CN102839208B - 一种荧光原位杂交细胞计数的绝对定量方法 - Google Patents

Abstract

一种荧光原位杂交细胞计数的绝对定量方法属于荧光原位杂交检测技术领域，本发明中提到的绝对定量方法，是在荧光原位杂交过程中增加可进行重量定量的步骤，在取样，样品预处理，实验处理以及后期结果分析等各个阶段对原有实验方案进行改进，建立起了整套方法。其特征在于，定量生物膜等固体样品时，可取定量高速离心后的样品，同时对同一样品高温烘干，经过荧光原位杂交后在显微镜下观察计算，最后得到一定重量干污泥的微生物浓度。实现了同一反应器中不同形态的样品在微生物群落数量上的比较，同时提出了一种可建立标准方法的绝对定量手段。

Description

一种荧光原位杂交细胞计数的绝对定量方法

技术领域

本发明属于荧光原位杂交检测技术领域，涉及荧光原位杂交技术在绝对定量上的改进，具体的说是一种对于悬浮液和生物膜泥样都适用的绝对定量方法。

背景技术

荧光定位杂交技术（FISH）是将DNA(或RNA)探针用特殊的荧光染料标记, 然后将探针直接杂交到生物样品的染色体或RNA上，以对某种基因或RNA进行定性、定量、定位等检测。FISH技术具有特异性强, 灵敏度高, 分析时间短等特点, 因此在污水处理领域也被广泛应用。

荧光原位杂交法在定量中的研究主要集中在两个方面，一是相对定量，主要采用混合探针，不同波长荧光同一视野下观察相应的目标细菌数，后期再利用图像分析软件将不同细菌的照片合成一张图片，用目标细菌和总菌的比例来定量目标细菌的数量。二是绝对定量，其应用对象主要为液体的泥样，取一定量体积的样品，杂交后的结果在计数软件的帮助下，进行绝对定量。而这两种方法都存在着相应的问题。

FISH技术中广泛应用的相对定量法，虽然可以分析反应器内部的生物群落的演替情况，但是却存在着难以认定微生物变化量是否可以对系统处理效果产生影响的问题。特别是在不同环境下的样品，作为参考点的总菌存在数量上的差异甚至相差悬殊，导致建立目标细菌数量与反应器运行效果的关系在逻辑上不成立。在常用的绝对定量方法中，定量测量的主要目标是悬浮液，因为生物膜作为一种半固体物质，难以采用适用于悬浮液的定额体积的方法来进行定量测量。对于兼有生物膜和悬浮液的处理工艺来说，无法在一个量化标准下对二者之间微生物群落结构的联系和区别进行分析。

发明内容

基于这点，发明人开发了一种荧光原位杂交绝对定量方法，本发明所要解决的技术问题是不同形态下的泥样的绝对定量问题，在同一量化标准下分析生物膜和悬浮液中目标细菌的数量变化，在大量实验数据的支持下，建立一种标准化定量方法。

本发明的技术方案是在常规荧光杂交方法的实施过程中，增加可进行重量定量的步骤，实现了同一反应器中不同形态的样品在微生物群落数量上的比较，同时提出了一种可建立标准方法的绝对定量手段。本发明提到的绝对定量方法，是在荧光原位杂交过程中，在取样，样品预处理，实验处理以及后期结果分析等各个阶段增加或者改进原有实验方案，建立起了整套方法。其特征在于，定量生物膜等固体样品时，可取定量高速离心后的样品，同时对同一样品高温烘干，最后得到一定重量干污泥的微生物浓度。

本发明提出的对样品中的细胞计数绝对定量方法，包括以下步骤如附图1所示。

1)用于FISH实验的泥样12000rmp高速离心3分钟后取30mg，并取同一样品在烘箱中120℃烘干2h。

2)制备4%多聚甲醛-PBS溶液清洗30mg泥样，采用1：1的 PBS和无水乙醇混合液1500μL对微生物细胞进行固定和保存。超声处理样品，3μL样品涂于载玻片上, 37℃干燥2h以将样品固定在玻片上，最后在46℃对样品进行荧光原位杂交2h。

3)每一种试样的载玻片进行10个（数值越大，结果越准确）视野的观察, 摄取10个画面如附图2所示, 运用计数软件对每一个视野进行荧光光点的计数，得到每个视野下的细菌数，对所得结果进行平均计算处理，以此可以推算得出试样中一个视野下的平均细菌数。具体方法为:

       (a1+a2+……+a10)/10 =A       (1)

因此干污泥样品中的细菌浓度的计算公式如下;

$C=1000\×A\×\frac{S}{S_A}\×\frac{V}{V_A}\÷M(\mathrm{cell}/\mathrm{mg})---\left(2\right)$

A： 视野下的平均细菌数；

V：样品杂交液体积 mL ；

V_A: 每个杂交孔所滴杂交液体积 mL；

S ： 玻片杂交孔面积 mm²；

SA：显微镜视野面积  mm²；

M ：30mg泥样120℃烘干2h后的重量 mg。

本发明在实验过程中需注意的有，生物膜取样过程中，须在膜厚度为1-3mm左右处取样；取30mg泥样，如果泥样过多则导致不能将泥样超声均匀，泥样过少则会使结果误差较大，取样时可先多取出一部分用药匙混合均匀，取样后的部分称重后烘干再记录其重量，以此保证用烘干污泥的重量推算样品泥样的干污泥重量的正确性；对样品进行超声处理后，需得到视觉上无明显颗粒的悬浮液，保证样品中微生物细胞分散良好，但为防止样品中细胞破裂，超声时间不宜过长，宜取3min左右，频率为20KHZ, 强度40%；由于绝对定量实验在荧光下观察的时间较长，因此需在杂交后的样品中滴加抗荧光衰减剂，保证杂交信号的稳定性；在运用显微镜对杂交玻片进行观察时，视野数需值越高，所得结果越准确，一般不小于10组，同时视野位置的选取要考虑到杂交孔的性状，以保证所取视野涵盖整个杂交孔。

本发明的技术路线：

（1）为了分析不同形态下泥样内部微生物数量的组成情况，将绝对定量的基础放在质量定量上，创造了分析同一反应器中生物膜和悬浮液微生物数量上区别与联系的技术平台。

（2） 取样时对所取样品12000rmp高速离心3分钟，主要兼顾到泥样的保存方法为12000rmp高速离心3分钟-20℃下保存，因此所取新泥可以与之前保存的泥样一同进行分析。

（3）取同一样品在烘箱中120℃烘干2h，最终得到的是干污泥中的微生物细胞数量，相对的减少了外界环境对结果的影响，其与测量MLSS的方法相同，因此杂交计数后的结果可以与悬浮液中MLSS相联系得出悬浮污泥中每毫升的细菌数浓度。

（4）利用现有的FISH杂交技术完成所取样品的杂交过程，杂交样品滴加抗荧光衰减剂，滴加量以覆盖杂交孔二分之一为准，过多可能造成盖玻片的移动。

（5）利用显微镜在荧光下对杂交样品进行观察并摄取图像，视野数量保证涵盖整个杂交孔，保证所取视野的全面性，取像方法如附图2所示，每个杂交孔竖向分为五个等高的部分，根据实验所取视野数，再对每部分的视野取数按照上下左右对称的原则进行分配，本研究将这种方法命名为五线法。

（6）利用FISH计数软件对拍摄的照片进行计数，计算出各个杂交孔视野下的平均细菌数， 按照视野面积与杂交孔面积的比例可计算杂交孔内的细菌数，由于滴加到杂交孔的杂交液体积为3μL，因此可推算出30mg离心后的泥样配成1.5mL杂交液后所含的细菌数，结合30mg离心泥样烘干后的质量，最终可推算出干污泥的细菌浓度。

本发明的有益效果

本发明通过对原来荧光原位杂交技术手段的改进，既增加重量定量的步骤，实现了不同状态下泥样的绝对定量，建立了一套可实现标准化定量的方法。这种绝对定量方法，对不同工艺下的泥样都具有很强的适用性。计算方法简单准确，扩展了FISH技术的应用深度，为运用FISH手段进行定量提供了技术上的支持。本发明可广泛应用于工业微生物检测、污水处理、卫生检疫、食品和土壤等方面。

附图说明

图1为荧光原位杂交实验绝对定量步骤图。

图2为杂交孔视野选取方法。

图3a. 生物膜与悬浮液中总菌FISH图像。

图3b 碳氮比分别为4，8，12，15时AOB菌FISH图像。

图3c 碳氮比分别为4，8，12，15时NOB菌FISH图像。

具体实施方式

取样及预处理

用于FISH实验的泥样12000rmp高速离心3分钟后取30mg，并取同一样品在烘箱中120℃烘干2h。

FISH法实验过程

Ⅰ 4%多聚甲醛-PBS溶液的制备

取约5ml超纯水于烧杯，用微波炉强档加热20s，至手触感热而不烫，将事先称好的0.4g多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）倒入烧杯中，加入几滴2molL^-1NaOH，直到PFA完全溶解之后，再加入3333μL3×PBS，将烧杯置入冰浴中冷却，用2 molL^-1 HCl调pH至7.2左右。将溶液倒入事先冰过的10mL容量瓶中，加冰超纯水定容，用0.22μm的膜过滤，转移到事先冰过的试剂瓶。冰箱4℃保存，24h内使用。

Ⅱ 细胞固定和保存

取30mg离心后的污泥，溶于1000mL超纯水中，离心15000rpm×5min。弃去700μL上清液，残300μL，振荡重悬污泥。加4%PFA in PBS900μL，,既1体积污泥+3体积的4%PFA in PBS。冰箱4℃4h。离心10000rpm×5min，去上清，加1mL滤过(0.22μm膜)的1×PBS，重悬，可重复1—2次。离心10000rpm×5min，去上清，加滤过(0.22μm膜)的1×PBS和无水乙醇各750μL（量可调整），重悬。-20℃保存，六个月之内使用。

Ⅲ 样品在玻片上的固定

对样品进行超声处理，将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜计数，取3μL样品涂于带有12个直径为9mm凹槽（well）的载玻片上，在37℃干燥2h以上或者过夜。

Ⅳ 全细胞杂交

玻片依次用50%、80%、98%乙醇各浸渍3min对细胞进行脱水，立放风干。将约2mLHB(杂交液)涂布于滤纸上，折卷起滤纸并放入圆柱形的杂交管中，让滤纸贴在管壁上。按1：8的比例将1体积25ng/μL的探针储备液溶于8体积的HB中，离心10s混匀。将玻片放入装有滤纸的杂交管并与配好的杂交液一起放入46℃分子杂交仪中预热10min，注意无光预热。预热后，分别在含有样品的凹槽中滴加9μLl杂交液，再将玻片放于杂交管中，注意不要将玻片倾斜，以免杂交液流出凹槽。迅速把杂交管转移到杂交仪中，46℃杂交90min。将杂交液和洗脱液放入48℃下水浴，并将超纯水在4℃冰浴待用。杂交后，迅速从杂交管中去除玻片，并用杂交液冲洗，再立刻浸入洗脱液中48℃水浴20min。取出玻片，用预先冰浴后的4℃超纯水冲洗玻片，迅速甩干。在玻片上滴防褪色封片剂，盖上盖玻片，用指甲油将玻片四周密封，避光常温保存。

结果分析与定量

每一种试样的载玻片进行10个（数值越大，结果越准确）视野的观察, 摄取10个画面,运用计数软件对每一个视野进行荧光光点的计数，得到每个视野下的细菌数，对所得结果进行平均计算处理，以此可以推算得出试样中的细菌浓度。具体方法为:

     (a1+a2+……+a10)/10 =A        (1)

因此干污泥样品中的细菌浓度的计算公式如下;

$C=1000\×A\×\frac{S}{S_A}\×\frac{V}{V_A}\÷M(\mathrm{cell}/\mathrm{mg})---\left(2\right)$

A： 视野下的平均细菌数；

V：样品杂交液体积 mL ；

V_A: 每个杂交孔所滴杂交液体积 mL；

S ： 玻片杂交孔面积 mm²；

SA：显微镜视野面积  mm²；

M ：30mg泥样120℃烘干2h后的重量 mg。

实例

为了考察碳氮比对同步硝化反硝化的影响，实验设置了四组附积床生物膜反应器，填料采用BX填料，DO为1-3mg/L，碳氮比分别为4、8、12、15。其他条件相同。

1、当四组反应器达到稳定时，每个反应器分别在生物膜和悬浮液中取泥样，12000rmp离心3分钟后取30mg，并取同一样品120℃烘干2h称重。

2、选取真细菌基因探针EUB338（5′-GCTGCCTCCCGAGGAT-3′)（5′端Cy3修饰），氨氧化菌基因探针NS0190(5′-CGATCCCTGCTTTTCTCC-3′.) ( 5′端FITC标记)，亚硝酸氧化菌基因探针NIT3(5′-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3′.)(5.端HEX标记)分别作为总菌、氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的荧光原位杂交分析探针，经细胞固定，细胞在玻片上固定以及全细胞荧光原位杂交等步骤，完成整个FISH实验。

3、利用显微镜（Olympus）在三种探针对应的滤光片下对杂交结果进行观察记录，每一杂交孔内摄取10个画面，如附图3所示。

4、利用计数软件对所取的10画面进行计数。

5、根据计数结果得到视野下细菌数平均值，利用上述绝对定量公式计算泥样中干污泥细菌浓度，得到如下表数据, 所得数据结果与其他研究人员通过传统的培养皿培养的方法所得细胞数目的数量级相同，因此所得绝对值可信度较大。

表1 反应器内部微生物组成情况统计表

Claims (2)

1.一种荧光原位杂交细胞计数的绝对定量方法，其特征在于包括以下步骤：

1)用于FISH实验的泥样12000rmp高速离心3分钟后取30mg，并取同一样品在烘箱中120℃烘干2h；

2)经细胞固定，超声，细胞在玻片上固定，全细胞荧光原位杂交以及抗荧光衰减措施，完成整个FISH实验；

3)运用计数软件，并利用以下公式推算试样中的细菌浓度；

$C=1000\×A\×\frac{S}{S_A}\×\frac{V}{V_A}\÷M(\mathrm{cell}/\mathrm{mg})$

A：视野下的平均细菌数；

V：样品杂交液体积mL；

V_A:每个杂交孔所滴杂交液体积mL；

S：玻片杂交孔面积mm²；

SA：显微镜视野面积mm²；

M：30mg泥样120℃烘干2h后的重量mg。

2.如权利要求1所述的荧光原位杂交细胞计数的绝对定量方法，其特征在于：

取样位置：在生物膜厚度为1-3mm处取样；

对样品进行超声时间为3min,频率为20KHZ,强度40%；

在运用显微镜对杂交玻片进行观察时，视野数值不小于10组，同时视野位置的选取要保证所取视野涵盖整个杂交孔。

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