KR20160065093A - 세포 파쇄 및/또는 생체분자 회수를 위한 미세입자 - Google Patents

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KR20160065093A
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라이너 한
알로이스 융바우어
알렉산드로 트리필로프
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베링거 인겔하임 에르체파우 게엠베하 운트 코 카게
산도즈 아게
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Abstract

본 발명은 세포 파쇄 및 세포로부터 생체분자를 방출시키는 신규 방법을 제공한다. 본 발명은 분쇄된 수지를 포함하는 양으로 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도를 포함한다. 특히 세포 배양액으로부터 생체분자의 정제에 유용하다.

Description

세포 파쇄 및/또는 생체분자 회수를 위한 미세입자{MICROPARTICLES FOR CELL DISRUPTION AND/OR BIOMOLECULE RECOVERY}
본 발명은 일반적으로 생체분자 회수 및 세포 파쇄, 또한 특히 세포 현탁액으로부터 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 세포내 생체분자의 회수 분야와 관련되어 있다. 본 발명은 생물학적 유체와 같은 유체로부터 생체분자를 회수하는 방법을 포함한다. 다른 태양에서, 본 발명은 세포 배양 및 세포 배양액으로부터 생체분자의 정제 분야와 관련되어 있다.
인공 생산 시스템을 개발하기 위한 이전의 모든 노력에도 불구하고, 세포와 같은 생물학적 실재가 항체, 단백질 및 핵산 등의 복합물질을 생산하는 능력과 비교할 수 없다. 오늘날 산업적으로 생산되는 세포 유래의 모든 물질은 거의 세포 내에서 생산되어 외부로 분비되는 세포 외 분비 물질이다. 그러나, 잠재적으로 유용한 물질의 대부분이 세포 내에 남아 있다. 세포 내 물질을 방출시키기 위해, 세포는 일반적으로 기계적, 물리적, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 파괴된다. 가치 있는 세포 생성물의 효율적인 회수는 그들의 구조, 위치 및 그들의 생물학적 시스템 내에서의 연결 관계와 밀접한 관련이 있다. 과거 수십년 동안 이러한 세포 내 시스템에서 분자 구조 및 기능에 대한 조사는 그러한 생성물의 분류 및 그들의 대량 처리 공정을 향상시켰다. 동시에, 특히 의료 분야에서, 제품의 품질에 대한 요구사항은, 잘 정의되고 효율적이며 매우 순도가 높은 물질을 제공하게 만들었다.
세포 파쇄에 이용하는 현재 방법들은 기계적 및 비기계적 방법을 포함한다. 비기계적 방법들은 물리적(감압(decompression), 삼투압 충격(osmotic shock), 열분해(thermolysis), 동결 건조(freeze drying), 마이크로파(microwave)), 화학적(항생제(antibiotics), 킬레이트제(chelating agents), 계면활성제(detergents), 용제(solvents), 알칼리(alkalis), 초임계 CO2(supercritical CO2)) 및 효소적(용해(lysis), 자가분해(autolysis), 파지(phages)) 방법을 포함한다. 반면에, 세포 파쇄에 이용하는 기계적 방법 및 장치는 비드 밀링(bead milling), 균질기(homogenisers), 캐비테이션(cavitation(초음파, 유체역학)) 및 미세유체기(microfluidizers)를 포함한다. 몇가지 세포 파쇄 방법만이 산업적 규모에서 이용되고, 일반적으로 다운스트림(회수, 정제) 공정과 결합되어 있다.
큰 규모를 위해, 가장 일반적인 기계적 방법은 표준 작업(standard operations)으로 일반적으로 구현되는 비드 밀링 및 고압 균질기이다. 고압 균질기를 사용할 때, 세포 용액은 고압하에서 좁은 판막를 통해서 압력을 받는다. 상기 판막을 통과하면서, 세포는 난류(turbulence), 캐비테이션(cavitation), 높은 전단력(high shear forces) 및 세포가 서로 찢어져 전단되자 마자 순간 압력 강화(sudden pressure drop)를 겪는다. 밸브의 스트레스 및 부식은 구조와 관련되고 균질기 압력이 증가하면 증가한다. 또한, 용액의 온도는, 압력이 증가하고, 에너지를 소비하고, 필요한 장치 및 현탁액을 냉각하고, , 특히, 온도에 불안정한 효소가 방출될 때, 증가한다. 균질기로 소비되는 약 90% 이상의 전력은 열로 방출되고, 그리고 냉각 비용은 세포 분리를 위한 전체 비용의 큰 부분을 차지한다. 또한, 연속적인 경로가 충분히 높은 수율을 달성하기 위해 종종 요구된다(Kula et al.,"Purification of Proteins and the Disruption of Microbial Cells." Biotechnology Progress 1987).
비드 밀링에서, 비드를 생물학적 유체에 첨가하고 그 다음 상기 생물학적 유체를 젓거나 흔들어서 빠른 속도로 교반한다. 비드와 충돌하여 세포는 파쇄되고 세포내 물질이 방출된다. 비드 밀링은 또한 열을 발생하므로 냉각이 필요하다. 비드 밀링은 비드 밀의 구성, 작동 파라미터 및 제품별 특성을 포함하는 다양한 파라미터에 영향을 받아 오히려 복잡하다. 비드 밀의 구성 및 기하학은 중요한 공정 변수이다. 그러나, 더 작은 버전은 산업적 규모의 비드 밀과 기하학적으로 다르다. 이것은 일괄 성능(batch performance) 실험실 시험에서의 데이터 추정을 복잡하게 한다(Kula et al., "Purification of Proteins and the Disruption of Microbial Cells." Biotechnology Progress 1987).
기계적 파쇄 방법은 몇 가지 결점이 있다. 세포가 완전히 파쇄되기 때문에, 모든 세포내 물질이 방출되고, 중간 생성물의 오염 물질 함량을 증가시킨다. 그러므로, 목적 생성물을 단백질, 핵산 및 세포 파편의 복잡한 혼합물로부터 분리해야한다. 또한, 방출된 핵산은 용액의 점도를 증가시킬 수 있고 크로마토그래피 같은 다음 공정 단계를 복잡하게 만들 수 있다. 기계적 분해로 생성된 세포 부유물은 작은 세포 파편들로 구성되고, 용액을 정제하기 어렵게 만든다. 완성된 생성물 방출을 위해 파쇄 장치를 한번 이상 통과하여야 하고, 이것은 파편의 크기를 더 감소시켜 문제를 더 악화시킨다. 장치의 처리량은 입자 직경의 제곱에 반비례하기 때문에 이것들을 계속적인 원심분리를 통해서 제거하기 어렵다. 여과는 균질액의 끈적이는 특성 및 막 오염(foul membranes)에 대한 특성에 의해서 복잡하다. 게다가, 기계적 방법은 정기적인 유지 보수 비용이 드는 장비를 필요로 하고 에너지를 소비한다. 그것들은 열을 발생시키고 온도 민감성 효소를 사용하기 위한 광범위한 냉각이 필요하다. 또한, 세포 및 추출물을 높은 전단응력(shear stress)에 노출시킨다. 장치가 충분히 냉각되지 않는다면, 대부분의 생성물은 생성된 열에 의해 분해될 것이다.
상기 언급된 것과 같이, 더 선택적인 방출 방법은 물리적, 화학적 또는 효소적 처리를 포함한다. 화학적 처리는 EDTA, chaotropic agents, organic solvents, antibiotics, acids, alkalis 및 surfactants의 사용을 포함한다. 화학 폐기물 문제 외에도, 이 방법은 오히려 비싸고 따라서 큰 규모의 산업에 적절하지 않다. 화학 물질로 인한 원하는 생성물의 오염은 또 다른 단점이다. 일부 화학 물질은 매우 선택적이지 않고 민감성 단백질, 효소 및 세포벽에 피해를 입힐 수 있다.
효소적 세포 파쇄는 더 특이적이지만 세균 세포 벽 같은 몇몇 구별되는 층을 가지는 복잡한 세포 구조에 적용할 때는 제한적이다. 또한, 효소 및 버퍼의 비용 때문에 제한적이다. 그러므로, 효소적 처리는 큰 산업적 규모에 적용할 수 없다. 다른 단점은 효소에 의한 원하는 생성물의 오염 가능성이다.
물리적 투과(Physical permeabilization)는 동결-융해(freeze-thawing) 또는 삼투압 충격 요법(osmotic shock treatment)에 의해 수행될 수 있다. 동결-융해에 의하면, 효율적인 생성물 방출을 위해서 수회 반복할 필요가 있고, 그 공정이 상당히 길어 질 수 있다. 반면에, 삼투압 충격 요법은 튼튼한 세포 벽 구조를 가진 세포를 파쇄하는데 충분하지 않을 수 있다.
결론적으로, 이러한 방법들의 단점은 높은 비용, 대규모에 낮은 적합성, 낮은 효율성 및 재생산성 그리고 방출 후에 첨가된 물질을 제거할 필요성을 포함한다.
세포 생산 시스템의 가능성을 고려하여, 취급하기 쉽고 비용 효율적이고 확장성이 있는, 특히 세포 현탁액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 대체 방법이 필요하다. 또한, 상기 방법은 민감한 생체분자 생성물에 충분히 적합하고 오염이 적은 생성물을 얻을 수 있는 매우 선택적인 생체분자 회수가 가능하게 할 수 있다. 그러므로 본 발명의 목적은 하나 이상의 상기 언급된 단점을 극복하는 방법 또는 시스템을 제공하는 것이다.
***
본 발명에서 사용된 용어 단수 형태 "한(a)", "한(an)" 및 "그(the)"는 명백히 이와 달리 명시하지 않았다면 복수의 형태를 포함한다. 예를 들어, "시약( reagent)"에 대한 것은 그러한 다른 시약 하나 또는 이상을 포함하고 "방법(method)"에 대한 것은 본 발명에 기재된 방법을 변경하거나 치환할 수 있는 본 발명의 기술분야에서 통상의 기술자에게 널리 알려진 등가의 단계 및 방법을 포함한다.
달리 명시하지 않으면, 일련의 요소 앞에 기재된 "적어도(at least)"라는 용어는 일련의 모든 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 기술분야에서 통상의 기술자가 본 발명에 기재된 특정 실시예의 많은 등가물을 통상의 실험만으로 이해하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 본다.
본 명세서에서 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "모든 또는 상기 용어에 의해 연결된 요소들의 다른 조합"을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 주어진 가치 또는 범위의 20% 내를 의미하고, 바람직하게는 10%내, 그리고 더욱 바람직하게는 5%내를 의미한다. 그 지정된 숫자도 포함한다. 예를 들면 약 20은 20을 포함한다.
용어 "이하" 또는 "이상" 은 구체적인 숫자를 포함한다. 예를 들어, 20 이하는 20보다 적거나 같음을 의미한다. 비슷하게, 이상은 많거나 같음을 의미한다.
이하 본 발명의 명세서와 청구범위에 달리 명시가 없다면, 용어 "포함하다(comprise, comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 다른 용어는 정해진 정수(integers) 또는 단계 또는 정수 그룹 또는 단계들뿐 아니라, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 그룹 또는 단계들도 포함함을 내재하고 있는 것으로 이해되어야 것이다. 본 발명에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"으로 치환되어 사용될 수 있거나 때때로 용어 "가진(having)"으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "로 구성된(consisting of)"이 사용되는 경우, 청구범위에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본 발명에서 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"이 사용되는 경우, 실질적으로 청구항의 기본적이고 신규한 특성에 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다.
본 발명에서 각각의 경우에, 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "구성되는(consisting of)" 중 어느 하나는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
본 발명은 특히 본 발명에 기술된 방법론, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등에 제한되지 않고 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위한 것이며, 청구항에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 명세서의 전반에 걸쳐 인용된 모든 출판물 및 특허문헌(모든 특허 문헌, 특허 출원, 과학 출판물, 제조업체의 사양, 설명서 등)은 본 명세서에 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서의 어떠한 기재도 선행 발명에 의해 본 발명이 그러한 공개보다 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석될 수 없다. 참조로 인용된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 한도 내에서, 본 명세서가 이러한 자료를 대체할 것이다.
요약
본 발명은 생체분자를 수득하는 신규 방법, 또한 하나 이상 전술한 단점을 극복하는 생체분자 회수방법을 제공한다. 상기 방법은 E. coli, Pichia pastoris 및 CHO 세포 배양 등 으로부터 세포 배양액, 세포 균질액, 세포 용해액, 세포 현탁액, 발효액, 배양액, 발효 상청액, 배양 상청액, 세포 상청액과 같은 액체 또는 유체에서 생체분자를 수득하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 세포 내 생체분자를 방출시키는데 사용될 수 있는 세포 파쇄 방법을 포함한다. 명세서에 기술된 것과 같이, 본 발명은 특히 세포 파쇄 및 세포 내 셍체분자 회수에 유용하다. 본 발명의 방법은 간단하고, 경제적이고, 산업 응용에 쉽게 확장 가능하다. 상기 방법은 선택적인 생체분자 회수를 위해 복잡한 장비 또는 버퍼 및 염을 제외한 수용성 첨가제가 필요 없는 간단한 공정을 제공한다. 전술한 것과 같이, 기존의 세포 현탁액에서 생체분자 회수 방법은 기계적 스트레스 및/또는 화학적 첨가제를 포함한다. 현재 산업적 규모에 적용되는 종래의 방법과 대조적으로, 본 발명의 방법은 부드럽고 세포 및/ 또는 원하는 생체분자 생성물을 가혹한 조건에 두지 않는다. 그러므로, 본 발명의 방법은 오염된 불순물의 양을 감소시키고 원하는 생체분자에 잠재적으로 해로운 기계적이고 물리적인 스트레스를 줄인다.
본 발명자들은, 놀랍게도, 분쇄된 수지를 포함하는 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자는 생물학적 유체로부터 생체분자를 회수할(추출할) 수 있음을 발견하였다. 또한, 몇몇 실시예에서, 세포 현탁액에 추가할 때, 하전된 미세입자는 세포를 파쇄하는 동시에 세포로부터 방출된 생체분자를 흡착할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 한 측면에서 미세입자는, 세포를 파쇄하여 생체분자를 방출시키고, 간단하고 확장 가능한 방법으로, 생체분자를 흡착하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 측면에서, 미세입자는 세포 및/또는 생체분자 및/또는 반대로 하전된 미세입자가 결합하자마자 응집물을 형성하고 생물학적 유체로부터 쉽게 분리된다는 것을 발견하였다. 그러므로 방출된 생체분자는 흡착된 후 생체분자와 응집물을 분리하여 쉽게 회수될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 다운 스트림 공정에서 세포 파쇄 및 생체분자 추출 단계가 조합된 간단한 방법을 제공한다. 이 기술은 콜로이드 고체상 추출법(colloidal solid phase extraction, CSPE)으로 불린다. 이론에 구애됨이 없이, 음이온 교환 수지로부터 유래된 양으로 하전된 미세입자는 일반적으로 음으로 하전된 특히 박테리아 세포 표면과 결합하는 양이온, 특히 칼슘 및/또는 마그네슘 이온을 변위시켜서 음으로 하전된 세포 표면에 흡착하여 세포와 응집물을 형성하는 것으로 가정하였다. 결과적으로, 세포막을 구축하는 분자의 내부가 다소 불안정해져 세포가 약해지게 된다. 킬레이팅한 양이온 교환 수지로부터 유래된 음으로 하전된 미세입자의 경우에, 그러한 입자는 양이온, 특히 칼슘 및/또는 마그네슘에 결합하고, 그것에 의하여 세포막을 구축하는 분자의 내부를 불안정하게 만드는 것으로 가정하였다. 소수성 입자도 응집물을 형성시키는 것을 발견하였다.
본 발명은 세포 구조(예를 들면, 세포벽)의 낮은 파편화를 이용하여 세포를 부드럽게 "개방시켜서"세포 내 생체분자를 추출하는 특별한 방법으로, 이로 인해 오염도를 감소시킨다. . 동시에, 이 신규 기술은 선택적 생체분자 추출을 가능하게 하고, 또한 효율성 측면에서, 예를 들면, 고압 균질기(high pressure homogenisation) 및 비드 밀링(bead milling)과 같은 이 기술분야에서 알려진 기계적 방법과 견줄 만 하지만, 더 높은 선택성 및 더 낮은 오염도를 제공한다. 동시에, 본 발명의 신규 방법을 사용하면, 원하는 생체분자를 회수하는 동안 세포를 온전히 유지하는 것이 가능하다. 그러므로, 세포 "개방(opening)"은, 그러나, 바람직하게는 세포가 완전히 파쇄되는 것을 의미하는 것은 아니다. 따라서, "개방(opening)"은, 바람직하게는, 세포가 약해져 세포질 내용물이 새어 나오는 것을 의미한다.
제 1 측면에서, 본 발명은 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음으로 하전된 미세입자를 포함하는, 생체분자 회수에 이용하기 위한 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 신규한 용도를 제공한다. 일 실시예에서, 양으로 하전된 미세입자만 사용된다. 다른 실시예에서, 음으로 하전된 미세입자만 사용된다. 또 다른 실시예에서, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자가 사용된다.
본 발명의 제 2 측면에서, 상기 조성물은 소수성 미세입자를 포함한다. 이러한 소수성 미세입자는 특히 펩타이드 또는 폴리펩타이드뿐만 아니라 다른 생체분자들도 흡착할 수 있다. 흡착 매커니즘은 먼저 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 같은 흡착 리간드의 소수성 부분과 미세입자의 고분자 표면간의 소수성 결합(Van der Waals, London Type)에 기초한 것으로 생각된다.
미세입자는 명세서에 설명된 것과 같이 분쇄된 수지로부터 얻어진다. 예를 들면, 이온 교환 수지를 분쇄하고 선택적으로 상기 분쇄 수지를 조절(conditioning)함으로써 얻을 수 있다. 이러한 입자는 바람직하게는 본 발명에서 "미세입자", "흡착 물질", "흡착제", "입자들", "분쇄된 입자", 또는 "분쇄된 수지"와 같이 지칭된다. 이들 용어들은 교환적으로 사용된다. 바람직하게는, 미세입자는 예를 들면, 물의 탈이온화 및 폐수 처리를 위해 보통 사용되는 통상적인 큰 직경 작은 기공 입자를 분쇄하여 얻을 수 있다.
양이온 교환 수지는 음으로 하전된 미세입자를 제조하는데 사용될 수 있다. 양이온 교환 수지는 약산 또는 강산이 될 수 있다. 반대로, 음이온 교환 수지는 양으로 하전된 미세입자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 음이온 교환 수지는 약염기 또는 강염기가 될 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 양이온 교환 수지 및/또는 음이온 교환 수지는 킬레이팅 수지일 수 있다.
본 발명에 따르면, 이온 교환 수지는 임의의 적합한 물질을 바탕으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate(HEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(DMAEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(pDMAEMA) -based), 폴리아크릴아마이드계(polyacrylamide-based) 또는 메타크릴산계(methacrylic acid(MAA) -based )을 바탕으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 수지는 디비닐벤젠(divinylbenzene)과 교차결합된 폴리스티렌이다.
바람직하게는, 상기 미세입자는 약 5 ㎛이하 등, 약 10 ㎛ 이하의 평균 입자크기를 가지는 분쇄된 입자 형태로 존재한다.
본 발명에 따르면 미세입자는 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지를 분쇄하여 얻을 수 있다. 음이온 교환 수지는 예를 들면, Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-485, Dowex 1X2-100, Dowex 1-8-100, DIAION SA 20A, Marathon A2 또는 다른 이 기술분야에서 알려진 음이온 교환수지일 수 있다. 양이온 교환 수지는 예를 들면, Amberlite IRC-748, Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, DIAION SK 110, Marathon MSC, 또는 다른 이 기술분야에서 알려진 양이온 교환 수지일 수 있다. 바람직한 음이온 교환 수지는 Amberlite IRA-458 및 Marathon A2을 포함한다. 바람직한 양이온 교환 수지는 Amberlite IRC-748를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 생체분자, 바람직하게는 유체로부터 단백질 또는 예를 들면, 플라스미드 DNA(plasmid DNA), 코스미드 DNA(cosmid DNA), BAC DNA, YAC DNA, 미니-서클 DNA(mini-circle DNA) 등의 DNA와 같은 폴리뉴클레오타이드 흡착에 이용하기 위한, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자의 용도를 제공한다. 상기 유체는 세포 균질액, 발효 상청액, 발효액, 배양액, 배양 상청액, 세포 용해액 또는 세포 현탁액 등의 생물학적 유체이다.
또한, 본 발명은 세포 파쇄에 이용하기 위한 미세입자의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 파쇄된 세포는 생체분자를 방출하고 생체분자는 미세입자에 흡착된다. 파쇄 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 세포는 원핵 세포이다. 상기 세포는 Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae , Lactobacteriacea 또는 Bacillaceae로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 세포는 E. coli. 이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 유체에 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자를 첨가하여 생물학적 유체로부터 생체분자를 회수하는 단계를 포함하는, 생체분자 수득 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에서, 상기 방법은 상기 미세입자가 응집물을 형성하게 하고, 생물학적 유체로부터 응집물을 제거하고, 그리고 응집물로부터 생체분자를 흡착하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 실시예에서, 회수될 생체분자에 따라, 상기 미세입자는 원하지 않는 세포 구조와 응집물을 형성하고 응집물을 제거한 후 유체로부터 생체분자를 회수하는 데 사용될 수 있다. 상기 응집물은 예를 들면, 원심분리 또는 여과에 의해 생물학적 유체로부터 제거될 수 있다. 일 실시예에서, 생물학적 유체는 미세입자를 첨가하는 동안 및/또는 후에 및/또는 응집물 또는 상기 생물학적 유체로부터 생체분자를 흡착하는 동안에 교반된다.
본 발명은 세포 현탁액에 하전된 및/또는 소수성 미세입자를 첨가하는 단계를 포함하는 세포 파쇄 방법을 또한 제공한다. 상기 하전된 미세입자는 양으로 및/또는 음으로 하전될 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 방법은 세포로부터 생체분자를 방출시키는 단계를 더 포함한다. 또한, 본 발명은 또한 생물학적 유체 및 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자를 제공한다.
본 발명의 정확한 본질 및 장점은 통상의 기술자에게 이하 명세서 및 실시예를 통해서 명백해 질 것이다. 본 발명은 바람직한 실시예 또는 실시예에 제한되지 않는다. 통상의 기술자는 다른 실시예 및 응용에 본 발명을 쉽게 적용할 수 있다.
도 1: Marathon MSC (MMSC), Marathon A2 (MA2), Amberlite IRC748 및 Amberlite IRA458의 작용기 및 이들의 고분자 매트릭스에 대한 결합부위의 화학 구조.
도 2: 세포 체적 농도 및 Marathon A2 미세입자의 수지:세포 체적비율이 1시간 배양((50 mM TRIS, pH 8.0)한 GFP를 발현하는 E. coli으로부터 GFP의 회수에 미치는 영향.
도 3: Marathon A2 미세입자의 수지:세포 체적비율이 1시간 배양((50 mM TRIS, pH 8.0)한 GFP를 발현하는 E. coli(10 % v/v) 로부터 GFP의 회수에 미치는 영향.
도 4: pH(7.5, 8.0, 8.5), 배양 시간(0.2-3시간) 및 Marathon A2 미세입자의 수지:세포 체적 비율(100%, 70%, 50%, 30%, 0%)이 GFP를 발현하는 E. Coli를 포함하는 세포액으로부터 GFP 회수에 미치는 영향.
도 5: 염 농도가 GFP를 발현하는 E. coli(10% v/v) 으로부터 GFP의 회수에 미치는 영향. Marathon A2 미세입자(100%, 70%, 50%, 30%, 0% 의 수지:세포 체적비율) 및 NaCl 농도(500 mM, 100 mM, 50 mM, 0 mM)로 1시간 배양((50 mM TRIS, pH 8.0)한 후 1 M NaCl 용출.
도 6: 서로 다른 NaCl 농도(500 mM, 100 mM, 50 mM, 0 mM)로 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)하고 1 M NaCl로 용출한 후, Marathon A2 미세입자(100%, 70%, 50%, 30%, 0% 의 수지:세포 체적비율)로 흡착하여 E. coli 세포(10% v/v)로부터 추출된 GFP의 평균 용량. 수용액상으로부터 GFP를 1 M NaCl로 용출 전과 후에 형광을 측정하여 정량하였다. GFP 양의 차이는 수지에 흡착된 것으로 간주한다. 경향은 표준 "Langmuir" 방정식으로 결정되었다.
도 7: 배양 조건이 GFP를 발현하는 E. coli(5 % v/v) 으로부터 GFP의 회수에 미치는 영향. 1 M NaCl로 용출 없이 킬레이트한 Amberlite IRC 748 미세입자(70%, 30%의 수지:세포 체적비율)로 교반(1-2 시간, 50 mM TRIS, pH 8.0)한 후 측정하였다.
도 8: 수지:세포 체적비율 및 용출이 GFP를 발현하는 E. coli(5% v/v) 으로부터 GFP의 회수에 미치는 영향. 1 M NaC로 용출하는 경우 또는 안하는 경우, 킬레이트한 Amberlite IRC 748 미세입자(100%, 70%, 30%의 수지:세포 체적비율)로 2시간 정적 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)한 후 측정하였다.
도 9 : 세포 체적 농도(volumetric cell concentration)(20%, 15%, 10%, 5% v/v)가 GFP를 발현하는 E. coli(5% v/v) 으로부터 GFP의 회수에 미치는 영향. 킬레이트한 Amberlite IRC 748 미세입자(70%의 수지:세포 체적비율)로 2시간 교반 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)한 후 측정하였다.
도 10: 세포 체적 농도(20%, 15%, 10%, 5% v/v)에 따른 GFP를 발현하는 E. coli으로부터 GFP 추출 반응속도. 킬레이트한 Amberlite IRC 748 미세입자(70%의 수지:세포 체적비율)로 2시간 교반 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)한 후 측정하였다.
도 11: 수지:세포 체적비율이 SOD를 발현하는 E. coli(10% v/v)으로부터 SOD의 회수에 미치는 영향. 아크릴(acrylic) IRA 458 미세입자(100%, 70%, 50% v/v 수지: 세포 체적 비율)로 1-3시간 정적 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)하고 NaCl 농도(1.0 M, 0.5 M, 0 M)로 용출한 후 측정하였다. SOD 양은 SDS-Page 농도계(densitometry)로 측정하였다.
도 12: 아크릴 Amberlite IRA 458 미세입자(100%, 70%, 50% v/v 수지: 세포 체적 비율)로 짧은 시간 혼합 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)하고 NaCl 농도(1.0 M, 0.5 M, 0 M)로 용출한 후 10% v/v 세포 현탁액에서 얻은 E. coli 균질액으로부터 SOD의 회수. SOD 양은 SDS-Page 농도계로 측정하였다.
도 13: NaCl(200-1000 mM)로 용출한 후 Marathon A2 미세입자(50% 수지:세포 체적 비율)로 GFP를 발현하는 E. Coli를 3시간 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)하여 비-목적 단백질(non-target protein) 추출. SDS-Page 및 쿠마씨 염색법으로 측정된 E. coli 균질액 및 균질 상청액을 비교하였다.
도 14: 도 13의 SDS-Page 농도계(densitometry) 분석.
도 15: Marathon A2 미세입자(50% 수지:세포 체적비율)로 3시간 정적 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)하고 300mM NaCl로 용출하여 E. coli으로부터 획득한 것과 GFP를 발현하는 E. coli 균질 상청액의 단백질 프로파일 비교.
도 16: E. coli 균질액 및 세포 현탁액(10% v/v)으로부터 단백질(SOD) 추출하는 동안 dsDNA 감소 속도. Amberlite IRA458 및 Marathon A2(50, 70, 100% v/v 수지:세포 체적비율)미세입자로 정적 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)하고 NaCl로 용출 한 후 측정하였다.. DNA 양을 Invitrogen의 "Pico Green QuantIt" 분석법으로 측정하였다.
도 17: 50 mM TRIS, pH 8.0에서 정적 배양한 다음 NaCl 로 용출한 후, MarathonA2 미세입자로 E. Coli 균질액 및 세포 현탁액(10% v/v)으로부터 단백질(SOD)을 추출 반응 동안 엔도톡신 감소. 엔도톡신 양은 Lonza 로부터 구입한 PyroGene™ Recombinant Factor C Assay에 의해 측정되었다.
도 18: 분쇄된 수지의 원자력 현미경(AFM) 관찰. Marathon A2(Image 1), Marathon MSC(Image 2) 및 Amberlite IRC748(Image 3)의 길이 측정.
도 19: E. coli 세포의 원자력 현미경(AFM) 관찰. 분쇄된 Marathon A2로 한시간 배양 전(왼쪽)과 후(오른쪽) 세포의 길이 측정.
도 20: 미세입자가 없는 경우(picture 1), 분쇄된 Marathon A2 (picture 2) 및 분쇄된 Amberlite IRC748(picture 3)로 50mM TRIS, pH8.0에서 한 시간 배양한 후 E. coli HMS174 (GFPmut3.1)의 오버레이 이미지(Overlaid images)
도 21: Marathon A2 미세입자(70% 부피비의 수비:세포)로 2시간 정적 배양(50mM TRIS, pH8.0)하고 생리 버퍼에서 1:10으로 희석한 후 E. coli 세포(10% v/v)의 생존도. 생존((녹색)/죽은(빨간색) 세포 염색을 Invitrogen의 "BacLite" 형광분석 염색 키트로 수행하였다.
도 22: SDS-Gel은 세포 균질액으로부터 GFP를 수집하기 위해 미세입자를 이용한 용출 프로파일을 보여준다.
도 23: SDS-Gel은 세포 균질액으로부터 IFN-γ 을 회수하기 위해 미세입자를 이용한 용출 프로파일을 보여준다.
도 24: 화학적 파쇄 방법(4)을 사용한 최대 GFP와 비교하여, 실시예 13.2의 수집 상청액(1) 및 세척 버퍼(2) 용출된 GFP(3)에서의 GFP 양을 보여주는 막대 그래프.
발명의 구성 요소
본 발명은 다음 구성으로 특정될 수 있다.
1. 분쇄된 고분자 음이온 교환수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음으로 하전된 미세입자를 포함하는, 생체분자 회수에 이용하기 위한 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도. 상기 생체분자는 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다.
2. 분쇄된 고분자 음이온 교환수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 세포 파쇄에 이용하기 위한, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
3. 생체분자 회수에 이용하기 위한 소수성 미세입자의 용도.
4. 구성 1 또는 2에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 약산 또는 강산인 것인, 용도.
5. 구성 1 또는 2에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 약염기 또는 강염기인 것인, 용도.
6. 구성 1 또는 2에 있어서, 상기 양이온 교환 수지 및/또는 음이온 교환 수지는 킬레이트(chelating) 수지인 것인, 용도.
7. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate(HEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(DMAEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(pDMAEMA) -based), 폴리아크릴아마이드계(polyacrylamide-based), 메타크릴산계(methacrylic acid(MAA) -based )인 것인, 용도.
8. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지는 디비닐벤젠(divinylbenzene)과 교차결합된 폴리스티렌(polystyrene)인 것인, 용도.
9. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 미세입자는 평균 입자의 크기가 약 5 ㎛ 이하인 것인, 용도.
10. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자 또는 음으로 하전된 미세입자는 고분자 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 분쇄하여 얻을 수 있는 것인, 용도.
11. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-485, Dowex 1X2-100, Dowex 1-8-100, Marathon A2 또는 DIAION SA 20A인 것인, 용도.
12. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 Amberlite IRC-748, Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, Marathon MSC 또는 DIAION SK 110인 것인, 용도.
13. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 수지는 비다공성(non-porous)인 것인, 용도.
14. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것인, 용도.
15. 구성 1 내지 14 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 세포는 Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae , Lactobacteriacea 또는 Bacillaceae 중 선택되는 것인, 용도.
16. 구성 14 또는 15에 있어서, 상기 세포는 E. coli인 것인, 용도.
17. 상기 구성 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 생체분자는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 인 것인, 용도.
18. a) 구성 1 내지 13 중 어느 한 구성으로 정의된 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자를 생물학적 유체에 첨가하여 생체분자를 회수하는 단계를 포함하는, 생물학적 유체로부터 생체분자를 획득하는 방법.
19. 구성 18에 있어서, b) 미세입자가 응집물을 형성하도록 하는 단계, c) 생물학적 유체로부터 응집물을 제거하는 단계 및 d) 생체분자를 흡착하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
20. 구성 19에 있어서, 상기 생물학적 유체는 세포 현탁액, 발효액, 배양액, 세포 균질액 또는 발효 상청액인 것인, 방법.
21. 구성 18 내지 20 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 방법은 a) 및/또는 b)단계 후에 생물학적 유체를 교반하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
22. 구성 18 내지 21 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 c) 단계는 원심분리, 여과 등의 분리 기술로 수행되는 것인, 방법.
23. 구성 18 내지 22 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 약산 또는 강산 인 것인, 방법.
24. 구성 18 내지 22 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 약염기 또는 강염기인 것인, 방법.
25. 구성 18 내지 22 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양이온 교환 수지 및/또는 음이온 교환 수지는 킬레이트 수지인 것인, 방법.
26. 구성 18 내지 25 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate(HEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(DMAEMA) -based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(pDMAEMA) -based), 폴리아크릴아마이드계(polyacrylamide-based), 메타크릴산계(methacrylic acid(MAA) -based )인 것인, 방법.
27. 구성 18 내지 26 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양이온 교환 수지 및 음이온 교환 수지는 디비닐벤젠과 교차결합된 폴리스티렌인 것인, 방법.
28. 구성 18 내지 28 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 미세입자는 평균 입자 크기가 약 5 ㎛ 이하인 것인, 방법.
29. 구성 18 내지 28 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자 또는 음으로 하전된 미세입자는 고분자 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 분쇄하여 얻을 수 있는 것인, 방법.
30. 구성 18 내지 29 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-485, Dowex 1X2-100, Dowex 1-8-100, Marathon A2 또는 DIAION SA 20A인 것인, 방법.
31. 구성 18 내지 30 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 Amberlite IRC-748, Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, Marathon MSC 또는 DIAION SK 110인 것인, 방법.
32. 구성 18 내지 31 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 수지는 비다공성인 것인, 방법.
33. 구성 18 내지 32 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것인, 방법.
34. 구성 18 내지 33 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 세포는 Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae , Lactobacteriacea 또는 Bacillaceae 중 선택되는 것인, 방법.
35. 구성 34에 있어서, 상기 세포는 E. coli인 것인, 방법.
36. 구성 18 내지 35 중 어느 한 구성에 있어서, 상기 생체분자는 단백질 또는 폴리뉴클레이타이드인 것인, 방법.
37. 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자를 세포 현탁액에 첨가하는 단계를 포함하는 세포 파쇄 방법.
38. 구성 37에 있어서, 세포로부터 생체분자를 방출시키는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
39. 구성 37에 있어서, 상기 생체분자는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드인 것인, 방법.
40. 분쇄된 고분자 음이온 교환수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음으로 하전된 미세입자를 포함하는, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자를 포함하는 생물학적 유체.
41. 구성 40에 있어서, 응집물을 더 포함하는 것인, 생물학적 유체.
42. 생체분자 회수에 이용하기 위한 양으로 하전된 미세입자의 용도로, 상기 양으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하고 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 것인, 용도.
43. 구성 42에 있어서, 세포 용해액 또는 세포 균질액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 것인, 용도.
44. 구성 42에 있어서, 세포 현탁액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 것인, 용도.
45. 생체분자 회수에 이용하기 위한 음으로 하전된 미세입자의 용도로, 상기 음으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하고 상기 생체분자는 산성 또는 염기성 인 것인, 용도.
46. 구성 45에 있어서, 세포 용해액 또는 세포 균질액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 것인, 용도.
47. 구성 45에 있어서, 세포 현탁액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 것인, 용도.
48. 생체분자 회수에 이용하기 위한 양과 음으로 하전된 미세입자의 용도로, 상기 양으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하고, 상기 음으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하고, 그리고 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 것인, 용도.
49. 구성 48에 있어서, 세포 용해액 또는 세포 균질액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 것인, 용도.
50. 구성 48에 있어서, 세포 현탁액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 것인, 용도.
51. 세포를 파쇄하여 생체분자를 방출시키기 위한 양으로 하전된 미세입자의 용도로, 상기 양으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하고 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 것인, 용도.
52. 세포를 파쇄하여 생체분자를 방출시키기 위한 음으로 하전된 미세입자의 용도로, 상기 음으로 하전된 미세입자는 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하고 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 것인, 용도.
53. a) 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자를 생물학적 유체에 첨가하여 생물학적 유체로부터 생체분자를 회수하는 단계를 포함하는, 생물학적 유체로부터 생체분자를 수득하는 방법으로, 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 것인, 방법.
54. 구성 53에 있어서, 상기 생물학적 유체는 세포 현탁액, 세포 용해액 또는 세포 균질액 인 것인, 방법.
55. 세포로부터 생체분자를 수득하는 방법으로, a) 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자를 첨가하여 세포를 파쇄하여 세포로부터 생체분자를 방출시키는 단계 및 b) 방출된 생체분자를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
56. 구성 55에 있어서, 상기 생체분자는 산성 또는 염기성인 것인, 방법.
57. 구성 55에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자가 첨가되는 것인, 방법.
58. 구성 55에 있어서, 상기 음으로 하전된 미세입자가 첨가되는 것인, 방법.
발명의 상세한 설명
본 발명은 상기 설명된 것과 같이, 하전된 미세입자 또는 소수성 미세입자를 사용하여 간단하고 빠른 생체분자 회수 방법 및/또는 세포 파쇄 방법을 제공한다. 이것은 상기 미세입자, 특히 하전된 미세입자는 세포를 파쇄할 수 있고 세포로부터 생체분자를 방출시키고 흡착할 수 있어서, 신속하고 효율적인 생체분자 회수가 가능하다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. 또한, 하전된 미세입자가 생물학적 유체에 첨가될 때, 상기 미세입자가 세포에 결합/흡착 및/또는 생체분자를 흡착하여 빠르게 큰 직경(적어도 5 ㎛)의 응집물을 형성하도록 함을 알아냈다. 이것은 상기 미세입자 및 생체분자에 의해 형성된 미세입자 및/또는 응집물에 흡착된 생체분자의 쉬운 분리를 가능하도록 한다. 소수성 미세입자도 마찬가지이다.
이 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명은 특히 상기 설명된 것과 같이 시험적 또는 산업적 규모를 포함하는 대규모의 적용분야에서, 세포 현탁액과 같은 생물학적 유체로부터 단백질 또는 플라스미드를 분리하는 데 유용하다. 상기 하전된 미세입자 및/또는 소수성 미세입자는 배치 공정(배치 흡착으로 지칭됨)에서 유리하게 사용될 수 있다.
또한, 상기 설명된 신규 방법은 높은 회수율 및 낮은 오염도를 제공한다. 본 발명은 생체분자 회수에 유리하게 적용될 수 있다. 특히 종래의 생체분자 추출 방법이 적용될 때, 생체분자가 온도 또는 전단에 민감하고 변성하는 경향이 있다면 본 발명은 생체분자 회수에 유리하게 적용될 수 있다.
세포 및 생체분자
상술한 바와 같이, 본 발명은 생물학적 유체와 같은 유체로부터 생체분자 회수 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 방법은 생물학적 유체에서 세포를 파쇄하고 세포로부터 생체분자를 방출시키는 것을 포함한다. 생체분자는 바람직하게는 단백질 또는 플라스미드와 같은 새포 내 생체분자이다. 상기 방출된 생체분자는 그다음 생물학적 유체로부터 회수될 수 있다.
본 발명에서 정의된 바와 같이, 상기 용어"세포 내"는 세포 안에서 발견되는 어떤 임의의 물질을 지칭한다. 본 발명에서 정의된 바와 같이 "생체분자"는 일반적으로 세포 내에 존재하거나 세포로부터 합성되는, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 상기 생체분자는 산성 또는 염기성 생체분자일 수 있다. 생체분자의 예는 올리고사카라이드(oligosaccharide), 폴리사카라이드(polysaccharide), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide), 올리고펩타이드(oligopeptides), 단백질(proteins), 뉴클레오시드(nucleosides), 플라보노이드(flavonoids), 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides), DNA (ds 또는 ssDNA), 플라스미드(plasmid) DNA, RNA (ds 또는 ssRNA), 유기금속 화합물(organometallic compounds), 아미노산(amino acids), 지질(lipids), 피리미딘(pyrimidines), 퓨린(purines), 카복실산(carbohydrates), 펩타이드 모방체 화합물 (peptidomimetic compounds), 독소(toxins), 스테로이드(steroids) 및 효소(enzymes)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 "세포"는 세포, 바람직하게는 생체분자를 생산(발현)"할 수 있는 "숙주 세포"를 지칭한다. 그러한 세포는 본 발명의 방법에 적용될 수 있다. 외래 뉴클레오타이드 서열이 생체분자 생산을 위해 상기 세포로 도입될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 세포 또는 숙주세포는 원핵 세포, 진핵 세포 또는 각각이 될 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 세포는 포유류, 조류, 양서류, 어류 세포 및 곤충 세포를 포함하는 척추 동물 세포이다. 또한 세포 또는 숙주세포로 포함되는 것은 진핵 세포이다. 일반적으로, 진핵 세포는 포유류 세포, 조류 세포 또는 곤충 세포이다. 세포 또는 숙주 세포는 또한 효모 세포 또는 진균 세포를 포함한다. 그러나, 숙주 세포는 Enterobacteriaceae(e.g. E. coli) 또는 Pseudomonadaceae(e.g. P. putida)와 같은 그람 음성 세균 또는 Lactobacteriaceae 또는 Bacillaceae와 같은 그람 양성 세균의 세포를 포함하는 원핵 세포가 바람직하다. 그러나 가장 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 E. coli.이다.
미세입자
본 발명에서 정의된 "하전된" 미세입자는 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자이다. "양으로 하전된" 미세입자는 중성 pH 에서 일반적으로 적어도 하나 이상의 양성자를 가진다. "음으로 하전된" 미세입자는 중성 pH 에서 일반적으로 적어도 하나 이상의 전자를 가진다.
상기 미세입자는 분쇄된 수지를 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 수지는 다양한 물질에 결합 및 부착할 수 있고 혼합물로부터 물질을 포집할 수 있는 고체상, 불용성 고분자 물질이다. 수지는 일반적으로 세파덱스(sephadex), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate) 또는 중성 폴리사카라이드(neutral polysaccharides)을 포함하는 불활성 화합물로 구성되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 수지는 또한 셀룰로스(cellulose), 덱스트란(dextran) 또는 아가로스(agarose )와 같은 교차결합된 중성 고분자를 포함한다.
바람직한 실시예에 따른 미세입자는 이온 교환 수지, 더 바람직하게는, 고분자 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지로부터 제조된다. 이온 교환 수지는 고정된 작용기 또는 이온 교환 부위를 운반하는 전기적으로 하전된 고분자의 불용성 담체를 포함하는 고체 지지체를 지칭한다. 미세입자를 제조하기 위한 적절한 이온 교환 수지의 실예는 음이온 교환 수지, 양이온 교환 수지 및 혼합형 크로마토그래피 수지를 포함하고, 또한 본 발명에서 때때로 지칭되는 혼합형 이온 교환 수지를 포함한다. 교환 가능한 이온 형태는 이온 교환 수지 형태에 따라, 일반적으로 하나 또는 하나이상의 Na+, H+, OH- 또는 Cl- 이온이다. 이온 교환 수지는 약산 및 강산 양이온 교환 수지뿐만 아니라 약염기 및 강염기 음이온 교환 수지를 포함한다. 적절한 이온 교환 수지는 킬레이팅(chelating) 수지를 더 포함한다.
이온 교환 수지는 다양한 산업 분야에 널리 이용된다. 이온 교환 수지는 예를 들면, 발전소에서 보일러용 물의 광물질 제거 또는 응축물 처리와 같은 수처리 분야, 설탕액의 정제와 같은 식품분야 및 반도체를 위한 정제수 제조 분야에서 일반적으로 사용된다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 미세입자는 다공성, 구형의 이온 교환 수지로부터 제조된다. 구형의 이온 교환 수지는 단일 반응성 추가 중합가능 모노머(monofunctional addition-polymerizable monomer) 및 라디칼 중합 개시제가 포함된 모노머 혼합체를 액체 배지에 첨가한 후 모노머 혼합체의 현탁액을 제조하기 위해 젓고, 그 다음 현탁액은 구형의 교차결합된 고분자가 형성되도록 중합 온도에서 일정 시간 유지하는 과정을 포함하는 모노머 혼합체에서 서스펜션 중합(suspension polymerization)에 의해서 제조된다. 물 처리용 이온 교환 수지의 직경은 일반적으로 300-600 ㎛이다. 다른 실시예에서, 미세입자는 젤 형 및/또는 다공성 이온 교환 수지로부터 제조될 수 있다.
이온 교환 수지의 고분자 매트릭스는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리스티렌 및 스티렌 중합체(polystyrene and styrene copolymers), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 방향족 치환 비닐 공중합체(aromatic substituted vinyl copolymers), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 페놀-포름알데하이드(phenol-formaldehyde), 폴리아크릴아민(polyalkylamine) 및 이들의 조합체 등을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 고분자 매트릭스는 고분자 매트릭스는 폴리스티렌 및 스티렌 공중합체, 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트이고, 그리고 다른 실시예에서 고분자 매트릭스는 스티렌-디비닐벤젠(styrene-divinylbenzene, DVB) 공중합체이다. 바람직하게는, 미세입자를 제조하기 위한 이온 교환 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate (HEMA)-based), 디메틸아미노 에틸메탈크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate (DMAEMA)-based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트(dimethylamino ethylmethacrylate, pDMAEMA), 메타크릴산계(methacrylic acid (MAA)-based)의 수지를 사용한다. 가장 바람직하게는, 상기 수지는 디비닐벤젠과 교차결합된 폴리스티렌으로부터 만들어진다.
본 발명에서 사용된 양이온 교환 수지는 약산 또는 강산이 될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "약산성 양이온 교환 수지"는 일반적인 방법으로 측정하여 약 4.5 이상의 이온화 상수(pKa) 또는 해리 상수를 가지는 수지를 말한다 (예를 들면, Fisher et al., "Effect of Cross-linking on the Properties of Carboxylic Polymers. I. Apparent Dissociation Constants of Acrylic and Methacrylic Acid Polymers" J. Phys. Chem ., 60(8), 1030 (1956)). 수지는 교환기로써 카복실기, 페놀하이드록실기, 인산기 및 arsono group을 가질 수 있다. 반면에, 상기 용어 "강산성 양이온 교환 수지"는 1.5 이하의 이온화 상수 (pKa)를 가지는 수지를 말한다. 강산성 양이온 교환 수지는 소듐 폴리스티렌 설포네이트(sodium polystyrene sulfonate) 또는 polyAMPS와 같은 설폰산기 (sulfonic acid groups)를 가질 수 있다. 설폰산기(-HSO3)는 교환기이고 산성 용액에서 SO3- 및 H+이 해리되면서 강산의 역할을 수행한다.
본 발명에서 사용된 음이온 교환 수지는 약염기 또는 강염기일 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "약염기성 양이온 교환 수지" 일반적인 방법으로 측정하여 약 8.5 이상의 이온화 상수(pKa) 또는 해리 상수를 가지는 수지를 말한다(예를 들면, Fisher et al., "Effect of Cross-linking on the Properties of Carboxylic Polymers. I. Apparent Dissociation Constants of Acrylic and Methacrylic Acid Polymers" J. Phys. Chem ., 60(8), 1030 (1956)). 수지는 교환기로 폴리스티렌 아민과 같은 일차, 이차 및/또는 3차 아미노기를 가질 수 있다. 반면에, 상기 용어 "강염기성 음이온 교환 수지"는 약 12이하의 이온화 상수를 가지는 수지를 말한다. 강염기 음이온 교환 수지는 교환기로 예를 들면 트리메틸암모늄기(즉, polyAPTAC) 또는 디메틸에탄올아민(dimethylethanolamine)과 같은 4차 아미노기를 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지는 금속 이온과 킬레이트(chelate) 복합체를 형성할 수 있는 작용기를 포함하는 킬레이팅(chelating) 수지를 더 포함한다. 킬레이팅 수지는 일반적으로 특정 금속 이온에 높은 선택성을 가지는 특성이 있다. 몇몇 킬레이팅 수지는 그들의 작용기 및 pH 에 따라, 염기 및/또는 산성일 수 있다. 킬레이팅 수지의 일반적인 작용기는 이미노디아세트산(iminodiacetic acid), 폴리아민(polyamine), 메틸글루카마이드(methylglucamide), 티오우로니움(thiouronium) 및 아미노포스폰산(aminophosphonic acid)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. Amberlite IRC 748는 예를 들면, 세포 현탁액으로부터 생체분자 회수에 이용하기 위한 미세입자 제조에 이용될 수 있는 이미노디아세트산(iminodiacetic acid) 작용기를 가진 킬레이트 양이온 교환 수지의 일예이다.
시판되는 이온 교환 수지는 예를 들어 Amberlite, Amberjet, Duolite 및 Imac 수지는 Rohm & Haas of Philadelphia, Pennsylvania USA로부터, Lewatit 수지는 Bayer of Leverkusen, Germany로부터, Dow 수지는 Dow Chemical of Midland, Michigan USA으로부터, Diaion 및 Relite 수지는 Mitsubishi Chemical of Tokyo, Japan으로부터, Purolite 수지는 Purolite of Bala Cynwyd, Pennsylvania USA로부터, Ionac 수지는 Sybron of Birmingham, N.J. USA 및 Resintech of West Berlin, N.J. USA로부터 제공된다.
양으로 하전된 미세입자는 고분자 음이온 교환 수지로부터 제조될 수 있다. 시판되는 음이온 교환 수지는 일반적으로 OH- 또는 Cl- 형태 중 하나이다. 일 실시예에서, 음이온 교환 수지는 OH- 형태이다. 수지는 예를 들면, Diaion SA 수지(DIAION SA 20A 포함) 및 Diaion SK 수지 (DIAION SK 110 포함)(Mitsubishi Chemical 제조)과 같은 "Diaion" 이온 교환 수지, Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-734, and Amberlite IRA-900 (Rohm & Haas Co. 제조)과 같은 "Amberlite" 수지 또는 Dowex 1, Dowex 2, Dowex 11, Dowex 21K, Dowex 1x2, Dowex 1x4, Dowex 1x8 및 Marathon A2와 같은 Dowex Marathon 수지(Dow Chemical Co 제조)와 같은 "Dowex" 수지일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 음이온 교환 수지는Amberlite IRA-458 또는 Marathon A2이다. 음이온 교환 수지에서 작용기는 4차 암모늄기, 예컨대, 벤질트리메틸암모늄기(benzyltrimethylammonium groups, 타입 1 수지), 벤질디메틸에탄올암모늄기(benzyldimethylethanolammonium groups, 타입 2 수지), 트리알킬벤질 암모늄기(trialkylbenzyl ammonium groups, 타입 1 수지), 디메틸에탄올아민(dimethylethanolamine, 타입 2 수지) 또는 3차 아민기를 포함할 수 있다. 세포 파쇄를 위해, Marathon MA2 및 Amberlite IRA-458는 특히 양으로 하전된 미세입자의 제조에 바람직한 음이온 교환 수지이다.
음으로 하전된 미세입자는 고분자 양이온 교환 수지로부터 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, 고분자 물질은 고분자, 고분자 혼합물, 교차결합된 고분자, 그들의 혼합체 또는 고분자 네트워크까지 지칭한다. 종종, 고분자 물질은 간단히 고분자를 말한다. 일반적으로 시판되는 양이온 교환 수지는 일반적으로 H+ 또는 Na+ 형태 중 하나일 수 있다. 일 실시예에서, 양이온 교환수지는 H+ 형태이다. 수지는 예를 들면, Diaion PK 수지 및 Diaion SK 수지 (Mitsubishi Chemical 제조)와 같은 "Diaion" 양이온 교환 수지, Amberlite IRC-748와 같은 "Amberlite"(Rohm & Haas Co. 제조)수지 또는 Dowex 50WX2, Dowex 50WX8 및 Marathon C, Marathon MSC와 같은 Dowex Marathon 수지와 같은 "Dowex" 수지(Dow Chemical Co 제조)일 수 있다. 양이온 교환 수지의 작용기는 설폰산기(-SO3H), 포스폰산기(-PO3H), 포스핀산기(-PO2H), 카복실기(-COOH 또는 -C(CH3)-COOH) 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 양이온 교환 수지의 작용기는 -SO3H, -PO3H, 또는 -COOH일 것이고, 가장 바람직한 일 실시예로 양이온 교환 수지의 작용기는 -SO3H이다. 세포 파쇄를 위해, Amberlite IRC 748와 같은 킬레이팅 작용기를 가진 양이온 교환 수지가 특히 음으로 하전된 미세입자의 제조에 바람직하다.
본 발명에서 사용된 것과 같이, 고분자 음이온 교환 수지는 하나이상의 양성자를 가지는 고분자 물질 또는 그러한 고분자 자체를 말한다. 고분자 음이온 교환 수지는 하나이상의 전자를 가진다.
상기 본 발명의 양으로 하전된 미세입자는 중성 pH에서, 적어도 하나의 양성자, 및 더 일반적으로는 하나 이상을 가지는 입자이다. 반면에 음으로 하전된 미세입자는 중성에서 적어도 하나의 전자를 가진다.
양 또는 음으로 하전된 미세입자는 미세입자의 적어도 일부 성분이 이온적으로 하전될 때, 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 고체이고 소수성을 가진 생체분자 미세입자 포집에 이용하기 위한 신규 흡착 물질을 제공한다. 상기 미세입자는 분쇄형으로 존재하고 Amberlite XAD4, Amberlite XAD7HP, Amberlite XAD761와 같은 소수성 흡착 물질을 분쇄하여 제조할 수 있다.
일 실시예에서, 양으로 하전된 미세입자만 생물학적 유체에 첨가된다. 다른 실시예에서, 음으로 하전된 미세입자만 생물학적 유체에 첨가된다. 또한 다른 실시예에서, 양으로 및 음으로 하전된 미세입자 각각이 생물학적 유체에 첨가된다. 양으로 및 음으로 하전된 미세입자 각각이 생물학적 유체에 첨가되면, 양으로 하전된 미세입자 및 음으로 하전된 미세입자의 비율은 약 0.1:99.9 (w/w)에서 99.9 : 0.1 (w/w)까지 일 수 있다. 예를 들면, 약 50 : 50일 수 있지만, 또한 90 : 10, 80 : 20, 75 : 25, 60 : 40 , 40 : 60, 20 : 80, 25 : 75, 10 : 90, 등등과 같이 다를 수 있다. 또 다른 실시예에서, 소수성 미세입자는 생물학적 유체에 첨가된다.
바람직한 일 실시예에서, 미세입자는 약9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 6 ㎛, 5 ㎛, 4 ㎛, 3 ㎛, 2 ㎛ 및 1 ㎛이하와 같이 약 10 ㎛ 이하의 평균 미세입자를 가지는 분쇄된 입자 형태를 가진다. 바람직하게는, 분쇄된 입자는 평균 입자 크기가 약 5 ㎛ 이하이고, 더욱 바람직하게는 2.5 ㎛이하이다. 바람직하게는, 분쇄된 입자는 0.5 ㎛ 이상의 평균 입자 크기를 가진다. 따라서, 분쇄된 입자는 바람직하게 약 0.5 ㎛ 내지 10 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 9 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 8 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 7 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 6 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 5 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 4 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 3 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 2.5 ㎛ 범위의 평균 입자 크기를 가진다. 그러나, 분쇄된 입자는 0.5 ㎛ 이하뿐만 아니라 10 ㎛ 이상의 입자크기를 가질 수 있다.
미세입자의 제조
미세입자는 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 분쇄하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 상기 본 발명의 미세입자는 수지를 분쇄하고 컨디셔닝(conditioning)하여 얻을 수 있다.
수지의 제조 공정에서 잔여 부산물을 제거하기 위해 분쇄된 입자를 컨디셔닝하는 것이 바람직하다. 일반적인 이온 교환 수지 컨디셔닝 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있고 또한 공급자에 의해서 잘 설명된다.
필요하다면, "컨디셔닝"은 H+ 또는 OH- 형에서 Na+ 또는 Cl- 형으로 전이시키기 위해 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 컨디셔닝은 NaCl 및 물을 사용하여 세척 단계를 반복하여 수행될 수 있다. 상기 공정에서, 수지는 물 속에서 분쇄될 수 있고 원심분리에 의해 침강될 수 있다. 또한 Na+ 또는 Cl- 형인 수지는 상업적으로 이용가능하고 공급업체로부터 얻을 수 있다.
바람직한 실시예에서, 미세입자는 (a) 이온 교환 수지를 분쇄하고, (b) 수용액에 상기 분쇄된 수지를 재현탁하고, (c) 상기 분쇄된 수지를 침강시키고, (d) 침강이 일어난 상청액으로부터 분쇄된 수지를 수득하고, (e) 약 2 M NaCl에서 수득된 분쇄된 수지를 재현탁하고, (f) 상기 분쇄된 수지를 침강시키고, (g) (f) 단계의 침강이 일어난 상청액으로부터 분쇄된 수지를 수득하고, (h) 상기 분쇄된 수지를 침강시키고, (i) (h) 단계의 분쇄된 수지의 침강물을 수득하고, 및 (j) 상기 수득된 분쇄된 수지를 세척하여 제조된다.
본 발명의 소수성 미세입자는 바람직하게는 밤새 분쇄된다. 분쇄된 수지를 물로 재현탁한다. 상청액을 원심분리한다. 수지를 2 M NaCl와 같은 식염수로 재현탁하고 원심분리한 후 펠렛은 제거한다. 상청액을 옮기고 다시 원심분리한다. 상청액은 제거한다. 분쇄된 수지를 물로 재현탁하고 튜브로 옮긴다. 수지를 원심분리하고 상청액은 버리고 수지는 수용성 세척액으로 재현탁한다. 세척 조건은:
- 1x 50% EtOH (유기 잔유물의 희석)
- 3x deionized water (EtOH의 희석)
분쇄
분쇄는 분쇄기(제트밀(jet mill), 볼밀(ball mill), 해머밀(hammer mill) 등)와 같은 분쇄장치 또는 예를 들면, 막자사발을 이용한 손수 분쇄하는 방법을 포함하는 이 기술분야에서 알려진 방법에 의해서 수행될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용된 "분쇄"는 입자 크기를 감소시키는 공정을 말한다. 통상의 기술자는 수지를 제조하기 위하여 쉽게 분쇄방법을 선택할 수 있다. 일 실시예에서, 수지는 사발에서 하나이상의 막자를 작동시키는 자동화된 수단으로 습식 분쇄된다. 분쇄공정은 입자의 대부분이 약 10 ㎛ 이하, 즉, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 ㎛ 이하의 크기가 될 때까지 계속 수행된다. 바람직하게는, 수지는 입자의 대부분이 이하 설명된 평균 입자 크기를 가지도록 분쇄된다. 대부분 50% 이상, 즉, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 의미한다. 다른 실시예에서, 입자의 대부분은 적어도 0.1 ㎛, 즉, 0.2 ㎛, 0.3 ㎛, 0.4 ㎛, 0.5 ㎛, 0.6 ㎛, 0.7 ㎛, 0.8 ㎛, 0.9 ㎛, 1.0 ㎛, 1.1 ㎛, 1.2 ㎛, 1.3 ㎛, 1.4 ㎛, 1.5 ㎛, 1.6 ㎛, 1.7 ㎛, 1.8 ㎛, 1.9 ㎛, 2.0 ㎛, 3 ㎛, 4 ㎛ 및 5 ㎛의 평균 입자 크기를 가진다.
통상의 기술자는 이 기술분야에서 알려진 방법으로 쉽게 분쇄된 입자의 크기를 결정할 수 있다. 그로부터, 평균 입자 크기는 이 기술분야에서 알려진 수단 및 방법에 의해서 결정될 수 있다. 예를 들면, 크기는 실시예에 기재된 것과 같이 소프트웨어 기반 크기 측정을 사용하는 광학현미경에 의해서 결정된다. 분쇄된 수지의 입자 크기는 동등한 구 직경을 추정함으로써 1000배 배율로 측정될 수 있다. 분포는 바람직하게 1% v/v 에서 약 100 내지 500 입자의 직경 크기를 비교함으로써 계산된다. 분쇄는 좁은 구멍을 깨서 표면적을 증가시키는 효과를 가지고, 표면적의 증가로 특히, 단백질 또는 폴리펩타이드와 같은 생체분자의 결합능의 증가뿐만 아니라 매우 빠른 결합 속도를 나타낸다. 직경의 측정은 바람직하게는 입자를 인식하고 직경을 측정하는 소프트웨어 같은 기술적 수단의 도움으로 수행된다.
"재현탁", "현탁" 또는 본 발명에서 사용된 이러한 문법적 형태는 미세입자가 현탁액에 첨가되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "침강"은 혼합되어 있는 용액에서 미세입자가 가라앉아 바닥면에 멈추는 것을 의미한다. 침강은 미세입자에 작용하는 힘에 반응한 용액을 통한 입자 운동 때문이다. 상기 힘은 중력 또는 원심분리에 의한 원심 가속도일 수 있고, 바람직하게는 후자이다.
"수집"은 미세입자가 현탁액으로부터 수득되는 것을 의미한다..
본 발명에서 사용된 "세척"은 미세입자의 성능을 방해할 수 있는 액체 부유물의 양이 감소되는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 수지를 50 % (v/v) ethanol (EtOH) 및 double-deionized water (ddH2O)로 세척하고 상기 설명된 것과 같이 컨디셔닝하고, 그런 다음 ddH2O으로 반복하여 세척한다. 이러한 유체 각각의 부피는 미세입자의 부피를 초과하고, 바람직하게는 10배 또는 20배 초과한다.
분쇄 공정 후, 바람직한 범위 외의 입자는 예를 들면, 원심분리, 침강, 여과 또는 이 기술분야에서 통상의 기술자에게 알려진 다른 방법에 의해서 선택적으로 제거될 수 있다.
놀랍게도, 분쇄 입자의 거친 표면이 Bio-Rad Laboratories (USA)에서 개발된 Nuvia 배지와 같은 높은 결합능을 가진 일반적인 크로마토그래피 배지와 같이 유사한 단백질 흡착량을 제공한다.
미세입자의 첨가
첫 단계에서, 미세입자는 유체로 첨가된다. 본 발명의 흡착제는 실험실 규모, 시험적 규모 또는 산업적 규모로 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "실험실 규모"는 약 1 또는 10 ml내지 약 1000 ml의 유체로부터 생체분자의 배치흡착을 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "시험적 규모"는 약 1리터 내지 10리터의 유체로부터 생체분자의 배치흡착을 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "산업적 규모" 또는 대규모는 약 10리터 내지 약 1000 또는 10000리터의 유체로부터 생체분자의 배치흡착을 포함한다.
본 발명의 방법은 생물학적 유체에 양으로 하전된 미세입자의 첨가, 또는 음으로 하전된 미세입자의 첨가 또는 양으로 및 음으로 하전된 미세입자 각각의 첨가 또는 소수성 미세입자의 첨가를 포함한다. 양으로 및 음으로 하전된 미세입자 각각이 첨가된다면, 그들은 동시 또는 연속적인 방식으로, 준비된 혼합물 또는 별도로 첨가될 수 있다. 양으로 및 음으로 하전된 미세입자가 연속적으로(잇달아) 첨가된다면, 본 발명은 먼저 양으로 하전된 미세입자 또는 음으로 하전된 미세입자 중 하나를 생물학적 유체에 첨가하고 다음으로 반대의 하전된 미세입자를 생물학적 유체에 첨가하는 것을 포함한다. 통상의 기술자는 생물학적 유체의 종류 및 생물학적 유체로부터 회수될 원하는 생체분자를 고려하여 양으로 하전된 미세입자만을 사용할지 또는 음으로 하전된 미세입자만을 사용할지 또는 양으로 및 음으로 하전된 미세입자 각각을 사용할지를 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 흡착제는 분쇄된 입자 형태의 소수성 수지를 포함한다. 낮은 염 농도에서 일반적인 크로마토그래피 배지보다 뛰어난 소수성 미세입자의 단백질 흡착 용량은 특히 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 또는 친수성 단백질의 네거티브 정제(negative purification)에 유용하다. 따라서, 본 발명은 소수성 미세입자를 적용하여 폴리뉴클레오타이드 또는 친수성 단백질의 네거티브 정제를 위한 용도 및 방법을 제공한다. 상기 목적을 위해 균질액 또는 표준 단백질 용액에 50 % (v/v) 소수성 미세입자 현탁액을 첨가한다. 미세입자 현탁액을 30분 동안 배양한다. 그 후에 미세입자를 원심분리하고 용출 버퍼를 첨가하여 결합된 단백질을 용출시키고, 혼합하고 30분 동안 배양한다. 선택적으로, 용출 버퍼로 두번째 세척 단계가 포함될 수 있다. 이후에 용출된 미세입자를 다시 전과 같이 원심분리한다. 상청액의 단백질 농도는 예를 들면, 광도분석(photometric analysis)으로 정량할 수 있고 목적 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 확인할 수 있다.
상기 미세입자는 생체분자가 분리가 되어야 하는 생물학적 유체에 첨가될 수 있다. 용어 "생물학적 유체"는 넓게 이해될 수 있다. 이것은 어떤 기관으로부터 얻어지거나 생산된 것과 같이, 기관과 관련된 유체를 지칭한다. 생물학적 유체는 세포 배양 배지, 세포 발효 상청액, 발효액, 세포 현탁액, 세포 용해액을 포함된다. 생물학적 유체의 또 다른 예는 상기 위에 설명되어 있습니다. 다른 실시예에서, 생물학적 유체는 타액, 소변, 림프액, 전립선액, 정액, 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 점액분비, 우유, 유청, 복수의 유체, 기관 추출물, 식물 추출물, 동물 추출물일 수 있다. 바람직한 실시예에서, 생물학적 유체는 시험관내 또는 생체내 과정에서 다양한 유래의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, BAC DNA, minicircle DNA 등을 함유하는 유체로서, 본 발명에 기재된 임의의 생물학적 유체, 특히, 발효액, 배양액, 발효 상청액, 배양 상청액, 세포 균질액, 세포 용해물 또는 세포 현탁액 중 어느 하나일 수 있다. "세포 파쇄액"은 일반적으로 파쇄된 세포의 혼합체로 이해될 수 있다. 세포 균질액은 기계적 또는 화학적 방법으로 얻어질 수 있다. 예를 들면, 세포는 발효 균질액을 만들기 위해 균질기로 고압처리하는 것과 같은 통상적인 방법, 또는 알카리 용해물(alkaline lysis)을 포함하는 용해액으로 간단히 혼합함으로써 균질화 될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 생체분자 및 양으로 및 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 유체를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 생물학적 유체는 본 발명의 방법 중 어느 한 단계 동안 및 /또는 후에 교반된다. 그러나 바람직하게는 입자가 응집물을 형성하도록 하는 단계 및/또는 응집물이 생물학적 유체로부터 제거되는 단계 동안은 그러하지 아니하다.
"세포 균질액"은 일반적으로 파쇄된 세포의 혼합물을 말한다. 세포 균질액은 기계적 또는 화학적 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 세포는 세포 균질액/용해액을 만들기 위해 균질기로 고압처리 하는 것과 같은 통상적인 방법으로 균질화 될 수 있고, 또한 세포를 알카리 용해물(alkaline lysis)을 포함하는 용해액으로 볼텍싱하여 균질화할 수 있다.
생물학적 유체의 예로는 세포 배양액, 세포 균질액, 세포 용해액 및 E. coli 로 부터 얻은 발효 상청액 및 CHO 세포 배양액을 포함한다. 발효 상청액 또는 세포 균질액은 추가로 여과, 농축, 투석, 조절 또는 다른 방법으로 처리될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 생물학적 유체는 세포 현탁액이다. 본 발명에서 사용된 상기 용어 "세포 현탁액"은 바람직하게는 그대로의 세포를 포함하는 세포 배양 배지, 버퍼와 같은 액체 또는 임의의 다른 적절한 액체를 말한다. "그대로(intact)"는 세포의 세포 내 구성물을 둘러싸고 있는 세포막의 물리적 연속성을 지칭하고 일반적인 배양 조건에서 세포막의 투과성을 초과하는 정도까지 세포 내 성분을 방출시키는 임의의 방식으로는 상기 세포막이 파쇄되지 않은 것을 의미한다.
상기 미세입자가 생물학적 유체에 첨가되는 동안 및/또는 후에, 균질한 혼합물을 얻기 위해 젓거나 흔들어 줌으로써(상기 MPs 첨가 직후) 그것들을 혼합할 수 있다. 어떤 실시예에서, 혼합은 응집 및/또는 세포 및/또는 생체분자와 미세입자간에 접촉을 용이하게 하여 세포 파쇄를 촉진시킬 수 있다. 상기 입자가 생물학적 유체와 혼합되는 동안 흡착이 지속적으로 일어난다. 그러나, 어떤 실시예에서는, 미세입자의 첨가 후에 혼합이 필요없다(실시예에서 정적 배양(static incubation)으로 언급함).
배양 파라미터
미세입자가 생물학적 유체에 첨가될 때, 세포의 최적 부피 농도(각각의 부피 분율의 비율을 가르키는 "% (v/v)" 로 표시한다)는 조정될 수 있다. 어떤 실시예에서, 세포 부피 농도는 30% (v/v)이하로, 즉, 약 25% (v/v)이하, 약 20% (v/v)이하, 약 15% (v/v)이하, 약 10% (v/v)이하, 약 9 % (v/v)이하, 약 8% (v/v)이하, 약 7% (v/v)이하, 약 6% (v/v)이하, 약 5% (v/v)이하, 약4% (v/v)이하, 약 3% (v/v)이하, 약 2% (v/v)이하 또는 약 1% (v/v)이하 이다. 혼합은 세포 및 미세입자의 균질한 혼합물을 얻는데 유용할 것이다.
본 발명의 일부 양태에서, 상기 미세입자 농도는 바람직하게는 약 300 % (v/v)이하로, 즉, 약 200%, 100% (v/v), 80% (v/v), 70% (v/v), 60% (v/v), 50% (v/v), 40% (v/v), 30% (v/v), 20% (v/v), 10% (v/v)이하 또는 그 이하이다. 수지:세포의 부피 비율의 선택은 예를 들면, 미세입자 크기 분포(효과적인 표면적) 및 전하 밀도(접촉 면적당 작용기)에 의존한다.
응집(flocculation)
일부 실시예에서, 미세입자를 생물학적 유체에 첨가한 후 다음 단계는 응집물을 형성하도록 하는 것이다. 놀랍게도 미세입자는 생물학적 유체내에서 미세입자에 세포 및/또는 생체분자가 흡착하자마자 빠르게 세포 및/또는 생체분자와 큰 직경의 응집물을 형성할 수 있다는 것을 알았다.
미세입자가 세포 현탁액에 첨가될 때, 세포는 미세입자에 흡착하여 응집물로 고정화 될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 세포는 생체분자를 방출하고 남아 있다. 방출된 생체분자는 미세입자에 흡착될 수도 아닐 수도 있다.
미세입자가 세포 용해액, 세포 균질액, 발효 상청액과 같은 생물학적 유체에 첨가될 때, 응집물은 미세입자에 생체분자가 흡착하자마자 형성될 것이다. 일부 실시예에서, 양으로 및 음으로 하전된 미세입자가 먼저 혼합되고 그 다음 생물학적 유체에 첨가되면 생물학적 유체와 상기 미세입자 혼합물이 접촉하자마자 응집이 일어난다. 다른 실시예에서, 먼저 양으로 또는 음으로 하전된 미세입자가 생물학적 유체에 첨가된 다음 반대로 하전된 미세입자가 별도로 첨가될 때, 응집물을 형성하였다.
일 실시예에서 생체분자는 산성이다. 이 경우에, 양으로 하전된 미세입자는 흡착에 이용하기 위해 세포 용해액 또는 세포 균질액과 같은 생물학적 유체에 첨가된다. 양으로 하전된 미세입자는 또한 세포를 파쇄하고 생체분자를 방출시키기에 충분한 양 또는 세포 파쇄와 생체분자 흡착에 필요한 양보다 많은 양 중 어느 하나로 세포 현탁액에 첨가될 수 있다. 통상의 기술자는 세포를 부분적으로 또는 완전히 파쇄하는데 필요한 양을 결정할 수 있다. 음으로 하전된 미세입자는 그 후에 첨가될 수 있고 이것은 입자 크기 및 응집물의 안정성을 증가시키는 가교제와 같은 역할을 한다. 또한, 킬레이트 양이온 교환 수지로부터 제조된 음으로 하전된 미세입자는 추가 정제를 위해 세포를 파쇄하고 생체분자를 방출시키기에 충분한 양으로 세포 현탁액에 또한 첨가될 수 있다. 선택적으로, 양으로 하전된 미세입자는 이후에 응집을 증가시키기 위해 첨가될 수 있다.
다른 실시예에서 상기 생체분자는 염기성이다. 이 경우에, 양으로 하전된 미세입자는 세포 파편 또는 DNA, 숙주 세포 단백질 및 세포 조각과 같은 다른 불순물과 응집물을 형성하도록 하기 위해, 세포 용해액 또는 세포 균질액과 같은 생물학적 유체에 첨가될 수 있다. 음으로 하전된 미세입자는 입자 크기 및 응집물의 안정성을 증가시키기 위해 첨가될 수 있고, 그래서 상기 응집물은 쉽게 분리 제거될 수 있다. 그 다음 염기성 생체분자는 양으로 하전된 미세입자에 결합하지 않으므로 상청액으로부터 회수될 수 있다. 또한, 양으로 또는 음으로 하전된 미세입자는 추가 정제를 위해 세포를 파쇄하고 생체분자를 방출시키기에 충분한 양으로 세포 현탁액에 첨가될 수 있다. 응집물은 일반적으로 시각적으로 잘 보이고 그들의 분리를 용이하게 하기 위해서 100 ㎛ 또는 훨씬 더 큰 크기를 가진다. 이것은 세포 및/또는 세포 파편을 여과, 정제, 원심분리를 통해서 쉽게 제거할 수 있음을 의미한다. 그러므로 본 발명은 이전의 방법보다 더 빠르고 더 간단하다. 컬럼 크로마토그래피를 사용하는 경우에는, 그렇지 않은 경우에 필요한 수지를 재생산할 필요가 있지만 불가능하다. 또한, 상기 미세입자는 값싼 물질이므로 사용 후 폐기할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 응집물은 적어도 5 ㎛의 평균 입자 크기를 가진다, 즉 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 ㎛ 또는 그 이상이 형성된다.
흡착 용량
본 발명에서 사용된 상기 "흡착 용량"은 평형 상태에서 수지 1ml 당 흡착된 생체분자의 양(mg)으로 정의된다. 본 발명에서 사용된 것과 같이 평형은 흡착률과 탈착률이 동등해지는 상태이다. 원하는 생체분자, 특히 수용성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대한 미세입자의 흡착 용량은 예를 들면, 생체분자의 용출 전후에, 예를 들면, 형광(fluorescence) 또는 분광도(spectrophotometry)에 의해서 상청액에 존재하는 상기 폴리펩타이드 또는 폴린뉴클레오타이드를 정량하여 결정될 수 있다. 생체분자량 차이는 그 다음 미세입자에 흡착될 것으로 간주한다. 이 기술분야에서 통상의 기술자가 이해할 수 있는 바와 같이, 상기 흡착 용량은 미세입자의 특성, 생체분자, pH, 온도, 염 농도 및 다른 파라미터, 또는 이들의 조합과 같은 다양한 파라미터에 의존한다 일부 실시예에서, 양으로 하전된 미세입자는 실시예 3.1.5에 기재된 조건 하에서, 적어도 5 mg, 즉, 수지 1 ml 당 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mg GFP를 흡착할 수 있다. 다른 실시예에서, 양으로 하전된 미세입자는 실시예 4.1.3에 기재된 조건 하에서, 적어도 5 mg, 즉, 수지 1ml 당 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mg SOD 을 흡착할 수 있다.
응집물의 제거
일반적으로, 액체(생물학적 유체 또는 버퍼)로부터 응집물의 제거는 여과, 원심 분리, 침강 또는 다른 적절한 수단에 의해서 수행될 수 있다. 통상의 기술자는 유체로부터 응집물을 분리하거나 흡착하는데 사용될 수 있는 방법을 쉽게 선택할 수 있다. 응집물의 현탁은 예를 들어 버킷(bucket), 원심분리기(실험실 규모), 관형(tubular) 원심분리기, 디켄터(decanter) 또는 시험적 및 산업적 규모 운영을 위한 디스크 스택(disk stack) 원심분리기 중 어느 하나로 처리될 수 있다. 마찬가지로, 남아 있는 응집물은 여과, 침강 또는 추출에 의해서 제거가 가능하다. 탈착은 추출 디켄터, 혼합-침강기 또는 컬럼 추출기에 의해서 수행될 수 있다. 제거를 위한 다른 유용한 방법은 접선 유동 여과(tangential flow filtration), 딥 베드 여과(deep-bed filtration), 데드 엔드 여과(Dead End Filtration) 또는 필터 프레스(filter press), 누체 필터(nutsche filter)의 사용을 포함하는 방법에 의할 수 있다.
생체분자의 탈착
탈착은 이 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 탈착은 단백질과 같은 생체분자의 탈착이 가능한 버퍼(탈착 버퍼)에서 응집물을 재현탁함으로써 수행될 수 있다. 이것은 관형 혼합기 또는 교반기와 같은 다른 혼합 장치를 포함하는, 이 기술분야에서 알려진 수단을 사용함으로써 수행될 수 있다. 탈착은 또한 추출 디켄터, 혼합-침강기 또는 컬럼 추출기에 의해서 수행될 수 있다..
현탁액은 탈착을 위한 적절한 조건이 적용된다. 통상의 기술자는 응집물에 흡착된 생체분자를 탈착하기 위한 조건을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 통상의 이온 교환 크로마토그래피에서 사용되는 탈착 방법이 적용될 수 있다. 예를 들면, 탈착은 등전점 이하 또는 이상의 pH에서 용출되거나 증가된 염 농도에 의해 수행될 수 있다.
생체분자는 이 기술분야에서 알려진 방법에 의하여 더 정제되거나 농축될 수 있다. 이들은 예를 들면, 침전, 결정화 및/또는 소수성 결합 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), (슈도-친화 크로마토그래피(pseudo-affinity chromatography), 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피(anion or cation exchange chromatography) 및/또는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 구성되는 군으로부터 선택되는 크로마토그래피를 포함한다. 따라서, 바람직한 실시예에서 본 발명에 설명된 방법은 상기 기술된 침전 및/또는 크로마토그래피를 사용함으로써 생체분자, 특히 단백질을 정제 하고/하거나 농축하는 더 많은 단계를 포함한다.
그러나, 일부 실시예에서, 세포는 미세입자에 흡착하지 않고 상기 미세입자와 접촉하자 마자 생체분자를 방출하는 것을 발견하였다. 이 경우, 세포는 미세입자에 흡착하지 않고 응집이 일어나지 않을 것이다. 예를 들면, 하전된 미세입자가 반대 표면 순 전하(opposite surface net charge)를 가진 세포의 세포 현탁액에 첨가될 때, 상기 세포는 미세입자에 흡착하지 않고 응집이 일어나지 않을 것이다. 상기 세포의 "표면 순 전하"는 주위 용액의 pH 에 의존하는 세포 표면에 존재하는 모든 전하의 합으로 정의된다.
방출된 생체분자는 미세입자에 흡착될 수도 있고 아닐 수도 있다. 생체분자가 미세입자에 흡착되지 않는다면, 생체분자의 탈착도 일어나지 않는다. 이 경우에, 예를 들면, 원심분리 또는 여과 또는 임의의 다른 수단을 이용하여 유체로부터 세포 및 미세입자를 분리함으로써 생체분자를 상청액으로부터 회수할 수 있다. 생체분자가 미세입자에 흡착된다면, 예를 들면, 탈착 버퍼를 이용하여 생체분자가 용출되도록 미세입자의 조건을 변경함으로써 탈착이 이루어진다. 응집물의 크기 때문에, 생체분자가 탈착 버퍼로 탈착된 후에, 탈착 버퍼로부터 형성된 응집물을 분리하기가 쉽다.
이 기술분야에서 통상의 기술자는 미세입자 및/또는 세포로부터 상청액을 분리하기 위해 적용할 방법을 용이하게 알고 있다.
회수
본 발명은 생물학적 유체 및/도는 세포로부터 생체분자를 회수하는데 사용될 수 있다. 모든 문법적 형태에 있어서 생체분자를 회수하는 것은 생체분자를 획득하고, 수확하고, 달성하고, 받고 또는 얻는 것을 의미한다. 생체분자는 플라스미드, 폴리뉴클레오타이드 또는 펩타이드, 단백질과 같은 발현생성물일 수 있다. 상기 단백질은 당화되거나 번역 후 변형된 것을 포함한다. 이 기술분야 및/또는 본 발명에서 설명된 수단 및 방법에 의해서, 생체분자는 분리되고/되거나 추가 정제와 같은 추가로 처리될 수 있다. 또한, 회수는 세포로부터 생체분자를 방출시키기 위해 세포를 파쇄하고, 가능한 세포 배양액으로부터 생체분자를 분리 정제하는 실시예를 또한 포함한다. 다음 단계로, 추가 정제 및/또는 생체분자의 농축이 수행될 수 있다.
세포 파쇄
본 발명은 또한 세포 현탁액에 하전된 미세입자를 첨가하여 세포를 파쇄하는 방법을 제공한다. 상기 용어 "세포 파쇄" 또는 "세포의 파쇄"는 생체분자가 세포로부터 방출될 정도로 까지 세포를 투과성이 있도록 만드는 방법 또는 공정으로 본 발명에서 교환적으로 사용된다. 세포 파쇄는 세포 사멸을 포함할 수도 아닐 수도 있다. 바람직하게는, 세포 파쇄는 세포벽과 같은 세포 내 구조물을 완전히 조각화하지 않으므로 세포 조각화를 감소시켜 세포 파편을 포함하여 원하지 않는 오염도를 감소시킨다. 본 발명의 일부 실시예에서, 본 발명에서 설명된 방법에 의해 파쇄된 세포는 생체분자를 방출하고 존속할 수 있는 상태로 남아 있다. 상기 용어 "존속할 수 있는"은 적절한 성장 환경에서 복제가 가능한 세포를 지칭한다.
상기 방출된 생체분자는 세포 파쇄에 사용된 미세입자에 흡착될 수도 있고 아닐 수도 있다. 그 다음 생체분자는 본 발명에 설명된 방법 또는 알려진 다른 기술을 사용하여 생물학적 유체로부터 회수된다. 그러므로, 본 발명은 간단한 두 단계 공정으로, 세포 파쇄, 생체분자 방출 및 생체분자 회수에 이용하기 위한 신규 방법을 제공한다. 본 발명의 미세입자는 생체분자를 방출시키기 위해 세포를 여는데 사용하여 생체분자의 산도에 관계 없이(생체분자는 산성, 염기성 또는 중성일 수 있다), 상기 생체분자를 세포 현탁액에서 회수할 수 있다.
선택성
본 발명의 방법은 통상의 세포 파쇄 방법에 의해 수득된 생체분자와 비교하여 더 높은 순도의 생체분자를 제공할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 회수된 생체분자 파편에 비 대상 물질이 적기 때문에 종래 사용된 통상의 방법보다 더 높은 선택성을 가진다. 추가적인 연속적 정제 단계가 필요없기 때문에 회수된 생체분자의 고순도는 더 바람직하다. 바람직하게는, 본 방법은 비 대상 생체분자와의 상대 농축비가 30% 이상, 즉, 40% 이상, 50 % 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 심지어 100%인 생체분자를 제공한다. 비 대상 생체분자와 비교하여 주어진 생체분자의 순도를 평가하는 방법은 이 기술분야에서 통상의 기술자가 이용 가능하다. 폴리펩타이드를 들면, 예시적인 방법은 SDS 폴리아크릴아마이드 겔전기영동(polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-Page)으로 분리한 후 쿠마씨 블루(Coomassie blue)로 염색한 단백질을 정량농도계(quantitative densitometry)로 측정하는 방법이다.
통상적인 세포 파쇄 방법이 적용될 때, 세포는 파괴되고 핵산, 세포벽 구성물 및 다른 파편들이 방출된다. 그러므로, 회수된 생체분자는 오염물을 제거하기 위해 추가로 더 정제되어야 한다. 그러나, 본 발명에 설명된 방법은 고분자(macromolecular) 오염물질의 방출을 감소시킬 수 있다. 그러한 오염물질은 dsDNA, RNA, 숙주 세포 단백질(host cell proteins), 숙주 세포 파편(host cell debris) 및 엔도톡신(endotoxins)를 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 놀랍게도 본 발명의 방법은 실시예 2.2에 설명된 것과 같이, 표준 HPH 프로토콜에 의해 얻어진 세포 균질액에서의 dsDNA 양과 비교하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 또는 그 이상으로 dsDNA 양을 감소시킴을 알았다. 이 기술분야에서 통상의 기술자는 예를 들면, 통상적으로 이용가능한 형광(fluorimetric) 또는 비색 분석(colorimetric assays)을 통하여, 주어진 샘플에서 dsDNA 양을 측정할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법을 적용하면 세포로부터 5배 적은 dsDNA가 방출되고, 더 바람직하게는 10배 적은 dsDNA, 또는 심지어 100배, 1000배 더 적은 dsDNA가 방출된다.
본 발명에서 사용된 "엔도톡신"은 그람 음성 세균의 외부 세포막의 주요 성분인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 교환적으로 사용된다. 엔도톡신은 일반적으로 세균 외부 세포벽이 파괴되자마자 방출된다. 본 발명의 방법은 놀랍게도 실시예 2.2와 같이, 표준 HPPH 프로토콜로 얻어진 세포 균질액에서의 엔도톡신 양과 비교하여 방출된 엔도톡신 양이 감소함을 보여준다. 바람직하게는, 본 발명의 방법을 적용하면 세포로부터 5배 적은 엔도톡신이 방출되고, 더 바람직하게는 10배 적은 dsDNA, 또는 심지어 100배, 1000배, 104 배, 105 배 또는 106 배 더 적은 엔도톡신이 방출된다. 이 기술분야에서 통상의 기술자는 예를 들면, Limulus Amebocyte Lysate (LAL) gel clot test, LAL chromogenic tests 및 이 기술분야에서 통상적으로 이용가능하거나 알려진 다른 chromogenic tests를 이용하여 엔도톡신 양을 측정할 수 있다.
생체분자를 생산하는 세포 배양 ("생성물")
본 발명의 흡착제를 적용하기 전에, 본 발명에서 설명한 것과 같이 생체분자를 수득하는 방법은 선택적으로 생체분자(생성물), 바람직하게는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 발현물을 생산하는(발현하는) (숙주)세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 숙주세포 내 배지(혈청 포함 또는 불포함)에서 상기 용어 "세포 배양" 또는 "세포를 배양하는 것"은 배양용기에 세포를 시드하는 것, 부착배양의 경우 단일층을 형성할 때까지 배지에서 세포가 성장하는 것, 또는 현탁 배양의 경우 단일층을 형성하자마자 충분한 세포 밀도가 달성되거나 유지되는 것 또는 현탁액내에서 세포를 유지하는 것을 각각 지칭한다. 배지에서 상기 용어 "세포 배양" 또는 "세포의 배양"은 또한 상기 언급된 모든 단계가 무 혈청 배지에서 수행되는 것을 포함해서 전체 세포 배양 과정동안 어떠한 동물 혈청 생성물은 존재하지 않는다. 세포는 지수 공급(exponential feed), 또는 선형 또는 지속적 공급(linear or constant feed) 또는 다른 형태의 공급, 일괄 공급 배양(fed batch cultivation), 또는 고밀도 배양(high density cultivation)에 의해서 배양될 수 있다..
염기서열 및/또는 코딩된 폴리펩타이드는 세포에 대해서 이종이거나 아닐 수 있다. "이종", 이것은 다른 유전적 배경을 가진 세포 또는 기관으로부터 유래된 것이거나 자연적으로 발생한 상기 염기서열의 대응보다 다른 유전적 환경에 위치한 숙주세포에 대해서 동종인 것을 의미한다. 이것은 염기서열이 숙주와 동종이라면, 상기 숙주의 게놈에서 그것의 자연적 위치에 존재하지 않고 특히 다른 유전자에 의해 둘러싸여 있는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 발현 생성물은 단백질 생성물이다. 본 발명에서 사용된 "단백질"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 보통 황을 포함하는 어떤 복합 유기 거대분자군과 하나 또는 그 이상의 아미노산 고리로 구성된 것을 지칭한다. 바람직한 단백질 발현 생성물은 폴리펩타이드이다. 따라서, 그 용어 "단백질"은 또한 단백질과 관련된, 단백질로 이루어진, 단백질로 구성된 또는 단백질에 관한 것을 의미한다. 본 발명의 더 바람직한 실시예에서, 생성물은 발현되고 생산된 목적 폴리펩타이드 일 수 있다. 생성물은 생물학적으로 활성을 가지는 것이 바람직하다. 단백질 생성물은 산성 또는 염기성일 수 있다.
발현 생성물은 염기서열의 전사 생성물 및/또는 번역 생성물이 될 수 있다. 바람직하게, 염기서열은 유전적으로 조작된 숙주세포에서 이 기술분야에서 통상적으로 알려진 수단 및 방법에 의해서 세포에 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 생성물은 예를 들면, 플라스미드(plasmid), mini-circle DNA, 코스미드(cosmid), BAC, ssDNA 또는 dsDNA 서열 또는 RNA 서열 (ribozyme, antisense RNA, siRNA, iRNA, miRNA 등), 숙주세포에서 생성될 수 있는 모든 것을 포함하는 염기서열이 될 수 있다. 또한, 그것은 세포에서 전사된 RNA의 번역에 의해 생성된 폴리펩타이드가 될 수 있다.
본 발명에서 사용된 "폴리펩타이드"는 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 그들의 조각을 포함하고, 상기 "폴리펩타이드"는 바람직하게는 생물학적 활성을 가진다. 상기 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 일반적으로 약 10. 20 또는 30 이상의 아미노산 임의의 길이를 가진 아미노산 폴리머로 지칭되어 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 당화, 아세틸화 및 인산화를 포함하는 반응을 통해서 번역 후 변경된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 Fc-융합, 알부민-융합과 같은 반감기 연장을 위한 융합 파트너, 또는 친화 크로마토그래피용 친화 태그로써 융합 파트너, 또는 관심있는 단백질의 N-말단을 변경하거나 생산을 증가시키는 융합 파트너로 융합된 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 용어 "펩타이드"는 일반적으로 약 30미만의 아미노산으로 이루어진 짧은 가닥의 아미노산을 지칭한다. 폴리펩타이드는 작용제 또는 길항제의 역할 및/또는 치료 또는 진단용으로 사용될 수 있다.
또한, 비록 미생물 및 효모 생성물로 또한 생산될 수 있지만 본 발명의 세포에서 발현된 폴리펩타이드는 포유류 유래일 수 있다.
포유류 폴리펩타이드 또는 단백질의 예로는 호르몬, 사이토카인(cytokines), 림포카인(lymphokines) 및 Fabs, 나노바디(nanobodies), dAbs, scFvs, 리셉터(receptors), 부착분자(adhesion molecules)와 같은 항체 및 효소뿐만 아니라 그들의 파편이 포함된다. 원하는 생성물의 비포괄적인 목록은 예를 들어, 인간 성장 호르몬(human growth hormone), (소 성장 호르몬(bovine growth hormone), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone), 난포 자극 호르몬 성장(follicle stimulating hormone growth), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone); 호르몬 분비 인자(hormone releasing factor); 지질단백질(lipoproteins); 알파1 항트립신(alpha-1-antitrypsin); 인슐린 A체인(insulin A-chain); 인슐린 B 체인(insulin B-chain); 인슐린 전구체(proinsulin); 칼시토닌(calcitonin); 글루카콘(glucagon); 레닌(rennin)과 같은 분자; VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자, 및 본 빌레프란트 인자(von Willebrands factor)와 같은 응고 인자(clotting factors); 단백질 C, 심방 나트륨이뇨성 인자(atrial natriuretic factor), 폐계면활성제(lung surfactant)와 같은 항 응고 인자(anti-clotting factors); 우로키나아제(urokinase), 인뇨(human urine) 또는 t-PA(tissue-type plasminogen activator)와 같은 플라스미노겐활성화인자(plasminogen activator); 봄베신(bombesin); 트롬빈(thrombin); 조혈 성장 인자(hemopoietic growth factor); 종양 괴사 인자-알파 및 -베타(tumor necrosis factor-alpha and-beta); 엔케팔리나아제(enkephalinase); RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed and secreted); 인간 대식세포 염증 단백질(human macrophage inflammatory protein, MIP-1-alpha); 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민(serum albumin); 뮬러 억제 물질(mullerian-inhibiting substance); 릴랙신(relaxin A- 또는 B-chain); 릴랙신 전구체(prorelaxin); 쥐 성선 자극 호르몬 관련 펩티드(mouse gonadotropin-associated peptide); DNase; 인히빈(inhibin); 액티빈(activin); 호르몬 또는 성장 인자용 리셉터; 인테그린(integrin); 단백질 A 또는 D; 류머티즘 인자(rheumatoid factors); 뼈 유래 신경 영양 인자(bone-derived neurotrophic factor, BDNF), neurotrophin-3,-4,-5,-6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 포함하는 성장인자, 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF)와 같은 신경 영양 인자(neurotrophic factor); 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF); aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, FGF-6와 같은 섬유 아세포 성장 인자(fibroblast growth factor); TGF-alpha 및 TGF-pl, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4, TGF-p를 포함하는 TGF-beta와 같은 변형 성장 인자(transforming growth factor, TGF); 인슐린 유사 성장 인자-1 및 -2(insulin-like growth factor-I 및 -II, IGF-I 및 IGF-11); des (1-3)-IGF-I(brain IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(insulin-like growth factor binding proteins); CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19과 같은 CD 단백질(CD protein); 적혈구 생성 촉진 인자(erythropoietin); 골유도 인자(osteoinductive factors); 항체독소(immunotoxins); 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP); 인터페론 알파, 베타 및 감마 와 같은 인터페론(interferon); M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF와 같은 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors, CSFs); IL-1 내지 IL-10과 같은 인터루킨(interleukins, ILs); 과산화물 제거 효소(superoxide dismutase); T 세포 리셉터(T-cell receptors); HER2와 같은 표면 막 단백질(surface membrane proteins); 부패 촉진 인자(decoy accelerating factor); 예를 들면, AIDS 껍질 부분과 같은 바이러스 항원(viral antigen); 운반 단백질(transport proteins); 수용체(homing receptors); 주소단백질(addressins); 조절 단백질(regulatory proteins); 항체(antibodies); 면역접합체(immunoadhesins)와 같은 키메라 단백질(chimeric proteins) 및 상기 기재된 폴리펩타이드의 어느 하나의 파편을 포함한다.
본 발명에서 바람직한 폴리펩타이드 및 단백질은 TGF-β, TGF-α, PDGF, EGF, FGF, IGF-I, DNase, t-PA 와 같은 플라스미노겐활성화인자, 조직인자 및 인자 VIII과 같은 응고인자, 릴랙신 및 인슐린과 같은 호르몬, IFN-y와 같은 사이토카인, TNF receptor IgG immunoadhesin(TNFr-IgG)와 같은 키메라 단백질 또는 이중 특이성 항체(bispecific antibodies), 카멜리드 항체(cameldid antibodies) 및 이들의 파면, VHH 도메인 항체, 도메인 항체와 같은 항체, anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-IgD 또는 anti-IgE와 같은 면역글루불린(immunoglobulins)과 같은 치료용 단백질이다. 바람직한 치료용 단백질은 본 발명에서 설명된 것과 같이 인간 항체와 같은 인간 유래 또는 "인간화" 단백질이다.
생성물이 폴리펩타이드라면, 폴리펩타이드는 태그될 것이다. 예를 들면, 바람직하게는 상기 폴리펩타이드로 분리 및/또는 정제시킬 수 있는 이종의 폴리펩타이드와 융합될 수 있다. 이종의 폴리펩타이드는 예를 들면, 히스티틴 태그(histidine tag), 플래그 태그(Flag-tag), 스트렙타비딘 태그(streptavidin tag), 스트랩 II 태그(strep II tag), 인테인(intein), 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein), IgA Fc portion, IgG Fc portion, 단백질 A(protein A) 또는 단백질(protein G)가 될 수 있다.
생성물이 어떤 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드라면, 상기 염기서열은 염기서열을 포함하는 상기 발현 생성물을 분리 및/또는 정제시킬 수 있는 이종의 염기서열과 융합될 수 있다. 예를 들면, 이종 염기서열은 상보적인 염기서열에 결합할 수 있다. 이에 따라, 상기 염기서열의 분리 및/또는 정제가 가능하다. 이종의 폴리펩타이드 또는 염기서열의 문맥에서 사용된 "이종의"는 폴리펩타이드 또는 염기서열이 목적하는 생성물을 발현하는 폴리펩타이드 또는 염기서열과 다른 것을 의미한다.
생성물이, 폴리뉴클레오타이드의 예로써, 플라스미드라면, 상기 플라스미드는 유전자 치료 또는 DNA 백신에 유용하거나 상기 목적하는 생성물과 같이 치료용 단백질을 코딩할 수 있다.
반면에, 세포는 바이러스를 발현할 수 있다. 예를 들면 상기 세포는 말하자면, 바이러스가 복제 및/또는 전파되는 적절한 환경을 제공하는 생산 세포주 역할을 수행한다. 따라서, 생성물은 바이러스가 될 수 있다. 실제로, dsDNA 바이러스(e.g. Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses), ssDNA 바이러스(e.g. Parvoviruses), dsRNA 바이러스(e.g. Reoviruses), (+) ssRNA 바이러스(e.g. Picornaviruses, Togaviruses), (-) ssRNA(e.g. Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses), ssRNA-RT 바이러스(e.g. Retroviruses) 및 dsDNA-RT 바이러스(e.g. Hepadnaviruses)와 같은 어떠한 바이러스도 본 발명의 방법에 의해서 회수될 수 있다. 바이러스 복제는 숙주세포에 감염 또는 전파 과정동안 바이러스의 형성을 설명하는데 사용하는 용어이다. 바이러스 관점에서, 바이러스 복제의 목적은 이러한 종류의 생산 및 생존을 위한 것이다. 풍부한 게놈 카피를 생성하고 이들 카피로 바이러스를 조립함으로써, 바이러스는 계속적으로 새로운 숙주에 감염할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 적절한 숙주 세포로부터 생성된 바이러스는 라이시스(lysis) 또는 버딩(budding)에 의해 숙주세포에 필수적으로 탈거하지 않을 수 있다.
전에 언급했던 것과 같이, 생성물은 바이러스 일 수 있다. "바이러스"는 "천연" 바이러스 및 "재조합" 바이러스를 포함한다. "천연"은 유전적 조작(임상분리)없이 자연으로부터 분리된 바이러스 또는 자연에서(자연적으로 나타나는) 발견되는 바이러스 또는 전형적인 재조 바이러스, 예를 들면, 예방 접종 목적에서 사용되는(약화된 바이러스)를 의미한다.
그러므로 본 발명은 산업적 규모로 쉽게 적용될 수 있는 빠르고, 효율적이며 저비용의 방법을 제공한다.
실시예
실시예 1 이온 교환 수지로부터 미세입자의 제조
물 처리용 수지 비드는 DOW에서 구입하였다. 테스트된 수지의 개요를 표 1에 나타내었다.
수지
매트릭스 기능
명칭 고분자 타입 그룹 타입 교환된 이온 용량 (eq/l)
Marathon MSC Styrene-DVB Macroporous Sulfonic acid Strong acid Cation ≥ 1.7 (Na)
Marathon A2 Styrene-DVB Gel Dimethylethanol ammonium Strong base Anion ≥ 1.2 (Cl)
Amblerlite IRC748 Styrene-DVB Macroporous Imminodiacetic acid Chelating Cation ≥ 1.25 (Na)
Amberlite IRA458 Acrylic Gel Trimethyl ammonium Strong base Anion ≥ 1.25 (Cl)
모든 수지들은 양이온 교환기(Marathon MSC, Amberlite IRC748) 및 음이온 교환기 (Marathon A2, Amberlite IRA458)에 대하여 각각 그들의 Na 또는 Cl 형으로 미리 조정되었다. 그 후에 입자들은 반복하여 탈이온수로 세척하였다(<1mS/cm 및 중성pH). 수지 작용기의 개요는 표 1에 나타내었다.
미세입자를 NETSCH 사에서 Labstar LS1 mill 또는 막자 사발을 이용하여 수동으로 습식분쇄하였다. 분쇄하여 얻은 평균 입자 크기 분포(PSD)의 개요는 표 2에 나타내었다. 입자크기는 1000x 배율의 광학현미경으로 측정하고 평균 직경은 500 - 50000 discrete projections을 계산하여 측정하였다.
수지 크기 d50 (㎛) 분포 d1-d99 (㎛)
Marathon MSC 0.9 0.4-1.9
Marathon A2 1 0.4-2.4
Amblerlite IRC748 1 0.2-4.5
Amberlite IRA458 1.4 0.4-5.1
광학 투영(optical projections)을 통한 분쇄된 입자의 형상은 정의되지 않은 것으로 간주하였다. 현탁액 농도를 원심분리로 조정하였고 탈이온수 내에서 충전층 부피로부터 측정하였다. 물의 양은 습식과 건식 수지의 무게차이로 계산하였다.
실시예 2 목적 단백질의 회수
실시예 2.1: CSPE 에 의한 목적 단백질의 회수
E. coli (HMS174) 세포를 37°C(GFPmut3.1) 및 30°C(SOD)에서 유가식(fed batch)으로 배양하였다. 재조합 단백질의 발현을 IPTG로 유도하였다. 세포를 원심분리하여 수집했다. 단백질 추출 실험을 실온에서 부분 표본(aliquots)으로 수행하였다. 초기 세포 농도 부피(습식 충전층)는 약 10% v/v이었다. 이것은50ml 현탁액을 10분동안 4000rcf 로 원심분리하여 측정하였다. 다양한 세포 및 염 농도에서의 실험을 위해, 각각의 버퍼에서 펠렛을 격렬히 혼합하여 현탁하였다. 최종적으로 세포, 입자, 버퍼 및 염 농도를50% 현탁액에 10x 저장액(stock solutions)을 첨가하고 작업량(working volume)(20ml)을 ddH2O로 희석하여 조정하였다. 실온(~23°C)에서 3시간 동안 교반 비커(혼합) 또는 튜브(정적)에서 배양하였다. 각각은 유사한 크기의 직경 비율을 가졌다. 혼합 강도를 바닥에 편리한 금속 교반기를 사용하여 800rpm으로 조정하였다. 방출된 단백질 정량을 위해서 1ml의 부분 표본을 각각의 버퍼와 1:2로 희석하였다. 샘플을 10분동안(~23°C) 8000rcf로 원심분리하고 즉시 추가적 분석을 위해 상청액을 수집하였다.
실시예 2.2 HPH 로 목적 단백질의 추출
E. coli (HMS174) 세포를 37°C(GFPmut3.1) 및 30°C(SOD)에서 유가식(fed batch)으로 배양하였다. 세포를 버퍼(50mM Tris, pH 8.0, 100mM NaCl)에서 25% v/v로 현탁하고 고압 균질기(Niro-Soave Panda 2k, 2x passes at 100MPa)로 파쇄하였다.
실시예 3 형광에 의한 목적 단백질의 정량
실시예 3.1 형광
GFPmut3.1 standard (>95%)가 이온 교환(AIEX CaptoQ), 소수성 결합 (ButylSepharose) 및 겔 여과(SuperdexG75 prep. grade) 크로마토그래피로 E. coli 균질액(60분 동안 10000rcf로 원심분리 및 0.2 미세 여과된)으로부터 연속정제(sequential purification)에 의해 제조되었다. 농도는 280nm(100°C에서 10분동안 8M Urea로 분리된)에서의 흡광도로부터 결정되었다. 등가 형광(Equivalent fluorescence)은 485nm (흥분) 및 535/20nm(방출)에서 플레이트 리더(Tecan GENios Pro)로 표준 눈금을 측정하여 결정되었다.
GFP의 회수율(% 회수)은 HPH 세포 파쇄와 비교하여 상대적으로 정량되었다(실시예 2.2에 설명된 것과 같이 100 MPa에서 2번).
실시예 3.1.1 세포 농도
분쇄된Marathon A2(MA2)에 흡착시키고 NaCl으로 용출함으로써 회수된 E. coli 세포로부터 GFP 회수율을 측정하였다. 세포를 원심분리하여 세포 배양액으로부터 분리하고 20%(v/v), 6%(v/v), 및 1%(v/v)의 부피 농도로 50 mM TRIS, pH 8.0에서 현탁하였다. 세포 현탁액을 200%, 100%, 50% 및 0%의 다양한 부피비율을 가지는 수지와 혼합하고 1시간동안 정적 배양하였다. 현탁액 일부와 2 M NaCl을 1:2로 희석하여 용출하였다. 수용액 상에서GFP를 형광으로 정량하였다. 분쇄된 Marathon MSC(MMSC)는 양이온 수지와 비교하기 위해 같은 조건에서 사용되었다.
도 2는 6%(v/v) 세포 농도에서 GFP가 100% 회수됨을 보여준다. 20% (v/v) 세포 농도에서, 추출된 단백질의 양은 50%이하로 감소하였다. 반면에, 20% (v/v) 세포 현탁액에 더 적은 양의 미세입자를 첨가한 것은 45%까지 회수되었다. 1% 에서 회수된 GFP양은 미세입자의 양과 비례하여 증가하였다. 미세입자를 첨가하지 않은 경우, 상청액에서 GFP의 양은 20% 이하였다. 단백질 추출 및 세포 파쇄의 효과는 같은 조건에서 분쇄된 Marathon MSC(양이온 교환기)로 세포 배양하여 관찰되지 않았다.
실시예 3.1.2 수지:세포 부피비
분쇄된Marathon A2(MA2)에 흡착하고 NaCl으로 용출에 의해서 다양한 수지:세포 부피 비율에서 회수된 E. coli 세포로부터 추출한GFP 회수율을 측정하였다. 세포를 원심분리하여 세포 배양액으로부터 분리하고 10%(v/v)의 부피 농도로 50 mM TRIS, pH 8.0에서 현탁하였다. 세포 현탁액을 200%, 100%, 70%, 50%, 30% 및 0%의 다양한 부피비율을 가지는 수지와 혼합하고 1시간동안 정적 배양하였다. 현탁액 일부와 2M NaCl을 1:2로 희석하여 용출하였다. 수용액 상에서GFP를 형광으로 정량하였다.
도 3 배양 1시간 후 거의 100%의 GFP가 분쇄된 Marathon A2로부터 흡착되어 회수됨을 보여준다. 전체 용해 GFP의 20% 이하가 Marathon A2없이 세포로부터 추출되었다.
실시예 3.1.3 pH 및 배양 시간
pH값 및 배양 시간에 따라, 분쇄된Marathon A2(MA2)에 흡착되고 NaCl로 용출에 의해서 회수된 E. coli 세포로부터 추출한GFP 회수율을 측정하였다. NaOH를 첨가하여 세포 현탁액의 pH를 7.5, 8.0 및 8.5로 조정하였다. 세포 현탁액을 100% 부피비를 가지는 수지와 혼합하고 3시간 동안 정적 배양하였다. 현탁액 일부와 2 M NaCl을 1:2로 희석하여 정기적(10, 60, 120, 180분)으로 용출하였다. 수용액 상에서GFP를 형광으로 정량하였다. 최대 약 3시간 배양 후, 전체 용해 GFP의 40% 및 70%가 세포배양액으로부터 pH 7.5 및 8.0에서 회수될 수 있었다. 100% 회수는 pH 8.5에서만 이루어졌다.
실시예 3.1.4 pH, 수지:세포 부피비 및 배양 시간
0-100%에서의 수지:세포 부피 비의 영향을 더 조사하였다. NaOH를 첨가하여 세포 현탁액의 pH를 7.5, 8.0 및 8.5로 조정하였다. 세포 현탁액을 100%, 70%, 50%, 30% 및 0%의 다양한 부피비의 수지:세포로 혼합하고 3시간 동안 정적 배양하였다. 현탁액 일부와 2M NaCl을 1:2로 희석하여 정기적(10, 60, 120, 180분)으로 용출하였다.
도 4는 pH가 최대 회수율에 상당한 영향을 주는 반면에, 첨가된 수지 양의 효과는 무시해도 상관없었다. 정적 배양 후, pH 8.5에서 70% 수지:세포 비(v/v)가 10%(v/v) 세포 현탁액의 파쇄 및 세포 배양액으로부터 직접 GFP 회수에 효과적인 것으로 판단되었다.
실시예 3.1.5 염 농도 및 GFP 흡착 용량
NaCl 농도(0 - 500 mM)에 따라, 분쇄된 Marathon A2(MA2)에 흡착되고 NaCl로 용출에 의해서 회수된 E. coli 세포로부터 추출한GFP 회수율을 측정하였다. 세포를 원심분리하여 세포 배양액으로부터 분리하고 10%(v/v)의 부피 농도로 50 mM TRIS, pH 8.0에서 현탁하였다. 현탁액의 NaCl 농도를2M NaCl 버퍼 용액으로 조정하였다. 세포 현탁액을 100%, 70%, 50%, 30% 및 0%의 다양한 부피비의 수지:세포로 혼합하고 1시간동안 정적 배양하였다. 현탁액 일부와 2 M NaCl을 1:2로 희석하여 용출하였다. 수용액 상에서 GFP를 형광으로 정량하였다.
도 5는 0 mM NaCl 에서 100%까지 GFP 회수가 가능함을 보여준다.
미세입자에 결합된 GFP의 양을 흡착 전과 후, 수용액 상(상청액)에서 농도별로 비교하여 조사하였다(도 6). GFP 양의 차이는 수지에 흡착되는 것으로 간주하였다. 이와 같은 경향은 standard Langmuir equation과 일치한다.
실시예3 .1.6 음이온 킬레이트 수지로 추출
단백질 추출은 또한 킬레이트 미세입자와 E. coli 세포의 배양으로 설명되었다(도 7). Marathon A2의 강염기성 4차 작용기와 대조적으로, Amberlite IRA 748로부터 자체적으로 만들어진 미세입자의 이미노디아세트산기(iminodiacetic acid groups)는 다가 양이온과 높은 친화력을 가진 양이온 교환기이다. 이 경우에 현탁액에서 어떠한 응집도 일어나지 않았다.
킬레이팅 수지(분쇄된 Amberlite IRA 748) 및 양이온 미세입자(분쇄된 Marathon A2)의 세포 현탁액(E. coli)에서 GFP 추출량이 30% 및 70% v/v 부피비의 수지:세포(5% v/v)를 50 mM TRIS, pH 8.0로 배양한 다음 1 M NaCl로 용출한 후 결정되고 동일한 조건에서 염으로 용출하지 않은 경우의 GFP 추출량과 비교하였다(도 7 a, b). 또한, 교반 및 배양 조건에 따른 GFP 추출량을 조사하였다(도 7 a, b). 단백질(GFP)이 탈착에 의해 회수된 분쇄된 MA2와 반대로 킬레이트 미세입자에는 GFP가 흡착되지 않았다. 상기 단백질 수율은 수행 규모에서 킬레이트 미세입자와의 배양동안 정적 또는 교반 조건에 의해서 영향을 받지 않는 것으로 보인다.
실시예 3.1.7 단백질 추출에서 용출 조건의 영향
킬레이팅 수지(분쇄된 Amberlite IRA 748) 및 양이온 미세입자(분쇄된 Marathon A2)로 세포 현탁액(E. coli)에서 GFP 추출량이 30%, 70% 및 100% v/v 부피비의 수지:세포(5% v/v)를 50 mM TRIS, pH 8.0로 2 시간 정적 배양한 다음 1 M NaCl로 용출한 후 측정되고 동일한 조건에서 염으로 용출하지 않은 경우의 GFP 추출량과 비교하였다. 분쇄된 Amberlite IRA 748 와 pH 8.0, 50 mM TRIS로 E. Coli 세포를 2시간 동안 배양하여 GFP추출량이 100%까지 얻어졌다(도 8). 회수된 GFP양은 킬레이트 미세입자의 부피비율이 증가함에 따라 증가하였다.
실시예 3.1.8 단백질 추출에서 세포 농도의 영향
킬레이트 수지(분쇄된 Amberlite IRA 748)로 세포 현탁액(E. coli)으로부터 단백질(GFP) 추출량을 20 %, 15 %, 10 % 및 5 %의 세포 농도에서 70% v/v 부피비의 수지:세포를 50 mM TRIS, pH 8.0로 교반 비커에서 배양한 후 염으로 용출하지 않고 측정하였다(도 9). 현탁액에서 더 높은 세포 농도는 킬레이트 미세입자를 이용한 추출량에 유리하게 영향을 미쳤다. 건조 생물량(dry biomass, d.m.)과 관련된 추출된 단백질 양에 대한 GFP 추출 속도를 측정하였다(도 10).
실시예 4 SDS Page로 목적 단백질의 정량
E. coli 균질액의 무거운 고체 파편은15분 동안 4000 rcf로 원심분리하여 분리하였다. 상청액을 옮기고 가벼운 파편을 60분 후에 수집하였다. 펠렛을 탈 이온수로 현탁하고 전과 동일한 방법으로 연속적으로 2번 세척하였다. 세포 파편과 균질액의 표준 시료를 10 M Urea, pH 8.0과 1:5로 희석하고 회전 진탕기(rotatory shaker)에서 한시간 동안 배양하였다.
모든 시료를 1:4 SDS Sample buffer 및 0,2M DTT내에서 10분 동안 100°C로 가열하였다. MES-SDS running buffer, 200V 및 최대 400Ma로 60분 동안 8-12% polyacrylamide gels에서 전기영동하였다. CoomassieR250 및 BismarkBraunR으로 염색하였다(Choi et al. 1996). 밀도측정은 광학 겔 주사(optical gel scanning)(Epson Perfection Scan V770, 600dpi, 16bit grayscale) 및 LumiAnalyst(v3.0 Roche Diagnostics) software로 평가하여 측정하였다.
실시예 4.1 SOD 추출
단백질 추출은 Amberlite IRA458에서 얻은 양이온 미세입자와 E. coli 세포를 배양하여 설명되었다. Marathon A2의 스티렌 디비닐벤젠(styrene divinylbenzene, PS/DVB) 매트릭스(matrix)와 반대로, 아크릴(acrylic) 수지에서 얻은 미세입자는 같은 충전층 부피에서 더 많은 물을 포함하였다. 응집은 아크릴 미세입자가 더 잘 일어나지만(더 큰 응집물과 더 빠른 침전) 이것을 상세히 조사하지 않았다. 또한 목적 단백질은 GFP 대신 superoxide dismutase(SOD)이다.
실시예 4.1.1 다양한 배양 조건에서 단백질량
단백질(SOD) 추출량은 50, 70 및 100% v/v의 수지:세포(10% v/v) 부피비에서 50 mM TRIS, pH 8.0로 튜브에서 정적 배양하고 NaCl 로 용출한 후 아크릴 수지(분쇄된 Amberlite IRA458)를 포함하는 세포 현탁액(E. coli)으로부터 측정하였다. 단백질량은 SDS-Page에 표준 눈금으로부터 농도를 측정함으로써 추정하였다(도 11). SOD 방출은 아크릴 수지로 1시간 정적 배양 후 거의 끝났다. 아크릴 미세입자에 흡착된 SOD는 같은 양의 0.5 M 및 1.0 M NaCl로 회수되었다.
실시예 4.1.2 E. coli 균질액으로부터 SOD 회수
10 % (v/v) 세포 현탁액으로부터 얻은 E. coli 균질액으로부터의 SOD 회수량은 Amberlite IRA 458 미세입자(100%, 70%, 50% v/v 수지:세포 부피비)로 짧은 시간 혼합하고 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)한 다음 NaCl (0.0 M, 0.5 M, 0.1 M)로 용출한 후 측정되었다. Amberlite IRA 458 미세입자에 흡착된 SOD는 0.5 M 및 1.0 M에서 용출하여 같은 양으로 회수되었다(도 12).
실시예 4.1.3 SOD 흡착 용량
미세입자에 결합된 SOD양을 조사하였다.
SOD 표준(>95%는SDS-Page의 쿠마씨 염색에 의해서 달성)는 A2 미세입자로 E. coli 세포로부터 추출하고 0.2 M NaCl를 포함하는 50mM TRIS, pH 8.0에서 70% v/v (수지/세포)에서 2시간 배양하여 탈착시킨 다음, 겔 여과(SuperdexG75 prep. grade from GE)에 의해 정제하여 제조된다. 농도는 280 nm에서의 흡광도로 측정되었다(100 °C에서 10분 동안 8 M Urea로 변성). 시료의 농도는 SDS-page에서 5 단위 눈금을 측정하여 밀도 측정을 통해서 평가된다. 추출 및 균질화에 의해 얻은 SOD 샘플의 농도는 표준 SOD 농도와 상대적으로 비교하였다.
실시예 5: 비 목적 단백질 추출
Marathon A2에 흡착되어 추출된 GFP의 순도는 균질액과 비교하여 SDS-Page에 의해 확인되었다. HPH 후에, E. coli 균질액의 무거운 고체 파편(예를 들면, GFP 봉입체 포함)은 15분 동안 4000 rcf로 원심분리하여 분리되었다. 상청액을 옮기고 가벼운 균질액 파편은 60분 동안 4000 rcf로 원심분리한 후 수집하였다. 가벼운 균질액 파편은 세포 조각 및 외부 세포막 단백질 A(OmpA)와 같은 세포막 단백질을 포함하고 세포 파쇄의 지표 역할을 한다. 펠렛을 탈 이온수로 현탁하였고 동일한 방법으로 2번 세척하였다. 세포 조각 및 균질액의 표준 시료는 10 M urea, pH 8.0와 1:5로 희석하였고 한시간 동안 회전 진탕기(rotatory shaker)로 배양하였다. 세포 균질액, 균질 상청액 및 50% v/v 분쇄된 Marathon A2와 50mM TRIS, pH8.0를 포함하는 세포를 3시간 배양하여 추출한 용출된 단백질에 SDS-Page를 수행하였다. 현탁액의 일부를 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 및 1000 mM NaCl와 1:2로 희석하여 용출하였다. 모든 시료에 대해 같은 희석율로 SDS-Page를 수행하였고 쿠마씨 염색의 농도계는 단백질 양을 측정하는데 사용하였다. 세척된 세포 조각은 ~39 kDa(OMP)에서 주요 막 단백질에 대한 표준으로써 적용될 수 있다.
300 mM NaCl 탈착 조건내에서, 천연 균질액과 비교하여 단 15% 및 17%의 비목적 단백질만이 추출 후 발견되었다. 같은 조건에서 가벼윤 균질액 파편에서 6% 및 12%의 단백질이 각각 상청액에서 발견되었다.
또한, 균질 상청액 및 용출된 단백질을 70% v/v 분쇄된 Amberlite IRC 748 및 분쇄된 Marathon A2와 50 mM TRIS, pH 8.0를 포함하는 세포를 2시간 동안 혼합 및 정적 조건에서 배양한 후, 각각 비교하였다. 상청액 일부를 50 mM TRIS buffer 또는 1 M NaCl와 1:2로 희석하였다. 모든 시료에 대해 같은 희석율로 SDS-Page를 수행하였고 쿠마씨 염색의 농도계는 단백질 양을 측정하는 데 사용하였다.
GFP 회수량을 SDS-Page(쿠마씨)의 농도계로 측정하였고 용출돈 숙주세포 단백질, 특히 세포막 단백질과 비교하였다(도 13, 14, 15). 50% v/v 분쇄된 Marathon A2와 50 mM TRIS, pH 8.0를 포함하는 세포를 3시간 동안 배양한 후 추출된 단백질들을 비교하였다. 상청액의 일부를 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 및 1000mM NaCl에서 1:2로 희석하여 용출하였다. 모든 시료에 대해 같은 희석율로 SDS-Page를 수행하였고 쿠마씨 염색의 농도계는 단백질 양을 측정하는데 사용하였다(도 13). 300 mM NaCl 의 상청액에서 Marathon A2로부터 거의 100%의 GFP가 회수되었다. 더 높은 염 농도에서의 탈착은 더 많은 양의 비목적 단백질 및 가벼운 파편 단백질의 회수를 야기한다(도 14). 고압 균질기에 의한 상청액에서 추출된 것과 비교하여 평균 15%의 가벼운 파편 단백질 및 20%의 비목적 단백질이 각각 미세입자를 포함하는 세포로부터 추출되었다.
쿠마씨 염색법에 의해 발견된 단백질의 프로파일은 HPH 및 미세입자 용출에 의하여 파쇄된 세포의 상청액간의 순도 차이를 보여준다. 균질 상청액 및50% v/v 분쇄된 Marathon A2와 50mM TRIS, pH 8.0를 포함하는 세포를 3시간 배양한 후 300 mM NaCl로 용출한 단백질의 프로파일을 도 15에 나타내었다. 모든 시료에 대해 같은 희석율로 SDS-Page를 수행하였고 쿠마씨 염색의 농도계는 단백질 양을 측정하는데 사용하였다. GFP의 상대적 순도는 균질액에서 9.8%이고 300 mM NaCl 용출 단백질에서 37.4% 이었고 추출 후 평균 33.2% ± 2.9%이었다.
다른 방법으로, 균질 상청액 및 추출된 단백질의 단백질 프로파일을 70% 분쇄된 Amberlite 748과 50 mM TRIS, pH 8.0를 포함하는 세포를 2시간동안 배양한 후 측정하였다. 모든 시료에 대해 같은 희석율로 SDS-Page를 수행하였고 쿠마씨 염색의 농도계는 단백질 양을 측정하는데 사용하였다. GFP의 상대적 순도는 균질액에서 12.4%이고 상청액에서 38.4% 이었고 추출 후 평균 41.6% ± 2.7%이었다.
50 mM TRIS, pH 8.0(10% v/v)에서 정적 배양한 다음 NaCl로 용출 한 후, 양이온성 수지(Marathon A2)로 세포 현탁액(E. coli)으로부터 단백질(SOD) 추출 동안 비 목적 단백질의 감소를 측정하였다. 비 목적 단백질량을 SDS-Page의 농도계로부터 측정하였다. 세포로부터 추출된 SOD의 순도는 스티렌 미세입자에 의핸 균질액으로부터 수집된 것보다 두배 더 높았다.
실시예 6: SOD 활성
스티렌 양이온성 미세입자 Marathon A2 (MA2)에 의해 세포로부터 추출된 SOD의 효소 활성을 70% v/v 부피비의 수지:세포(10% v/v)를 50 mM TRIS, pH 8.0에서 정적 배양한 다음 0.5 M NaCl 로 용출한 후 세포 현탁액(E. coli) 또는 균질액으로부터 추출하여 측정하였다. 상청액을 원심분리하고(1 ml, 30 min, 23 °C 및 16000 rcf), 여과하고(PVDF membrane, 0.2 ㎛) 그리고 유효 측정 범위에서 각각의 버퍼와 1:10으로 희석하였다. SOD 활성을 Sigma 에서 구입한19160 SOD 측정 키트로 측정하였다. MA2 미세입자에 의해 세포로부터추출된 SOD의 효소 활성은 균질액으로부터 수집한 것보다 1 unit까지 평균적으로 증가하였다.
실시예 7: 오염물질
DNA는 Invitrogen 로부터 구입한 Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit 로 정량하였다. 엔도톡신(Endotoxin)은 Lonza 로부터 구입한 PyroGene™ Recombinant Factor C Assay 로 정량하였다. 모든 상청액 시료를 원심분리하고(1 ml, 30 min, 23 °C 및16000 rcf), 여과하고(PVDF membrane, 0.2 ㎛) 그리고 유효 측정 범위에서 각각의 버퍼와 1:10으로 희석하였다. 측정은 플레이트 리더(Tecan의 GENios Pro 또는 Infinite 200M)로 각각의 키트 설명서에 따라서 수행되었다.
실시예 7.1 dsDNA
dsDNA 감소는 50, 70, 100% v/v 부피비의 수지:세포(10% v/v)를 50 mM TRIS, pH 8.0에서 정적 배양한 다음 NaCl 로 용출한 후, 아크릴(Amberlite IRA458) 및 양이온성 수지(MarathonA2)로 세포 현탁액(E. coli)으로부터 단백질(SOD)을 추출하는 동안 측정하였다. DNA는 상기 설명한 것과 같이 정량하였다. 최대102 이하의 dsDNA가 미세입자와 세포를 배양함으로써 방출되었다. 단백질 용출 조건(0.5 M NaCl)에서, 상청액의 dsDNA 감소는 102 내지 103 이었다(도 16).
실시예 7.2 엔도톡신( Endotoxin )
엔도톡신 감소는 50 mM TRIS, pH 8.0에서 정적 배양한 다음 NaCl 로 용출한 후, 양이온성 수지(MarathonA2)로 세포 현탁액(E. coli)으로부터 단백질(SOD)을 추출하는 동안 측정하였다. 엔도톡신 양은 상기 설명과 같이 정량하였다.
추출 조건에서 균질액으로부터 흡착된 것과 비교하여 103 이하의 엔도톡신이 상청액으로 방출되었다(도 17). 0.5 M NaCl 및 1.0 M NaCl에서 엔도톡신은 약 10배 감소하였다.
실시예 8: 현미경의 사용(Microscopy)
실시예 8.1: 원자력 현미경(Atomic force microscopy, AFM )
양으로 하전된 현미경 슬라이드에 수크로스(sucrose) 용액(50mM), 탈 이온 수 및 희석된 미세입자 현탁액을 연속적으로 처리하였다. 각 단계 후, 24시간 동안 65°C에서 건조시켰다. 측정은 나노바이오기술학과(Department of Nanobiotechnology, BOKU (Dr. Gerhard Sekhot))에서 수행하였다.
오픈 소스 소프트웨어(open source software) Gwyddion (v2.60)가 AFM 데이터를 영상화 하는데 사용되었다. 엣지면 지형(edged surface topography)은 비드의 기계적 마모 결과로 분명히 생성된다. 분쇄된 입자는 유사한 표면 지형을 가졌다(도 18).
분쇄된 Marathon A2로 배양 전과 후, E. coli 의 AFM (도. 19) 이미지는 단백질이 세포의 조각화 없이 추출됨을 나타내었다.
실시예 8.2: 광학 현미경(Optical microscopy)
공 초점 형광 현미경(Confocal and fluorescence microscopy) 관찰을 Vienna Institute of Biotechnology (VIBT)에서 Leica "Live Cell" wide-field microscope로 수행하였다. 시료를 각각의 버퍼로 ~1% v/v 고형 농도로 희석하고 1000배 배율(Leica HCX PL APO 100x 1.4 oil)로 영상화 하였다.
명시(Bright field, BF), 미분 간섭 대비(differential interference contrasts, DIC) 및 형광 현미경 관찰을 1000배 배율로 수행하였다. 세포는 GFP의 기본 흥분(excitation) 및 방출(emission) 파장에서 이동하고 밝은 형광을 나타내었다. 세포는 미세입자에 흡착되어 고정되었다(도 20).
실시예 9: 세포 생존도(Cell viability)
실시예 9.1: BacLite
Marathon A2 미세입자(70% 부피비의 수지:세포)로 2시간 정적 배양(50 mM TRIS, pH 8.0)하고 생리 버퍼에서 1:10 로 희석한 후 E. coli 세포(10% v/v)의 생존 판별. 세포를 "BacLite" (Invitrogen)으로 염색하였다. 생존(green)세포와 죽은(red)세포를 도 21에 나타내었다.
실시예 9.2: Koch's plates
분쇄된 Marathon A2 및 Amberlite IRA 458 (70% v/v 부피비의 수지:세포)에서 얻은 미세입자를 포함하는 E. coli 세포(10% v/v)를 50 mM TRIS, pH 8.0에서 3시간 정적배양한 후 세포 생존 여부를 확인하였다. 세포(E. coli GFP) 및 세포/수지 현탁액(1ml aliquots)을 계속 희석하고 멸균 0.9% w/w NaCl 에서 1:10으로 격렬히 혼합하였다. ddH2O내에서 20 g/l 미생물 머크(microbiology Merck) 영양 배지(Nutrient agar, NA)를 증기 오토클레이브(steam autoclave)에서 15분 동안 121 °C로 가열하였다. 희석된 현탁액의 일부(1ml)를 배양 접시(culture dishes)에 붓고 55°C NA 용액과 혼합하였다. 실온에서 30분 후 완전히 겔이 되었고 접시(plates)를 추가적으로 37 °C 에서 30분동안 배양하였다.
양이온성 미세입자로 배양한 후 최대 103 이상 집락 형성 단위(colony forming units, CFU)까지 측정하였다. 생리 버퍼로 1000배 희석 후 미세입자에 대한 적절한 CFU 값을 얻었고 이것은 흡착된 세포는 고정되어 있음을 나타내었다.
세포의 특성은 양이온성 미세입자로 GFP 추출 후 세포 및 수지를 1000배 희석없이 10배 희석한 세포를 광학 현미경으로 측정하였다. 크기, 형상 및 형광은 E. coli GFP에 대응한다.
실시예 10 소수성 미세입자
소수성 미세입자의 제조
DOW에 의해 제공된 흡착형 수지: Amberlite XAD4, Amberlite XAD7HP 및 Amberlite XAD761는 Sigma Aldrich(Vienna, Austria, 2011)로부터 구입하였다. 수지를 전기모터로 구동하는 세라믹 막자사발로 오버나이트(20 g로 ~12 시간 동안) 분쇄하였다. 분쇄된 수지를 물에서 현탁하였다(~10% v/v 및 ad. 50ml). 상청액을 30분 동안 4000x g(상대 원심력과 평형)로 원심분리하였다. 수지를1분동안(4000x g)원심분리 된 2M NaCl(50 ml)에서 재현탁하였다. 1분 원심분리한 펠렛을 제거하였다. 상청액을 옮기고 30분동안(4000x g) 다시 원심분리하였다. 상청액을 제거하였다. 분쇄된 수지를 물에서(1:2) 재현탁하고 튜브로 옮겼다. 수지를 4000x g에서 원심분리하고, 상청액은 베거하고 수지는 50 ml 수용성 세척액에서 재현탁하였다.
세척 조건은:
1x 50% EtOH (유기 잔유물 희석)
3x deionized water (EtOH 희석)
소수성 미세입자의 입자 크기
미세입자의 크기 분포는 1% v/v 및 600x배 배율에서 약 500입자의 명시야 현미경 예측(bright field microscopy projections) 측정에 의한 평균 구 직경으로부터 계산하였다.
미세입자 및 통상적인 크로마토그래피 배지 흡착/탈착을 위한 일반적인 프로토콜(protocol)
흡착 및 탈착 연구를 1 mL 배치(균질액 또는 표준 단백질 용액)에서 수행하였다. 다양한 양의 50%(v/v) 미세입자 현탁액(㎕)을 2 mL 튜브내의 단백질 용액에 첨가하였다. 단백질 농도와 전도도에 대한 희석 인자를 고려하였다.
미세입자 현탁액은 30분 동안 배양하고 통상의 크로마토그래피 배지 현탁액은 12시간 동안 배양했다. 그 후에 미세입자 또는 통상의 크로마토그래피 배지를 10분 동안 7000x g로 원심분리하였고 결합된 단백질 용출은 1 mL 용출 버퍼를 추가하여 잘 혼합하고 30분동안 배양하여 수행하였다. 일부 경우에, 용출 버퍼를 사용한 두번째 세척 단계가 포함될 수 있다. 미세입자 또는 통상의 크로마토그래피 배지를 용출한 후에 다시 전과 같이 원심분리하였다. 상청액에서 단백질의 농도는 광도 분석(photometric analysis)으로 정량 하였고 목적 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 확인하였다.
실시예 11 산성 생체분자의 회수
E. coli 균질액으로부터 재조합 GFP의 배치 흡착은 다음 단계로 미세입자(MPs) (분쇄된 크로마토그래피 수지 MARATHON A2 (MA2))를 사용하여 수행하였다. 이 실시예는 산성 세포 용해 단백질로써 GFP를 사용하였다.
E. coli 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)는 5L 규모의 유가식 공정(fed-batch process)으로 발효되었다. 세포내 용해 목적 단백질 GFP(green fluorescent protein)의 발현을 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
수확 및 균질화: E. coli 현탁액(바이오매스 함량(biomass content) ~30%wt)을 4 °C로 냉각시키고 20분동안 15000 g로 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포 펠렛은 추가로 처리하였다. 세포 펠렛을 50 mM Tris, pH 7.5로 재현탁하고 바이오매스 함량 20%wt cells/buffer로 희석하였다. 천연 세포 용해액을 제조하는 두 경로를 위해 세포를1000 bar의 고압 균질기로 파쇄하였다.
E. coli 용해액으로부터 배치 흡착을 위해 냉동 바이오매스를 사용하는 것도 가능하다. 이 경우에 바이오매스(20% w/v)는 50 mM Tris, pH 7.5에서 재현탁하고 천연발효된 E. coli 세포에서와 같이 동일한 파쇄 공정이 적용될 수 있다.
목적 단백질의 수집
배치 흡착을 실온에서 100ml의 유리 비커의 규모에서뿐만 아니라 1ml 부피의 작은 규모의 튜브에서도 수행하였다. 천연 세포 용해액에 MA2를 추가하고(1 ㎍ 세포 펠렛당 1.2 ㎕의 50% v/v MA2가 추가됨) 실험실 와동(lab vortex)으로 5초동안 혼합하거나 30초동안 더 큰 규모의 교반기(overhead stirrer)로 혼합하였다. 혼합되는 동안 응집이 일어나고 MA2가 DNA, hcps(숙주 세포 단백질) 및 세포 파편과 같은 불순물뿐만 아니라 목적 단백질에 결합하였다. 응집 후에 상기 시료를 3분 동안 13400 g에서 원심분리하거나 전량 여과(dead-end filtration) 방식에서 오버헤드 압력(overhead pressure) 1.5 bar로 0.2 ㎛ 필터 플레이트(filter plate)를 사용하여 여과하였다. 상청액을 제거하고 펠렛/필터 케이크(filter cake)는 세척 단계를 더 처리하였다.
응집물 세척
응집물의 펠렛을 75 mM NaCl이 포함된 50 mM Tris 세척 버퍼, pH 7.5로 재현탁하였다. 짧은 시간 배양 후 응집물을 원심분리하여 분리하였다(3분 동안 13400 g). 여과 과정을 거쳐 분리가 일어날 때, 필터 케이크(filter cake)를 재현탁 하지 않고 필터 케이크를 통해 세척 버퍼를 여과시킴으로써 세척하였다(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트). 상청액을 제거하고 펠렛/필터 케이크는 용출 단계를 더 수행하였다. 낮은 염 농도는 낮은 결합력을 가지는 불순물을 용출할 수 있다.
용출 단계에서 세척된 응집물을 400 mM NaCl를 포함하는 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5에서 재현탁하였다. 응집물을 텀블러에서 5분동안 혼합하였다. 400 mM NaCl 에서 목적 단백질은 MPs 로부터 용출되고 상청액에 존재한다. 상청액은 원심분리(13400 g로 3분 동안) 또는 전량 여과(dead-end filtration)(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트)를 사용하여 응집물로부터 분리하였다. 불순물이 결합된 MPs 를 포함하는 펠렛/필터 케이크를 제거하고 목적 단백질(GFP)을 포함하는 상청액은 더 처리하였다.
GFP의 용출 프로파일을 도 22에 나타내었다. 정제 공정에서 시작 물질인 용해액 시료는 1번 레인에서 볼 수 있다. 2번 레인은 마커(Mark12TM)이다. 3번 레인은 수집 후의 상청액을 보여준다. 누락된 GFP 밴드는 모든 GFP 분자가 MPs에 결합되었음을 보여준다. 4번 레인는 세척단계이다. 용출은 100 - 400 mM NaCl 사이에서 일어난다. 용출 시료의 풀링(Pooling)은 GFP에 대하여 98% 수율 및 약 60% 순도 레인을 제공하였다.
실시예 12 양으로 하전된 미세입자를 사용한 염기성 생체분자의 회수
이 실시예는 분쇄된 MARATHON A2(MA2) 수지의 MPs를 사용한 세포 균질액으로부터 발현된 재조합 염기성 단백질의 회수를 설명한다. 단백질 인터페론 감마(protein Interferon Gamma, IFN-γ)는 예를 들면 세포 용해성 발현 염기성 단밸질(intracellular soluble expressed basic protein)과 같은 기능을 한다. 이 실시예는 양으로 하전된 교환 수지가 불필요한 세포 구조 및 세포 물질에 결합함으로써 생체분자 회수에 사용될 수 있음을 보여준다(음성적 정제(negative purification)를 지칭함).
IFN-γ는 유기식 발효에 의해서 E. coli 세포 내 용해되어 발현되었다.
수확 및 균질화
인터페론 감마 IFN-γ를 발현하는 냉동 바이오매스(20% w/v) 세포를 사용하여 용해 버퍼(20 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M Urea, 0.1 % beta-mercaptoethanol)에서 재현탁하였다. 조 세포 용해액을 생산하는 세가지 경로를 위해 950bar에서 고압 균질기로 세포를 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄는 새로운 바이오매스와도 수행하였다.
목적 단백질의 음성적 정제(Negative Purification)
배치 흡착을 실온에서 2 ml 작은 규모의 튜브에서 수행하였다. 조 세포 용해액을 MA2와 혼합하고 ~5초 동안 실험실 볼텍스로 혼합하였다(습식 세포 펠렛1 ㎍당 0.84㎕의 50% v/v Marathon A2). 혼합하는 동안 MA2가 음으로 하전된 DNA, hcps (숙주 세포 단백질) 및 세포 파편과 같은 불순물에 결합하는 응집이 일어난다. 응집 후에 상기 시료를 3분 동안 13400 g에서 원심분리하거나 전량 여과(dead-end filtration) 방식에서 오버헤드 압력(overhead pressure) 1.5 bar로 0.2 ㎛ 필터 플레이트(filter plate)를 사용하여 여과하였다. 분순물이 결합된 MPs를 포함하는 펠렛/필터 케이크(filter cake)는 제거하고 목적 단백질(IFN-γ)을 포함하는 상청액은 더 처리하였다.
인터페론 감자 IFN-γ의 용출 프로파일을 도 23에 나타내었다. 1번 레인은 Mark12TM마커이고 2-4번 레인은 정량 목적의 BSA이다. 3번 레인은 세포 균질액이다. 6번 레인은 HCPs DNA 및 세포 파편과 결합한 양으로 하전된 미세입자가 첨가된 상청액 시료이다. 7번 레인은 불순물을 용출시키기 위해 1000 mM NaCl로 세척 및 스트립(strip)한 예시적인 펠릿을 보여준다. 수율은 30% 순도로 99%까지이다.
실시예 13 양으로 하전된 미세입자를 사용한 E. coli 세포로부터 산성 생체분자의 회수
이 실시예는 MA2로부터 제조된 양으로 하전된 MPs를 사용하여 E. coli 세포로부터 산성 세포 용해성 단백질(acidic intracellular soluble protein)의 추출을 보여준다. 이 실시예에서 사용된 목적 단백질은 GFP이다. 상기 단백질 추출은 GFP분자, GFPmut3.1 및 GFP.1을 각각 가진 두가지 다른 E. Coli 균주, HMS174(DE3) 및 BL21을 사용하여 보여주었다. 두가지 다른 방법으로 단백질 추출을 수행하였다.
실시예 13.1
E. coli 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1) 및 BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1) 을 5 L 규모 유가식 공정(fed-batch process)에서 발효시켰다. 세포 용해 목적 단백질 GFP(green fluorescent protein)의 발현을 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
세포 수확 및 세척
세포를 수확하고 Flexboy® Bags에서 밤새(~12 시간) 4 °C로 보관하였다. E. coli 상청액(바이오매스 함량 ~30%wt)을 4 °C로 냉각시키고 15000 g로 20분 동안 원심분리한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5으로 동일한 바이오매스 함량을 가지도록 재현탁하였다.
세포 응집 및 단백질 회수
실시예 13.1는 E. coli 세포에 결합시키고 응집시키기 위해 감소된 양의 MPs(30% 습식 바이오매스 함량에서 1 mL 세포 현탁액 당 85 ㎕ MA2(50% v/v))를 사용한다. 상기 MPs가 세포와 결합하는 동안 추출이 일어나고 목적 단백질(GFP)이 방출되어 상청액에 축적되었다. 2-3 시간 배양 후, 추출이 완료되었고 응집된 세포를 전량 여과방식(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트) 또는 원심분리(13000 g로 3 분 동안)을 통해서 분리하였다. 세포 펠렛/필터 케이크를 제거하고 목적 단백질을 포함하는 상청액을 더 처리하였다.
실시예 13.2
이 실시예에서 더 많은 입세입자가 세포 현탁액에 첨가되었다. 더 많은 양의 미세입자가 직접 목적 단백질에 결합하여 추출되도록 하였다.
E. coli 균주 HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1) 및 BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1) 을 5 L 규모 유가식 공정(fed-batch process)에서 발효시켰다. 세포 용해 목적 단백질 GFP(green fluorescent protein)의 발현을 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 유도하였다.
세포 수확 및 세척
세포를 수확하고 Flexboy® Bags에서 밤새(~12 시간) 4 °C로 보관하였다. E. coli 상청액(바이오매스 함량 ~30%wt)을 4 °C로 냉각시키고 15000 g로 20분 동안 원심분리한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5으로 동일한 바이오매스 함량을 가지도록 재현탁하였다.
세포 응집 및 단백질 회수
실시예 13.2는 E. coli 세포에 결합하여 응집되도록 실시예 13.1과 비교하여 더 많은 양의 미세입자(30% 습식 바이오매스 함량에서 1ml 세포 현탁액 당 350 ㎕ MA2 (50 % v/v))를 사용한다. 상기 미세입자가 세포에 결합하는 동안, 목적 단백질의 추출이 일어났고 상기 단백질은 MPs에 직접 결합되었다. 1.5 내지 2.5 시간 배양 후, 추출이 완료되었다. 상청액을 전량 여과방식(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트) 또는 원심분리(13000 g로 3분 동안)을 사용하여 분리하였다. 생층액을 제거하고 목적 단백질을 포함하는 응집물 펠렛을 더 처리하였다.
응집물 세척
응집물의 펠렛을75 mM NaCl 를 포함하는 50 mM Tris 세척 버퍼, pH 7.5에서 재현탁하였다. 짧은 시간 배양 후, 응집물을 원심분리(13400 g로 3분 동안)하여 분리하였다. 분리가 여가 공정을 통해 일어날 때, 필터 케이크는 재현탁하지 않고 필터 케이크(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트)에 세척 버퍼를 여과시킴으로써 세척하였다. 상청액을 제거하고 펠렛/필터 케이크는 용출 단계를 더 진행하였다. 낮은 염 농도는 낮은 결합력을 가진 불순물을 용출할 수 있다.
용출
용출 단계동안, 세척된 응집물을400 mM NaCl 을 포함하는 50 mM Tris, pH 7.5에서 재현탁하였다. 응집물을 5분동안 텀블러에서 혼합하였다. 400 mM NaCl 농도에서 목적 단백질은 MPs로부터 용출되어 상청액에 존재한다. 상청액을 원심분리(13400 g로 3분 동안) 또는 전량 여과 방식(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트)을 사용하여 응집물로부터 분리하였다. 불순물이 결합한 MPs를 포함하는 펠렛/필터 케이크를 제거하고 목적 단백질(GFP)를 포함한느 상청액을 더 처리하였다.
도 24는 다른 배양 시간: 1시간 및 2시간 동안 실시예 13.2로부터의 GFP수율을 보여주는 막대 그래프이다. 1 은 수집 상청액에서의GFP 양을 보여준다. 2는 응집물의 세척 단계에서 세척 버퍼내 GFP의 양을 보여준다. 1 또는 2에서는 어떠한 GFP 누락은 없다. 3은 GFP가 MPs로부터 용출되고 상청액에 축적되는 50 mM Tris에서 400 mM NaCl에 의한 용출을 보여준다. 4는 화학적 파쇄 방법을 사용하여 용해된 세포에서의 최대 GFP 양을 보여준다.
실시예 14 양으로 하전된 미세입자를 사용한 세포로부터 염기성 단백질의 회수
양으로 하전된 미세입자는 실시예 1에 설명된 것과 같이 미세입자를 얻기 위하여 Dowex M-A2 음이온 교환 수지를 분쇄하여 제조하였다.
IFN-γ는 유가식 발효에 의해서 E. coli 세포 내에 용해되어 발현되었다.
세포 수확 및 세척
세포를 수확하고 Flexboy® Bags에서 밤새(~12 시간) 4 °C로 보관하였다. E. coli 상청액(바이오매스 함량 ~30%wt)을 4 °C로 냉각시키고 15000g로 20분 동안 원심분리한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5으로 동일한 바이오매스 함량을 가지도록 재현탁하였다.
세포 응집 및 단백질 회수
1mL 세포 현탁액(30% 습식 바이오매스 함량)당 MPs (85 ㎕ MA2 (50 % v/v)가 E. coli 세포에 결합하여 응집시키기 위하여 세포 현탁액에 첨가되었다. MPs가 세포에 접촉하는 동안, 추출이 일어나고 목적 단백질 (IFN-γ)이 방출되어 상청액에 축적되었다. 2-3 시간 배양 후, 추출이 완료되었고 응집된 세포를 전량 여과방식(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트) 또는 원심분리(13000 g로 3분 동안)을 사용하여 분리하였다. 세포 펠렛/ 필터 케이크를 제거하고 목적 단백질을 포함하는 상청액은 더 처리하였다.
실시예 15 음으로 하전된 , 킬레이트 미세입자를 사용한 세포로부터 염기성 단백질의 회수
미세입자는 킬레이트 양이온 교환 수지 Amberlite IRC748에 의해 제조되었다.
IFN-γ는 유가식 발효에 의해서 E. coli 세포 내에 용해되어 발현되었다.
세포 수확 및 세척
세포를 수확하고 Flexboy® Bags에서 밤새(~12 시간) 4 °C로 보관하였다. E. coli 상청액(바이오매스 함량 ~30%wt)을 4 °C로 냉각시키고 15000 g로 20분 동안 원심분리한 후, 50 mM Tris 버퍼, pH 7.5으로 동일한 바이오매스 함량을 가지도록 재현탁하였다.
세포 응집 및 단백질 회수
1mL 세포 현탁액(30% 습식 바이오매스 함량)당 MPs (85 ㎕ MA2 (50 % v/v)가 E. coli 세포에 결합하여 응집시키기 위하여 세포 현탁액에 첨가되었다. MPs가 세포에 접촉하는 동안, 추출이 일어나고 목적 단백질 (IFN-γ)이 방출되어 상청액에 축적되었다. 2-3 시간 배양 후, 추출이 완료되었고 응집된 세포를 전량 여과방식(1.5 bar에서 0.2 ㎛ 필터 플레이트) 또는 원심분리(13000 g로 3분 동안)을 사용하여 분리하였다. 세포 펠렛/ 필터 케이크를 제거하고 목적 단백질을 포함하는 상청액은 더 처리하였다.
실시예 16 이온 교환 수지로부터 미세입자의 제조
다른 형태의 이온 교환 수지를 Sigma Aldrich 및 DIAION으로부터 구매하였다.
다음의 음이온 교환 수지가 사용되었다: Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-743, Dowex 1X2-100, Dowex 1X2 -400, Dowex 1X8-100, Marathon A2, DIAION SA20A, DIAION SA10A, DIAION SA312.
다음의 양이온 교환 수지가 사용되었다: Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, Marathon C, Marathon MSC, DIAION PK216, DIAION SK110.
수지는 약 30분 동안 세라믹 막자사발로 손으로 습식 분쇄(30분 동안 20 g)되었다. 분쇄된 수지를 물(50 ml)에서 현탁하였다. 약 96시간 후에 수지 침전물의 상청액을 튜브로 옮겼다. 튜브당 약 200 ㎕ 수지가 모일 때까지7000 rcf(상대 원심력)으로 15분 동안 1 ml 로 구분하여 상청액을 원심분리하였다. 2 M NaCl(1.5 ml)에서 1분 동안 원심분리(7000 rcf)하여 수지를 재현탁하였다. 1분 동안 원심분리 후 펠렛을 제거하였다(Amberlite IRA-743 제외). 상청액은 옮겨서 15분 동안 다시 원심분리하였다(7000 rcf). 15분 동안 원심분리한 상청액을 제거하였다. 미세입자(약 200 ㎕)를 2 M NaCl에서 원심분리하였다. 미세입자(약 150 ㎕) 및 다른 분쇄된 수지(50 - 200 ㎕)는 물과 1:4 비율로 재현탁하였고 수지를 튜브에 50 ㎕씩 옮겼다.
수지의 일부를7000 rcf로 원심분리하고 상청액은 제거하고 수지는 20배 부피(약 1 ml)의 수용성 세척용액으로 재현탁하였다. 용액에서 배양시간은 30분이었다.
세척 조건:
- 1x 50% EtOH (유기 잔유물의 희석)
- 3x deionized water (EtOH의 희석)
- 중성 pH에 근접하도록 확인
- 탁이온 수(약 70%v/v)로 미세입자 및 분쇄된 수지의 재현탁
- 특정 실험에 사용되는 알맞은 버퍼로 수지를 평형화시켰다.
광학 현미경을 통한 입자 크기 결정
제조된 미세입자의 입자크기는 소프트웨어 기반의 크기 결정을 사용하는 광학 현미경에 의해서 결정되었다. 분쇄된 물질 및 미세입자의 입자 크기는 상대적 직경 측정에 의해 1000배 배율에서 측정되었다. 크기 분포는 1% v/v에서 1000-5000 입자의 직경을 비교함으로써 계산되었다. 결과를 표 3에 나타내었다.
음이온 교환기 타입 리간드 d (mm) q BSA
Amberlite IRA-400 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.3-1.2 0.3±0.11
Amberlite IRA-743 Methylglucamine 0.5-0.7 6.1±0.25
Dowex 1X2-100 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.1-0.5 0.5±0.18
Dowex 1X2 -400 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.04-0.07 0.8±0.01
Dowex 1X8-100 -N+-(CH3)3 (Type1) 0.1-0.5 0.4±0.03
Marathon A2 -N+-(CH2-CH2OH)-(CH3)2 (Type2) 0.4-0.6 0.2±0.02
DIAION SA20A Dimethylethanolamine 0.3 - 1.18 n.a.
DIAION SA10A Trimethylamine 0.3 - 1.18 n.a.
DIAION SA312 Trimethylamine 0.3 - 1.18 n.a.
양이온 교환기 타입 리간드 d (mm)
Dowex 50 WX2-100 -SO3 - n.a. n.a.
Dowex 50 WX8-100 -SO3 - n.a. n.a.
Marathon C -SO3 - 1.2 n.a.
Marathon MSC -SO3 - 1.2 n.a.
DIAION PK216 Sulphonic 0.3 - 1.18 n.a.
DIAION SK110 Sulphonic 0.3 - 1.18 n.a.

Claims (18)

  1. 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음이온으로 하전된 미세입자를 포함하는, 생체분자 회수에 이용하기 위한 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생체분자는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드인 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자는 응집물(flocs)을 형성하는 것을 특징으로 하는, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  4. 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음이온으로 하전된 미세입자를 포함하는, 세포 파쇄에 이용하기 위한 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지는 폴리스티렌계(polystyrene-based), 하이드록시에틸 메타크릴레이트계(Hydroxyethyl methacrylate(HEMA)-based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(DMAEMA)-based), 디메틸아미노 에틸메타크릴레이트계(dimethylamino ethylmethacrylate(pDMAEMA) -based), 폴리아크릴아마이드계(polyacrylamide-based), 메타크릴산계(methacrylic acid(MAA)-based)인 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지 및 음이온 교환 수지는 디비닐벤젠계(divinylbenzene-based)와 교차결합된 폴리스티렌(polystyrene)인 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세입자는 평균 입자의 크기가 약 5 ㎛ 이하인 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양으로 하전된 미세입자 또는 음으로 하전된 미세입자는 고분자 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 분쇄하여 얻을 수 있는 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지는 Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-485, Dowex 1X2-100, Dowex 1-8-100, Marathon A2 또는 DIAION SA 20A인 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환수지는 Amberlite IRC-748, Dowex 50 WX2-100, Dowex 50 WX8-100, Marathon MSC 또는 DIAION SK 110인 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포인 것인, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자의 용도.
  12. 하기 단계를 포함하는, 생물학적 유체로부터 생체분자를 수득하는 방법:
    a) 생물학적 유체에 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항으로 정의된 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자를 첨가하고, 그리고 생물학적 유체로부터 생체분자를 수득하는 단계.
  13. 제 12항에 있어서, 하기 단계를 더 포함하는 생물학적 유체로부터 생체분자를 수득하는 방법:
    b) 상기 미세입자가 응집물(flocs)을 형성하도록 하고,
    c) 생물학적 유체로부터 상기 응집물(flocs)을 제거하고, 그리고
    d) 생물학적 유체로부터 생체분자를 탈착하는 단계.
  14. 세포 상청액에 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자를 첨가하는 단계를 포함하는 세포 파쇄 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 세포로부터 생체분자를 방출하는 단계를 더 포함하는 세포 파쇄 방법.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 생체분자는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드인 것인, 세포 파쇄 방법.
  17. 분쇄된 고분자 음이온 교환 수지를 포함하는 양으로 하전된 미세입자, 및 분쇄된 고분자 양이온 교환 수지를 포함하는 음이온으로 하전된 미세입자를 포함하는, 양으로 하전된 미세입자 및/또는 음으로 하전된 미세입자를 포함하는 생물학적 유체.
  18. 제 17항에 있어서, 응집물(flocs)을 더 포함하는 생물학적 유체.

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