CN1703621A - 采集组件 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于采集和稳定生物样品特别是全血样品的方法和装置。更具体而言,本发明涉及在样品采集期间大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA的应用,以及其中含有一定量EDTA的排空的液体样品容器,从而使得在采集样品时所达到的量为大约5.6-大约37.5mM,优选大约5.6-大约10.1mM EDTA以稳定血液。
Description
[0001]本申请要求于2002年5月7日提交的美国临时专利申请序列号60/377,986的优先权。
发明领域
[0002]本发明针对直接从患者采集和稳定生物样品特别是全血样品的方法和装置。更具体而言,本发明涉及在血液采集期间使用大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA,以及其中含有一定量EDTA的排空的液体样品容器,从而使得在采集血液时所达到的EDTA量为大约5.6-大约37.5mM,优选大约5.6-大约10.1mM,以稳定血液。预期在血液采集期间使用大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA还将作用于保藏核酸特别是脱氧核糖核酸(DNA)更特别是基因组DNA并增进其稳定和/或分离,从而抑制在血液的贮存或运送期间的离体DNA降解和/或断裂。
发明背景
[0003]用于采集和贮存血液和其它体液或样品的采样容器已普遍使用多年。典型地,采集容器是具有回弹塞子的玻璃或塑料管。当使用塑料管时,常用多种化学试剂如硅烷化剂对塑料管进行处理。
[0004]采血管在现有技术中是广为人知的。在离心之前通常使用在血样中普遍采用的抗凝添加剂以分离各种血液成分。典型地,抗凝添加剂是缓冲柠檬酸盐或肝素水溶液。含有抗凝剂的采血管的一个实例公开于Smith等人的美国专利No.5,667,963中。采血管还可在其中含有多种稳定添加剂,以制备用于特定血液相关检测的血样。多种抗凝剂已单独或与细胞维持溶液相联合用在血液采集/分离装置中,以在离心和分析之前保藏血样于非凝状态一段时间。例如,一些常用的抗凝剂包括肝素钠和柠檬酸钠。特别是柠檬酸钠溶液已被用作抗凝剂多年。例如,目前对于基因扩增技术如聚合酶链式反应的要求推荐采用柠檬酸钠在全血中实现抗凝功能。参见Holodniy等人,″Inhibition of HumanImmunodeficiency Virus Gene Amplification by Heparin″,J.Clin.Microbiol.,29:676-679(1991)。已知钙在凝血级联中起关键作用。柠檬酸钠溶液阻止钙参与凝血。典型地,这些柠檬酸钠溶液被添加到新鲜采集的全血中以防止凝血。随后,可将钙加回至全血悬液中以在需要时诱导随后的凝血。
[0005]在血液采集中使用EDTA是已知的。例如,Dawes等人,Thrombosis Research,12(5):851-861(1978)泛泛地描述了在采血过程中使用EDTA,而Ludlam等人,Thrombosis Research,6(6):543-548(1975)公开了在采血过程中在3ml总体积中使用0.1ml 10wt%EDTA溶液(即0.33wt%EDTA)。
[0006]美国专利No.4,311,482公开了特别使用“标准的”EDTA用于采集血样的方法和设备。具体公开的是在10ml采集管中使用0.6ml2.5wt%EDTA溶液(即0.15wt%EDTA)。
[0007]美国专利No.5,849,517公开了用于固定和稳定组织、细胞及细胞成分的方法和组合物,从而保藏其中的抗原性位点和核酸。所述组合物特别包含EDTA,优选浓度高至大约0.2wt%,最优选的浓度高至大约0.1wt%。
[0008]美国专利No.6,309,885公开了在血液采集过程中使用溶解血细胞的试剂与至少一种酶抑制剂组合,以检测同型半胱氨酸和/或总叶酸。该专利公开了高至大约1.1mg/ml量的EDTA可用作酶的抑制剂。
[0009]在采血期间上述EDTA量与现有技术中的标准一致。国立临床化学实验室(“NCCLS”)为全国的临床实验室提供了执业标准。NCCLS出版物H1-A4(NCCLS,Vol.16,No.13,在A3.2)公开了加入血液的EDTA的可接受的标准量应该为4.55+/-8.85umol/ml血液。在NCCLS出版物中指定的EDTA比(mg EDTA/ml血液)为:(1)EDTA二钠脱水化物(Na2EDTA-2H2O)1.4-2.0mg/ml;(2)EDTA二钾脱水化物(K2EDTA-2H2O)1.5-2.2mg/ml;和(3)无水EDTA三钾(K3EDTA)1.5-2.2mg/ml。除了教导使用指定量的EDTA之外,NCCLS出版物公开了过量的EDTA可能引起血细胞的形态学改变。
[00010]按照NCCLS中公开的可接受的EDTA wt/vol血液范围,取决于所用的EDTA盐,常规的采血方法和装置通常采用1.4-2.2mgEDTA/ml采集的血液。照此,常规的方法是遵循NCCLS公开的保藏血液的指南。
[00011]近年来,在生物、医学和药理学领域对获自生物样品的核酸的研究兴趣有所增加。特别是,从人全血分离的基因组DNA(gDNA)可提供有关细胞遗传起源和功能的广泛信息。该信息可用于临床实践中,例如在倾向性测试、HLA分型、身份检测、遗传性疾病的分析和肿瘤学中。许多分子诊断下游操作(例如微阵列分析、定量PCR、实时PCR、DNA印迹分析等)需要高质量的gDNA。目前可利用的血液采集方法和装置导致在抽血后产生微小的凝块,在gDNA分离操作中这可导致产生不纯的gDNA。不纯的gDNA可干扰下游分子分析操作,从而导致结果不正确或结果差,或者根本没有结果。必须采取措施来维持血液中核酸的完整性,血液在其中贮存或运送的容器允许进行分析和/或其它操作。因此,需要克服目前用于血液采集的那些方法和装置的缺点的采血方法和装置。
发明概述
[00012]本发明涉及在血液化学相关技术和装置,特别是血液采集和分离组件中抗凝剂的应用。更期望的是,本发明涉及血液分离组件,包括容器,优选采血管。
[00013]根据本发明的抗凝剂应包括大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA。发明人发现了,对于维持血液中核酸的完整性这一问题的解决方案是添加惊人大量的EDTA。
[00014]EDTA可存在于血液采集装置中;可在采集之前即刻加入血液采集装置;或者可在采集之后立即加入血液采集装置。优选EDTA在采集之前存在于装置中。
[00015]本发明的抗凝剂还可被引入特定的血液分离组件中,从而提供新并且有用的这类装置。这类装置典型地包括具有开口和封闭端的容器。所述容器优选是血液分离管。
[00016]本发明的另一方面是提供用于接收和采集生物样品的采集容器,其中所述容器预先装有一定量的EDTA,从而使得在采集样品时,达到的摩尔浓度为大约5.6-大约37.5mM,优选大约5.6-大约10.1mMEDTA。预先充装的EDTA可以为溶液或干燥形式。目前的采集容器包括玻璃或塑料管,含有EDTA溶液或EDTA喷雾干燥至容器的一部分。含有总体积为2ml的K3EDTA溶液的采血管在加入8.5ml血液后达到大约8.1mM的摩尔浓度,其经证明很有效。
[00017]本发明的另一方面是提供一种排空的容器,其中预先装有一定量EDTA,在采集血液后达到大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM摩尔浓度的EDTA,其中所述容器具有低于大气压的内部压力。优选所述压力足以将预定体积的血液抽取到所述容器中。
[00018]本发明还解决了对于在血液的采集、运输和贮存期间保护核酸特别是DNA的方法和装置的需要。已发现,使用大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA还会稳定存在于采集的样品中的核酸特别是DNA。在本发明中所用的EDTA或其盐的浓度(wt/血液vol)超过先前认为在常规采血中可接受的量。
[00019]本发明的另一方面是提供用于采血和将血液与一定量的EDTA混合的血液采集方法和装置,从而在采血时达到大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA的摩尔浓度,以产生稳定并且抑制DNA降解或断裂的血样,从而使得血样中DNA的分离和纯化可以在较迟后进行。
[00020]本发明的这些方面、优点和其它显著特征由以下发明详述特别是结合附图一并考虑时将更为显而易见。
附图简要说明
[00021]图1是本发明一个实施方案中容器的截面观。
发明详述
[00022]在此所用的术语“EDTA”指EDTA化合物例如K2EDTA,K3EDTA或Na2EDTA的EDTA部分。
[00023]本发明针对稳定和保藏生物样品的方法和装置。更具体而言,本发明针对在血液采集期间含大约5.6-大约37.5Mm、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA的抗凝剂的应用。在本发明优选的实施方案中,所述装置是含有一定量EDTA的预填充容器,使得在采血后达到大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA的摩尔浓度。
[00024]本发明还针对稳定生物样品的方法和装置,以更好地保持该样品之中所含的DNA的结构完整性。更具体而言,本发明针对抑制血样中DNA降解和断裂的方法和装置。预期大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA将抑制、防止和/或减少在样品运送或贮存期间血样中DNA降解和/或断裂的发生。
[00025]生物样品可以是从受试对象抽取的体液。在优选的实施方案中,生物液体是全血。其它生物样品的实例包括含细胞的组合物,如红细胞浓缩物、血浆、血清、尿、骨髓抽吸物、脑脊液、组织、细胞和其它体液。
[00026]参照图1,本发明的装置包括样品采集装置10,其具有用塞子塞住的容器12并且包含大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA 14。图1显示EDTA溶液;但是,EDTA也可以以固体形式存在。优选地,容器是预填充的容器。最优选地,预填充的容器具有可去除的封盖装置16,其在位时作用于保护和维持容器的任何内容物在容器之中并防止其任何泄漏或溅出。封盖装置16还可以是这样的构造:使得相对于在容器外部的压力在容器之中保持降低的内部压力。
[00027]EDTA 14可以预先装载到本发明的容器12中,从而在与生物样品合并时存在大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA。该EDTA量防止生物样品如血样凝固并使其稳定,以产生室温稳定的组合物,其抑制或防止生物样品贮存或运送期间DNA的降解和断裂。其还减少样品中微小凝块的形成。
[00028]本发明的采集装置可包括任何采集装置,包括但不限于管如试管和离心管;封闭系统采血装置,如采集袋;注射器,特别是预充装的注射器;实验室容器如烧瓶、小瓶和其它适于盛装生物样品的容器。根据本发明,优选的采集装置是具有可去除的封盖装置的管,所述封盖装置能保持管中较管外压力低的压力。
[00029]如图1所示,本发明的装置10是用于直接从受试对象抽取血样,防止血凝并通过抑制DNA的降解和断裂而稳定包含在血样中的DNA。装置10包括具有至少一个内壁15的容器12,所述内壁限定用于装生物样品18的贮器17,样品18在优选的实施方案中是血液。容器12包括至少一个开口20,其由所述至少一个内壁15的开放端22限定,开口20与贮器部分17互通。封闭的底端24由所述至少一个内壁15形成。封盖装置16的大小和构造使得其可释放地连到所述至少一个内壁15的开放端22。
[00030]大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA14具有经证实的优于已知EDTA量的抗凝特性,预期其可抑制、防止和/或减少在样品运送或贮存期间生物样品18中DNA降解和/或断裂的发生。EDTA 14稳定生物样品18以产生稳定的组合物,其抑制或防止生物样品中存在的DNA的降解和/或断裂。其还减少样品中微小凝块和/或其它沉淀的形成。优选地,本发明的装置10由制造商预充装大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA 14并包装成现成即可用的形式。通常,经包装的采集装置10是无菌的并包装在无菌的包装材料中。
[00031]容器12可由玻璃、塑料或其它合适的材料制成。塑料材料可以是不透氧的材料或含有不透氧层。可供选择地,容器12可以由透水和透气的塑料材料制成。优选地,容器12被排空至低于大气压的内部压力。所述压力优选经选择以抽取预定体积的生物样品18到容器12中。通常,通过用针头28或如现有技术中已知的套管刺穿封盖装置16而将生物样品18抽取到贮器17中。合适的容器12和封盖装置16的一个实例公开于Cohen的美国专利No.5,860,397,所述专利在此整体引入作为参考。
[00032]容器12优选由透明材料制成。合适的透明热塑材料的实例包括聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。容器12具有按照采集的生物样品的所需体积而选择的合适尺寸。在一个实施方案中,容器12为管状,其轴向长度为大约100mm,直径为大约13mm-大约16mm。装置10的优选实施方案是装有K3EDTA的100mm×16mm PET管,EDTA浓度为8.1mM。
[00033]封盖装置16由有弹性的材料制成,其能维持有差别的低于大气压的内部压力并可由针头28或其它套管刺穿以将生物样品18引入容器12中。用于封闭的合适材料包括例如硅酮橡胶、天然橡胶、苯乙烯丁二烯橡胶、乙烯-丙烯共聚物和聚氯丁烯。还可采用保护罩30来可释放地覆盖并保护封盖装置16。
[00034]在一个实施方案中,容器12由透水和透气的塑料制成。氧通过管壁的扩散具有降低容器内真空度的作用。容器的水和氧透过性能经选择以维持容器内有差别的期望压力以实现容器的期望保藏期。保藏期通过平衡透氧性和水分丧失而优化。所述容器具有至少大约1年、优选更长的保藏期。
[00035]还可包含另外的添加剂与EDTA 14一起以有助于稳定生物样品18。另外的添加剂的实例包括阳离子化合物、表面活性剂、离液序列高的盐、核糖核酸酶抑制剂、另外的螯合剂、季胺及其混合物。
[00036]此外,为了处理生物样品,可向混合物中加入其它成分。例如,可将化学试剂包括在内以透过或溶解生物样品18中的细胞。其它合适的成分包括但不限于阳离子化合物、表面活性剂、去污剂、离液序列高的试剂、核糖核酸酶抑制剂、季胺、蛋白酶、脂酶、苯酚、酚衍生物、酚/氯仿混合物、醇类、醛类、酮类、有机酸、简单的盐,象有机酸的盐、卤素的碱金属盐;另外的有机螯合剂、还原剂、缓冲剂、糖类、荧光染料、抗体、结合剂、抗凝剂如柠檬酸钠、肝素等;和任何其它正常用于处理生物样品以进行分析的试剂或试剂组合。
[00037]本发明的方法是这样进行的:获得生物样品18并将样品引入容器12中,容器优选已经含有EDTA。在优选的实施方案中,制备生物样品18并立即直接引入采集容器12中。在更优选的实施方案中,将生物样品18由患者直接抽取到采集容器12中而无任何干预处理步骤。预期从患者直接采集生物样品18,如当采集全血样品时,并将样品直接引入含有大约5.6-大约37.5mM、优选大约5.6-大约10.1mM EDTA的容器,可大大防止或减少在样品贮存时发生的DNA降解和断裂。
[00038]EDTA 14可以以任何合适的形式提供,包括但不限于溶液、悬浮液或其它液体;小丸、喷雾干燥物质、冻干物质、粉末、颗粒或凝胶。EDTA 14可以位于容器12的贮器17之中的任何一处,如果喷雾干燥到容器中,则可以沿着所述采集装置的至少一个内壁15或在贮器部分之中的任何地方。优选地,EDTA 14以液体形式预先装到容器12之中。
[00039]在优选的实施方案中,生物样品18是全血。在与血液混合后EDTA的摩尔浓度范围从大约5.6到大约37.5mM,优选从大约5.6到大约10.1mM,更优选从大约6.3到大约9.0mM,甚至更优选从大约7.2到大约8.5mM。最优选地,EDTA的摩尔浓度为大约8.1mM。可用于本发明中的EDTA的合适盐包括例如K2EDTA,K3EDTA,Na2EDTA,Na3EDTA,Na4EDTA,CaNa2EDTA,Na2ZnEDTA,Na2CuEDTA,Na2MgEDTA,NaFe(III)EDTA和(NH4)2EDTA。优选地,EDTA盐是K2EDTA,K3EDTA和Na2EDTA中的一种或多种。
具体实施方式
[00040]本发明将通过以下非限定性实施例进行进一步例示说明。
[00041]在一系列试验中,研究了在液体抗凝剂溶液中更高浓度的EDTA和/或更大体积的液体是否导致产生更高质量和/或更高产率的基因组DNA。
[00042]实施例1:使用目前可从Sarstedt(cat.no./ref.no.02.1066.001)得到的9ml EDTA管从三名不同的供体抽取静脉全血,浓度为1.6mg EDTA/ml血液。从每名供体抽取8管血液。将来自每名供体的一份样品中的10μl血液在采集后立即抽出,用Neubauer盒计数白细胞。在一个白细胞含有大约6.6pg DNA的假设基础之上,计算理论产率。将来自供体1-3的4管血液贮存在原始采血管中不加修饰。将来自供体1的其余4管血液与1.8ml 0.9%NaCl溶液(生理盐浓度)混合。这是通过将1管血液转移至装有1.8ml 0.9%NaCl溶液的15ml管(常规聚丙烯圆底离心管)并通过倒转封闭的管3次来混合而实现的。将来自供体2的其余4管以相同方式与1.8ml含有0.9%NaCl和1%Na2EDTA的溶液混合。这产生大约8.1mM摩尔浓度EDTA。将来自供体3的其余4管以相同方式与1.8ml含有0.9%NaCl和7.5%Na2EDTA的溶液混合。这产生大约37.5mM摩尔浓度EDTA。
[00043]将原始采血管中的血样和在15ml聚丙烯离心管中的血样在实验室的工作台上于室温贮存3天。随后,将血液于4℃再贮存4天。
[00044]贮存后,如下进行DNA提取:将血样倒转10次以使血清和红细胞均匀混合。然后将血液转移至50ml处理管(常规聚丙烯圆底离心管)中,所述管中装有25ml含有Triton-X 100的Tris/HCl缓冲的细胞溶解溶液,并通过倒转离心管5次而混合以溶解红细胞和白细胞。将血液置于甩平式转头中于2000×g离心5分钟以沉淀细胞器,诸如细胞核和线粒体。弃去上清并将离心管倒置于一张吸水纸上2分钟。为了去除蛋白质污染物,加入5ml高浓度的盐酸胍缓冲液,并将样品涡旋混合直到沉淀完全变均匀。
[00045]在加入50μl QIAGEN-蛋白酶后,将样品置于水浴中并于65℃温育10分钟。再次涡旋10秒之后,加入5ml异丙醇。将管倒转直到白色的DNA丝结在一起并形成可见的沉淀。将样品置于甩平式转头中于2000×g离心3分钟以沉淀DNA。弃去上清,通过加入5ml 70%乙醇并涡旋5秒来洗DNA沉淀。于2000×g再离心2分钟后,再次弃去上清并将离心管倒置于一张吸水纸上5分钟以干燥DNA。然后,加入1ml重悬缓冲液(10mM Tris/HCl pH8.5),将样品涡旋5秒并在水浴中于65℃温育60分钟以溶解DNA。温育之后,将DNA溶液转移到2ml微量离心管的盖中。
供体 | EDTA浓度[mgEDTA/ml血液] | 加入的有0.9%NaCl的溶液 | 异丙醇沉淀的颜色 | 平均产率[μgDNA/ml血液] | 平均产率[%理论产率] | 平均A260/A280比率 | 标准PCR中阳性数 |
1 | 1.6 | 无 | 白色 | 445.4±33.2 | 141.5±10.6 | 1.78±0.00 | 4/4 |
1 | 1.6 | 1.8ml | 白色 | 404.3±16.9 | 128.4±5.4 | 1.79±0.00 | 4/4 |
2 | 1.6 | 无 | 白色 | 374.4±32.5 | 120.6±10.5 | 1.79±0.01 | 4/4 |
2 | 3.6 | 1.8m1 | 白色 | 343.0±36.7 | 110.5±11.8 | 1.79±0.01 | 4/4 |
3 | 1.6 | 无 | 白色 | 456.8±5.1 | 113.5±1.3 | 1.79±0.01 | 4/4 |
3 | 16.6 | 1.8ml | 浅褐色 | 525.4±18.1 | 130.6±4.5 | 1.77±0.00 | 4/4 |
[00047]表1显示了添加或不添加另外溶液的来自供体1-3的4份样品的产率、占理论产率的百分比和纯度的平均值和标准偏差。此外还列出了异丙醇DNA沉淀的颜色和在标准PCR体系中的表现。在该PCR中,扩增了人单拷贝基因‘hugl’(homologue of giant larvae)的1.1kb片段。表1表明所有样品具有类似的结果。但是由于供体数目少,比较个体结果几乎没有统计学显著性。
[00048]实施例2:为了研究更高浓度的液体EDTA相对于在目前可得到的采血管中的EDTA抗凝剂的作用,制备了一系列排空的样管。这些样管含有1.8或3.6mg EDTA盐/ml血液,抗凝剂的液体体积不同,如表2所示。
表2
样管 | K3EDTA浓度[mgK3EDTA/ml血液] | 液体体积 | 抽血体积 | 管材料 |
1 | 1.8 | 2ml | 8.5ml | 塑料 |
2 | 3.6 | 2ml | 8.5ml | 塑料 |
3 | 1.8 | 2.5ml | 8.0ml | 塑料 |
4 | 3.6 | 2.5ml | 8.0ml | 塑料 |
5 | 1.8 | 3ml | 7.5ml | 塑料 |
6 | 3.6 | 3ml | 7.5ml | 塑料 |
[00050]使用样管1-6(参见表2)和目前可得到的来自Becton,Dickinson and Company的喷雾干燥EDTA(K2EDTA)管,后者的浓度为1.8mg EDTA/ml血液,从4名不同的供体抽取静脉全血。从每名供体抽取样管1-6各1管和喷雾干燥管1管。将血样在原始采血管中以水平位置于40℃贮存于加热盒中。48小时后,如实施例1中所述进行DNA提取。
[00051]置于40℃ 48小时之后,观察不到凝块;但是,在溶解、离心并除去上清之后,从喷雾干燥EDTA采血管获得的细胞器沉淀与从含有液体EDTA的样管1-6获得的沉淀相比常具有不同的颜色和大小。来自喷雾干燥EDTA管的细胞器沉淀常为红色至棕色,并沿管壁向下留有许多污迹。来自含有液体EDTA的样管1-6的细胞器沉淀主要是红色的并含有较少的污迹。
[00052]此外,当用消化缓冲液溶解棕色的细胞器沉淀时,溶解的溶液是棕色的。当用消化缓冲液溶解红色的细胞器沉淀时,溶液呈现红色或浅红色。
[00053]测试结果提示更高量EDTA是有用的,并导致进行进一步的试验,所述试验在以下实施例中作更具体描述。
[00054]实施例3:使用样管1-6从5名不同的供体抽取静脉全血。从每名供体抽取样管1-6各1管。将来自每名供体的1.8mg/ml喷雾干燥管的10μl血液用于测定理论产率。
[00055]将血样放在实验室工作台上于原始采血管中以竖直位贮存13天。13天后,如实施例1中所述进行DNA提取。
[00056]通过分光光度法分析DNA(参见表3)。
[00057]于室温贮存13天后,在处理前倒转采血管以均匀混合血液和血清时可看见凝块。当将血液转移至50ml处理管时观察血液流出采血管,可区分大凝块和小凝块。
[00058]于室温贮存13天后,抽取到样管1、3和5(含有液体抗凝剂和1.8mg EDTA/ml血液)中的来自5名不同供体的所有血样均含有大凝块。无论采用何种采血管,来自1名供体的血液都含有大凝块。抽取到样管2、4和6(含有液体抗凝剂和3.6mg EDTA/ml血液)中的其余4份血样含有较少的凝块(参见表3)。
表3
采血管 | 可见凝块 | 异丙醇DNA沉淀的颜色 | 平均产率[μgDNA/ml血液] | 平均产率[%理论产率] | 平均260/280商数 |
样管1 | 5份样品中都有大凝块 | 5份样品中都没有可见沉淀 | 3.1 | 9.1±9.0 | 1.89±0.14 |
样管2 | 3份中没有,1份中有小凝块,1份中有大凝块 | 4次白色,1次白色但非常小 | 27.0 | 80.2±51.6 | 1.68±0.17 |
样管3 | 5份中都有大凝块 | 5份样品中都没有可见沉淀 | 0.8 | 2.1±0.7 | 2.61±15.0 |
样管4 | 3份中没有,1份中有小凝块,1份中有大凝块 | 4次白色,1次白色但非常小 | 23.1 | 66.3±41.9 | 1.78±0.03 |
样管5 | 5份中都有大凝块 | 2次棕色,3次没有可见沉淀 | 2.2 | 7.2±10.9 | 1.61±0.70 |
样管6 | 2份中没有,1份中有小凝块,2份中有大凝块 | 2次白色,1次白色但非常小,2次没有可见沉淀 | 15.3 | 42.8±43.9 | 2.14±0.068 |
[00060]显示了来自5名供体的5份样品的对于产率、占理论产率的百分比和纯度的平均值。对于占理论产率的百分比和A260/A280比值,计算标准偏差。DNA产率显示为μg DNA/ml血液,从而能够比较来自血液体积不同的不同样管的产率。
[00061]在凝块的发生与基因组DNA的产率之间存在清楚的关联。血液中凝块越多,则可分离的DNA越少。最佳的产率获自样管2,其在2ml抗凝剂中含有3.6mg EDTA/ml血液。
[00062]实施例4:基于上述结果,涉及一项更大的研究。在该研究中,将在2ml抗凝剂中含有3.6mg EDTA/ml血液的样管2与目前可从Becton,Dickinson and Company得到的喷雾干燥1.8mg/ml血液采集管作比较。
[00063]使用样管2和喷雾干燥EDTA管从六十(60)名不同供体抽取静脉全血。将每名供体的血液抽取到两支样管和两支喷雾干燥管中。将来自每名供体的喷雾干燥管中的一支中的10μl血液用于测定理论产率。
[00064]将每组血样中的一套(即60支样管和60支喷雾干燥EDTA管)于室温在实验室工作台上贮存7天。7天之后,如实施例1中所述进行DNA提取。将每组血样的另一套于室温在实验室工作台上贮存13/14天。13/14天后,如实施例1中所述进行DNA提取。
[00065]通过分光光度法分析DNA,结果如以下表4中所示。
[00066]置于室温7天后,在任何管中都没有观察到凝块。置于室温13/14天后,仅在1支样管中观察到凝块,但在8支喷雾干燥EDTA管中观察到了凝块。
[00067]显示了来自60名供体的4份样品对于纯度、产率和占理论产率的百分比的平均值。对于占理论产率的百分比和A260/A280比值,计算了标准偏差。DNA产率显示为μg DNA/ml血液,从而能够比较来自含有不同体积血液的管的产率。
表4
采血管 | 平均产率[μgDNA/ml血样] | 平均产率[%理论产率] | 平均260/280商数 |
7天样管 | 21.98 | 52.34±20.99 | 1.81±0.09 |
7天喷雾干燥EDTA | 24.48 | 53.65±17.43 | 1.81±0.07 |
13/14天样管 | 23.79 | 57.53±34.24 | 1.82±0.07 |
13/14天喷雾干燥EDTA | 20.21 | 43.38±16.76 | 1.77±0.13 |
[00069]贮存7天后,在样管和目前可得到的喷雾干燥管之间没有观察到显著差异。但是,在贮存13/14天后,可以看出优势,包括凝块较少、纯度更好(即更高的A260/A280商数)、无有色的DNA溶液(有色的DNA溶液表明存在潜在的PCR抑制剂)、更高的平均产率等等。
[00070]实施例5:为了比较抗凝剂,使用样管2和以“Citrat”商品名出售的目前可从Becton,Dickinson and Company得到的采集管(目录号366007,BD Vacutainer 10ml,100×16,0.105M柠檬酸盐,浅蓝色塞子,玻璃管)从4名不同供体抽取静脉全血。从每名供体抽取4支样管2和两支Citrat管。将来自每名供体的一支Citrat管中的10μl血液用于测定理论产率。
[00071]如实施例1中所述,立即处理来自每名供体的两支样管2。于25℃贮存21天后,如实施例1中所述对剩余管进行DNA提取。
[00072]通过分光光度法分析DNA,结果如表6所示。
采血管 | 储存 | 平均产率[μgDNA/ml血样] | 平均产率[%理论产率] | 平均260/280商数 |
样管2 | T0 | 31.79±5.89 | 64.21±21.38 | 1.87±0.05 |
样管2 | 25℃ 21天 | 26.46±5.04 | 54.09±19.20 | 1.89±0.01 |
Citrat管 | 25℃ 21天 | 2.10±0.83 | 4.47±2.52 | 1.99±0.13 |
[00074]尽管选择了多种实施方案来说明本发明,本领域技术人员将理解,不偏离本发明的范围可以作出多种修改和添加。
Claims (61)
1.用于采集生物液体样品的容器,所述容器中放置有一定量的EDTA化合物,其中在采集样品后,达到大约5.6-大约3 7.5mM EDTA摩尔浓度。
2.权利要求1的容器,其中所述样品选自全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、尿、骨髓抽吸物、脑脊液、组织细胞和其它体液。
3.权利要求2的容器,其中所述样品是全血。
4.权利要求3的容器,其中在采集血液之后EDTA的摩尔浓度是大约5.6-大约10.1mM。
5.权利要求3的容器,其中在采集血液之后EDTA的摩尔浓度是大约6.3-大约9.0mM。
6.权利要求4的容器,其中在采集血液之后EDTA的摩尔浓度是大约7.2-大约8.5mM。
7.权利要求5的容器,其中在采集血液之后EDTA的摩尔浓度是大约8.1mM。
8.权利要求1的容器,其中EDTA化合物以选自以下的形式存在:液体、小丸、喷雾干燥物质、冻干物质、粉末、颗粒或凝胶。
9.权利要求8的容器,其中EDTA化合物为液体形式。
10.权利要求9的容器,其中EDTA化合物为溶液或悬浮液。
11.权利要求8的容器,其中EDTA化合物被喷雾干燥至容器的内表面。
12.权利要求1的容器,其中EDTA化合物是一种或多种选自以下的EDTA盐:K2EDTA,K3EDTA和Na2EDTA。
13.权利要求1的容器,其中所述容器选自试管、离心管、采血管、采血袋、血液分离管、注射器、烧瓶和小瓶。
14.权利要求13的容器,其中所述容器是采血管。
15.权利要求13的容器,其中所述容器是血液分离管。
16.权利要求15的容器,其中所述容器包含凝胶或机械分隔,从而使得在离心时,所述凝胶或机械分隔提供对血液的一种或多种成分的分离。
17.权利要求3的容器,其中所述容器排空至低于大气压的内部压力。
18.权利要求17的容器,其中所述内部压力足以将预定体积的血液抽取到容器之中。
19.权利要求1的容器,其中所述容器包括可去除的封盖装置。
20.权利要求1的容器,其中所述容器由玻璃制成。
21.权利要求1的容器,其中所述容器由塑料制成。
22.权利要求21的容器,其中所述容器由选自以下的透明材料制成:聚碳酸酯类、聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。
23.权利要求3的容器,其中所述容器进一步包含一种或多种选自以下的添加剂:阳离子化合物、表面活性剂、去污剂、离液序列高的化合物、核糖核酸酶抑制剂、螯合剂、季胺、蛋白酶、脂酶、苯酚、酚/氯仿混合物、醇类、醛类、酮类、有机酸、诸如有机酸盐的简单盐、卤素的碱金属盐;荧光染料、抗体、结合剂、还原剂、缓冲剂、糖类和抗凝剂。
24.用于采集全血的容器,所述容器中放置有一定量液体形式的EDTA化合物,其中在采集全血后,达到大约5.6-大约10.1mM EDTA摩尔浓度。
25.用于采集全血的容器,所述容器中放置有喷雾干燥至容器内表面的一定量EDTA化合物,其中在采集全血后,达到大约5.6-大约10.1mM EDTA摩尔浓度。
26.用于采集全血的血液分离管,所述管中放置有凝胶或机械分隔,从而使得在离心时所述凝胶或机械分隔提供对血液的一种或多种成分的分离,所述管中还放置有一定量的EDTA化合物,其中在采集全血后,达到大约5.6-大约10.1mM EDTA摩尔浓度。
27.稳定生物液体样品的方法,包括将样品分散在一定量的EDTA化合物中,其中在生物样品分散后达到大约5.6-大约37.5mM EDTA摩尔浓度。
28.权利要求27的方法,其中所述样品选自全血、红细胞浓缩物、血浆、血清、尿、骨髓抽吸物、脑脊液、组织细胞和其它体液。
29.权利要求27的方法,其中所述样品是全血。
30.权利要求29的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液分散之后是大约5.6-大约10.1mM。
31.权利要求30的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液分散之后是大约6.3-大约9.0mM。
32.权利要求31的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液分散之后是大约7.2-大约8.5mM EDTA。
33.权利要求32的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液分散之后是大约8.1mM EDTA。
34.权利要求33的方法,其中EDTA化合物是一种或多种选自以下的EDTA盐:K2EDTA,K3EDTA和Na2EDTA。
35.权利要求27的方法,其中EDTA化合物存在于选自以下的容器中:试管、离心管、采血管、采血袋、血液分离管、注射器、烧瓶和小瓶。
36.权利要求35的方法,其中所述容器是采血管。
37.权利要求36的方法,其中所述容器是血液分离管。
38.权利要求36的方法,其中所述容器由玻璃制成。
39.权利要求36的方法,其中所述容器由塑料制成。
40.权利要求39的方法,其中所述容器由选自以下的透明材料制成:聚碳酸酯类、聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。
41.权利要求29的方法,其中所述容器进一步包含一种或多种选自以下的添加剂:阳离子化合物、表面活性剂、去污剂、离液序列高的化合物、核糖核酸酶抑制剂、螯合剂、季胺、蛋白酶、脂酶、苯酚、酚/氯仿混合物、醇类、醛类、酮类、有机酸、诸如有机酸盐的简单盐、卤素的碱金属盐;荧光染料、抗体、结合剂、还原剂、缓冲剂、糖类和抗凝剂。
42.权利要求29的方法,其中所述容器排空至低于大气压的内部压力。
43.权利要求42的方法,其中所述内部压力足以将预定体积的血液抽取到容器之中。
44.权利要求43的方法,其中所述分散包括将血液由患者引入容器中。
45.从血样中提取DNA的方法,包括以下步骤:提供包含血液和一定量EDTA化合物的血液采集容器,其中EDTA的量为大约5.6-大约37.5mM;和对血样进行DNA提取操作。
46.权利要求45的方法,其中所述样品选自全血和红细胞浓缩物。
47.权利要求45的方法,其中所述样品是全血。
48.权利要求47的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液收集后为大约5.6-大约10.1mM。
49.权利要求48的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液分散后为大约6.3-大约9.0mM。
50.权利要求49的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液分散后为大约7.2-大约8.5mM EDTA。
51.权利要求50的方法,其中EDTA的摩尔浓度在血液分散后为大约8.1mM EDTA。
52.权利要求51的方法,其中EDTA化合物是一种或多种选自以下的EDTA盐:K2EDTA,K3EDTA和Na2EDTA。
53.权利要求45的方法,其中EDTA化合物存在于选自以下的容器中:试管、离心管、采血管、采血袋、血液分离管、注射器、烧瓶和小瓶。
54.权利要求53的方法,其中所述容器是采血管。
55.权利要求54的方法,其中所述容器是血液分离管。
56.权利要求54的方法,其中所述容器由玻璃制成。
57.权利要求54的方法,其中所述容器由塑料制成。
58.权利要求57的方法,其中所述容器由选自以下的透明材料制成:聚碳酸酯类、聚乙烯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。
59.权利要求47的方法,其中所述容器进一步包含一种或多种选自以下的添加剂:阳离子化合物、表面活性剂、离液序列高的化合物、核糖核酸酶抑制剂、螯合剂、季胺、蛋白酶、苯酚、酚/氯仿混合物、醇类、醛类、酮类、有机酸、诸如有机酸盐的简单盐、卤素的碱金属盐;荧光染料、抗体、结合剂和抗凝剂。
60.权利要求47的方法,其中所述容器排空至低于大气压的内部压力。
61.权利要求60的方法,其中所述内部压力足以将预定体积的血液抽取到容器之中。
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