CN109694901A - 一种用于外周血样中游离dna的保存剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于外周血样中游离DNA的保存剂，由如下配方组成，即，在每升外周血样中添加：抗疑剂1.2～2.3g/L；细胞膜保存剂0.4～1.2g/L；氯化盐0.12～0.36g/L；游离核酸保存剂0.3～1.8g/L；磷酸二氢盐0.02～0.16g/L。实验表明：使用本发明所提供的保存剂，可使外周血样中的游离DNA在模拟运输环境下常温存放9天，基本不发生溶血和细胞破裂，不仅可有效防止基因组DNA产生干扰，而且可有效避免运输震动造成溶血现象，使得外周血样中的游离DNA能在常温下长期稳定保存；另外，本发明所述保存剂的各组分价廉易得，且使用量低，不仅可使保存成本显著降低，而且易于实现规模化。

Description

一种用于外周血样中游离DNA的保存剂
技术领域
本发明是涉及一种用于外周血样中游离DNA的保存剂，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，随着新型基因检测技术的发展，外周血中的游离DNA在临床上的应用越来越多，主要是用于两方面的研究，一是优生优育的产前诊断，二是肿痛相关液体活检的基因靶标检测。而外周血中游离DNA含量较低，如果外周血采集后不能及时处理和保存，或运输过程中有白细胞或者核红细胞破裂，将引起细胞内基因组DNA的降解并进入到血浆中稀释游离DNA，这会严重影响检测结果的准确性。
为了解决上述问题，现阶段主要采取的措施有：(1)选用带抗凝剂(EDTA、肝素、柠檬酸盐)的采血管采集血液样本，以防止全血细胞凝血，减少白细胞释放基因组DNA；(2)在6小时内分离出血浆，于4℃低温保存运输，但是4℃低温保存运输情况下，DNA酶仍具有一定活性，长期保存会使血浆游离DNA大量损失，仍不利于血浆游离DNA的精确检测。同时，血样的保存和运输都在低温下进行，不仅带来许多不便，而且使游离DNA的检测成本较高；因此，本领域急需提供一种可常温采集血样、常温保存血样、且保存时间长的用于外周血样中游离DNA的保存剂。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种用于外周血样中游离DNA的保存剂，以解决现有游离DNA保存方法所存在的常温保存时间短、需要低温保存运输及运输过程中的震动容易造成溶血等问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于外周血样中游离DNA的保存剂，由如下配方组成，即，在每升外周血样中添加：
作为优选方案，所述抗凝剂选自乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠及枸橼酸钠中的至少一种。
作为优选方案，所述细胞膜保存剂选自二甲基亚砜、丙烯酸丁酯和乙酸乙烯酯中的至少一种。
作为优选方案，所述氯化盐选自氯化钠、氯化钾和氯化锌中的至少一种。
作为优选方案，所述游离核酸保存剂选自聚乙二醇、1,6-己二胺、二乙烯三胺中的至少一种。
作为优选方案，所述磷酸二氢盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的至少一种。
作为最佳方案，所述保存剂是由如下配方组成，即，在每升外周血样中添加：
作为最佳方案，所述抗疑剂为乙二胺四乙酸三钾，所述细胞膜保存剂为二甲基亚砜，所述氯化盐为氯化钠或氯化钾，所述游离核酸保存剂为聚乙二醇或1,6-己二胺，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
实验表明：使用本发明所提供的保存剂，可使外周血样中的游离DNA在模拟运输环境下常温存放9天，基本不发生溶血和细胞破裂，不仅可有效防止细胞破裂导致基因组DNA释放入血浆产生干扰，而且可有效避免运输震动造成溶血现象，使得外周血样中的游离DNA能在常温下长期稳定保存；另外，本发明所述保存剂的各组分价廉易得，且使用量低，不仅可使保存成本显著降低，而且易于实现规模化；因此，本发明相对于现有技术取得了显著性进步，对提高基因检测的准确性具有重要价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细、完整地说明。
实施例1
本实施例提供的一种用于外周血样中游离DNA的保存剂，由如下配方组成，即，在每升外周血样中添加：
所述抗疑剂为乙二胺四乙酸三钾，所述细胞膜保存剂为二甲基亚砜，所述氯化盐为氯化钾，所述游离核酸保存剂为聚乙二醇，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠。
将添加有上述保存剂的外周血样与存储于现有的EDTA采血管中的外周血样，均放置在相同常温环境中，并每日将血样轻柔颠倒混匀5次，模拟运输环境；分别在第0、1、3、5、7、9天离心分离血浆，分离血浆的步骤是：先将血样放入离心管中，在2500×g离心10min，移取上清到一个新的离心管中，如果取到白细胞或红细胞，则重新进行离心后移取上清；将离心后获得的上清液再次放入离心机中，在8000×g离心10min，将上层液体小心地移取到另一个新的离心管中，这样获得的溶液就是血浆样本；提取分离后的血浆中的DNA，提取试剂盒选用德国凯杰公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit的核酸提取试剂(货号：55114)；将获得的游离DNA利用管家基因GAPDH进行荧光定量PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。
正常的未受基因组DNA干扰的血浆中管家基因GAPDH的DNA片段较少，扩增的Ct值较大，而当白细胞破裂后，白细胞中的基因组DNA大量释放到血浆中，血浆中管家基因的DNA片段数量增加，qPCR扩增的Ct值逐渐减小。通过管家基因的qPCR验证，可以判断出白细胞是否破裂和释放出干扰DNA。
首先，通过观测在模拟运输环境下常温存放第0、1、3、5、7、9天的添加有本发明所述保存剂的外周血样和存储于现有的EDTA采血管中的外周血样，可得知：添加有本发明所述保存剂的外周血样的抗溶血效果显著优于存储于现有的EDTA采血管中的外周血样。
另外，由表1测试结果可见：添加有本发明所述保存剂的外周血样，在模拟运输环境下常温存放第9天后，由qPCR测得的Ct值与第0天的数据接近，存放中基本未发生变化；而在同等存放条件下的存储于现有的EDTA采血管中的外周血样中的游离DNA随着保存时间的延长，Ct值逐渐缩小，与第0天的数据差距逐渐增大，由此可说明：使用本发明所述保存剂可有效避免血样中白细胞的破裂释放，能保护血浆DNA不受基因组DNA的干扰，可为后续基因检测提供所需的高质量样本。
表1保存时间与Ct值的关系
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处仅在于：构成所述保存剂中的游离核酸保存剂为1,6-己二胺，其余内容均同实施例1中所述。
参照实施例1中实验过程，观测添加有上述保存剂的外周血样与存储于现有的EDTA采血管中的外周血样的抗溶血效果和由管家基因qPCR的验证结果。
首先，通过观测在模拟运输环境下常温存放第0、1、3、5、7、9天的添加有本发明所述保存剂的外周血样和存储于现有的EDTA采血管中的外周血样，可得知：添加有本发明所述保存剂的外周血样的抗溶血效果显著优于存储于现有的EDTA采血管中的外周血样。
另外，由表2测试结果可见：
表2保存时间与Ct值的关系
添加有本发明所述保存剂的外周血样，在模拟运输环境下常温存放第9天后，由qPCR测得的Ct值与第0天的数据接近，存放中基本未发生变化；而在同等存放条件下的存储于现有的EDTA采血管中的外周血样中的游离DNA随着保存时间的延长，Ct值逐渐缩小，与第0天的数据差距逐渐增大，由此可说明：使用本发明所述保存剂可有效避免血样中白细胞的破裂释放，能保护血浆DNA不受基因组DNA的干扰，可为后续基因检测提供所需的高质量样本。
实施例3
本实施例提供的一种用于外周血样中游离DNA的保存剂，由如下配方组成，即，在每升外周血样中添加：
所述抗疑剂为乙二胺四乙酸三钾，所述细胞膜保存剂为二甲基亚砜，所述氯化盐为氯化钾，所述游离核酸保存剂为1,6-己二胺，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠。
分别采集添加有上述保存剂的外周血样和存储于现有的EDTA采血管中的外周血样各10mL，然后向每管血样中加入肿瘤来源已知EGFR基因突变阳性的参考DNA样品1μg；然后均放置在相同常温环境中，并每日将血样轻柔颠倒混匀5次，模拟运输环境；分别在第0、1、3、5、7、9天离心分离血浆，分离血浆的步骤是：先将血样放入离心管中，在2500×g离心10min，移取上清到一个新的离心管中，如果取到白细胞或红细胞，则重新进行离心后移取上清；将离心后获得的上清液再次放入离心机中，在8000×g离心10min，将上层液体小心地移取到另一个新的离心管中，这样获得的溶液就是血浆样本；提取分离后的血浆中的DNA，提取试剂盒选用德国凯杰公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit的核酸提取试剂(货号：55114)；将获得的游离DNA利用肿瘤来源已知突变的EGFR基因进行荧光定量PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。
正常的未受基因组DNA干扰的血浆中突变EGFR基因的DNA片段含量一致，扩增的Ct值较为接近，而当白细胞破裂后，白细胞中的基因组DNA会大量释放到血浆中，使血浆中突变EGFR基因DNA相对含量降低，qPCR扩增的Ct值会逐渐增大，同时，血浆中缺少保存剂也会造成游离DNA的降解，从而引起扩增的Ct值逐渐增大。
首先，通过观测在模拟运输环境下常温存放第0、1、3、5、7、9天的添加有本发明所述保存剂的外周血样和存储于现有的EDTA采血管中的外周血样，可得知：添加有本发明所述保存剂的外周血样的抗溶血效果显著优于存储于现有的EDTA采血管中的外周血样。
另外，由表3测试结果可见：
表3保存时间与Ct值的关系
添加有本发明所述保存剂的外周血样，在模拟运输环境下常温存放第9天后，由qPCR测得的突变EGFR基因Ct值与第0天的数据接近，存放中基本未发生变化；而在同等存放条件下的存储于现有的EDTA采血管中的外周血样中的游离DNA随着保存时间的延长，突变EGFR基因Ct值逐渐增大，与第0天的数据差距也逐渐增大，由此可说明：使用本发明所述保存剂可有效避免血样中白细胞的破裂，能有效保护血浆DNA不受基因组DNA的干扰，可为后续基因检测提供所需的高质量样本。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于外周血样中游离DNA的保存剂，其特征在于：所述保存剂由如下配方组成，即，在每升外周血样中添加：
2.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：所述抗凝剂选自乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠及枸橼酸钠中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：所述细胞膜保存剂选自二甲基亚砜、丙烯酸丁酯和乙酸乙烯酯中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：所述氯化盐选自氯化钠、氯化钾和氯化锌中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：所述游离核酸保存剂选自聚乙二醇、1,6-己二胺、二乙烯三胺中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：所述磷酸二氢盐选自磷酸二氢钠、磷酸二氢钾中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的保存剂，其特征在于：所述保存剂是由如下配方组成，即，在每升外周血样中添加：
8.根据权利要求7所述的保存剂，其特征在于：所述抗疑剂为乙二胺四乙酸三钾，所述细胞膜保存剂为二甲基亚砜，所述氯化盐为氯化钠或氯化钾，所述游离核酸保存剂为聚乙二醇或1,6-己二胺，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠。
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