JP6092891B2 - ゲノムの異常の有無を決定する方法及び判断するシステム - Google Patents
ゲノムの異常の有無を決定する方法及び判断するシステム Download PDFInfo
- Publication number
- JP6092891B2 JP6092891B2 JP2014546269A JP2014546269A JP6092891B2 JP 6092891 B2 JP6092891 B2 JP 6092891B2 JP 2014546269 A JP2014546269 A JP 2014546269A JP 2014546269 A JP2014546269 A JP 2014546269A JP 6092891 B2 JP6092891 B2 JP 6092891B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chromosome
- red blood
- sequence
- nucleated red
- determining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 154
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 title claims description 110
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 255
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 231
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 133
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 78
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 68
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 61
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 58
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 claims description 55
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 claims description 52
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 38
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 claims description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 34
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 33
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 33
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 32
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 25
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 claims description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 23
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 11
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 11
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 11
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 11
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 11
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 9
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 claims description 9
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 claims description 6
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 5
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 4
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 5
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 4
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 238000009598 prenatal testing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 2
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000012177 large-scale sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 2
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 2
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010056254 Intrauterine infection Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710179516 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012176 true single molecule sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
- G16B30/10—Sequence alignment; Homology search
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明の一態様によれば、本発明は、ゲノムの異常の有無を判断する方法を提供する。図1を参照すると、本発明の実施例により、この方法には、次のステップが含まれる。
本発明において、妊婦の生体試料から胎児有核赤血球を単離することは、本発明者の次の発見に基づいている。現在では、胎児の遺伝的異常に対して行われた研究は、主に母体の末梢血から胎児の遊離DNAを単離することによる。しかしながら、胎児由来の遊離DNAに加えて、妊婦の末梢血には母体由来のDNAが多量あって、胎児のゲノムのDNAの半分が母由来のものであるため、DNA源を正確に区別することは、今まで困難であった。一方で、母体の末梢血にある胎児の遊離DNAは、不完全なゲノムとして存在するため、特定の遺伝子座を検出するプロセスにおいて、テンプレートが失われることにより偽陰性が大幅に増加する可能性がある。従って、胎児由来の遊離DNAを利用して、胎児の遺伝的異常を検出すること自体が欠陥を有する。またさらに、本発明者は、胎児の遊離核酸に加えて、母体の末梢血に完全な胎児細胞があることを発見した。母体の末梢血に遊離している胎児細胞は、主に栄養膜細胞と、白血球と、胎児有核赤血球とを含む。本発明者は、栄養膜細胞が多核と単球の2形態で存在するため、誤診につながりやすいことを発見した。白血球は、胎児を出産した後に、恒久的に母体血の中に存在する。これにより、次回の妊娠の検出を阻害する。また、本発明者は、胎児有核赤血球が、より短いライフサイクルを有し、胎児を出産した後、90日以内になくなり、次回の妊娠の検出を阻害しないこととともに、有核赤血球の表面抗原が比較的安定して同定および単離をしやすいことを発見した。従って、胎児有核赤血球により、ゲノムに異常があるか否かを効果的に判断できる。本発明者は、妊婦の末梢血にある胎児有核赤血球により非侵襲的に出産前の診断を行う方法は、高スループットの配列解読と組み合わせると、今までの母体血漿を用いた非侵襲的な出生前診断法より優れた効果を示すことを発見した。
本発明の実施例によれば、胎児有核赤血球を単離した後に、前記有核赤血球のゲノムの少なくとも一部の配列を決定してもよい。当業者は、所望の遺伝子により、有核赤血球のゲノム配列を決定する対象を選択して、これらの対象に対応する配列の解析結果を得ることができる。本発明の実施例によれば、当業者は、公知の方法で、配列を決定する対象、例えば、いくつかの染色体のみを選択してもよい。もちろん、そのままで有核赤血球の全ゲノムの配列を決定して、配列の解析結果を得た後、配列の解析結果から、特定のサイトからの配列データを選択して研究に供してもよいことは、当業者に自明である(詳細は後述する)。便宜のために、有核赤血球の全ゲノムの配列を決定することを例に以下説明する。
本明細書で使用される「ゲノム異常」という用語は、広義に理解されるべきであり、ゲノム配列のいずれかの変化、例えば、染色体異数性、構造変異、一塩基突然変異などの遺伝的変異(http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_variation)を意味し、ゲノム修飾のサイトでの変化、例えば、メチル化レベルなども意味する。本発明の実施例によれば、検討対象とするゲノム異常は、染色体異数性、及び所定の領域での突然変異の少なくとも1種である。本発明の実施例では、所定の領域での突然変異は、構造変異(http://en.wikipedia.org/wiki/Structural_variation)又は一塩基突然変異(SNP,http://en.wikipedia.org/wiki/Single−nucleotide_polymorphism)を意味する。
有核赤血球のシーケンシングデータを解析するために、まず、それぞれ所定の長さを独立して有する窓口に既知の第一の染色体の配列を分ける。本発明の実施例によれば、これらの窓口の長さは、同一でもよいし、相違していてもよいし、特に制限はない。本発明の一実施例によれば、複数の前記窓口は、所定の長さがともに60KBである。それにより、有核赤血球における染色体異数性を判断する効率を向上できる。また、当業者は、必要に応じて、窓口に含まれる第一の染色体の配列範囲を選択してもよい。
シーケンシングデータを得た後、得られたシーケンシングデータを既知の第一の染色体の配列と対比することによって、所定の長さを有する窓口にそれぞれ分けることができる。公知の方法や手段に基づいて、こられのシーケンシングデータの数を対比し算出できることは、当業者に自明である。例えば、シーケンシング機器製造会社からのソフトウェア、例えば、SOAPv2.20を用いて解析してもよい。本発明の一実施例によれば、前記各窓口に入るシーケンシングデータは、唯一適合のシーケンシングデータである。それにより、有核赤血球における染色体異数性を判断する効率を、シーケンシングデータをスクリーニングすることによって向上させることができる。ここで使用される「唯一適合のシーケンシングデータ」という用語は、シーケンシングデータを既知の染色体配列、例えば、ヒトゲノムであるHg19と対比させる時、唯一の参照ゲノムに完全に適合するシーケンシングデータであることを意味し、本明細書では、「unique read」とも呼ばれる。
有核赤血球の全ゲノムの配列を決定した結果では、特定の染色体に対するシーケンシングデータの数と全ゲノムにおける当該染色体の含有量との間に正の相関があるので、配列の解析結果における、特定の染色体のシーケンシングデータの数、及び全ゲノムシーケンシングの総数を分析することにより、当該染色体を効果的に決定できる。そのため、第一の染色体の各窓口に入るシーケンシングデータの数を分析することによって、第一のパラメータを決定できる。当該第一のパラメータを用いて、第一の染色体に異数性があるか否かを確実に示すことができるようにするために、本発明の一実施例によれば、得られた各窓口に入るシーケンシングデータの数に基づいて第一のパラメータを決定することには、更に、それぞれ、各窓口に入るシーケンシングデータの数に対して所定の重みを付けるステップ、及び、前記第一の染色体の第一のパラメータとして、前記重みに基づいて各窓口に入る配列データの数を加重平均して中央値を算出するステップ、が含まれる。本発明者は、このような第一パラメータにより、シーケンシングデータにおける第一の染色体からのシーケンシングデータの数を効果的に反映できることを発見した。本発明の実施例によれば、重みをつけるのは、シーケンシングデータに存在する恐れがある誤差によるデータ歪曲を排除するためである。本発明の一例示によれば、所定の重みは、各窓口に入るシーケンシングデータの数を各窓口におけるGC含有量にそれぞれ関連させることにより得られる。それにより、シーケンシング技術によるGC含有量の高い領域に対する偏向誤差を効果的に排除する。本発明の実施例では、例えば次の方法によって重みを得ることができる。
本発明の別の態様によれば、本発明は、ゲノムに異常があるか否かを判断するシステム1000を提供する。図3を参照すると、本発明の実施例によれば、システム1000は、母体血から胎児有核赤血球を単離する有核赤血球の分離装置100、前記有核赤血球のゲノムの少なくとも一部の配列を決定して、配列の解析結果を得る配列決定装置200、及び配列決定装置200から配列の解析結果を受信するように該配列決定装置200に接続され、配列の解析結果に基づいて、有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを判断する分析装置300を含む。
本発明の更に別の態様によれば、本発明は、胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法を提供する。これは、次の手順を含む。
実験材料
サンプルである末梢血は、いずれもダウン症スクリーニングを受けたハイリスクの妊婦由来のものである。他の実験材料は、特に記載がない限り、いずれも本分野における従来の方法で用いられる試薬、又は市販のものである。
1.有核赤血球抽出
妊婦から末梢血を3ml採取し、抗凝固剤としてEDTAを用い、血液試料を、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まない0.1Mのリン酸塩緩衝液(PBS)を用いて、1:1の割合で希釈し、希釈された試料を、密度が1.077である3mlのFicoll試薬(Sigma社製、アメリカ)の上にゆっくりと置き、室温、800g×30minで密度勾配遠心分離を行った。遠心分離を行った後、単核細胞層が見えた。慎重に層細胞を吸引して、1.5mlの遠心分離管に移し、3倍体積量の1%のBSAを含むPBSバッファーに再懸濁させて、室温、200g×5minで再び遠心分離を行って、上澄みを捨てた。残留する密度勾配液を除去するように、得られた細胞ペレットを同じ方法により、2回洗浄した。最終的に、0.1%のBSAを含む300mlのPBSに細胞ペレットを再懸濁させて、均一になるように吹かせた。細胞数を測定し、そして、CD71抗体が固定化された磁気ビーズ(ミルテニーバイオテク株式会社、ドイツ)を、20マイクロリットル/細胞106個の割合で加えて、4℃で15min静置した後、遠心分離を行って、上澄みを捨てた。0.1%のBSAを含むPBSにペレットを再懸濁させて、磁気ビーズの分級システム(ミルテニーバイオテク株式会社、ドイツ)を組み立てた。分級カラムを、0.1%のBSAを含む500マイクロリットルのPBSバッファーで洗浄し、液体が流れた後、分級された細胞をカラムに入れて、流出物を集めて、「陰性細胞」と記した。0.1%のBSAを含むPBSでチューブを洗浄することを、液体が流れた後、2回繰り返し、PBS/EDTA/BSAを分級カラムに入れることを、液体が流れた後、1回繰り返した。最終的に、0.1%のBSAを含むPBSを分級カラムに入れて、磁場から離して、15mlの遠心管に液体を流して、「陽性細胞」と記した。陽性細胞に遠心分離を行い、最下部の約100マイクロリットルを残し、得られた有核赤血球を「GP9」と記した。
Sigma社の操作マニュアルに従い、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplificationキットにより、有核赤血球全体に全ゲノム増幅を行った。超音波破砕装置であるコバリスを用いて、コバリスを用いた場合の取扱説明書に従って、増幅された生成物を断片化させて、DNA断片の長さが350bpのDNA断片を得た。
10×T4ポリヌクレオチドキナーゼの緩衝液 10μl
dNTPs(10mM) 4μl
T4 DNAポリメラーゼ 5μl
クレノウ断片 1μl
T4ポリヌクレオチドキナーゼ 5μl
断片化された生成物であるDNA断片 30μl
ddH2Oを100μl追加する。
10×クレノウ緩衝液 5μl
dATP(1mM) 10μl
クレノウ(3’-5’ exo−) 3μl
DNA 32μl
2x Rapid DNA結合の緩衝液 25μl
PEI Aアダプター oligomix(20μM) 10μl
T4 DNAポリメラーゼ 5μl
末端に塩基Aを加えたDNA 10μl
試料 10μl
Phusion DNAポリメラーゼMix 25μl
PCR用プライマー*(10pmol/μl) 1μl
Nタグ付プライマー**(10pmol/μl) 1μl
UltraPureTM水 13μl
配列の解析結果を表1に示す。配列決定されたサンプルGP9は、配列データの総数(読み出し)が13,407,381で、対比可能な参照ゲノム(HG19)の数が9,217,701で、対比率が68.70%で、唯一適合のシーケンシングデータの数が7,341,230で、唯一の対比率が80%であった。
(付記)
(付記1)
妊婦の生体試料から胎児有核赤血球を単離するステップ、
前記有核赤血球のゲノムの少なくとも一部の配列を決定して、配列の解析結果を得るステップ、及び、
前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを判断するステップ、を含む、
ことを特徴とするゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記2)
前記妊婦の生体試料は妊婦末梢血である、
ことを特徴とする付記1に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記3)
検討対象として12-20週の在胎週数である妊婦の生体試料を採取する、
ことを特徴とする付記1又は2に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記4)
妊婦末梢血から前記胎児有核赤血球を単離するステップは、更に、
密度勾配遠心分離用試薬により、前記末梢血に密度勾配遠心分離を行って、単核細胞を得るステップ、及び、
有核赤血球の表面抗原を特異的に認識できる抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記単核細胞から有核赤血球を収集するステップ、を含む、
ことを特徴とする付記2又は3に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記5)
前記密度勾配遠心分離用試薬はポリショ糖であり、例えば800Xg、30分で前記勾配遠心を行う、
ことを特徴とする付記4に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記6)
前記単核細胞を得た後であって、CD71抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記有核赤血球を収集する前に、更に、残留する密度勾配遠心分離用試薬を除去するように、1%のBSAを含むPBSバッファーで前記単核細胞を洗浄するステップを含み、
前記PBSバッファーは、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まない、
ことを特徴とする付記4に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記7)
1%のBSAを含むPBSバッファーで前記単核細胞を洗浄するステップは、更に、
前記単核細胞を1%のBSAを含むPBSバッファーと混合させて、単核細胞を含む浮遊液を得るステップ、及び、
前記単核細胞を含む浮遊液に、好ましくは、200Xg、5分で遠心分離を行って、上澄みを捨てて、洗浄した有核赤血球を得るステップ、を含む、
ことを特徴とする付記6に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記8)
前記抗体は、CD71を特異的に認識できる抗体である、
ことを特徴とする付記4に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記9)
有核赤血球1個の配列決定を行う、
ことを特徴とする付記1に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記10)
有核赤血球の全ゲノムの配列決定を行う、
ことを特徴とする付記1に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記11)
有核赤血球の全ゲノムの配列決定を行うことは、更に、
前記有核赤血球の全ゲノムを増幅して、増幅された全ゲノムを得るステップと、
増幅された全ゲノムで、全ゲノムシーケンシングライブラリを構築するステップと、
前記ライブラリーの配列を決定して、配列データからなる配列の解析結果を得るステップと、を含む、
ことを特徴とする付記10に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記12)
前記有核赤血球全ゲノムを、OmniPlex WGAで増幅させる、
ことを特徴とする付記11に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記13)
前記全ゲノムシーケンシングライブラリを構築するステップは、更に、
増幅された全ゲノムを断片化させて、DNA断片を得るステップと、
前記DNA断片にその末端を修復させて、末端が修復されたDNA断片を得るステップと、
末端が修復されたDNA断片の3’末端に塩基Aを加えて、粘着性末端Aを有するDNA断片を得るステップと、
前記粘着性末端Aを有するDNA断片をアダプターに結合させて、結合生成物を得るステップと、
前記結合生成物をPCR増幅させて、第二の増幅生成物を得るステップと、
前記第二の増幅生成物を精製して回収し、前記全ゲノムシーケンシングライブラリを構成する回収物を得るステップと、を含む、
ことを特徴とする付記11に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記14)
増幅された全ゲノムを、Covaris破砕機にて、断片化させる、
ことを特徴とする付記13に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記15)
前記DNA断片長は350bpである、
ことを特徴とする付記13に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記16)
5’→3’ポリメラーゼ活性と3’→5’エキソヌクレアーゼ活性とを有し、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、前記DNA断片にその末端を修復させる、
ことを特徴とする付記15に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記17)
クレノウ断片(3’−5’ exo−)を用いて、前記末端が修復されたDNA断片の3’末端に塩基Aを加える、
ことを特徴とする付記13に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記18)
T4 DNAポリメラーゼを用いて、前記粘着末端Aを有するDNA断片をアダプターに結合させる、
ことを特徴とする付記13に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記19)
Hiseq2000、SOLiD、454、及び単一分子のシークエンシング装置から選ばれる少なくとも1つを用いて、前記配列決定を行う、
ことを特徴とする付記1に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記20)
前記ゲノム異常は、染色体異数性、及び所定の領域での突然変異から選ばれる少なくとも1種である、
ことを特徴とする付記1に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記21)
前記ゲノム異常は染色体異数性であり、
前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを判断するステップは、更に、
有核赤血球の全ゲノムの配列を決定して、配列データからなる配列の解析結果を得るステップ、
所定の長さを独立して有する複数の窓口に既知の第一の染色体の配列を分けるステップ、
前記配列の解析結果に係る配列データを、前記既知の第一の染色体の配列と対比して、各窓口に入る配列データの数を特定するステップ、
各窓口に入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定するステップ、及び、
前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを判断するステップ、を含む、
ことを特徴とする付記1に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記22)
前記第一の染色体は、ヒト染色体における21番染色体、18番染色体、13番染色体、X染色体、及びY染色体から選ばれる少なくとも1種である、
ことを特徴とする付記21に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記23)
前記複数の窓口は、同一の長さを有する、
ことを特徴とする付記21に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記24)
前記複数の窓口は60KBの長さを有する、
ことを特徴とする付記22に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記25)
前記各窓口に入る配列データは、唯一適合の配列データである、
ことを特徴とする付記21に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記26)
前記各窓口に入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定するステップは、更に、
各窓口に入る配列データの数に所定の重みを付けるステップ、及び、
前記第一の染色体の第一のパラメータとして、前記重みに基づいて各窓口に入る配列データの数を加重平均して中央値を算出するステップ、を含む、
ことを特徴とする付記21に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記27)
前記所定の重みは、各窓口に入る配列データの数を、各窓口におけるGC含有量にそれぞれ関連させることにより得られる、
ことを特徴とする付記26に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記28)
前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを判断するステップは、更に、
前記第一の染色体と同じ方法で第二の染色体の中央値を算出するステップ、
前記第一の染色体の中央値と前記第二の染色体の中央値とをt値検定することにより、前記第一の染色体と前記第二の染色体との差分値を得るステップ、及び、
前記差分値を所定の第一の閾値及び第二の閾値と比較して、該差分値が所定の閾値を下回ると、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があると判断し、該差分値が所定の閾値を上回ると、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性がないと判断するステップ、を含む、
ことを特徴とする付記27に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記29)
前記第二の染色体は1−12番ヒト染色体から選ばれるいずれか一種である、
ことを特徴とする付記28に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記30)
前記第一の染色体の中央値と前記第二の染色体の中央値とを、次の式
(ここで、T i,j は、第一の染色体と第二の染色体との差分値を、μ i は、第一の染色体の中央値を、μ j は、第二の染色体の中央値を、σ i は、第一の染色体の各窓口に分布している配列データ数の標準偏差を、σ j は、第二の染色体の各窓口に分布している配列データ数の標準偏差を、n i は、第一の染色体における窓口の数を、n j は、第二の染色体における窓口の数を示す。)
により、t値検定する、
ことを特徴とする付記28に記載のゲノムに異常の有無を判断する方法。
(付記31)
前記所定の第一の閾値は−4以下で、前記第二の閾値は−3.5以上である、
ことを特徴とする付記26に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記32)
前記ゲノム異常は、所定の領域での突然変異である、
ことを特徴とする付記1に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記33)
前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを判断するステップは、更に、
前記配列の解析結果に基づいて、有核赤血球の所定の領域における核酸配列を決めるステップ、
前記有核赤血球の所定の領域における核酸配列を、比較対照となる核酸配列、好ましくは、健常者のゲノム配列と対比するステップ、及び、
該対比結果に基づいて、前記有核赤血球の所定の領域に異常があるか否かを判断するステップ、を含む、
ことを特徴とする付記32に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記34)
前記所定の領域での突然変異は、挿入突然変異、欠失突然変異、置換突然変異、転座突然変異、逆位突然変異、コピー数変異及び一塩基多型の少なくとも1種を含む、
ことを特徴とする付記33に記載のゲノムの異常の有無を判断する方法。
(付記35)
妊婦の生体試料から胎児有核赤血球を単離する有核赤血球の分離装置、
前記有核赤血球のゲノムの少なくとも一部の配列を決定して、配列の解析結果を得る配列決定装置、及び、
前記配列決定装置から配列の解析結果を受信するように該配列決定装置に接続され、前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを判断する分析装置、を含む、
ことを特徴とするゲノムの異常の有無を判断するシステム。
(付記36)
前記有核赤血球の分離装置は、更に、
密度勾配遠心分離用試薬により、妊婦の末梢血である妊婦の生体試料に密度勾配遠心分離を行って、単核細胞を得る単核細胞の分離ユニットと、
該単核細胞の分離ユニットに接続され、有核赤血球の表面抗原を特異的に認識できる抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記単核細胞から有核赤血球を収集する磁気収集ユニットと、を含む、
ことを特徴とする付記35に記載のシステム。
(付記37)
前記シーケンサーは、Hiseq2000、SOLiD、454、及び単一分子のシークエンシング装置から選ばれる少なくとも1つである、
ことを特徴とする付記35に記載のシステム。
(付記38)
前記配列決定装置に接続され、該配列決定装置に配列を決定する全ゲノムシーケンシングライブラリを提供する全ゲノムシーケンシングライブラリの構築装置を含み、
該全ゲノムシーケンシングライブラリの構築装置は、更に、
前記有核赤血球の分離装置に接続され、有核赤血球を受け取って溶解させて、有核赤血球の全ゲノムを得る有核赤血球の溶解ユニット、
前記有核赤血球の溶解ユニットに接続され、有核赤血球の全ゲノムを増幅させて、増幅された全ゲノムを得る全ゲノムの増幅ユニット、及び、
増幅された全ゲノムを受け取るとともに、全ゲノムシーケンシングライブラリを前記増幅された全ゲノムで構築するシーケンシングライブラリの構築ユニット、を含む、
ことを特徴とする付記34に記載のシステム。
(付記39)
前記分析装置は、
所定の長さを独立して有する複数の窓口に既知の第一の染色体の配列を分け、
前記配列の解析結果に係る配列データを、前記既知の第一の染色体の配列と対比して、各窓口に入る配列データの数を特定し、
各窓口に入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定し、
前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを判断する、ように構成される、
ことを特徴とする付記35に記載のシステム。
(付記40)
前記分析装置は、前記各窓口に入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定するユニットを備え、
該ユニットは、
各窓口に入る配列データの数に所定の重みを付け、
前記第一の染色体の第一のパラメータとして、前記重みに基づいて各窓口に入る配列データの数を加重平均して中央値を算出する、ように構成される、
ことを特徴とする付記39に記載のシステム。
(付記41)
前記分析装置は、前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを判断するユニットを備え、
該ユニットは、
前記第一の染色体と同じ方法で第二の染色体の中央値を算出し、
前記第一の染色体の中央値と前記第二の染色体の中央値とをt値検定することにより、前記第一の染色体と前記第二の染色体との差分値を得て、
前記差分値を所定の閾値と比較して、該差分値が該所定の閾値を下回ると、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があると判断する、ように構成される、
ことを特徴とする付記40に記載のシステム。
(付記42)
前記分析装置は、更に、前記第一の染色体の中央値と前記第二の染色体の中央値とを、次の式
(ここで、T i,j は、第一の染色体と第二の染色体との差分値を、μ i は、第一の染色体の中央値を、μ j は、第二の染色体の中央値を、σ i は、第一の染色体の各窓口に分布している配列データの数の標準偏差を、σ j は、第二の染色体の各窓口に分布している配列データの数の標準偏差を、n i は、第一の染色体における窓口の個数を、n j は、第二の染色体における窓口の個数を示す)
により、t値検定するユニットを含む、
ことを特徴とする付記41に記載のシステム。
(付記43)
前記分析装置は、更に、
前記配列の解析結果に基づいて、有核赤血球の所定の領域における核酸配列を決める核酸配列決定ユニット、
前記核酸配列決定ユニットと接続され、前記有核赤血球の所定の領域における核酸配列を、比較対照となる核酸配列と対比する対比ユニット、及び、
前記対比ユニットと接続され、当該対比結果に基づいて、有核赤血球の所定の領域に異常があるか否かを判断する異常判断ユニット、を含む、
ことを特徴とする付記35に記載のシステム。
(付記44)
前記対比ユニットは、比較対照となる核酸配列、好ましくは、健常者のゲノム配列を記憶している、
ことを特徴とする付記43に記載のシステム。
(付記45)
妊婦の生体試料から胎児有核赤血球を単離するステップ、
前記有核赤血球のゲノムの少なくとも一部の配列を決定して、配列の解析結果を得るステップ、及び、
前記配列の解析結果に基づいて、前記胎児有核赤血球のゲノム配列を決めるステップ、を含む、
ことを特徴とする胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記46)
前記妊婦の生体試料は妊婦末梢血である、
ことを特徴とする付記45に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記47)
検討対象として12-20週の在胎週数である妊婦の生体試料を採取する、
ことを特徴とする付記45又は46に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記48)
妊婦末梢血から前記胎児有核赤血球を単離するステップは、更に、
密度勾配遠心分離用試薬により、前記末梢血に密度勾配遠心分離を行って、単核細胞を得るステップ、及び、
有核赤血球の表面抗原を特異的に認識できる抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記単核細胞から有核赤血球を収集するステップ、を含む、
ことを特徴とする付記46又は47に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記49)
前記密度勾配遠心分離用試薬はポリショ糖であり、例えば800Xg、30分で前記勾配遠心を行う、
ことを特徴とする付記48に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記50)
前記単核細胞を得た後であって、CD71抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記有核赤血球が収集される前に、更に、残留する密度勾配遠心分離用試薬除去するように、1%のBSAを含むPBSバッファーで前記単核細胞を洗浄するステップを含み、
前記PBSバッファーは、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まない、
ことを特徴とする付記48に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記51)
1%のBSAを含むPBSバッファーで前記単核細胞を洗浄するステップは、更に、
前記単核細胞を1%のBSAを含むPBSバッファーと混合させて、単核細胞を含む浮遊液を得るステップ、及び、
前記単核細胞を含む浮遊液に、好ましくは、200Xg、5分で遠心分離を行って、上澄みを捨てて、洗浄した有核赤血球を得るステップ、を含む、
ことを特徴とする付記50に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記52)
前記抗体は、CD71を特異的に認識できる抗体である、
ことを特徴とする付記48に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記53)
有核赤血球1個の配列決定を行う、
ことを特徴とする付記45に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記54)
有核赤血球の全ゲノムの配列決定を行う、
ことを特徴とする付記45に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記55)
有核赤血球の全ゲノムの配列決定を行うことは、更に、
前記有核赤血球の全ゲノムを増幅して、増幅された全ゲノムを得るステップと、
増幅された全ゲノムで、全ゲノムシーケンシングライブラリを構築するステップと、
前記ライブラリーの配列を決定して、配列データからなる配列の解析結果を得るステップと、を含む、
ことを特徴とする付記54に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記56)
前記有核赤血球全ゲノムを、OmniPlex WGAで増幅させる、
ことを特徴とする付記55に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記57)
前記全ゲノムシーケンシングライブラリを構築するステップは、更に、
増幅された全ゲノムを断片化させて、DNA断片を得るステップと、
前記DNA断片にその末端を修復させて、末端が修復されたDNA断片を得るステップと、
末端が修復されたDNA断片の3’末端に塩基Aを加えて、粘着性末端Aを有するDNA断片を得るステップと、
前記粘着性末端Aを有するDNA断片をアダプターに結合させることにより、結合生成物を得るステップと、
前記結合生成物をPCR増幅させて、第二の増幅生成物を得るステップと、
前記第二の増幅生成物を精製して回収し、前記全ゲノムシーケンシングライブラリを構成する回収物を得るステップと、を含む、
ことを特徴とする付記55に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記58)
増幅された全ゲノムを、Covaris破砕機にて、断片化させる、
ことを特徴とする付記57に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記59)
前記DNA断片長は350bpである、
ことを特徴とする付記57に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記60)
5’→3’ポリメラーゼ活性と3’→5’エキソヌクレアーゼ活性とを有し、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、前記DNA断片にその末端を修復させる、
ことを特徴とする付記59に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記61)
クレノウ断片(3’−5’ exo−)を用いて、前記末端が修復されたDNA断片の3’末端に塩基Aを加える、
ことを特徴とする付記57に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記62)
T4 DNAポリメラーゼを用いて、前記粘着末端Aを有するDNA断片をアダプターに結合させる、
ことを特徴とする付記57に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
(付記63)
Hiseq2000、SOLiD、454、及び単一分子のシークエンシング装置から選ばれる少なくとも1つを用いて、前記配列決定を行う、
ことを特徴とする付記45に記載の胎児有核赤血球のゲノム配列を決める方法。
Claims (25)
- ゲノムの異常の有無を決定する方法であって、
妊婦の生体試料から胎児有核赤血球を単離するステップ、
前記有核赤血球1個の配列を解析して、配列の解析結果を得るステップ、
前記配列の解析結果に基づいて、前記胎児有核赤血球のゲノム配列を決めるステップ、及び、
前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを決定するステップを含み、
前記ゲノム異常は、染色体異数性であり、
前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを決定するステップは、更に、
有核赤血球の全ゲノムの配列を決定して、配列データからなる配列の解析結果を得るステップ、
所定の長さを独立して有する複数のウインドウに既知の第一の染色体の配列を分けるステップ、
前記配列の解析結果に係る配列データを、前記既知の第一の染色体の配列と対比して、各ウインドウに入る配列データの数を特定するステップ、
各ウインドウに入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定するステップ、及び、
前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを決定するステップ、を含み、
前記各ウインドウに入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定するステップは、更に、
各ウインドウに入る配列データの数に所定の重みを付けるステップ、及び、
前記第一の染色体の第一のパラメータとして、前記重みに基づいて各ウインドウに入る配列データの数を加重平均して中央値を算出するステップ、を含み、
前記所定の重みは、各ウインドウに入る配列データの数を、各ウインドウにおけるGC含有量にそれぞれ関連させることにより得られる、
ことを特徴とするゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記第一の染色体は、ヒト染色体における21番染色体、18番染色体、13番染色体、X染色体、及びY染色体から選ばれる少なくとも1種である、
ことを特徴とする請求項1に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記複数のウインドウは、同一の長さを有する、
ことを特徴とする請求項1または2に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記複数のウインドウは60KBの長さを有する、
ことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか1項に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記各ウインドウに入る配列データは、唯一適合の配列データである、
ことを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを決定するステップは、更に、
前記第一の染色体と同じ方法で第二の染色体の中央値を算出するステップ、
前記第一の染色体の中央値と前記第二の染色体の中央値とをt値検定することにより、前記第一の染色体と前記第二の染色体との差分値を得るステップ、及び、
前記差分値を所定の第一の閾値及び第二の閾値と比較して、該差分値が所定の閾値を下回ると、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があると決定し、該差分値が所定の閾値を上回ると、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性がないと決定するステップ、を含む、
ことを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記第二の染色体は1−12番ヒト染色体から選ばれるいずれか一種である、
ことを特徴とする請求項6に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記第一の染色体の中央値と前記第二の染色体の中央値とを、次の式
(ここで、Ti,jは、第一の染色体と第二の染色体との差分値を、μiは、第一の染色体の中央値を、μjは、第二の染色体の中央値を、σiは、第一の染色体の各ウインドウに分布している配列データ数の標準偏差を、σjは、第二の染色体の各ウインドウに分布している配列データ数の標準偏差を、niは、第一の染色体におけるウインドウの数を、njは、第二の染色体におけるウインドウの数を示す。)
により、t値検定する、
ことを特徴とする請求項6または7に記載のゲノムに異常の有無を決定する方法。 - 前記所定の第一の閾値は−4以下で、前記第二の閾値は−3.5以上である、
ことを特徴とする請求項6に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記ゲノム異常は、所定の領域での突然変異であり、
前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを決定するステップは、更に、
前記配列の解析結果に基づいて、有核赤血球の所定の領域における核酸配列を決めるステップ、
前記有核赤血球の所定の領域における核酸配列を、比較対照となる核酸配列と対比するステップ、及び、
該対比結果に基づいて、前記有核赤血球の所定の領域に異常があるか否かを決定するステップを含み、
前記所定の領域での突然変異は、挿入突然変異、欠失突然変異、置換突然変異、転座突然変異、逆位突然変異、コピー数変異および一塩基多型の少なくとも1種を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記比較対照となる核酸配列は、健常者のゲノム配列である、
ことを特徴とする請求項10に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記妊婦の生体試料は、12−20週の在胎週数である妊婦から採取した妊婦抹消血である、
ことを特徴とする請求項1に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 妊婦末梢血から前記胎児有核赤血球を単離するステップは、更に、
密度勾配遠心分離用試薬により、前記末梢血に密度勾配遠心分離を行って、単核細胞を得るステップ、及び、
有核赤血球の表面抗原を特異的に認識できる抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記単核細胞から有核赤血球を収集するステップ、を含み、
前記密度勾配遠心分離用試薬はポリショ糖であり、800Xg、30分で勾配遠心を行い、
前記抗体は、CD71を特異的に認識できる抗体である、
ことを特徴とする請求項12に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記単核細胞を得た後であって、CD71抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記有核赤血球を収集する前に、更に、残留する密度勾配遠心分離用試薬を除去するように、1%のBSAを含むPBSバッファーで前記単核細胞を洗浄するステップを含み、
前記PBSバッファーは、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まず、
前記1%のBSAを含むPBSバッファーで前記単核細胞を洗浄するステップは、更に、
前記単核細胞を1%のBSAを含むPBSバッファーと混合させて、単核細胞を含む浮遊液を得るステップ、及び、
前記単核細胞を含む浮遊液に、200Xg、5分で遠心分離を行って、上澄みを捨てて、洗浄した有核赤血球を得るステップ、を含む、
ことを特徴とする請求項13に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記配列の解析結果に基づいて、前記胎児有核赤血球のゲノム配列を決めるステップは、有核赤血球の全ゲノムの配列の決定を行い、
前記有核赤血球の全ゲノムを増幅して、増幅された全ゲノムを得るステップと、
増幅された全ゲノムで、全ゲノムシーケンシングライブラリを構築するステップと、
前記ライブラリの配列を決定して、配列データからなる配列の解析結果を得るステップと、を更に含み、
前記全ゲノムシーケンシングライブラリを構築するステップは、
増幅された全ゲノムを断片化させて、DNA断片を得るステップと、
前記DNA断片にその末端を修復させて、末端が修復されたDNA断片を得るステップと、
末端が修復されたDNA断片の3’末端に塩基Aを加えて、粘着性末端Aを有するDNA断片を得るステップと、
前記粘着性末端Aを有するDNA断片をアダプターに結合させて、結合生成物を得るステップと、
前記結合生成物をPCR増幅させて、第二の増幅生成物を得るステップと、
前記第二の増幅生成物を精製して回収し、前記全ゲノムシーケンシングライブラリを構成する回収物を得るステップと、を含む、
ことを特徴とする請求項1に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 前記DNA断片長は350bpである、
ことを特徴とする請求項15に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 5’→3’ポリメラーゼ活性と3’→5’エキソヌクレアーゼ活性とを有し、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、前記DNA断片にその末端を修復させる、
ことを特徴とする請求項15または16に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - クレノウ断片(3’−5’ exo−)を用いて、前記末端が修復されたDNA断片の3’末端に塩基Aを加える、
ことを特徴とする請求項15乃至17のいずれか1項に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - T4 DNAポリメラーゼを用いて、前記粘着性末端Aを有するDNA断片をアダプターに結合させる、
ことを特徴とする請求項15乃至18のいずれか1項に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - Hiseq2000、SOLiD、454、及び単一分子のシークエンシング装置から選ばれる少なくとも1つを用いて、前記配列決定を行う、
ことを特徴とする請求項1に記載のゲノムの異常の有無を決定する方法。 - 妊婦の生体試料から胎児有核赤血球を単離する有核赤血球の分離装置、
前記有核赤血球1個の配列を解析して、配列の解析結果を得る配列決定装置、及び、
前記配列決定装置から配列の解析結果を受信するように該配列決定装置に接続され、前記配列の解析結果に基づいて、前記有核赤血球のゲノムに異常があるか否かを判断する分析装置、を含み、
前記ゲノム異常は、染色体異数性であり、
前記分析装置は、
所定の長さを独立して有する複数のウインドウに既知の第一の染色体の配列を分け、
前記配列の解析結果に係る配列データを、前記既知の第一の染色体の配列と対比して、各ウインドウに入る配列データの数を特定し、
各ウインドウに入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定し、
前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを判断する、ように構成され、
前記分析装置は、前記各ウインドウに入る配列データの数に基づいて、第一のパラメータを決定するユニットを備え、
該ユニットは、
各ウインドウに入る配列データの数に所定の重みを付け、
前記第一の染色体の第一のパラメータとして、前記重みに基づいて各ウインドウに入る配列データの数を加重平均して中央値を算出する、ように構成され、
前記所定の重みは、各ウインドウに入る配列データの数を、各ウインドウにおけるGC含有量にそれぞれ関連させることにより得られる、
ことを特徴とするゲノムの異常の有無を判断するシステム。 - 前記有核赤血球の分離装置は、更に、
密度勾配遠心分離用試薬により、妊婦の末梢血である妊婦の生体試料に密度勾配遠心分離を行って、単核細胞を得る単核細胞の分離ユニットと、
該単核細胞の分離ユニットに接続され、有核赤血球の表面抗原を特異的に認識できる抗体が固定化された磁気ビーズにより、前記単核細胞から有核赤血球を収集する磁気収集ユニットと、を含み、
シーケンサーは、Hiseq2000、SOLiD、454、及び単一分子のシークエンシング装置から選ばれる少なくとも1つであり、
更に、前記配列決定装置に接続され、該配列決定装置に配列を決定する全ゲノムシーケンシングライブラリを提供する全ゲノムシーケンシングライブラリの構築装置を含み、
該全ゲノムシーケンシングライブラリの構築装置は、
前記有核赤血球の分離装置に接続され、有核赤血球を受け取って溶解させて、有核赤血球の全ゲノムを得る有核赤血球の溶解ユニット、
前記有核赤血球の溶解ユニットに接続され、有核赤血球の全ゲノムを増幅させて、増幅された全ゲノムを得る全ゲノムの増幅ユニット、及び、
増幅された全ゲノムを受け取るとともに、全ゲノムシーケンシングライブラリを、前記増幅された全ゲノムで構築するシーケンシングライブラリの構築ユニット、を含む、
ことを特徴とする請求項21に記載のシステム。 - 前記分析装置は、前記第一のパラメータに基づいて、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があるか否かを判断するユニットを備え、
該ユニットは、
前記第一の染色体と同じ方法で第二の染色体の中央値を算出し、
前記第一の染色体の中央値と前記第二の染色体の中央値とを、次の式
(ここで、Ti,jは、第一の染色体と第二の染色体との差分値を、μiは、第一の染色体の中央値を、μjは、第二の染色体の中央値を、σiは、第一の染色体の各ウインドウに分布している配列データの数の標準偏差を、σjは、第二の染色体の各ウインドウに分布している配列データの数の標準偏差を、niは、第一の染色体におけるウインドウの個数を、njは、第二の染色体におけるウインドウの個数を示す)
により、t値検定することにより、前記第一の染色体と前記第二の染色体との差分値を得て、
前記差分値を所定の閾値と比較して、該差分値が該所定の閾値を下回ると、前記有核赤血球の前記第一の染色体に対する異数性があると判断する、ように構成される、
ことを特徴とする請求項21または22に記載のシステム。 - 前記分析装置は、更に、
前記配列の解析結果に基づいて、有核赤血球の所定の領域における核酸配列を決める核酸配列決定ユニット、
前記核酸配列決定ユニットと接続されるとともに、比較対照となる核酸配列を記憶しており、前記有核赤血球の所定の領域における核酸配列を、比較対照となる核酸配列と対比する対比ユニット、及び、
前記対比ユニットと接続され、当該対比結果に基づいて、有核赤血球の所定の領域に異常があるか否かを判断する異常判断ユニット、を含む、
ことを特徴とする請求項21に記載のシステム。 - 前記比較対照となる核酸配列は、健常者のゲノム配列である、
ことを特徴とする請求項24に記載のシステム。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2011/084165 WO2013086744A1 (zh) | 2011-12-17 | 2011-12-17 | 确定基因组是否存在异常的方法及系统 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015501646A JP2015501646A (ja) | 2015-01-19 |
JP2015501646A5 JP2015501646A5 (ja) | 2015-07-02 |
JP6092891B2 true JP6092891B2 (ja) | 2017-03-15 |
Family
ID=48611840
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014546269A Active JP6092891B2 (ja) | 2011-12-17 | 2011-12-17 | ゲノムの異常の有無を決定する方法及び判断するシステム |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20140336075A1 (ja) |
EP (1) | EP2792751B1 (ja) |
JP (1) | JP6092891B2 (ja) |
CN (1) | CN103987856B (ja) |
ES (1) | ES2699743T3 (ja) |
HK (1) | HK1196857A1 (ja) |
RU (1) | RU2599419C2 (ja) |
WO (1) | WO2013086744A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016042830A1 (ja) * | 2014-09-16 | 2016-03-24 | 富士フイルム株式会社 | 胎児染色体の解析方法 |
JP2016067268A (ja) * | 2014-09-29 | 2016-05-09 | 富士フイルム株式会社 | 胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法 |
CN107075582A (zh) * | 2014-09-29 | 2017-08-18 | 富士胶片株式会社 | 胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法及判别系统 |
US10301660B2 (en) | 2015-03-30 | 2019-05-28 | Takara Bio Usa, Inc. | Methods and compositions for repair of DNA ends by multiple enzymatic activities |
WO2016161081A1 (en) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | Fluxion Biosciences, Inc. | Molecular characterization of single cells and cell populations for non-invasive diagnostics |
CN104894268B (zh) * | 2015-06-05 | 2018-02-09 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 定量样本中源自细胞凋亡的dna浓度的方法及其应用 |
CN105019034A (zh) * | 2015-07-11 | 2015-11-04 | 浙江大学 | 高通量转录组文库构建方法 |
CN108073790B (zh) * | 2016-11-10 | 2022-03-01 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种染色体变异检测装置 |
WO2018148903A1 (zh) * | 2017-02-16 | 2018-08-23 | 上海亿康医学检验所有限公司 | 泌尿系统肿瘤的辅助诊断方法 |
CN108660197A (zh) * | 2017-04-01 | 2018-10-16 | 深圳华大基因科技服务有限公司 | 一种二代序列基因组重叠群的组装方法和系统 |
CN107217308A (zh) * | 2017-06-21 | 2017-09-29 | 北京贝瑞和康生物技术股份有限公司 | 一种用于检测染色体拷贝数变异的测序文库构建方法和试剂盒 |
CN109402247B (zh) * | 2018-11-06 | 2020-04-07 | 苏州首度基因科技有限责任公司 | 一种基于dna变异计数的胎儿染色体检测系统 |
DE102020116178A1 (de) * | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Analytik Jena Gmbh | Verfahren zum Erkennen einer Amplifikationsphase in einer Amplifikation |
CN112652359B (zh) * | 2020-12-30 | 2024-05-28 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 染色体异常检测装置 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0778899A4 (en) * | 1994-09-20 | 2001-08-29 | Miltenyi Biotech Inc | ENRICHMENT OF FETAL CELLS FROM MATERNAL BLOOD |
US20050277147A1 (en) * | 2004-06-11 | 2005-12-15 | Ameet Patki | Identifying chromosomal abnormalities in cells obtained from follicular fluid |
CN101305087A (zh) * | 2005-09-15 | 2008-11-12 | 阿尔特弥斯康复公司 | 用于磁富集细胞和其他颗粒的装置和方法 |
EP2589668A1 (en) * | 2006-06-14 | 2013-05-08 | Verinata Health, Inc | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
CN101675169B (zh) * | 2006-06-14 | 2018-01-02 | 维里纳塔健康公司 | 使用样品拆分和dna标签进行稀有细胞分析 |
WO2008015396A2 (en) * | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Solexa Limited | Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers |
CA2737643C (en) * | 2008-09-20 | 2020-10-06 | Hei-Mun Fan | Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing |
CA2748030A1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Arnold R. Oliphant | Methods and genotyping panels for detecting alleles, genomes, and transcriptomes |
WO2011091063A1 (en) * | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Verinata Health, Inc. | Partition defined detection methods |
-
2011
- 2011-12-17 WO PCT/CN2011/084165 patent/WO2013086744A1/zh active Application Filing
- 2011-12-17 RU RU2014129321/10A patent/RU2599419C2/ru active
- 2011-12-17 ES ES11877603T patent/ES2699743T3/es active Active
- 2011-12-17 CN CN201180075423.4A patent/CN103987856B/zh active Active
- 2011-12-17 US US14/365,847 patent/US20140336075A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-17 JP JP2014546269A patent/JP6092891B2/ja active Active
- 2011-12-17 EP EP11877603.8A patent/EP2792751B1/en active Active
-
2014
- 2014-09-24 HK HK14109621.2A patent/HK1196857A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2792751A4 (en) | 2015-07-29 |
US20140336075A1 (en) | 2014-11-13 |
EP2792751B1 (en) | 2018-09-05 |
CN103987856A (zh) | 2014-08-13 |
RU2599419C2 (ru) | 2016-10-10 |
CN103987856B (zh) | 2016-08-24 |
ES2699743T3 (es) | 2019-02-12 |
EP2792751A1 (en) | 2014-10-22 |
JP2015501646A (ja) | 2015-01-19 |
HK1196857A1 (zh) | 2014-12-24 |
WO2013086744A1 (zh) | 2013-06-20 |
RU2014129321A (ru) | 2016-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6092891B2 (ja) | ゲノムの異常の有無を決定する方法及び判断するシステム | |
JP6039034B2 (ja) | 非侵襲的出生前診断に有用な母体試料由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物 | |
JP6634105B2 (ja) | 非侵襲性の出生前診断のために有用な、母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく濃縮のためのプロセスおよび組成物 | |
US20170363628A1 (en) | Means and methods for non-invasive diagnosis of chromosomal aneuploidy | |
Hahn et al. | Determination of fetal chromosome aberrations from fetal DNA in maternal blood: has the challenge finally been met? | |
JP6161607B2 (ja) | サンプルにおける異なる異数性の有無を決定する方法 | |
JP5938484B2 (ja) | ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法、システム及びコンピューター読み取り可能な記憶媒体 | |
JP5964432B2 (ja) | 単細胞染色体の非整倍数性を確定する方法及びシステム | |
US20190309345A1 (en) | Clinical application of cell free dna technologies to non-invasive prenatal diagnosis and other liquid biopsies | |
WO2024076469A1 (en) | Non-invasive methods of assessing transplant rejection in pregnant transplant recipients |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150901 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151130 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20151228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160201 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160705 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161027 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161110 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20161205 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170207 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170209 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6092891 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |