CN107075582A - 胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法及判别系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法、以及胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统，所述胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法为具有分析从母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA的工序的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，其中，胎儿为根据超声波检查的结果，分类为选自单胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎、单绒毛膜双羊膜双胞胎及双绒毛膜双羊膜双胞胎中的任一情况的胎儿，且根据分类情况使分析DNA的有核红细胞候选细胞的个数最优化。

Description

胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法及判别系统
技术领域
本发明涉及一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法及系统或装置。更详细而言，本发明涉及一种基于从母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA分析的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法及系统或装置。
背景技术
为了诊断胎儿的染色体异常和基因异常，以往作为产前诊断，进行了通过羊水穿刺和绒毛采集来采集胎儿细胞，由此调查染色体和基因的方法。但是，这些方法中，虽然概率较小，但存在被检体的采集引起的流产等并发症风险，这一点作为重大问题而被指出。
近年来，得知胎儿细胞在母体的血液中移动，与源自母体的血液细胞一同在母体中循环。通过重现性良好且可靠地分析这种母体血液中的胎儿细胞的染色体的DNA，能够实现无流产可能性的安全的产前诊断。然而，理解到母体的血液中存在的胎儿细胞(胎儿有核红细胞)在母体血液数mL中仅存在1个左右，对进行该安全的产前诊断而言，可靠地获取胎儿细胞(胎儿有核红细胞)是非常重大的课题。并且，得知妊娠母体的血液中还存在源自母亲的有核红细胞，对进行该安全的产前诊断而言，分离源自母亲的有核红细胞与源自胎儿的有核红细胞(胎儿有核红细胞)也是需解决的课题。
作为着眼于母体血液中的有核红细胞的胎儿的产前诊断方法，专利文献1中记载有如下方法，即，对从母体血液通过过滤器分离的有核细胞的基因组进行扩增，利用多态性标志物及Y染色体标志物鉴定源自胎儿的细胞，并通过FISH(Fluorescence in situhybridization)法检测源自胎儿的细胞的染色体异常。
并且，专利文献2中记载有如下方法，即，对多个胎儿细胞的DNA的平行同源的基因进行扩增，通过测序仪确定扩增产物的量并根据等位基因的比分析数量异常的三体。
并且，专利文献3中记载有检测异卵双胞胎的方法，从母体血液不区分源自母体及源自胎儿而采集有核红细胞的混合样本鉴定胎儿标识符及父性等位基因。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2004-533243号公报
专利文献2：日本特表2004-531271号公报
专利文献3：日本特表2012-513217号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
如上所述，公开有针对单胎及异卵双胞胎着眼于母体血液中的有核红细胞的胎儿的产前诊断方法，但公开有单胎的产前诊断方法的专利文献1的方法中，当为多胞胎时，存在无法判断需分析多少细胞的问题，专利文献2的方法中，存在无法进行母体血液中的胎儿细胞的选择、及源自母体的细胞与源自胎儿的细胞的识别的问题。而且，公开有异卵双胞胎的产前诊断方法的专利文献3的方法中，由于是从源自母体的细胞及源自胎儿的细胞的混合样本的检测，因此存在无法掌握双胞胎的各自的遗传信息的来历的问题。
另一方面，作为以往的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，进行检测母体血液中含有微量的源自胎儿的核酸的方法，但胎儿为双胞胎时，以往的方法中，很难判别源自胎儿的核酸是源自双胞胎中的一方还是源自双方。
并且，还已知有分离母体血液中包含的源自胎儿的有核红细胞来检测染色体非整倍性的方法，当为双胞胎时，无法掌握其卵性和性别时，应分离的细胞数不明确，导致仅检测出源自一个胎儿的有核红细胞，有可能错过另一个胎儿，因此所需的细胞分离数不明确，因此存在操作效率性较差等问题。
因此，本发明的课题在于提供一种在胎儿为单胎或双胞胎时能够检测各胎儿的染色体非整倍性的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法。
并且，本发明的课题还在于提供一种胎儿为单胎或双胞胎时能够检测各胎儿的染色体非整倍性的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，其结果发现通过如下方法，在胎儿为单胎或双胞胎时能够检测各胎儿的染色体非整倍性，并完成了本发明，即，一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，其具有分析从母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA的工序，其中，胎儿为根据超声波检查的结果，分类为选自单胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎、单绒毛膜双羊膜双胞胎及双绒毛膜双羊膜双胞胎中的任一情况的胎儿，且根据上述分类使分析DNA的有核红细胞候选细胞的个数最优化。
并且，本发明人等发现根据如下胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统，在胎儿为单胎或双胞胎时能够检测各胎儿的染色体非整倍性，并完成了本发明，即一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统，其包含：胎儿信息获取单元，用于获取基于超声波检查结果的胎儿的分类信息；形态信息获取单元，获取母体血液样本中包含的细胞的形态信息；细胞分离单元，分离母体血液样本中包含的细胞；PCR(聚合酶链反应)装置，对所分离的细胞进行全基因组扩增；多重PCR装置，对全基因组扩增产物进行多重PCR；及DNA测序装置，解读PCR扩增产物的碱基序列并测量序列读取数。
即，本发明提供以下的(1)～(5)。
(1)一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，其具有分析从母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA工序，其中，
胎儿为根据超声波检查结果，分类为选自单胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎、单绒毛膜双羊膜双胞胎及双绒毛膜双羊膜双胞胎中的任一情况的胎儿，且根据分类使分析DNA的有核红细胞候选细胞的个数最优化。
(2)根据(1)所述的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，其中，
最优化包括将分析DNA的有核红细胞候选细胞的个数设定为如下的内容，即，
单胎的情况的个数≤单绒毛膜单羊膜双胞胎的情况的个数＜单绒毛膜双羊膜双胞胎的情况的个数＜双绒毛膜双羊膜双胞胎的情况的个数。
(3)根据(1)或(2)所述的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，分析从母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA的工序包括以下工序：
＜工序1＞获取下述a)～d)所示的、基于通过超声波检查获得的膜性信息的胎儿的分类信息的工序；
a)单胎
b)单绒毛膜单羊膜双胞胎
c)单绒毛膜双羊膜双胞胎
d)双绒毛膜双羊膜双胞胎
＜工序2＞根据分类信息确定从母体血液样本分离的有核红细胞候选细胞的个数的工序；
＜工序3＞从母体血液样本分离上述个数的有核红细胞候选细胞的工序；
＜工序4＞对所分离的有核红细胞候选细胞分别进行全基因组扩增的工序；
＜工序5＞利用全基因组扩增产物进行基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认的工序；
＜工序6＞对通过基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认来检测出的源自胎儿的有核红细胞的基因型的数量与根据胎儿的分类信息推断出的胎儿的基因型的数量进行比较，一致时选择进入下一工序，不一致时选择返回工序3的工序；及
＜工序7＞判别源自胎儿的有核红细胞的染色体非整倍性的工序。
(4)一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统，其包括：胎儿信息获取单元，用于获取基于超声波检查结果的胎儿的分类信息；形态信息获取单元，根据胎儿的分类信息获取母体血液样本中包含的细胞的形态信息；细胞分离单元，分离母体血液样本中包含的细胞；PCR装置，对所分离的细胞进行全基因组扩增；多重PCR装置，对全基因组扩增产物进行多重PCR；及DNA测序装置，解读PCR扩增产物的碱基序列并测量序列读取数。
(5)根据(4)所述的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统，其中，根据通过胎儿信息获取单元获取的信息，确定要分离的有核红细胞候选细胞的个数，
根据通过形态信息获取单元获取的信息，选择要分离的有核红细胞候选细胞，
通过细胞分离单元分离有核红细胞候选细胞，
利用PCR装置进行所分离的有核红细胞候选细胞的全基因组扩增，
利用多重PCR装置进行多重PCR，
利用DNA测序装置进行通过多重PCR获得的DNA片段的碱基序列解读及序列读取数的测量，对通过基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认来检测出的有核红细胞候选细胞的基因型的数量与根据胎儿的分类推断出的胎儿的基因型的数量进行比较，一致时选择进入下一工序，不一致时选择返回分离有核红细胞候选细胞的工序并重复进行之后的工序。
发明效果
根据本发明，能够提供一种胎儿为单胎或双胞胎时，能够检测各胎儿的染色体非整倍性的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法。
并且，根据本发明，能够提供一种胎儿为单胎或双胞胎时，能够检测各胎儿的染色体非整倍性的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统。
以往的利用母体血浆、血清中源自无细胞胎儿的核酸的染色体非整倍性判别中，很难检测保有染色体非整倍性的胎儿或保有染色体非整倍性的胎儿的比例，但根据本发明，能够根据基于超声波检查的膜性信息确定多胞胎的卵性，确定伴随卵性信息的胎儿核酸的处理数，通过该确定处理数的基因分析准确地判别各个胎儿的染色体非整倍性，并且检测保有染色体非整倍性的胎儿的比例。
附图说明
图1是表示本发明的具体实施方式的概要的流程图。
具体实施方式
[胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法]
本发明的胎儿的非侵入性判别方法如下。
[1]一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，其具有分析从母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA的工序，其中，上述胎儿为根据超声波检查结果，分类为选自单胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎、单绒毛膜双羊膜双胞胎及双绒毛膜双羊膜双胞胎中的任一情况的胎儿，且根据上述分类使分析上述DNA的有核红细胞候选细胞的个数最优化。
更详细而言，本发明的胎儿的非侵入性判别方法如下。
[2]优选上述最优化包括将上述分析DNA的有核红细胞候选细胞的个数设定为“单胎的情况的个数≤单绒毛膜单羊膜双胞胎的情况的个数＜单绒毛膜双羊膜双胞胎的情况的个数＜双绒毛膜双羊膜双胞胎的情况的个数”的内容。
进一步详细而言，本发明的胎儿的非侵入性判别方法如下。
[3]优选分析从上述母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA的工序包括以下工序。
＜工序1＞获取下述a)～d)所示的基于通过超声波检查获得的膜性信息的胎儿的分类信息的工序；
a)单胎
b)单绒毛膜单羊膜双胞胎
c)单绒毛膜双羊膜双胞胎
d)双绒毛膜双羊膜双胞胎
＜工序2＞根据上述分类信息确定从母体血液样本分离的有核红细胞候选细胞的个数的工序；
＜工序3＞从母体血液样本分离上述个数的有核红细胞候选细胞的工序；
＜工序4＞对所分离的有核红细胞候选细胞分别进行全基因组扩增的工序；
＜工序5＞利用全基因组扩增产物，进行基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认的工序；
＜工序6＞对通过上述基因多态性分析和/或上述Y染色体存在与否确认来检测出的源自胎儿的有核红细胞的基因型的数量与根据上述胎儿的分类信息推断出的胎儿的基因型的数量进行比较，一致时选择进入下一工序，不一致时返回工序3的工序；及
＜工序7＞判别上述源自胎儿的有核红细胞的染色体非整倍性的工序。
另外，本发明中，除非另有指明，则“胎芽”也视作“胎儿”。
以下，对本发明的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法进行详细说明。
＜工序1、工序2＞
(胎儿的分类信息)
本发明中，胎儿根据通过超声波检查获得的膜性信息分类为以下4个情况的任一个。
a)单胎
b)单绒毛膜单羊膜双胞胎
c)单绒毛膜双羊膜双胞胎
d)双绒毛膜双羊膜双胞胎
胎儿的分类信息的获取方法并无特别限定，能够利用以往公知的信息传递单元及信息接收单元获取。关于胎儿的分类信息，即使被编码，只要能够解码即可，即使被加密，只要能够解密即可。作为信息传递单元，例如，可举出电通信线路、磁盘、电话线、书信等，但并不限定于这些。作为信息接收单元，例如，可举出与电通信线路连接的终端装置、磁盘读取装置、接收装置、书信接收单元等，但并不限定于这些。
(超声波检查)
超声波检查是指对对象物发射超声波，将其反应影像化，根据其影像进行判定或诊断的检查法。
(膜性信息)
膜性信息为通过超声波检查诊断的绒毛膜的数量、羊膜的数量及这些的组合。关于膜性的诊断，能够在超声波检查中直接计数孕囊的数量、绒毛膜的数量及羊膜的数量来进行，此外还能够根据超声波图像上的隔膜的厚度和隔膜的边缘部的形状来进行。通过超声波检查进行膜性的诊断的时期优选为妊娠初期，具体而言，优选为妊娠15周以前，更优选为妊娠10周以前。并且，优选在妊娠初期至少进行是单绒毛膜双胞胎还是双绒毛膜双胞胎的诊断。关于能够进行超声波检查的时期，通常，孕妇发现妊娠时已经是能够进行超声波检查的时期的情况较多，但大致在妊娠6～8周以后，至少能够进行是单绒毛膜双胞胎还是双绒毛膜双胞胎的诊断。并且，超声波检查可进行多次。
(双胞胎的种类)
双胞胎的种类能够根据绒毛膜的数量与羊膜的数量的组合分为双绒毛膜双羊膜双胞胎、单绒毛膜双羊膜双胞胎及单绒毛膜单羊膜双胞胎的3种。
通过超声波检查，双绒毛膜双胞胎中，能够确认到2个孕囊与各孕囊中的胎芽搏动或胎儿的心脏搏动，单绒毛膜双胞胎中，能够在大致妊娠7～9周期间确认到1个孕囊与孕囊中的2个胎芽搏动或胎儿的心脏搏动。并且，双绒毛膜双胞胎中，羊膜也有2个，但单绒毛膜双胞胎中，根据受精卵分为2个的时期，有羊膜为2个的情况与1个的情况。
另外，单胎时，绒毛膜及羊膜分别为1个。
(卵性与膜性之间的关系)
并且，作为卵性与膜性之间的关系，若是异卵双胞胎，几乎确定为为双绒毛膜双胞胎，若是同卵双胞胎，则根据受精卵分为2个的时期，成为双绒毛膜双胞胎或成为单绒毛膜双胞胎。成为异卵双胞胎且单绒毛膜双胞胎的情况极其罕见。并且，若是单绒毛膜双胞胎，几乎确定为同卵双胞胎，若是双绒毛膜双胞胎，则有同卵双胞胎的情况与异卵双胞胎的情况。虽然很少见，但也存在即便是单绒毛膜双胞胎也是异卵的情况。而且，胎儿的性别不同时，与膜性信息无关地为异卵双胞胎，胎儿的性别相同时，为同卵双胞胎或异卵双胞胎的任一个，但无法仅根据胎儿的性别及膜性信息予以区别。
然而，已知当为同卵双胞胎时，单绒毛膜双羊膜双胞胎约为75％，双绒毛膜双羊膜双胞胎约为25％，单绒毛膜单羊膜双胞胎为1约％。因此，通过超声波检查诊断为单绒毛膜双羊膜双胞胎时，可推断为同卵双胞胎。另外，胎儿的性别不同时，可与膜性信息无关地视作异卵双胞胎。
(卵性与基因型之间的关系)
同卵双胞胎中，2个胎儿源自同一受精卵，因此2个胎儿的基因型一致，基因型的数量为1个。相对于此，异卵双胞胎中，2个胎儿分别源自不同的受精卵，因此2个胎儿的基因型不一致，基因型的数量为2个。
(分析从母体血液样本分离的DNA的有核红细胞候选细胞的个数)
根据胎儿的分类信息确定从母体血液样本分离的有核红细胞候选细胞的个数。
通过基因型分析(本发明中，是“基因多态性分析”及“Y染色体存在与否确认”的总称。)检测出的基因型的数量根据上述的膜性与卵性之间的关系及卵性与基因型之间的关系，推断为双绒毛膜双羊膜双胞胎中为2个，单绒毛膜双羊膜双胞胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎及单胎中为1个。但是，即使是双绒毛膜双羊膜双胞胎，也存在同卵双胞胎的可能性，并且即使是单绒毛膜双羊膜双胞胎或单绒毛膜单羊膜双胞胎，虽然可能性很小但存在异卵双胞胎的可能性，该可能性在单绒毛膜双羊膜双胞胎中大于单绒毛膜单羊膜双胞胎，单绒毛膜单羊膜双胞胎中为与单胎相同或稍大于单胎的程度。因此，所分离的有核红细胞候选细胞的个数的大小关系如下述不等式所示。
单胎的情况的个数≤单绒毛膜单羊膜双胞胎的情况的个数＜单绒毛膜双羊膜双胞胎的情况的个数＜双绒毛膜双羊膜双胞胎的情况的个数
〔工序3〕
(母体血液样本)
本发明中，母体血液为已进行超声波检查或即将进行超声波检查的孕妇的外周血，母体血液样本是指从孕妇采集的外周血本身或对从孕妇采集的外周血进行添加抗凝剂、利用生理食盐水稀释等处理的样本。进行超声波检查来进行膜性诊断的孕妇与采集母体血液的孕妇为同一个体。
母体血液中，除了源自母体的嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等白细胞、无核的成熟的红细胞以外，还包含源自母体的有核红细胞以及源自胎儿的有核红细胞。认为源自胎儿的有核红细胞在妊娠之后的6周左右开始存在于母体血液中，因此，本发明中，检查在妊娠之后6周左右以后采集的孕妇的外周血。
获取基于超声波检查结果的胎儿的分类结果，确定所分离的有核红细胞候选细胞的个数之后，从母体血液样本分离有核红细胞候选细胞，因此在采血之后进行基于超声波检查的膜性诊断时，优选至少在进行膜性诊断之前冷藏保存母体血液样本。
源自胎儿的有核红细胞为通过胎盘而存在于母亲的血液中的红细胞前体。母亲在妊娠期间，胎儿的红细胞有可能有核。该红细胞中存在染色体，因此能够以侵入性较低的方法获得源自胎儿的染色体及胎儿基因。认为该源自胎儿的有核红细胞以在母体血液中的细胞的每106个中存在1个的比例存在，孕妇的外周血中的存在量非常小。
国际公开第2012/023298号中记载有包含该胎儿的有核红细胞的母体的血细胞的密度。根据该记载，所设想的源自胎儿的有核红细胞的密度为1.065～1.095g/mL左右，母体的血细胞的密度为，红细胞为1.070～1.120g/mL左右，嗜酸性粒细胞为1.090～1.110g/mL左右，嗜中性粒细胞为1.075～1.100g/mL左右，嗜碱性粒细胞为1.070～1.080g/mL左右，淋巴细胞为1.060～1.080g/mL左右，单核细胞为1.060～1.070g/mL左右。
(有核红细胞的浓缩)
为了从母体血液样本分离有核红细胞，优选首先通过不连续密度梯度离心分离法对母体血液样本中的有核红细胞进行浓缩。
不连续密度梯度离心分离法是利用不同密度的第一介质及第二介质，形成不连续的密度梯度，对具有其中间密度的成分进行划分、浓缩的方法。
作为本发明中使用的第一介质及第二介质，可使用用聚乙烯吡咯烷酮涂布的直径15～30nm的硅酸胶体粒子分散液即Percoll(注册商标、Percoll、Sigma-Aldrich Co.LLC.制)、由蔗糖制成的富含于侧链的中性的亲水性聚合物即Ficoll-Paque(注册商标、Ficoll-Paque、GE Healthcare Life Sciences公司制)、基于多聚蔗糖与泛影酸钠的溶液即Histopaque(注册商标、Histopaque、Sigma-Aldrich Co.LLC.制)等介质。本发明中，优选使用Percoll或Histopaque。Percoll市售有密度(比重)1.130的产品，能够通过稀释来制备目标密度(比重)的介质。Histopaque能够利用市售的密度1.077g/mL的介质与密度1.119g/mL的介质制备所希望的密度的第一介质及第二介质制备。
为了分离密度为1.065～1.095g/mL左右的有核红细胞与母体血液样本中的其他血细胞成分，设定叠加的介质的密度。有核红细胞的密度分布的中央值为1.080g/mL左右，因此制作夹着该密度的2个不同密度的介质，并相邻层叠，由此能够在其界面聚集包含有核红细胞的组分。优选将第一介质的密度设定为1.08g/mL以上且1.10g/mL以下并将第二介质的密度设定为1.06g/mL以上且小于1.08g/mL，更优选将第一介质的密度设定为1.08g/mL以上且1.09g/mL以下并将第二介质的密度设定为1.065g/mL以上且小于1.08g/mL。例如，通过将第一介质的密度设定为1.085g/mL并将第二介质的密度设定为1.075g/mL，能够从包含有核红细胞的组分分离血浆成分、嗜酸性粒细胞及单核细胞。并且，还能够分离红细胞、嗜中性粒细胞及淋巴细胞的一部分。本发明中，只要能够实现本发明的效果，则第一介质的种类与第二介质的种类并无限制，可相同也可不同，但优选使用相同种类的介质。
(细胞的形态信息获取)
本发明中，将包含从母体血液样本分离的有核红细胞的组分涂布于透明基板上，优选涂布于载玻片上，制作分析用标本。利用该标本，利用细胞的形态信息分选源自胎儿的有核红细胞候选细胞。本发明中，能够利用细胞的、核区域的面积相对于细胞质的面积的比例及核的圆形程度、核区域的面积等，分选源自胎儿的有核红细胞候选细胞，优选将具有满足核区域的面积相对于细胞质的面积的比例或核的圆形程度的条件的细胞分选为源自胎儿的有核红细胞候选细胞。
本发明中，优选分选满足下述式(I)的有核红细胞候选细胞。
0.25＜N/C＜1.0 ……(I)
其中，式(I)中，
C为细胞质的面积(μm2)，
N为核区域的面积(μm2)。
并且，本发明中，进一步优选分选满足下述式(II)的有核红细胞候选细胞。
0.65＜N/L2＜0.785 ……(II)
其中，式(II)中，
L为进行图像分析的细胞的核的长径的长度，
N的含义与上述式(I)中的N相同。
另外，进行图像分析的细胞的核的长径的长度为与呈复杂的形状的细胞核外切的椭圆形的长径的长度。
本发明中，利用细胞的形态信息分选源自胎儿的有核红细胞候选细胞的系统具备光学显微镜、数码相机、载玻片用载物台、光学传送系统、图像处理PC、控制PC、显示器。光学传送系统具备物镜与CCD相机。图像处理PC具备进行数据分析、数据存储的处理系统。控制PC具备控制载玻片用载物台的位置或控制整体处理的控制系统。
＜工序4＞
(全基因组扩增)
全基因组扩增为例如能够将从单一细胞回收的微量的DNA扩增为106倍左右，利用该扩增产物，使基因变异等基因分析变得容易的扩增法。
作为本发明中使用的全基因组扩增法，使用如下获得的基因组DNA：对从母体血液样本分离的每个有核红细胞候选细胞，经过作为通常方法的利用表面活性剂的细胞溶解、利用蛋白酶K等的蛋白质分解工序，由此从细胞分离。
并且，也可不从细胞分离基因组DNA，而是直接将1个细胞添加于PCR反应溶液中。
作为全基因组扩增试剂，可使用基于聚合酶链反应(PCR)的试剂PicoPLEX WGAkit(New England Biolabs公司制)、GenomePlex Single Cell Whole GenomeAmplification kit(Sigma-Aldrich公司制)、MALBAC法(国际公开第2012/166425号)所涉及的试剂。并且，还能够同样使用基于链取代型DNA合成反应的试剂GenomiPhi(GEHealthcare Japan Corporation制)、REPLI-g(QIAGEN公司制)。本发明中，优选使用PicoPLEX WGA kit(New England Biolabs公司制)。
优选对通过全基因组扩增获得的扩增产物(全基因组扩增产物)，通过琼脂糖凝胶电泳确认有无扩增。而且，优选利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司制)等PCR产物纯化试剂盒，对全基因组扩增产物进行纯化。
并且，优选利用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司制)、BioAnalyzer(Agilent公司制)、Quantus Fluorometer(Promega公司制)等能够测定DNA浓度的装置，测定全基因组扩增产物的浓度。
＜工序5、工序6＞
《基因多态性分析》
关于已进行全基因组扩增的有核红细胞候选细胞，虽说根据形态信息分选源自胎儿的有核红细胞候选细胞，对所分离的细胞进行了全基因组扩增，但还能考虑到未包含源自胎儿的有核红细胞的情况和混入有源自母亲的有核红细胞的情况。
因此，作为实施方式，优选通过基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认，从已进行全基因组扩增的有核红细胞候选细胞鉴定源自胎儿的有核红细胞。
基因多态性分析鉴定较短的重复序列即STR(Short Tandem Repeat)、单核苷酸多态性即SNPs等基因多态性。本发明中，将包含基因多态性部位的区域作为目标来进行PCR扩增，解读所获得的PCR产物的碱基序列，鉴定各个有核红细胞候选细胞的基因多态性是优选方式之一。PCR扩增可通过将各个区域作为目标的多次PCR扩增进行，但从提高处理能力的观点考虑，优选为多重PCR。
为了基因多态性分析而进行PCR扩增的区域优选设定为包含STR部位、SNPs部位等基因多态性部位，并且包含染色体特异性碱基序列，能够以染色体特异性进行PCR扩增的区域。通过PCR扩增获得的PCR扩增产物不仅能够用于基因多态性分析，还能够为了进行染色体非整倍性的判别而使用，因此高效。而且，还能够同时进行基因多态性分析与染色体非整倍性的检测来提高处理能力。
针对各个有核红细胞候选细胞，对通过基因多态性分析获得的基因多态性信息与母亲的基因多态性信息进行对比，能够判定具有与母亲不同的基因多态性信息的有核红细胞为源自胎儿的有核红细胞。母亲的基因多态性信息可以是预先通过基因多态性分析获得的基因多态性信息，也可以是对从母体血液分离的源自母亲的细胞，例如白细胞进行相同的基因多态性分析来确定的基因型。
关于多重PCR的目标区域，本发明主要欲检测源自双胞胎中的各个胎儿的有核红细胞中的13号染色体、18号染色体或21号染色体的非整倍性，优选对这些染色体的每一个，总计选择至少10处特异性区域，更优选至少选择15处。进一步优选这些区域为包含基因多态性部位的区域。关于目标区域的尺寸，优选以除引物部分之外，40bp以上被扩增的方式设计引物对，更优选为40bp以上、200bp以下。
(PCR)
PCR(聚合酶链反应)使用DNA聚合酶反复复制模板DNA。在使其扩增的DNA碱基序列的开始和结束的部分加以与模板DNA杂交的较短的DNA引物，并通过聚合酶开始复制。每反复复制一次，模板双链DNA的两个链便解离而分开被复制。
(多重PCR)
多重PCR能够使用通常的用于PCR的耐热性DNA聚合酶、反应缓冲液，但各个引物对与模板DNA进行退火的温度不同，因此有时需要研究反应条件。因此，优选使用最适合多重PCR的耐热性DNA聚合酶、反应缓冲液，本发明中，更优选使用Multiplex PCR Assay kit(TAKARA BIO INC.制)进行反应。
(扩增产物的序列分析)
已通过多重PCR进行扩增的产物优选通过琼脂糖凝胶电泳确认有无扩增。进一步优选利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司制)对多重PCR扩增产物进行纯化。并且还能够使用AMPure XP Kit(BECKMAN COULTER公司制)，其为利用顺磁性微珠的纯化法。
并且，针对多重PCR扩增产物的浓度，优选利用NanoDrop(Thermo FisherScientific公司制)、BioAnalyzer(Agilent公司制)、Quantus Fluorometer(Promega公司制)等能够测定DNA浓度的装置进行测定。
扩增产物的序列分析中能够使用Miseq(Illumina公司制)。利用Miseq测定多个多重PCR扩增产物时，需要对各个多重PCR扩增产物加成，由6～8碱基构成的样本识别序列(指数序列)与用于向Miseq流动池上的寡核苷酸序列杂交的P5、P7序列。通过这些序列的加成，能够一次测定最多96种多重PCR扩增产物。
作为向多重PCR扩增产物的两末端加成指数序列、P5、P7序列的方法，可使用接头连接法、PCR法。
并且，混合多个多重PCR扩增产物并通过Miseq测定时，优选准确地定量各个PCR产物。作为定量方法，还能够利用BioAnalyzer(Agilent公司制)、Quantus Fluorometer(Promega公司制)，但进一步优选通过定量PCR法测定多重PCR扩增产物的方法。作为本发明中的定量方法，优选利用NIPPON Genetics Co,Ltd制的KAPA Library QuantificationKits进行定量。
作为对通过Miseq获得的测序数据进行分析的方法，优选利用Burrows-WheelerAligner(BWA)匹配已知的人类基因组序列，作为分析基因异常的方法，优选通过利用SAMtools、BEDtools分析基因的变异和染色体数的定量。
《Y染色体存在与否确认》
源自母亲的有核红细胞中不存在Y染色体，因此Y染色体的检测是表示源自胎儿的有力的证据。
作为确认Y染色体存在与否的方法，例如可举出如下方法，即，将包括Y染色体特异性碱基序列并能够Y染色体特异性PCR扩增的Y染色体上的区域作为目标来进行PCR反应，并确认是否生成了正确的扩增产物。关于是否生成了正确的扩增产物，例如能够通过如下来确认，即，确认通过琼脂糖凝胶电泳是否可获得所希望的尺寸的带，或解读PCR扩增产物的碱基序列并确认是否扩增了规定的区域。
作为目标区域，若选择包含基因多态性部位的区域，则还能够利用于基因多态性分析，有时在双胞胎的性别均为男的情况下有用。
作为确认Y染色体的存在与否的其他方法，例如可举出利用Y染色体特异性荧光探针的FISH法。具体而言，例如可举出利用Abbott公司制CEP X/Y DNA Probe Kit的方法。
《基因型的数量的比较》
根据分类信息推断出的胎儿的基因型的数量在单胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎及单绒毛膜双羊膜双胞胎的情况下为1个，双绒毛膜双羊膜双胞胎的情况下为2个。
根据基因分析(本发明中，是“基因多态性分析”及“Y染色体存在与否确认”的总称。)检测出的有核红细胞的基因型的数量为0以上，将根据分类信息推断出的胎儿的基因型的数量+1作为上限。
通过基因分析检测出的源自胎儿的有核红细胞的基因型的数量与根据分类信息推断出的胎儿的基因型的数量非一致(不一致)时，返回工序3并反复工序3之后的工序。从工序7返回工序3的次数并无特别限定，优选为1～5次，更优选为1～3次。
通过基因分析检测出的源自胎儿的有核红细胞的基因型的数量与根据分类信息推断出的胎儿的基因型的数量一致时，进入工序7，判别源自胎儿的有核红细胞的染色体非整倍性。
另外，通过基因分析检测出的有核红细胞(包含源自胎儿的有核红细胞与源自母亲的有核红细胞)的基因型的数量为根据分类信息推断出的胎儿的基因型的数量+1时，源自胎儿的有核红细胞的基因型的数量与胎儿的基因型的数量一致。
例如，针对胎儿分类为单胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎及单绒毛膜双羊膜双胞胎中的任意情况时的有核红细胞检测出的基因型为2种时，能够判断其中1种为源自胎儿的有核红细胞的基因型，针对胎儿分类为双绒毛膜双羊膜双胞胎的情况时的有核红细胞检测出的基因型为3种时，能够判断其中2种为源自胎儿的有核红细胞的基因型。这种情况下，即使不对有核红细胞的基因型与母亲的基因型进行对比，只要对所获得的2种或3种基因型的全部进行染色体非整倍性的判别，就能够判别源自胎儿的有核红细胞的染色体非整倍性。源自母亲的有核红细胞中没有染色体非整倍性，检测到染色体非整倍性时，表示源自胎儿的有核红细胞中存在染色体非整倍性。
从工序7返回工序3并反复进行工序3之后的工序时，在再一次进行的工序7中，通过基因分析检测出的源自胎儿的有核红细胞的基因型的数量与根据分类信息推断出的胎儿的基因型的数量不一致时，获取胎儿的性别是相同还是不同的信息，性别相同时，优选视作同卵并不再反复，性别不同时为异卵，因此优选进一步反复进行多次，优选反复进行1～5次，更优选反复进行1～3次。
＜工序7＞
(扩增DNA断片的序列读取数的测量)
对通过聚合酶链反应进行扩增并鉴定出胎儿有核红细胞的细胞的核酸断片，利用测序仪求出具有预先确定的40bp以上200bp以下的区域的序列的扩增产物的扩增量。作为基准(或者参考)，利用测序仪求出鉴定为源自母亲的有核红细胞的细胞的细胞中具有预先确定的40bp以上200bp以下的区域的序列的扩增产物的扩增量。若胎儿为正常状态，则预测源自胎儿的扩增产物的扩增量与源自母亲的扩增产物的扩增量大致成为1：1的量比。胎儿具有源自扩增的染色体三体的疾病时，预测其比成为1：1.5(或者2：3)的比。
本发明中，预先求出多个从多个妊娠母体采集的、源自胎儿的扩增产物的量相对于源自妊娠有正常胎儿的母亲的扩增产物的量的比，并求出其分布。并且，求出多个妊娠有三体胎儿的母体的、源自胎儿的扩增产物的量相对于源自母亲的扩增产物的量的比，并求出其分布。还能够在该2个分布不重叠的区域设定截止值。还能够如下分析检查结果，即，将该预先确定的截止值与求出扩增产物的比的结果进行比较，若该比为截止值以下，则胎儿为正常，若为截止值以上，则为三体。
[胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统]
本发明的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统如下。
[1′]包括：胎儿信息获取单元，用于获取基于超声波检查结果的胎儿的分类信息；形态信息获取单元，根据胎儿的分类信息，获取母体血液样本中包含的细胞的形态信息；细胞分离单元，分离母体血液样本中包含的细胞；PCR装置，对所分离的细胞进行全基因组扩增；多重PCR装置，对全基因组扩增产物进行多重PCR；及DNA测序装置，解读PCR扩增产物的碱基序列并测量序列读取数。
更详细而言，本发明的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统如下。
[2′]根据通过上述胎儿信息获取单元获取的信息，确定要分离的有核红细胞候选细胞的个数，
根据通过上述形态信息获取单元获取的信息，选择要分离的有核红细胞候选细胞，
通过上述细胞分离单元分离有核红细胞候选细胞，
利用上述PCR装置进行所分离的有核红细胞候选细胞的全基因组扩增，
利用上述多重PCR装置进行多重PCR，
利用上述DNA测序装置进行通过多重PCR获得的DNA片段的碱基序列解读及序列读取数的测量，对通过基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认来检测出的有核红细胞候选细胞的基因型的数量与根据胎儿的分类推断出的胎儿的基因型的数量进行比较，一致时进入下一工序，不一致时返回分离有核红细胞候选细胞的工序并重复进行之后的工序。
[实施例]
[实施例1]
(超声波检查)
利用超声波检查装置，检查妊娠第10周以前的孕妇，从确认到妊娠有双胞胎的被测者获得了外周血样本。作为超声波检查装置，可使用GE Healthcare Japan Corporation制的Vscan、TOSHIBA MEDICAL SYSTEMS CORPORATION制的Aplio系列，但本发明中，优选使用FUJIFILM Corporation制的FC1、FAZONE CB、FAZONE M。
(胎儿的分类信息的获取)
通过超声波检查确认到被测者的膜性为双绒毛膜双羊膜双胞胎。胎儿的性别均为男婴，在该时点很难进行是同卵双胞胎还是异卵双胞胎的判别。然而，判断为双绒毛膜双羊膜双胞胎在概率上为异卵双胞胎的可能性较高，因此在后述的有核红细胞候选细胞采集工序中，将目标定为采集20个以上。
(母体血液样本的获取)
在7mL采血管中，作为抗凝剂添加10.5mg的EDTA的钠盐之后，从已进行上述超声波检查的孕妇志愿者，在获得知情同意之后，在采血管内作为志愿者血获得了外周血7mL。之后，利用生理盐水稀释了血液。
(有核红细胞的浓缩工序)
使用Percoll液(注册商标、Sigma-Aldrich Co.LLC.制)，制备密度1.070g/mL与密度1.095g/mL的液体，在离心管的底部添加密度1.095g/mL的液体2mL，在冰箱内在4℃下冷却30分钟。之后，从冰箱取出离心管，在密度1.095g/mL的液体上，以不打乱界面的方式缓慢叠加密度1.070g/mL的液体2mL。之后，在密度1.070g/mL的介质上，在离心管中缓慢添加在上述中采集的血液的稀释液11mL。之后，以2000rpm进行了20分钟的离心分离。
(向载玻片的涂布)
取出离心管，利用移液管采集沉淀在密度1.070g/mL与密度1.095g/mL的液体之间的组分。对如此采集的血液的组分，用一只手保持载玻片基板(以下，称为“载玻片基板1”。)，在其一端滴落1滴所采集的血液的组分。用另一只手拿另一载玻片基板(以下称为“载玻片基板2”。)，使载玻片基板2的一端以30度的角度与载玻片基板1接触，使载玻片基板2的接触下表面与血液的组分接触，由此通过毛细管现象血液在被2张载玻片基板包围的空间扩散。接着，在保持角度的状态下，使载玻片基板2向载玻片基板1的放置有血液的区域的相反区域的方向滑动，从而使血液涂布于第1玻璃基板上。涂布结束后，进行1小时以上的送风来使其充分干燥。将该载玻片基板在迈格林华染色液中浸渍3分钟，并浸渍于磷酸缓冲液中清洗之后，在姬姆萨染色液(用磷酸缓冲液稀释来设为浓度3％)中浸渍10分钟。之后，用纯水清洗之后使其干燥。如此，制作了已染色的多张载玻片基板。
(根据细胞的形态信息分选源自胎儿的有核红细胞候选细胞的工序)
为了从涂布于载玻片基板上的细胞分选源自胎儿的有核红细胞候选细胞，准备了以下：电动XY载物台；具备物镜、CCD相机的光学显微测定系统；具备XY载物台控制部、Z方向控制部的控制部；具备图像输入部与图像处理部及XY位置记录部的控制单元部。
将如上述那样准备的、涂布于载玻片基板上的血液细胞放置于XY载物台，对焦于载玻片上并进行扫描，读入通过光学显微镜获得的图像，通过图像分析搜索作为目标细胞的有核红细胞。
图像分析中，检测满足以下2个条件的细胞，并记录XY位置。
0.25＜N/C＜1.0 ……(I)
0.65＜N/L2＜0.785 ……(II)
其中，式(I)、(II)中，
C为进行图像分析的细胞的细胞质的面积，
N为进行图像分析的细胞的核的面积，
L为进行图像分析的细胞的核的长径的长度，即与呈复杂的形状的细胞核外切的椭圆形的长径的长度。
从存在于载玻片基板上的细胞选择20个满足式(I)及(II)的细胞来作为源自胎儿的有核红细胞候选细胞。
(源自胎儿的有核红细胞候选细胞的分离)
使用微型机械手回收了如上述那样选择的20个源自胎儿的有核红细胞候选细胞。
(全基因组扩增)
对利用微型机械手分离的20个细胞的每一个，利用New England Biolabs公司制PicoPLEX WGA kit，根据说明书记载，将细胞中的微量DNA扩增为约100万倍，由此进行了全基因组扩增。
利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司制)，去除所获得的全基因组扩增产物中的杂质，并利用Quantus Fluorometer dsDNA System(Promega公司制)测定了扩增产物的浓度。
(多重PCR工序)
为了胎儿细胞的分析、染色体的数量异常的分析，从表1及表2所示的23处染色体位置制作了用于多重PCR的引物。作为各检测区域的PCR扩增碱基长度，以成为100～220碱基对的方式制作引物，并且以各检测区域内含有遗传多态性的方式设计了引物的位置。所设计的46种引物以各引物的最终浓度成为25nmol/L的方式进行了混合。
多重PCR中，利用Multiplex PCR Assay kit(Takara Bio Inc.制)进行了反应。
关于反应溶液，作为模板，利用从各细胞获得的扩增产物10ng、46种混合引物8μL、Multiplex PCR Mix1 0.125μL、Multiplex PCR Mix2 12.5μL、水，制备成最终液量25μL。
PCR条件为在94℃下进行60秒的改性之后，将94℃下30秒、60℃下90秒、72℃下30秒循环30次来进行了反应。
利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司制)对所获得的PCR产物进行了纯化。
[表1]
表1
[表2]
表2
接着，为了进行利用Miseq的测序反应，向多重PCR扩增产物的两个末端进行了样本识别用的指数序列、流动池结合用P5、P7序列的加成。
作为引物，将表3所示的D501-F(序列编号47)、D701-R(序列编号48)、D702-R(序列编号49)、D703-R(序列编号50)、D704-R(序列编号51)、D705-R(序列编号52)及D706-R(序列编号53)各使用1.25μM，利用Multiplex PCR Assay kit进行了PCR。
作为PCR条件，在94℃下进行3分钟的改性之后，将94℃下45秒、50℃下60秒、72℃下30秒循环5次进行反应之后，将94℃下45秒、55℃下60秒、72℃下30秒循环11次进行了反应。
利用AMPure XP Kit(BECKMAN COULTER公司制)对所获得的PCR产物进行纯化，并利用BioAnalyzer测定了浓度。
而且，作为正确的扩增产物的定量，利用NIPPON Genetics Co，Ltd制的KAPALibrary Quantification Kits进行了定量。
[表3]
表3
序列编号 引物名 碱基序列(5’→3’)
47 D501-F AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTG
48 D701-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC
49 D702-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC
50 D703-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGAGCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC
51 D704-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAATCTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC
52 D705-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC
53 D706-R CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAATTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAC
(扩增产物的序列分析)
利用Miseq Reagent Kit v2 300 Cycle(ILLUMINA公司制)对23种混合多重PCR扩增产物进行测序，利用BWA使所获得的FastQ文件与人类基因组序列(hg19)匹配，通过SAMtools提取基因多态性信息，通过BEDtools计算出各检测区域的测序读断数，由此进行了分析。
(基因型分析)
利用从各细胞扩增的全基因组扩增产物，利用ILLUMINA公司制基因组分析仪Miseq，对13号、18号、21号染色体的表1及表2所示的基因区域的SNPs进行比较，由此确认到20个细胞中的3个细胞具有不同的SNP信息。并且，进一步确认到2个细胞具有不同的SNP信息。另外，利用微型机械手，从涂布有血液的载玻片基板上回收根据核的形状而预测为白细胞的细胞，与20个细胞相同地扩增DNA并调查了SNP，其结果确认到与15个细胞的SNP一致。通过以上，确认到5个细胞为源自胎儿的有核红细胞，而且在3个与2个中获取到不同的SNP信息，由此确定为异卵双胞胎，15个细胞为源自母亲的有核细胞。
(数量异常的检测)
利用Miseq确定通过多重PCR扩增产物的序列分析判别的鉴定为源自胎儿的有核红细胞的21号染色体的检测区域的扩增产物的量。另外，利用ILLUMINA公司制基因组分析仪Miseq确定了鉴定为源自母亲的有核细胞中的1个细胞的21号染色体的检测区域的扩增产物的量。计算该2个量比，其结果为接近1：1的值，推断为双胞胎为正常染色体数。
[实施例2]
从与实施例1中采血的孕妇不同的孕妇，通过超声波检查确认到被测者的膜性为双绒毛膜双羊膜双胞胎。胎儿的性别为男婴、女婴，在该时点确认到是异卵双胞胎。根据该性别结果，作为有核红细胞的遗传型，需要获取具有源自母体、源自胎儿男婴、源自胎儿女婴的3种遗传型的有核红细胞，因此作为有核红细胞候选细胞的分离，将目标设为采集20个以上。
与实施例1相同地，在胎儿有核红细胞的分选工序中回收20个有核红细胞候选细胞，同样地进行至DNA扩增工序。在之后的多重PCR工序中，与实施例1同样地通过SNPs的确认，确认到存在4个源自胎儿的有核红细胞。并且，根据胎儿为男婴、女婴，通过确认有无性染色体来判别了源自胎儿的有核红细胞，其结果确认到源自男婴的有核红细胞为2个，源自女婴的有核红细胞为2个。
作为胎儿的染色体数量异常，推断为双胞胎为正常染色体数。
[实施例3]
从与在实施例1、2中采血的孕妇不同的其他孕妇采集外周血，通过超声波检查，确认到被测者的膜性为双绒毛膜双羊膜双胞胎。胎儿的性别为男婴、女婴，在该时点确认到是异卵双胞胎。根据该性别结果，作为有核红细胞的遗传型，需要获取具有源自母体、源自胎儿男婴、源自胎儿女婴的3种遗传型的有核红细胞，为了确认本发明的有效性，作为有核红细胞的分离，实施了10个细胞的采集。
与实施例2相同地，在胎儿有核红细胞的分选工序中回收10个细胞，同样地进行至DNA扩增工序。在之后的多重PCR工序中，与实施例2同样地确认了SNPs，其结果确认到存在4个源自胎儿的有核红细胞。但是，确认到结果只获取到了源自胎儿男婴的有核红细胞，未能获取到源自女婴的胎儿有核红细胞。
[序列表]
基于国际受理专利合作条约的国际申请W-5427PCT胎儿的染色体非整倍性的非侵入式判别方法JP15077328 20150928----00050038751501930517正常20150928154328201507220958422790_P1AP101_W-_3.app
序列表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法及胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统
<130> W-5427PCT
<150> JP2014-199417
<151> 2014-09-29
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_1: rs2737699-F
<400> 1
cgctcttccg atctctgtgc agtcatcttg ctctaca 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_2: rs2737699-R
<400> 2
cgctcttccg atctgaccag ttttgatggc tccgaag 37
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_3: rs9552929-F
<400> 3
cgctcttccg atctctgccg cacaacaggt aaaagac 37
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_4: rs9552929-R
<400> 4
cgctcttccg atctgacacg gtatttccct ggttctg 37
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_5: rs3751355-F
<400> 5
cgctcttccg atctctgggg aataagggtg acgtggg 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_6: rs3751355-R
<400> 6
cgctcttccg atctgaccca gcctcttatt ccccgga 37
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_7: rs3751357-F
<400> 7
cgctcttccg atctctgtgc tttcactgtg gggctca 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_8: rs3751357-R
<400> 8
cgctcttccg atctgacata gaccccagca atgtggc 37
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_9: rs202198487-F
<400> 9
cgctcttccg atctctgggc aacattgggc ctttggg 37
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_10: rs202198487-R
<400> 10
cgctcttccg atctgaccct cgatctcctt tccagcc 37
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_11: rs2230162-F
<400> 11
cgctcttccg atctctgtgt ccatgcaaac cctggaa 37
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_12: rs2230162-R
<400> 12
cgctcttccg atctgacaag tggggagagt ggctgtt 37
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_13: rs3745051-F
<400> 13
cgctcttccg atctctggcc attgagaaag gctgctc 37
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_14: rs3745051-R
<400> 14
cgctcttccg atctgaccaa gggcacagtc tttgggg 37
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_15: rs581894-F
<400> 15
cgctcttccg atctctgcat ctccaggctg tgcagtg 37
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_16: rs581894-R
<400> 16
cgctcttccg atctgacggt ccctttccca caagcag 37
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_17: rs8096037-F
<400> 17
cgctcttccg atctctggca gcaggaggaa ggcaaaa 37
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_18: rs8096037-R
<400> 18
cgctcttccg atctgactcc caagcctgac catacct 37
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_19: rs7234309-F
<400> 19
cgctcttccg atctctggca acatgacaag cactggg 37
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_20: rs7234309-R
<400> 20
cgctcttccg atctgaccgc tactgggact ggctgat 37
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_21: rs9305426-F
<400> 21
cgctcttccg atctctgctg tggttatggc ggctgtg 37
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_22: rs9305426-R
<400> 22
cgctcttccg atctgacagg agtgggagac atagcca 37
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_23: rs12053674-F
<400> 23
cgctcttccg atctctgagc cacagccagt tccatag 37
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_24: rs12053674-R
<400> 24
cgctcttccg atctgacctc ctgaaatcat gtgttgc 37
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_25: rs10775648-F
<400> 25
cgctcttccg atctctgctt cgagtctgtg gatcgcg 37
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_26: rs10775648-R
<400> 26
cgctcttccg atctgacgca aaggagtatg gagaggc 37
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_27: rs10775648-F2
<400> 27
cgctcttccg atctctgctt cgagtctgtg gatcgcg 37
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_28: rs10775648-R2
<400> 28
cgctcttccg atctgacgca aaggagtatg gagaggc 37
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_29: rs2073370-F
<400> 29
cgctcttccg atctctggcc agacatgtgc ctcgaag 37
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_30: rs2073370-R
<400> 30
cgctcttccg atctgactcg tgcagcagaa gacactt 37
<210> 31
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_31: rs457705-F
<400> 31
cgctcttccg atctctggcc caagaccaac tgtgtcc 37
<210> 32
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_32: rs457705-R
<400> 32
cgctcttccg atctgaccaa ggacgactgg ctgttcc 37
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_33: COL18A1-F
<400> 33
cgctcttccg atctctgcag caaagccaca gtccttc 37
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_34: COL18A1-R
<400> 34
cgctcttccg atctgacccc caccctgaca tccttac 37
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_35: TBL1X-F
<400> 35
cgctcttccg atctctgctg ttttgggtgg gtttggt 37
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_36: TBL1X-R
<400> 36
cgctcttccg atctgacatt tgaaagtggg gcaccat 37
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_37: CTPS2-F
<400> 37
cgctcttccg atctctgggt acttctggga tgccttg 37
<210> 38
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_38: CTPS2-R
<400> 38
cgctcttccg atctgacgtt gcagactaag gcccacc 37
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_39: PHF16-F
<400> 39
cgctcttccg atctctgtgt tggtcttgtt cttgcgt 37
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_40: PHF16-R
<400> 40
cgctcttccg atctgacgac ccatctgtga cgctgtg 37
<210> 41
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_41: ELK1-F
<400> 41
cgctcttccg atctctgggg cccagggagt catacat 37
<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_42: ELK1-R
<400> 42
cgctcttccg atctgactca cggccttctt ctccagg 37
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_43: TMEM185A-F
<400> 43
cgctcttccg atctctgaca cacactgccc atggaac 37
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_44: TMEM185A-R
<400> 44
cgctcttccg atctgaccaa ctcagccaag cccagtc 37
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_45: CY_2655422-674_S-F
<400> 45
cgctcttccg atctctgaga ccacacgatg aatgcgt 37
<210> 46
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_46: CY_2655422-674_S-R
<400> 46
cgctcttccg atctgacggc aacgtccagg atagagt 37
<210> 47
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_47: D501-F
<400> 47
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atagccttct ttccctacac gacgctcttc 60
cgatctctg 69
<210> 48
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_48: D701-R
<400> 48
caagcagaag acggcatacg agatcgagta atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 49
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_49: D702-R
<400> 49
caagcagaag acggcatacg agattctccg gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 50
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_50: D703-R
<400> 50
caagcagaag acggcatacg agataatgag cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 51
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_51: D704-R
<400> 51
caagcagaag acggcatacg agatggaatc tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 52
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_52: D705-R
<400> 52
caagcagaag acggcatacg agatttctga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69
<210> 53
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SeqID_53: D706-R
<400> 53
caagcagaag acggcatacg agatacgaat tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgac 69

Claims (5)

1.一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，其具有分析从母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA的工序，其中，
所述胎儿为根据超声波检查的结果，分类为选自单胎、单绒毛膜单羊膜双胞胎、单绒毛膜双羊膜双胞胎及双绒毛膜双羊膜双胞胎中的任一情况的胎儿，且根据所述分类使用于分析所述DNA的有核红细胞候选细胞的个数最优化。
2.根据权利要求1所述的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，其中，
所述最优化包括将用于分析所述DNA的有核红细胞候选细胞的个数设定为如下关系，即，
单胎的情况下的个数≤单绒毛膜单羊膜双胞胎的情况下的个数＜单绒毛膜双羊膜双胞胎的情况下的个数＜双绒毛膜双羊膜双胞胎的情况下的个数。
3.根据权利要求1或2所述的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法，分析从所述母体血液中分离的有核红细胞候选细胞的DNA的工序包括以下工序：
＜工序1＞获取基于通过超声波检查获得的膜性信息的胎儿分类信息的工序，该胎儿分类信息为下述a)～d)所示的胎儿分类信息；
a)单胎
b)单绒毛膜单羊膜双胞胎
c)单绒毛膜双羊膜双胞胎
d)双绒毛膜双羊膜双胞胎
＜工序2＞根据所述分类信息确定从母体血液样本分离的有核红细胞候选细胞的个数的工序；
＜工序3＞从母体血液样本分离所述个数的有核红细胞候选细胞的工序；
＜工序4＞对所分离的有核红细胞候选细胞分别进行全基因组扩增的工序；
＜工序5＞利用全基因组扩增产物进行基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认的工序；
＜工序6＞对通过所述基因多态性分析和/或所述Y染色体存在与否确认来检测出的源自胎儿的有核红细胞的基因型的数量与根据所述胎儿的分类信息推断出的胎儿的基因型的数量进行比较，一致时选择进入下一工序，不一致时选择返回工序3的工序；以及
＜工序7＞判别所述源自胎儿的有核红细胞的染色体非整倍性的工序。
4.一种胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统，其包含：
胎儿信息获取单元，用于获取基于超声波检查结果的胎儿的分类信息；形态信息获取单元，根据胎儿的分类信息获取母体血液样本中包含的细胞的形态信息；细胞分离单元，分离母体血液样本中包含的细胞；PCR装置，对所分离的细胞进行全基因组扩增；多重PCR装置，对全基因组扩增产物进行多重PCR；及DNA测序装置，解读PCR扩增产物的碱基序列并测量序列读取数。
5.根据权利要求4所述的胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别系统，其中，
根据通过所述胎儿信息获取单元获取的信息，确定要分离的有核红细胞候选细胞的个数，
根据通过所述形态信息获取单元获取的信息，选择要分离的有核红细胞候选细胞，
通过所述细胞分离单元，分离有核红细胞候选细胞，
利用所述PCR装置进行所分离出的有核红细胞候选细胞的全基因组扩增，
利用所述多重PCR装置进行多重PCR，
利用所述DNA测序装置进行通过多重PCR获得的DNA片段的碱基序列解读及序列读取数的测量，对通过基因多态性分析和/或Y染色体存在与否确认来检测出的有核红细胞候选细胞的基因型的数量与根据胎儿的分类推断出的胎儿的基因型的数量进行比较，一致时进入下一工序，不一致时返回分离有核红细胞候选细胞的工序并重复进行之后的工序。
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