CN113884671A - 一种流式染色试剂盒及其配置方法和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流式染色试剂盒及其配置方法和应用方法，具体为一种用于检测哺乳动物有核细胞胞浆内各类蛋白分子的流式染色试剂盒配制方法及其应用方法，所述试剂盒包括流式胞内固定/破膜液和流式胞内破膜/洗涤液。本发明的固定/破膜液由多聚甲醛、皂素、磷酸盐缓冲液组成；破膜/洗涤液由皂素、胎牛血清、金属离子螯合剂、磷酸盐缓冲液、防腐剂组成。该试剂盒可联合多种标记了荧光素的抗体共同使用，通过破膜/洗涤液将细胞膜进行打孔，使标记荧光的抗体分子进入细胞浆内与特定抗原蛋白结合。将上述细胞通过流式细胞仪检测，即可获得特定胞浆内蛋白分子表达的信息。本发明可用于多种细胞的流式免疫检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种流式分析用细胞内蛋白染色试剂盒及其配置方法和应用方法，属于细胞内蛋白分子检测技术领域。
背景技术
流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种可以对处于快速直线流动状态中的单列细胞、微生物或人工合成微球等生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量或分选的技术。流式细胞术可实现高通量检测，每秒钟检测的细胞数目可达数千个，被检测的细胞数最高可达数百万；能对单列细胞或生物颗粒进行逐个检测；通过多参数、多色荧光分析实现对细胞的准确识别和计数，对细胞进行定性、定量，还可根据细胞等生物颗粒的性状对其进行分选。对同一个细胞做有关物理、化学、生物等特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义，流式细胞术已被广泛应用于各个领域之中。
细胞因子(cytokine，CK) 是在免疫系统中有重要功能的一类蛋白质，是指由免疫细胞（如T细胞、B细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞等）和某些非免疫细胞（如内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞、骨髓及胸腺基质细胞等）经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质，多属分子量为6~60kDa的多肽或糖蛋白。细胞因子通常包括白细胞介素(interleukin， IL) 、干扰素(interferon，IFN) 、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF) 、造血因子、趋化因子、各种细胞生长因子等。细胞因子在体内广泛参与免疫应答及调节、促进组织修复、刺激造血功能、刺激细胞的增殖与分化、参与细胞凋亡等重要生理活动。某些因素可导致一些细胞因子的异常表达或功能异常，从而参与炎症反应、免疫性疾病、肿瘤性疾病等病理过程的发生与发展。细胞因子必须通过与靶细胞膜表面特异性受体（即细胞因子受体， cytokinereceptor， CKR）相结合，才能发挥其广泛的生物学效应。检测活化免疫细胞内的细胞因子，对于研究分泌细胞因子的细胞类型、产量，所分泌细胞因子的种类和评价细胞免疫功能等具有重要价值。
细胞内染色结合流式细胞术分析是确定某些细胞内细胞因子或蛋白表达水平的一种简便快捷的方法。流式细胞术分析细胞内抗原的关键在于要使荧光标记的单克隆抗体能自由进人细胞内，且不能破坏细胞形态的完整性和保持细胞内靶抗原不变。鉴于上述要求，流式细胞术分析细胞内抗原的主要环节在于细胞固定（保持细胞形态的完整性）和在胞膜上打孔穿透（使荧光标记的单克隆抗体能自由进人）。
理想的固定方法应该是使抗原固定，同时保持细胞、亚细胞结构的真实性，使抗体能够充分地与所有细胞、亚细胞结构内的成分接触。但是，目前还没有一种方法能做到这一点。固定方法可分为两大类，第一为沉淀法，其可使细胞蛋白成分沉淀于局部其他亚细胞结构上，通过这种方式固定细胞的固定剂为有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮等，其能够迅速溶解脂类物质，使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上，但会导致许多被抗体识别的表位发生改变，由于这类固定剂的溶脂作用，即对细胞已经产生了通透作用，故在随后的步骤中不必再用穿膜剂进行穿膜；第二为交联法，即通过化学键与细胞内其他分子连接，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它们一般是通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网，但交联剂没有穿膜作用，故在随后的步骤中需经去污剂溶解脂类成分进行穿膜，从而增强细胞的通透性，其中多聚甲醛具有相对更优的稳定性和安全性，能使抗原固定并且更好地保持细胞、亚细胞结构的真实性，使抗体更充分地与抗原结合，故本试剂盒选用多聚甲醛来固定细胞。
穿膜剂一般为去污剂，如TritonX-100、NP-40或皂素(saponin) ，通过使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。穿膜剂的好坏取决于能否保持细胞形态的完整性和是否不影响染色背景。在这几种穿膜剂中，TritonX-100、NP-40穿膜作用较强，对细胞形态影响较大，而皂素较温和，更适合于对细胞膜穿孔从而进行胞内染色，它可选择性与细胞膜胆固醇作用，将胆固醇从细胞膜上移除，从而形成孔洞。
一般来说，随着保存时间的延长，含有机物（如氨基酸、糖类等）的生物试剂易受到空气、水中微生物的腐蚀，因此需加入一定量的防腐剂，以延长保存时间。免疫检测试剂中常用的防腐剂有硫柳汞、叠氮钠和抗生素等。其中叠氮钠曾经是体外诊断试剂中常用的防腐剂之一，但叠氮钠与氰化物相似，是剧毒化合物；而且遇高热或剧烈震动能强烈爆炸，出于安全方面的考虑，叠氮钠的使用日益受限。与叠氮钠相同，硫柳汞也具有很大毒性。
发明内容
鉴于检测胞内蛋白分子的重要性，开发一种应用广泛，可快速、准确、方便显示细胞内蛋白分子水平的检测试剂盒，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。本发明公开了一种流式分析用细胞内蛋白因子染色试剂盒及其配置方法和应用方法，其具体技术方案如下：
一种流式染色试剂盒，通过优化其内的固定/破膜液（Fix/Perm）和破膜/洗涤液(Perm/Wash)以检测哺乳动物有核细胞胞浆内各类蛋白分子，所述固定/破膜液含多聚甲醛和皂素，所述破膜/洗涤液含皂素、胎牛血清、金属离子螯合剂EDTA以及防腐剂中的一种或者几种。皂素破膜作用较温和，胎牛血清可减少非特异性染色，金属离子螯合剂EDTA可减少细胞间黏连。多聚甲醛通过形成分子间交联，影响蛋白质构型从而固定细胞形态以及抗原抗体结合位点；皂素是一种表面活性剂，可通过与细胞膜表面的磷脂双分子层相互作用，从而在细胞表面打孔。
进一步的，所述固定/破膜液使用NaOH调整PH至7.2-7.4之间。
进一步的，所述固定/破膜液中多聚甲醛的浓度为2~8%，所述皂素的浓度为0.01~0.05%。
进一步的，所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI），即为Proclin 300，其具广谱抗菌性，pH适用范围广，毒性远低于其他防腐剂如叠氮化钠并不会对流式染色造成影响。
进一步的，所述破膜/洗涤液中皂素的浓度为0.5%-2%，胎牛血清的浓度为10%-50%，金属离子螯合剂EDTA的浓度为10mM~100mM， EDTA为已经商品化的缓冲液，直接购买稀释使用（品牌：苏州东岭生物货号：CK20003-100）。
进一步的，所述防腐剂Proclin 300的浓度为1-10 ppm。所述的防腐剂Proclin300为已经商品化的缓冲液，直接购买稀释使用（品牌：Sigma货号：48914-U）。
进一步的，该试剂盒内试剂的溶剂均为PBS，即磷酸盐缓冲液。所述的溶剂PBS（磷酸盐缓冲液）为已经商品化的缓冲液，直接购买配置（品牌:Solarbio 货号:P1010）。
本发明还包括上述流式染色试剂盒的配置方法，其内的固定/破膜液按以下步骤配置：
步骤1.1：将磷酸盐缓冲液粉末配置成1 X磷酸盐缓冲液代用；
步骤1.2：用上述1 X磷酸盐缓冲液配置特定浓度的皂素；
步骤1.3：用上述1 X磷酸盐缓冲液在50℃环境中配置特定浓度的多聚甲醛溶液；
步骤1.4：在步骤1.3中配好的多聚甲醛溶液中加入步骤1.2中配好的皂素，搅拌混匀后调节其pH至7.2-7.4，于2-8℃保存。
上述流式染色试剂盒的破膜/洗涤液按以下步骤配置：
步骤2.1：将磷酸盐缓冲液粉末配置成10X磷酸盐缓冲液代用；
步骤2.2：用双蒸水稀释Proclin 300原液至所需浓度；
步骤2.3：用10X磷酸盐缓冲液稀释皂素至所需浓度；
步骤2.4：取所需量的10X磷酸盐缓冲液，向其内依次加入步骤2.2中稀释好的皂素、所需浓度的胎牛血清、步骤2.2中稀释好的皂素、所需浓度的金属离子螯合剂EDTA以及步骤2.1中稀释后的Proclin 300，搅拌混匀后调节pH至7.2-7.4，于2-8℃保存。
上述流式染色试剂盒在检测细胞因子分泌指标中的应用，具体包括如下步骤：
步骤3.1：用带有PMA/INOMYCIN的培养基制备1-3M/ml 的PBMC（外周血单个核细胞）悬液；
步骤3.2：将步骤1中制备的悬液于24孔板1ml/well铺板后置于培养箱刺激1小时，再加入golgi-stop；
步骤3.3：4-6小时后收集细胞，每管加入50ul 表面染色缓冲液和适量体积的CD3表面抗体，充分重悬细胞，于4℃避光孵育30 min 后，加入500 ul 表面染色缓冲液，300g×5min，4℃离心后弃去上清液；
步骤3.4：细胞固定：向每管细胞中加入 200ul Fix Buffer (1X)，充分重悬细胞，4℃避光孵育 12 分钟；
步骤3.5：向每管细胞中加入 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，然后600g×5min，4℃离心后弃去上清液；
步骤3.6：抗体孵育：每管加入 100ul 1X C-Perm/Wash Buffer 和适量体积的胞内抗体，充分重悬细胞，于2-8°C 避光孵育 1h 以上或过夜；
步骤3.7：向每管细胞中添加 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，洗去抗体，然后600g×5min，4 ℃离心后弃去上清液；
步骤3.8：将细胞重悬于 300ul-500ul 1X C-Perm/Wash Buffer 进行上机分析。
上述流式染色试剂盒在检测细胞因子分泌指标中的应用，具体包括如下步骤：
步骤4.1：细胞固定：向每管细胞中加入 200ul Fix Buffer (1X)，充分重悬细胞，4℃避光孵育 12 分钟；
步骤4.2：向每管细胞中加入 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，然后600g×5min，4℃离心后弃去上清液；
步骤4.3：抗体孵育：每管加入 100ul 1X C-Perm/Wash Buffer 和适量体积的胞内抗体，充分重悬细胞，于2-8°C 避光孵育 1h 以上或过夜；
步骤4.4：向每管细胞中添加 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，洗去抗体，然后600g×5min，4 ℃离心后弃去上清液；
步骤4.5：将细胞重悬于 300ul-500ul 1X C-Perm/Wash Buffer 进行上机分析。
有益效果：
本发明试剂盒内含有优化后的流式胞内固定/破膜液和破膜/清洗液，以细胞免疫荧光染色为原理，整合多步骤、多方法的所需试剂，可最大程度地减少非特异性染色并最大化特异性荧光信号强度，结果直观，数据准确，为流式分析检测细胞内蛋白分子提供有力的工具。相对于传统酶联免疫吸附试验(ELISA)，利用流式细胞术对细胞内蛋白因子检测更为方便、步骤相对简单检测参数相对丰富。通过细胞内蛋白因子染色液从单细胞水平检测不同细胞内的细胞因子，并可由此判断产生特定细胞因子的细胞种类、细胞定位、分布密度及细胞因子与组织病变的关系等，对免疫学基础研究及临床免疫学分析具有重要意义。
本发明试剂盒内含有优化后的流式胞内固定液和破膜液，以细胞免疫荧光染色为原理，整合多步骤、多方法的所需试剂，可最大程度地减少非特异性染色并最大化特异性荧光信号强度，结果直观，数据准确，为流式分析检测细胞内蛋白分子提供有力的工具。能用于细胞内蛋白分子的检测，弥补了流式分析用细胞浆内蛋白分子检测方法的空白，具有检测通量大、结果确切、特异性灵敏性高、操作简便的特点，且配置成本低，易于推广和应用。
本试剂盒选用皂素作为穿膜剂对细胞进行破膜染色，更好地保留了细胞的原有特性。选择ProClin 300作为防腐剂，具有广谱抗菌活性，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长；同时，它又能保持体系中酶的活性，因此它是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等生物防腐剂。其活性成分主要是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)，它在与细胞膜接触几分钟后，可立即渗透到膜内并抑制细胞内KREBS循环中相关酶的活性，从而抑制细胞生长代谢，大分子的合成，引起细胞内能量水平迅速下降，由于能量体系的崩溃，细胞不能合成日常代谢所需要的化合物从而起到抑菌作用，同时不会影响流式染色效果，测试结果见图5和图6，图5显示无添加防腐剂，图6显示试剂盒内加入防腐剂Proclin300，两者染色结果无差别，可得出防腐剂Proclin300的加入与否，对胞内染色基本无影响。
附图说明
图1是本发明实施例1中试剂盒检测细胞固定后的表面染色信号示意图，
图2是本发明实施例1中试剂盒检测细胞固定后的胞内染色分群示意图，
图3是本发明实施例2中的293T染色结果示意图，
图4是本发明实施例2中稳定表达IFNg的293T染色结果示意图，
图5是无添加防腐剂显示的染色结果图，
图6是本发明试剂盒内加入防腐剂Proclin300显示的染色结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施案例中未注明具体技术或条件者按照产品说明书进行，未进行特殊说明的试剂均为本领域市售可得的产品，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明流式染色试剂盒，通过优化其内的固定/破膜液和破膜/洗涤液以检测哺乳动物有核细胞胞浆内各类蛋白分子。该试剂盒内试剂的溶剂均为PBS，即磷酸盐缓冲液。
固定/破膜液含多聚甲醛和/或皂素，且用NaOH调整PH至7.2-7.4之间。多聚甲醛的浓度为2~8%，皂素的浓度为0.01~0.05%。
固定/破膜液按以下步骤配置：（以100ml为例）：
步骤1.1：使用购买的磷酸盐缓冲液粉末，配置为1 X PBS；
步骤1.2：称取12.5g上述浓度的皂素溶解于40 ml 1 X PBS中，完全溶解后用磷酸盐缓冲液定容至50 ml，此为浓度是25%的皂素；
步骤1.3：称取4 g上述浓度的多聚甲醛溶解于70 ml 1 X PBS中，50℃环境中搅拌使其溶解；
步骤1.4：加入40 ul上述25%浓度的皂素，搅拌混匀；将配置好的固定/破膜液通过1mol/L的盐酸或NaOH调节pH至7.2-7.4，最后用1 X PBS定容至100ml，于2-8℃保存。
破膜/洗涤液含皂素、胎牛血清、金属离子螯合剂EDTA以及防腐剂中的一种或者几种。防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MCI）和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMCI），即为Proclin 300。皂素的浓度为0.5%-2%，所述胎牛血清的浓度为10%-50%，所述金属离子螯合剂EDTA的浓度为10mM~100mM，防腐剂Proclin 300的浓度为1-10 ppm。
破膜/洗涤液按以下步骤配置：（以100ml为例）：
步骤2.1：使用购买的磷酸盐缓冲液粉末，配置为10 X PBS；
步骤2.2：取5mlProclin 300原液加入双蒸水稀释至50ml，此为稀释后的Proclin300；
步骤2.3：取4 ml上述配置的25%浓度的皂素加入至40 ml 10 X PBS中，
步骤2.4：加入20 ml上述浓度的胎牛血清，搅拌混匀，加入4 ml上述25%浓度的皂素，搅拌混匀，加入10 ml上述浓度的500mMEDTA，搅拌混匀，加入1.7 ml上述浓度的稀释后Proclin 300，搅拌混匀，将配置好的胞内破膜/清洗液通过1mol/L的盐酸或NaOH调节pH至7.2-7.4，最后用10 X PBS定容至100ml，于2-8℃保存。
实施例1
Th1/Th2细胞胞内染色
由于在静止状态下，未活化的淋巴细胞内基本不表达或仅表达少量细胞因子，因而难以检测。只有当其被活化后，细胞内细胞因子才能合成增加，因此检测细胞内细胞因子必须利用激活剂将其激活，但活化后，细胞因子合成增多，不断地分泌至胞外发生作用，造成了检测其细胞内细胞因子水平的困难，所以还要使用阻断剂阻止细胞因子分泌至胞外才能进行检测。因此我们通过加入PMA（佛波酯）和Inomycin（离子霉素）使T细胞活化；再使用莫能菌素（BD公司的商品名为GolgiStop）通过抑制细胞内细胞因子向细胞外分泌，使细胞因子合成后累积在细胞内，便于更有效的检测细胞内蛋白因子分泌水平，将本发明流式染色试剂盒应用于检测细胞因子分泌指标（从步骤1开始），具体操作步骤如下：
步骤3.1：用带有PMA/INOMYCIN(Biolegend,货号423301)的培养基制备PBMC（外周血单个核细胞）细胞悬液，1-3M/ml；
步骤3.2：铺板，24孔板1ml/well，将细胞置于培养箱，刺激1小时，加入golgi-stop（BD Biosciences，货号554724）；
步骤3.3：4-6小时后收集细胞，每管加入50ul 表面染色缓冲液和适量体积的CD3表面抗体，充分重悬细胞，4℃，避光孵育30 min 后，加入500 ul 表面染色缓冲液，300g×5min，4℃离心，弃去上清液；
步骤3.4：细胞固定：向每管细胞中加入200ul Fix/Perm Buffer (1X)，充分重悬细胞，4℃避光孵育12分钟；
步骤3.5：向每管细胞中加入 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，600g×5min 离心，4 ℃，弃去上清液；
步骤3.6：抗体孵育：每管加入 100ul 1X C-Perm/Wash Buffer 和适量体积的IL4/IFNg胞内抗体，充分重悬细胞，2-8°C 避光孵育 1h 以上或过夜；
步骤3.7：向每管细胞中添加 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，洗去抗体，600g×5min 离心，4 ℃，弃去上清液；
步骤3.8：将细胞重悬于 300ul-500ul 1X C-Perm/Wash Buffer 进行上机分析。
染色结果见图1和图2，图1可看出通过本试剂盒检测，细胞固定后，表面染色信号仍清晰；图2可看出胞内染色分群明显。
实施例2
293t-ifng稳转细胞株胞内染色
将本发明流式染色试剂盒制备细胞悬液应用于检测细胞胞浆内蛋白（从步骤4开始）具体操作步骤如下：
步骤4.1：细胞固定：向每管细胞中加入 200ul Fix/Perm Buffer (1X)，充分重悬细胞，4℃避光孵育 12 分钟；
步骤4.2：向每管细胞中加入 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，600g×5min 离心，4 ℃，弃去上清液；
步骤4.3：抗体孵育：每管加入 100ul 1X C-Perm/Wash Buffer 和适量体积的IFNg胞内抗体，充分重悬细胞，2-8°C 避光孵育 1h 以上或过夜；
步骤4.4：向每管细胞中添加 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，洗去抗体，600g×5min 离心，4 ℃，弃去上清液；
步骤4.5：将细胞重悬于 300ul-500ul 1X C-Perm/Wash Buffer 进行上机分析。
染色结果见图3和图4。图3为本发明实施例2中的293T染色结果示意图，图4是本发明实施例2中稳定表达IFNg的293T染色结果示意图。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种流式染色试剂盒，包括固定/破膜液和破膜/洗涤液，其特征在于，所述固定/破膜液含多聚甲醛和/或皂素，所述破膜/洗涤液含皂素、胎牛血清、金属离子螯合剂EDTA以及防腐剂中的一种或者几种。
2.根据权利要求1所述的流式染色试剂盒，其特征在于，所述固定/破膜液使用NaOH调整PH至7.2-7.4之间。
3.根据权利要求1所述的流式染色试剂盒，其特征在于，所述固定/破膜液中多聚甲醛的浓度为2~8%，所述皂素的浓度为0.01~0.05%。
4.根据权利要求1所述的流式染色试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，即为Proclin 300。
5.根据权利要求1所述的流式染色试剂盒，其特征在于，所述破膜/洗涤液中皂素的浓度为0.5%-2%，胎牛血清的浓度为5%-15%，金属离子螯合剂EDTA的浓度为10mM~100mM。
6.根据权利要求4所述的流式染色试剂盒，其特征在于，所述Proclin 300的浓度为1-10 ppm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的流式染色试剂盒，其特征在于，所述固定/破膜液溶解在PBS缓冲液中，所述破膜/洗涤液溶解在PBS缓冲液中。
8.权利要求7所述的流式染色试剂盒的配置方法，其特征在于，所述的固定/破膜液按以下步骤配置：
步骤1.1：将磷酸盐缓冲液粉末配置成1 X磷酸盐缓冲液代用；
步骤1.2：用上述1 X磷酸盐缓冲液配置特定浓度的皂素；
步骤1.3：用上述1 X磷酸盐缓冲液在50℃环境中配置特定浓度的多聚甲醛溶液；
步骤1.4：在步骤1.3中配好的多聚甲醛溶液中加入步骤1.2中配好的皂素，搅拌混匀后调节其pH至7.2-7.4，于2-8℃保存；
其内的破膜/洗涤液按以下步骤配置：
步骤2.1：将磷酸盐缓冲液粉末配置成10X磷酸盐缓冲液代用；
步骤2.2：用双蒸水稀释Proclin 300原液至所需浓度；
步骤2.3：用10X磷酸盐缓冲液稀释皂素至所需浓度；
步骤2.4：取所需量的10X磷酸盐缓冲液，向其内依次加入步骤2.2中稀释好的皂素、所需浓度的胎牛血清、步骤2.2中稀释好的皂素、所需浓度的金属离子螯合剂EDTA以及步骤2.1中稀释后的Proclin 300，搅拌混匀后调节pH至7.2-7.4，于2-8℃保存。
9.权利要求1-7中任一项所述的流式染色试剂盒在检测细胞因子分泌指标中的应用，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤3.1：用带有PMA/INOMYCIN的培养基制备1-3M/ml 的外周血单个核细胞PBMC悬液；
步骤3.2：将步骤1中制备的悬液于24孔板1ml/well铺板后置于培养箱刺激1小时，再加入golgi-stop；
步骤3.3：4-6小时后收集细胞，每管加入50ul 表面染色缓冲液和适量体积的CD3表面抗体，充分重悬细胞，于4℃避光孵育30 min 后，加入500 ul 表面染色缓冲液（PBS+2.5%胎牛血清），300g×5min，4℃离心后弃去上清液；
步骤3.4：细胞固定：向每管细胞中加入 200ul 1X Fix/Perm Buffer ，充分重悬细胞，4℃避光孵育 12 分钟；
步骤3.5：向每管细胞中加入 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，然后600g×5min，4 ℃离心后弃去上清液；
步骤3.6：抗体孵育：每管加入 100ul 1X C-Perm/Wash Buffer 和适量体积的胞内抗体，充分重悬细胞，于2-8°C 避光孵育 1h 以上或过夜；
步骤3.7：向每管细胞中添加 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，洗去抗体，然后600g×5min，4 ℃离心后弃去上清液；
步骤3.8：将细胞重悬于 300ul-500ul 1X C-Perm/Wash Buffer 进行上机分析。
10.权利要求1-7中任一项所述的流式染色试剂盒在检测细胞胞浆内蛋白中的应用，其特征在于：具体包括如下步骤
步骤4.1：细胞固定：向每管细胞中加入 200ul 1X Fix/Perm Buffer ，充分重悬细胞，4℃避光孵育 12 分钟；
步骤4.2：向每管细胞中加入 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，然后600g×5min，4 ℃离心后弃去上清液；
步骤4.3：抗体孵育：每管加入 100ul 1X C-Perm/Wash Buffer 和适量体积的胞内抗体，充分重悬细胞，于2-8°C 避光孵育 1h 以上或过夜；
步骤4.4：向每管细胞中添加 500ul 1X C-Perm/Wash Buffer，洗去抗体，然后600g×5min，4 ℃离心后弃去上清液；
步骤4.5：将细胞重悬于 300ul-500ul 1X C-Perm/Wash Buffer 进行上机分析。
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