 200 nm, 구체적으로 약 30 내지 100 nm, 보다 구체적으로 약 50 내지 80 nm 범위일 수 있다. 또한, 나노 웹의 평균 메쉬 사이즈는 약 1 내지 1,500 nm, 구체적으로 약 50 내지 1,200 nm, 보다 구체적으로 약 100 내지 1,000 nm 범위일 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 제2 고분자는 폴리에테르케톤(PEK, PEEK, PEEKK), 폴리설폰(PSU; 예를 들면 상품명 Udel, 폴리에테르 설폰, 폴리페닐에테르설폰, 폴리페닐렌, 폴리이미다졸, 폴리이미드, 폴리아미드이미드, 및 폴리아닐린(polyaniline; PANI) 구체적으로 폴리아닐린등을 예시할 수 있으며, 이를 단독으로 또는 조합하여 선택할 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 나노 웹 형성을 위한 제2 고분자의 중합 반응은 주형을 이용한 방법, 또는 계면 방식, 시딩(seeding) 방식 및 미셀(micellar) 방식과 같은 주형을 이용하지 않는 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

특정 구체예에 따르면, 제2 고분자로서 폴리아닐린을 사용할 수 있는 바, 이때 사용 가능한 아닐린 모노머의 경우, 예를 들면 치환되거나(예를 들면, p-CH₃, p-OCH₃, o-CF₃, m-CF₃, p-COOH, o-NH₂, p-NH₂ 등으로 치환 가능함), 치환되지 않은 아닐린, 구체적으로 치환되지 않은 아닐린일 수 있다.

특정 구체예에서 상기 제2 고분자로서 하기 일반식 1로 표시되는 반복단위를 갖는 폴리아닐린이 사용될 수 있다.

[일반식 1]

상기 구체예에 있어서, 폴리아닐린은 전도성 고분자로서 제조 및 도핑이 용이하고 환경적으로도 안정하기 때문에 센서, 태양전지, 디스플레이, 배터리 전극, 내부식성 코팅 등에 적용하는데 적합하며, 예를 들면 약 1,000 내지 100,000, 구체적으로 약 5,000 내지 90,000, 보다 구체적으로 약 10,000 내지 6,5000의 중량평균분자량(M_w)을 가질 수 있다.

폴리아닐린은 전형적으로는 산성 매질 내에서 아닐린 모노머를 화학적으로 중합하는 방식(교반 또는 비교반 조건 하에서)으로 합성될 수 있다. 대표적으로, 아닐린 모노머를 함유하는 산성 수용액 매질 내에서 산화제(oxidant)를 사용한 화학적 산화 방식을 채택할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리아닐린의 중합 반응 및 최종 생성물의 특성에 영향을 미치는 파라미터로서, 전형적으로 반응 매질, 산화제의 사용량(농도), 반응 시간, 반응 매질의 온도 등을 예시할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 산성 수용액 매질 내에 사용되는 산의 종류로서, 예를 들면, 염산, 황산, 질산, 과염소산, β-나프탈렌설폰산(β-naphtalenesulfonic acid), 폴리(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산(poly(2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid), 폴리(스티렌설폰산) 등의 다양한 무기산 및/또는 유기산(고분자산)을 사용할 수 있다. 예시적으로, 아닐린 모노머는 수용액 매질 내에, 예를 들면 약 0.1 내지 3 중량%, 구체적으로 약 0.9 내지 3 중량%, 보다 구체적으로 약 0.9 내지 1 중량%의 범위로 함유될 수 있다.

특정 구체예에 있어서, 산성 매질 내 산 : 아닐린 모노머의 몰 비는, 예를 들면 약 1 : 0.001 내지 약 1 : 0.1, 구체적으로 약 1 : 0.01 내지 약 1 : 0.05, 보다 구체적으로 약 1 : 0.01 내지 약 1 : 0.02 범위일 수 있다. 상기 산성 매질의 pH 범위는, 예를 들면 약 -1 내지 7, 구체적으로 약 -1 내지 2, 보다 구체적으로 약 1 내지 2 범위일 수 있다. 상술한 수치 범위는 예시적인 것으로서, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것이 아님을 주목해야 한다.

또한, 산화제로서, 예를 들면 암모늄 퍼설페이트, 암모늄 퍼옥시디설페이트, 소디움 퍼설페이트, 포타슘 퍼설페이트, FeCl₃, CuCl₂, 과산화수소, 과망간산칼륨 등을 사용할 수 있다. 상술한 산화제의 사용량은 아닐린 모노머의 중량 기준으로, 예를 들면 약 1 내지 100 중량%, 구체적으로 약 30 내지 60 중량%, 보다 구체적으로 약 40 내지 50 중량% 범위일 수 있다. 이외에도, 중합 반응 시간은, 예를 들면 약 1 내지 60 시간, 구체적으로 약 12 내지 60 시간, 보다 구체적으로 약 15 내지 24 시간 범위일 수 있다.

상술한 구체예에 있어서, 폴리아닐린은 수불용성이므로 중합이 진행됨에 따라 고분자의 침전물이 형성된다. 본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 모노머 분자들이 먼저 특정 과포화 레벨로 축적된 후에 핵 형성 및 성장 과정을 거치는 것으로 볼 수 있는 바, 여기서 핵은 모상(parental phase) 내에서 순간적으로(균일한 방식으로) 형성되거나, 또는 용액 내의 다른 종류의 표면(구체적으로, 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물) 상에서 불균일한 방식으로 성장하게 된다.

이와 관련하여, 중합 반응은, 예를 들면 약 0 내지 10 ℃, 구체적으로 약 2 내지 7 ℃, 보다 구체적으로 약 3 내지 5 ℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 이와 같이, 비교적 낮은 온도 범위에서 중합 반응을 수행함으로써 생성된 폴리아닐린은 불균한 방식으로 핵 형성이 이루어지는 경향을 갖게 되는 바, 핵과 기재와의 계면 에너지를 최소화할 수 있기 때문에 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 보다 견고한 결합이 이루어질 수 있는 것으로 판단된다.

또한, 폴리아닐린 중합 반응을 보다 높은 온도, 예를 들면 상온에서 수행할 경우, 폴리아닐린 섬유(fiber)의 성장 속도가 빨라지기는 하나, 이 경우 형성되는 고분자 간의 응집 경향 역시 증가할 수 있다. 이 때문에 전술한 바와 같이 비교적 저온에서 중합반응을 수행할 경우, 반응 속도를 늦추도록 하여 나노 구조물 전체에 걸쳐 효과적인 중합 반응이 일어날 수 있고, 특히 폴리아닐린 섬유를 나노 패턴 구조물 내 나노필라 사이에 나노 웹 구조가 균일하게 성장할 수 있는 것으로 판단된다.

전술한 바와 같이, 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물에 나노 웹이 형성된 복합 나노 구조체는 나노 웹의 형성 전의 표면과 상이한 특성을 갖게 된다. 구체적으로, 제2 고분자로서 폴리아닐린 재질의 나노 웹이 형성될 경우, 소수성을 나타내는 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물이 친수성을 나타내도록 특성이 변화한다. 예를 들면, 나노 웹 형성 전 나노 구조물의 수접촉각은, 예를 들면 약 80 내지 150°(구체적으로 약 90 내지 130°)인 반면, 나노 웹 형성 후에는 예를 들면 약 5 내지 50°(구체적으로 약 10 내지 30°)으로 감소할 수 있다.

또한, 나노 웹 형성 전의 나노 패턴 구조물의 나노필라는 상호 간격이 좁고 외부에서 작용하는 물리적인 힘에 의하여 쉽게 변형이 될 수 있는데, 이는 연성 구조물의 경우 외부에서 가해주는 힘에 따라 변형된 이후 근접 거리가 가까워지며 이후 반데르발스 힘에 의하여 상호 엉겨붙게 되면 보다 강력한 결합력으로 원래의 구조를 유지하기 곤란하기 때문이다. 그러나, 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체의 경우, 나노필라 사이에 형성된 구조의 강성이 증가하게 되고 일종의 중간 범퍼층으로 작용하여 외부에서 가해주는 힘(수평 및/또는 수직 힘)의 크기가 증가하더라도 나노필라의 구조 일부가 변형이 될 수 있다 해도 전체적인 구조를 일정 수준으로 지지할 수 있다. 또한, 중간에 형성된 복합 나노구조체의 형상 또는 모양은 일정하게 유지할 수 있다.

상기와 같이 제조된 복합 나노구조체는 유연성을 갖는 물품(예를 들면, 장갑, 섬유 등)의 표면에 부착할 수 있다. 특히, 제조 과정 중 나노구조체 내 나노필라의 길이, 직경, 나노필라 사이의 간격 등을 용이하게 조절할 수 있는 바, 특히 나노필라 사이의 간격을 조절함으로써 궁극적으로 이의 형태, 특성 등을 제어할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예에서는 도 6에 도시된 순서에 따라 복합 나노 구조체를 제작하였다. 본 실시예에서 사용된 물질 및 장치는 하기와 같다:

- UV-경화성 접착제: NOA 63(Norland Optical Adhesives)

- PET 필름: 일본 Mitsubishi사 (두께: 50 μm)

- 폴리우레탄 아크릴레이트(PU): 일본 Minuta Tech사의 제품명 MINS-311RM

- 과염소산(Perchloric acid; HClO₄): 한국, OCI사(농도: 70%)

- 아닐린 모노머: Sigma-Aldrich(99.5%)

- 암모늄 퍼설페이트(Ammonium Persulfate): Sigma-Aldrich (98%)

- 반응기: Neo 60 폴리프로필렌 박스(KOMAX, Korea)

- Si 웨이퍼: LG 실트론사의 제품명 8인치 웨이퍼 (두께: 0.7 mm)

- E-beam evaporator: Evatac Process System사의 제품명 BAK641

마스터 몰드의 제작

Si 웨이퍼를 퍼니스(Centrotherm사의 제품명 Furnace E1200)에 넣고 1500 nm 두께의 SiO₂ 층을 형성하였다. 이후, 0.7 ㎛ 두께에 상당하는 량의 포토레지스트로서 Dongjin Semichem사의 제품명 SKKA-8670을 Si 웨이퍼 상에 스핀코터(SEMES 사의 제품명 Kspin 8)로 3000 rpm에서 60 초 동안 도포하였다. 그 다음, 마스크(mask)를 사용하여 포토레지스트가 도포된 Si 웨이퍼 표면에 UV 광(세기: 30 mJ/cm²)을 조사하여 노광하였다. 이후, 현상액(developer)을 이용하여 포토레지스트를 제거하고, 그 다음 ICP(Lam Research사의 제품명 TCP9400 SE) 및 가스 혼합물(Cl₂, HBr 및 O₂)을 이용하여 에칭하였다. 그 결과, Si 웨이퍼에 복수의 나노 홀이 형성되었으며, 이때 나노 홀의 직경, 깊이 및 나노 홀 사이의 간격은 각각 500 nm, 1000 nm 및 500 nm이었다.

나노 패턴 구조물의 제작

복수의 나노홀이 형성된 Si 웨이퍼를 주형으로 하여 대면적 나노필라 어레이(나노 패턴 구조물)를 제작하였다. 구체적으로, 폴리우레탄 아크릴레이트(PU) 및 NOA 68 을 3 : 7(중량 기준)의 비율로 교반 하에서 혼합하여 액상의 고분자 블렌드(PUNO)를 제조하였다. 상기 고분자 블렌드를 앞서 제작된 마스터 몰드 상에 스핀 코팅(조건: 30초 간 1200 rpm)에 의하여 도포하여 마스터 몰드 상에 약 100 ㎛의 두께를 갖는 필름을 형성시켰고, 이에 진공을 가하여 기포를 충분히 제거하였다. 상기 스핀코팅된 PUNO 고분자 필름의 표면 상에 PET 필름을 덮어주고 롤러를 이용하여 충분히 롤링시킴으로써 PET 필름과 PUNO 필름 사이의 기포를 제거하였다. 상기 얻어진 필름 복합체(PET 필름/PUNO 필름/마스터 몰드)에 480 mJ/cm² 강도의 UV를 1분 동안 조사하여 PUNO 필름을 경화시켰다. 이후, 형성된 PUNO 고분자 층을 마스터 몰드로부터 박리하여 나노 패턴 구조물을 얻었으며, 추가적으로 자외선(UV)을 5분 동안 조사하였다. 분석 결과, 나노 패턴 구조물(즉, 나노 패턴이 형성된 필름 형상의 구조물)에 형성되어 있는 나노필라의 직경, 높이, 그리고 복수의 나노필라 사이의 간격은 각각 500 nm, 1000 nm 및 500 nm이었다.

표면 개질용 금속층의 부착

상술한 바와 같이 제작된 나노 패턴 구조물 상에 E-beam evaporator를 사용하여 Ti를 20 nm 두께로 증착하였고, 이후 Au를 200 nm 두께로 순차적으로 증착하여 나노 패턴 구조물 상에 Au/Ti 금속층을 형성하였다. E-beam evaporator는 50 ^oC로 조절된 챔버 내에서 작동되었으며, 각각의 타겟 금속(Ti 및 Au)에 특이적으로 레이저를 조사하여 해당 금속의 유리전이온도까지 가열하여 증착시켰다(증착 조건: 2000 Å, 10초 당 1 nm 두께로 증착). 이때, Ti는 200 초, 그리고 Au는 1000 초 동안 증착시켰다.

나노 웹의 형성

Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물을 기재로 하여 하기의 절차에 의하여 폴리아닐린(PANI) 재질의 나노 웹을 형성하였다. 상기 나노 웹의 형성에 수반되는 혼합 및 중합 반응은 모두 3℃의 냉장고 내에서 수행하였다.

6L 용량의 폴리프로필렌 박스에 940 mL 의 탈이온수(DI water) 및 60.16 mL 의 과염소산(1 M)을 투입하여 혼합하였으며, 추가적으로 1.53 g의 암모늄 퍼설페이트 (0.0067 M) 을 투입하여 혼합하였다. 그 다음, 중합 반응 직전에 아닐린 모노머 900 μL(0.001 M)를 투입한 합성 용액을 제조하고, 이에 Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물을 함침시켜 24 시간 동안 중합 반응을 수행하였다. 중합 반응이 종료된 후, 복합 나노구조체를 꺼내고 잔여 미반응물을 탈이온수로 세척하여 제거하였다.

본 실시예에서 제작된 (a) PUNO 재질의 나노 패턴 구조물, (b) Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 및 (c) PANI 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체 기반 필름 각각에 대한 외관 사진, 모식도 및 SEM 사진을 도 7에 나타내었다.

상기 도면에 나타낸 바와 같이, PUNO 재질의 나노 패턴 구조물 중 나노필라가 Si 마스터 몰드의 나노 홀에 대응하여 형성되었고, 나노 패턴 구조물의 표면에 Au/Ti 금속층을 부착한 후 중합 반응에 의하여 폴리아닐린(PANI) 재질의 나노 웹 구조가 이의 표면에 형성되었다. 특히, 복합 나노구조체 기반 필름 중 나노필라의 측면으로부터 폴리아닐린 섬유(또는 스트랜드)가 성장하여 인접하는 나노필라의 측면으로부터 성장된 폴리아닐린 섬유(또는 스트랜드)와 합쳐져 메쉬 구조와 유사한 네크워크를 형성함을 확인할 수 있다.

또한, 폴리아닐린 재질의 나노 웹 구조의 형성 전 나노필라 자체의 직경은 약 500 nm이었고, 폴리아닐린으로 피복된 나노필라의 직경은 약 550 nm이었다. 폴리아닐린의 형성 과정을 거친 후, 나노필라의 깊이(복수의 나노필라 사이의 바닥면 상에 폴리아닐린이 성장한 상태에서의 깊이)는 약 800 nm이었다. 또한, 나노필라 사이에 형성된 폴리아닐린 나노 웹의 두께는 약 150 nm이었다.

복합 나노구조체 기반 필름의 분석

- 표면 상 EDS (Energy Dispersive X-ray Spectrometry) 분석

EDS 장비를 이용하여 (a) PUNO 재질의 나노 패턴 구조물, (b) Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물, 및 (c) PANI 재질의 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체 기반 필름 각각에 대한 표면 상 EDS 분석 결과를 SEM 사진과 함께 도 8에 나타내었다.

검출된 특성 X-선을 분석한 결과, (a) 나노 패턴 구조물의 경우에는 PUNO 고분자를 구성하는 C, O 및 S의 특성 피크가 주로 검출되었고, 마스터 몰드로부터 기인하는 Si의 특성 피크가 미량 검출되었다. (b) Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물의 경우에는 Au에 상당하는 특성 피크가 두드러짐을 알 수 있는 바, 이는 구조물의 표면 상에 Au가 치밀하게 존재함을 의미한다. 한편, (c) PANI 재질의 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체 기반 필름의 경우에는 부착된 Au 이외에 나노 웹을 구성하는 폴리아닐린으로부터 기인하는 질소(N)에 대응하는 특성 피크가 검출되었다. 상술한 SEM 사진 및 EDS 분석 결과로부터 표면 개질용 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물에 나노 웹 구조의 폴리아닐린이 형성되었음을 확인할 수 있다.

- 수접촉각의 변화 측정

접촉각 측정기를 이용하여 (a) 나노 패턴 구조물, (b) Au/Ti 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물, 및 (c) PANI 나노 웹이 형성된 복합 나노구조체 기반 필름 각각에 대한 수접촉각을 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, PUNO로 이루어진 나노 패턴 구조물 및 표면 개질용 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 모두 수접촉각이 130°로서 물에 대한 젖음성이 낮았다(즉, 높은 소수성). 반면, 폴리아닐린 나노 웹 구조가 형성됨에 따라 수접촉각이 20°로 급격히 감소하였는 바, 이는 물에 대한 젖음성이 현저히 증가하였음을 의미한다(즉, 친수성의 증가). 이러한 결과로부터 나노 웹을 통하여 나노 패턴 구조물의 표면 특성을 변화시킬 수 있음이 확인되었다.

- 복합 나노구조체 기반 필름의 수평 방향 외력에 대한 내성 테스트

본 실시예에서 제작된 복합 나노구조체 기반 필름의 강성을 평가하기 위하여, 수평 방향으로 힘을 가하여 발생하는 나노구조의 변형 정도를 SEM으로 관찰하였고, 가한 수평 압력에 대한 복합 나노구조체 내 나노필라의 각도 변화 정도를 도 10a에 나타내었다.

내성 테스트 결과, 수평 방향 외력의 크기가 증가함에 따라 수직 방향으로 배열된 나노필라가 점차 기울어졌으나, 복수의 나노필라 측면에서 성장하여 서로 연결되어 웹을 형성한 섬유 구조가 상호 완충 작용을 하기 때문에 상당한 외력이 가해짐에도 불구하고 기본 구조가 쉽게 붕괴되지 않음을 확인할 수 있다.

- 복합 나노구조체 기반 필름의 수직 방향 외력에 대한 내성 테스트

본 실시예에서 제작된 복합 나노구조체 기반 필름의 강성을 평가하기 위하여, 수직 방향으로 힘을 가하여 발생하는 나노구조의 변형 정도를 SEM으로 관찰하여 그 결과를 도 10b에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 588 kPa의 수직 압력까지는 복합 나노구조체 내의 기본 나노필라 어레이의 형태가 유지되었으며, 보다 높은 1961 kPa의 압력에서는 전체적으로 복합 나노구조체의 구조가 붕괴되었음을 확인할 수 있다. 이와 같이, 수직 방향으로 588 kPa까지의 높은 압력(외력)에 대하여도 나노필라의 기본 형태가 유지되는, 양호한 내성을 나타내는 이유는 나노필라 측면에 형성된 나노 섬유 구조들이 나노필라와 나노필라를 연결하고 있어 상호 완충 작용을 하기 때문으로 판단된다.

- 다양한 물체의 표면에 대한 외력 내성 테스트

손을 이용하여 상기 복합 나노구조체 기반 필름을 도마에 문지르는 방식으로 외력을 가하였으며, 이때 유발된 변형 정도를 SEM으로 관찰하여, 문지르기 전(좌측) 및 문지른 후(우축)의 결과를 도 10c에 나타내었다.

상기 도면에서 나타난 바와 같이, 복합 나노구조체의 상부의 일부분에서 손상이 있었으나, 대부분의 구조는 유지됨을 알 수 있다.

비교예 1

나노 패턴 구조물의 제작 후 Au/Ti 금속층의 개재 없이 직접 나노 웹을 형성한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 복합 나노구조체를 제작하였다.

비교를 위하여, 상기와 같이 제작된 복합 나노구조체 및 실시예 1에 따라 제작된 복합 나노구조체 각각에 대한 SEM 사진을 도 11에 나타내었다.

상기 도면에 나타낸 바와 같이, 나노 패턴 구조물의 표면에 금속층의 부착 여부에 관계없이 복합 나노구조체를 형성할 수 있었다. 그러나, 표면 개질용 금속층이 부착된 경우에는 금속층이 일종의 촉매 역할을 수행하여 동일 시간 대비 웹 구조의 형성 속도가 빠르게 진행되는 반면, 금속층이 부착되지 않는 경우에는 폴리아닐린의 성장 속도가 현저히 감소하기 때문에 웹 구조를 형성하는데 상당히 많은 시간이 소요될 것으로 예상된다.

비교예 2

나노 웹의 형성 없이 실시예 1에서 제작된 나노 패턴 구조물에 대하여만 수직 및 수평 방향으로 힘을 가하여 발생하는 나노구조의 변형 정도를 SEM으로 관찰하였는 바, 외력을 가하기 전 및 외력(각각 160 kPa 및 1,200 kPa)을 가한 이후, 나노 패턴 구조물 내 나노필라 어레이의 형태 변화를 각각 도 12에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 나노 웹이 형성되지 않은 나노 패턴 구조물에 있어서 수직 방향으로 배열되어 있는 나노필라가 외부의 물리적 힘에 의하여 비교적 용이하게 변형되는 현상이 관찰되었다. 특히, 나노필라 간 거리가 근접하도록 변형된 이후에는 PUNO 고분자의 탄성 특성에도 불구하고 나노필라 사이에 발생하는 반데르발스 힘에 의하여 본래 구조를 유지하기 곤란한 것으로 판단되었다.

비교예 3

나노패턴이 형성되지 않은 필름 형태의 구조물을 제작하였다. 구체적으로, 시중에 판매하고 있는 PET 필름(Mitsubishi사)을 이용하여 적용하고자 하는 크기(2 x 2cm)에 맞춰 절단기를 이용하여 재단하는 방법으로 제작하였다.

실시예 2

바이오물질(박테리아)에 대한 포집 및 검출 테스트 절차

이하에서는, 실시예 1에 따르 제작된 복합 나노구조체 기반의 필름을 "b-SNAP 필름"으로, 그리고 비교예 3에 따른 필름을 "베어 필름(bare film)"으로 지칭한다.

- 프로브의 준비

뉴클라아제에 대하여 응답성을 갖는 이중 스트랜드 DNA 프로브(nuclease responsive DNA probe)는 GenoTech Corp.(Korea)에 주문 제작하였다. 사용된 프로브의 서열은 하기 표 3과 같다(푸른색은 미스매치를 표시함).

상기 표에 따르면, 이중 스트랜드 프로브의 양 말단에 형광체 및 소광체를 쌍으로 위치시켰다. 또한, 접착 말단(sticky-end)의 3' 말단에서 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 의한 교정 작업의 일환인 3' → 5' 핵산 분해작용이 일어나도록 미스매치를 발생시켰다. 다만, 상보적 염기서열이 5' 말단으로부터 3개 이상 떨어지게 되면 소광체(quencher)에 의한 효과가 감소되므로 1개의 미스매치만을 부여하였다.

핵산말단 분해효소 이외에 핵산내부 가수분해효소에 의한 분해 효과도 함께 작용하도록 프로브 내에 3 개의 미스매치(불일치) 염기 서열(mismatched bases)을 구성하였다.

각각의 올리고뉴클레오티드 프로브는 100 pmol로 증류수(DW)에 용해시켰다. 상보적인 올리고뉴클레오티드를 각각 20 pmol씩 어닐링 완충액(annealing buffer; 10 mM Tris(pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2.5 mM의 MgCl₂) 50 μL에 혼합하여 각각의 올리고뉴클레오티드의 최종 농도가 2 μM이 되도록 하였다.

이후 95 ℃에서 10분 동안 변성시키고 45 ℃에서 70분 동안 혼성화(hybridization)시켰다. 이와 같이 형성된 이중 스트랜드 DNA(dsDNA)는 형광체 및 소광체가 인접하여 형광 신호가 최소화된다.

- 박테리아 준비

그람-음성(gram-negative) 박테리아인 Escherichia coli (E. coli) O157:H7, Salmonella enteritidis (S. enteritidis) 및 Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica), 그리고 그람-양성(gram-positive) 박테리아인 Staphylococcus aureus (S. aureus), Bacillus cereus (B. cereus) 및 Listeria monocytogenes (L. monocytognes)를 준비하였다. 각각의 박테리아를 Luria-Bertani 브로스(LB broth)에서 12 내지 24 시간에 걸쳐 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 배양하였다.

각각의 박테리아의 농도를 10⁸ CFU/mL(colony-forming units per milliliter)로 조절하기 위하여, 600 nm에서 광학밀도를 측정하였다(Beckman Coulter DU-730, USA).

박테리아 시료(108 CFU/mL)들을 12,000 rpm에서 10 내지 20분 동안 원심분리 하였다. 이후, LB 상층액을 버리고, 박테리아를 PBS(phosphate buffered saline solution)에 분산시켜 박테리아 시료를 10³ CFU/mL에서 10¹⁰ CFU/mL까지 농도 별로 준비하였다. 박테리아 사균 시료(107 CFU)은 각각 100 ℃에서 1시간 동안 가열하거나, 70% EtOH을 이용하여 3시간 동안 처리하여 준비하였다.

- 박테리아의 포집

b-SNAP 필름을 5x5 ㎟ 크기로 준비하였으며, 농도 별로 준비한 박테리아 시료를 10 μL씩 적가하였다. 필름에 형성된 복합 나노구조체와 박테리아가 충분히 반응할 수 있도록 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 이후, b-SNAP 필름의 포집능을 정확하게 평가하기 위하여 PBS를 이용하여 농도 별로 박테리아를 적가한 후에 가혹한 수준으로 세척하였다. 복합 나노구조체 유무에 따른 비교 실험을 위하여, 베어 필름 역시 동일한 방식으로 처리하였다.

- SEM 샘플링 및 측정

E. coli O157:H7 및 S. aureus를 농도 별로 준비하여 b-SNAP 필름에 10 μL씩 적가하였다. 상온에서 1시간 정도 반응시킨 후, PBS를 이용하여 세척하였다. 이와 같이 준비된 시료를 Nova230(FEI company)를 이용하여 SEM으로 관찰하였다.

- 포집된 박테리아의 세포 용해 및 형광 측정

b-SNAP 필름으로 포집된 박테리아를 최적화된 세포용해 완충액을 이용하여 세포용해시켰다. 세포용해를 위한 완충액은 리소자임(lysozyme), 리소스타핀(lysostaphin), EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail), Tris-HCl(pH 7.4), NaCl, Triton X-100 및 CHAPS(3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)을 함유한 것이다.

이후, 준비된 프로브를 보호하고 뉴클레아제 활성을 높이기 위하여 세포용해된 박테리아 용액을 반응 완충액(reaction buffer; 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM CaCl₂)을 이용하여 10배 희석하였다. 사균 시료에 대하여도 동일한 방법으로 세포용해를 진행하였다.

각각의 시료에 대한 형광을 측정하기 전에, 10 μL dsDNA 프로브(20 μM) 및 100 μL의 반응 시료(reaction sample)를 혼합하였고, 그 다음 96-well 블랙 마이크로웰 플레이트(Greiner bioone, Germany)에 로딩하였다. 10¹ 내지 10⁷ CFU/rxn 범위의 개별 박테리아 시료의 형광 세기를 형광 스펙트로포토미터(Infiniteㄾ M200 PRO, Tecan Trading AG, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 여기 파장은 470 nm이고, 방출 파장은 520 nm이었다. 모든 데이터는 i-control™ software(Tecan Trading AG, Switzerland)를 이용하여 획득하여 분석하였다.

- 실제 시료의 준비

실제 시료에 대한 평가를 위하여, 도마(cutting board), 칼(knife), 샐러드(양배추 및 방울토마토) 및 식수를 준비하였다. 도마, 칼 및 샐러드의 표면을 E. coli O157:H7(10⁷ CFU/rxn) 및 S. aureus(10⁷ CFU/rxn)를 이용하여 인위적으로 오염시켰다. 또한, 식수에 E. coli O157:H7 및 S. aureus의 최종 농도가 10⁷ CFU/rxn이 되도록 각각 주입하였다.

테스트 결과 분석

- 바이오물질(박테리아)의 포집 분석

b-SNAP 필름에 대한 박테리아의 포집 테스트 결과를 도 13a 내지 도 13c에 나타내었다.

상기 도면을 참조하면, E.coli O157:H7는 b-SNAP 필름 표면에 대하여 별도의 표면처리 과정 없이도 성공적으로 포집되어 있음을 확인할 수 있다. 특히, 도 13b 및 도 13c에 따르면, b-SNAP 필름에 포집된 E.coli O157:H7와 복합 나노구조체 사이에 나노스케일의 돌출영역이 형성됨이 명확하게 관찰되었는 바, 이는 박테리아 표면과 복합 나노구조체의 3차원적 섬유 형태의 구조 사이에 강한 지형학적 상호작용(topographical interaction)이 존재함을 의미한다.

반면, 베어 필름 상에도 E.coli O157:H7를 동일한 방식으로 부착한 후, SEM으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, 평평한 베어 필름 상에 포집된 박테리아의 수는 b-SNAP 필름에 비하여 현저히 적은 수준임을 알 수 있다. 이는 b-SNAP 필름의 3차원적 섬유 형태의 구조가 박테리아를 포집하는데 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다.

- 형광 스펙트럼 분석

도 15는 b-SNAP 필름(실시예 1) 및 베어 필름(비교예 3) 각각에 포집된 E. coli O157:H7를 세포용해시킨 후, 이중 스트랜드의 DNA 프로브와 반응시켜 얻은 형광 스펙트럼이다. 상기 도면으로부터 알 수 있듯이, 각각의 스펙트럼은 520 nm에서 주 시그널을 나타내는 바, 이는 E.coli로부터 나온 뉴클라아제에 의하여 이중 스트랜드 DNA 프로브가 절단되었음을 의미한다. 또한, 형광 스펙트럼의 면적(크기)은 각각의 필름에 포집된 E.coli의 수와 부합됨을 알 수 있다.

- 바이오물질(박테리아)에 대한 진단 신뢰성 평가

b-SNAP 필름의 포집능을 이용하여 식중독을 유발하는 대표적인 6종류의 박테리아에 대한 정량 분석을 수행하였다. 분석 대상 박테리아는 그람-음성 박테리아로 Escherichia coli (E. coli) O157:H7, Salmonella enteritidis (S. enteritidis) 및 Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica)이었고, 그람-양성 박테리아로 Staphylococcus aureus (S. aureus), Bacillus cereus (B. cereus) 및 Listeria monocytogenes (L. monocytognes)이었다. 이러한 박테리아는 식중독을 유발하는 대표적인 병원성 세균이다.

각각의 박테리아를 농도 별(10⁷ CFU/rxn에서 0 CFU/rxn까지) 준비하고, b-SNAP 필름을 이용하여 박테리아를 포집하였다. b-SNAP 필름의 포집능을 비교하기 위하여, 베어 필름을 이용하여 동일한 조건 하에서 실험을 수행하였다. b-SNAP 필름 및 베어 필름에 포집된 박테리아 각각을 세포용해 완충액을 이용하여 세포용해시켰다. 이때, 사용된 세포용해 완충액은 리소자임 및 리소스타핀을 함유하고 있어 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 모두에 적용 가능한 것이다.

세포용해를 거쳐 각각의 필름에 포집된 박테리아는 박테리아 뉴클레아제를 방출하게 되며, 방출된 박테리아 뉴클레아제는 핵산말단분해효소(exo-nuclease) 및 핵산내부가수분해효소(endo-nuclease), 그리고 DNA 분해효소(DNase)이다.

Escherichia coli (E. coli) O157:H7, Salmonella enteritidis (S. enteritidis) 및 Yersinia enterocolitica (Y. enterocolitica) 각각으로부터 방출된 뉴클레아제에 의한 이중 스트랜드 DNA 프로브 사슬의 절단에 따라 소광 상태에 회복된 형광체(형광 염료)의 형광 세기를 측정하였다. 이와 관련하여, 도 16a 내지 도 16c는 각각 b-SNAP 필름을 이용하여 E. coli O157:H7, S. enteritidis 및 Y. enterocolitica을 농도 별로 포집하여 세포분해시킨 다음, 이중 스트랜드 DNA 프로브와 반응시켜 얻은 형광 세기를 나타낸다. 또한, 도 16d 내지 도 16f는 베어 필름을 이용한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 얻은 형광 세기를 나타낸다.

상기 도면을 참조하면, b-SNAP 필름의 경우 10⁷ CFU/rxn에서 10⁴ CFU/rxn의 농도 구간에서 박테리아 농도에 따른 형광 신호의 차이를 관찰할 수 있었는 바, E. coli O157:H7, S. enteritidis 및 Y. enterocolitica 박테리아의 검출 한계가 대략 10⁴ CFU임을 보여준다. 반면, 베어 필름의 경우, 박테리아 농도에 따른 형광 신호 차이를 관찰할 수 없었다. 이는 b-SNAP 필름이 박테리아를 농도별로 정확하게 직접 포집하여 검출할 수 있다는 것을 의미한다.

생균 검출에 대한 특이성(specificity)을 확인하기 위하여 각각의 박테리아에 대하여 건열 및 화학소독제와 같은 간단한 멸균 방법을 적용하였다.

70% EtOH은 잘 알려진 화학소독제로서 병원, 식풍가공 처리 설비에서 주로 사용되는 바, 사균 시료를 준비하기 위하여 각각의 박테리아를 100 ℃에서 1시간 동안 반응시키거나, 또는 70% 에탄올에서 2시간 동안 반응시켜 비활성화시켰다. 이와 같이 비활성화 과정을 거친 후, b-SNAP 필름을 이용하여 포집하였다.

도 16g 내지 도 16i 각각은 3종의 그람-음성 박테리아에 대하여 b-SNAP 필름을 이용하여 포집된 생균 및 사균의 형광 세기를 나타낸다. 건열처리한 E. coli O157:H7, S. enteritidis 및 Y. enterocolitica 박테리아의 형광 세기는 살아있는 박테리아들에 비하여 상당히 감소하였다. E. coli O157:H와 달리 S. enteritidis, Y. enterocolitica에서는 70% 에탄올로 처리한 경우가 건열 처리한 경우에 비하여 형광 신호가 크게 감소하지는 않았으나, 살아있는 박테리아와는 분명하게 구분할 수 있었다.

이처럼, b-SNAP 필름을 이용한 포집 및 검출 시스템을 통하여 생균 및 사균을 명확하게 구분할 수 있었다.

전술한 바와 동일하게, 그람-양성 박테리아인 S. aureus, B. cereus 및 L. monocytognes에 대하여도 각각 농도별로 b-SNAP 필름 및 베어 필름으로 포집하여 세포용해시킨 후, 이중 스트랜드 DNA 프로브와 반응시켜 형광 세기를 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.

상기 도면을 참조하면, 그람-음성 박테리아와 유사하게 b-SNAP 필름에서는 박테리아 농도에 따른 신호 차이를 관찰할 수 있었으나, 베어 필름에서는 구별하기 곤란하였다. S. aureus 및 B. cereus의 경우 10⁷ CFU/rxn에서 10⁵ CFU/rxn까지 농도에 따른 형광 신호의 차이를 관찰할 수 있었고, 이때 검출 한계는 10⁵ CFU이었다. 반면, L. monocytognes는 10⁶ CFU/rxn에서 0 CFU/rxn까지의 구간에서는 형광 신호의 차이를 구별하기 곤란하였고, 10⁷ CFU/rxn의 농도에서만 현저히 높은 신호세기를 나타내었다.

상기 박테리아에 대하여도 위양성 평가를 위하여 건열 및 70% 에탄올을 이용하여 사균 시료를 준비하였다. 도 17g 내지 도 17i 각각은 3종의 그람-양성 박테리아에 대하여 b-SNAP 필름으로 포집된 생균 및 사균의 형광세기를 나타낸다. 건열 처리 및 70% 에탄올로 처리된 S. aureus, B. cereus 및 L. monocytognes 모두 살아있는 박테리아에 비하여 형광신호가 상당히 감소함을 알 수 있다.

상술한 결과를 통하여, b-SNAP 필름 및 박테리아에 대한 응답성을 갖는 DNA 프로브를 이용한 검출 방식을 통하여 특별한 표면처리 없이 유해한 바이오물질인 식중독균 등의 병원체를 고효율로 직접 포집할 수 있고, 그람-음성 및 그람-양성 박테리아에 대하여 각각 10⁴ CFU 및 10⁵ CFU의 검출 한계를 가짐을 확인하였다. 통상적으로 이용되는 기존 검출 장비의 민감도와 대비할 경우, b-SNAP 필름을 기반으로 하는 검출 시스템의 검출 한계는 유사한 민감도를 나타낸다.

더욱이, b-SNAP 필름의 박테리아 포집능을 정확히 평가할 목적으로, 포집 후에 가혹한 세척 과정을 거쳤는 바, 그 과정에서 일어나는 박테리아 손실을 고려하면 이러한 검출한계는 유의미한 결과이다. 또한, 상업적으로 가장 널리 사용되는 방법인 Swab 시료링 및 ATP 측정 방식을 통한 간접적인 식중독균 검출법은 생균과 사균 간의 구분이 불가능하고, 비박테리아-유래 ATP에 의한 잘못된 신호(false signal)에 따른 검출 한계를 갖고 있으나, b-SNAP 필름 기반 시스템에서는 생균과 사균을 명확하게 구분하여 위양성에 대한 검출 우수성도 가지고 있다.

- 실제 시료에 대한 진단 테스트 및 평가

b-SNAP 필름 기반 시스템의 현장 적용성을 평가할 목적으로, 실제 조리기구 및 식재료로부터 식중독균을 검출하였다. 대표적인 그람-음성 및 그람-양성 박테리아인 E. coli O157:H7 (10⁷ CFU/rxn) 및 S. aureus (10⁷ CFU/rxn)를 이용하여 인위적으로 칼, 도마, 샐러드 및 식수를 오염시켰다. 실제 시료에서 박테리아 포집능력을 평가하기 위하여, b-SNAP 필름, 베어 필름 및 습식 와이프(wet wipe)를 이용하여 박테리아를 시료 표면으로부터 직접 포집하여 전술한 방법에 따라 세포용해 및 형광 검출을 수행하였다.

도 18을 참조하면, E. coli O157:H7(a, b, e 및 f) 및 S. aureus(c, d, g 및 h)를 각각의 실제 시료에서 검출한 형광세기를 나타낸다. 분석 결과, b-SNAP 필름은 베어 필름에서와 달리 칼, 도마, 샐러드 및 식수에서 모두 성공적으로 E. coli O157:H7 및 S. aureus를 검출하였고, 습식 와이프와 대비하는 경우에도 대부분의 b-SNAP 필름에서의 형광세기가 현저하였는 바, 이는 b-SNAP 필름의 포집 효율이 우수하다는 것을 의미한다.

이처럼, b-SNAP 필름 및 박테리아 뉴클라아제-응답성 DNA 프로브를 이용한 검출 플랫폼은 실제 현장(예를 들면, 단체 급식소, 식당 등)에서 식중독 등의 예방에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (20)

1. a) 바이오물질을 함유하는 시료를 상기 바이오물질에 대한 고정능을 갖는 복합 나노구조체와 접촉시켜 상기 시료에 비하여 증가된 밀도의 바이오물질을 상기 복합 나노구조체 상에 포집시키는 단계;
   b) 상기 포집된 바이오물질을 세포 용해(lysis)시키는 단계;
   c) 상기 바이오물질의 세포 용해물(lysate)을 소광 상태에 있는 프로브와 접촉시켜 상기 세포 용해에 의하여 방출되는 뉴클레아제에 의하여 상기 프로브 내 사슬을 절단하는 단계, 여기서 상기 프로브는 상기 방출되는 뉴클라아제에 대하여 응답성을 갖는 핵산 프로브로서, 상기 사슬에 의하여 연결된 각각 말단에 형광체 및 소광체를 포함하며, 사슬의 절단 전에는 소광체의 작용에 의하여 형광체의 발색이 억제되어 있음;
   d) 상기 프로브의 절단에 따라 유리된 형광체로부터 생성된 형광에 대하여 정량적 분석 및 정성적 분석 중 적어도 하나를 수행하는 단계;
   를 포함하며,
   상기 복합 나노구조체는,
   (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 제1 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질용 금속층, 및 (iii) 상기 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된 제2 고분자 재질의 나노 웹 구조를 포함하고,
   상기 나노 웹 구조는 나노필라의 측면의 적어도 일 지점으로부터 횡 방향으로 성장한 제2 고분자 재질의 스트랜드가, 이와 인접하는 나노필라의 적어도 일 지점으로부터 횡 방향으로 성장한 제2 고분자 재질의 스트랜드와 합쳐져 상호 연결되어 있고, 그리고
   제2 고분자 재질의 나노 웹 구조 내 스트랜드의 직경은 10 내지 200 nm 범위인 시료 내 바이오물질의 포집 및 진단 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1 고분자는 폴리우레탄(Poly urethane, PU)계, 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS)계, NOA(Noland Optical Adhesive)계 및 에폭시(Epoxy)계로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 제2 고분자는 폴리에테르케톤(PEK), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리에테르에테르케톤케톤(PEEKK), 폴리설폰, 폴리에테르 설폰, 폴리페닐에테르설폰, 폴리페닐렌, 폴리이미다졸, 폴리이미드, 폴리아미드이미드, 폴리아닐린, 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리피롤(polypyrrole), 및 폴리티오펜(polythiophene)으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 제1 고분자는 폴리우레탄 아크릴레이트(PU)와 NOA계 접착제의 블렌드이고,
   상기 블렌드 내 폴리우레탄 아크릴레이트 및 NOA계 접착제 각각의 함량은 20 내지 80 중량% 및 80 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 복수의 나노필라의 직경 및 높이는 각각 100 내지 1000 nm 및 100 내지 1500 nm 범위이고, 상기 복수의 나노필라 사이의 간격은 100 내지 3500 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 표면 개질용 금속층은 Ni, Zn, Pd, Ag, Cd, Pt, Ga, In 및 Au로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 표면 개질용 금속층과 상기 나노 패턴 구조물 사이에 Ti, V, Cr, Sc, Nb, Mo 및 W으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나가 선택되는 중간층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 표면 개질용 금속층 및 중간층 각각의 재질은 Au 및 Ti인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제3항에 있어서, 상기 제2 고분자는 폴리아닐린인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제3항에 있어서, 상기 제2 고분자 재질의 나노 웹 구조의 평균 메쉬 사이즈는 1 내지 1,500 nm 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 이중 스트랜드 DNA 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 바이오물질은 박테리아로서, 그람-양성 박테리아 및 그람-음성 박테리아 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 단계 b)는 세포용해 완충액을 사용하여 수행되며,
    여기서, 상기 세포용해 완충액은 리소자임(lysozyme) 및 리소스타핀(lysostaphin)을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 형광체는 FAM, HEX, JOE, TET, MAX 및 VIC으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 소광체는 DABCYL, ROX, Black Hole 및 Quencher(BHQ), Eclipse, TAMRA, QSY-6 및 금 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 형광체는 FAM이고, 상기 소광체는 BHQ-1인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 프로브 내 형광체와 소광체 간 거리는 25 내지 60개의 염기로 이루어지고,
    상기 프로브는 상기 방출되는 뉴클라아제에 응답하여 형광체와 소광체 사이의 사슬이 절단되도록 염기 서열 내 미스매치를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 생성된 형광은 공초점 현미경(confocal microscope), 형광 현미경(fluorescence microscope), 형광계(fluorometer), 형광 스캐너(fluorescence scanner), 플로우사이토메터(flow cytometer), 광전자증폭관(photo multiplier tube), 또는 포토다이오드(photo diode)에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 시료 내 바이오물질의 포집 및 진단 시스템으로서,
    a) (i) 상측에 복수의 나노필라가 형성된 제1 고분자 재질의 나노 패턴 구조물, (ii) 상기 나노 패턴 구조물의 표면에 부착된 표면 개질용 금속층, 및 (iii) 상기 금속층이 부착된 나노 패턴 구조물 상에 형성된 제2 고분자 재질의 나노 웹 구조를 포함하는 복합 나노구조체;
    b) 상기 바이오물질로부터 유래된 뉴클레아제에 대하여 응답성을 갖는 핵산 프로브, 여기서 상기 프로브는 사슬에 의하여 연결된 각각 말단에 형광체 및 소광체를 포함하며, 뉴클라아제에 의하여 사슬이 절단되기 전에는 소광체의 작용에 의하여 형광체의 발색이 억제되어 있음; 및
    c) 상기 사슬의 절단에 의하여 상기 프로브로부터 유리되는 형광체의 형광 및 형광 세기 중 적어도 하나를 검출하는 장치;
    를 포함하고,
    상기 나노 웹 구조는 나노필라의 측면의 적어도 일 지점으로부터 횡 방향으로 성장한 제2 고분자 재질의 스트랜드가, 이와 인접하는 나노필라의 적어도 일 지점으로부터 횡 방향으로 성장한 제2 고분자 재질의 스트랜드와 합쳐져 상호 연결되어 있고, 그리고
    제2 고분자 재질의 나노 웹 구조 내 스트랜드의 직경은 10 내지 200 nm 범위인 포집 및 진단 시스템.
19. 제18항에 있어서, 상기 포집 및 진단 시스템의 검출 한계(LOD)는 10³ 내지 10⁷ CFU인 것을 특징으로 하는 포집 및 진단 시스템.
20. 제18항에 있어서, 상기 프로브는 이중 스트랜드 DNA 프로브로서, 하기 표 3에 따른 염기서열의 5'-말단에 형광체로서 FAM이 부착되어 있고, 3'-말단에 소광체로서 BHQ-1이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 포집 및 진단 시스템:
    [표 3]
    

    

Images