CN106244535B - 孕妇外周血中胎儿游离dna的保存剂及其构成的真空采血管 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂及其构成的真空采血管,解决了目前尚未见成熟的孕妇外周血中游离DNA的体外检测的采集和保存技术,导致现有血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解的问题。本发明的保存剂包括细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂。本发明能稳定母体外周血有核细胞,防止释放细胞染色体DNA,抑制DNA酶介导降解,有助于胎儿游离DNA的整体稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种产前诊断领域,具体涉及一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂及其构成的真空采血管。
背景技术
无创伤性产前诊断主要是利用孕妇血浆中游离胎儿DNA进行的诊断,孕妇从怀孕7周开始即可检测到胎儿游离DNA,利用胎儿游离DNA可以早期、特异地进行产前筛查和诊断。
但是,孕妇血浆中胎儿游离DNA的量甚微,仅占总游离DNA的约5%~7%,且极易受到母体有核细胞破裂释放出的染色体DNA污染和细胞内高浓度的DNA酶降解。
研究表明游离胎儿DNA检测分析前因素如:血样采集、保存、血浆分离方法等不当时,会明显影响分析的效果。而且,目前尚未见成熟的孕妇外周血中游离DNA的体外检测的采集和保存技术,导致现有血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解、易污染的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:目前尚未见成熟的孕妇外周血中游离DNA的体外检测的采集和保存技术,导致现有血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解的问题,提供解决上述问题的一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂及其构成的真空采血管。
本发明通过下述技术方案实现:
一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂,包括细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂。
本发明通过上述组分的结合,能稳定母体外周血有核细胞,防止释放细胞染色体DNA,抑制DNA酶介导降解,有助于胎儿游离DNA的整体稳定。解决了血浆中胎儿游离DNA保存时间短、易降解的问题。
优选地,所述细胞稳定剂为60~250重量份,抗凝剂为15~22重量份,缓冲液为12~40重量份,代谢抑制剂为0.5~3重量份,DNA酶抑制剂为0.2~2重量份。
通过上述组成配比的优化,能极大保证孕妇外周血在常温下的保存时间,保存时间甚至可以达到7天以上,且在该保存期间内,胎儿游离DNA的量不会发生显著降解。
进一步,所述细胞稳定剂由50~200重量份的重氮咪唑烷基脲和1~5重量份的NaF组成;或所述细胞稳定剂由50~200重量份的重氮咪唑烷基脲和10~50重量份的浓度为40%的甲醛组成。
更进一步,所述抗凝剂为EDTA钾盐或EDTA钠盐。所述缓冲液为终浓度为10mM的标准Tris-Cl缓冲液。所述代谢抑制剂为分子生物级糖原。所述DNA酶抑制剂为二硫苏糖醇(DTT)。
一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管,包括采血管本体,设置在采血管本体内用于将血液细胞和血浆进行隔离的惰性分离胶,以及设置在采血管本体内如权利要求1~7任一项所述的保存剂。
本发明通过惰性分离胶的设置,在临床机构常用离心条件(如1500g-2200g离心力)分离后,能有效将血细胞隔离,防止血细胞尤其是有核细胞成分对样品血浆的影响,进一步提高胎儿游离DNA的稳定性。
进一步,所述惰性分离胶的密度为1.05~1.07g/cm3。
更进一步地,所述采血管本体的内壁膜化处理,处理方法为:采血管内壁进行超声波洁净处理,喷涂水溶性硅油和乳化剂混合制成的混合液,经150~200℃干燥,表面形成光滑永固且不与添加剂及血液发生反应的一层仿生膜。混合液中水溶性硅油和乳化剂的重量配比为40~80∶250~500。该混合液的具体制备方法如下:
定量称取乳化剂40~80份,水溶性硅油250~500,将水溶性硅油按60~120滴/秒的速度缓慢滴加入乳化剂中,匀速搅拌5~20分钟,直到混合物呈透明均匀粘性体,然后溶入1000份纯化水而成。
同理,本发明中的采血管本体可以采用玻璃或塑料材质构成,如本发明的真空采血管可以是实验室用中性玻璃材质,也可以是满足真空保持和水份稳定的PET塑料材质。
本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
1、本发明通过上述组成成分的组合,能稳定母体外周血有核细胞,防止释放细胞染色体DNA,抑制DNA酶介导降解,有助于胎儿游离DNA的整体稳定;
2、本发明通过配比和具体物质的优化,能有效使保存时间更长,保存效果更佳;
3、本发明通过惰性分离胶的设置,能有效将血细胞隔离,防止血细胞尤其是有核细胞成分对样品血浆的影响,进一步提高胎儿游离DNA的稳定性;
4、本发明通过采血管的内壁膜化处理,降低对胎儿游离DNA的吸附,提高检测时胎儿游离DNA的准确度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂,包括细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂。
本实施例中该细胞稳定剂为重氮咪唑烷基脲和NaF,该抗凝剂为EDTA钾盐,该缓冲液为终浓度为10mM的标准Tris-Cl缓冲液,该代谢抑制剂为分子生物级糖原,该DNA酶抑制剂为二硫苏糖醇(DTT)。
其中,各组分的配比具体设置如表1所示。
表1
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于,本实施例中将实施例1中的NaF替换成了浓度为40%的甲醛作为实例4-6,具体设置如下:
实例4:将实例1中的NaF替换成了添加量为30μl的浓度为40%的甲醛;
实例5:将实例2中的NaF替换成了添加量为10μl的浓度为40%的甲醛;
实例6:将实例3中的NaF替换成了添加量为50μl的浓度为40%的甲醛。
实施例3
本实施例提供了一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管,包括采血管本体,设置在采血管本体内用于将血液细胞和血浆进行隔离的惰性分离胶,以及设置在采血管本体内的保存剂。
本实施例中该惰性分离胶的密度为1.05~1.07g/cm3,该采血管本体采用塑料材质构成,同时,本实施例还对采血管本体的内壁膜化处理,处理方法如下:
采血管内壁进行超声波洁净处理,在采血管内壁上喷涂水溶性硅油和乳化剂混合制成的混合液,经150~200℃干燥,表面形成光滑永固且不与添加剂及血液发生反应的一层仿生膜。
混合液的具体制备方法为:定量称取乳化剂60重量份,水溶性硅油400重量份,将水溶性硅油按60~120滴/秒的速度缓慢滴加入乳化剂中,匀速搅拌5~20分钟,直到混合物呈透明均匀粘性体,然后溶入1000重量份纯化水而成。
选取孕龄12-30周健康待产孕妇50例,分别采用实施例1和实施例2中的保存剂以及常规EDTA-K3采血管对同一孕妇外周血的血液标本进行处理,对处理后的外周血进行检测,然后再常温保存7天,再对采血管内外周血进行检测,检测结果如表2所示。本实施例中保存剂1ml可采集保存血液为10ml。
检测时,使用荧光定量PCR技术检测ALU基因长片段的CT值以换算出血浆中总游离DNA含量。检测SRY基因当量(GE)变化体现DNA含量变化。
表2
通过表2可知:采用实施例1至实施例2的产品对孕妇外周血进行保存后,外周血中的胎儿游离DNA稳定性远远高于对照例和常规EDTA-K3管,且同期保存胎儿游离DNA在常温下7天后含量无显著差异。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种孕妇外周血中胎儿游离DNA的保存剂,其特征在于,由细胞稳定剂、抗凝剂、缓冲液、代谢抑制剂和DNA酶抑制剂组成;
所述细胞稳定剂为60~250重量份,抗凝剂为15~22重量份,缓冲液为12~40重量份,代谢抑制剂为0.5~3重量份,DNA酶抑制剂为0.2~2重量份;
所述细胞稳定剂由50~200重量份的重氮咪唑烷基脲和1~5重量份的NaF组成;或所述细胞稳定剂由50~200重量份的重氮咪唑烷基脲和10~50重量份的浓度为40%的甲醛组成;
所述抗凝剂为EDTA钾盐;
所述缓冲液为终浓度为10mM的标准Tris-Cl 缓冲液;
所述代谢抑制剂为分子生物级糖原;
所述DNA酶抑制剂为二硫苏糖醇。
2.一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管,其特征在于,包括采血管本体,设置在采血管本体内用于将血液细胞和血浆进行隔离的惰性分离胶,以及设置在采血管本体内如权利要求1所述的保存剂。
3. 根据权利要求2所述的一种用于孕妇外周血中胎儿游离DNA检测的真空采血管,其特征在于,所述惰性分离胶的密度为1.05~1.07 g/cm3。
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