CN107969420A - 用于胎儿游离dna检测的血浆常温运输方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血浆常温运输处理方法。即：从孕妇外周血中分离血浆，将血浆装入无菌无核酸酶的装置中，密封，即可进行常温运输。常温运输后的血浆，与超低温(‑70℃以下)储存的血浆相比，原始的游离DNA浓度、游离DNA片段分布、胎儿游离DNA百分浓度、测序片段长度分布和染色体Z检测值均相当，适用于胎儿游离DNA检测和无创产前基因筛查产品。本发明无需专用装置、无需额外添加保护剂，可将血浆样本运输拓展至常温运输，改善血浆冷链运输的不便捷和高运输成本的问题，可避免全血样本运输超时的尴尬和由于运输机械力导致溶血情况的发生，为现有的孕妇外周血处理方式和血浆运输的方式提供多一种新颖、有效和便捷的可选方法。

Description

用于胎儿游离DNA检测的血浆常温运输方法

技术领域

本发明属于血浆游离核酸测序领域，更具体地，涉及一种血浆常温运输处理方法及其应用。

背景技术

1997年，香港中文大学的卢煜明教授发现了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，从此开创了无创产前基因筛查(Noninvasive Prenatal Testing，NIPT)的新时代。目前，基于孕妇外周血样本和高通量测序技术，无创胎儿染色体非整倍体筛查，无创胎儿染色体微缺失微重复筛查已应用于临床服务，无创胎儿单基因病筛查技术在研发和样本积累验证阶段。相对于传统的有创筛查/诊断技术，如羊膜腔穿刺、绒毛活检、脐静脉穿刺等，基于高通量测序的无创产前基因筛查具有无创取样，无流产风险，高灵敏度，高准确率(99％以上)，检测周期短等优势，对普及孕妇产前筛查和提高出生人口素质的具有重要意义。

NIPT检测样本为孕妇外周血，由于母源血细胞基因组DNA的释放会影响胎儿游离DNA的比例，因此需及时将血细胞与血浆进行分离，以血浆作为检测样本进行DNA提取、文库构建、基因测序和信息分析。血浆中胎儿游离DNA浓度是NIPT检测的重要质控指标，胎儿DNA浓度越高，则NIPT检测的准确性越高。对NIPT而言，胎儿DNA浓度过低会提高阳性样本漏检的风险。因此，孕妇外周血和血浆中胎儿游离DNA浓度的维持和避免母体DNA的增加导致胎儿游离DNA浓度下降对基于胎儿游离DNA的无创产前筛查尤为重要。

由于条件、资源和资质的关系，NIPT检测采样点和检测点往往非同一地区，检测样本需运输至检测点进行检测。目前，采集孕妇外周血往往是根据实际情况选择抗凝采血管或游离核酸稳定管，其中使用EDTA抗凝采血管采集后需4℃保存，并要求8小时内送达实验室进行血浆分离；如果使用价格比EDTA抗凝采血管贵十几倍到几十倍不等的游离核酸稳定管，例如Streck cfDNA BCT采血管，则可常温保存和常温运输，但仍需在72～96小时内送达实验室进行血浆分离，由于物流运输时间的不稳定性及运输过程中的机械碰撞或摇晃，外周血样本往往会存在因运输超时或运输机械力导致的溶血情况，需重新采集外周血。

一直以来，已完成血浆分离的血浆样本如需运输至检测点，须依赖高成本的冷链物流运输或干冰保温运输，然而物流运输受地理、节假日和天气的影响，常存在运输时间超时导致冷链或干冰运输温度失控的情况，同时干冰价格偏贵，增加检测成本。

针对上述问题，本发明提供一种血浆常温运输处理方法，将血浆样本的运输方式拓展至常温，降低样本处理成本，可用于基于孕妇外周血血浆胎儿游离DNA的无创产前筛查技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血浆常温运输处理方法及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种血浆常温运输处理方法，包括如下步骤：

(1)采集外周血；

(2)从外周血中分离血浆；

(3)将血浆装入无菌无核酸酶的装置中，密封，即可进行常温运输。

作为上述方法的优选，步骤(1)中，外周血采集至抗凝采血管或游离核酸稳定管。

作为上述方法的优选，所述抗凝采血管选自EDTA抗凝管，但不限于此，添加有其他抗凝成分的抗凝采血管同样适用。

作为上述方法的优选，所述游离核酸稳定管选自Streck Cell-Free DNA BCT采血管、万基生物的Cell Free DNA保存管、国盛医学的Ardent血浆游离DNA保鲜采血管、康为世纪的游离DNA样品保存管、美岸生物的cfDNA保存管，但不限于此，其他性能相近的外周血游离核酸稳定管同样适用。

作为上述方法的优选，分离血浆采用离心法。

作为上述方法的优选，离心法的具体步骤为：将外周血4℃下1600g离心10～15min，吸取上清，将上清4℃下16000g离心10～15min，所得上清即为血浆。

作为上述方法的优选，所述装置选自EP管或玻璃管。

作为上述方法的优选，常温运输的保质期不超过10天。

作为上述方法的优选，常温运输的温度不超过45℃。

上述用于血浆常温运输处理方法应用于胎儿游离DNA检测产品、无创胎儿染色体非整倍体筛查产品、无创胎儿染色体微缺失微重复筛查产品、无创胎儿单基因病筛查产品。

本发明的有益效果是：

出人意料地发现：从孕妇外周血中分离血浆，将血浆装入无菌无核酸酶的装置中，密封，即可进行常温运输；常温运输后的血浆，经游离DNA提取、文库构建、高通量测序、生物信息分析后，与超低温(-70℃以下)储存的血浆相比，原始的游离DNA片段分布、胎儿游离DNA的百分浓度、测序片段长度分布相当，可应用于胎儿游离DNA检测产品及无创产前筛查产品。

本发明提供的一种血浆常温运输处理方法，有以下效益：(1)本发明血浆常温运输处理方法无需专用装置和无需额外添加保护剂，血浆分离后经常温运输，胎儿游离DNA的浓度和长度无显著差异；(2)将血浆样本运输由冷链运输拓展至常温运输；(3)可支持的常温运输时间至少7天，改善血浆冷链运输的不便捷和高运输成本的问题；(4)血浆集中处理后常温运输可避免全血样本运输超时和由于运输机械力导致溶血情况的发生；(5)为现有的孕妇外周血处理方式和血浆运输的方式提供多一种新颖、有效和便捷的可选方法。总而言之，本发明的血浆运输处理方法对胎儿游离DNA检测产品及无创产前基因筛查产品的应用具有重要的价值。

附图说明

图1是具体实施例1中G16N08504样本三种处理方法后提取的游离DNA片段分布图，图中G16N08504_37表示37℃运输组，G16N08504_45表示45℃运输组，G16N08504_C表示对照组；

图2是具体实施例1中G16N08504样本三种处理方法后提取的游离DNA测序片段分布图，图中G16N08504_37表示37℃运输组，G16N08504_45表示45℃运输组，G16N08504_C表示对照组；

图3是具体实施例1中G16B27510样本三种处理方法后提取的游离DNA片段分布图，图中G16B27510_37表示37℃运输组，G16B27510_45表示45℃运输组，G16B27510_C表示对照组；

图4是具体实施例1中G16B27510样本三种处理方法后提取的游离DNA测序片段分布图，图中G16B27510_37表示37℃运输组，G16B27510_45表示45℃运输组，G16B27510_C表示对照组；

图5是具体实施例2中G16N18904样本两种处理方法后提取的游离DNA片段分布图，图中G16N18904_T表示实际常温运输组，G16N18904_C表示对照组；

图6是具体实施例2中G16N18904样本两种处理方法后提取的游离DNA测序片段分布图，图中G16N18904_T表示实际常温运输组，G16N18904_C表示对照组；

图7是具体实施例2中G16B37527样本两种处理方法后提取的游离DNA片段分布图，图中G16B37527_T表示实际常温运输组，G16B37527_C表示对照组；

图8是具体实施例2中G16B37527样本两种处理方法后提取的游离DNA测序片段分布图，图中G16B37527_T表示实际常温运输组，G16B37527_C表示对照组。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于以下实施例的发现，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中涉及的装载血液和血浆的装置均无菌无核酸酶；实施例中未特别说明的仪器或试剂均可市售获得，未详细说明的实验条件按本领域文献报道或产品说明书操作；实施例中的外周血样本来自东莞市妇幼保健院。

具体实施例1

1、血浆常温运输处理

从3位孕妇采集外周血置于EDTA抗凝管，4℃放置8小时内采用离心法分离血浆，离心步骤为：全血1600g离心10min，小心吸取上清，避免吸到白细胞，上清置于离心管中，16000g离心10min，上清即为分离的血浆，小心吸取上清分装至无菌无核酸酶的EP管中，密封。

从3位孕妇采集外周血置于万基生物的Cell Free DNA保存管(以下简称万基保存管)，在72小时内采用离心法分离血浆，离心步骤为：全血1600g离心15min，小心吸取上清，避免吸到白细胞，上清置于离心管中，16000g离心10min，上清即为分离的血浆，小心吸取上清分装至无菌无核酸酶的EP管中，密封。

2、常温运输测试

将上述每例血浆均分为三份，每份800μL，一份血浆置于培养箱，以37℃，130rpm振荡的条件保存7天，模拟常温运输，作为37℃运输组；一份血浆置于培养箱，以45℃，130rpm振荡的条件保存7天，模拟常温运输，作为45℃运输组；另一份血浆置于-80℃保存7天，作为对照组。

3、DNA提取

对以上每组处理后的血浆进行游离DNA提取，各提取1份(提取体积为400μL)，使用硅胶膜柱离心法提取、磁珠法提取等方式，例如使用TIANGEN公司的TIANamp Micro DNAkit(产品货号DP316)、Magnetic Serum/Plasma Circulating DNA Kit(产品货号DP340)、美基生物公司的磁珠法游离核酸DNA提取试剂盒(产品货号12918)提取血浆中的游离DNA。本实施例中选用东莞博奥木华基因科技有限公司的核酸提取或纯化试剂盒(产品货号S10020)，提取方法：按照产品说明书进行提取，首先，用裂解液和蛋白酶K对样品进行裂解消化，将游离DNA释放到裂解液中；其次，将游离的核酸吸附到磁珠表面；第三，利用洗涤液洗去未吸附的蛋白质、盐分等杂质；第四，将被吸附的游离DNA从磁性粒子上洗脱，获得DNA溶液，用Qubit3.0荧光定量仪检测DNA浓度，结果如表1-1所示。

4、DNA长度分布检测

使用Agilent 2100生物分析仪，选用Agilent High Sensitivity DNA Kit对提取得到的游离DNA进行检测，图1和图3示例性给出其中两个样本2100结果，可见三种处理方法的血浆提取的游离DNA分布相当。

5、文库构建

将提取的游离DNA进行文库构建和定量，本实施例使用胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(博奥生物集团)中的部分建库试剂成分：末端修复缓冲液、末端修复酶、DNA连接缓冲液、DNA连接酶、PCR扩增试剂、PCR引物、TE溶液、P1接头、标签序列1-32，磁珠B2，作为替代，也可以使用Life Technology或New England Biolabs、Enzymatics在Proton测序平台上的建库试剂、测序试剂。本实施例的操作方法为：将双链DNA的末端补平，然后通过DNA连接酶将接头序列、特异性标签序列分别加到DNA的两端，最后通过PCR反应增加片段分子数，QPCR法确定文库浓度，结果如下表1-2所示。

A.末端修复

将上一步提取获得的DNA分别按照下面的表格配置反应体系，在室温下放置20min。

组分	反应体积(μL)
		DNA	X(使用无核酸酶水补至39.5)
末端修复缓冲液	10
		末端修复酶	0.5
反应体系总量	50

将此反应体系置于室温孵育20min。使用磁珠B2 1.8X进行纯化，25μL TE溶液溶解洗脱。

B.接头连接

将上述片段集中的DNA溶液分别按照下面的表格配置反应体系：

组分	反应体积(μL)
		上步所得的平末端DNA	25
无核酸酶水	15
		连接缓冲液	5
DNA连接酶	1
		P1接头	2
标签序列X	2
		反应体系总量	50

接头为由如下两个正反序列组成的P1-Adapter：

5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'(SEQ ID NO:1)，

3'-T*T*GGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5'(SEQ ID NO:2)。

特异标签序列是由如下正反两个序列组成的Barcode Primer X组成：

5'-CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3'(SEQ ID NO:3)，

3'-CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'(SEQ ID NO:4)。

其中”N”代表A、T、C、G任意一个碱基,*代表核苷酸进行了硫代修饰。

将此反应体系置于室温孵育30min，使用磁珠B2 1.5X进行纯化，18.2μL TE溶液溶解洗脱。

C.PCR扩增

将上步所得的连接接头的DNA按照下面的表格配置反应体系

组分	反应体积(μL)
		上步所得的连接接头的DNA	18
PCR扩增试剂	50
		PCR引物	2
反应体系总量	70

PCR引物序列为：

Primer 1：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3’(SEQ ID NO:5)，

Primer 2：5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3’(SEQ ID NO:6)。

PCR反应条件：72℃，10min，95℃，5min；(95℃，15s；62℃，15s；70℃，1min)12cycles；70℃，5min；4℃，holding。

PCR结束后，用磁珠B2 1.2X进行纯化，50μLTE溶液溶解洗脱。

6、文库质检

该文库质检可选用Qubit及其试剂进行检测，本方法中选择QPCR检测扩增产物的浓度，浓度如表1-2所示，文库浓度适当，远远高于Ion Proton^TM测序平台上机浓度(26pM)和博奥生物集团的BioelectronSeq 4000基因测序仪上机浓度(20pM)。

7、测序反应

根据样本文库浓度和特异性标签序列，编制上机记录表，将多个文库混合成一个pooling样本，经过乳液PCR反应、富集纯化，引物退火及样本加载到芯片，即可进行测序反应。Ion Proton^TM测序平台采取单端测序法，测序最大读长为300bp，获得测序数据，图2和图4示例性给出其中两个样本的测序片段长度分布图，可见三种处理方法的血浆提取的游离DNA分布相当。

8、胎儿浓度和非整体Z检验值分析

将测序得到的序列(reads)比对到人类参考基因组，并去除低质量的比对结果以及重复序列，进而计算22对染色体以及性染色体的序列数(reads number)和序列比例(reads ratio)。根据用核型正常的样本建立的参考数据库(Reference)，可以计算每条染色体的Z-score：Z-score＝(序列比例-Reference平均值)/Reference标准差。当Z-score值≤1.96，判断为三体阴性；当Z-score值在1.96和3范围内，判断为灰区样本，建议进行重新抽血取样后复检；当Z-score值>3，判定为三体阳性样本。由于男胎的胎儿DNA浓度和Y染色体的Z-score是呈现正相关关系的，因此根据男胎Y染色体的Z-score可以推测胎儿游离DNA浓度，结果如表1-3和表1-4所示。

表1-1、实施例1三组血浆提取的游离DNA检测总量(单位ng)

表1-2、实施例1三组血浆提取的游离DNA文库构建浓度(单位nmol/L)

表1-3、实施例1三组血浆提取的胎儿游离DNA百分数(％)

表1-4、实施例1三组血浆无创产前检测Z-score值

表1-1～表1-4结果表明：无论是利用EDTA采血管，还是游离核酸稳定管采集外周血，与对照组相比，经模拟常温运输(37℃、45℃，130rpm)处理后，其DNA浓度、文库浓度、胎儿游离DNA百分数相当，同一例样本的三种运输方法的检验Z-score值判定结果一致，其中，有1例样本(G16B27524)的三种处理方式的血浆的检测结果均为21三体阳性(21号染色体Z-score大于3)，与核型检测结果(47，XN，+21(N代表X或Y染色体))相符，检测结果准确。

具体实施例2

1、血浆常温运输处理

从3位孕妇采集外周血置于EDTA抗凝管，4℃放置8小时内采用离心法分离血浆，离心步骤为：全血1600g离心10min，小心吸取上清，避免吸到白细胞，上清置于离心管中，16000g离心10min，上清即为分离的血浆，小心吸取上清分装至无菌无核酸酶的EP管中，密封。

从3位孕妇采集外周血置于万基生物的Cell Free DNA保存管(以下简称万基生物保存管)，在72小时内采用离心法分离血浆，离心步骤为：全血1600g离心15min，小心吸取上清，避免吸到白细胞，上清置于离心管中，16000g离心10min，上清即为分离的血浆，小心吸取上清分装至无菌无核酸酶的EP管中，密封。

2、常温运输测试

将上述血浆分为两份，每份800μL，一份血浆置于泡沫箱内但不添加任何降温和保温材料，以冷链运输途径运输，于8月份从广州寄往北京再折返寄回，时长为7天，作为实际常温运输组；另一份血浆置于-80℃保存7天，作为对照组。

3、DNA提取、DNA长度分布检测、文库构建、文库质控、测序反应、胎儿浓度和Z值分析

以上步骤同具体实施例1。

结果：

示例性给出其中两个样本2100结果，如图5和图7所示，两种处理方法的血浆提取的游离DNA分布相当。

示例性给出其中两个样本测序片段长度分布图，如图6和图8所示，两种处理方法的血浆提取的游离DNA分布相当。

表2-1、实施例2两组血浆提取的游离DNA检测总量(单位ng)

表2-2、实施例2两组血浆提取的游离DNA文库构建浓度(nmol/L)

表2-3、实施例2两组血浆提取的游离DNA胎儿百分数(％)

表2-4、实施例2两组血浆无创产前检测Z-score值

表2-1～表2-4结果表明：无论是利用EDTA采血管，还是游离核酸稳定管采集外周血，与对照组相比，经实际常温运输处理后，其DNA浓度、文库浓度、胎儿游离DNA百分数相当，同一例样本的三种运输方法的染色体的Z-score值判定结果一致，其中，有1例样本

(G16N18905)的三种处理方式的血浆的检测结果均为18三体阳性(18号染色体的Z-score大于3)，与该样本的核型检测结果(47，XN，+18(N代表X或Y染色体))相符，检测结果准确。

以上具体实施例测试结果均表明：本发明提供的血浆常温运输处理方法对DNA浓度、游离DNA片段分布、测序读长分布、胎儿游离DNA百分数及染色体非整倍体检测(Z-score值分析)无影响，可应用于胎儿游离DNA检测产品和基于游离DNA的无创产前基因筛查产品，无创筛查产品包括但不限于无创胎儿染色体非整倍体筛查产品、无创胎儿染色体微缺失微重复筛查产品、无创胎儿单基因病筛查产品。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞博奥木华基因科技有限公司

<120> 用于胎儿游离DNA检测的血浆常温运输方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工接头

<400> 1

ccactacgcc tccgctttcc tctctatggg cagtcggtga t 41

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工接头

<220>

<221> 硫代修饰

<222> (42)..(43)

<400> 2

atcaccgact gcccatagag aggaaagcgg aggcgtagtg gtt 43

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工标签

<220>

<221> 硫代修饰

<222> (13)..(14)

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(40)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn gat 43

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工标签

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

atcnnnnnnn nnnctgagtc ggagacacgc 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

ccatctcatc cctgcgtgtc 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

ccactacgcc tccgctttcc tctctatg 28

Claims (10)

1.一种血浆常温运输处理方法，包括如下步骤：

(1)采集外周血；

(2)从外周血中分离血浆；

(3)将血浆装入无菌无核酸酶的装置中，密封，即可进行常温运输。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，外周血采集至抗凝采血管或游离核酸稳定管。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抗凝采血管选自EDTA抗凝管。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述游离核酸稳定管选自Streck Cell-Free DNA BCT采血管、万基生物的Cell Free DNA保存管、国盛医学的Ardent血浆游离DNA保鲜采血管、康为世纪的游离DNA样品保存管、美岸生物的cfDNA保存管。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分离血浆采用离心法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：离心法的具体步骤为：将外周血4℃下1600g离心10～15min，吸取上清，将上清4℃下16000g离心10～15min，所得上清即为血浆。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述装置选自EP管或玻璃管。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：常温运输的保质期不超过10天。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：常温运输的温度不超过45℃。

10.权利要求1～9任一项所述的血浆常温运输处理方法应用于胎儿游离DNA检测产品、无创胎儿染色体非整倍体筛查产品、无创胎儿染色体微缺失微重复筛查产品、无创胎儿单基因病筛查产品。