CN101620220A - 一种可兼用作溶血剂的破膜剂及其用法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可用作溶血剂的破膜剂。其主要成分为皂角苷，叠氮钠和多聚甲醛，将适量上述组分混合，溶解在磷酸盐缓冲液中，可制得本发明的破膜剂，将其稀释后可用作溶血剂。与现有溶血剂和破膜剂相比，本发明涉及的破膜剂既可以直接用作破膜剂又可以稀释后用作溶血剂，具有双重用途。本发明涉及的溶血剂和破膜剂可应用于流式细胞仪检测人体血液中各项免疫学指标，其检测特异性和敏感性等方面明显优于进口试剂，特别是在白血病、红细胞增多症、重型肝病病人全血标本溶血和破膜等预处理过程中更加具有优势。
Description
技术领域
本发明属于医疗检测用试剂领域。具体涉及用于流式细胞仪的辅助检测用试剂。
背景技术
随着流式细胞仪的普及和应用，其配套试剂的开发和研制也日益重要。目前，国内很多医院和实验室都使用国外进口的溶血剂和破膜剂，如BDIS，BD-Pharmingen，Immunotech，Caltag等公司的产品。普遍存在用途单一、裂解不完全、目的细胞丢失、价格昂贵等缺点。
发明内容
本发明针对现有技术的缺点，提供用于流式细胞分析的破膜剂，以及将其稀释后的溶血剂，其检测的特异性和敏感性等方面明显优于进口试剂，检测成本低，稳定性好，使用简便易行，适用于科研和临床流式检测。
本发明还提供此破膜剂的配制方法和使用方法。
本发明涉及的破膜剂的主要成分和配制方法为：
皂角苷(saponin) 0.1-0.5％
叠氮化钠(NaN3) 0.05-0.5％
多聚甲醛(paraformaldehyde) 1-4％；
首先准确称取多聚甲醛，置于0.01M磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffered saline，简称PBS)中，在37℃水浴箱中水浴1-2小时。若有部分不溶解，可以逐滴加入0.01M的氢氧化钠(NaOH)助溶，直至完全溶解。待冷却后，分别加入皂角苷和NaN3，用0.01M PBS补足体积(总体积为1)；调整pH 7.0-7.4(25℃)；最后用G5漏斗除菌、过滤。制得破膜剂，为方便叙述，将此破膜剂简称A液。
本发明采用的皂角苷是从植物中提取，由皂角苷元和糖、糖醛酸或其他有机酸组成的。有刺激性气味，能溶于水；本发明采用的多聚甲醛是低分子量多聚甲醛((CH2O)n)，为白色结晶粉末，不溶于乙醇，微溶于冷水，溶于稀酸、稀碱。
此破膜剂A液可直接用于流式细胞仪分析细胞内免疫指标。
另外，本发明涉及的破膜剂A液可稀释后用作溶血剂，采用特定浓度范围的NaN3、多聚甲醛的0.01M磷酸盐缓冲液溶液，将破膜剂中的皂角苷稀释为皂角苷含量为0.05％，制得溶血剂。
特别的，可采用与溶血剂中NaN3、多聚甲醛的浓度相同的NaN3、多聚甲醛(其范围分别为0.05-0.5％和1-4％)的0.01M磷酸盐缓冲液溶液，将破膜剂中的皂角苷稀释为皂角苷含量为0.05％，制得溶血剂。也就是说，稀释可采用以下成分和配比的稀释剂进行：
NaN3 0.05-0.5％
多聚甲醛 1-4％
0.01M磷酸盐缓冲液 余量；
稀释剂中各成分的浓度与权利要求1所述的破膜剂中相同成分的浓度相同。
制得的溶血剂的成分和配比为：
皂角苷 0.05％
NaN3 0.05-0.5％
多聚甲醛 1-4％
0.01M磷酸盐缓冲液 余量。
稀释可采用相应体积的与A液中NaN3、多聚甲醛的浓度一致NaN3和多聚甲醛的0.01M磷酸盐缓冲液溶液分别稀释；也可以加入相应重量份的NaN3、多聚甲醛和磷酸盐后，加入蒸馏水稀释；还可以将NaN3和多聚甲醛与磷酸缓冲液配置成稀释剂稀释。优选的稀释方法为将NaN3、多聚甲醛与磷酸缓冲液配置成可稳定保存的浓溶液，使用前用蒸馏水稀释用作稀释剂。
优选稀释方法详述如下：
1)配置下列成分和组成的溶液，为便于叙述，将此稀释剂浓溶液称为B溶液：
叠氮化钠(NaN3) 0.5-5％
多聚甲醛(paraformaldehyde) 10-40％
0.1M磷酸盐缓冲液 余量
为方便保存和稀释，一般可将B溶液的各组分的具体浓度配置为相应A液中同样组分浓度的10倍；
2)使用前用蒸馏水稀释为稀释剂，稀释剂中叠氮化钠、多聚甲醛的浓度与相应破膜剂中叠氮化钠、多聚甲醛的浓度相同；
3)将适量稀释剂与破膜剂A液混合，使溶液中的皂角苷含量为0.05％，制得用于溶血的溶血剂。
优选稀释方法中所用的B溶液在常温下可稳定保存，实验证明本发明的B溶液可以保存6个月以上，使用前用蒸馏水稀释即可用作稀释剂。采用此稀释方法，既便于保存稀释剂，又使稀释步骤简单易行。
本发明的溶血剂是皂角苷含量为0.05％，稀释剂与破膜剂A液的的混合液，可用于流式细胞仪分析细胞表型免疫指标。
本发明涉及的可用作溶血剂的破膜剂的使用方法为：
1)用作破膜剂：可直接作为破膜剂应用于流式细胞仪检测细胞内多项免疫学指标；
2)用作溶血剂：将破膜剂中的皂角苷稀释至0.05％，可用作检测临床血标本免疫表型的溶血剂。
具体地说，本发明涉及的可用作溶血剂的破膜剂的使用方法为：
1、作为溶血剂应用于流式细胞仪检测临床血标本的免疫表型分析：取适量抗凝血(室温存放，在24小时内使用EDTA，肝素或柠檬酸钠抗凝的全血样本)，加入检测细胞表面分子用的荧光素标记抗体，混和均匀，避光孵育；加入溶血剂：破膜剂的稀释液(皂角苷含量为0.05％，稀释剂与破膜剂A液的的混合液)，振荡均匀；离心去除上清液；加入固定剂。于48小时内上机分析。
2、作为破膜剂应用于流式细胞仪检测临床血标本细胞内多项免疫学指标：取适量抗凝血(室温存放，在24小时内使用的EDTA，肝素或柠檬酸钠抗凝的全血样本)，加入检测细胞表面分子用的荧光标记抗体，混和均匀，避光孵育；加入溶血剂：破膜剂的稀释液(皂角苷含量为0.05％，稀释剂与破膜剂A液的的混合液)，振荡均匀，离心去除上清液；重悬；离心去除上清液；加入破膜剂A液，振荡均匀；离心去除上清液；加入胞内细胞因子检测用荧光素标记抗体，混和均匀，避光孵育；重悬洗涤细胞，离心去除上清液；加入固定剂。于48小时内上机分析。
3、作为破膜剂应用于流式细胞仪检测外周血PBMC(外周血单个核细胞)的细胞内多项免疫学指标：取新鲜的PBMC，加入检测细胞表面分子用的荧光素标记抗体，混和均匀，避光孵育；加入破膜剂A液，振荡均匀；离心去除上清液；加入检测细胞内细胞因子用的荧光素标记抗体，混和均匀，避光孵育；重悬洗涤细胞，离心(300g，5分钟)去除上清液；加入固定剂。于48小时内上机分析。
与现有溶血剂和破膜剂相比，本发明涉及的破膜剂既可以直接用作破膜剂又可以稀释后用作溶血剂，具有双重用途。溶血作用好，既能保证白细胞不被破坏，保留原有的生物活性，又能完全裂解红细胞，产生的细胞碎片少，降低染色背景，减少非特异染色，一般可以获得富集血液样本中90％以上的白细胞。
而且，本发明涉及的溶血剂和破膜剂的检测特异性和敏感性等方面明显优于进口试剂，可以用于诸如白血病、红细胞增多症、重型肝病病人的全血标本的溶血和破膜，解决由于其外周血中含有较多有核红细胞，现有溶血剂和破膜剂裂解红细胞不完全或者损伤白细胞产生大量的碎片的问题；也可以处理红细胞含量较多或者脂肪细胞较多的组织样本；还可以用于Th1/Th2细胞内因子检测，白血病免疫分型和细胞内相关指标的检测，处理效果良好。
本发明涉及的破膜剂，其稀释剂浓溶液：B溶液以及溶血剂的稳定性好，实验证明可以保存6个月以上。配置方法简单易行，原料成本低廉，制备简单，应用方便，使用者可根据需要自行选择，适用于科研和临床流式检测。
附图说明
图1为市售溶血剂和本发明溶血剂的流式FSC/SSC点图结果比较，A，B，C分别为应用市售溶血剂BD，JM和本发明的溶血剂溶血后样品的流式FSC/SSC点图，其中R1，R2，R3，R4分别为淋巴细胞群，单核细胞群，粒细胞群和碎片。
图2为市售溶血剂和本发明溶血剂在血标本细胞免疫表型检测中的比较，A，B分别为应用市售溶血剂BD和本发明的溶血剂处理血标本的细胞免疫表型检测结果。
图3为市售破膜剂与本发明破膜剂在细胞内颗粒酶检测应用中的比较，A，B分别为应用市售破膜剂BD和本发明的破膜剂处理全血标本的细胞内颗粒酶检测结果。
图4为市售破膜剂与本发明破膜剂在细胞内细胞因子检测中的比较，A，B分别为应用市售破膜剂BD和本发明的破膜剂处理全血标本的细胞内细胞因子检测结果。
图5为溶血剂的加速稳定性试验。A，B分别为4℃保存与37℃保存6天的溶血剂处理血样品后的FSC/SSC点图。其中R1，R2分别为淋巴细胞群，单核细胞群。
图6为破膜剂的加速稳定性试验。A，B分别为4℃保存与37℃保存6天的破膜剂处理血样品后的检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
采用分析级纯度的试剂配置破膜剂和稀释剂浓溶液，首先准确称取多聚甲醛1g，置于一定量的0.01M磷酸盐缓冲液(Phosphate bufferedsaline，简称PBS)中，在37℃水浴箱中水浴1小时，逐滴加入0.01M的氢氧化钠(NaOH)助溶不溶解的多聚甲醛，直至完全溶解，冷却至室温。加入准确称取的皂角苷0.5g，叠氮化钠0.05g，直至完全溶解，用0.01M的PBS补足体积，使重量为100g；用1N的盐酸(HCl)调整pH至7.2(25℃)；最后用G5漏斗除菌、过滤，得到破膜剂A液。
准确称取多聚甲醛10g，置于一定量的0.1M磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，简称PBS)中，在37℃水浴箱中水浴2小时。逐滴加入0.01M的氢氧化钠(NaOH)助溶不溶解的多聚甲醛，直至完全溶解，冷却至室温。加入准确称量的叠氮化钠0.5g，溶解完全后，用0.1M的PBS补足体积至重量为100g；然后用G5漏斗除菌过滤，得到稀释剂浓溶液B液，室温保存。
配置本发明的溶血剂，先将B液用蒸馏水稀释10倍成稀释剂，以9∶1的比例混合该稀释剂和破膜剂A液，得到皂角苷含量为0.05％的溶血剂。
实施例2 作为溶血剂应用于流式细胞仪检测临床血标本的免疫表型分析的使用方法
采用室温存放，在24小时内使用的EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝的全血样本，应用本发明溶血剂。
1、取抗凝血50μl放入流式管中。
2、加入适量荧光标记抗体(鼠抗人CD123-PE)，混和均匀，室温避光孵育20分钟。
3、加入1ml本发明的溶血剂(皂角苷含量为0.05％，破膜剂A液与稀释剂的混合稀释液)，振荡均匀，室温放置5分钟，离心(300g，5分钟)去除上清液。
4、用300μl 1％多聚甲醛固定，4℃避光保存。48小时内采用流式细胞仪检测分析。
实施例3 作为破膜剂应用于流式细胞仪检测临床血标本细胞内多项免疫学指标的使用方法
采用室温存放，使用在24小时内EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝的全血样本，应用本发明涉及的破膜剂和溶血剂。
采用下列步骤进行：
1、取抗凝血50μl放入流式管中。
2、加入检测细胞表面分子用的荧光标记抗体(鼠抗人CD3-PerCP)20μl，混和均匀，室温避光孵育20分钟。
3、加入1ml本发明溶血剂(皂角苷含量为0.05％，破膜剂A液与稀释剂的混合稀释液)，振荡均匀，室温放置5分钟，离心(300g，5分钟)，去除上清液。
4、用1ml 0.01M的PBS重悬洗涤细胞，离心(300g，5分钟)去除上清液。
5、加入1ml本发明破膜剂A液，振荡均匀，室温放置20分钟。离心(300g，5分钟)，去除上清液。
6、加入细胞内检测用荧光标记抗体(鼠抗人Granzymes-FITC)20μl，混和均匀，室温避光孵育20分钟。
7、用1mlPBS重悬洗涤细胞，离心(300g，5分钟)去除上清液。
8、加入300μl的1％多聚甲醛固定，4℃避光保存，48小时内采用流式细胞仪分析。
实施例4 作为破膜剂应用于流式细胞仪检测外周血PBMC的细胞内多项免疫学指标的使用方法
采用下列步骤进行：
1、使用Lympholyte-H人淋巴细胞分离液(比重1.0770±0.001)分离外周血样本，获得新鲜PBMC(外周血单个核细胞)后，取1×106的细胞放入流式管中。
2、加入检测细胞表面分子用的荧光素标记抗体(鼠抗人CD8-APC)20μl，混和均匀，室温避光孵育20分钟。
3、加入1m破膜剂A液，振荡均匀，室温放置20分钟。离心(300g，5分钟)去除上清液。
4、加入检测细胞内细胞因子用的荧光素标记抗体(鼠抗人IFN-r-FITC和鼠抗人I1-7-PE)20μl，混和均匀，室温避光孵育20分钟。
5、用1mlPBS重悬洗涤细胞，离心(300g，5分钟)去除上清液。
6、加入300μl 1％多聚甲醛固定，4℃避光保存，48小时内采用流式细胞仪分析。
实施例5
将室温存放，在24小时内使用的EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝的正常人全血样本分成三份，分别应用市售BD红细胞裂解液(FACSlysing solution，美国BD PharMingen公司)和JM红细胞裂解液(晶美生物工程有限公司)，以及实施例1配置的溶血剂(皂角苷含量为0.05％；NaN3含量为0.05％；多聚甲醛含量为1％的0.01M的PBS溶液)，考察其溶血效果。
图1的A，B，C分别为应用市售溶血剂BD，JM和本发明的溶血剂处理血样品的流式FSC/SSC点图。通过比较发现，应用本发明溶血剂处理血样本，红细胞裂解完全，产生的细胞碎片少，背景清晰，白细胞分群明显，特别是单个核细胞丢失很少。图1的具体分析结果见表1：
表1 市售溶血剂和本发明溶血剂溶血程度比较(％)
说明本发明涉及的溶血剂，其溶血效果好于市售常用溶血剂BD和JM。
实施例6
采用实施例2的实验步骤进行此实验。
采用室温存放，在24小时内使用的EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝的重型肝炎患者的全血标本，将此全血样本分成两份，分别应用市售溶血剂BD和本发明涉及的溶血剂(皂角苷含量为0.05％；NaN3含量为0.25％；多聚甲醛含量为2％的0.01M的PBS溶液)，考察此溶血剂检测临床血标本的免疫表型分析效果。
图2的A，B分别为应用市售溶血剂BD和本发明的溶血剂(皂角苷含量为0.05％，破膜剂A液与稀释剂的混合稀释液)处理血标本的细胞免疫表型检测结果。应用FACS Calibia上的CELLQUEST分析软件分析获取的数据。设定单个核细胞群(淋巴细胞和单核细胞)区域为R1，以R1为门建立Lin1 FITC/HLA-DR PerCP双参数点图；设定Lin1阴性细胞区域为R2，以R2为门建立CD123 PE/HLA-DR PerCP双参数点图，设定HLA-DR+/CD123+双阳性细胞区域为R3。统计LIN1阴性和HLA-DR+/CD123+双阳性细胞数量占单个核细胞总数的百分比。可见：对于重型肝炎患者的全血标本，本发明的溶血剂比市售溶血剂BD溶血效果好，背景清晰，目的细胞检出率高。图2的具体分析结果见表2：
表2 市售破膜剂和本发明的溶血剂处理血标本后细胞免疫表型检测比较(％)
注：以重型肝炎患者全血标本为检测样品
说明本发明涉及的溶血剂，可用于重型肝炎患者的免疫表型分析，效果良好，明显好于市售常用溶血剂BD。
实施例7
采用实施例3的实验步骤进行此实验。
将室温存放，在24小时内使用EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝的全血样本分成两份，分别应用本发明实施例1配置的破膜剂和市售破膜剂，考察破膜剂检测细胞内颗粒酶的结果，实验过程中使用的溶血剂为皂角苷含量为0.05％；NaN3含量为0.45％；多聚甲醛含量为4％的0.01M的PBS溶液。
图3中的A，B分别为应用市售破膜剂BD和破膜剂处理全血标本的细胞内颗粒酶检测结果。应用FACS Calibia上的CELLQUEST分析软件分析获取的数据。设定淋巴细胞群区域为R1，以R1为门建立Gra(Granzymes，简称Gra)-FITC/CD3-PerCP双参数点图。设定四个象限：Gra+/CD3-为左上象限(UL)，Gra+/CD3+为右上象限(UR)，Gra-/CD3-为左下象限(LL)，Gra-/CD3+为右下象限(LR)。分别统计四个象限内的细胞数量占淋巴细胞总数的百分比。可见：本发明的破膜剂与市售破膜剂BD的检测结果相近。图3的具体分析结果见表3：
表3 市售破膜剂和本发明破膜剂处理血标本后细胞内颗粒酶检测比较(％)
实施例8 市售溶血剂与本发明破膜剂在细胞内细胞因子检测中的比较
采用实施例4的实验步骤进行此实验。
将室温存放，在24小时内使用EDTA、肝素或柠檬酸钠抗凝的正常人全血样本分成两份，分别应用本发明涉及的破膜剂(皂角苷含量为0.15％；NaN3含量为0.4％；多聚甲醛含量为3％的0.01M的PBS溶液)和市售破膜剂，考察此破膜剂在细胞内细胞因子检测方面的应用。
图4的A，B分别为应用市售溶血剂BD和本发明的破膜剂处理全血标本的细胞内细胞因子检测结果。应用FACS Calibia上的CELLQUEST分析软件分析获取的数据。设定淋巴细胞群区域为R1，以R1为门建立IFN-r-FITC/CD8-APC和I1-7-PE/CD8-APC双参数点图。设定四个象限(UL、UR、LL、LR)，统计IFN-r+/CD8+、IFN-r-/CD8+和IL-17-/CD8+、IL-17+/CD8+四群细胞数量占淋巴细胞总数的百分比。可见：本发明的破膜剂的检测结果与市售破膜剂BD结果基本符合。图4的具体分析结果见表4：
表4 应用市售破膜剂和本发明破膜剂在细胞内细胞因子检测中的比较(％)
实施例9 稳定性实验
按照实施例1所述的方法新鲜配制破膜剂A液和稀释剂浓溶液B液，分别放置37℃孵箱和4℃保存6天，进行加速稳定性试验。结果发现：37℃和4℃保存6天的A液和B液的外观都清亮透明，无混浊和沉淀；比较37℃和4℃保存6天的A液，外观未见差异；比较37℃和4℃保存6天的B液，外观未见差异，说明本发明的破膜剂和稀释剂浓溶液具有良好的稳定性。
分别将4℃保存6天、37℃保存6天的破膜剂A液和稀释剂浓溶液B液按照实施例1所述的方法配置成溶血剂，以实施例2的方法进行实验。图5的A，B分别是4℃与37℃保存6天后配置的溶血剂处理血样品后的FSC/SSC点图。FSC/SSC点图显示4℃存放与37℃保存6天后配置的溶血剂溶血结果相近。红细胞裂解完全，产生的细胞碎片少，背景清晰，白细胞分群明显。图5的具体分析结果见表5：
表5 溶血剂4℃和37℃6天稳定性试验比较(％)
按照实施例1所述的方法新鲜配制破膜剂和溶血剂，分别放置37℃孵箱和4℃保存6天，进行加速稳定性试验。结果发现：37℃和4℃保存6天的破膜剂和溶血剂的外观都清亮透明，无混浊和沉淀；比较37℃和4℃保存6天的破膜剂，外观未见差异；比较37℃和4℃保存6天的溶血剂，外观也未见差异，说明本发明的破膜剂和溶血剂具有良好的稳定性。
按照实施例4的实验步骤进行进行溶血和破膜对照试验，对照分析全血标本的细胞内细胞因子结果。图6的A，B分别是4℃存放与37℃保存6天的溶血剂和破膜剂处理血样品后的双参数点图。应用FACSCalibia上的CELLQUEST分析软件分析获取的数据。设定CD3T淋巴细胞群区域为R1，以R1为门建立IFN-r-FITC/CD8-PerCP和I1-7-PE/CD8-PerCP双参数点图。设定四个象限(UL、UR、LL、LR)，统计CD3+、CD8+、IFN-r+/CD8-、IFN-r+/CD8+和IL-17+/CD8-、IL-17+/CD8+四群细胞数量占CD3T淋巴细胞总数的百分比。图6的具体分析结果见表6：
表6 破膜剂4℃和37℃保存6天的稳定性比较(％)
Claims (10)
1、一种破膜剂，其成分和配比为：
皂角苷 0.1-0.5％
NaN3 0.05-0.5％
多聚甲醛 1-4％；
0.01M磷酸盐缓冲液 余量。
2、如权利要求1所述的破膜剂，其特征在于其pH值为7.0-7.4。
3、一种溶血剂，其特征在于，是稀释权利要求1所述的破膜剂，使皂角苷含量为0.05％得到的。
4、如权利要求3所述的溶血剂，稀释采用以下成分和配比的稀释剂进行：
NaN3 0.05-0.5％
多聚甲醛 1-4％
0.01M磷酸盐缓冲液 余量；
稀释剂中各成分的浓度与权利要求1所述的破膜剂中相同成分的浓度相同。
5、如权利要求4所述的溶血剂，所述稀释剂是由以下溶液：
NaN3 0.5-5％
多聚甲醛 10-40％
0.1M磷酸盐缓冲液 余量；
用蒸馏水稀释后得到的。
6、权利要求3-5任一所述的溶血剂，其成分和配比为：
皂角苷 0.05％
NaN3 0.05-0.5％
多聚甲醛 1-4％
0.01M磷酸盐缓冲液 余量。
7、权利要求1-2任一所述的破膜剂在流式细胞分析中的应用。
8、权利要求3-6任一所述的溶血剂在流式细胞分析中的应用。
9、一种处理用于流式细胞分析的血标本的方法，包括：适量样品中加入检测细胞表面分子用的荧光标记抗体，混和均匀，避光孵育；加入权利要求3-6任一所述的溶血剂，振荡均匀，离心去除上清液；重悬；加入权利要求1-2任一所述的破膜剂，振荡均匀；离心去除上清液；加入胞内细胞因子检测用荧光素标记抗体，混和均匀，避光孵育；重悬洗涤细胞，离心去除上清液；加入固定剂，于48小时内上机分析。
10、一种处理用于流式细胞分析的血标本的方法，包括：取适量抗凝血，加入检测细胞表面分子用的荧光标记抗体，混和均匀，避光孵育；加入权利要求3-6任一所述的溶血剂，振荡均匀；离心去除上清液；重悬；于48小时内上机分析。
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2008
- 2008-06-30 CN CN200810115932A patent/CN101620220A/zh active Pending
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