CN115927565A - 基于mNGS检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法建立及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了基于mNGS(metagenomic next‑generation sequencing，宏基因组测序)技术检测CAR‑T细胞制品中病原微生物的方法及应用，属于基因检测技术领域。一种基于mNGS技术检测CAR‑T细胞制品中病原微生物的方法，包括：S1.基于mNGS检测CAR‑T细胞制品的核酸提取；S2.基于mNGS检测CAR‑T细胞制品的文库制备；S3.基于mNGS检测CAR‑T细胞制品的测序；S4.分析CAR‑T细胞制品测序数据。本发明建立了一种高效的、规范的、易于标准化的、能够用于CAR‑T细胞制品快速放行的检测方法。通过大大缩短CAR‑T细胞制品外源性病原微生物风险因子的检测时间，能极大缩短患者等待CAR‑T细胞产品的时间，从而更好地造福患者、服务临床。

Description

基于mNGS检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法建立及应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及基于mNGS技术检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法及应用。

背景技术

近年来，CAR-T细胞疗法发展迅速，在肿瘤免疫治疗领域取得了突破性进展，为临床治疗带来了革命性的影响。目前，国内外已有8款针对血液肿瘤的CAR-T产品上市。同行业内公司目前使用的产品检测方法主要针对于生产CAR-T细胞用到的慢病毒或逆转录病毒中间制品进行检测，检测方法主要包括培养法和Q-PCR法。获批放行的每批次慢病毒制品检测结果均为阴性，但存在检验周期长、检测范围单一等缺陷。

2017年，国家食药监总局(CFDA)官网发布《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》，该原则指出：细胞治疗产品的检测机制建议采用中间样品的质量检验和终产品放行检验相结合的方法；产品放行检测的项目和标准可参考国外已上市品种。

2020年第四版《中国药典》在《药品微生物检验替代方法验证指导原则》一文指出：在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因，如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法(即替代方法)时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。

宏基因组测序，全称为宏基因组新一代测序技术(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)，是综合分析样本内微生物和宿主的基因物质(DNA和RNA)的方法。由于其检测范围广、灵敏度高、特异性好等特点，mNGS已广泛应用于食品、环保、工农业和医药等诸多领域。如今，mNGS被频频用于临床微生物检测服务，应用于多种感染性疾病的诊断、微生物学分析、识别肿瘤相关病毒等多个方面。

目前，存在用mNGS技术检测各种临床样本的大量报道，但尚无研究机构或企业将mNGS技术用于CAR-T细胞制品的病原微生物检测或产品放行。

发明内容

本发明的目的在于提出基于mNGS技术检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法及应用，具有快捷、便利、准确、高效的检测效果。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种基于mNGS技术检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法，包括：

S1.基于mNGS检测CAR-T细胞制品的核酸提取：

对供试品进行核酸提取，并采用去人源和非去人源样品前处理；

对样本分别进行DNA和RNA提取，将提取后的RNA进行逆转录得到cDNA；

S2.基于mNGS检测CAR-T细胞制品的文库制备：

使用DNA文库制备试剂盒对所提取的核酸分别建库，其中，核酸包括提取后的DNA，以及RNA经逆转后得到的cDNA；

S3.基于mNGS检测CAR-T细胞制品的测序：

对所述两种核酸文库进行高通量测序；

依据所述样本标签序列和文库标签序列对高通量测序数据进行拆分，得到对应于不同样本的测序读长数据；

S4.分析CAR-T细胞制品测序数据：

将测序数据与华大基因病原微生物数据库进行比对分析，得到每个样本的分析结果；

若mNGS分析结果显示CAR-T细胞制品未检出病原微生物，且同批次的传统检测方法结果也未检出微生物，则判定该制品满足放行要求。

作为本发明的进一步改进，所述供试品包括新鲜CAR-T细胞制品、冻存CAR-T细胞制品，所述CAR-T细胞来源于健康供体或者患者体内的T细胞。

作为本发明的进一步改进，所述CAR-T细胞包括从健康供体或者患者体内获得的T细胞一直到体外培养、刺激、转导和扩增之后的成品CAR-T细胞。

作为本发明的进一步改进，所述CAR-T细胞包括以CD30为靶点的细胞制品，也包含其他所有靶点的CAR-T细胞制品。

作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述比对分析包括：

S41.对所述测序数据进行过滤；

S42.将过滤后的测序数据与宿主基因组进行比对，去除比对到所述宿主基因组的序列；

S43.将未比对到所述宿主基因组的序列与病原微生物基因组进行比对；

S44.统计比对到所述病原微生物基因组的序列的检测参数，获得包括特异比对序列数、覆盖率、覆盖深度、背景微生物、相对丰度中的任一项或多项参数在内的检测结果；

S45.输出所述检测结果。

作为本发明的进一步改进，所述宿主基因组包括人类参考基因组序列和炎黄基因组序列。

作为本发明的进一步改进，步骤S43中所述与病原微生物基因组进行比对，基于下列中的至少之一确定所述测序数据中来自于所述病原微生物的测序数据：

(1)保留所述测序数据中比对长度占比大于90％的序列；

(2)保留所述测序数据中错配碱基数小于5％的序列；

(3)保留具有比对特异性的序列，其中所述具有比对特异性的序列为唯一比对序列或多比对结果中满足次优比对分值除以最优比对分值小于0.8的序列，其中所述唯一比对序列是唯一比对到所述病原微生物基因组一个位置上的序列。

本发明进一步保护一种上述的方法在病原微生物的检测中的应用。

本发明首次提出并应用华大基因mNGS系统建立了快速检测CAR-T细胞制品的病原微生物方法，有利于为细胞治疗行业树立检测新标准。

本发明提供了mNGS检测CAR-T细胞制品的相关原理、配套试剂盒、相关参数等等。

本发明比较了mNGS对新鲜CAR-T细胞制品和冻存液处理后的冻存制品的检测结果，发现新鲜CAR-T细胞制品更适用于mNGS检测。

本发明验证了“去人源处理”能显著提高mNGS检测CAR-T细胞制品病原微生物的理论灵敏度。

本发明比较了新型mNGS检测与传统检测方法，包括对支原体检测的常规培养法、DNA荧光染色法，以及用于外源性病毒因子检测的细胞形态观察法、血吸附试验和红细胞凝集实验，对六个批次细胞制品的病原微生物风险因子的检测结果均显示，两种方法的检测结果均为阴性。

本发明建立了一种快速检测CAR-T细胞制品病原体微生物的高通量测序检测技术。

与传统检测方法相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明可通过特殊处理CAR-T细胞制品提取核酸，通过去人源化处理提高病原微生物的检测灵敏度，以PCR技术进行文库制备，再到上机检测和分析，实现短期内对CAR-T制品病原微生物的快速检测；

(2)通过将mNGS分析结果与传统微生物检测结果作对比，发现mNGS能同时检测多个样本，能进一步提高检测通量并极大程度地缩短检测时间；此外，基于传统方法检测指标的有限性，mNGS技术的检测范围极大，涵盖包括细菌、真菌、病毒、寄生虫在内的近2万种病原微生物。若出现某批次CAR-T制品质控不合格，通过mNGS检测结果能快速判断是何种微生物污染，能对生产环节做出及时调整，而传统检测方法并不具备该特殊优势。

(3)本发明提出的mNGS检测能有效提高CAR-T细胞制品的检测精度，能极大地缩短检测时间、提高检测效率，该方法能作为传统方法检测和放行CAR-T细胞制品的辅助或替代方法，这样不仅能为病人争取更多时间，也能为企业缩减成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为华大病原微生物文库基本信息；

图2为华大MGI2000检测CAR-T细胞制品的基本流程。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供用于CAR-T细胞制品提取的试剂盒、去人源化处理的操作细节、构建文库和测序的配套试剂，以及分析软件和流程。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1：mNGS测序检测病原微生物基本方案

本发明采用了华大MGI2000测序仪，其能灵活支持多种测序模式，具有高准确性、低重复序列率和低标签跳跃等特点。

本发明采用了MGIEasy通用文库制备试剂套装，能将提取、优化后的核酸分别制备DNA文库和RNA文库。图1显示了该系统现有的病原微生物文库信息，包括10989种细菌(含196种分枝杆菌、159种支原体/衣原体/立克次氏体)、5050种DNA和RNA病毒、1179种真菌、282种寄生虫。

本发明采用MGISEQ-2000RS高通量(快速)测序试剂套装(FCL SE50)，搭配MGISEQ-2000RS测序载片，能在12h内完成对DNA和RNA的测序。本发明采用MegaBOLT数据分析系统，具有快速、集成、易用等分析特点，能快速精准地获取样本检测信息。图2显示了mNGS技术检测CAR-T细胞制品病原微生物的基本流程图。

实施例2：两种样本类型经“去人源”和“不去人源”的病原微生物检测的结果比较

本发明随机选取病例1的CD30 CAR-T样本，包括新鲜制备的CAR-T细胞制品，以及使用DMSO冻存液处理过的冻存制品，以下简称“细胞悬液”和“冻存液”。

“细胞悬液”是含有T细胞培养基的细胞悬液，在经历体外刺激、慢病毒转导和扩增后，收集而成的悬浮CAR-T细胞。

“冻存液”是将新鲜CAR-T细胞经洗涤并按一定密度冻存于GMP级别的冻存液制品。对于部分患者，生产出的CAR-T细胞需要经过冻存液处理，再经冷链运输才能回输患者体内。

本发明比较了mNGS测序对上述两种样本的检测结果的具体区别。

CAR-T细胞制品属于高人源样本，含有大量宿主DNA，容易对病原体微生物的检测产生负面影响。

本发明因此对两种样本采取“去人源”和“不去人源”处理，通过比较最终测序结果以确定是否需要去除宿主核酸，并确定最佳的样本类型。

运用独特的差异裂解法原理，使用BunnyPure^TM去宿主试剂盒(cat#：TQ06BT0050)，对宿主细胞进行裂解和核酸消化，能高效地去除样本中的宿主细胞和核酸，从而富集、纯化微生物。去宿主操作步骤总耗时不足30min，能显著提高病原微生物的检测灵敏度。

优选地，使用高测序通量(100M)对该批自体CAR-T细胞的两种类型产品分别进行“去人源”、“不去人源”处理，再进行测序分析。结果见表1和表2。

表1两种类型的CAR-T产品经两种不同前处理后的初步检测结果(DNA)

表1结果显示，经过“DNA去人源处理”的“细胞悬液”的不同类型病原体的理论检测灵敏度均在1-10copies/ml范围内，表明“去人源处理”能显著提升针对不同微生物类型的检测灵敏度。另外，对于两种样本类型，“去人源处理”对“冻存液”样本的单位体积人细胞含量并无影响。因此，“细胞悬液”比“冻存液”更能反映样本的真实情况。

表2两种类型的CAR-T制品初步检测结果(RNA)

	细胞悬液RNA	冻存液RNA
			检出总序列数	24328296	46024175
内参是否检出	是	是

表2结果显示，两种样本类型对于RNA检测的结果影响不大。综合以上数据，本发明优先选取新鲜CAR-T细胞悬液为后期处理样本(下文统称“CAR-T细胞制品”)，并对所有样本进行“去人源处理”。

实施例3：不同测序量对CAR-T细胞制品病原微生物测序分析的影响

针对病原体微生物测序分析，华大MGISEQ测序平台涵盖100M和20M测序通量，本发明比较了两种测序量对CAR-T细胞制品测序结果的影响，包括表15-17体现的具体检测结果。

本发明使用MGIEasy核酸提取试剂盒(Cat#：1000023938)，配套MGISP-NE32全自动核酸提取纯化仪(Cat#：950-000020-00)，对送测样本进行DNA或RNA提取。其中，核酸提取试剂盒包括由裂解液、磁珠、洗涤液、无核酸酶水组成的96孔试剂板，和塑料磁棒保护套。

自动化核酸提取原理简单，即通过高结合力超顺磁性的纳米磁珠捕获裂解释放的核酸，再用洗涤液洗掉结合在核酸表面的杂质，最后将磁珠上的核酸洗脱下来，即得到高纯度的DNA或RNA样本。核酸提取操作方便快捷，即使用核酸提取纯化仪设定好自动化提取程序，包括吸磁珠、裂解、洗涤、洗脱和弃磁珠。详见下表3：

表3

	步骤1	步骤2	步骤3	步骤4	步骤5
						具体内容	吸磁珠	裂解	洗涤	洗脱	弃磁珠
机器孔位	2	1	3	5	2
						等待时间(s)	0	0	0	0	0
混合时间(s)	0	180	25	90	0
						磁吸时间(s)	15	60s x 3	60s x 2	15	0
容积(μL)	100	700	200	50	100

核酸提取纯化仪加热设置：

裂解温度：55℃，裂解加温终止步骤：3；

洗脱温度：80℃，洗脱加温开始步骤：3。

整个核酸提取步骤快速高效，耗时仅约10min。

使用上述同样的方法提取得到RNA，再通过病毒富集技术对RNA进一步富集，再使用北京华大逆转录试剂盒(Cat#：BPI01030)得到cDNA。

将逆转后的cDNA和基因组DNA通过MGIEasy通用DNA文库制备试剂盒(Cat#：1000006986)分别进行建库。具体操作步骤如下：

(1)使用非接触式超声DNA破碎仪(Covaris S220)对DNA进行物理打断，确保DNA片段在100-700bp之间。

(2)对片段化的DNA进行磁珠片段筛选，控制文库片段主带的集中长度。优选地，对于SE50推荐主带约为180bp。

(3)将磁珠片段筛选的DNA进行末端修复(添加“dA”尾)。

a.根据样本浓度，取适量样本(50ng)至新的0.2mL PCR管，用TE Buffer补充至总体积40μL；

b.在冰上配置末端修复反应液，详见下表4：

表4

组分	体积(μL)
		ERAT Buffer	7.1
ERAT Enzyme Mix	2.9
		总体积	10

c.取10μL配制好的末端修复反应液加入步骤a的PCR管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；

d.将上述PCR管置于PCR仪上，按照下表5中的条件进行反应：

表5

温度	时间
		37℃	30min
65℃	15min
		4℃	Hold

(4)收集上一步反应液，立即进行接头连接。

a.在步骤(3)-d.中的PCR管中加入5μL的MGIEasy DNA Adapters，涡旋震荡3次，每次3s，离心收集反应液至管底；

b.在冰上配置接头连接反应液，详见下表6：

表6

组分	体积(μL)
		Ligation Buffer	23.4
DNA Ligase	1.6
		总体积	25

c.吸取25μL配制好的接头连接反应液加入步骤(4)-a.中的PCR管中，涡旋震荡6次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

d.将PCR管置于PCR仪上，23℃孵育30min，瞬时离心收集反应液；

e.加入20μL的TE Buffer至总体积100μL，全部转移到新的1.5mL离心管中。可直接进行下一步纯化，也可至于-20℃冰箱16h内进行下一步操作。

(5)连接产物纯化，去除未连接上的接头。

a.提前30min取出DNA Clean Beads置于室温，使用前充分震荡混匀；

b.吸取50μL DNA Clean Beads至步骤(4)-e中的接头连接产物中，并轻轻吸打至少10次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中；

c.室温孵育5min；

d.瞬时离心，将离心管置于磁力架，静置2-5min至液体澄清，移液器吸取并弃上清；

e.加入200μL配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后吸取并丢弃上清。重复该步骤一次；

f.打开仍旧至于磁力架上的离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂；

g.取下离心管，加入40μL TE Buffer洗脱DNA，用移液器轻轻吸打至少10次至完全混匀；

h.室温孵育5min；

i.瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，取38μL上清液转移至1.5mL离心管中，即得到连接纯化产物。

(6)对纯化产物进行PCR扩增、再纯化。

a.取19μL步骤(5)-i.的连接纯化产物于新的0.2mL PCR管中；

b.在冰上配置PCR反应液，详见下表7：

表7

组分	体积(μL)
		PCR Enzyme Mi×	25
PCR Primer Mi×	6
		总体积	31

c吸取31μL配制好的PCR反应液加入步骤(6)-a.的PCR管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；

d.将上一步骤的PCR管置于PCR仪，按下表8条件进行PCR反应：

表8

e.瞬时离心，将反应液转移到新的1.5mL离心管中，即得到PCR扩增产物。

f.将上一步的扩增产物进行再次纯化，使用50μL DNA Clean Beads，参考步骤(5)的纯化步骤，通过洗涤、洗脱得到再纯化产物。

(7)产物质检

a.使用

dsDNA HS Assay Kit双链DNA荧光定量试剂盒对上一步得到的纯化产物进行定量；

b.使用电泳分离设备对PCR纯化后产物进行片段分布检测。

c.对质检合格的纯化产物进行95℃、3min热变性处理；

d.立即将PCR管转移到冰上，静置2min后瞬时离心。

(8)对变性的单链DNA产物进行单链环化、酶切消化和纯化等处理，最终完成对DNA和RNA原始样本的建库。

a.在冰上配置单链环化反应液，如下表9：

表9

组分	体积(μL)
		Splint Buffer	11.6
DNA Rapid Ligase	0.5
		总体积	12.1

b.吸取12.1μL的单链环化反应液加入步骤(7)-d.的PCR管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；

c.将PCR管置于PCR仪上，37℃孵育30min，再迅速转移至冰上；

d.提前在冰上配制酶切消化反应液，如下表10：

表10

e.吸取4μL配置好的酶切消化反应液加入步骤(8)-c.中的PCR管，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底；

f.将PCR管置于PCR仪上，37℃孵育30min，再迅速转移至冰上；

g.向PCR管中加入7.5μL Digestion Stop Buffer，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底，吸取全部反应液转移到新的1.5mL离心管中。

h.将上一步的酶切后产物进行再次纯化，使用50μL DNA Clean Beads，参考步骤(5)的纯化步骤，通过洗涤、洗脱得到再纯化产物。

i.类似地，对酶切纯化产物进行质检，合格的产物即为完整的DNA或RNA样本文库。

本发明采用MGISEQ-2000RS高通量(快速)测序试剂套装(FCL SE50)(Cat#：1000012533)，搭配MGISEQ-2000RS测序载片(Cat#：1000008403)，根据实验需求比较100M或20M不同测序通量。该步骤的原理是使用联合探针锚定聚合技术(cPAS)，将DNA分子锚和荧光探针在DNA纳米球(DNB)上进行聚合，并利用高分辨率成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后获得高质量、高准确度的样本序列信息。简要地来说，可根据说明书按照以下步骤进行：

(1)按照测序所需的文库浓度、总量对文库进行适度调整；

(2)制备DNB；

a.在冰上配制反应混合液，如下表11：

b.将上述反应混合液震荡混匀，瞬时离心5s，按如下表12反应程序进行反应：

表12

温度	时间
		95℃	1min
65℃	1min
		40℃	1min
4℃	Hold

c.提前取出DNB聚合酶混合液II(LC)置于冰上，短暂离心5s，使用前需吹打混匀。

d.当步骤(2)-b的反应液达到4℃，取出PCR管至于冰上，并加入如下表13的组分：

表13

组分	100μL体系加入量(μL)
		DNB聚合酶混合液I	40
DNB聚合酶混合液II(LC)	4

e.反应混合液震荡混匀，短暂离心5s，按如下表14反应程序进行反应：

表14

备注：建议设置热盖温度为35℃，或尽可能设置成接近35℃的最低温度。

f.当PCR仪温度达到4℃后立即加入20μL DNB终止缓冲液，并缓慢地吹打混匀5-8次。

(1)测定DNB浓度；

取2μL DNB测量浓度，标准文库的合格浓度应≥8ng/μL。若文库浓度超过40ng/μL，可使用DNB加载缓冲液稀释至20ng/μL使用。

(2)准备MGISEQ-2000RS载片，并加载DNB；

(3)准备SE50测序试剂槽；

(4)开始测序。

本发明使用华大独家的MegaBOLT数据分析系统，能快速、精准地获取测序后的具体样本信息。结果见表15-16。

表15不同测序量对检测结果的影响(DNA)

表15列出的DNA数据表明，100M测序量能检出平均约2.5×10⁸序列，而20M测序量仅检出平均约4×10⁷序列。尽管两种测序量的检出总序列数差异明显，但样本单位体积含有的人细胞含量相当，平均约为2.7E+02cells/ml。同时，针对细菌、真菌、病毒和寄生虫等四类微生物的检测灵敏度相似，均在1-10copies/mI范围内。

表16不同测序量对检测结果的影响(RNA)

表16显示的RNA检测数据表明，两种测序量对微生物的检出序列数有些许差异，报告分析可能是由于不同个体来源的T细胞状态差异而引起的，而这并不影响对病原体微生物检测的整体结果，也能真实地反映每批样本的真实情况。

表17 六批不同批次的CAR-T细胞制品的病原微生物检测结果(含DNA、RNA)

表17显示了DNA和RNA检测后的综合结果，数据表明六个批次的细胞制品的病原微生物检测结果均为阴性。

综合表15-17检测结果，对后期样本均选取20M测序量进行测序。

实施例4：自体CD30 CAR-T细胞制品(病例6)的病原微生物检测结果

以2022-06-02批次的检测报告为示例，来分析该批样本检测报告的具体情况，报告内容涵盖了本批次样本的疑似背景微生物，表18和表19分别显示了该样本经DNA、RNA分别提取、检测、分析后的疑似背景微生物情况。其中，DNA检测结果包含的疑似背景微生物有斯氏假单胞菌、粪产碱杆菌、琼氏不动杆菌、痤疮丙酸杆菌、人葡萄球菌、限制马拉色菌等；RNA检测结果表明的疑似背景微生物有痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和限制马拉色菌等。

表18 2022-06-02批次样本的疑似背景微生物(DNA检测报告)

表19 2022-06-02批次样本的疑似背景微生物(RNA检测报告)

整体而言，检测出的疑似背景微生物序列数较低，相对丰度偏低，能反应定植于该患者体内原有的正常共生/定植微生物，理论上不会引起感染，但不应该忽视这些病原体可能引起人体感染的可能性。

为了更好地理解本发明，上述优选实施例中涉及的专业术语定义如下：

(1)类型：指检出病原微生物的类型，细菌包括G+(革兰氏阳性菌)/G-(革兰氏阴性菌)，病毒包括ssDNA：单链DNA病毒，dsDNA：双链DNA病毒，ssRNA：单链RNA病毒，dsRNA：双链RNA病毒，及真菌和寄生虫；其中“-”表示信息不详；“*”表示只翻译到属名；

(2)检出序列数：指在属/种水平上检测到的该微生物的严格比对的序列数目；

(3)相对丰度：指检测出列最低层级的微生物，在同类微生物(细菌/真菌/病毒/寄生虫)中所占百分比；

(4)疑似背景微生物：指存在于人体部位的正常共生/定植微生物，不排除其引起感染的可能。

实施例5：传统检测方法与mNGS技术对病原微生物检测的结果比较

目前大多数CAR-T企业采取的病原微生物检测方法均为传统检测方法，比如针对支原体的培养法、对外源性病毒因子的Q-PCR检测法等等。波睿达公司在采用创新的mNGS技术检测CAR-T细胞制品的病原微生物同时，也使用传统检测方法为产品质量做进一步保证。

通过与武汉珈创生物合作，对六个不同批次的CAR-T细胞制品进行了外源性病毒因子和支原体的检测，表20显示所有批次样品的检测结果均合格。

表20传统检测方法对六批不同批次CAR-T细胞制品的检测结果

表21列举了使用传统方法检测2022-02-09批次(病例3)自体CAR-T细胞制品的检测结果。针对支原体检测，长达21天的培养法和耗时7天的DNA荧光染色法鉴定结果均为阴性。此外，通过细胞形态观察、血吸附试验和红细胞凝集实验，外源性病毒因子的检测结果也均为阴性。

表21传统方法检测支原体和外源性病毒因子的检测结果(2022-02-09批次样本)

综合来看，传统检测方法周期长。此外，一旦上述的培养法、荧光染色法、形态观察法、血吸附试验或红细胞凝集检测结果出现阳性，也很难判断造成污染的具体病原微生物因子。

值得说明的是，mNGS涵盖的病原微生物文库含量大、种类丰富，通过序列对比分析能迅速判定出样本中的风险因子。因此，mNGS方法相比于传统检测方法具有独特且不可取代的优势。

以上是本发明的优选方式，值得注意的是，它们不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

为了更好地理解本发明，上述优选实施例中涉及微生物检测的专业术语定义如下：

为了更好地理解本发明，实施例中涉及微生物检测的专业术语定义如下：

(1)支原体培养法：该方法是鉴定支原体污染的经典方法，得到全世界范围认可，也是被《中国药典》2015版第三部分3301记录的权威检测方法。使用支原体肉汤培养基接种待测CAR-T细胞样品(或细胞培养上清等)，经过约21天的培养，观察有无支原体的生长，以此来判断细胞是否存在支原体污染。

(2)支原体DNA荧光染色法：利用萤光染剂(Hoechst33258)来侦测支原体污染。支原体DNA中A-T含量占多数(55-80％)，该染料能结合至A-T丰富区。将待检细胞样本经染色后置于荧光显微镜下观察，若检测样品为支原体污染，则可见细胞核外与细胞周围分布了许多大小均一的萤光小点，即为支原体DNA。

待检样品的支原体检测指标合格体现为：支原体肉汤培养基无支原体生长，DNA荧光染色为阴性。

(3)外源性病毒因子检测之细胞形态观察：根据《药典》，用待检细胞培养上清液制备活细胞或细胞裂解物，分别接种至少三种单层指示细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属、同组织类型来源的细胞。其中，每种单层指示细胞至少接种10⁷个活细胞或相当于10⁷个活细胞的裂解物。接种量应占维持液的1/4以上，每种指示细胞至少接种2瓶。取培养7天的细胞各一瓶，取上清液或细胞裂解物再分别接种于新鲜制备的相应的指示细胞盲传一代，与初次接种的另一瓶细胞继续培养7天，观察细胞形态，看是否出现病变。

(4)外源性病毒因子检测之血吸附试验：在实验(3)中的观察末期，取细胞培养物进行血吸附试验。用0.2％-0.5％豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。将混合红细胞加入细胞培养瓶，一半置于2-8℃孵育30min，一半置于20-25℃孵育30min，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况。

(5)外源性病毒因子检测之红细胞凝集实验：在实验(3)中的观察末期，取细胞培养上清液进行红细胞凝集试验。用0.2％-0.5％豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行红细胞凝集试验。取细胞上清液从原倍起进行倍比稀释后，加入混合红细胞，先置于2-8℃孵育30min，再置于20-25℃孵育30min，分别观察红细胞凝集情况。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于mNGS技术检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法，其特征在于，包括：

S1.基于mNGS检测CAR-T细胞制品的核酸提取：

对供试品进行核酸提取，并采用去人源和非去人源样品前处理；

对样本进行DNA和RNA提取，提取后的RNA进行逆转录得到cDNA；

S2.基于mNGS检测CAR-T细胞制品的文库制备：

使用DNA文库制备试剂盒对所提取的核酸分别建库，其中，核酸包括提取后的DNA，以及RNA经逆转后得到的cDNA；

S3.基于mNGS检测CAR-T细胞制品的测序：

对所述两种核酸文库进行高通量测序；

依据所述样本标签序列和文库标签序列对高通量测序数据进行拆分，得到对应于不同样本的测序读长数据；

S4.分析CAR-T细胞制品测序数据：

将测序数据与华大基因病原微生物数据库进行比对分析，得到每个样本的分析结果；

若mNGS分析结果显示CAR-T细胞制品未检出病原微生物，且同批次样本经传统方法检测后也未检出微生物，则判定该制品满足放行要求。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述供试品包括新鲜CAR-T细胞制品、冻存CAR-T细胞制品，所述CAR-T细胞来源于健康供体或者患者体内的T细胞。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述CAR-T细胞包括从健康供体或者患者体内获得的T细胞一直到体外培养、刺激、转导和扩增之后的成品CAR-T细胞。

4.根据权利要求1-3任一项所述方法，其特征在于，所述CAR-T细胞包括以CD30为靶点的细胞制品，也包含其他所有靶点的CAR-T细胞制品。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S4中所述比对分析包括：

S41.对所述测序数据进行过滤；

S42.将过滤后的测序数据与宿主基因组进行比对，去除比对到所述宿主基因组的序列；

S43.将未比对到所述宿主基因组的序列与病原微生物基因组进行比对；

S44.统计比对到所述病原微生物基因组的序列的检测参数，获得包括特异比对序列数、覆盖率、覆盖深度、背景微生物、相对丰度中的任一项或多项参数在内的检测结果；

S45.输出所述检测结果。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述宿主基因组包括人类参考基因组序列和炎黄基因组序列。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S43中所述与病原微生物基因组进行比对，基于下列中的至少之一确定所述测序数据中来自于所述病原微生物的测序数据：

(1)保留所述测序数据中比对长度占比大于90％的序列；

(2)保留所述测序数据中错配碱基数小于5％的序列；

(3)保留具有比对特异性的序列，其中所述具有比对特异性的序列为唯一比对序列或多比对结果中满足次优比对分值除以最优比对分值小于0.8的序列，其中所述唯一比对序列是唯一比对到所述病原微生物基因组一个位置上的序列。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的方法在病原微生物检测中的应用。

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