CN109321561B - 一种用于保护体外血液中核酸的保存剂及采血管 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于保护体外血液中核酸的保存剂及采血管，具体的，按照百分比计，包括5～15重量％抗凝剂、2～40重量％防腐剂、0.74～0.79重量％渗透压调节剂，及调节PH值至6.0～8.0的缓冲剂。使用本发明的保存剂，可有效防止细胞破裂释放染色体DNA，维持外周血中游离DNA的整体稳定。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于保护体外血液中核酸的保存剂及采血管。
背景技术
近年来，随着生物医学和临床诊断技术的不断发展，人们对于血液中循环游离DNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面的研究也越来越多，例如无创产前基因检测和肿瘤诊断等。
无创产前基因检测是对孕妇血浆中游离胎儿DNA进行的诊断，孕妇从怀孕七周开始即可检测到胎儿游离DNA，利用胎儿游离DNA可以早期、特异地进行产前筛查和诊断。
肿瘤诊断是对外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)进行测序，对ctDNA的检测可作为肿瘤复发及耐药动态检测的有利工具。
无创产前基因检测和肿瘤诊断都以外周血中的游离DNA为检测目标。在检测过程中游离DNA的含量是一个关键的指标，很大程度上会影响检测结果的可靠性。基因检测的高成本和高度专业性使得样本的获得和检测通常相分离，需要检测的样本大多需要经过短途或者长途的运输才能进入到检测流程。由于血液中游离DNA具有含量低、半衰期短等特点，加之天气情况和地理条件等因素，使得运输过程中的血液保存尤为困难。目前商业化的游离核酸采血管，在运输条件下通常只能保存3～4天，这就需要对样本的运输时间做严格限制。若运输期限内不能到达检测目的地进行检测，会导致游离DNA的降解或者有核细胞的破裂，对以游离DNA为检测目标的检测结果造成影响或无法获得检测结果。
因此，有必要开发一种在运输条件下能够为血液提供稳定环境，防止细胞破裂，游离DNA降解，维持血液原状态的保存剂，以消除对后续检验检测的不利影响。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于保护体外血液中核酸的保存剂及采血管。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，通过研发及实验发现：对抗凝剂、防腐剂、渗透压调节剂、缓冲剂按照比例进行混合，可长时间维持血液的原状态，保护血浆中游离DNA，从而完成本发明。
1.一种用于保护体外血液中核酸的保存剂，包括：5～15重量％的抗凝剂、2～40重量％的防腐剂、0.74～0.79重量％的渗透压调节剂、及调节PH值至6.0～8.0的缓冲剂。
2.根据项1所述的保存剂，其中，所述保存剂包括7～11重量％的抗凝剂，3～20重量％的防腐剂，0.77～0.79重量％的渗透压调节剂，及调节PH值至7.2的缓冲剂。
3.根据项1或2所述的保存剂，其中，所述保存剂与血液的体积比为1:40～1:60。
4.根据项1或2所述的保存剂，其中，所述保存剂与血液的体积比为1:45～1:55。
5.根据项1或2所述的保存剂，其中，所述抗凝剂选自乙二胺四乙酸钾盐、乙二胺四乙酸钠盐、柠檬酸钠、肝素及枸橼酸纳中的一种或多种组合。
6.根据项1或2所述的保存剂，其中，所述防腐剂选自双咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二氯-5，5-二甲基乙内酰脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基尿、2-溴-2-硝基-1,3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合。
7.根据项1或2所述的保存剂，其中，所述缓冲剂选自磷酸二氢钾，磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠的一种或多种组合。
8.根据项1或2所述的保存剂，其中，所述渗透压调节剂选自氯化钠、氯化钾、氯化铵的一种或多种组合。
9.根据项1或2所述的保存剂，其中，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾二水合物、防腐剂为双咪唑烷基脲、渗透压调节剂为氯化钠、缓冲剂为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠七水合物。
10.一种用于保护体外血液中核酸的采血管，其中，所述采血管在管体内放置如项1～9中任一项所述的保存剂。
有益效果
本发明开发一种新的用于保护体外血液中核酸的保存剂(本发明的保存剂)，实现了长期保存血液中核酸，有效抑制背景gDNA污染，为血液提供稳定的环境。在运输条件下使用本发明的保存剂可保存6～12天，在此期间游离DNA不会发生明显的变化。
附图说明
图1本发明实施例1中采血管保存血液运输0天后文库分布图；
图2本发明实施例1中采血管保存血液运输3天后文库布图；
图3本发明实施例1中采血管保存血液运输7天后文库分布图；
图4本发明实施例1中采血管保存血液运输10天后文库分布图；
图5本发明实施例2中采血管保存血液运输0天后文库分布图；
图6本发明实施例2中采血管保存血液运输3天后文库分布图；
图7本发明实施例2中采血管保存血液运输7天后文库分布图；
图8本发明实施例2中采血管保存血液运输10天后文库分布图；
图9本发明对比例中采血管保存血液运输0天后文库分布图；
图10本发明对比例中采血管保存血液运输3天后文库分布图；
图11本发明对比例中采血管保存血液运输7天后文库分布图；
图12本发明对比例中采血管保存血液运输10天后文库分布图。
具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
本发明的用于保护体外血液中核酸的保存剂的配方经过了发明人的反复优化及验证，从而解决了现有采血管在运输过程中温度变化、复杂路况和时间长短等影响因素下的游离DNA的降解及污染的难题。
首先，在一个方面中，本发明提供一种用于保护体外血液中核酸的保存剂，该保存剂包括：5～15重量％的抗凝剂、2～40重量％的防腐剂、0.74～0.79重量％的渗透压调节剂，及调节PH值的缓冲剂，所述保存剂的PH值为6.0～8.0。
优选地，所述保存剂包括7～11重量％的抗凝剂，3～20重量％的防腐剂，0.77～0.79重量％的渗透压调节剂，及调节PH值的缓冲剂，所述保存剂的PH值为7.2。
在这里，所述保存剂与血液的体积比为1:40～1:60，优选地，所述保存剂与血液的体积比为1:45～1:55。
本发明中所述抗凝剂的主要作用为防止血液凝固。抗凝剂选自乙二胺四乙酸钾盐、乙二胺四乙酸钠盐、柠檬酸钠、肝素及枸橼酸纳中的一种或多种组合。优选地，抗凝剂为乙二胺四乙酸钾盐，更优选地，抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾二水合物。
所述防腐剂的主要作用是防止血液变质。防腐剂选自双咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、1,3-二氯-5，5-二甲基乙内酰脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基尿、2-溴-2-硝基-1,3-二醇、恶唑烷、钠羟甲基甘氨酸及金刚烷季铵中的一种或多种组合。优选地，防腐剂为双咪唑烷基脲。
所述渗透压调节剂选自氯化钠、氯化钾、氯化铵的一种或多种组合。
所述缓冲剂的主要作用调节整体保存剂的酸碱、离子环境。缓冲剂选自磷酸二氢钾，磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠的一种或多种组合，优选地，缓冲剂为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠七水合物的混合液。
另一方面，本发明还提供一种保护体外血液核酸的采血管(本发明的采血管)，所述的采血管在管体体内放置保存剂，所述保存剂为用于保护体外血液核酸的保存剂(本发明的保存剂)。
使用本发明的采血管，在血液样本保存结束后，允许血液样本被分离和检测核酸之前维持原状态储存一段时间。
已经分离的游离DNA，可以对它们进行检测，以确定疾病状态，包括存在、不存在或严重程度，可以应用于但不限于产前基因检测和多种癌症检测。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。
实施例1
本实施例中保存剂的具体成分是7.5重量％乙二胺四乙酸二钾二水合物，4重量％双咪唑烷基脲，0.79重量％氯化钠，磷酸二氢钾和磷酸氢二钠七水合物调节PH值至7.2。按照以下步骤进行：
1.使用添加有100μL本发明保存剂的采血管进行静脉外周血采集，每只管采血量5mL；
2.将采血后的采血管打包并通过快递途径进行0天、3天、7天及10天的运输测试；
3.完成运输后进行血浆分离，血浆分离步骤是将采血管放入离心机中，1,600g离心10分钟，后小心移取上清至新的离心管中，16,000g离心10分钟，将血浆移取至新的离心管中，此即为分离获得的血浆；
4.分离后的血浆中DNA使用赛默飞世尔科技公司的MagMAXTM Cell-Free DNAIsolation Kit进行提取；
5.将获得的DNA使用illumina公司的TruSeq Nano DNA Library Prep Kit构建文库，并使用Caliper分析仪检测文库。
实施例2
本实施例中保存剂的具体成分是9重量％乙二胺四乙酸二钾二水合物，10重量％双咪唑烷基脲，0.77重量％氯化钠，磷酸二氢钾和磷酸氢二钠七水合物调节PH值至7.2。按照以下步骤进行：
1.使用添加有100μL本发明保存剂的采血管进行静脉外周血采集，每只管采血量5mL；
2.将采血后的采血管打包并通过快递途径进行0天、3天、7天及10天的运输测试；
3.完成运输后进行血浆分离，血浆分离步骤是将采血管放入离心机中，1,600g离心10分钟，后小心移取上清至新的离心管中，16,000g离心10分钟，将血浆移取至新的离心管中，此即为分离获得的血浆；
4.分离后的血浆中DNA使用赛默飞世尔科技公司的MagMAXTM Cell-Free DNAIsolation Kit进行提取；
5.将获得的DNA使用illumina公司的TruSeq Nano DNA Library Prep Kit构建文库，并使用Caliper分析仪检测文库。
对比例
操作与实施例1的一致，使用的保存剂具体成分：7重量％乙二胺四乙酸二钾二水合物，1重量％双咪唑烷基脲，0.77重量％氯化钠，磷酸二氢钾和磷酸氢二钠七水合物调节PH值至7.2。
结果从图1-12可知，分别以血液运输0天后cfDNA文库检测结果为参考，实施例1中的采血管在保存血液3天、7天、10天后cfDNA文库无显著差异，DNA片段分布一致，基本无杂峰出现。实施例2中的采血管在保存血液3天、7天、10天后cfDNA文库无显著差异，DNA片段分布一致，基本无杂峰出现。而同步对照测试的对比例中采血管在保存血液3天后cfDNA文库发生变化，运输10天后cfDNA文库出现较多杂峰。此为基因组DNA释放及降解导致，表明对比例中使用的采血管运输3天后，白细胞已经破裂释放DNA。说明本发明采血管在连续运输条件下保存10天，游离DNA不会发生显著的变化。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保存范围内。
工业实用性
根据本发明，提供一种适用于保护体外血液核酸的保存剂及采血管。
Claims (2)
1.一种用于保护体外血液中核酸的保存剂，所述保存剂由7.5~9重量%的乙二胺四乙酸二钾二水合物、4~10重量%的双咪唑烷基脲、0.77~0.79重量%的氯化钠及调节PH值的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠七水合物组成，所述保存剂的PH值为6.0~8.0；
所述保存剂与血液的体积比为1:40~1:60。
2.一种用于保护体外血液中核酸的采血管，其特征在于，所述采血管在管体内放置如权利要求1中所述的保存剂。
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