JPWO2016052405A1 - 胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法および判別システム - Google Patents
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Abstract
本発明は、母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程を有する胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法であって、胎児が、超音波検査の結果に基づいて、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎および2絨毛膜2羊膜双胎から選択されるいずれか1つの場合に場合分けがされた胎児であり、かつ、DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を場合分けに基づいて最適化する、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法、ならびに胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムを提供する。
Description
本発明は、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法およびシステムまたは装置に関する。より詳細には、本発明は、母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNA解析による胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法およびシステムまたは装置に関する。
胎児の染色体異常や遺伝子異常を診断するため、従来、出生前診断として、羊水穿刺や絨毛採取により、胎児細胞を採取し、染色体や遺伝子を調べる方法が行われてきた。しかし、これらの方法は、僅かではあるが検体採取による流産等の合併症リスクが存在することが大きな問題点として指摘されている。
近年、母体の血液中に胎児細胞が移行し、母体由来の血液細胞とともに母体中を循環していることが知られるようになった。このような母体血中の胎児細胞の染色体のDNAを再現性よく確実に分析することにより、流産の可能性のない安全な出生前診断が実現できる。しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞(胎児有核赤血球細胞)は、母体血の数mL中に1個程度しか存在しないことが理解されるようになり、確実に胎児細胞(胎児有核赤血球細胞)を取得することが、この安全な出生前診断を行ううえで非常に大きな課題として存在している。また妊娠した母体の血液中には、母親由来の有核赤血球細胞も存在することが知られるようになり、母親由来の有核赤血球細胞と、胎児由来の有核赤血球(胎児有核赤血球細胞)を分離することもこの安全な出生前診断を実現する上で解決すべき課題として存在する。
母体血中の有核赤血球細胞に着目した胎児の出生前診断方法としては、特許文献1に、母体血からフィルターで分離した有核細胞のゲノムを増幅し、多型マーカーおよびY染色体マーカーを用いて胎児由来細胞を同定し、胎児由来細胞の染色体異常をFISH(Fluorescence in situ hybridization)法で検出する方法が記載されている。
また、特許文献2には、複数の胎児細胞のDNAのパラロガスな遺伝子を増幅し、増幅産物の量をシークエンサーで確定し対立遺伝子の比から、数的異常であるトリソミーを分析する方法が記載されている。
また、特許文献2には、複数の胎児細胞のDNAのパラロガスな遺伝子を増幅し、増幅産物の量をシークエンサーで確定し対立遺伝子の比から、数的異常であるトリソミーを分析する方法が記載されている。
また、特許文献3には、二卵性双胎を検出する方法が記載されており、母体血から有核赤血球細胞を母体由来および胎児由来の区別なく採取した混合サンプルから、胎児識別子および父性対立遺伝子を同定している。
上記のように、単胎および二卵性双胎について、母体血中の有核赤血球細胞に着目した胎児の出生前診断方法が開示されているが、単胎の出生前診断方法が開示された特許文献1の方法では、多胎児の場合、いくつ細胞を解析すればよいか判断できないという問題があり、特許文献2の方法では、母体血中の胎児細胞の選択、および母体由来の細胞と胎児由来の細胞との識別をすることができないという問題がある。さらに、二卵性双胎の出生前診断方法が開示された特許文献3の方法では、母体由来細胞および胎児由来細胞の混合サンプルからの検出であるため、双胎児個々の遺伝情報の由来が把握できないという問題がある。
一方、従来の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法として、母体血中に微量に含有される胎児由来核酸を検出する方法が行われているが、胎児が双胎児の場合、従来法では、胎児由来核酸が双胎児の一方に由来するものであるか、または両方に由来するものであるかを判別することが困難であった。
また、母体血中に含まれる胎児由来の有核赤血球を単離し、染色体異数性を検出する方法も知られているが、双胎児の場合、その卵性や性別が把握できていない場合には、単離するべき細胞数が明瞭ではなく、一方の胎児由来の有核赤血球のみを検出してしまい、もう一方の胎児を見逃す可能性、それに伴い必要な細胞単離数が明瞭でない為、作業の効率性が悪い等の問題があった。
そこで、本発明は、胎児が単胎児または双胎児の場合に各胎児の染色体異数性を検出することができる、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、胎児が単胎児または双胎児の場合に、各胎児の染色体異数性を検出することができる、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムを提供することも課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねたところ、母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程を有する胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法において、胎児が、超音波検査の結果に基づいて、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎および2絨毛膜2羊膜双胎から選択されるいずれか1つの場合に場合分けがされた胎児であり、かつ、DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を上記場合分けに基づいて最適化すると、胎児が単胎児または双胎児の場合に各胎児の染色体異数性を検出することができることを知得し、本発明を完成させた。
また、本発明者らは、超音波検査の結果に基づく胎児の場合分け情報を取得するための胎児情報取得手段と、母体血サンプルに含まれる細胞の形態情報を取得する形態情報取得手段と、母体血サンプルに含まれる細胞を単離する細胞単離手段と、単離した細胞を全ゲノム増幅するPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)装置と、全ゲノム増幅産物をマルチプレックスPCRするマルチプレックスPCR装置と、PCR増幅産物の塩基配列を解読し、配列リード数を計測するDNAシークエンシング装置とを含む、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムによれば、胎児が単胎児または双胎児の場合に、各胎児の染色体異数性を検出することができることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、次の(1)〜(5)を提供する。
(1)母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程を有する胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法であって、
胎児が、超音波検査の結果に基づいて、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎および2絨毛膜2羊膜双胎から選択されるいずれか1つの場合に場合分けがされた胎児であり、かつ、DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を場合分けに基づいて最適化する、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法。
(2)最適化することが、DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を、
単胎である場合の個数≦1絨毛膜1羊膜双胎である場合の個数<1絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数<2絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数
と設定することを含む、(1)に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法。
(3)母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程が以下の工程を含む、(1)または(2)に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法:
〈工程1〉下記a)〜d)に示す、超音波検査によって得られた膜性情報に基づく胎児の場合分け情報を取得する工程
a)単胎
b)1絨毛膜1羊膜双胎
c)1絨毛膜2羊膜双胎
d)2絨毛膜2羊膜双胎
〈工程2〉母体血サンプルから単離する有核赤血球候補細胞の個数を場合分け情報に基づいて決定する工程、
〈工程3〉母体血サンプルから上記個数の有核赤血球候補細胞を単離する工程、
〈工程4〉単離した有核赤血球候補細胞を、それぞれ、全ゲノム増幅する工程、
〈工程5〉全ゲノム増幅産物を用いて、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認を行う工程、
〈工程6〉遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数と胎児の場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは工程3に戻ることを選択する工程、ならびに
〈工程7〉胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別する工程。
(4)超音波検査の結果に基づく胎児の場合分け情報を取得するための胎児情報取得手段と、胎児の場合分け情報に基づいて母体血サンプルに含まれる細胞の形態情報を取得する形態情報取得手段と、母体血サンプルに含まれる細胞を単離する細胞単離手段と、単離した細胞を全ゲノム増幅するPCR装置と、全ゲノム増幅産物をマルチプレックスPCRするマルチプレックスPCR装置と、PCR増幅産物の塩基配列を解読し、配列リード数を計測するDNAシークエンシング装置とを含む、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システム。
(5)胎児情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞の個数が決定され、
形態情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞が選択され、
単離手段によって、有核赤血球候補細胞が単離され、
PCR装置を用いて単離された有核赤血球候補細胞の全ゲノム増幅が行われ、
マルチプレックスPCR装置を用いてマルチプレックスPCRが行われ、
DNAシークエンシング装置を用いてマルチプレックスPCRにより得られたDNAフラグメントの塩基配列解読および配列リード数の計測が行われ、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって検出された有核赤血球候補細胞の遺伝子型の数と胎児の場合分けから推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは有核赤血球候補細胞を単離する工程に戻り、以降の工程を繰り返す、
(4)に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システム。
(1)母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程を有する胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法であって、
胎児が、超音波検査の結果に基づいて、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎および2絨毛膜2羊膜双胎から選択されるいずれか1つの場合に場合分けがされた胎児であり、かつ、DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を場合分けに基づいて最適化する、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法。
(2)最適化することが、DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を、
単胎である場合の個数≦1絨毛膜1羊膜双胎である場合の個数<1絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数<2絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数
と設定することを含む、(1)に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法。
(3)母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程が以下の工程を含む、(1)または(2)に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法:
〈工程1〉下記a)〜d)に示す、超音波検査によって得られた膜性情報に基づく胎児の場合分け情報を取得する工程
a)単胎
b)1絨毛膜1羊膜双胎
c)1絨毛膜2羊膜双胎
d)2絨毛膜2羊膜双胎
〈工程2〉母体血サンプルから単離する有核赤血球候補細胞の個数を場合分け情報に基づいて決定する工程、
〈工程3〉母体血サンプルから上記個数の有核赤血球候補細胞を単離する工程、
〈工程4〉単離した有核赤血球候補細胞を、それぞれ、全ゲノム増幅する工程、
〈工程5〉全ゲノム増幅産物を用いて、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認を行う工程、
〈工程6〉遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数と胎児の場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは工程3に戻ることを選択する工程、ならびに
〈工程7〉胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別する工程。
(4)超音波検査の結果に基づく胎児の場合分け情報を取得するための胎児情報取得手段と、胎児の場合分け情報に基づいて母体血サンプルに含まれる細胞の形態情報を取得する形態情報取得手段と、母体血サンプルに含まれる細胞を単離する細胞単離手段と、単離した細胞を全ゲノム増幅するPCR装置と、全ゲノム増幅産物をマルチプレックスPCRするマルチプレックスPCR装置と、PCR増幅産物の塩基配列を解読し、配列リード数を計測するDNAシークエンシング装置とを含む、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システム。
(5)胎児情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞の個数が決定され、
形態情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞が選択され、
単離手段によって、有核赤血球候補細胞が単離され、
PCR装置を用いて単離された有核赤血球候補細胞の全ゲノム増幅が行われ、
マルチプレックスPCR装置を用いてマルチプレックスPCRが行われ、
DNAシークエンシング装置を用いてマルチプレックスPCRにより得られたDNAフラグメントの塩基配列解読および配列リード数の計測が行われ、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって検出された有核赤血球候補細胞の遺伝子型の数と胎児の場合分けから推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは有核赤血球候補細胞を単離する工程に戻り、以降の工程を繰り返す、
(4)に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システム。
本発明によれば、胎児が単胎児または双胎児の場合に、各胎児の染色体異数性を検出することができる、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法を提供することができる。
また、本発明によれば、胎児が単胎児または双胎児の場合に、各胎児の染色体異数性を検出することができる、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムを提供することができる。
また、本発明によれば、胎児が単胎児または双胎児の場合に、各胎児の染色体異数性を検出することができる、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムを提供することができる。
従来の母体血漿・血清中の無細胞胎児由来核酸を用いた染色体異数性判別では、染色体異数性を保有する胎児、または染色体異数性を保有する胎児の割合を検出することが困難であったが、本発明によれば、超音波検査による膜性情報により多胎児の卵性を決定し、卵性情報に伴う胎児核酸の処理数を決定し、その決定処理数を遺伝子解析により個々の胎児の染色体異数性を正確に判別し、また、染色体異数性を保有する胎児の割合を検出することが可能となる。
[胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法]
本発明の胎児の非侵襲的判別方法は、
[1]母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程を有する胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法であって、上記胎児が、超音波検査の結果に基づいて、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎および2絨毛膜2羊膜双胎から選択されるいずれか1つの場合に場合分けがされた胎児であり、かつ、上記DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を上記場合分けに基づいて最適化する。
本発明の胎児の非侵襲的判別方法は、
[1]母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程を有する胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法であって、上記胎児が、超音波検査の結果に基づいて、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎および2絨毛膜2羊膜双胎から選択されるいずれか1つの場合に場合分けがされた胎児であり、かつ、上記DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を上記場合分けに基づいて最適化する。
より詳細には、本発明の胎児の非侵襲的判別方法は、
[2]上記最適化することが、上記DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を、「単胎である場合の個数≦1絨毛膜1羊膜双胎である場合の個数<1絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数<2絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数」と設定することを含むことが好ましい。
[2]上記最適化することが、上記DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を、「単胎である場合の個数≦1絨毛膜1羊膜双胎である場合の個数<1絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数<2絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数」と設定することを含むことが好ましい。
さらに詳細には、本発明の胎児の非侵襲的判別方法は、
[3]上記母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程が以下の工程を含むことが好ましい。
〈工程1〉下記a)〜d)に示す、超音波検査によって得られた膜性情報に基づく胎児の場合分け情報を取得する工程
a)単胎
b)1絨毛膜1羊膜双胎
c)1絨毛膜2羊膜双胎
d)2絨毛膜2羊膜双胎
〈工程2〉母体血サンプルから単離する有核赤血球候補細胞の個数を上記場合分け情報に基づいて決定する工程、
〈工程3〉母体血サンプルから上記個数の有核赤血球候補細胞を単離する工程、
〈工程4〉単離した有核赤血球候補細胞を、それぞれ、全ゲノム増幅する工程、
〈工程5〉全ゲノム増幅産物を用いて、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認を行う工程、
〈工程6〉上記遺伝子多型解析および/または上記Y染色体存否確認によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数と上記胎児の場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは工程3に戻ることを選択する工程、ならびに
〈工程7〉上記胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別する工程
なお、本発明においては、特に断りがない限り、「胎芽」も「胎児」として取り扱うものとする。
[3]上記母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程が以下の工程を含むことが好ましい。
〈工程1〉下記a)〜d)に示す、超音波検査によって得られた膜性情報に基づく胎児の場合分け情報を取得する工程
a)単胎
b)1絨毛膜1羊膜双胎
c)1絨毛膜2羊膜双胎
d)2絨毛膜2羊膜双胎
〈工程2〉母体血サンプルから単離する有核赤血球候補細胞の個数を上記場合分け情報に基づいて決定する工程、
〈工程3〉母体血サンプルから上記個数の有核赤血球候補細胞を単離する工程、
〈工程4〉単離した有核赤血球候補細胞を、それぞれ、全ゲノム増幅する工程、
〈工程5〉全ゲノム増幅産物を用いて、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認を行う工程、
〈工程6〉上記遺伝子多型解析および/または上記Y染色体存否確認によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数と上記胎児の場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは工程3に戻ることを選択する工程、ならびに
〈工程7〉上記胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別する工程
なお、本発明においては、特に断りがない限り、「胎芽」も「胎児」として取り扱うものとする。
以下、本発明の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法を詳細に説明する。
〈工程1・工程2〉
(胎児の場合分け情報)
本発明において、胎児は、超音波検査によって得られた膜性情報に基づいて、以下の4つの場合のいずれか1つに場合分けがされている。
a)単胎
b)1絨毛膜1羊膜双胎
c)1絨毛膜2羊膜双胎
d)2絨毛膜2羊膜双胎
〈工程1・工程2〉
(胎児の場合分け情報)
本発明において、胎児は、超音波検査によって得られた膜性情報に基づいて、以下の4つの場合のいずれか1つに場合分けがされている。
a)単胎
b)1絨毛膜1羊膜双胎
c)1絨毛膜2羊膜双胎
d)2絨毛膜2羊膜双胎
胎児の場合分け情報の取得方法は特に限定されず、従来公知の情報伝達手段および情報受信手段を用いて取得することができる。胎児の場合分け情報はエンコードされていてもデコードできればよく、エンクリプトされていてもデクリプトできればよい。情報伝達手段としては、例えば、電気通信回線、磁気ディスク、電話回線、書面等が挙げられるが、これらに限定されない。情報受信手段としては、例えば、電気通信回線に接続された端末装置、磁気ディスク読取装置、受話装置、書面受領手段等が挙げられるが、これらに限定されない。
(超音波検査)
超音波検査は、超音波を対象物に当て、その反響を映像化し、その映像に基づいて判定または診断がなされることを意図した検査法をいう。
超音波検査は、超音波を対象物に当て、その反響を映像化し、その映像に基づいて判定または診断がなされることを意図した検査法をいう。
(膜性情報)
膜性情報は超音波検査によって診断された絨毛膜の数、羊膜の数およびこれらの組合せである。膜性の診断は、超音波検査において、胎嚢の数、絨毛膜の数および羊膜の数を直接数えることによって行うことができるほか、超音波画像上の隔膜の厚さや隔膜の辺縁部の形状によっても行うことが可能である。超音波検査により膜性の診断を行う時期は妊娠初期が好ましく、具体的には、妊娠15週以前が好ましく、妊娠10週以前がより好ましい。また、少なくとも、1絨毛膜双胎であるか、または2絨毛膜双胎であるかの診断を妊娠初期に行うことが好ましい。超音波検査が可能となる時期は、一般に、妊婦が妊娠に気付いた時には既に超音波検査が可能な時期になっていることが多いが、概ね、妊娠6〜8週以降に、少なくとも1絨毛膜双胎であるか、または2絨毛膜双胎であるか診断をすることができる。また、超音波検査は複数回行ってもよい。
膜性情報は超音波検査によって診断された絨毛膜の数、羊膜の数およびこれらの組合せである。膜性の診断は、超音波検査において、胎嚢の数、絨毛膜の数および羊膜の数を直接数えることによって行うことができるほか、超音波画像上の隔膜の厚さや隔膜の辺縁部の形状によっても行うことが可能である。超音波検査により膜性の診断を行う時期は妊娠初期が好ましく、具体的には、妊娠15週以前が好ましく、妊娠10週以前がより好ましい。また、少なくとも、1絨毛膜双胎であるか、または2絨毛膜双胎であるかの診断を妊娠初期に行うことが好ましい。超音波検査が可能となる時期は、一般に、妊婦が妊娠に気付いた時には既に超音波検査が可能な時期になっていることが多いが、概ね、妊娠6〜8週以降に、少なくとも1絨毛膜双胎であるか、または2絨毛膜双胎であるか診断をすることができる。また、超音波検査は複数回行ってもよい。
(双胎の種類)
双胎の種類は、絨毛膜の数と羊膜の数との組合せによって、2絨毛膜2羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎、および1絨毛膜1羊膜双胎の3種類に分けることができる。
超音波検査により、2絨毛膜双胎では、2個の胎嚢とその中に1つずつ胎芽拍動または胎児の心拍動を確認することができ、1絨毛膜双胎では、概ね妊娠7〜9週の間に1個の胎嚢と、その中の2つの胎芽拍動または胎児の心拍動を確認することができる。また、2絨毛膜双胎では羊膜も2つあるが、1絨毛膜双胎では、受精卵が2つに分かれた時期によって、羊膜が2つである場合と、1つである場合とがある。
なお、単胎の場合には、絨毛膜および羊膜はそれぞれ1つである。
双胎の種類は、絨毛膜の数と羊膜の数との組合せによって、2絨毛膜2羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎、および1絨毛膜1羊膜双胎の3種類に分けることができる。
超音波検査により、2絨毛膜双胎では、2個の胎嚢とその中に1つずつ胎芽拍動または胎児の心拍動を確認することができ、1絨毛膜双胎では、概ね妊娠7〜9週の間に1個の胎嚢と、その中の2つの胎芽拍動または胎児の心拍動を確認することができる。また、2絨毛膜双胎では羊膜も2つあるが、1絨毛膜双胎では、受精卵が2つに分かれた時期によって、羊膜が2つである場合と、1つである場合とがある。
なお、単胎の場合には、絨毛膜および羊膜はそれぞれ1つである。
(卵性と膜性との関係)
また、卵性と膜性との関係としては、二卵性双胎であればほぼ確実に2絨毛膜双胎となり、一卵性双胎であれば、受精卵が2つに分かれた時期によって、2絨毛膜双胎となるか、または1絨毛膜双胎となる。二卵性双胎であって1絨毛膜双胎となる場合は極めて稀である。また、1絨毛膜双胎であればほぼ確実に一卵性双胎であり、2絨毛膜双胎であれば、一卵性双胎である場合と、二卵性双胎である場合とがある。1絨毛膜双胎であっても二卵性であることがわずかにではあるが存在する。さらに、胎児の性別が異なるときは膜性情報によらず二卵性双胎であり、胎児の性別が同じであるときは一卵性双胎または二卵性双胎のいずれかであるが、胎児の性別および膜性情報のみによって区別することはできない。
しかしながら、一卵性双胎である場合、1絨毛膜2羊膜双胎が約75%であり、2絨毛膜2羊膜双胎が約25%であり、1絨毛膜1羊膜双胎が約1%であることが知られている。そのため、超音波検査によって、1絨毛膜2羊膜双胎であると診断された場合には、1卵性双胎と推定してもよく、1絨毛膜2羊膜双胎であると診断された場合には、1卵性双胎とみなしてもよい。なお、胎児の性別が異なる場合には、膜性情報によらず、二卵性双胎として取り扱ってよい。
また、卵性と膜性との関係としては、二卵性双胎であればほぼ確実に2絨毛膜双胎となり、一卵性双胎であれば、受精卵が2つに分かれた時期によって、2絨毛膜双胎となるか、または1絨毛膜双胎となる。二卵性双胎であって1絨毛膜双胎となる場合は極めて稀である。また、1絨毛膜双胎であればほぼ確実に一卵性双胎であり、2絨毛膜双胎であれば、一卵性双胎である場合と、二卵性双胎である場合とがある。1絨毛膜双胎であっても二卵性であることがわずかにではあるが存在する。さらに、胎児の性別が異なるときは膜性情報によらず二卵性双胎であり、胎児の性別が同じであるときは一卵性双胎または二卵性双胎のいずれかであるが、胎児の性別および膜性情報のみによって区別することはできない。
しかしながら、一卵性双胎である場合、1絨毛膜2羊膜双胎が約75%であり、2絨毛膜2羊膜双胎が約25%であり、1絨毛膜1羊膜双胎が約1%であることが知られている。そのため、超音波検査によって、1絨毛膜2羊膜双胎であると診断された場合には、1卵性双胎と推定してもよく、1絨毛膜2羊膜双胎であると診断された場合には、1卵性双胎とみなしてもよい。なお、胎児の性別が異なる場合には、膜性情報によらず、二卵性双胎として取り扱ってよい。
(卵性と遺伝子型との関係)
一卵性双胎では、2つの胎児は同一の受精卵に由来するので、2つの胎児の遺伝子型は一致し、遺伝子型の数は1つである。これに対して、二卵性双胎では、2つの胎児はそれぞれ異なる受精卵に由来するので、2つの胎児の遺伝子型は一致せず、遺伝子型の数は2つである。
一卵性双胎では、2つの胎児は同一の受精卵に由来するので、2つの胎児の遺伝子型は一致し、遺伝子型の数は1つである。これに対して、二卵性双胎では、2つの胎児はそれぞれ異なる受精卵に由来するので、2つの胎児の遺伝子型は一致せず、遺伝子型の数は2つである。
(母体血サンプルから単離するDNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数)
母体血サンプルから単離する有核赤血球候補細胞の個数は、胎児の場合分け情報に基づいて決定する。
遺伝子型解析(本発明において「遺伝子多型解析」および「Y染色体存否確認」を総称していう。)によって検出される遺伝子型の数は、上述した膜性と卵性との関係および卵性と遺伝子型との関係から、2絨毛膜2羊膜双胎では2つ、1絨毛膜2羊膜双胎、1絨毛膜1羊膜双胎および単胎では1つと推定される。ただし、2絨毛膜2羊膜双胎であっても一卵性双胎である可能性が存在するとともに、1絨毛膜2羊膜双胎または1絨毛膜1羊膜双胎であっても二卵性双胎である可能性が少ないながらも存在し、その可能性は1絨毛膜2羊膜双胎の方が1絨毛膜1羊膜双胎よりも大きく、1絨毛膜1羊膜双胎は単胎と同じか僅かに大きい程度である。そのため、単離する有核赤血球候補細胞の個数の大小関係は、下記不等式に示すとおりである。
単胎である場合の個数≦1絨毛膜1羊膜双胎である場合の個数<1絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数<2絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数
母体血サンプルから単離する有核赤血球候補細胞の個数は、胎児の場合分け情報に基づいて決定する。
遺伝子型解析(本発明において「遺伝子多型解析」および「Y染色体存否確認」を総称していう。)によって検出される遺伝子型の数は、上述した膜性と卵性との関係および卵性と遺伝子型との関係から、2絨毛膜2羊膜双胎では2つ、1絨毛膜2羊膜双胎、1絨毛膜1羊膜双胎および単胎では1つと推定される。ただし、2絨毛膜2羊膜双胎であっても一卵性双胎である可能性が存在するとともに、1絨毛膜2羊膜双胎または1絨毛膜1羊膜双胎であっても二卵性双胎である可能性が少ないながらも存在し、その可能性は1絨毛膜2羊膜双胎の方が1絨毛膜1羊膜双胎よりも大きく、1絨毛膜1羊膜双胎は単胎と同じか僅かに大きい程度である。そのため、単離する有核赤血球候補細胞の個数の大小関係は、下記不等式に示すとおりである。
単胎である場合の個数≦1絨毛膜1羊膜双胎である場合の個数<1絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数<2絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数
〔工程3〕
(母体血サンプル)
本発明において、母体血は超音波検査を行った、またはこれから行う妊婦の末梢血であり、母体血サンプルは妊婦から採血した末梢血そのもの、または妊婦から採血した末梢血に抗凝固剤を添加、生理食塩水で希釈などの処理を施したものをいう。超音波検査を行って膜性診断を行う妊婦と母体血を採血する妊婦は同一個体である。
母体血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、6週程度から母体血中に存在するといわれており、そのため本発明では、妊娠後6週程度以降に採血した妊婦の末梢血を検査する。
超音波検査の結果に基づく胎児の場合分けの結果を取得し、単離する有核赤血球候補細胞の個数を決定してから、母体血サンプルから有核赤血球候補細胞を単離するため、超音波検査による膜性診断を採血よりも後に行う場合には、少なくとも膜性診断が行われるまでは、母体血サンプルを冷蔵保存しておくことが好ましい。
(母体血サンプル)
本発明において、母体血は超音波検査を行った、またはこれから行う妊婦の末梢血であり、母体血サンプルは妊婦から採血した末梢血そのもの、または妊婦から採血した末梢血に抗凝固剤を添加、生理食塩水で希釈などの処理を施したものをいう。超音波検査を行って膜性診断を行う妊婦と母体血を採血する妊婦は同一個体である。
母体血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、6週程度から母体血中に存在するといわれており、そのため本発明では、妊娠後6週程度以降に採血した妊婦の末梢血を検査する。
超音波検査の結果に基づく胎児の場合分けの結果を取得し、単離する有核赤血球候補細胞の個数を決定してから、母体血サンプルから有核赤血球候補細胞を単離するため、超音波検査による膜性診断を採血よりも後に行う場合には、少なくとも膜性診断が行われるまでは、母体血サンプルを冷蔵保存しておくことが好ましい。
胎児由来の有核赤血球細胞は、胎盤を通過して、母親の血液中に存在する赤血球前駆体である。母親が妊娠中には、胎児の赤血球細胞は有核であり得る。この赤血球細胞には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球細胞は、母体血中の細胞の106個に1個の割合で存在しているといわれており、妊婦の抹消血中には非常に存在が少ない。
国際公開第2012/023298号に、この胎児の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、1.065〜1.095g/mL程度、母体の血球の密度は、赤血球が1.070〜1.120g/mL程度、好酸球は1.090〜1.110g/mL程度、好中球は1.075〜1.100g/mL程度、好塩基球が、1.070〜1.080g/mL程度、リンパ球が、1.060〜1.080g/mL程度、単核球が、1.060〜1.070g/mL程度である。
(有核赤血球細胞の濃縮)
母体血サンプルから有核赤血球細胞を単離するためには、まず、母体血サンプル中の有核赤血球細胞を不連続密度勾配遠心分離法によって濃縮することが望ましい。
不連続密度勾配遠心分離法は、密度が相違する第一の媒体および第二の媒体を用いて、不連続な密度勾配を形成させ、その中間の密度を有する成分を分画、濃縮する方法である。
本発明で用いる、第一の媒体および第二の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径15〜30nmのケイ酸コロイド粒子分散液であるパーコール(登録商標、Percoll、シグマアルドリッチ社製)、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるフィコール−パック(登録商標、Ficoll−Paque、GEヘルスケアライフサイエンス社製)、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるヒストパック(登録商標、Histopaque、シグマアルドリッチ社製)等の媒体を使用することができる。本発明では、パーコールまたはヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度(比重)1.130の製品が市販されており、希釈することで目的とする密度(比重)の媒体を調製することが可能である。ヒストパックは、市販されている密度1.077g/mLの媒体と密度1.119g/mLの媒体を用いて、所望の密度である、第一の媒体および第二の媒体を調製することが可能である。
母体血サンプルから有核赤血球細胞を単離するためには、まず、母体血サンプル中の有核赤血球細胞を不連続密度勾配遠心分離法によって濃縮することが望ましい。
不連続密度勾配遠心分離法は、密度が相違する第一の媒体および第二の媒体を用いて、不連続な密度勾配を形成させ、その中間の密度を有する成分を分画、濃縮する方法である。
本発明で用いる、第一の媒体および第二の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径15〜30nmのケイ酸コロイド粒子分散液であるパーコール(登録商標、Percoll、シグマアルドリッチ社製)、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるフィコール−パック(登録商標、Ficoll−Paque、GEヘルスケアライフサイエンス社製)、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるヒストパック(登録商標、Histopaque、シグマアルドリッチ社製)等の媒体を使用することができる。本発明では、パーコールまたはヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度(比重)1.130の製品が市販されており、希釈することで目的とする密度(比重)の媒体を調製することが可能である。ヒストパックは、市販されている密度1.077g/mLの媒体と密度1.119g/mLの媒体を用いて、所望の密度である、第一の媒体および第二の媒体を調製することが可能である。
密度が、1.065〜1.095g/mL程度の有核赤血球を、母体血サンプル中の他の血球成分と分離するために、積層する媒体の密度が設定される。有核赤血球の密度分布の中央値は1.080g/mL程度であるため、この密度をはさむ2つの異なる密度の媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に有核赤血球細胞を含む画分を集めることが可能となる。第一の媒体の密度を1.08g/mL以上1.10g/mL以下、第二の媒体の密度を1.06g/mL以上1.08g/mL未満に設定することが好ましく、第一の媒体の密度を1.08g/mL以上1.09g/mL以下、第二の媒体の密度を1.065g/mL以上1.08g/mL未満に設定することがより好ましい。例えば、第一の媒体の密度を1.085g/mL、第二の媒体の密度を1.075g/mLに設定することで、血漿成分、好酸球および単核球を、有核赤血球を含む画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球およびリンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第一の媒体の種類と第二の媒体の種類は、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はなく、同じであってもよいし、異なってもよいが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい。
(細胞の形態情報取得)
本発明では、母体血サンプルから分離した有核赤血球細胞を含む画分を、透明基板、好ましくは、スライドガラス上に塗布を行い、分析用の標本を作製する。この標本を用いて、細胞の形態情報を用いて胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別する。本発明では、細胞の、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、および核の円形度合い、核領域の面積などを利用して、胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別することが可能であるが、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、または核の円形度合いを満たす条件を有する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補細胞として選別することが好ましい。
本発明では、母体血サンプルから分離した有核赤血球細胞を含む画分を、透明基板、好ましくは、スライドガラス上に塗布を行い、分析用の標本を作製する。この標本を用いて、細胞の形態情報を用いて胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別する。本発明では、細胞の、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、および核の円形度合い、核領域の面積などを利用して、胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別することが可能であるが、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、または核の円形度合いを満たす条件を有する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補細胞として選別することが好ましい。
本発明においては、下記式(I)を満たす有核赤血球候補細胞を選別することが好ましい。
0.25<N/C<1.0 ・・・(I)
ただし、式(I)中、
Cは細胞質の面積(μm2)であり、
Nは核領域の面積(μm2)である。
0.25<N/C<1.0 ・・・(I)
ただし、式(I)中、
Cは細胞質の面積(μm2)であり、
Nは核領域の面積(μm2)である。
また、本発明においては、さらに、下記式(II)を満たす有核赤血球候補細胞を選別することが好ましい。
0.65<N/L2<0.785 ・・・(II)
ただし、式(II)中、
Lは画像解析する細胞の核の長径の長さであり、
Nは上記式(I)におけるNと同義である。
なお、画像解析する細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さである。
0.65<N/L2<0.785 ・・・(II)
ただし、式(II)中、
Lは画像解析する細胞の核の長径の長さであり、
Nは上記式(I)におけるNと同義である。
なお、画像解析する細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さである。
本発明において、細胞の形態情報を用いて胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別するシステムは、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理PC、制御PC、ディスプレイを装備している。光学搬送系は、対物レンズとCCDカメラを備える。画像処理PCは、データ解析、データ記憶を行う処理系を備える。制御PCは、スライドガラス用のステージの位置制御や、全体の処理を制御する制御系を備える。
〈工程4〉
(全ゲノム増幅)
全ゲノム増幅は、例えば単一細胞から回収した微量なDNAを106倍程度に増幅することが可能であり、その増幅産物を用いて、遺伝子変異等の遺伝子解析を容易にする増幅法である。
本発明で用いる全ゲノム増幅法としては、母体血サンプルから単離した有核赤血球候補細胞のそれぞれについて、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼK等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から分離することにより得られたゲノムDNAを用いる。
また、細胞からゲノムDNAを分離することなく、細胞1個をそのまま、PCR反応溶液に添加してもよい。
(全ゲノム増幅)
全ゲノム増幅は、例えば単一細胞から回収した微量なDNAを106倍程度に増幅することが可能であり、その増幅産物を用いて、遺伝子変異等の遺伝子解析を容易にする増幅法である。
本発明で用いる全ゲノム増幅法としては、母体血サンプルから単離した有核赤血球候補細胞のそれぞれについて、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼK等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から分離することにより得られたゲノムDNAを用いる。
また、細胞からゲノムDNAを分離することなく、細胞1個をそのまま、PCR反応溶液に添加してもよい。
全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく試薬PicoPLEX WGA kit(New England Biolabs社製)、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit(Sigma−Aldrich社製)、MALBAC法(国際公開第2012/166425号)を用いることができる。また、鎖置換型DNA合成反応に基づく試薬GenomiPhi(GEヘルスケア社製)、REPLI−g(QIAGEN社製)も同様に用いることができる。本発明では、PicoPLEX WGA kit(New England Biolabs社製)を用いることが好ましい。
全ゲノム増幅により得られた増幅産物(全ゲノム増幅産物)は、アガロースゲル電気泳動により増幅の有無を確認することが好ましい。さらに、全ゲノム増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)等のPCR産物精製キットを用いて精製することが好ましい。
また、全ゲノム増幅産物の濃度について、NanoDrop(Thermo Fisher Scientific社製)、BioAnalyzer(Agilent社製)、Quantus Fluorometer(Promega社製)等のDNA濃度を測定することができる装置を用いて測定することが好ましい。
また、全ゲノム増幅産物の濃度について、NanoDrop(Thermo Fisher Scientific社製)、BioAnalyzer(Agilent社製)、Quantus Fluorometer(Promega社製)等のDNA濃度を測定することができる装置を用いて測定することが好ましい。
〈工程5、工程6〉
《遺伝子多型解析》
全ゲノム増幅した有核赤血球候補細胞は、形態情報に基づいて胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別し、単離したものを全ゲノム増幅したとはいえ、胎児由来の有核赤血球細胞が含まれていない場合や、母親由来の有核赤血球細胞が混入していることが考えられる。
そのため、実施態様としては、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって、全ゲノム増幅した有核赤血球候補細胞から胎児由来の有核赤血球細胞を同定することが好ましい。
《遺伝子多型解析》
全ゲノム増幅した有核赤血球候補細胞は、形態情報に基づいて胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別し、単離したものを全ゲノム増幅したとはいえ、胎児由来の有核赤血球細胞が含まれていない場合や、母親由来の有核赤血球細胞が混入していることが考えられる。
そのため、実施態様としては、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって、全ゲノム増幅した有核赤血球候補細胞から胎児由来の有核赤血球細胞を同定することが好ましい。
遺伝子多型解析は、短い反復配列であるSTR(ショートタンデムリピート)、一塩基多型であるSNPs(スニップス)等の遺伝子多型を同定するものである。本発明では、遺伝子多型部位を含む領域を標的としてPCR増幅を行い、得られたPCR産物の塩基配列を解読し、それぞれの有核赤血球候補細胞の遺伝子多型を同定することが好ましい一態様である。PCR増幅は個々の領域を標的とした複数回のPCR増幅によってもよいが、スループットを向上させられることから、マルチプレックスPCRが好ましい。
遺伝子多型解析のためにPCR増幅する領域は、STR部位、SNPs部位等の遺伝子多型部位を含むとともに、染色体特異的塩基配列を含み、染色体特異的にPCR増幅することが可能な領域に設定することが好ましい。PCR増幅により得られたPCR増幅産物を、遺伝子多型解析だけではなく、染色体異数性の判別を行うためにも使用できるので、効率的である。さらには、遺伝子多型解析と染色体異数性の検出を同時に行い、スループットを向上させることもできる。
それぞれの有核赤血球候補細胞について遺伝子多型解析によって得た遺伝子多型情報と母親の遺伝子多型情報とを対比し、母親と相違した遺伝子多型情報を有するものが胎児由来の有核赤血球と判別することが可能である。母親の遺伝子多型情報は、予め遺伝子多型解析によって得た遺伝子多型情報であってもよいし、母体血から単離した母親由来の細胞、例えば、白血球細胞、について、同様の遺伝子多型解析を行って決定した遺伝子型でもあってよい。
マルチプレックスPCRの標的領域であるが、本発明は、双胎児におけるそれぞれの胎児由来の有核赤血球中の、主として、13番染色体、18番染色体または21番染色体の異数性を検出することを意図しているため、これらの染色体のそれぞれに特異的な領域を合計で少なくとも10箇所選択することが好ましく、少なくとも15箇所選択することがより好ましい。さらに、これらの領域は、遺伝子多型部位を含む領域であることが好ましい。標的領域のサイズは、プライマー部分を除いて、40bp以上が増幅されるようにプライマー対を設計することが好ましく、40bp以上、200bp以下がより好ましい。
(PCR)
PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)は、DNAポリメラーゼを使用して鋳型DNAを繰り返し複製させる。増幅させるDNA塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型DNAとハイブリダイズする短いDNAプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型2本鎖DNAの2本の鎖が解離し別々に複製される。
PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)は、DNAポリメラーゼを使用して鋳型DNAを繰り返し複製させる。増幅させるDNA塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型DNAとハイブリダイズする短いDNAプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型2本鎖DNAの2本の鎖が解離し別々に複製される。
(マルチプレックスPCR)
マルチプレックスPCRは、一般的なPCRに用いられる耐熱性DNAポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが可能であるが、夫々のプライマー対が鋳型DNAにアニーリングする温度が異なる為、反応条件の検討が必要な場合がある。そのため、マルチプレックスPCRに最適化された耐熱性DNAポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが好ましく、本発明では、Multiplex PCR Assay kit(タカラバイオ(株)社製)を用いて反応することがより好ましい。
マルチプレックスPCRは、一般的なPCRに用いられる耐熱性DNAポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが可能であるが、夫々のプライマー対が鋳型DNAにアニーリングする温度が異なる為、反応条件の検討が必要な場合がある。そのため、マルチプレックスPCRに最適化された耐熱性DNAポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが好ましく、本発明では、Multiplex PCR Assay kit(タカラバイオ(株)社製)を用いて反応することがより好ましい。
(増幅産物の配列解析)
マルチプレックスPCRで増幅された産物は、アガロースゲル電気泳動により増幅有無を確認することが好ましい。さらに、マルチプレックスPCR増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製することが好ましい。また、常磁性微小ビーズを利用した精製法であるAMPure XP Kit(BECKMAN COULTER社製)を用いることも可能である。
また、マルチプレックスPCR増幅産物の濃度について、NanoDrop(Thermo Fisher Scientific社製)、BioAnalyzer(Agilent社製)、Quantus Fluorometer(Promega社製)等のDNA濃度を測定することができる装置を用いて測定することが好ましい。
増幅産物の配列解析には、Miseq(Illumina社製)を用いることが可能である。複数のマルチプレックスPCR増幅産物をMiseqを用いて測定する場合、夫々のマルチプレックスPCR増幅産物に6〜8塩基で構成されるサンプル識別配列(インデックス配列)とMiseqフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせる為のP5、P7配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大96種類のマルチプレックスPCR増幅産物を1回で測定することが可能である。
インデックス配列、P5、P7配列のマルチプレックスPCR増幅産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法、PCR法を用いることが可能である。
また、複数のマルチプレックスPCR増幅産物を混合してMiseqで測定する場合には、夫々のPCR産物を正確に定量することが望ましい。定量する方法としては、BioAnalyzer(Agilent社製)、Quantus Fluorometer(Promega社製)を用いることも可能であるが、マルチプレックスPCR増幅産物を定量PCR法で測定する方法がさらに好ましい。本発明での定量方法としては、日本ジェネティクス(株)社製のKAPA Library Quantification Kitsを用いて定量することが好ましい。
マルチプレックスPCRで増幅された産物は、アガロースゲル電気泳動により増幅有無を確認することが好ましい。さらに、マルチプレックスPCR増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製することが好ましい。また、常磁性微小ビーズを利用した精製法であるAMPure XP Kit(BECKMAN COULTER社製)を用いることも可能である。
また、マルチプレックスPCR増幅産物の濃度について、NanoDrop(Thermo Fisher Scientific社製)、BioAnalyzer(Agilent社製)、Quantus Fluorometer(Promega社製)等のDNA濃度を測定することができる装置を用いて測定することが好ましい。
増幅産物の配列解析には、Miseq(Illumina社製)を用いることが可能である。複数のマルチプレックスPCR増幅産物をMiseqを用いて測定する場合、夫々のマルチプレックスPCR増幅産物に6〜8塩基で構成されるサンプル識別配列(インデックス配列)とMiseqフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせる為のP5、P7配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大96種類のマルチプレックスPCR増幅産物を1回で測定することが可能である。
インデックス配列、P5、P7配列のマルチプレックスPCR増幅産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法、PCR法を用いることが可能である。
また、複数のマルチプレックスPCR増幅産物を混合してMiseqで測定する場合には、夫々のPCR産物を正確に定量することが望ましい。定量する方法としては、BioAnalyzer(Agilent社製)、Quantus Fluorometer(Promega社製)を用いることも可能であるが、マルチプレックスPCR増幅産物を定量PCR法で測定する方法がさらに好ましい。本発明での定量方法としては、日本ジェネティクス(株)社製のKAPA Library Quantification Kitsを用いて定量することが好ましい。
Miseqで得られたシークエンスデータ解析する方法としては、Burrows−Wheeler Aligner(BWA)を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、SAMtools、BEDtoolsを用いることで遺伝子の変異や染色体数の定量を解析することが好ましい。
《Y染色体存否確認》
母親由来の有核赤血球細胞にはY染色体は存在しないため、Y染色体の検出は胎児由来であることを示す有力な証拠である。
Y染色体の存否を確認する方法としては、例えば、Y染色体特異的塩基配列を含み、Y染色体特異的にPCR増幅することが可能なY染色体上の領域を標的としてPCR反応を行い、正しい増幅産物が生成したか否かを確認する方法が挙げられる。正しい増幅産物が生成したか否かは、例えば、アガロースゲル電気泳動で所望のサイズのバンドが得られるか否かを確認することによって、またはPCR増幅産物の塩基配列を解読し、所定の領域を増幅したものであるか否かを確認することによって、確認することができる。
標的領域として、遺伝子多型部位を含む領域を選択すれば、遺伝子多型解析にも利用することができ、双胎児の性別が両方とも男であった場合に有用である場合がある。
Y染色体の存否を確認する別の方法としては、例えば、Y染色体特異的な蛍光プローブを用いるFISH法が挙げられる。具体的には、例えば、Abbott社製CEP X/Y DNA Probe Kitを用いた方法が挙げられる。
母親由来の有核赤血球細胞にはY染色体は存在しないため、Y染色体の検出は胎児由来であることを示す有力な証拠である。
Y染色体の存否を確認する方法としては、例えば、Y染色体特異的塩基配列を含み、Y染色体特異的にPCR増幅することが可能なY染色体上の領域を標的としてPCR反応を行い、正しい増幅産物が生成したか否かを確認する方法が挙げられる。正しい増幅産物が生成したか否かは、例えば、アガロースゲル電気泳動で所望のサイズのバンドが得られるか否かを確認することによって、またはPCR増幅産物の塩基配列を解読し、所定の領域を増幅したものであるか否かを確認することによって、確認することができる。
標的領域として、遺伝子多型部位を含む領域を選択すれば、遺伝子多型解析にも利用することができ、双胎児の性別が両方とも男であった場合に有用である場合がある。
Y染色体の存否を確認する別の方法としては、例えば、Y染色体特異的な蛍光プローブを用いるFISH法が挙げられる。具体的には、例えば、Abbott社製CEP X/Y DNA Probe Kitを用いた方法が挙げられる。
《遺伝子型の数の比較》
場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数は、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎および1絨毛膜2羊膜双胎である場合については1つ、2絨毛膜2羊膜双胎である場合については2つである。
遺伝子解析(本発明において「遺伝子多型解析」および「Y染色体存否確認」を総称していう。)によって検出される有核赤血球細胞の遺伝子型の数は、0以上であり、場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数+1を上限とする。
遺伝子解析によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数が場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数と一致しない(不一致である)ときは、工程3に戻り、工程3以降の工程を繰り返す。工程7から工程3に戻る回数は、特に限定されないが、1〜5回が好ましく、1〜3回がより好ましい。
遺伝子解析によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数が場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数と一致するときは、工程7に進み、胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別する。
なお、遺伝子解析によって検出された有核赤血球細胞(胎児由来のものと母親由来のものとを含む)の遺伝子型の数が場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数+1であるときは、胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数と胎児の遺伝子型の数とは一致する。
例えば、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎および1絨毛膜2羊膜双胎のいずれかの場合に胎児が場合分けされたときの有核赤血球細胞について検出された遺伝子型が2種類である場合は、そのうち1種類が胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型であり、2絨毛膜2羊膜双胎である場合に胎児が場合分けされたときの有核赤血球細胞について検出された遺伝子型が3種類である場合は、そのうち2種類が胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型であると判断することができる。これらの場合、有核赤血球細胞の遺伝子型を母親の遺伝子型と対比しなくても、得られた2種類または3種類の遺伝子型のすべてについて染色体異数性の判別を行えば、胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別することができる。母親由来の有核赤血球細胞には染色体異数性がないため、染色体異数性が検出できた場合には胎児由来の有核赤血球細胞に染色体異数性が存在することとなる。
場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数は、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎および1絨毛膜2羊膜双胎である場合については1つ、2絨毛膜2羊膜双胎である場合については2つである。
遺伝子解析(本発明において「遺伝子多型解析」および「Y染色体存否確認」を総称していう。)によって検出される有核赤血球細胞の遺伝子型の数は、0以上であり、場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数+1を上限とする。
遺伝子解析によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数が場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数と一致しない(不一致である)ときは、工程3に戻り、工程3以降の工程を繰り返す。工程7から工程3に戻る回数は、特に限定されないが、1〜5回が好ましく、1〜3回がより好ましい。
遺伝子解析によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数が場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数と一致するときは、工程7に進み、胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別する。
なお、遺伝子解析によって検出された有核赤血球細胞(胎児由来のものと母親由来のものとを含む)の遺伝子型の数が場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数+1であるときは、胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数と胎児の遺伝子型の数とは一致する。
例えば、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎および1絨毛膜2羊膜双胎のいずれかの場合に胎児が場合分けされたときの有核赤血球細胞について検出された遺伝子型が2種類である場合は、そのうち1種類が胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型であり、2絨毛膜2羊膜双胎である場合に胎児が場合分けされたときの有核赤血球細胞について検出された遺伝子型が3種類である場合は、そのうち2種類が胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型であると判断することができる。これらの場合、有核赤血球細胞の遺伝子型を母親の遺伝子型と対比しなくても、得られた2種類または3種類の遺伝子型のすべてについて染色体異数性の判別を行えば、胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別することができる。母親由来の有核赤血球細胞には染色体異数性がないため、染色体異数性が検出できた場合には胎児由来の有核赤血球細胞に染色体異数性が存在することとなる。
工程7から工程3に戻り、工程3以降の工程を繰り返した場合であって、再度の工程7において、遺伝子解析によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数が場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数と一致しないときは、胎児の性別が同じであるか異なるかの情報を取得し、性別が同じである場合には一卵性であるとみなして、それ以上の繰り返しを行わないことが望ましく、性別が異なる場合には二卵性であるから、さらに数回、好ましくは1〜5回、より好ましくは1〜3回、繰り返すことが望ましい。
〈工程7〉
(増幅DNA断片の配列リード数の計測)
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、胎児有核赤血球の細胞が同定された核酸断片に対して、あらかじめ決定された40bp以上200bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。基準(あるいは参照)として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された40bp以上200bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量と、母親由来の増幅産物の増幅量とは、ほぼ、1:1の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、1:1.5(あるいは2:3)の比となると予想される。
(増幅DNA断片の配列リード数の計測)
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅され、胎児有核赤血球の細胞が同定された核酸断片に対して、あらかじめ決定された40bp以上200bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。基準(あるいは参照)として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された40bp以上200bp以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量と、母親由来の増幅産物の増幅量とは、ほぼ、1:1の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、1:1.5(あるいは2:3)の比となると予想される。
本発明においては、あらかじめ、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した母親由来の増幅産物の量に対する胎児由来の増幅産物の量の比を複数求め、その分布を求める。また、トリソミーの胎児を妊娠した母体の、母親由来の増幅産物の量に対する胎児由来の増幅産物の量の比を複数求め、その分布を求める。この2つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定することもできる。この、あらかじめ決定したカットオフ値と、増幅産物の比を求めた結果とを比較して、その比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである、と検査結果を解釈することも可能である。
[胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システム]
本発明の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムは、
[1´]超音波検査の結果に基づく胎児の場合分け情報を取得するための胎児情報取得手段と、胎児の場合分け情報に基づいて母体血サンプルに含まれる細胞の形態情報を取得する形態情報取得手段と、母体血サンプルに含まれる細胞を単離する細胞単離手段と、単離した細胞を全ゲノム増幅するPCR装置と、全ゲノム増幅産物をマルチプレックスPCRするマルチプレックスPCR装置と、PCR増幅産物の塩基配列を解読し、配列リード数を計測するDNAシークエンシング装置とを含む。
本発明の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムは、
[1´]超音波検査の結果に基づく胎児の場合分け情報を取得するための胎児情報取得手段と、胎児の場合分け情報に基づいて母体血サンプルに含まれる細胞の形態情報を取得する形態情報取得手段と、母体血サンプルに含まれる細胞を単離する細胞単離手段と、単離した細胞を全ゲノム増幅するPCR装置と、全ゲノム増幅産物をマルチプレックスPCRするマルチプレックスPCR装置と、PCR増幅産物の塩基配列を解読し、配列リード数を計測するDNAシークエンシング装置とを含む。
より詳細には、本発明の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システムは、
[2´]上記胎児情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞の個数が決定され、
上記形態情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞が選択され、
上記単離手段によって、有核赤血球候補細胞が単離され、
上記PCR装置を用いて単離された有核赤血球候補細胞の全ゲノム増幅が行われ、
上記マルチプレックスPCR装置を用いてマルチプレックスPCRが行われ、
上記DNAシークエンシング装置を用いてマルチプレックスPCRにより得られたDNAフラグメントの塩基配列解読および配列リード数の計測が行われ、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって検出された有核赤血球候補細胞の遺伝子型の数と胎児の場合分けから推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは有核赤血球候補細胞を単離する工程に戻り、以降の工程を繰り返す。
[2´]上記胎児情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞の個数が決定され、
上記形態情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞が選択され、
上記単離手段によって、有核赤血球候補細胞が単離され、
上記PCR装置を用いて単離された有核赤血球候補細胞の全ゲノム増幅が行われ、
上記マルチプレックスPCR装置を用いてマルチプレックスPCRが行われ、
上記DNAシークエンシング装置を用いてマルチプレックスPCRにより得られたDNAフラグメントの塩基配列解読および配列リード数の計測が行われ、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって検出された有核赤血球候補細胞の遺伝子型の数と胎児の場合分けから推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは有核赤血球候補細胞を単離する工程に戻り、以降の工程を繰り返す。
[実施例1]
(超音波検査)
超音波検査装置を用いて、妊娠10週目以前の妊婦を検査し、双胎児妊娠が確認された被験者から末梢血サンプルを入手した。超音波検査装置としては、GEヘルスケア社製のVscan、東芝メディカルシステムズ社製のAplioシリーズを用いることが可能であるが、本発明では、富士フイルム社製のFC1、FAZONE CB、FAZONE Mを用いることが好ましい。
(超音波検査)
超音波検査装置を用いて、妊娠10週目以前の妊婦を検査し、双胎児妊娠が確認された被験者から末梢血サンプルを入手した。超音波検査装置としては、GEヘルスケア社製のVscan、東芝メディカルシステムズ社製のAplioシリーズを用いることが可能であるが、本発明では、富士フイルム社製のFC1、FAZONE CB、FAZONE Mを用いることが好ましい。
(胎児の場合分け情報の取得)
超音波検査により、被験者の膜性は、2絨毛膜2羊膜双胎であることが確認された。胎児の性別は両方男児であり、この時点では、一卵性双胎か二卵性双胎の判別は困難であった。しかしながら、2絨毛膜2羊膜双胎は、確率的には二卵性双胎の可能性が高いと判断した為、後述の有核赤血球候補細胞採取工程において、20個以上の採取を目安とした。
超音波検査により、被験者の膜性は、2絨毛膜2羊膜双胎であることが確認された。胎児の性別は両方男児であり、この時点では、一卵性双胎か二卵性双胎の判別は困難であった。しかしながら、2絨毛膜2羊膜双胎は、確率的には二卵性双胎の可能性が高いと判断した為、後述の有核赤血球候補細胞採取工程において、20個以上の採取を目安とした。
(母体血サンプルの取得)
7mL採血管に抗凝固剤として、EDTAのナトリウム塩を10.5mg添加した後、上記の超音波検査を行った妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血7mLを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
7mL採血管に抗凝固剤として、EDTAのナトリウム塩を10.5mg添加した後、上記の超音波検査を行った妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血7mLを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
(有核赤血球の濃縮工程)
パーコール液(登録商標、シグマアルドリッチ社製)を使用して、密度1.070g/mLと、密度1.095g/mLの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095g/mLの液2mLを添加し、冷蔵庫で4℃に30分冷却した。その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度1.095g/mLの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度1.070g/mLの液2mLを重層した。その後、密度1.070g/mLの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液11mLをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を2000rpmで20分間行った。
パーコール液(登録商標、シグマアルドリッチ社製)を使用して、密度1.070g/mLと、密度1.095g/mLの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度1.095g/mLの液2mLを添加し、冷蔵庫で4℃に30分冷却した。その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度1.095g/mLの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度1.070g/mLの液2mLを重層した。その後、密度1.070g/mLの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液11mLをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を2000rpmで20分間行った。
(スライドガラスへの塗布)
遠沈管を取り出し、密度1.070g/mLと、密度1.095g/mLの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板(以下「スライドガラス基板1」という。)を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板(以下「スライドガラス基板2」という。)を持ち、1端をスライドガラス基板1に30°の角度で接触させ、スライドガラス基板2の接触下面を血液の画分に触れることで、毛管現象により2枚のスライドガラス基板に囲まれた空間に血液が広がった。次に角度を保ったまま、スライドガラス基板2をスライドガラス基板1の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板1上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風で1時間以上十分に乾燥させた。このスライドガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分間浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液(リン酸緩衝液で希釈して濃度3%とした。)に10分間浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させることにより、染色済みのスライドガラス基板を複数枚作製した。
遠沈管を取り出し、密度1.070g/mLと、密度1.095g/mLの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板(以下「スライドガラス基板1」という。)を保持し、その1端に1滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板(以下「スライドガラス基板2」という。)を持ち、1端をスライドガラス基板1に30°の角度で接触させ、スライドガラス基板2の接触下面を血液の画分に触れることで、毛管現象により2枚のスライドガラス基板に囲まれた空間に血液が広がった。次に角度を保ったまま、スライドガラス基板2をスライドガラス基板1の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板1上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風で1時間以上十分に乾燥させた。このスライドガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に3分間浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液(リン酸緩衝液で希釈して濃度3%とした。)に10分間浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させることにより、染色済みのスライドガラス基板を複数枚作製した。
(細胞の形態情報により胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別する工程)
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別するため、電動XYステージと、対物レンズ、CCDカメラを備えた光学顕微の測定系と、XYステージ制御部、Z方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびXY位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。
上記のように準備したスライドガラス基板上に塗布した血液細胞をXYステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、胎児由来の有核赤血球候補細胞を選別するため、電動XYステージと、対物レンズ、CCDカメラを備えた光学顕微の測定系と、XYステージ制御部、Z方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびXY位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。
上記のように準備したスライドガラス基板上に塗布した血液細胞をXYステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の2つの条件を満たす細胞を検出し、XY位置を記録した。
0.25<N/C<1.0 ・・・(I)
0.65<N/L2<0.785 ・・・(II)
ただし、式(I)、(II)中、
Cは画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、
Nは画像解析をおこなう細胞の核の面積であり、
Lは画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さである。
スライドガラス基板上に存在する細胞から、式(I)および(II)を満たすものを20個、胎児由来の有核赤血球候補細胞として選択した。
0.25<N/C<1.0 ・・・(I)
0.65<N/L2<0.785 ・・・(II)
ただし、式(I)、(II)中、
Cは画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、
Nは画像解析をおこなう細胞の核の面積であり、
Lは画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さである。
スライドガラス基板上に存在する細胞から、式(I)および(II)を満たすものを20個、胎児由来の有核赤血球候補細胞として選択した。
(胎児由来の有核赤血球候補細胞の単離)
上記のように選択された胎児由来の有核赤血球候補細胞20個を、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。
上記のように選択された胎児由来の有核赤血球候補細胞20個を、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。
(全ゲノム増幅)
マイクロマニュピュレータを用いて単離した20個の細胞それぞれについて、New England Biolabs社製PicoPLEX WGA kitを用いて、説明書記載に則り細胞中の微量なDNAを約100万倍に増幅し、全ゲノム増幅を行った。
得られた全ゲノム増幅産物は、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて不純物を除去し、Quantus Fluorometer dsDNA System(Promega社製)を用いて増幅産物の濃度を測定した。
マイクロマニュピュレータを用いて単離した20個の細胞それぞれについて、New England Biolabs社製PicoPLEX WGA kitを用いて、説明書記載に則り細胞中の微量なDNAを約100万倍に増幅し、全ゲノム増幅を行った。
得られた全ゲノム増幅産物は、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて不純物を除去し、Quantus Fluorometer dsDNA System(Promega社製)を用いて増幅産物の濃度を測定した。
(マルチプレックスPCR工程)
胎児細胞の分析、染色体の数的異常を分析する目的で、表1および表2に示す23箇所の染色体位置からマルチプレックスPCRに用いるプライマーを作製した。各検出領域のPCR増幅塩基長としては、100〜220塩基対となるようにプライマーを作製、また、各検出領域内は遺伝的多型を含有するようにプライマーの位置を設計した。設計した46種類のプライマーは、各プライマーの終濃度が25nmol/Lとなるように混合した。
胎児細胞の分析、染色体の数的異常を分析する目的で、表1および表2に示す23箇所の染色体位置からマルチプレックスPCRに用いるプライマーを作製した。各検出領域のPCR増幅塩基長としては、100〜220塩基対となるようにプライマーを作製、また、各検出領域内は遺伝的多型を含有するようにプライマーの位置を設計した。設計した46種類のプライマーは、各プライマーの終濃度が25nmol/Lとなるように混合した。
マルチプレックスPCRは、Multiplex PCR Assay kit(タカラバイオ社製)を用いて反応を行った。
反応溶液は、鋳型として各細胞から得られた増幅産物10ngと、46種類混合プライマー8μLと、Multiplex PCR Mix1 0.125μLと、Multiplex PCR Mix2 12.5μLと、水とで最終液量25μLに調製した。
PCR条件は、94℃ 60秒で変性した後、94℃ 30秒、60℃ 90秒、72℃ 30秒を30サイクルとして反応を行った。
得られたPCR産物は、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。
反応溶液は、鋳型として各細胞から得られた増幅産物10ngと、46種類混合プライマー8μLと、Multiplex PCR Mix1 0.125μLと、Multiplex PCR Mix2 12.5μLと、水とで最終液量25μLに調製した。
PCR条件は、94℃ 60秒で変性した後、94℃ 30秒、60℃ 90秒、72℃ 30秒を30サイクルとして反応を行った。
得られたPCR産物は、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。
次に、Miseqを用いたシークエンス反応を行う為に、サンプル識別用のインデックス配列、フローセル結合用P5、P7配列をマルチプレックスPCR増幅産物の両末端へ付加を行った。
プライマーとしては、表3に示すD501−F(配列番号47)、D701−R(配列番号48)、D702−R(配列番号49)、D703−R(配列番号50)、D704−R(配列番号51)、D705−R(配列番号52)およびD706−R(配列番号53)を各1.25μM用いて、Multiplex PCR Assay kitを用いてPCRをおこなった。
PCR条件としては、94℃ 3分で変性した後、94℃ 45秒、50℃ 60秒、72℃ 30秒を5サイクルで反応した後、94℃ 45秒、55℃ 60秒、72℃ 30秒を11サイクルで反応をおこなった。
得られたPCR産物は、AMPure XP Kit(BECKMAN COULTER社製)を用いて精製し、BioAnalyzerを用いて濃度を測定した。
さらに正確な増幅産物の定量として、日本ジェネティクス(株)社製のKAPA Library Quantification Kitsを用いて定量を行った。
プライマーとしては、表3に示すD501−F(配列番号47)、D701−R(配列番号48)、D702−R(配列番号49)、D703−R(配列番号50)、D704−R(配列番号51)、D705−R(配列番号52)およびD706−R(配列番号53)を各1.25μM用いて、Multiplex PCR Assay kitを用いてPCRをおこなった。
PCR条件としては、94℃ 3分で変性した後、94℃ 45秒、50℃ 60秒、72℃ 30秒を5サイクルで反応した後、94℃ 45秒、55℃ 60秒、72℃ 30秒を11サイクルで反応をおこなった。
得られたPCR産物は、AMPure XP Kit(BECKMAN COULTER社製)を用いて精製し、BioAnalyzerを用いて濃度を測定した。
さらに正確な増幅産物の定量として、日本ジェネティクス(株)社製のKAPA Library Quantification Kitsを用いて定量を行った。
(増幅産物の配列解析)
23種類の混合マルチプレックスPCR増幅産物を、Miseq Reagent Kit v2 300 Cycle(ILLUMINA社製)を用いてシークエンスを行い、得られたFastQファイルをBWAを用いてヒトゲノム配列(hg19)へマッピングを行い、SAMtoolsにより遺伝子多型情報を抽出、BEDtoolsにより各検出領域のシークエンスリード数を算出することで解析を行った。
23種類の混合マルチプレックスPCR増幅産物を、Miseq Reagent Kit v2 300 Cycle(ILLUMINA社製)を用いてシークエンスを行い、得られたFastQファイルをBWAを用いてヒトゲノム配列(hg19)へマッピングを行い、SAMtoolsにより遺伝子多型情報を抽出、BEDtoolsにより各検出領域のシークエンスリード数を算出することで解析を行った。
(遺伝子型解析)
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番、18番、21番染色体の表1および表2に示す遺伝子領域のSNPsを比較することで、20個の細胞のうち、3個の細胞が異なるSNP情報を有することが確認できた。また、さらに2個の細胞が異なるSNP情報を有することが確認できた。別途、核の形状より白血球と予想される細胞をマイクロマニュピュレータを用いて、血液を塗布したスライド上から回収し、20個の細胞と同様にしてDNAを増幅し、SNPを調べたところ、15個の細胞のSNPと一致することが確認された。以上より、5個の細胞が胎児由来の有核赤血球細胞であり、その上3個と2個で違うSNP情報が取得されたことから二卵性双胎と確定し、15個の細胞が、母親由来の有核細胞であることが確認された。
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番、18番、21番染色体の表1および表2に示す遺伝子領域のSNPsを比較することで、20個の細胞のうち、3個の細胞が異なるSNP情報を有することが確認できた。また、さらに2個の細胞が異なるSNP情報を有することが確認できた。別途、核の形状より白血球と予想される細胞をマイクロマニュピュレータを用いて、血液を塗布したスライド上から回収し、20個の細胞と同様にしてDNAを増幅し、SNPを調べたところ、15個の細胞のSNPと一致することが確認された。以上より、5個の細胞が胎児由来の有核赤血球細胞であり、その上3個と2個で違うSNP情報が取得されたことから二卵性双胎と確定し、15個の細胞が、母親由来の有核細胞であることが確認された。
(数的異常の検出)
マルチプレックスPCR増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の21番染色体の検出領域の増幅産物の量をMiseqを用いて、確定させた。別途、母親由来と同定された有核細胞のうちの1個の細胞の21番染色体の検出領域の増幅産物の量を、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、確定させた。この2つの量比を計算したところ、1:1に近い値であり、双胎児は正常染色体数であることが推定された。
マルチプレックスPCR増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の21番染色体の検出領域の増幅産物の量をMiseqを用いて、確定させた。別途、母親由来と同定された有核細胞のうちの1個の細胞の21番染色体の検出領域の増幅産物の量を、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、確定させた。この2つの量比を計算したところ、1:1に近い値であり、双胎児は正常染色体数であることが推定された。
[実施例2]
実施例1で採血した妊婦とは別の妊婦から、超音波検査により被験者の膜性は、2絨毛膜2羊膜双胎であることが確認された。胎児の性別は男児、女児であり、この時点で二卵性双胎であることが確認された。その性別結果に基づき、有核赤血球の遺伝型としては、母体由来、胎児男児由来、胎児女児由来の3種類の遺伝型を持つ有核赤血球を取得する必要があるため、有核赤血球候補細胞の単離としては20個以上の採取を目安とした。
実施例1と同様にして、胎児有核赤血球の選別工程において20個の有核赤血球候補細胞を回収し、DNA増幅工程まで同様におこなった。この後のマルチプレックスPCR工程で、実施例1と同様にして、SNPsの確認により胎児由来の有核赤血球が4個存在することを確認した。また、胎児が男児、女児であることから性染色体有無の確認により胎児由来の有核赤血球を判別した結果、男児由来が2個、女児由来が2個であることを確認した。
胎児の染色体数的異常としては、双胎児は正常染色体数であることが推定された。
実施例1で採血した妊婦とは別の妊婦から、超音波検査により被験者の膜性は、2絨毛膜2羊膜双胎であることが確認された。胎児の性別は男児、女児であり、この時点で二卵性双胎であることが確認された。その性別結果に基づき、有核赤血球の遺伝型としては、母体由来、胎児男児由来、胎児女児由来の3種類の遺伝型を持つ有核赤血球を取得する必要があるため、有核赤血球候補細胞の単離としては20個以上の採取を目安とした。
実施例1と同様にして、胎児有核赤血球の選別工程において20個の有核赤血球候補細胞を回収し、DNA増幅工程まで同様におこなった。この後のマルチプレックスPCR工程で、実施例1と同様にして、SNPsの確認により胎児由来の有核赤血球が4個存在することを確認した。また、胎児が男児、女児であることから性染色体有無の確認により胎児由来の有核赤血球を判別した結果、男児由来が2個、女児由来が2個であることを確認した。
胎児の染色体数的異常としては、双胎児は正常染色体数であることが推定された。
[実施例3]
実施例1、2で採血した妊婦とはさらに別の妊婦から末梢血を採取し、超音波検査により被験者の膜性は、2絨毛膜2羊膜双胎であることが確認された。胎児の性別は男児、女児であり、この時点で二卵性双胎であることが確認された。その性別結果に基づき、有核赤血球の遺伝型としては、母体由来、胎児男児由来、胎児女児由来の3種類の遺伝型を持つ有核赤血球を取得する必要があるが、本発明の有効性を確認する為、有核赤血球の単離としては10個の採取を実施した。
実施例2と同様にして、胎児有核赤血球の選別工程において10個の細胞を回収し、DNA増幅工程まで同様におこなった。この後のマルチプレックスPCR工程で、実施例2と同様にして、SNPsを確認したところ胎児由来の有核赤血球を4個の存在を確認した。しかし、胎児が男児由来の有核赤血球のみしか取得することができず、女児由来の胎児有核赤血球を取得することができていないことが明らかとなった。
実施例1、2で採血した妊婦とはさらに別の妊婦から末梢血を採取し、超音波検査により被験者の膜性は、2絨毛膜2羊膜双胎であることが確認された。胎児の性別は男児、女児であり、この時点で二卵性双胎であることが確認された。その性別結果に基づき、有核赤血球の遺伝型としては、母体由来、胎児男児由来、胎児女児由来の3種類の遺伝型を持つ有核赤血球を取得する必要があるが、本発明の有効性を確認する為、有核赤血球の単離としては10個の採取を実施した。
実施例2と同様にして、胎児有核赤血球の選別工程において10個の細胞を回収し、DNA増幅工程まで同様におこなった。この後のマルチプレックスPCR工程で、実施例2と同様にして、SNPsを確認したところ胎児由来の有核赤血球を4個の存在を確認した。しかし、胎児が男児由来の有核赤血球のみしか取得することができず、女児由来の胎児有核赤血球を取得することができていないことが明らかとなった。
Claims (5)
- 母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程を有する胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法であって、
前記胎児が、超音波検査の結果に基づいて、単胎、1絨毛膜1羊膜双胎、1絨毛膜2羊膜双胎および2絨毛膜2羊膜双胎から選択されるいずれか1つの場合に場合分けがされた胎児であり、かつ、前記DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を前記場合分けに基づいて最適化する、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法。 - 前記最適化することが、前記DNAを解析する有核赤血球候補細胞の個数を、
単胎である場合の個数≦1絨毛膜1羊膜双胎である場合の個数<1絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数<2絨毛膜2羊膜双胎である場合の個数
と設定することを含む、請求項1に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法。 - 前記母体血中から単離した有核赤血球候補細胞のDNAを解析する工程が以下の工程を含む、請求項1または2に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別方法:
〈工程1〉下記a)〜d)に示す、超音波検査によって得られた膜性情報に基づく胎児の場合分け情報を取得する工程
a)単胎
b)1絨毛膜1羊膜双胎
c)1絨毛膜2羊膜双胎
d)2絨毛膜2羊膜双胎
〈工程2〉母体血サンプルから単離する有核赤血球候補細胞の個数を前記場合分け情報に基づいて決定する工程、
〈工程3〉母体血サンプルから前記個数の有核赤血球候補細胞を単離する工程、
〈工程4〉単離した有核赤血球候補細胞を、それぞれ、全ゲノム増幅する工程、
〈工程5〉全ゲノム増幅産物を用いて、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認を行う工程、
〈工程6〉前記遺伝子多型解析および/または前記Y染色体存否確認によって検出された胎児由来の有核赤血球細胞の遺伝子型の数と前記胎児の場合分け情報から推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは工程3に戻ることを選択する工程、ならびに
〈工程7〉前記胎児由来の有核赤血球細胞の染色体異数性を判別する工程。 - 超音波検査の結果に基づく胎児の場合分け情報を取得するための胎児情報取得手段と、胎児の場合分け情報に基づいて母体血サンプルに含まれる細胞の形態情報を取得する形態情報取得手段と、母体血サンプルに含まれる細胞を単離する細胞単離手段と、単離した細胞を全ゲノム増幅するPCR装置と、全ゲノム増幅産物をマルチプレックスPCRするマルチプレックスPCR装置と、PCR増幅産物の塩基配列を解読し、配列リード数を計測するDNAシークエンシング装置とを含む、胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システム。
- 前記胎児情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞の個数が決定され、
前記形態情報取得手段によって取得した情報に基づいて、単離する有核赤血球候補細胞が選択され、
前記単離手段によって、有核赤血球候補細胞が単離され、
前記PCR装置を用いて単離された有核赤血球候補細胞の全ゲノム増幅が行われ、
前記マルチプレックスPCR装置を用いてマルチプレックスPCRが行われ、
前記DNAシークエンシング装置を用いてマルチプレックスPCRにより得られたDNAフラグメントの塩基配列解読および配列リード数の計測が行われ、遺伝子多型解析および/またはY染色体存否確認によって検出された有核赤血球候補細胞の遺伝子型の数と胎児の場合分けから推定される胎児の遺伝子型の数とを比較し、一致しているときは次工程に進み、一致していないときは有核赤血球候補細胞を単離する工程に戻り、以降の工程を繰り返す、
請求項4に記載の胎児の染色体異数性の非侵襲的判別システム。
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