CN105019034A - 高通量转录组文库构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量转录组文库构建方法，包括以下步骤：1)、从总RNA中分离mRNA；2)、将mRNA打碎成片段；3)、对片段化后的mRNA加poly？A尾：利用polyA聚合酶以及ATP，在片段化的mRNA的3’端加上碱基A；4)、逆转录生成单链cDNA：设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物，与mRNA的polyA结合，并逆转录，加热变性后生成单链cDNA；5)、单链cDNA的环化：在单链DNA连接酶的作用下，单链cDNA环化，生成一个环；6)、PCR富集，文库构建：利用环上的两段特异性序列，设计两段特异性引物，通过一轮PCR，制备转录组文库。

Description

高通量转录组文库构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是基于分子生物学的基因组学检测技术，提供了一种高通量测序转录组文库构建方法。

背景技术

转录组是特定物种、组织或细胞类型转录的所有RNA(转录本)的集合。通过比较转录组或基因表达谱的研究以揭示生物学现象或疾病发生的分子机制是高通量组学研究的一个常用策略。利用高通量测序技术研究转录组在全面快速得到基因表达谱变化的同时，还可以通过测定的序列信息精确地分析转录本的cSNP(编码序列单核苷酸多态性)、可变剪接等序列及结构变异，另外对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有其独特的优势。目前转录组的研究方法主要包括基因芯片和二代测序，而基因芯片只能对已知物种的转录组学研究，而二代测序则可以对已知和未知物种都可以做转录组学研究，基于第二代测序技术的转录组测序，又称为RNA-Seq。

转录组谱可以提供什么条件下什么基因表达的信息，并据此推断相应未知基因的功能，揭示特定调节基因的作用机制。通过这种基于基因表达谱的分子标签，不仅可以辨别细胞的表型归属，还可以用于疾病的诊断。

而转录组文库的构建，传统方法较为繁琐，步骤包括mRNA的分离，mRNA片段化，逆转录成cDNA，双链合成，末端补齐，末尾加A，加接头，PCR富集等步骤。同时对RNA的起始量也有较高的要求，一般要求微克级别的总RNA。因此，在一定条件下限定了转录组的应用，特别在一些单细胞转录组学研究，传统技术无法通过如此少量的RNA中构建文库。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高通量转录组文库的构建方法，采用本发明的方法RNA起始量可以做到ng级别，操作步骤比传统方法更简便。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高通量转录组文库构建方法(如图1所示)：

逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物为带有polyT以及两段特异性序列的引物，

所述特异性引物为：3'-(T)16-TCTAGCCTTC TCGTGTGCAG-GTGCTGCGAGAAGGCTAGA--5'。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的改进：

PCR富集时所用的两段特异性引物为：

引物F：

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCT3’；

备注说明：其中斜体加下划线部分与“逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物中的其中一段”互补；

引物R：

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCA 3’。

备注说明：其中斜体加下划线部分与“逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物中的其中一段”相同，小写且下划线部分为高通量测序时用的barcode序列。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进：

滚环扩增中所用的引物为：

RCA-F引物agatcggaagagcacacgtc

RCA-R引物agatcggaagagcgtcgtgt。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进，该方法包括以下步骤：

1)、mRNA的分离：

从总RNA中分离mRNA；

2)、mRNA的片段化：

将mRNA打碎成片段(为约180-300bp的片段)；

3)、对片段化后的mRNA加poly A尾：

利用polyA聚合酶以及ATP，在片段化的mRNA的3’端加上碱基A(约为20-50个碱基A)；

4)、逆转录生成单链cDNA：

设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物(即，上文中所述的逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物)，与mRNA的polyA结合，并逆转录，加热变性后生成单链cDNA；

5)、单链cDNA的环化：

在单链DNA连接酶的作用下，单链cDNA环化，生成一个环；

6)、PCR富集，文库构建：

利用环上的两段特异性序列，设计两段特异性引物(即，上文中所述的PCR富集时所用的两段特异性引物)，通过一轮PCR，制备转录组文库。

作为本发明的高通量转录组文库构建方法的进一步改进：

在步骤5)和步骤6)之间补充如下的滚环扩增：

通过环上的两段特异性序列(即，上文中所述的滚环扩增中所用的引物)，利用Phi29聚合酶，进行滚环扩增，从而生成1千到几万倍的含两段特异性序列的DNA单链。

备注说明：该步为可选步骤，如果起始RNA量达到微克级，则可省略该步骤，如果起始RNA量只有纳克级，则需要此步。

本发明具体如下：

步骤1)的mRNA的分离：

真核生物的mRNA的3’端有polyA结构，因此可以利用带oligo(dT)的磁珠从总RNA中分离mRNA；

步骤2)的mRNA的片段化：

在mRNA中，加入片段化缓冲液，94℃4分钟，将mRNA打碎成1约80-300bp的片段；

步骤3)的对片段化后的mRNA加poly A尾：

利用polyA聚合酶以及ATP，在片段化的mRNA的3’端加上约20-50个碱基A；

步骤4)的逆转录生成单链cDNA：

设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物，与mRNA的polyA结合，并逆转录，加热变性后生成单链cDNA。

步骤5)的单链cDNA的环化：

在单链DNA连接酶的作用下，单链cDNA环化，生成一个环。

滚环扩增：

该步为可选步骤，如果起始RNA量达到微克级，则可省略该步骤，如果起始RNA量只有纳克级，则需要此步。通过环上的两段特异性序列，利用Phi29聚合酶，进行滚环扩增，可以生成大量含两段特异性序列的DNA单链。

步骤6)的PCR富集，文库构建。

利用环上的两段特异性序列，设计两段特异性引物，通过一轮PCR，就制备成功转录组文库。

本发明具有如下技术优势：

1、比传统的文库构建方法更为精简，传统方法需要mRNA分离，mRNA片段化，逆转录，二链补齐，末端修复，加A尾，加接头，胶回收，PCR富集等步骤。利用本发明的流程，可以节省约一半时间；

2、本发明的流程，可以对极低的RNA进行文库构建，传统方法需要几百纳克到几个微克，而本方法可以对几个纳克的RNA进行文库构建，对RNA起始量要求比传统方法纸了10-100倍。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1本发明构建二代测序文库的流程和原理图；

图2为实施例1得到的转录组文库的电泳图；

图3为实施例2得到的转录组文库的电泳图；

图4为对比例1得到的转录组文库的电泳图；

图5为对比例2得到的转录组文库的电泳图；

图6为对比例3得到的转录组文库的电泳图。

具体实施方式

实施例1、应用本发明，对小鼠肝脏来源的1μg的总RNA进行转录组建库。

一、实验方法与步骤：

1、mRNA的分离(以下试剂可从Invitrogen公司购得，货号:610-02)

以1μg的总RNA起始，按照life公司官方操作说明进行mRNA的分离，见https://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/mrna-protocols/dynabeads-oligo-dt-25.html#prot2。

用20μl的无核酸酶的水溶解，得mRNA；

2、mRNA的片段化(以下试剂可从Ambion公司购得，货号AM8740)

按以下体系加入试剂

10X片段化缓冲液     2μL

mRNA                18μL

混合均匀后，在PCR仪中94℃2分钟，然后迅速置入冰上，并加入1μL 3M pH 5.2的醋酸钠溶液，2μL糖原(5ug/μL,Ambion公司，货号AM9510)，以及30μL无水乙醇，放置于-80℃30分钟。然后12000rpm离心30分钟，去上清，mRNA沉淀用11μL的无核酸酶的水溶解；得片段化RNA；

此片段化RNA约为180-300bp。

3、mRNA加polyA尾(以下试剂可从NEB公司购得，货号M076S)

按以下体系加入试剂

总共20μL，混匀后于37℃30分钟，并加入10mM的EDTA终止反应，并用Qiagen的DNA纯化试剂盒(Qiagen公司，货号28104)纯化，用11μL的水溶解，得加了polyA的RNA；

此加了polyA的RNA，是在片段化的mRNA的3’端加上约20-50个的碱基A。

4、逆转录(以下试剂可从invitrogen公司购得，货号18080-044)

按以下体系加入试剂

加了polyA的RNA       10μL

特异性引物           2μL

无核酸酶的水         2μL

65℃温育5分钟，然后放于冰上；

再加入以下试剂

5X缓冲液     4μL

逆转录酶     1μL

dNTP(10mM)   1μL

用水补齐到20μL，在PCR仪上42℃1小时，然后65℃5分钟终止反应。

上述特异性引物为：3'-(T)16-TCTAGCCTTC TCGTGTGCAG-GTGCTGCGAGAAGGCTAGA--5'；

其中5’端为磷酸化修饰，3’端为16个连续的T，以及中间两段各20bp的通用特异性序列。

用Qiagen的DNA纯化试剂盒(以上试剂可从Qiagen公司购得，货号28104)纯化，用11μL的水溶解，得单链cDNA。

5.单链cDNA环化(以下试剂可从epicenter公司购得，货号CL4111K)

按以下体系加入试剂

PCR仪上60℃1小时，然后80℃10分钟终止反应；得环化产物。

6.PCR富集(以下试剂可从NEB公司购得，货号M0494S)

按以下体系加入试剂

混匀后，PCR扩增，扩增程序如下：

引物F：

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCT3’其中斜体加下划线部分与步骤4中的其中一段特异性引物互补。

引物R：

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCA 3’

其中斜体加下划线部分与步骤4中的其中一段特异性引物相同，小写且下划线部分为高通量测序时用的barcode序列。

用Qiagen的DNA纯化试剂盒(Qiagen公司，货号28104)纯化；得PCR富集产物，此产物即为制备好的高通量测序文库。

7、文库质检

利用紫外分光光度计检测文库浓度，为40ng/ul,OD260/280＝1.87。

利用agilent 2100进行电泳检测，具体操作步骤见http://www.chem.agilent.com/library/usermanuals/Public/G2938-90014_DNA1000Assay_KG.pdf得到峰值为490bp的文库。如图2所示。

实施例2、应用本发明，对小鼠肝脏来源的10ng的总RNA进行转录组建库。

步骤1-5同实施例1；得到环化产物---环化后的单链DNA。

步骤6、滚环扩增(以下试剂可从NEB公司购得，货号M0269S)

按以下体系加入试剂

RCA-F引物agatcggaagagcacacgtc

RCA-R引物agatcggaagagcgtcgtgt。

混匀，然后在PCR仪上30℃45分钟；得到环滚扩增产物。

步骤7、

按以下体系加入试剂

混匀后，PCR扩增，扩增程序如下：

备注说明：引物F和引物R，同实施例1。

步骤8：利用紫外分光光度计检测文库浓度，为26ng/μl,OD260/280＝1.81。

利用agilent 2100进行电泳检测，得到峰值为491bp的文库。如图3所示。

结果显示，本发明可以用于二代测序的文库制备，使用步骤比传统方法少，并且改进了微量RNA的建库步骤，增加了滚环扩增步骤，能增加扩增效率，可以对10ng的总RNA进行建库。

对比例1：利用Illumina官方的试剂盒和步骤(试剂盒货号：15026495，详细操作步骤见http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/documentation.html)，对小鼠肝脏来源的10ng的总RNA进行转录组建库。步骤8中利用agilent 2100进行电泳检测，显示无条带，如图4所示，说明官方的试剂盒和实验步骤，无法对低至10ng的总RNA进行文库构建。

对比例2：将实施例2步骤4)中的特异性引物分别改成如下引物：3'-(T)16-TCTAGCCTTCTCGTGTGCAG-GTGCTGCGAG AAGGCTAGA-5'，5’端不进行磷酸化修饰，其余完全同实施例2；

则在第五步的单链DNA环化步骤中，由于5’端没有磷酸基团，因此，无法与3’的-OH生成磷酸二脂键，无法闭合成环，因此，第七步PCR富集后，得不到任何产物。步骤8中利用agilent 2100进行电泳检测，显示无条带，如图5所示。

对比例3：将实施例2步骤4)中的特异性引物分别改成如下引物：3'-(T)16-TCTAGCCTTCTCGTGTGCAG-CTGCTGCGAG AAGGCTAGA-5'，将中间的一个G碱基改变为C，其余完全同实施例1；

则在第七步中，由于引物从3’端开始退火形成双链，由于一个碱基不匹配，导致结合效率非常差，导致该步无法得到能检测出的产物浓度。步骤8中利用agilent 2100进行电泳检测，显示无条带，如图6所示。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.高通量转录组文库构建方法，其特征是：

逆转录生成单链cDNA时所用的特异性引物为带有polyT以及两段特异性序列的引物，

所述特异性引物为：3'-(T)16-TCTAGCCTTC TCGTGTGCAG-GTGCTGCGAGAAGGCTAGA--5'。

2.根据权利要求1所述的高通量转录组文库构建方法，其特征是：

PCR富集时所用的两段特异性引物为：

引物F：

5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’；

引物R：

5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcgtgatGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT3’。

3.根据权利要求2所述的高通量转录组文库构建方法，其特征是：

滚环扩增中所用的引物为：

RCA-F引物agatcggaagagcacacgtc

RCA-R引物agatcggaagagcgtcgtgt。

4.根据权利要求2或3所述的高通量转录组文库构建方法，其特征是该方法包括以下步骤：

1)、mRNA的分离：

从总RNA中分离mRNA；

2)、mRNA的片段化：

将mRNA打碎成片段；

3)、对片段化后的mRNA加poly A尾：

利用polyA聚合酶以及ATP，在片段化的mRNA的3’端加上碱基A；

4)、逆转录生成单链cDNA：

设计一条带有polyT以及两段特异性序列的引物，与mRNA的polyA结合，并逆转录，加热变性后生成单链cDNA；

5)、单链cDNA的环化：

在单链DNA连接酶的作用下，单链cDNA环化，生成一个环；

6)、PCR富集，文库构建：

利用环上的两段特异性序列，设计两段特异性引物，通过一轮PCR，制备转录组文库。

5.根据权利要求4所述的高通量转录组文库构建方法，其特征是：

在步骤5)和步骤6)之间补充如下的滚环扩增：

通过环上的两段特异性序列，利用Phi29聚合酶，进行滚环扩增，从而生成1千到几万倍的含两段特异性序列的DNA单链。