CN109402112A - 一种快速、低成本从鸡血中分离pcr模板的方法 - Google Patents

一种快速、低成本从鸡血中分离pcr模板的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板的方法，步骤是：A、从血样中分离血细胞核：向1.5mL EP管中加入新鲜、冷冻的抗凝鸡血样品，4000rpm离心1分钟去上清；向管中加入500μl灭菌水，静置1分钟，9500rpm离心3分钟，弃上清；B、裂解细胞核：使用剪去枪头尖部的枪头向沉淀中加入200μl灭菌水摇匀的3－4％螯合型离子交换树脂溶液，混匀后，55－57℃水浴30分钟，再放入干热仪，100℃加热8分钟；C、PCR模板分离：9500rpm离心2分钟，取上清作为PCR模板。该法所获取的PCR模板与现有的传统DNA提取方法获得模板在用于PCR技术检测具有同等功效，操作上更加简单易行、耗时短(1小时以内)、成本低(约0.31元/样)，适用于利用PCR技术进行的各种快速DNA分子检测实验。

Description

一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板的方法
技术领域
本发明属于核酸快速提取技术领域，尤其涉及快速、低成本 从鸡血中分离PCR模板(DNA)的方法，可以快速、低成本从鸡 血中分离出DNA作为PCR模版用于各种快速DNA分子检测的实 验。
背景技术
随着分子生物学技术的高速发展，各种DNA分子检测技术已 逐步运用到医学、农业、环境及生物学等领域。目前在农业领域， PCR扩增技术已经广泛应用于育种或疾病诊断工作中，可检测的特 定疾病以及相关性状等的关联基因。在这些工作中有些需要进行 快速鉴定或诊断、有些实验需进行大量样本检测；但利用PCR检 测时模板DNA的分离时间与成本严重制约这类技术的广泛使用， 因此如何快速、低成本分离PCR模板(DNA)是提高这类技术使 用效率的关键。采集血样具有不杀死动物、经济实用且易获取等 优点，在实际操作中常从动物血液中提取DNA。
传统苯酚氯仿法是目前提取血液DNA的常用方法，这种方法 需要蛋白酶K较长时间消化处理血样，具有耗时长、实验试剂毒 性大，操作过程复杂等缺点。而市面上相关的商业化试剂盒方法 提取DNA的方法费用相对较高，且提取的DNA纯度和浓度都较低， 因此容易降解不易长期保存利用，存放较长时间后就无法作为模 板进行下游PCR扩增反应。本专利使用的螯合型离子交换树脂溶 液是一种聚苯乙烯基体离子交换树脂和灭菌水配置的，它可以高 与二价金属离子螯合，避免金属离子在高温和低离子强度溶液中 活化DNA酶使DNA降解。另外，其悬液在碱性环境和100℃高温 条件下可使包裹DNA的蛋白质变性从而从细胞核中释放DNA。在 当前的PCR检测实践中，采用传统的DNA提取方法耗时长，不足 以满足更有效、快速地获取PCR模板的需求。为了更快速、低成 本地大批量从鸡血中分离PCR模板(DNA)，申请人在借鉴和改进 前人工作的基础上，筛选出了一种螯合型离子交换树脂裂解细胞 核并建立了一种可以快速、低成本从鸡血中获取PCR模板的方法， 所获取的PCR模板(DNA)与现有的传统DNA提取方法获得模板 在用于PCR技术检测具有同等功效，经检索未发现一种快速、低 成本从鸡血中分离PCR模板(DNA)的方法公开或使用。
发明内容
鉴于上述情况中现有技术存在的问题，本发明的目的是在于 提供了一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板(DNA)的方法， 所获取的PCR模板(DNA)与现有的传统DNA提取方法具有同等 功效的同时，本方法操作步骤更简单、易于操作、耗时极短，提 取过程高效，试剂材料用量少，成本更加低廉。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
本发明的提取方法基于螯合型离子交换树脂溶液从鸡血样品 快速、低成本地分离PCR模板(DNA)。
一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板(DNA)的方法， 其步骤是：
A、从血样中分离血细胞核：向1.5mL EP管中加入10－20μl 新鲜、冷冻(需解冻)的抗凝鸡血样品，4000rpm离心1分钟去 上清；向管中加入500μl灭菌水，静置一分钟，9500rpm离心2 －4分钟，弃上清；
B、裂解细胞核：使用剪去枪头尖部的枪头向沉淀中加入200μl 灭菌水摇匀的3－4％螯合型离子交换树脂溶液，混匀后，55－57℃ 水浴30分钟，再放入干热仪，100℃加热8分钟；所述的利用筛 选出的螯合型离子交换树脂使血细胞细胞核膜破裂释放DNA并抑 制DNA降解，获取高质量的DNA可作为后续PCR扩增反应模板； 该方法耗时短(1小时以内)、成本低(约0.31元/样)，适用于利 用PCR进行的各种快速DNA分子检测实验。
C、PCR模板(DNA)分离：9500rpm离心2分钟，取上清作 为PCR(DNA)模板。
PCR扩增反应是实施例中检验PCR模板功效的具体操作，与 分离PCR模板过程分离开，是检测本发明分离的PCR模板(DNA) 可用于后续实验、并与传统DNA提取方法获得模板在用于PCR技 术检测时具有同等功效的一种分子实验。提取的DNA可以作为PCR 扩增等后续分子实验的模板，用于相关的分子实验检测。
通过上述技术措施：
1、相较于现有的传统苯酚氯仿法抽提的DNA的方法，在PCR 技术鉴定方面具有同等的功效(RCR扩增产物凝胶电泳结果成像 结果中条带与目的条带大小一致、清晰)的同时，本方法步骤简 单，易于操作。实验全过程中每个样品对应一个离心管，步骤简 单，不需多次转移样品，有效地避免了样品间污染和DNA沉淀的 损失。
2，对比已有的其他方法耗时极短，获取PCR模板的过程高效。 整个提取过程不超过1小时，提取的PCR模板足以支持后续的生 物分子学相关的鉴定实验，大批量提取时更加省时高效。
3，本方法试剂材料用量少，成本低廉。获取PCR模板过程中 主要试剂仅螯合型离子交换树脂溶液和灭菌水，裂解过程中使用 的常使用由灭菌水配制的质量分数为3—4％的螯合型离子交换树 脂溶液，材料准备容易，成本低廉。
4，相较于传统苯酚氯仿法抽提的DNA的方法，避免了有毒试 剂，不用在通风橱中进行实验，提取过程更加安全便捷。
通过上述四个步骤的技术措施：关键步骤B是裂解细胞核的 步骤，该步骤充分利用螯合型离子交换树脂溶液可以高选择性地 除去反应过程中金属离子以避免DNA降解，同时在碱性或100℃ 水浴条件下使包裹DNA的蛋白质变性从而从细胞核中释放DNA。 在试验中创新地选择了十分简化的裂解过程：在处理后的样品中 加入质量分数为3－4％螯合型离子交换树脂溶液，55－57℃水浴 28－32分钟，放入干热仪，100℃加热7－9分钟分离出样品中的 DNA。
本方法所获取的PCR模板与现有的传统DNA提取方法获得模 板在用于PCR技术检测具有同等功效，对比传统苯酚氯抽提仿法 相比，本专利提供的分离DNA的方法获得的更加安全无毒。现有 的多种获取PCR模板(DNA)方法，步骤繁多，操作复杂，耗时 较长，本发明获取的PCR模板与现有的传统DNA提取方法获得模 板在用于PCR技术检测具有同等功效，高效地利用螯合型离子交 换树脂溶液的作用，建立了极简的操作步骤和提取方法，提取成功率高，可以高效地提取从鸡血中快速低成本的分离PCR模板。
在实际操作中，曾多次使用该法批量提取数百样品样品 DNA，利用PCR扩增进行基因性状分型。实践中实验准备简 单，容易操作，耗时极短，并且成本低廉。本法可以大批量样品 的DNA提取实验，作为鉴定绿壳蛋、隐形白羽、以及鸡胚雌雄 鉴定等后续DNA分子实验的模板。实践中484个样品使用此法 提取DNA耗时不超过6小时，分离PCR模板可用于PCR扩增的 一次性成功率高达98％(见表3和实施例2)。以上更具体详细 的，使用PCR模板分离方法比较，并进行了多种方法提取DNA 步骤、时间、耗材以及成本的数据。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明操作简单，在获取同等效果的PCR模板时，本方法分 离PCR模板(DNA)十分快速，一个样品抽提全过程不到一个小 时，提取过程高效、便捷耗时短，同时实践中数百个样品采用此 法批量提取也仅需几个小时(实验室实践中484个样品使用此法 提取DNA耗时不超过6小时)，省时省力。另外，本发明仅使用螯 合型离子交换树脂和灭菌水两种试剂、步骤简单且均在同一EP管 中完成整个分离PCR模板(DNA)过程，避免了操作过程中因样 本转移导致的交叉污染或DNA丢失等现象，提高了检测结果的准 确性并大大提高了分离PCR模板(DNA)的效率。
附图说明
图1为一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板(DNA)的 方法流程示意图。
图2为本发明实施例1提供的4个基因片段PCR扩增产物琼 脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明实施例2提供的484个本方法分离的PCR模板 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1：
根据图1可知，一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板 (DNA)的方法，其步骤是：
1、材料与方法：
1.1供试材料
加入10％(质量分数)柠檬酸钠抗凝剂的鸡全血；
1.2试剂
螯合型离子交换树脂(Sigma)、灭菌水、正反向引物(生工 生物工程股份有限公司合成)、2×Taq Master mix(北京全式金 生物)；
1.3主要实验仪器及设备
微量移液枪(Eppendorf)、超纯水仪(普通)、高速离心机 (Eppendorf)、干热仪(普通)、数显恒温水浴锅(普通)、PCR仪 (Bio-Rad)、电子天平电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)、水 平电泳槽及配件(上海精密科学仪器有限公司)、紫外分光光度计 (Thermo)；
2、实验步骤：
2.1从血样中分离血细胞核
向1.5mL EP管中加入10－20μl新鲜10％柠檬酸钠抗凝剂的鸡 血样品，4000rpm离心1分钟去上清；向管中加入500μl灭菌水， 静置一分钟；9500rpm离心2－4分钟，弃上清。
2.2裂解细胞核
使用剪去枪头尖部的枪头向沉淀中加入200μl灭菌水摇匀的3 －4％螯合型离子交换树脂溶液，混匀后，55－57℃水浴30分钟， 再放入干热仪，100℃加热8分钟；
2.3PCR模板(DNA)分离
9500rpm离心2分钟，取上清作为PCR(DNA)模板。
2.4DNA模板的保存：
可放置4℃冰箱保存一周，或长期保存于-20℃冰箱中，使用 前9500rpm离心3分钟即可。
3、基因组DNA吸光值及质量浓度的测定：
选取12只母鸡血样按照上述提取过程获取DNA后，使用 NanoDrop 2000紫外分光光度计检测DNA的A260/A280值及质量 浓度，结果见表1(本发明提取12个母鸡血样的基因DNA样品测 定的紫外吸光值及质量浓度)，可以看出，提取的12个DNA样品 的A260/A280值可以说明分离的PCR模板(DNA)纯度较高，同 时提取的PCR模板(DNA)质量浓度也较高，足以用于后续的PCR 扩增实验。
表1:提取12个母鸡血样的基因DNA样品测定的紫外吸光值及 质量浓度
4、模板PCR(DNA)扩增及结果与分析：
4.1 PCR反应条件和步骤
分别通过传统苯酚氯仿法抽提DNA作为PCR模板(a2、b2、 c2、d2)以及本专利描述的方法对编号为1、2、3和4号鸡血样 品分离的PCR模板(a1、b1、c1、d1)，将获取的PCR模板，分别 使用表2中的4对引物进行PCR扩增反应。PCR扩增体系总体积 为10μl，反应体系组成如下：
模板DNA 1.1μl，正反引物各0.15μl，ddH2O 3.6μl，Taq Master mix 5μl。扩增反应的引物和条件见表2(进行PCR扩增反应的引物 及扩增条件)。
表2：实施例进行PCR扩增反应的引物及扩增条件
4.2模板DNA PCR扩增效果及分析
PCR产物用2％(质量分数)琼脂糖凝胶120V电泳30分钟后 使用凝胶成像仪器进行结果分析，PCR扩增产物的凝胶电泳条带清 晰均一且大小符合预期，结果可见于图2。
实施例2：
根据图1可知，一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板 (DNA)的方法，在此实施例中，我们使用该方法从来自四百只母 鸡的血样进行PCR模板(DNA)分离，然后进行相应的PCR鉴定。 其步骤是：
其中PCR模板分离和PCR扩增步骤同实施例1中步骤1－2；
3、模板PCR(DNA)扩增及结果与分析：
3.1 PCR产物用2％(质量分数)琼脂糖凝胶120V电泳30分钟后 使用凝胶成像仪器进行结果分析，PCR扩增产物的凝胶电泳目的条 带清晰且大小符合预期，根据图3部分结果统计，本方法分离的 484个PCR模板(DNA)中可用于后续检测的样品达474个，一次 性成功率高达98％，部分凝胶成像结果可见于图3；
3.2以50个样品为例，传统DNA提取方法与本方法提取时间时间 和成本比较，时间结果可见于表3，更详细的可见表3。
表3:不同方法从单个和50个样品分离PCR模板所需时间和成 本的比较
通过上述技术措施：
A、提取效果：
本专利分离的PCR模板(DNA)与传统方法提取的DNA在实 际应用中具有同等功效，但是用于PCR实验室提取DNA常用苯酚 氯仿法等传统方法，操作起来步骤繁多，消耗时间长，耗用试剂 多且步骤复杂。本发明全过程仅需配备螯合型离子交换树脂和灭 菌水，不仅步骤简单、耗时较短，同时对样品消耗少，可以高效 低成本地分离PCR模板(DNA)。同时对获取的PCR模板进行纯度 与浓度测定、以及PCR扩增产物等结果进行检测，确定该方法PCR 模板在实际应用中具有同等功效。
B、适用范围：
可对新鲜、冷冻(需解冻)的抗凝鸡血样品PCR模板(DNA) 进行快速、低成本地分离
提取鸡血DNA，提取的DNA可以作为用于分子鉴定等相关实 验在实际应用中具有同等功效。
C、裂解试剂与时长：
使用3－4％(质量分数)螯合型离子交换树脂溶液作为裂解 试剂，56℃温浴30分钟后，100℃干浴8分钟。
D、本发明的技术优势为：
本发明操作简单，在从血样中分离出PCR模板(DNA)十分 快速，一个样品提取全过程不到一个小时，提取过程高效、便捷 耗时短，同时实践中数百个样品采用此法批量提取也仅需几个小 时(实施例2中484个样品使用此法提取DNA耗时不超过6小时)， 省时省力。另外，本发明仅使用螯合型离子交换树脂和超纯水两 种试剂、步骤简单且均在同一EP管中完成整个分离PCR模板 (DNA)过程，避免了操作过程中因样本转移导致的交叉污染或 DNA丢失等现象，提高了检测结果的准确性并大大提高了分离PCR 模板的效率。本发明不仅适应于鸡全血，对从鸡血细胞以及其他 禽类血样中也可分离提取PCR模板。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发 明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和 改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板的方法，其步骤是：
A、从血样中分离血细胞核：向1.5mL EP管中加入10－20μl新鲜、冷冻的抗凝鸡血样品，4000rpm离心1分钟去上清；向管中加入500μl灭菌水，静置一分钟，9500rpm离心2－4分钟，弃上清；
B、裂解细胞核：使用剪去枪头尖部的枪头向沉淀中加入200μl灭菌水摇匀的3－4％螯合型离子交换树脂溶液，混匀后，55－57℃水浴30分钟，再放入干热仪，100℃加热8分钟；
C、PCR模板分离：9500rpm离心2分钟，取上清作为PCR模板。
2.根据权利要求1所述的一种快速、低成本从鸡血中分离PCR模板的方，其特征在于：所述的PCR扩增反应的引物及扩增条件：
。
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