CN1370984A - 一种加样装置及加样方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于分子生物学及细胞生物反应,特别是用于各种定量检测以及对微量污染高度敏感的实验室操作中的加样装置,其中所述加样装置中包括独立地含有参与所述反应的多个反应物和/或反应缓冲液的多元容器。本发明还涉及利用所述加样装置进行加样的方法及其用途。

Description

一种加样装置及加样方法及其用途

本发明涉及一种用于分子生物学及细胞生物反应，特别是用于各种定量检测以及对微量污染高度敏感的实验室操作中的加样装置，其中所述加样装置中包括独立地含有参与所述反应的多个反应物和/或反应缓冲液的多元容器。本发明还涉及利用所述加样装置进行加样的方法及其用途。

在很多分子生物学及细胞生物学反应的实验操作中，需要加入参与特定反应的多种反应试剂和/或缓冲液。目前普遍的做法是由实验操作者将反应所需的缓冲液及试剂，任选地分别稀释，并逐一加样。对于该领域中诸多定量检测，由于多种试剂均需要由操作者在每次检测前配制，必然增加因加样引起的误差和由于操作者不同或操作批次不同所造成的误差。另一方面，由于参与反应的各种试剂及缓冲液之间常常会发生某种化学反应，或者是某些试剂的贮存浓度与反应浓度不一致，因此，不能在操作前将待加样试剂混合加样或者混合保存。这样的加样方法不但使操作敏锁，更使操作时间延长，而且增加了引入污染物的可能性，往往导致反应产生假阳性结果或造成实验失败。为了解决目前分子生物学和/或细胞生物学领域多种反应中存在的上述问题，降低各实验室之间关于同一检验和/或实验因不同操作者甚至同一操作者不同批次操作造成的上述误差，提高实验结果的精确度和可信性，迫切需要能有效克服上述缺陷的用于这类反应中的加样装置和加样方法。

本发明一方面提供了一种用于分子生物学及细胞生物学反应，特别是用于各种定量检测以及对微量污染高度敏感的实验室操作中的加样装置，其中包括独立地含有参与所述反应的多个反应物和/或反应缓冲液的多元容器。

本发明另一方面提供了一种用于分子生物学或细胞生物学反应，特别是用于各种定量检测以及对微量污染高度敏感的实验室操作中的多个反应物加样的方法，其中利用本发明的加样装置将参与所述反应的多个反应物相互独立地同时或几乎同时加入进行反应的容器中。

在分子生物学和细胞生物学实验涉及的多种定量检测中，一般需要加入多种试剂和/或缓冲液，由于这些试剂和/或缓冲液之间存在发生相互反应的可能，通常不能将其按将进行的反应所需事先混合后贮存，而只能在实验前完成混合并加样，或者只能在实验过程中由操作者按反应要求剂量逐一加样。这样的操作方法，不但使实验操作步骤繁杂，花费时间过长，不利于进行大批量标本的检测，而且由于操作者不同，增加了反应结果的系统误差和随机误差，影响了结果的可信性。通过采用本发明所述的加样装置和加样方法，就可以大大减少这种人为操作带来的误差，提高检测质量。

另一方面，在分子生物学、细胞生物学的实验操作中，样品的污染，即使是极其微量的污染的存在，常常导致实验结果呈现假阳性或假阴性，甚至实验失败。一些高度敏感的实验中，污染源常常很难明确，因此难以避免。比如PCR扩增反应中，每20个扩增周期后，目标分子的数量可以扩增10⁴～10⁶倍。经过巢式PCR扩增反应，检测目标分子的敏感性理论上可以低至1个DNA分子拷贝。因此，即使有一个污染性DNA分子混入，也将导致假阳性检测结果出现。为了防止上述污染，目前实验室中一般采取如下方式：1)全部使用一次性反应用具和专用实验用品，并使用带有过滤的加样头；2)操作者经常更换手套和口罩；3)实施例行清洁，无流动空气，且在独立的实验间里分别完成加样过程和PCR产物鉴定过程。但是，即使如此，由熟练操作者进行PCR操作时，还是常有假阳性结果发生。污染源可能是接触所致，也可能是由空气中存在的微量分子所致。减少加样时反应容器暴露于空气的时间，简化操作步骤，是克服上述污染发生的有效手段。这类污染问题也给细胞生物学实验中的细胞培养带来很多困难。特别是在气侯潮湿、温热的梅雨季节，常常发生由空气中霉菌作为污染源引起的污染。由于空气中潜在的霉菌虽经紫外灯消毒、经消毒剂蒸汽消毒后仍能存活，且目前尚无针对霉菌污染的有效灭菌或抑菌措施，因此，污染常常难以避免，造成实验失败。类似地，减少细胞培养容器暴露于空气的时间，简化操作步骤，能够大大减少发生污染的可能性。

除减少污染，提高定量检测质量之外，使用本发明所述加样装置和加样方法还可以明显缩短操作时间，简化操作。为实现大批量标本的检测提供了可能性。可以将特定反应所需的多个反应物通过工业化方法和手段预先大批量配制并贮存于本发明所述装置中。进行所需反应时，利用本发明装置可以将所述多个反应物同时或几乎同时加入反应容器中，使操作更加简单、迅速、加样量准确。

本发明一方面提供了一种用于分子生物学及细胞生物学反应，特别是用于对微量污染高度敏感的实验室操作中的加样装置，所述加样装置中包括独立地含有参与所述反应的多个反应物和/或反应缓冲液的多元容器。本发明的加样装置可用于涉及多个反应物的定性及定量实验，包括测定样品中特定蛋白质量的反应；测定特定酶的单位活性的反应；特别是适用于基于PCR扩增的各种检测，以确定样品中是否含有的特定cDNA、mRNA和DNA，及测定其含量。在本发明的一个实施方案中，所述加样装置可用于进行定量PCR反应。在本发明的一个实施方案中，所述加样装置可用于细胞培养过程。

在所述加样装置中，所包含的多元容器的数量取决于进行特定反应所需的反应物和/或反应缓冲液的数量，通常为2-30个，优选为2-20个，更优选为2-10个，甚至更优选为2-5个。

在所述加样装置中，所包含的各个反应物为特定反应中所需的量，且各个反应物可各自独立地为液体、胶体、悬浊液或乳浊液或粉末形式，优选地为液体、胶体、悬浊液或乳浊液形式。

本发明的加样装置中，所述的多元容器可以由反应中的各个反应物和/或反应缓冲液可接受的稳定的惰性材料制成，即在常规的制备、贮藏或运输条件下，不与各个反应物和/或反应缓冲液发生反应，也不会由于材料结构发生改变，导致物理性损坏，造成容器破裂。此外，所述惰性材料还应当不吸附各个反应物和/或反应缓冲液，使得在加样时各个反应物和/或反应溶液能够完全加入反应容器中，不在各个多元容器中残留。适合制备本发明的多元容器的材料包括例如高分子材料、玻璃，尤其是经硅烷化的高分子材料、金属、玻璃和衬有防水性复合层的纸质材料等。材料的选择应取决于所构成的容器中容纳的用于特定酶反应之反应物和/或反应缓冲液的性质，以使容器自身以及其中的反应物和/或反应缓冲液在正常的制备、运输或储藏条件下保持稳定。

在本发明的加样装置中，所述的多元容器可相互联结或相互独立，只要各个多元容器的形状在整体上与进行反应的容器相配合，并便于加样。其中联结可通过物理或化学方法进行。所述的物理或化学方法包括捆绑、挤压、粘合、畴形，容器之间的相互关系可以是平面结构组合、空间立体组合等方式。

此外，本发明的加样装置中，所述多元容器还可以由整体材料中相互隔离的空洞作为贮存容器构成。所述的整体材料为如上所述的各个反应物和/或反应缓冲液可接受的稳定的惰性材料。所述空洞的形状可以是规则的或不规则的，只要各个空洞的体积可容纳特定反应中所需的量的各个反应物和/或反应缓冲液，并且该空洞的形状在加样过程中不会影响各个反应物和/或反应缓冲液完全加入反应容器中。构成本发明加样装置中多元容器的整体材料可为连成一体的如上所述的相同种的材料或不同种的材料。

本发明的加样装置中，所述多元容器上各自还具有在装载样品后可密封且在加样时可打开的封口，并且各个容器上的封口可为一个或多个。其中本发明装置中各个容器的封口优选为一次性封口。本领域技术人员周知，封口可以是多种形式，包括本领域公知的易折安瓿形式，通过与容器开口相互配合的盖，覆盖于容器开口之上的薄膜，与容器连为一体的易拉盖，等等。所述封口也应当由如上所述的各个反应物和/或反应缓冲液可接受的稳定的惰性材料制成。并且取决于形成的封口形式，所选用的材料可以与容器为相同种材料或不同种材料。

本领域技术人员应当知晓，根据本发明，本发明所述的加样装置中包含的反应所需量的各个反应物和/或反应缓冲液，可在制备好该加样装置后以工业化生产方式加入到相应的容器中，并进行密封。在进行反应之前，打开各个容器的封口，方便地将其中的各个反应物和/或反应缓冲液加入反应容器中。其中所述的打开是指将封口的至少一部分除去，使容器中的反应物得以完全进入反应容器之中。本领域技术人员周知，取决于加样装置中多元容器的形状以及封口的方式，所述封口的打开可以经过穿刺、挤压、切割、撕裂、折断、离心等作用来实现，从而使容器中的反应物完全进入反应容器之中。

本发明另一方面提供了一种用于分子生物学或细胞生物学反应，特别是用于各种定量检测以及对微量污染高度敏感的实验室操作中的多个反应物加样的方法，其中利用本发明的加样装置将参与所述反应的多个反应物相互独立地同时或几乎同时加入进行反应的容器中。其中参与所述反应的多个反应物独立地为液体、胶体、悬浊液、乳浊液或粉末形式的反应所需的量。也可以按反应的要求依次打开各个容器的封口，分别加入反应所需的反应物。

按照不同反应的实验操作要求，本发明可采用不同的装置。在本发明的一个实施方案中，在定量PCR反应加样时，本发明所述加样装置采用了与PCR反应使用的特定微量离心管相适应的加样口，加样装置的多元容器中分别加入PCR反应所需的多种试剂及缓冲液。所述试剂及缓冲液一般包括：DNA聚合酶PCR反应缓冲液，DNTP混合物，Mg⁺⁺离子和/或其它试剂，如DMSO等及石蜡油，这些试剂分别以该反应所需的量预先装入本发明加样装置的各个容器中，置于-8℃～-80℃冷冻保存。使用时，于4℃～室温环境中放置1～30分钟，使液体融化，同时将待检标本加样于反应管中，将本装置封口打开，与加入待检标本的离心管相连，以大约1,000转/分的速度离心1～10分钟将试剂及缓冲液加入反应管，去除本加样装置，将PCR反应管封盖，进行PCR反应。一般对于20个样品而言，加样时间在18分钟以内，准确率可达100％。

在本发明另一实施方案中，采用与RNA纯化实验所用试管(通常为1.8ml微量离心管，或5ml、50ml微量离心管)相符的本发明加样装置，分别加入RNA纯化用各种试剂。其中本发明加样装置的各个容器中预先加入了RNA提取及纯化过程中所需的适当浓度的试剂和缓冲液，包括：苯酚，醋酸缓冲液，异丙醇及氯仿。将本发明的加样装置保存于-4℃。使用时，打开封口，如上述条件离心，使试剂入纯化所用反应管。众所周知，由于RNA稳定性差，实验操作时间应尽可能缩短。采用本发明加样装置及加样方法，可明显缩短加样时间。使用本发明加样装置及加样方法纯化RNA，纯化效果明显提高，用吸收光谱法检测A₂₆₀/A₂₈₀可达1.805～1.87，高于用目前美国Gibco公司出品的Trizol试剂纯化得到的RNA的纯度，其仅为A₂₆₀/A₂₈₀1.65～1.68。

结合本发明附图和下面的实施例，将以举例的方式进一步详细说明本发明的加样装置，以及利用所述加样装置进行加样的方法，由此体现本发明所述加样装置及加样方法优于现有技术的诸多方面。本发明所述的加样装置绝不仅限于此处给出的实施例。

图1.表示配合进行基于PCR扩增反应的微量离心管之形状的加样装置。其中图1a为该加样装置的A-A剖面图；图1b为该加样装置的主视图(半剖)。

图2.表示配合进行RNA分离纯化的离心管之形状的加样装置。其中图2a为该加样装置的A-A剖面图；图2b为该加样装置的主视图(半剖)。

图3.表示配合细胞培养所用的微量滴定板之形状的本发明加样装置。其中图3a为该加样装置的俯视图；图3b为该加样装置的主视图(半剖)。

实施例1一种用于进行基于PCR扩增的反应的加样装置

用于进行基于PCR扩增的反应的本发明加样装置可以如图1所示。该装置为由壁3围成的管，其顶部封闭，中间带有若干隔片1，将管分成相应数量的腔3，构成所述多元容器，管的底部由封口4封闭。该加样装置由经硅烷化的聚苯乙烯材料制成，装置的外形被制成与进行PCR反应所用的微量离心管形状相配合的曲线形式。在加样前通过将封口处带有惰性防水衬里的纸质材料撕去，将所述多元容器的各个反应物加入反应容器中。实施例2：巢式PCR定性检测微量CEA mRNA的比较

本实验使用如实施例1所述本发明加样装置及加样方法加样，以常规加样法加样为对照，进行微量CEA mRNA的定性检测。比较两种加样方法在所得实验结果准确性及操作步骤、操作时间上的差别。本实验由二名PCR反应操作经验均为3年以上的熟练实验操作人员在相同的条件下，同样的试剂及反应管中进行巢式PCR加样操作。巢式PCR结果由琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色后进行检定。结果在上述两种加样方法，阳性标本检出率均为100％(10/10)。在利用常规加样方法对阴性标本进行的检测中，两个操作者所进行的实验中均出现假阳性结果，分别为20％和10％。而采用本发明加样装置及加样方法对阴性标本进行的检测中，两个操作者所进行的检测中阴性标本符合率均达到100％。在加样所需的操作时间上，二个操作者分别对10个阳性标本与10个阴性标本进行一一间隔加样，采用常规加样方法检验时，上述两个操作者之一所用时间分别为52分钟和68分钟，另一位操作者耗时59分钟和55分钟。而用本发明所述加样装置及加样方法进行检测，第一位操作者所用加样时间仅为16分钟和21分钟，另一位操作者耗时18分钟及24分钟。

具体实验内容如下：

操作者A：具有4年的PCR反应操作经验

B：具有3年的PCR反应操作经验

检测标本：1)阳性样本：从乳腺癌患者末梢血具核细胞抽提的RNA制备的cDNA；2)阴性样本：双蒸水

检测方法：巢式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色后检测

操作一：采用常规操作法进行巢式PCR反应

步骤1.将10个阳性样本与10个阴性样本间隔排放、编号；

步骤2.依次向进行PCR反应的微量离心管中加入样品1μl；

步骤3.开始计时。向1.8ml微量离心管中加入PCR反应液，其中所述反应液包括：10×PCR缓冲液(50mM MgCl₂，10mM各种dNTP)，引物A和引物B，DNA聚合酶和H₂O；

步骤4.分别向各反应管中加入如上配制的反应液25μl；

步骤5.分别向各反应管中加一滴石蜡油覆盖，计时完毕；

步骤6.PCR反应循环：95℃5分钟，96℃1分钟，63℃1分钟，72℃1分钟，共30次。之后再72℃5分钟4℃；

步骤7.再次PCR，以引物C代替引物B，操作同上1～6；

步骤8.将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色，观察结果。

操作二：采用本发明装置及加样方法进行巢式PCR反应

步骤1和2同常规操作法；

步骤3.计时开始。打开含有引物A和B的本发明所述加样装置，与反应管相连接，5,000转/分离心1分钟，使加样装置中各反应容器内的反应物进入反应管，取下装置，盖上反应管；

步骤4.轻轻振荡反应管，使液体混匀，再次于5000转/分离心1分钟，计时完毕；

步骤5.同常规操作法之步骤6

步骤6.重复前面的操作，其中使用含有引物C代替引物B的本发明加样装置；

步骤7.同常规操作法之步骤8。

所得检测结果和实验操作时间分别示于表1和表2中。

表1.检测结果

操作者	标本种类	标本数量(个)	阳性检测结果*		阴性检测结果*		样本与检测结果符合率(％)		假阳性率(％)
											A	阳性	10	10	10	0	0	100	100	0	0
阴性	10	2	0	8	10	80	100	20	0
										B		阳性	10	10	10	0	0	100	100	0	0
阴性	10	1	0	9	10	90	100	10	0

^*注：左侧栏为常规方法检测结果

 右侧为本发明方法检测结果表2.操作时间(单位：分钟)

操作者	一次PCR		二次PCR
					常规加样法	本发明加样法	常规加样法	本发明加样法
	A	52	16	68					21
B					59	18	55	24

实施例3一种用于提取并纯化RNA样品的本发明加样装置

用于进行RNA样品提取及纯化的本发明加样装置可以如图2所示。该装置为由壁7围成的管，其顶部封闭，中间带有若干隔片5，将管分成相应数量的腔6，构成所述多元容器，管的底部由封口8封闭。该加样装置由经DEPC处理的硅烷化聚苯乙烯材料制成，其中装置的外形可以与RNA提取和纯化所用的50ml离心管的管口形状相配合。在加样前去掉盖在封口8处的聚苯乙烯盖，将该加样装置与所用离心管对接，通过离心将各多元容器中的反应物加入已经预先含有目标样本的反应管中。实施例4比较ACGP方法、Trizol方法与采用本发明加样方法在RNA提取及纯化中的应用

本实验比较了目前较普遍采用的RNA提取及纯化方法：Trizol试剂方法和ACGP方法与采用如实施例3所述的本发明的加样装置及加样操作进行RNA提取及纯化的效率和操作时间。三种提取和纯化RNA的方法的比较结果见表3。

从细胞中提取RNA是目前分子生物学研究与临床检测中常用的方法。首先裂解细胞，然后进行RNA纯化。由于细胞裂解后大量的RNase释放出来，RNA很容易被降解。因此，尽快将蛋白质与RNA分离是保证纯化成功的关键。而所得纯化的RNA处于高纯度状态，是保证RNA稳定贮存的关键。目前文献报导中大量应用ACGP方法进行RNA纯化，此方法可以得到最终高纯度的RNA。但是，由于ACGP方法中应用的各种试剂不能相互混合，逐一加样耗时过长，操作也繁杂，使每次不能同时纯化大量的标本。为了简化操作手续，GIBCO公司目前开发了Trizol试剂，使多种试剂混合保存，一次加样，简化了操作手续，提高了操作效率，使RNA与蛋白质能够尽快分离。但是，经Trizol试剂纯化的RNA，最终的纯度大大低于ACGP方法纯化的结果，OD₂₆₀/OD₂₈₀只能达到1.6～1.7。

采用本发明的加样装置及加样方法进行RNA样本的提取和纯化，可以使操作简化，RNA与蛋白质尽快分离，利于保持各试剂的稳定性和发挥最佳效率。

具体操作步骤如下：

1.裂解细胞：用6孔培养板培养至HT-29细胞成单层生长，后用磷酸盐缓冲液洗细胞一次，加入细胞裂解液(4.0mol/l硫氰酸胍，0.1mol/Tris-HCl，1％β-巯基乙醇)，用刮棒将粘稠裂解物刮到边缘，移入10个1.8ml的离心管中；

2.分别采用A、B、C方法加样并计时；

方法A：提取RNA并纯化的常规ACGP方法：向细胞裂解液中逐一加入下列试剂，并混匀：3mM醋酸缓冲液、苯酚、氯仿/异丙醇混合液(49∶1)；

方法B：Trizol试剂：各反应管中加入1.5ml Trizol试剂；

方法C：取装有ACGP试剂的本发明加样装置与离心管结合，5000转/分离心1分钟，使各试剂加入反应管，卸下本装置。

3. 13,000转/分离心30分钟，分离上清液；

4.向上清液中加入异丙醇0.6ml混匀，13,000转/分离心30分钟；

5.保留沉淀，向沉淀中加入75％乙醇，13,000转/分离心10分钟；

6.保留沉淀，离心后真空干燥1分钟；

7.每管中加入DEPC水20μl，溶解RNA；表3  提取及纯化RNA样本的比较结果：

提取及纯化方法	标本数量	RNA分离操作时间(分钟)	纯化结果
					RNA量(μg)	纯度指标OD260/OD280
			本发明的方法	10			10	5.25±2.4	1.85±0.03
ACGP法	10	24			5.8±2.7	1.83±0.01
			Trizol法	10			8	5.0±3.3	1.68±0.05

由上述实验结果可知，采用本发明的加样装置及加样方法提取并纯化RNA，在操作时间上优于常规ACGP方法，在RNA纯化质量上优于Trizol方法。实施例5用于向细胞培养板加样的装置

用于向细胞培养板加样的本发明装置如图3所示。该装置为由壁9围成的管，其顶部封闭，中间带有若干隔片10，将管分成相应数量的腔11，构成所述多元容器，管的底部由封口12封闭。为了便于多次重复使用及灭菌，其由不锈钢材料制成，其在封口处带有螺口，便于重复打开和封闭封口12。多元容器的封口形状及尺寸应与所用6孔、24孔或96孔板的形状尺寸相配合。在加样前旋开所述装置的封口12，将该加样装置与所用细胞培养板对接，利用重力作用或通过短暂离心将各多元容器中的反应物加入进行反应的细胞培养板中。实施例6使用本发明的加样装置研究TNF-α、IL-6抑制Colo 201肿瘤生长的作用

众所周知，缩短操作时间，减少细胞培养物与外界暴露的时间，是防止污染的重要措施。本实验比较了使用如实施例5所述的本发明的加样装置与常规操作方法在进行细胞培养实验时细胞与外界的暴露时间。研究二种不同的细胞因子TNF-α和IL-6对Colo 201肿瘤细胞生长的作用。

由于实验操作较为复杂，使用本发明的加样装置及加样方法较常规操作所需实验操作时间明显缩短。以MTT方法检测的实验结果表明(参见表4)，二者在实验结果的准确性及可靠性方面基本相同。

具体实验操作步骤如下：

1.将Colo 201细胞(购于ATCC)配制成10⁶/ml，以100μl/孔的量接种于96孔细胞培养板，37℃5％CO₂气氛中培养过夜；

(一)按常规方法的加样操作：

2.将细胞因子TNF-α和IL-6以RPMI-1640培养液分别配制成：1000ng/ml、200ng/ml、40ng/ml、8ng/ml、1.6ng/ml、0ng/ml的浓度；

3.细胞培养板1000转/分离心5分钟后，吸去培养物上清液，开始计时。按下述表4所示的方案加入配制的各种含细胞因子的培养液后，计时结束。37℃，5％CO₂气氛下培养48小时。表4 96孔板中各孔中所加细胞因子及相应加样量

孔板编号		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
														样本浓度(ng/ml)			1000	200	40	8	1.6	0					样本浓度(ng/ml)
IL-6	A		*	*	*	*	*	*		-	-	-	0
														B		*	*	*	*	*	*		-	-	-	1.6
	C		*	*	*	*	*	*		-	-	-	8
														TNF-α	E		+	+	+	+	+	+		-	-	-	40
F		+	+	+	+	+	+		-	-	-	200
													G			+	+	+	+	+	+		-	-	-	1000
样本										IL-6+TNF-α

其中：^*表示加入IL-6的孔；+表示加入TNF-α的孔；-表示加入IL-6+TNF-α的孔。

(二)采用本发明装置的加样操作

2.取预先每个容器加入40微升RPMI-1640的如实施例5所述的可重复使用的加样装置，打开包装，按常规加样方案每孔加入10μl各含有IL-6、TNF-α100ng、20ng、4ng、0.8ng、0.16ng和0ng和分别含有上述二种液体的混合液。

3.取出细胞培养板，1000转/分离心5分钟，吸除上清液。计时开始：将本加样装置置于96孔细胞培养板上，旋开装置封口，1,000转/分离心1分钟，使反应液加入细胞培养板的孔中。取下本装置，盖上培养板盖，计时完毕。将细胞培养板于37℃、5％CO₂气氛下培养48小时。

4.取出细胞培养板，1,000转/分离心5分钟，吸除培养上清液，并用PBS洗涤一次。

比较用常规加样法与本装置加样法进行MTT方法测定细胞生长的影响。实际操作结果表明，两种加样方法的实验结果无统计学显著差异。而二种加样方法中细胞暴露时间明显不同，利用本发明的加样装置与常规加样法相比加样时间明显缩短，结果如下表5所示。表5 本发明加样方法与常规加样方法在不同实验中引起的细胞暴露时间

加样方法	细胞因子加样操作中的细胞暴露时间	MTT法加样操作中的细胞暴露时间
			常规加样法	18分钟	12分钟
本发明加样法	4分钟	4分钟

实施例7 本发明加样装置及加样方法用于荧光定量PCR方法检测GAPDH

在进行PCR定量检测时，由于检测中需应用的试剂之间发生化学反应，因此，不能将这些试剂混合后保存。目前应用方法是在每一次检测前配制反应试剂的混合液并及时使用。但是，由于混合液配制者不同及某些难以预测的因素，造成既使由同一操作者操作，不同试剂配制批次之间误差很大。如果能够降低批间误差，就可以增加批次之间、实验室之间检测结果的可比性，提高可信性。

使用如实施例1所述的本发明装置，可以将各种试剂分别贮存于由其中的腔围成的各个多元容器，并采用一次性大批量配制反应用试剂按反应要求量贮存于本装置中。每次应用时，取装有所需反应试剂的如实施例所述的本发明装置直接加样。这样，不但使操作更简便，而且由于避免了每批次试剂重新制备所造成的误差，使检测的精确度提高。由于采用大批量的试剂制备，还可对每批制备的试剂进行质量控制检测。使检测结果更加可信，更具有科学性。

所用标本为GAPDH标准品，分别含GAPH cDNA浓度为10拷贝/μl、100拷贝/μl及1,000拷贝/μl。具体实验操作如下：

(一)常规加样法的步骤：

1.配制反应液：其中在总量为50μl/管的反应液体积中含有：10×PCR反应液5μl，50mM MgCl₂10μl，dNTP(10mM)5μl，引物5μl，荧光标记的探针0.5μl，Tag酶(10U)5μl，ddH₂O 19.5μl；

2.将制备的cDNA标本重复三次加样，每管1μl；

3. 50μl/管中加入反应试剂；

4.加1滴石蜡油；

5.用PCR自动荧光定量分析仪进行检测及定量

(二)采用本发明装置的加样法的步骤

1.将常规加样方法中所用各种试剂及石蜡油分别按反应量加入本发明装置的各个独立容器中，-20℃保存备用；

2.按常规加样方法步骤2所述加入待测标本；

3.取出步骤1中所得本发明装置，室温放置1分钟后，打开包装，与装有待测标本的反应管连接，4℃下2,000rpm离心1分钟，取下加样装置，盖上反应管；

4.同常规方法操作中的步骤5。

将如上所述两种操作的检测结果之批内误差比较示于如下表6；将如上所述两种操作的检测结果之批间误差比较示于如下表7。表6.批内误差检测结果的比较

	标本1		标本2		标本3		标本4
									常规法	本发明	常规法	本发明	常规法	本发明	常规法	本发明
	检测值×103	11	12	5.7	5.4	2.4	2.5	1.3									1.4
9.4									10	5.3	4.8	2.6	2.4	1.7	1.6
		12	10	4.8	4.5	2.8	2.4	1.4								1.2
平均值									10.8	10.6	5.27	4.9	2.6	2.5	1.47		1.4
	标准差	1.31	1.15	0.45	0.46	0.2	0.17	0.21								0.2
CV％									12.2	10.8	8.5	9.35	7.7	6.9	14.15		14.28

表7.批间误差检测结果的比较

	标本1		标本2		标本3		标本4
										常规法	本发明	常规法	本发明	常规法	本发明	常规法	本发明
第一次检测平均值×103	10.8	10.6	5.27	4.9	2.6	2.5	1.47	1.4
									第二次检测平均值×103	12.5	11.5	6.0	4.85	2.8	2.75	1.6	1.3
第三次检测平均值×103	9.5	1.2	4.7	5.55	2.25	2.45	1.2	1.2
									平均检测值	10.9	11.17	5.32	5.1	2.55	2.56	1.47	1.3
标准差	1.50	1.04	0.65	0.39	0.28	0.16	0.2	0.1
									CV％	13.7	9.32	12.2	7.66	10.9	6.25	14.1	7.7

由上述结果可知，1)用常规方法加样所得检测结果与采用本发明装置的加样方法比较，二者在检测的批内误差方面相近，但本发明的批间误差明显低于常规方法的检测结果；2)用本发明的装置加样明显使操作更简便迅速。

Claims (25)

1.一种用于分子生物学及细胞生物学实验中的多个反应物的加样装置，其中包括独立地含有多个反应物和/或反应缓冲液的多元容器。

2.权利要求1的加样装置，其中所述实验为细胞培养。

3.权利要求1的加样装置，其中所述实验为定量PCR反应。

4.权利要求1的加样装置，其中所述多个反应物为反应所需的量，且各自独立地为液体、胶体、悬浊液、乳浊液或粉末形式。

5.权利要求1的加样装置，其中所述容器由高分子材料、金属、玻璃、或衬有防水性复合层的纸质材料制成。

6.权利要求1的加样装置，其中所述的多元容器相互联结。

7.权利要求6的加样装置，其中所述的多元容器通过物理或化学方法相互联结。

8.权利要求7的加样装置，其中所述的物理或化学方法包括捆绑、挤压、粘合等方式相互联结或铸型。

9.权利要求1的加样装置，其中所述多元容器由整体材料中相互隔离的空洞构成，各容器之间的空间位置可以是平面结构组合，或为立体空间组合。

10.权利要求9的加样装置，其中所述整体材料为高分子材料、金属、玻璃、衬有防水性复合层的纸质材料。

11.权利要求9的加样装置，其中所述整体材料为连成一体的相同种类的材料或不同种类的材料。

12.权利要求1的加样装置，其中所述多元容器相互独立。

13.权利要求1的加样装置，其中所述多元容器上各自有在装载样品后可密封且在加样时可打开的封口。

14.权利要求13的加样装置，其中所述的封口为一次性封口或多次使用的封口。

15.权利要求13的加样装置，其中所述的封口可为一个或多个。

16.权利要求13的加样装置，其中所述封口独立地由高分子材料、金属、玻璃、衬有防水性复合层的纸质材料制成。

17.权利要求13的加样装置，其中所述的打开是指将封口的至少一部分除去，使容器中的反应物得以流出。

18.权利要求13的加样装置，其中所述封口可以经过旋转、穿刺、挤压、折断、撕裂或离心作用而被打开，使容器中的反应物得以完全排出。

19.权利要求1的加样装置，其中所述的多元容器的整体形状与进行反应所用的容器相适应。

20.一种用于分子生物学或细胞生物学实验中的多个反应物加样的方法，其特征在于利用权利要求1-19中任一项的加样装置。

21.权利要求20的加样方法，其中多个反应物独立地为液体、胶体、悬浊液、乳浊液或粉末形式的反应所需的量。

22.权利要求20的加样方法，其中打开所有容器的封口，将参与反应的多个反应物相互独立地同时或几乎同时全部加入进行反应的容器中。

23.权利要求20的加样方法，其中按反应的要求依次打开各个容器的封口，在时间上分别加入反应所需的反应物。

24.权利要求20的加样方法，其中所述实验为细胞培养。

25.权利要求20的加样方法，其中所述实验为定量PCR反应。

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