CN104830830A

CN104830830A - 一种用于保护游离dna的血液抗凝剂及其应用

Info

Publication number: CN104830830A
Application number: CN201510132774.4A
Authority: CN
Inventors: 刘云芬; 林清华; 蔡阿莎; 宋庆涛; 郑立谋
Original assignee: Amoy Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Amoy Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2015-03-25
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明公开了一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂。所述抗凝剂按重量体积比(W/V)包括：甲醛释放剂占0.1～1.5％，抗凝剂占1.5～2.2g/L，嘌呤占0.014～0.035g/L，磷酸二氢盐占0.01％～0.15％，氯化盐占0.4％～1.0％，核酸酶抑制剂占0.3～1.4％。本发明是一种可有效防止细胞破裂，并减缓血浆中游离DNA的降解，为血浆提供稳定的环境，延长血液的稳定性的血液保护剂，避免由于血液变质、DNA降解而影响后续的检测。

Description

一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种保护血液样品的抗凝剂，具体是一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂。

背景技术

不同用途的采血管中含有不同的添加剂或附加物。主要包括抗凝剂和促凝剂等，添加剂可以是液体状态、溶液干燥物、冷冻干燥物、粉状等。

在临床中，由于肝素会抑制PCR过程，所以一般使用EDTA(包括乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠)、枸橼酸钠进行血液的抗凝，抗凝血经过离心后，获得的血浆再进行后续研究。

抗凝后的血液通过离心，可获得血浆。血浆DNA已经成为临床上重要的样本。主要用于两方面的研究，一是产前诊断，二是肿瘤相关标志物、特异性靶标的检测。

在产前诊断中通过对男胎孕妇血细胞、血浆和血清中Y-chromosomal的检测，80％的孕妇的血浆和血清中能检测到胎儿源性的DNAi，且血浆DNA的灵敏度和准确性更高。而在未怀孕的女性中，均不能检测出Y-chromosomal基因，三者的特异性一致。

北京肿瘤医院王洁教授2009年的一项研究ⁱⁱⁱⁱⁱiv分析血浆DNA样本EGFR 19外显子和21外显子的突变状态，比较了血浆样本和肿瘤组织的突变状态，并确定了EGFR突变情况和病人临床预期结果的关联性。肿瘤患者的血浆样本与肿瘤组织的突变状态的一致性为87％，明确了如果无法获得患者的肿瘤组织的情况下，血浆样本可用于临床肿瘤突变状态分析。

虽然血浆DNA可用于临床的预后及检测等方面，但是在临床过程中，由于实验条件的限制或实验时间的限制，无法在得到血液后第一时间分离血浆，血液中的细胞破裂、血浆中的DNA降解，造成无法进行后续实验或实验结果的假阴性，从而无法为临床提供有价值的信息。

有鉴于此，确有必要提供一种可有效防止细胞破裂，血浆游离DNA降解，为血浆提供稳定的环境，延长血液的保质期的血液抗凝剂，以减少对后续检验检测的干扰检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效防止细胞破裂，血浆游离DNA降解，为血浆提供稳定的环境，延长血液的保质期，避免游离DNA降解的血液抗凝剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，按重量体积比(w/v)计，包括以下组分：

作为本发明抗凝剂的一种改进，所述甲醛释放剂为1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因，羟甲基甘氨酸钠，尼泊金甲酯钠，尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠中的一种或几种。甲醛释放剂的添加，可有效抑制白细胞破裂。优选地，所述甲醛释放剂为1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因。

作为本发明抗凝剂的一种改进，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠、枸橼酸钠中的一种或几种。抗凝剂的添加，可防止凝血、抑制DNA酶。优选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾。

作为本发明抗凝剂的一种改进，所述嘌呤为腺嘌呤、鸟嘌呤中的至少一种。嘌呤的添加，可维持红细胞的形态，不易于变形。优选地，所述嘌呤为鸟嘌呤。

作为本发明抗凝剂的一种改进，所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠，PH 7.0，提供PH缓冲环境。

作为本发明抗凝剂的一种改进，所述氯化盐为氯化钠、氯化钾、氯化铵的至少一种，氯化盐的添加有利于保持血浆环境的稳定性。优选地，所述氯化盐为氯化钠。

作为本发明抗凝剂的一种改进，所述核酸酶抑制剂为尿素、DEPC、SDS、异硫氰酸胍的0种或一种或几种，核酸酶抑制剂的添加，可抑制RNA酶，避免血浆中核酸的降解。优选地，所述核酸酶抑制剂为尿素。

本发明可有效防止细胞破裂，为血浆提供稳定的环境，延长血液的保质期，以防止由于血液变质，游离DNA降解而影响后续的检测。本发明用于提取游离DNA，以获得疾病信息。

本发明抗凝剂的贮存温度为4-25℃，易于血液样本的保存。

附图说明

图1为本发明与普通EDTA采血管对比试验1Ct值对照图。

图2为本发明与普通EDTA采血管对比试验2Ct值对照图。

图3为含有肿瘤细胞血液样本中使用本发明与普通EDTA采血管对比试验Ct值对照图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明及其有益效果作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不限于此。

实施例1

本实施例提供的血液抗凝剂，按重量体积比(w/v)计，其中体积为血液的体积。包括以下组分：

根据以上组分配制抗凝剂，并与普通EDTA采血管进行对比试验，具体步骤如下：

1、用EDTA采血管及添加有本实施例提供的血液抗凝剂的采血管分别进行血液采集，每支管采血量为10mL；

2、采集的血液放置在室温中，每日将血液轻柔颠倒混匀两次，模拟运输环境，以便观察血液在运输环境中细胞及血浆DNA的变化情况。

3、在第0，1，3，5，7天分离血浆；分离血浆的步骤选择的是将血液放入离心管中，3000×g离心10min，小心的移取上清到一个新的离心管中，如果取到白细胞或红细胞，则重新进行离心后移取上清。将第一次离心后获得的上清再次放入离心机中，8000×g离心10min，小心的移取上清到一个新的离心管中，这样获得的溶液就是血浆样本。

4、提取分离后的血浆中的DNA，提取试剂盒选用厦门艾德生物医药科技有限公司的核酸提取试剂(型号：循环DNA)；

5、将获得的DNA进行管家基因的q-PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。正常的未受污染的血浆中管家基因的DNA片段较少，扩增的Ct值较大，而当白细胞破裂后，白细胞中的核酸大量释放到血浆中，血浆中管家基因的DNA片段数量增加，扩增的Ct值逐渐减小。通过管家基因的q-PCR验证，可以判断出白细胞破裂的数量多少。

结果如表1及图1所示。

表1本发明与普通EDTA采血管对比试验1

由表1可知本发明7天后的Ct值与第0天的数据更接近，而普通EDTA采血管中的血液随着储存时间的加长，Ct值逐渐缩小，与第0天的数据差距逐渐增大。可见，使用本发明可有效避免白细胞的破裂，避免基因组DNA污染血浆DNA，为后续的检测的样本质量提供了保证。

实施例2

本实施例提供的血液抗凝剂，按重量体积比(w/v)计，包括以下组分：

根据以上组分配制抗凝剂，并与普通EDTA采血管进行对比试验，步骤同实施例1。结果如表2及图2所示。

表2本发明与普通EDTA采血管对比试验2

由表2可知使用本发明7天后的Ct值与第0天的数据接近，而普通EDTA采血管中的血液随着储存时间的加长，Ct值与第0天的数据差距逐渐增大。可见，使用本发明可有效保证血液质量，有利于后续的DNA提取等操作。

实施例3

根据以上组分配制抗凝剂，并与普通EDTA采血管进行对比试验，具体操作步骤如下：

1、用EDTA采血管及添加有本实施例提供的血液抗凝剂的采血管分别进行血液采集，每支管采血量为10mL，往血液中加入2.25μg的突变阳性的肿瘤细胞系DNA；

3、在第0，1，5，7天分离血浆；分离血浆的步骤选择的是将血液放入离心管中，3000×g离心10min，小心的移取上清到一个新的离心管中，如果取到白细胞或红细胞，则重新进行离心后移取上清。将第一次离心后获得的上清再次放入离心机中，8000×g离心10min，小心的移取上清到一个新的离心管中，这样获得的溶液就是血浆样本。

5、将获得的DNA进行肿瘤突变基因的q-PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果。

正常的、未受污染的、未降解的血浆中肿瘤突变基因DNA片段是相同的，扩增的Ct值相差无几，而由于血浆中的降解机制，会造成肿瘤突变基因DNA片段的降解，造成扩增Ct的增大，另外，由于白细胞中的核酸大量释放到血浆中，会降低肿瘤突变DNA的丰度，也会造成扩增Ct的增大。

通过肿瘤突变基因的q-PCR验证，可以判断出肿瘤突变细胞系DNA的降解情况。

结果如表3及图3所示。

表3本发明与普通EDTA采血管对比试验3

由表3可知，使用本发明，7天后进行提取DNA并进行PCR验证，其Ct值与第0天的数据接近，而普通EDTA采血管中的样品随着储存时间的加长，其Ct值与第0天的数据相比显著增加，说明游离细胞DNA被降解严重。可见，使用本发明可有效缓解DNA降解，有利于后续的DNA提取等操作。

Claims

1.一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于，所述抗凝剂按重量体积比包括：甲醛释放剂0.1～1.5％，抗凝剂0.15～0.22％，嘌呤0.014～0.035g/l，磷酸二氢盐0.01％～0.15％，氯化盐0.4％～0.10％，核酸酶抑制剂0.3～1.4％。

2.如权利要求1所述的一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于：所述甲醛释放剂为1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因，羟甲基甘氨酸钠，尼泊金甲酯钠，尼泊金乙酯钠或尼泊金丙酯钠中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于：所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、乙二胺四乙酸二钠或枸橼酸钠中的至少一种。

4.如权利要求1所述的一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于：所述嘌呤为腺嘌呤、鸟嘌呤中的至少一种。

5.如权利要求1所述的一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于：所述磷酸二氢盐为磷酸二氢钠。

6.如权利要求1所述的一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于：所述氯化盐为氯化钠、氯化钾或氯化铵中的至少一种。

7.如权利要求1所述的一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于：所述核酸酶抑制剂为尿素、DEPC、SDS或异硫氰酸胍的至少一种。

8.一种用于保护游离DNA的血液抗凝剂，其特征在于：按重量体积比计，包括以下组分：

1,3-二羟甲基-5,5-二甲基海因0.8％，乙二胺四乙酸二钾0.18％，腺嘌呤0.027g/l，磷酸二氢钠0.090％，氯化钠0.498％，尿素0.7％。