CN106244535A - 孕妇外周血中胎儿游离dna的保存剂及其构成的真空采血管 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂及其构成的真空采血管，解决了目前尚未见成熟的孕妇外周血中游离DNA的体外检测的采集和保存技术，导致现有血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解的问题。本发明的保存剂包括细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂。本发明能稳定母体外周血有核细胞，防止释放细胞染色体DNA，抑制DNA酶介导降解，有助于胎儿游离DNA的整体稳定。

Description

孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂及其构成的真空采血管
技术领域
本发明涉及一种产前诊断领域，具体涉及一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂及其构成的真空采血管。
背景技术
无创伤性产前诊断主要是利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行的诊断，孕妇从怀孕7周开始即可检测到胎儿游离DNA，利用胎儿游离DNA可以早期、特异地进行产前筛查和诊断。
但是，孕妇血浆中胎儿游离DNA的量甚微，仅占总游离DNA的约5％～7％，且极易受到母体有核细胞破裂释放出的染色体DNA污染和细胞内高浓度的DNA酶降解。
研究表明游离胎儿DNA检测分析前因素如：血样采集、保存、血浆分离方法等不当时，会明显影响分析的效果。而且，目前尚未见成熟的孕妇外周血中游离DNA的体外检测的采集和保存技术，导致现有血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解、易污染的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：目前尚未见成熟的孕妇外周血中游离DNA的体外检测的采集和保存技术，导致现有血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解的问题，提供解决上述问题的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂及其构成的真空采血管。
本发明通过下述技术方案实现：
一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，包括细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂。
本发明通过上述组分的结合，能稳定母体外周血有核细胞，防止释放细胞染色体DNA，抑制DNA酶介导降解，有助于胎儿游离DNA的整体稳定。解决了血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解的问题。
优选地，所述细胞稳定剂为60～250重量份，抗凝剂为15～22重量份，缓冲液为12～40重量份，代谢抑制剂为0.5～3重量份，DNA酶抑制剂为0.2～2重量份。
通过上述组成配比的优化，能极大保证孕妇外周血在常温下的保存时间，保存时间甚至可以达到7天以上，且在该保存期间内，胎儿游离DNA的量不会发生显著降解。
进一步，所述细胞稳定剂由50～200重量份的重氮咪唑烷基脲和1～5重量份的NaF组成；或所述细胞稳定剂由50～200重量份的重氮咪唑烷基脲和10～50重量份的浓度为40％的甲醛组成。
更进一步，所述抗凝剂为EDTA钾盐或EDTA钠盐。所述缓冲液为终浓度为10mM的标准Tris-Cl缓冲液。所述代谢抑制剂为分子生物级糖原。所述DNA酶抑制剂为二硫苏糖醇(DTT)。
一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管，包括采血管本体，设置在采血管本体内用于将血液细胞和血浆进行隔离的惰性分离胶，以及设置在采血管本体内如权利要求1～7任一项所述的保存剂。
本发明通过惰性分离胶的设置，在临床机构常用离心条件(如1500g-2200g离心力)分离后，能有效将血细胞隔离，防止血细胞尤其是有核细胞成分对样品血浆的影响，进一步提高胎儿游离DNA的稳定性。
进一步，所述惰性分离胶的密度为1.05～1.07g/cm3。
更进一步地，所述采血管本体的内壁膜化处理，处理方法为：采血管内壁进行超声波洁净处理，喷涂水溶性硅油和乳化剂混合制成的混合液，经150～200℃干燥，表面形成光滑永固且不与添加剂及血液发生反应的一层仿生膜。混合液中水溶性硅油和乳化剂的重量配比为40～80∶250～500。该混合液的具体制备方法如下：
定量称取乳化剂40～80份，水溶性硅油250～500，将水溶性硅油按60～120滴/秒的速度缓慢滴加入乳化剂中，匀速搅拌5～20分钟，直到混合物呈透明均匀粘性体，然后溶入1000份纯化水而成。
同理，本发明中的采血管本体可以采用玻璃或塑料材质构成，如本发明的真空采血管可以是实验室用中性玻璃材质，也可以是满足真空保持和水份稳定的PET塑料材质。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明通过上述组成成分的组合，能稳定母体外周血有核细胞，防止释放细胞染色体DNA，抑制DNA酶介导降解，有助于胎儿游离DNA的整体稳定；
2、本发明通过配比和具体物质的优化，能有效使保存时间更长，保存效果更佳；
3、本发明通过惰性分离胶的设置，能有效将血细胞隔离，防止血细胞尤其是有核细胞成分对样品血浆的影响，进一步提高胎儿游离DNA的稳定性；
4、本发明通过采血管的内壁膜化处理，降低对胎儿游离DNA的吸附，提高检测时胎儿游离DNA的准确度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，包括细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂。
本实施例中该细胞稳定剂为重氮咪唑烷基脲和NaF，该抗凝剂为EDTA钾盐，该缓冲液为终浓度为10mM的标准Tris-Cl缓冲液，该代谢抑制剂为分子生物级糖原，该DNA酶抑制剂为二硫苏糖醇(DTT)。
其中，各组分的配比具体设置如表1所示。
表1
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中将实施例1中的NaF替换成了浓度为40％的甲醛作为实例4-6，具体设置如下：
实例4：将实例1中的NaF替换成了添加量为30μl的浓度为40％的甲醛；
实例5：将实例2中的NaF替换成了添加量为10μl的浓度为40％的甲醛；
实例6：将实例3中的NaF替换成了添加量为50μl的浓度为40％的甲醛。
实施例3
本实施例提供了一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管，包括采血管本体，设置在采血管本体内用于将血液细胞和血浆进行隔离的惰性分离胶，以及设置在采血管本体内的保存剂。
本实施例中该惰性分离胶的密度为1.05～1.07g/cm3，该采血管本体采用塑料材质构成，同时，本实施例还对采血管本体的内壁膜化处理，处理方法如下：
采血管内壁进行超声波洁净处理，在采血管内壁上喷涂水溶性硅油和乳化剂混合制成的混合液，经150～200℃干燥，表面形成光滑永固且不与添加剂及血液发生反应的一层仿生膜。
混合液的具体制备方法为：定量称取乳化剂60重量份，水溶性硅油400重量份，将水溶性硅油按60～120滴/秒的速度缓慢滴加入乳化剂中，匀速搅拌5～20分钟，直到混合物呈透明均匀粘性体，然后溶入1000重量份纯化水而成。
选取孕龄12-30周健康待产孕妇50例，分别采用实施例1和实施例2中的保存剂以及常规EDTA-K3采血管对同一孕妇外周血的血液标本进行处理，对处理后的外周血进行检测，然后再常温保存7天，再对采血管内外周血进行检测，检测结果如表2所示。本实施例中保存剂1ml可采集保存血液为10ml。
检测时，使用荧光定量PCR技术检测ALU基因长片段的CT值以换算出血浆中总游离DNA含量。检测SRY基因当量(GE)变化体现DNA含量变化。
表2
通过表2可知：采用实施例1至实施例2的产品对孕妇外周血进行保存后，外周血中的胎儿游离DNA稳定性远远高于对照例和常规EDTA-K3管，且同期保存胎儿游离DNA在常温下7天后含量无显著差异。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，其特征在于，包括细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，其特征在于，所述细胞稳定剂为60～250重量份，抗凝剂为15～22重量份，缓冲液为12～40重量份，代谢抑制剂为0.5～3重量份，DNA酶抑制剂为0.2～2重量份。
3.根据权利要求1所述的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，其特征在于，所述细胞稳定剂由50～200重量份的重氮咪唑烷基脲和1～5重量份的NaF组成；或所述细胞稳定剂由50～200重量份的重氮咪唑烷基脲和10～50重量份的浓度为40%的甲醛组成。
4.根据权利要求1或2所述的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，其特征在于，所述抗凝剂为EDTA钾盐或EDTA钠盐。
5. 根据权利要求1或2所述的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，其特征在于，所述缓冲液为终浓度为10mM的标准Tris-Cl 缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，其特征在于，所述代谢抑制剂为分子生物级糖原。
7.根据权利要求1或2所述的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂，其特征在于，所述DNA酶抑制剂为二硫苏糖醇。
8.一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管，其特征在于，包括采血管本体，设置在采血管本体内用于将血液细胞和血浆进行隔离的惰性分离胶，以及设置在采血管本体内如权利要求1～7任一项所述的保存剂。
9. 根据权利要求8所述的一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管，其特征在于，所述惰性分离胶的密度为1.05～1.07 g/cm3。
10.根据权利要求8或9所述的一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管，其特征在于，所述采血管本体的内壁膜化处理，处理方法为：
采血管内壁进行清洁，喷涂水溶性硅油和乳化剂的混合液，然后经150～200℃干燥即可。
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