JP2018515133A - ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに方法 - Google Patents

ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに方法 Download PDF

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Abstract

試料から細胞を培養する為のマイクロウェル高密度アレイを画定する微細加工デバイスについて述べる。一種以上の細胞を識別し且つ各細胞種が培養された個々のマイクロウェルの位置を特定するために一連の特異タグをマイクロウェルに配置できる。特異タグは核酸分子であって、標的核酸断片にアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列および１つ以上のマイクロウェルを識別する為に予め設定した位置特異性ヌクレオチド配列を含み得る。本デバイスは保温して多数の細胞を増殖でき、分析部分と予備部分に分割され得る。試料から細胞の培養、選別並びに相対および／または絶対存在度決定のためのハイスループット方法について述べる。

Description

本出願は、2016年2月24日に提出した「Biobanking Cells Using High Density Microfabricated Arrays」というタイトルの第62/299,088号米国仮特許出願と、2016年2月5日に提出した「Systems, Apparatus, and Methods for Isolation, Cultivation, Screening, and Identification of Cells」というタイトルの第62/292,091号米国仮特許出願と、2015年4月21日に提出した「Systems, Apparatus, and Methods for Isolation, Cultivation, Screening, and Identification of Cells」というタイトルの第62/150,677号米国仮特許出願の優先権を主張し、これら出願の各々の全文を参照文献としてここに組み込む。
本発明は一般的には、微生物学、微細加工、化学、光学、ロボット工学および情報技術における革新に関する。もっと具体的に言えば、本発明は生物学的実体および/または栄養素の高処理量の培養、選別、単離、試料採取および/または識別用システム、装置、キットおよび方法に関する。
自然環境およびその他の試料から生物学的実体を培養するための従来技術や手段は多くの場合、遅速で多くの労力と時間を要し且つ高価である。これら従来技術および手段を持ってしてさえ、しばしば細胞や他の生物学的実体は尚、培養しようとするあらゆる試みを拒み、情報および/または生成物を得る機会を逸することになる。同様に、特有の代謝産物、酵素、タンパク質、核酸、表現型、突然変異、代謝経路、遺伝子、適応性、性能および/または治療恩恵について一群の生物学的実体を選別することは難易度が高く、複雑で効果的な方法を必要とする。例えば、微生物は非常に危険度の高い環境に生息している。生き残るために微生物は、新規な酵素、特有代謝産物、革新的遺伝子経路、並びに環境および隣接微生物への操作戦略を含む驚くべき幾組かの生化学的手段、即ち新しい識見並びに生命救助抗生物質から食料の生産および安全性を改善する肥料にまでおよぶ生成物に導き得た強力な解決策、を創り出してきた。
本発明は、複数の実施形態に従って培養作業の流れを能率化し、高スループット選別を助け、および/または新しい病識並びに生成物を創り出す微生物学システム、装置、キットおよび方法を提供する。例えば、装置は1つ以上の細胞を含む試料を収容する微細加工デバイスを含み得る。微細加工デバイスは、１つ以上の細胞培養用マイクロウェルの高密度アレイを画定する。
複数の実施形態において、細胞培養用マイクロウェルの高密度アレイを備えたデバイスを設けることができる。更なる実施形態において、一組の特異タグを各マイクロウェルまたは複数のマイクロウェル内への配置用に供給してよい。或いは、各マイクロウェルまたはマクロウェルの複数の中に既に播種された特異タグをデバイスに設けてもよい。デバイスおよび/または特異タグを単体で或いはキットの一部として設けることができる。例えば、キットに一種以上の細胞を含む試料を収容する微細加工されたデバイスを組み込むことができ、その微細加工されたデバイスは細胞培養用マイクロウェルの高密度アレイを画定する。キットはまた、一種の細胞が培養される特定マイクロウェルを識別するようにマイクロウェルに配置するための一組の特異タグを含み得る。1つ以上の特異タグを、マイクロウェルの高密度アレイの各マイクロウェルに配置し得る。キットは更に、マイクロウェルへ特異タグを播種する指示および/または培養細胞をそれらが培養された特定マイクロウェルにまでたどって調べるための特異タグ使用の指示を組み込み得る。
複数の実施形態において、特異タグは、細胞或いはマイクロウェルに存在し得る特定種の細胞（例えば微生物）の標的核酸断片にアニーリングするための標的特異性ヌクレオチド配列およびマイクロウェル自体を識別するための位置特異性ヌクレオチド配列を備えた核酸分子を含み得る。複数の特異タグはある１つの特有マイクロウェルに、複数の位置特異性ヌクレオチド配列がその特定マイクロウェルに存在する様に、配置され得る。即ち、位置特異性ヌクレオチド配列は、（例えば、マイクロウェル高密度アレイ内のマイクロウェル寸法を識別するよう予め方向づけられていて）複数のマイクロウェルに見出すことができて、且つ特異タグは多次元であり得る。例えば、一組の特異タグは、マイクロウェルの高密度アレイ内マイクロウェル第１の次元（例えば、横列）を識別するように予め方向づけられた第１の位置特異性ヌクレオチド配列を備えたタグおよびマイクロウェルの高密度アレイ内マイクロウェル第２の次元（例えば、縦列）を識別するように予め方向づけられた第２の位置特異性ヌクレオチド配列を備えたタグを含む二次元とすることができる。第１の位置特異性ヌクレオチド配列と第２の位置特異性ヌクレオチド配列が合わさって、マイクロウェル高密度アレイ内の特定マイクロウェルを識別する。こうして、特定マイクロウェル内の特異タグの組み合わせが、そのマイクロウェルを識別するように機能する。
複数の実施形態において、細胞培養用マイクロウェルの高密度アレイを組み込むデバイスの各々のあるいは複数のマイクロウェル内に一種以上の栄養素を細胞の増殖および/または選別のために供給できる。一種以上の栄養素を全ての或いは複数のマイクロウェル内の配置用に（例えば、直接に、膜を介して、および/または透過性または半透過性膜上へ）供給できる。あるいはまた、デバイスに各々または複数のマイクロウェル内に予め配置された一種以上の栄養素を供給してもよい。栄養素は単独で、培地の一部として、および/またはキットの一部として供給できる。キットは、デバイスの特定マイクロウェル内で培養されている細胞に一種以上の栄養素を供給する指示を組み込み得る。例えば、キットはさらに、少なくとも１種の少なくとも１個の細胞を培養するための少なくとも１栄養素を含み得る。その少なくとも１種の少なくとも１個の細胞を培養するための少なくとも１栄養素は、少なくとも１種の少なくとも１個の細胞の自然環境からの抽出物の１成分、少なくとも１種の少なくとも１個の細胞の自然環境から派生した培地、少なくとも１種の少なくとも１個の細胞の自然環境に類似するように配合された培地、少なくとも１種の少なくとも１個の細胞のみを培養する選抜培地、および/または少なくとも１種の少なくとも１個の細胞を区別するための差別培地を含んでいても或いはそのものであってもよい。少なくとも１種の少なくとも１個の細胞の自然環境は、生物組織、生物生成物、微生物懸濁液、空気、土壌、堆積物、生命のある有機物、馬草、石油、汚水、および/または水であり得る。
複数の実施形態において、細胞培養用にマイクロウェル高密度アレイを組み込んでいるデバイスの各々のまたは複数のマイクロウェル内部に細胞を保持するため（例えば、相互汚染を防ぐため）、膜を設けることができる。膜は、複数のまたは全てのマイクロウェルを封止するように貼られてよい。あるいはまた、複数のまたは全てのマイクロウェル上を既に封止した膜をデバイスに設けてもよい。膜は、例えば、不透過性または気体だけに透過性であってよく、或いは１種以上の栄養素の１つ以上のマイクロウェルへの拡散を考慮してもよい。デバイスおよび/または膜は、単独で或いはキットの一部として設けることが出来る。例えば、キットは少なくとも一個の細胞を含む試料を収容する微細加工によって作られたデバイスを組み込み得る。キットは又、微細加工によって作られたデバイスに試料を装填した後で、マイクロウェルの高密度アレイの中の少なくとも１つのマイクロウェルに少なくとも１つの細胞を保持する為に膜を組み込み得る。キットは更に、マイクロウェルに試料を装填する指示および/または細胞を培養する特定マイクロウェル内に培養細胞を保持するために膜を使用する指示を組み込み得る。
複数の実施形態において、一連のステップが細胞培養用マイクロウェル高密度アレイを備えたデバイスを使う細胞培養のために設けられている。例えば、ある１つの方法は、試料から少なくとも１つの細胞を培養するためのマイクロウェル高密度アレイを画定する微細加工により作られたデバイスを取得するステップを含んでよく、そしてそれはマイクロウェル高密度アレイの中の少なくとも１つのマイクロウェルに少なくとも１つの特異タグを配置するステップ、デバイスに１つ以上の細胞を含む試料を装填するステップ、および/または細胞をそれらそれぞれのマイクロウェルに保持するためにデバイスの全てあるいは１部分に膜を貼りつけるステップを含んでよい。複数の実施形態においては、試料を装填前に調製する。例えば、僅か１つの細胞が、多数のマイクロウェル高密度アレイの各マイクロウェルに配置されるように、試料を希薄化してよい。ある１つの方法はまた、デバイスを培養用に温めてマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルで少なくとも１つの細胞から多数の細胞を増殖させることを含み得る。
複数の実施形態において、細胞の１部分は分析の為に部分的に変更および/または破壊される（例えば、増幅されて配列決定される）が、残りの細胞は将来の試料採取および/または分析から収集した情報に基づいた使用の為に取って置かれるようにマイクロウェル高密度アレイで培養された細胞を複製および/または分割するために、一連のステップが開示されている。例えば、ある１つの方法は、マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内の複数細胞を複数細胞第１部分と複数細胞第２部分に分割するステップを含み得る。少なくとも１つの特異タグは複数細胞第１部分と共に残り得る。マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内の複数細胞の分割は、細胞の幾つかがマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内に残り且つ細胞の幾つかが膜上に残るように、マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルから膜を取り除くステップを含み得る。或いはまた、膜を一時的に引き剥がして試料採取を可能にしても、あるいは試料採取のために突き通し（即ち穴をあけ）てもよい。
複数の実施形態において、マイクロウェル高密度アレイで培養された細胞の全てまたは幾つかを分析するために、一連のステップが開示されている。例えば、ある１つの方法は、複数細胞の第１部分を分析して少なくとも１つの対象物の種を明らかにすることを含み得る。分析された細胞は、それらが培養された同一マイクロウェル内にあっても、それらが培養されたマイクロウェルを覆った膜に付着していても、そして/あるいは別の場所（例えば、ペトリ皿または対応のマイクロウェル高密度アレイを備えた別のデバイス）に移されてもよい。分析は、少なくとも１つの対象物の種、それは核酸と遺伝子の少なくとも１つに基づいて選択され得る、の存在或いは不在を明らかにすることを含み得る。例えば、ポリメラーセ連鎖反応（PCR）を行って、少なくとも１つの特異タグの標的特異性ヌクレオチド配列に基づいて細胞内に存在する標的核酸断片のいずれをも増幅させ得る。分析はさらに、次世代配列決定法（NGS）あるいは他のどのタイプの配列決定法を使ってでも、PCRで増幅された標的核酸断片のいずれをも配列決定するステップを含み得る。配列決定は、細胞の種（例えば、微生物）および/または細胞のその種が培養された元のマイクロウェル高密度アレイ内の１つ以上の位置を特定するために使用され得る。
複数の実施形態において、細胞のある特定の種が培養されたマイクロウェル高密度アレイ内の１つ以上のマイクロウェルを識別および/または位置決定するために、一連のステップが開示されている。例えば、ある１つの方法は、少なくとも１つの対象物の種が培養されたマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルを少なくとも１つの特異タグに基づいて識別するステップを含み得る。その少なくとも１つの対象物の種が培養されたマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルの識別に基づき、ある１つの方法は複数細胞の第２部分の中でその少なくとも１つの対象物の種の位置を決定するステップを含み得る。
複数の実施形態において、複数の細胞が培養されたマイクロウェル高密度アレイ内の１つ以上のマイクロウェルを選抜又は試料を採取するために、一連のステップが開示されている。例えば、ある１つの方法は、ある１つの特定のマクロウェルまたはその特定のマイクロウェルと相間関係にある膜位置から少なくとも１つの細胞を採取するステップを含み得る。1つ以上のマイクロウェルから同時に採取するために、デバイスおよび方法を記述する。
複数の実施形態において、細胞を培養するためのマクロウェル高密度アレイを備えたデバイスを使って細胞を選別するために、複数の方法が開示されている。例えばある１つの方法は、マイクロウェル高密度アレイで培養された細胞を選別して対象物の種の存在あるいは不在を明らかにすることを含み得る。もし存在するなら、その方法は、それらの細胞が培養された１つ以上のマイクロウェルからその対象物の種の１つ以上の細胞を採取するステップを含み得る。ある１つの方法は、細胞の代謝産物、代謝経路、酵素、タンパク質、核酸、表現型、遺伝子、突然変異、適応性および/または性能に基づく分析試験を行うことを含み得る。もし特異タグが利用されたなら、ある１つの方法は１つ以上の位置特異性ヌクレオチド配列を使って対象物の種が培養された１つ以上のマイクロウェルを識別するステップを含み得る。例えば、標的核酸断片は対象物の種内に存在でき、その標的核酸断片は代謝産物、代謝経路、酵素、タンパク質、核酸、表現型、遺伝子、突然変異、適応性および/または性能に関する遺伝子コード等を含んでいる。
複数の実施形態において、複数の方法が細胞を培養するためのマイクロウェル高密度アレイを備えたデバイスを使って対象物の種の試料内の相対および/または絶対存在量を求めるために開示されている。例えば、ある１つの方法は、試料を調製して１組の特異タグが配置された複数のマイクロウェルへ装填するステップを含み得るが、その試料は少なくとも１つの細胞の中のただ１つの細胞が多数のマイクロウェル高密度アレイの各マイクロウェルに配置されるように調製される。培養に続いて、ある１つの方法はそれらのタグを使って少なくとも１つの細胞を持つマイクロウェルの第１数を、対象物の種を持つマイクロウェルの第２数をおよび、これらの数に基づいて、試料内の少なくとも１つの対象物の種の相対存在量を求めることを含み得る。ある１つの方法は更に、試料から細胞の総数および、その総数と試料内の少なくとも１つの対象物の種の相対存在量に基づき、試料内のその少なくとも１つの対象物の種の絶対存在量を求めることを含み得る。
より一般的には、実験ユニットの高密度アレイを画定する微細加工デバイスを使って生物学的実体を試料から培養するためのシステム、装置、キットおよび方法を開示する。生物学的実体は、微生物、細胞、細胞成分、細胞生成物およびウイルスであってよい。複数の実施形態において、複数の生物学的実体が、ある１つの試料内に存在し、デバイスに装填され、そして/あるいはある１つの実験ユニットに装填され得る。ある１つの実験ユニットは、その特定実験ユニットに関する空間情報を識別するために１つ以上の生物学的実体および/または１つ以上の特異タグを組み込み得る。ある１つの特異タグは、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質および/または薬物のような結合分子を含み得る。例えば、ある１つの特異タグは、対象物の生物学的実体に存在する生体分子に結合するためのタグ特異性の１成分を含み得る。ある１つの特異タグはまた、その少なくとも１つの実験ユニットに関する空間情報を識別するための位置特異性の１成分も含み得る。デバイスは、培養用に温められて実験ユニットの高密度アレイ内で複数の生物学的実体を増殖させ得る。培養された１つ以上の生物学的実体は、それら実体が少なくとも１つの特異タグに基づいて培養された少なくとも１つの実験ユニットに関する１つ以上の種および/または空間情報を識別するために分析され得る。
上記の構想および以下でより詳細に述べる構想（それらの構想が互いに矛盾しない限り）の全組み合わせが、此処に開示した集約的主題の一部として検討されることは正当に評価されるべきである。特に、この開示の最後に表示されるクレームに記載された主題の全組み合わせは、此処で開示の集約的主題の一部として検討されている。ここにおいて明確に用いられ参照として組み込まれたどの開示にも表示されている用語は、ここに開示の特定構想と最も整合性のある意味を与えられるべきであることもまた正当に評価される筈である。
他のシステム、製法および機能は、当技術分野の熟練技能者には以下の図面や詳細説明の検討によって明らかとなるであろう。その様な追加のシステム、製法および機能の全てが、本発明の明細書に包含され、本発明の範囲内にあり且つ添付の請求項によって保護されることを意味している。
熟練技術者であれば、図面が主として説明目的であってここに記述の発明主題の範囲を限定しようとするものではないことを分かっていると思う。図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、複数の例では、異なる機構の理解を容易にするために此処に開示した発明主題の様々な態様を図面において誇張あるいは拡大して示している場合がある。図面において、同じ参照記号は概ね同じ機構（例えば、機能的に類似および/または構造的に類似の構成部品）を意味する。
図1は、複数の実施形態に従う微細加工デバイスあるいはチップを図示する透視図である。
図2A〜図2Cはそれぞれ、複数の実施形態に従う微細加工デバイスあるいはチップの大きさを図示する上面図、側面図および端面図である。
図3Aおよび図3Bはそれぞれ、複数の実施形態に従う微細加工デバイスあるいはチップを図示する分解組立図および上面図である。
図4Aおよび図4Bは、複数の実施形態に従う膜の説明図である。
図5Aは、複数の実施形態に従って試料から幾つもの細胞を単離する方法を説明する作業ステップ図である。図5Bは、複数の実施形態に従って土壌試料から幾つもの細胞を単離する方法の説明図である。
図6は、複数の実施形態に従って試料から幾つもの細胞を単離し且つ培養する方法を説明する作業ステップ図である。
図7は、複数の実施形態に従って複合試料から幾つもの細胞を単離し且つ培養する方法の説明図である。
図8A〜図8Cは、複数の実施形態に従って行う１つのピンあるいは多数のピンによる採取の説明図である。
図9A〜図9Dは、複数の実施形態に従うある１つのウェルの選抜を示す画像である。
図10A〜図10Dは、複数の実施形態に従ってある1つのチップから採取するための道具の説明図である。
図11は、寒天の薄層を突き抜かれた１つのウェルの画像であって、複数の実施形態に従って膜または封止層を突きぬくことを図で示している。
図12は、複数の実施形態に従うチップ1200の断面を表す図である。
図13は、複数の実施形態に従う選別方法を説明する作業ステップ図である。
図14は、複数の実施形態に従う選別方法を図解する一覧図である。
図15は、複数の実施形態に従う１つの選別例を図示する一連の画像である。
図16A〜図16Cは、複数の実施形態に従う１つの遮蔽物からの回収を説明する画像である。
図17Aは、複数の実施形態に従う選別用チップを説明する分解組立図である。図17Bは、複数の実施形態に従う選別に続くチップの蛍光画像である。図17Cは、複数の実施形態に従って選別に続いてチップから試料を採取する１ステップを示す画像である。
図18は、複数の実施形態に従う計数方法を説明する作業ステップ図である。
図19は、複数の実施形態に従う計数方法を図解する一覧図である。
図20は、複数の実施形態に従う索引付け方法を図解する一覧図である。
図21A〜図21Eは、複数の実施形態に従うウェル特異性化学作用物質を有するチップを表す一覧図である。
詳細な説明
本発明は、生物学的実体および/または栄養素の単離、培養、適応、試料採取および/または選別のためのシステム、キット、装置および方法に概ね関する。少なくとも1つの生物学的実体を含む試料を収容するための微細加工デバイス（または“チップ”）を開示する。“生物学的実体”という用語は、微生物、細胞、細胞成分、細胞生成物、ウイルスおよびその他を含んでよく、そして“種”という用語は、分類の単位を記述するために使われ、操作上の分類単位（OTU）、遺伝子型、系統型、表現型、生態型、来歴、挙動または相互作用、生成物、変種、進化上有意種およびその他を含み得る。
細胞は、古細菌、細菌あるいは真核生物（例えば真菌類）であり得る。例えば、細胞は好気性、嫌気性あるいは条件的好気性微生物のような微生物であり得る。ウイルスはバクテリオファージであり得る。他の細胞成分/生成物は、タンパク質、アミノ酸、酵素、糖類、アデノシン三燐酸（ATP）、脂質、核酸（例えばDNAおよびRNA）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、細胞膜/壁、鞭毛、線毛、小器官、代謝産物、ビタミン、ホルモン、神経伝達物質、抗体およびその他を含み得る。
栄養素は、規定（例えば、化学的規定あるいは合成の培地）あるいは未規定（例えば、基礎あるいは複合の培地）であってもよい。栄養素は、実験室配合および/または市販用に生産された培地（例えば、二種以上の化学薬品の混合物）を含んでもあるいはその１成分であってもよい。栄養素は、例えばマリンブロス、溶原性ブロス（例えば、ルリアブロス）等のような、液体栄養培地（即ち、栄養スープ）であっても或いはその１成分であってもよい。栄養素は、寒天と混合されて固体培地を形成する液体培地および/または血液寒天培地のような市販製造の寒天板であっても或いはその１成分であってもよい。
栄養素は、選択培地を含んでもあるいはそれらの１成分であってもよい。例えば、選択培地は、或る特定の生物学的実体だけあるいは特定の性質（例えば、抗生物質耐性あるいは特定代謝物合成）を有する生物学的実体だけの増殖用に使うことができる。栄養素は、特異性指示薬（例えば、ニュートラルレッド、フェノールレッド、エオシンYあるいはメチレンブルー）の存在下で生物学的特性を利用して1つのタイプの生物学的実体をいま１つのタイプの生物学的実体あるいは他の複数の生物学的実体から区別する識別培地を含んでもあるいはその１成分であってもよい。
栄養素は、自然環境の抽出物あるいは自然環境から由来した培地を含んでもあるいはその１成分であっても良い。例えば、栄養素は特定タイプの生物学的実体にとって自然な環境、別の環境あるいは複数の環境から導きだされ得る。その環境は、1種以上の生物組織（例えば、結合組織、筋肉、神経、上皮、植物表皮、維管束、土壌等）、生物液あるいは他の生物産物（例えば、羊水、胆汁、血液、脳脊髄液、耳垢、浸出物、糞便、胃液、間質液、細胞内液、リンパ液、乳汁、鼻汁、ルーメン内容物、唾液、皮脂、精液、汗、尿、膣分泌物、吐瀉物等）、微生物懸濁液、空気（例えばいろいろな気体含有物を伴っている）、超臨界二酸化炭素、土壌（例えば、ミネラル、有機物、気体、液体、微生物等を伴っている）、堆積物（例えば、農業、海洋堆積物等）、生きている有機物（例えば、植物、昆虫、その他の小生物および微生物）、死んだ有機物、馬草（例えば、牧草、豆科植物、貯蔵牧草、作物残留物等）、ミネラル、油あるいは油製品（例えば、動物、植物、石油化学に由来するもの）、水（例えば、天然の真水、飲料水、海水等）および/または汚水（例えば、衛生、商業、工業および/または農業廃水、および表面流出物）、更にその他を含み得る。
微細加工デバイスは、少なくとも１つの生物学的実体の培養用マイクロウェルの高密度アレイを画定し得る。“高密度”という語は、システムまたは方法が一定領域内に多くの実験を割り振る能力を意味し得る。例えば、“高密度”の実験ユニットを備える微細加工デバイスは、ここで更に述べるように、ｃｍ２当たり約150マイクロウェルからｃｍ２当たり約160,000以上のアイクロウェルを組み込み得る。追加の例を表１に示す。
Figure 2018515133
微細加工デバイスは、一連の機能層を備えた基材を組み込み得る。その一連の機能層は、実験ユニットの第１アレイ（例えばウェル）を画定する第１機能層、および先行する機能層の各実験ユニット内で実験ユニットの次のアレイ（例えば、マイクロウェル）を画定する少なくとも１つの次の機能層を含み得る。実験ユニットの各々は、生物学的実体および/または栄養素を収容且つ培養し、および/または選別するように構成され得る。特に、ここに述べるシステム、キット、装置および方法は、細胞の高密度マトリックスに対する種々の条件の自動および/またはハイスループット選別用に使用され得る。例えば、ここに述べる、システム、キット、装置および方法は、1つ以上の異なる栄養素の微生物増殖への影響を調べて比較するおよび/または代謝物、酵素活性、突然変異あるいは他の細胞機能について検査するために使われ得る。
図１は、複数の実施形態に従う微細加工デバイスあるいはチップを説明する透視図である。チップ100は、上部表面102に射出成形機構を備えた顕微鏡スライドグラス形式に形づくられた基材を組み込んでいる。それら機構は、突き出しタグ10６に加えて４つの分離したマイクロウェルアレイ（あるいはマイクロアレイ）等である。各マイクロアレイ内のマイクロウェルは、チップ100の縁回りおよびマイクロアレイ104間のウェルの無い縁辺を備えた格子模様に配置されている。
図２Ａ〜図２Ｃはそれぞれ、複数の実施形態に従うチップ100の大きさを示す上面、側面および端面図である。図２Ａにおいて、チップ100の上面はおおよそ25.5ｍｍ×75.5ｍｍである。図２Ｂにおいて、チップ100の端面はおおよそ25.5ｍｍ×0.8ｍｍである。図２Ｃにおいて、チップ100の側面はおおよそ75.5ｍｍ×0.8ｍｍである。
試料を微細加工デバイスに装填した後、デバイスの少なくとも１部分に膜を施し得る。図３Ａは、複数の実施形態に従う微細加工デバイス300を図３Ｂの上面から見て表示した分解組立図である。デバイス300は、例えば土壌微生物を収容するウェルアレイ302を備えたチップを組み込んでいる。膜304が、ウェルアレイ302の上面に置かれる。ガスケット306が膜304の上面に置かれる。充填孔310を備えたポリカーボネートカバー308が、ガスケット306の上面に置かれる。最後に、封止テープ312がカバー308に貼られる。
1つ以上の実験ユニット、ウェルまたはマイクロウェルを組み込む微細加工デバイスの少なくとも１部分を膜で覆うことができる。例えば、微細加工デバイスに試料を装填した後、少なくとも１枚の膜をマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに貼り付け得る。複数枚の膜を微細加工デバイスの複数の部分に貼り付け得る。例えば、別々の膜をマイクロウェル高密度アレイの複数の異なる小区画に貼り付け得る。
膜は、マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに少なくとも１つの生物学的実体を保持するために、微細加工デバイスに結びつけられ、取り付けられ、部分的に取り付けられ、貼られ、封止されおよび/または部分的に封止され得る。例えば、膜は、微細加工デバイスへラミネート加工により可逆的に貼られてもよい。マイクロウェル高密度アレイの少なくとも1つのマイクロウェルへ少なくとも１つの生物学的実体を入れるために、膜は打ち抜かれ、引き剥がされ、脱着され、部分的に脱着され、除去されおよびまたは部分的に除去され得る。
少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内の細胞個体群の１部分は（例えば吸着等の経由で）膜に付着し得る。付着する場合、少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内の細胞個体群は、少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内の細胞固体群の１部分が膜に付着したままでその膜を引き剥がすことによって試料採取され得る。
図４Ａおよび図４Ｂは、複数の実施形態に従う膜の説明図である。図４Ａは、内容物で満たされたウェルアレイを画定するチップ400およびそのウェルアレイを覆ってチップ400を封止する膜402の側面図を示しており、従ってチップ400と接触した膜402の表面は、チップ400から剥がされた時に、図４Ｂに示されるように、そこに付着した（例えば、貼り付いた）ウェル内容物試料の付いたウェルの各々の刻印を有している。図４Ｃは、複数の実施形態に従うウェルアレイとの接触によって形成された刻印付き膜表面の画像である。
膜は、不透過性、半透過性、選択的透過性、差分透過性、および/またはマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルへ少なくとも１つの栄養素が拡散するのを可能にする部分的透過性であり得る。例えば、膜は天然物質および/または合成物質で構成されてよい。膜は、ヒドロゲル層および/または濾紙を組み込み得る。複数の実施形態では、マイクロウェル内の細胞の少なくとも幾つかあるいは全てを保持できる程に十分小さいサイズの孔を有する膜が選択される。哺乳動物細胞に関しては、孔のサイズは数ミクロンであってよく、それでも細胞を保持できる。しかしながら、複数の実施形態においては、孔のサイズは、例えば0.1μｍのような、約0.2μｍ以下の場合がある。膜直径と孔のサイズは材料次第である。例えば、親水性ポリカーボネート膜を利用でき、そのための直径は約10ｍｍから約3000ｍｍの範囲に、そして孔のサイズは約0.01μｍから約30.0μｍの範囲にあってよい。不透過性の膜は、ゼロにほぼ等しい孔のサイズを有する。不透過膜を使う実施形態では、その膜での封止に先立ってあらゆる栄養素がマイクロウェルに供給されなければならない。気体透過性であるが液体透過性でない膜は、マイクロウェルへの酸素およびマイクロウェルからの二酸化炭素を受け入れ得る。その膜は、限定された孔のサイズを有してよいあるいは有してはならない複雑な構造を持ち得る。しかしながら、それらの孔はナノメートル程度であり得る。膜を選ぶに際しての他の要素としては、コスト、密封性能および/または殺菌性能などが含まれ得る。
基材は、第１表面からその第１表面に向き合う第2表面へと伸ばされたマイクロウェルアレイを画定し得る。マイクロチャネルは、第１表面に第１開口を、第2表面に第２開口を有し得る。第１膜は、少なくとも１つのマイクロチャネル内の細胞個体群の少なくとも幾つかが第１表面に付着するように第1表面の少なくとも１部分に貼り付けられ得る。第2着脱可能膜は、少なくとも１つのマイクロチャネル内の細胞個体群の少なくとも幾つかが第２表面に付着するように第２表面の少なくとも１部分に貼り付けられ得る。少なくとも１つのマイクロチャネル内の細胞固体群は、少なくとも１つのマイクロチャネル内の細胞固体群の少なくとも幾つかが第１膜に付着したままで第１膜をおよび/または少なくとも１つのマイクロチャネル内の細胞固体群の少なくとも幾つかが第２膜に付着したままで第２膜を引き剥がすことによって試料採取され得る。
“ハイスループット”という語は、システムあるいは方法が有する非常に大きな数の実験を平行あるいは連続して迅速に行うことを可能にする能力を意味し得る。“ハイスループット”システムの一例は、此処で述べるように、1つ以上の生物学的実体を、少なくとも1つの代謝生成物、酵素、タンパク質、核酸、表現型、突然変異、代謝経路、遺伝子、適応型および能力について検査するために、調製、培養および/または多数の化学、遺伝、薬学、光学および/または画像分析を行う細胞生物学技法を備えた自動装置を含み得る。複数の実施形態によれば、“ハイスループット”は、少なくとも約96実験から少なくとも約10,000,000実験に及ぶ規模の実験を同時あるいはほぼ同時に行うことを意味し得る。
ここに開示のシステム、装置、キットおよび方法は、生物学的実体（例えば細胞）のマトリックスに対して種々の条件のハイスループット選別に使うことができる。“ウェル内ウェル”概念は、多重レベルの機能層を有するように基材あるいはチップを製造する（例えば、微細加工する）ことによって要求あるいは望まれる如何なるレベル（即ち、ウェル内ウェル内ウェル内ウェル等）でも実現され得る。第１機能層は、実験ユニット（例えば、ウェル）アレイを画定できる。実験ユニットの各々は、次の実験ユニット（例えば、マイクロウェル）アレイを画定するステップによってもう一つの機能層を提供する。このことによって、多重実験あるいは試験を単一チップで同時に行えることから、ハイスループット操作が可能となる。
例えば、図３Ａおよび図３Ｂにおいて、ガスケット306が膜304の上面に置かれ、その膜は複数の実施形態に従う微細加工デバイス300のウェルアレイ302に施されている。ガスケット306は1つの開口のみを有する。しかしながら、更なる実施形態では、１つのより小さな開口を有する多重のより小型なガスケットあるいは複数のより小さな開口を有する単一ガスケットをデバイスの上面（膜を備えていてもいなくても）に置き、それによって機能層、あるいは次の機能層を備えたより大きな実験ユニットのアレイあるいはそこに位置する次の実験ユニットアレイ（例えば、ウェル302）を形成するステップが出来る。
多重レベルの機能層があれば、例えば、複数の栄養素あるいは栄養素調合物を、同時にあるいはほぼ同時に試験できる。同じ方式が、例えば、代謝産物あるいは細胞の特異機能について検査するあるいは自然環境派生栄養素から微生物を引き離して別の栄養素にするために使用され得る。
実験ユニットは、微細加工デバイス表面の所定部位である。例えば、チップの表面を、所定部位の第１アレイに細胞を固定化するように、設計することができる。これらの所定部位は、ウェル、マイクロウェル、マイクロチャネルおよび/または指定固定化部位であり得る。例えば、表面がマイクロウェルアレイを画定するように微細加工されてよい。そのアレイは、基材に壁あるいは追加壁を画定するステップによって数区画に分けることができる。例えば、その表面がウェルの第１アレイを最初に画定するように微細加工されてよく、そこでは各ウェルの内部表面が、マイクロウェル、マイクロチャネルあるいは固定化部位の第2アレイを画定するように、順に加工される。もう１つの例においては、その表面を、マイクロウェルアレイを画定するように、加工でき、そしてもう１つの基材（例えば、寒天、プラスチックあるいはその他の物質）を、その表面およびそれによって画定されるマイクロウェルを仕切るように、その表面に塗ることができる。各ウェル、マイクロウェル、マイクロチャネルおよび/または固定化部位を、少なくとも１つの細胞を収容して増殖させるように構築し得るが、しかし使用において、どの所定ウェル、マイクロウェル、マイクロチャネルあるいは固定化部位も実際のところ1つ以上の細胞を収容および/または増殖させ得るあるいはさせ得ない。実験ユニットの型は置き換え可能であり得る。例えば、マイクロウェルを特に記述するこの文書中の実施形態は、それらのマイクロウェルがすくなくとも部分的にマイクロチャネル、固定化部位および/または他の型の実験ユニットと置き換えられる実施形態を開示することもまた意図している。
微細加工デバイスの１か所以上の部分は、選択され、処理され、および/または特別な表面化学性を有する様に表面化学性改質剤で塗布され得る。例えば、基材表面の少なくとも１部分は、細胞を寄せ付けないおよび/または細胞の表面へ貼りつく傾向を減じる第１の表面特性あるいは細胞を引き寄せおよび/または細胞の表面へ貼りつく傾向を高める第２の表面特性付きで設計され得る。標的細胞の種類によるが、物質および/または塗膜は疎水性および/または親水性であり得る。基材の上部表面の少なくとも１部分は、標的細胞を寄せ付けないおよび/または標的細胞のその表面に貼りつく傾向を減じる第１の表面特性を有する様に、処理されてよい。その一方で、各実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルの内部表面の少なくとも1部分は、標的細胞を引き寄せて標的細胞が実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを占める傾向を高める第２の特性を有する様に、処理されてよい。基材の１つの表面は異なった表面特性を備えた複数の部分を有してよい。
表面化学性改質剤は、化学蒸着法、電気穿孔法、プラズマ処理および/または電解析出法を使って施すことができる。表面化学性改質剤は、表面電位、ルンド電位、ゼータ電位、表面形態、疎水性および/または親水性を制御できる。表面化学性改質剤は、シラン、高分子電解質、金属、高分子、抗体および/または血漿などを含み得る。例えば、表面化学性改質剤はオクタデシルトリクロロシラン等であってよい。表面化学性改質剤は、例えばモノラウリン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタンおよび/またはポリエチレングリコールｐ−(1、1、3、3−テトラメチルブチル)−フェニルエーテルの様な、動的共重合体を含み得る。表面化学性改質剤は、例えばポロクサマー407、ポリ(Ｌ−リジン）および/またはポリ(エチレングリコール)−ポリ(ｌ−リジン）ブロック共重合体の様な、静的共重合体を含み得る。
細胞のマトリックスに対して種々の条件を選別するための装置は、マイクロウェルアレイを画定する表面を有する基材を含み得る。マイクロウェルアレイの数区画は、（例えば、より大きなウェルあるいは壁によって）サブアレイに分割され得る。基材は微細加工で作られ得る。各マイクロウェルは、生物学的実体（例えば、細胞）を収容し且つ増殖させ得る。結果として得た生物学的実体（例えば、細胞）のマトリックスは、生物学的実体の高密度マトリックスであり得る。第１アレイおよび/または第2アレイは、平面、概ね平面、および/または多重平面（例えば、ロール上で）であり得る。
“高分解能”という用語は、数多くの利用可能実験を区別するシステムあるいは方法の能力を意味し得る。例えば、“高分解能”システムあるいは方法は、約１nmから約800μｍの直径を有する１つの実験ユニットを高密度実験ユニット含有の微細加工デバイスから選択することができる。微細加工デバイスあるいはチップの基材は、約10,000,000あるいはそれ以上のマイクロウェルを組み込むことができる。例えば、マイクロウェルアレイは、少なくとも96箇所、少なくとも1,000箇所、少なくとも5,000箇所、少なくとも10,000箇所、少なくとも100,000箇所、少なくとも500,000箇所、少なくとも1,000,000箇所、少なくとも5,000,000箇所、あるいは10,000,000箇所の格納場所を含み得る。
マイクロウェルの表面密度は、cm2当たり約500マイクロウェルから約160,000マイクロウェル、あるいはそれ以上であり得る。微細加工デバイスあるいはチップの基材は、cm2当たり少なくとも150マイクロウェル、cm2当たり少なくとも250マイクロウェル、cm2当たり少なくとも400マイクロウェル、cm2当たり少なくとも500マイクロウェル、cm2当たり少なくとも750マイクロウェル、cm2当たり少なくとも1,000マイクロウェル、cm2当たり少なくとも2,500マイクロウェル、cm2当たり少なくとも5,000マイクロウェル、cm2当たり少なくとも7,500マイクロウェル、cm2当たり少なくとも10,000マイクロウェル、cm2当たり少なくとも50,000マイクロウェル、cm2当たり少なくとも100,000マイクロウェル、あるいはcm2当たり少なくとも160,000マイクロウェルのマイクロウェル表面密度を有し得る。
マイクロウェルの大きさは、ナノスケール（例えば、約１から約100ナノメートルの直径）からミクロスケール以上までの幅があり得る。例えば、各マイクロウェルは、約1μｍから約800μｍの直径、約25μｍから約500μｍの直径、あるいは約30μｍから約100μｍの直径を有し得る。マイクロウェルの有し得る直径は、約１μｍまたは１μｍ未満、約5μｍまたは5μｍ未満、約10μｍまたは10μｍ未満、約25μｍまたは25μｍ未満、約50μｍまたは50μｍ未満、約100μｍまたは100μｍ未満、約200μｍまたは200μｍ未満、約300μｍまたは300μｍ未満、約400μｍまたは400μｍ未満、約500μｍまたは500μｍ未満、約600μｍまたは600μｍ未満、約700μｍまたは700μｍ未満、あるいは約800μｍまたは800μｍ未満であり得る。
マイクロウェルは、約500μｍから約5000μｍの深さ、約１μｍから約500μｍの深さ、あるいは約25μｍから約100μｍの深さを有し得る。マイクロウェルの有し得る深さは、約１μｍ、約5μｍ、約10μｍ、約25μｍ、約50μｍ、約100μｍ、約200μｍ、約300μｍ、約400μｍ、約500μｍ、約600μｍ、約700μｍ、約800μｍ、約1,000μｍ、約1,500μｍ、約2,000μｍ、約3,000μｍ、あるいは約5,000μｍであり得る。
各マイクロウェルは、円形、六角形あるいは正方形の開口を有し得る。各マイクロウェルは側壁を伴い得る。それらの側壁は、垂直の、傾斜したあるいは湾曲した断面形状を有し得る。少なくとも１つの特有の位置特異性タグが、以下で更に述べるように、高密度マクロウェルアレイの少なくとも１つのマイクロウェルに割り付けられて種の識別およびマイクロウェルの高密度アレイの特異的なマイクロウェルへの種の相関を容易に成し得る。その少なくとも１つの特異タグは、その１つのマイクロウェルの底および/または少なくとも１つの側面に割り付けおよび/または配置され得る。その少なくとも１つの特異タグは、少なくとも1つの生物学的実体の標的核酸断片へアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列およびマイクロウェルの高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルを識別するための位置特異性ヌクレオチド配列を備えた核酸分子を組み込み得る。
例えば、微細加工デバイスあるいはチップの基材は、約4インチ×4インチの大きさの表面を有し得る。その表面は、おおよそ１億個のマイクロウェルのアレイを画定し得る。マイクロウェルアレイを壁によって約100の小区画に分割できおよび/または基材は約100ウェルのアレイを画定できる、すなわち各小区画あるいはウェル内で画定された約100万のマイクロウェルは合計で約１億のマイクロウェルとなる。異なった栄養素を試験する使用例に関しては、自然環境試料からの微生物は、個々の微生物あるいは微生物クラスターがチップ上のマイクロウェルに分配されるように、チップに装填でき、そこでは各マイクロウェルはより大きなウェルの下部に設置されている。より大きなウェルの各々は、異なる100の栄養素を同一のチップ上で並行してあるいは連続して試験できるように、実験ユニットを組み込むことができる、即ち各ウェルは100万までの試験例をまかなうことができる。
標的細胞は、古細菌、細菌あるいは真核生物（例えば、菌類、植物あるいは動物）であり得る。例えば、標的細胞は、好気性、嫌気性および/または条件的好気性微生物のような微生物であってよい。例えば細胞個体数、細胞成分および/または細胞生成物への増殖あるいは他の効果を分析および比較するために、異なる栄養素が標的細胞の組成物を使い並行してあるいは連続して試験され得る。標的細胞の組成物は、例えば一種以上のウイルス（例えばバクテリオファージ）、細胞表面（例えば、細胞膜、細胞壁）、代謝産物、ビタミン、ホルモン、神経伝達物質、抗体、アミノ酸、酵素、タンパク質、糖類、ATP、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸（例えばDNAあるいはRNA）、表現型、突然変異体、代謝経路、遺伝子および適応性のような、細胞の成分、生成物、および/または機能について検査され得る。
細胞の組成物は、自然環境試料抽出物および/または希釈物を含み得る。その自然環境試料抽出物および/または希釈物は、1種以上の生物組織（例えば、結合組織、筋肉、神経、上皮、植物表皮、維管束、土壌等）、生物液あるいは他の生物産物（例えば、羊水、胆汁、血液、脳脊髄液、耳垢、浸出物、糞便、胃液、間質液、細胞内液、リンパ液、乳汁、鼻汁、ルーメン内容物、唾液、皮脂、精液、汗、尿、膣分泌物、吐瀉物等）、微生物懸濁液、（例えば種々の気体成分を伴う）空気、超臨界二酸化炭素、（例えば、ミネラル、有機物、気体、液体、微生物等を伴う）土壌、（例えば、農業、海洋等の）堆積物、生きている有機物（例えば、植物、昆虫、その他の小生物および微生物）、死んだ有機物、馬草（例えば、牧草、豆科植物、貯蔵牧草、作物残留物等）、ミネラル、（例えば、動物、植物、石油化学由来の）油あるいは油製品、アルコール、緩衝物、有機溶媒、水（例えば、天然の真水、飲料水、海水等）および/または汚水（例えば、衛生、商業、工業および/または農業廃水、および表面流出物）およびその他を含み得る。
１つの方法は、細胞を含む組成物を微細加工デバイスへの適用（例えば、装填）に先立ち、細胞と自然環境試料抽出物および/または希釈物とを組み合わせて組成物を調製するステップを含み得る。その方法は更に、自然環境試料抽出物および/または希釈物を液化するステップ含む場合がある。組成物内の細胞濃度は、実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル１個当たりの１細胞の標的配分に合わせ得る。
試料が複数個の細胞あるいはウイルスを含む場合、試料内のそれら細胞は、微細加工デバイスに播された後で溶解されて、核酸分子を放出し得る。細胞は、例えばアルカリ性曝露のような化学処理、洗剤、音波処理、タンパク質分解酵素Ｋあるいはリゾチーム曝露を使って細胞を溶解し得る。細胞は、加熱によっても溶解され得る。
図5Aは、複数の実施形態に従って１つの試料から細胞を単離するための１つの方法を説明する作業ステップ図である。ステップ500において、試料を得る。ステップ502においては、物理的技法（例えば、混合および/または音波処理）および化学的技法（例えば、キレート剤、洗剤および/または酵素）の少なくとも１つを使って、試料を均一化および/または分散化する。ステップ504においては、均一化およびまたは分散化された試料内の細胞は、例えばNycodenz(登録商標)非粒子状媒体（プロゲンビオテクニクGmbH、ハイデルベルグ、ドイツ、から入手可能）を使う密度遠心法によって分離される。
図5Bは、複数の実施形態に従って1つの土壌試料から細胞を単離する方法を説明する一覧図である。パネル506は、土壌試料を表示している。パネル508は、試験管内で均質化されおよびまたは分散された試料を表示している。パネル510は、遠心分離後に可溶堆積物512、細胞514、不溶堆積物516およびNycodenz(登録商標)518に分離した試料を表示している。
図６は、複数の実施形態に従って１つの試料から細胞を単離しそして培養する方法を説明する作業ステップ図である。ステップ600において、試料を得る。ステップ602において、その得られた試料から少なくとも1細胞を抽出する。ステップ604において、微細加工デバイスあるいはチップの少なくとも１つの高密度マイクロウェルアレイにその少なくとも１つの抽出された細胞を装填する。ステップ604には、その少なくとも１つの抽出細胞を伴う細胞濃度を用意、少なくとも１つの栄養素/培地を選択、および/または少なくとも１つの膜の選択を組み込み得る。ステップ606には、マイクロウェルアレイの少なくとも１部分が少なくとも１つの選択された膜によって密閉されてそれらのマイクロウェルに関する細胞濃度を保持する。ステップ608において、チップが培養目的で温められる。ステップ608には、温度選択、（例えば、好気性かあるいは嫌気性かの）雰囲気の決定、および/または培養時間の決定を組み込み得る。ステップ610において、チップは分割されおよび/または（例えば、ピッカーを使って）複製がつくられ、結果としてここに述べた方法に従って培養された細胞を2部もたらすことになる。例えば、少なくとも1枚の膜が培養細胞の１部分を付着した儘で剥がされる、あるいは培養細胞を試料として取り出すために剥がされるかまたは突き破られる場合がある。省略可のステップ612において、培養細胞の1部が識別のために犠牲にされる。ステップ612には、PCR、配列決定、および/または様々なデータ解析を組み込み得る。ステップ614において、対象物の菌株が識別される。更なる培養、試験、および/または識別を、例えば対象物の菌株およびまたは培養細胞の残部を使って行い得る。
図７は、複数の実施形態に従って複合試料を単離して培養する方法を図解する一覧図である。パネル700には、複合試料、特に微生物叢試料702および土壌試料704、の例が示されている。パネル706では、例えば図5Aおよび図5Bに図解されたプロトコルを使って、試料から少なくとも１つの細胞が抽出されている。パネル708では、少なくとも１つの抽出細胞（および何らかの自然環境抽出物および希釈物）が、少なくとも１つの高密度マイクロウェルアレイ710を有する微細加工デバイスあるいはチップに装填されている。チップ710および試薬カートリッジ712が培養器714内に挿入される場合がある。試薬は、増殖のための栄養需要および/または種々の選抜目的を維持するために、液体を加えるのに役立得る。パネル716には、産出物、即ち培養細胞の単離菌株、が示されている。
1つのマイクロウェルで増殖する細胞あるいは微生物の種あるいは分類系統を識別するためには、DNA塩基配列決定、核酸混成、質量分析、赤外分光測定、DNA増幅、遺伝因子あるいは他の種識別子を識別するための抗体結合およびその他を含む技法が必要とされる。多くの識別方法および処理ステップは微生物を消滅させるので、更なる培養および対象物の微生物の研究を妨げている。以後の培養、研究および特定の対象物のクローンの更なる育成を可能にしながら細胞あるいは微生物の識別の両方を可能にするために、幾つもの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル全般にわたって位置保全および微生物個体群の分離を維持しながら１つの基材あるいはチップ全般にわたって各実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルから試料を取って調べるために更なる実施形態が設計される。
上述のように基材は、更に幾つものシステム、キット、装置や方法を使って細胞個体群から試料を取って調べることを可能にし得る。例えば、採取装置が基材の第１表面に適用され得る。その装置は、第１表面と向き合う少なくとも１個の突起物を組み込み得る。その少なくとも１個の突起物は、各マイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットの開口直径よりも小さな直径を有している。その少なくとも１個の突起物は、少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内の細胞の1個体群の１部分が少なくとも１個の突起物に付着および/または結合するように、その細胞個体群を保持する少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットに挿入され得る。少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内の細胞個体群の試料は、少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内の細胞個体群の１部分が少なくとも１個の突起物に付着および/または結合したままで残るように、採取装置を基材の第１表面から取り除くことによって回収され得る。各突起物は、１本のピンまたは複数のピンまたはピン集合体であり得る。
図8A〜図8Cは、複数の実施形態に従っての1本のピンあるは多数のピンによる採取の説明図である。チップ800は、顕微鏡802による検査および採取制御装置804による採取に提供される。図8Aにおいて、採取制御装置804は１本だけのピン806を有するアームを備えている。図8Bでは、多数のピン808を有するアームが示されている。図8Cは、採取ステップ進行中のチップの透視図である。
図9A〜図9Dは、複数の実施形態に従って1つのウェルの選抜を実際に行っている画像である。図9Aでは、そのウェルは満杯である。図9Bにおいて、ピンが所定位置へと動かされている。図9Cにおいて、そのウェルが選抜されている。図9Dにおいて、試料がそのウェルから取り出されている。
図10A〜図10Dは、複数の実施形態に従ってチップからの採取用器具を図解する一覧図である。図10Aにおいて、複数のピンを備えた器具は、複数のウェルを有するチップに位置合わせされている。図10Bにおいて、ピンがウェルに浸かるように器具が下げられている。図10Cにおいて、付着した試料を備えたピンが示され、それら試料は新しいチップへと移される。一方、図10Dでは、試料が器具自身に保持されるように器具を上下反転させている。
図11は、寒天薄層を突き通されたウェルの画像であり、複数の実施形態に従う膜あるいは密封層突き抜けを図示している。
一方、少なくとも１つの突起物が少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットに浸される時、その少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内の細胞固体群の１部分は、その少なくとも１つの突起物の上方およびまわりへ移動した量であって、その移動量部分の少なくとも幾分かは基材の第１表面およびまたはその少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットの内部表面上方にあるものとする。その方法はまた、細胞固体群の移動量部分の少なくとも幾分かを集めることによってその少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞固体群を試料として採取するステップを含んでいる。
同様の採取装置が基材の第１表面に向き合う第２表面へ適用され得る。その装置は、第２表面に向き合う少なくとも１つの突起物を組み込み得る。その少なくとも１つの突起物は、少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットの直径に略等しいまたはより小さい直径を有する。その少なくとも１つの突起物は、細胞の固体群を保持する少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットに対応する位置で第２表面へ押され、そして/あるいは細胞の固体群を保持するその少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットの中へ挿入されて、その少なくとも1つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内のその細胞個体群の1部分を基材の第１表面および/またはその少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットの内部表面の上方へ移動させることとする。細胞個体群の移動部分は、その後で収集され得る。その細胞個体群は、少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内のプラグ（例えば、ヒドロゲルあるいは寒天のような他の柔らかい物質）上に置かれ、少なくとも１つの突起物が第２表面へ押されそして少なくとも１つのマイクロウェルに挿入された少なくとも１つである時、そのプラグは移動させられ、それによって細胞個体群の1部を移動させるものとする。
少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルからの細胞個体群の試料は、別の位置に保管され得る。更なる試料採取に先立ち、少なくとも１つの突起物を洗浄および/または殺菌し得る。その少なくとも１つの突起物の少なくとも１部分が、細胞の付着に有利な表面特性のための表面化学性改質剤で処理および/または塗布された物質で構成され得る。その少なくとも１つの突起物は、突起物配列であり得る。基材の第１表面に装置を適用するに際して、突起物配列は、実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルの対応アレイに挿入され得る。突起物配列の突起物数は、第１アレイ内の実験ユニット数、マイクロウェルの1つの第２アレイ内のマイクロウェル数、あるいは基材内のマイクロウェル総数に相当し得る。
基材内の細胞固体群を試料採取するための別の装置は、第１表面と向き合う少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットを組み込んでいる。その少なくとも1つの注射針および/またはナノピペットは、各マイクロウェルの開口直径より小さい外径と標的細胞直径に対応し得る内径を有している。その少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットは、細胞の個体群を保持する少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルへ挿入される。その少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内細胞個体群の試料は、その少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルからその細胞個体群を引っ張り出すための圧力を使ってデバイスへ回収される。
その少なくとも1つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルからの細胞個体群の試料は、別の位置に保管され得る。更なる試料採取に先立ち、その少なくとも１つの注射針およびまたはナノピペットを洗浄および/または殺菌し得る。その少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットは、注射針アレイおよび/またはナノピペットアレイであり得る。微細加工基材の第１表面にその装置を適用するに際して、その注射針および/またはナノピペットアレイは実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルの対応アレイへ挿入され得る。注射針および/またはナノピペットアレイ内の注射針および/またはナノピペットの数は、第１アレイ内実験ユニット数、マイクロウェルの別の１アレイ内マイクロウェル数あるいは基材内マイクロウェル総数に相当し得る。
基材内の細胞個体群を試料採取する別の方法は、流動体内に細胞個体群を保持している少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルへ集束させた音響エネルギーを加えることを含んでいる。集束させた音響エネルギーは、少なくとも１つのマイクロウェルから１小液滴を射出するのに効果的なやり方、例えば音波による小液滴の射出（ADE）、で加える場合がある（例えば、Sackmann 等、"Acoustical Micro- and Nanofluidics: Synthesis, Assembly and Other Applications," Proceedings of the 4th European Conference on Microfluidics (December 2014) を参照）。その小液滴は、少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内の細胞個体群の試料を含んでいる。その小液滴は、別の容器あるいは表面あるいは基材へ向けて送り出され得る。
基材は、第１表面の少なくとも1部分を含む第１片と第２表面の少なくとも1部分を含む第２片とを少なくとも含んでいる。それら第1片と第２片は、第１表面および第２表面に平行な平面の少なくとも１部分に沿って脱着可能に結び付けられている。その平面は、幾つもの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを分割する。少なくとも1つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内の細胞個体群は、例えば少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内の細胞個体群の第１部分が第1片に付着したままで且つその少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェル内の細胞個体群の第２部分が第２片に付着したままで、第１片と第２片を切り離すことによって試料採取される。
図12は、複数の実施形態に従うチップ1200の1断面を示す図形である。チップ1200は、内容物で満たされたウェルアレイ1202を画定する基材を含んでいる。その基材は、第１片1206および第２片1208で構成されている。それら第１片1206と第２片1208は、ウェルアレイ1202に平行で且つそれを二分する平面に沿って脱着可能に結合されている。第1片1206と第２片1208が切り離される時、複数のウェル1202とそれらの内容物1204は分割されて、チップ1200の内容物1204の隔離と位置を維持する内容物1204の写し２部をもたらす。
各マイクロウェル、実験ユニットあるいはマイクロチャネルは、細胞個体群が第1部分と下部部分の両方で増殖できるようなそんな第１部分と下部部分にそのマイクロウェル、実験ユニットあるいはマイクロチャネルを部分的に分離する部分障壁を含み得る。細胞個体群を試料採取するに先立って、上述の方法は細胞個体群内の塊を分散および/または減少させることを含み得る。細胞個体群内細胞塊分散および/または減少には、音波処理、振盪、小粒子による分注等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
上記の方法は、少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルからの細胞個体群試料を別の場所へ付着させることを更に含み得る。そのべつの場所は、対応する実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルのアレイであり得る。その別の場所は1つの単独容器であってもよい。少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルからの細胞個体群の試料は、次の培養用に維持され得る。一方、その細胞個体群の中でその少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルに残った細胞も次の培養用に維持され得る。
上記の方法は、細胞固体群の試料および/または細胞個体群の残留細胞からの少なくとも１つの細胞を識別するステップを更に含み得る。このことは、DNA，cDNAおよび/またはRNA増幅、DNAおよび/またはRNA塩基配列決定、核酸分子混成物形成、質量分光法、およびまたは抗体結合を行うことを含み得る。一方、あるいはそれに加えて、それは少なくとも１つの細胞が由来した実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを識別するステップをも含み得る。各実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルは、位置特異性ヌクレオチド配列を組み込んだ特異タグでしるし付けをされ得る。その実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを識別するために、位置特異性ヌクレオチド配列が、配列決定および又は増幅反応において識別され、そしてその位置特異性ヌクレオチド配列は、その少なくとも１つの細胞が由来したその少なくとも１つの実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルと相間関係にあり得る。
上述のような微細加工デバイスは、更なるシステム、キット、装置および方法を使って自然環境由来の試料内細胞の培養を可能にし得る。例えば、細胞の少なくとも1つが少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットを占めるように、試料を基材の第１表面に塗布し得る。第１表面の少なくとも1部分（例えば、実験ユニットあるいはウェルの内部表面の少なくとも１部分）に、栄養素がその少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットへ拡散できるように、半透膜を貼りつける。その間、その少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットから占拠細胞が漏れ出すことが防がれおよび/または軽減される。半透膜は、例えば、ヒドロゲル層であり得る。半透膜は、例えばラミネート加工によって、基材に可逆的にあるいは不可逆的に結びつけられるか、あるいは貼り付けられる。このようにして、占拠細胞は、少なくとも１つの栄養素を備えた少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内で培養され得る。それらの細胞は、ある期間にわたって進行性部分交換を使って少なくとも１つの栄養素から少なくとも１つの他の栄養素あるいは栄養素配合物へと徐々に移動させ得て、それによって飼養化あるいは改造を受ける。
自然環境に由来する第１の栄養素は、少なくとも１つの第１実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを占拠する細胞を培養するのに使うことができ、そしてその環境に由来する第２の栄養素は、少なくとも1つの第２実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを占拠する細胞を培養するのに使うことができる。上記の方法は、少なくとも１つの第１実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを占拠する細胞と少なくとも１つの第２実験ユニット、ウェルあるいはマイクロウェルを占拠する細胞を比較して第１栄養素と第２栄養素を分析するステップを含み得る。
例えば、1つの方法は、以下に記すステップ中の1つ以上を含み得る：
・多くのより大きなウェルあるいはフローセル内に千から1千万個のマイクロウェルを画定するチップを取得すること、そこではマイクロウェルの各々は約１μｍ〜約800μｍの直径、約１μｍ〜約800μｍの深さを有し、チップは、標的微生物のマイクロウェルへの移動を容易にするように構成された1種以上の表面化学作用物質を有するものとする；
・自然環境試料あるいは自然環境試料からの派生物を、どの標的微生物もマイクロウェル内に配置される状態になる様にチップへ塗布するステップ；
・栄養素がマイクロウェル内へ拡散するのを可能にするがマイクロウェルからの微生物の漏れ出しを防ぐおよび/または軽減する障壁を創り出す様にチップ上に１つ以上の半透過性のフィルター、ヒドロゲル層あるいは他の障壁を設置するステップ；
・なくとも１つの栄養素（例えば、自然環境に由来）を備えたチップを培養目的で温めること；
・少なくとも１つの別の栄養素（例えば、配合物）を使って進行性部分交換により栄養素源を徐々に変化させること；および
・マイクロウェル内微生物の如何なる増殖をも検出するステップ。
標的細胞は、古細菌、細菌あるいは真核生物であり得る。標的ウイルスはバクテリオファージであり得る。ウイルスが標的とされる場合、チップのマイクロウェルは、ウイルスが増殖し得る宿主細胞をも含み得る。占拠細胞あるいはウイルスの増殖検出は、バイオマス（例えば、DNA/RNA/タンパク質/脂質）の変化、代謝産物の有無、pH、栄養素消費、および/または気体消費の検出を伴い得る。占拠細胞あるいはウイルスの増殖検出は、実時間順次画像化、顕微鏡分析、光学濃度測定、蛍光顕微鏡分析、質量分析、電気化学、増幅（DNA、cDNAおよび/またはRNA）、塩基配列決定（DNAおよび/またはRNA）、核酸分子混成物形成、および/または抗体結合を行うことを伴い得る。
図13は、複数の実施形態に従って選抜を行うための方法を説明する作業ステップ図である。ステップ1300において、試料を取得する。ステップ1302において、取得した試料から少なくとも１つの細胞を抽出する。ステップ1304において、微細加工デバイスあるいはチップの少なくとも１つの高密度マイクロウェルアレイに、その少なくとも１つの抽出細胞が装填される。ステップ1304は、その少なくとも１つの抽出細胞を有する細胞濃度を用意、少なくとも１つの栄養素/培地を選択、および/または少なくとも１つの膜の選択を含み得る。ステップ1306において、マイクロウェルアレイの少なくとも１部分が少なくとも１つの選択された膜によって密閉されてそれらのマイクロウェルに関する細胞濃度を保持する。ステップ1308において、チップが培養目的で温められる。ステップ1308には、温度選択、（例えば、好気性かあるいは嫌気性かの）雰囲気の決定、および/または培養時間の決定が含まれ得る。遺伝子検査および/または機能検査が実施される場合がある。ステップ1310において、遺伝子検査がチップにたいして施される。ステップ1312において、チップが分割されおよび/または（例えば、ピッカーを使って）複製されて、ここに記述した方法に従って培養した細胞を2部もたらすことになる。例えば、少なくとも１つの膜は、培養細胞を試料採取するために培養細胞の一部分が付着して残るように剥がされるか、あるいは剥がされかあるいは穴をあけられる場合がある。省略可のステップ1314において、培養細胞の１部分が識別のために犠牲にされる。ステップ1314は、PCR、配列決定、および/または様々なデータ解析を組み込み得る。ステップ1316において、対象物の菌株が識別される。更なる培養、試験、および/または識別を、例えば対象物の菌株およびまたは培養細胞の残部を使って行い得る。一方、ステップ1318において機能検査がチップに施される。ステップ1320において、1つ以上の変量を観察し、そしてステップ1316に於けるように、対象物の菌株を識別する。
図14は、複数の実施形態に従う選別方法を図解する一覧図である。パネル1400は、複合試料の例、具体的には微生物群系試料1402および土壌試料1404、を示している。パネル1406では、例えば図5Aおよび図5Bに示されたプロトコルを使って試料から少なくとも１つの細胞が抽出されている。パネル1408では、少なくとも１つの抽出細胞（および何らかの環境抽出物および/または希釈物）が、少なくとも１つの高密度マイクロウェルアレイ1410を備えた微細加工デバイスあるいはチップに装填されている。チップ1410および試薬カートリッジ1412は、培養器1414内へ挿入され得る。試薬は、増殖および/または種々の選別目的で栄養上の必要条件を維持するための液体を加えるのに有用であり得る。パネル1416は、出力、即ち選別結果および培養細胞の単離菌株、を示している。
図15は、複数の実施形態に従う選別例を示す一連の画像である。それらの画像は、低いpHについて検査するために施された膜および酸感受性層を備えたチップの複数の部分を示している。画像1500には、1800を超える50μmマイクロウェルが9箇所の明確なヒット1502を有する状態で表示されている。画像1504は、囲い枠1504の拡大画面であり、そして画像1506はヒット1502を有するマイクロウェルのなかの1つを拡大した画面である。
図16A〜図16Cは、複数の実施形態に従う遮蔽物からの回収を説明する画像である。図16Aでは、少なくとも１つのウェルが顕微鏡と少なくとも１つのピンを有する採集器を使って穿られている。図16Bでは、ピンが取り除かれ、培地で培養されている。図16Cでは、増殖が見た目に明らかである。
図17Aは、複数の実施形態に従う選別用チップを説明する分解組立図である。図17Aにおいて、チップ1700は、例えば土壌微生物を内部に有するマイクロウェルの高密度アレイを組み込んでいる。膜1702をチップ1700に貼りつける。ガスケット1704を膜1702越しにチップ1700に貼りつける。蛍光大腸菌を付けた寒天1706をガスケット1704および膜1702越しにチップ1700に貼り付ける。図17Bおよび図17Cは、複数の実施形態に従う選別例を説明する画像である。この例において、遮蔽物は、排除領域用である。図17Bは、図17Aにおけるチップ1700のように加工され、遮蔽物を同伴するチップの蛍光画像である。図17Cは、寒天を貫いてこのチップから試料を採集するステップを示す画像である。
複数の実施形態において、試料の１部分（あるいはその部分の一部）が装置から取り除かれた後、その装置上の位置はその位置に存在する試料のその１部分と相関関係にあり得る。装置はマイクロアレイであっても、あるいはマイクロアレイを組み込んでいてもよい。マイクロアレイは試料を施す複数の位置を有し、そこでは試料の１部分がそのマイクロアレイから取り除かれた後、各位置は試料のその１部分が由来した位置を識別するのに使用できる特異タグで印づけされる。
本発明は、試料の１部分がマイクロアレイから取り除かれた後、少なくとも１つの核酸分子を含む試料のその部がマイクロアレイのどの位置に由来したかを識別する方法に関しており、その方法は、（a）試料の1部分またはそれ以上の部分をマイクロアレイ上の複数位置の中の１つ以上へ塗るステップ、そこでは各位置は、（i）位置特異性ヌクレオチド配列および（ii）第1の標的特異性ヌクレオチド配列を含む核酸分子を有する特異タグで印づけが成されていることとする、（ｂ）試料の少なくとも１部分に見出される標的核酸分子を位置の印づけタグにアニールさせるステップ、（c）アニールされた核酸分子個体群に対してプライマー伸張、逆転写、1本鎖連結反応あるいは2本鎖連結反応を行い、それによって位置特異性ヌクレオチド配列をプライマー伸張、逆転写、1本鎖連結反応あるいは2本鎖連結反応によって生成された各核酸分子へ組み込むステップ、（d）ステップ（c）で生成された核酸分子個体群を組み合わせるステップ、（e）組み合わせた核酸分子個体群の配列決定を行い、それによって１つ以上の位置特異性ヌクレオチド配列の中のその配列を得るステップ、および（f）組み合わせた核酸分子個体群から得られた少なくとも１つの位置特異性ヌクレオチド配列のその配列をその位置特異性ヌクレオチド配列を含むタグで印づけられたマイクロアレイ上の位置と関連付け、それによって少なくとも１つの核酸分子を含む試料の１部分が由来したマイクロアレイ上の位置を識別するステップ、を含んでいる。複数の実施形態において、試料は少なくとも1つの細胞を含むことができ、その細胞から１つ以上の核酸分子がステップ (a) の後で且つステップ (b) の前に放出される。試料は少なくとも１つの細胞を含むことができ、そしてその少なくとも１つの細胞が、ステップ (a) の後で且つステップ (b) の前に自己複製あるいは分裂する。その試料の１部分の1部がステップ (b) の前に少なくとも１つの位置から取り除くことができて、その試料の1部分のその1部がマイクロアレイ上のその試料の１部分の元の位置と相関関係にある入れ物に保管され得る。位置を相互関連付けるあるいは識別する方法は、ステップ (c) で生成された核酸分子あるいはステップ (d) で生成された組み合わせ核酸分子の個体群を増幅するステップを更に含み得る。その増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応増幅、多重ポリメラーゼ連鎖反応増幅、入れ子ポリメラーゼ連鎖反応増副、リガーゼ連鎖反応増幅、リガーゼ検出反応増幅、鎖置換増幅、転写をベースとした増幅、核酸配列をベースとした増幅、ローリングサークル増幅、あるいは超分岐ローリングサークル増幅を含み得る。追加のプライマーを増幅反応中に添加し得る。例えば、5’および3’の両プライマーがPCR反応に必要とされ得る。増幅反応中に使われるプライマーの１つは、試料中のヌクレオチド配列に相補的であり得る。
複数の実施形態においては、細胞および/またはウイルスを含む組成物を、後続のステップにおいて汚染核酸分子が増幅しないようにその組成物が微細加工デバイスに塗られる前に、核酸分解酵素を使って処理し得る。
本発明の方法および装置で使われる配列決定は、混成物形成および配列特異性蛋白（例えば、酵素）の使用を含む配列情報を得る如何なるプロセスであってもよい。その配列決定は、サンガー配列決定、混成物形成による配列決定、連結反応による配列決定、定量増分蛍光ヌクレオチド付加配列決定（QIFNAS）、段階的連結および切断、蛍光共鳴エネルギー移動、分子標識、TaqManレポータプローブ消化、パイロシークエンシング、蛍光インサイチュー配列決定（FISSEQ）、ゆらぎ配列決定、多重配列決定、重合コロニー（POLONY）配列決定（例えば米国特許出願公報No. 2012/0270740を参照。この公報はここにおいての参照によりその全文が本発明の明細書に組み入れられる）、ナノグリッドローリングサークル（ROLONY）配列決定（例えば米国特許出願公報No. 2009/0018024を参照。この公報はここにおいての参照によりその全文が本発明の明細書に組み入れられる）、対立特異性オリゴ連結結合分析配列決定、あるいは次世代配列決定（NGS）プラットホームでの配列決定を含み得る。NGSプラットホームの非限定例には、Illumina(登録商標)（サンディエゴ、カリフォルニア）（例えば、MiSeqTM、NextSeqTM、HiSeqTMおよびHiSeqXTM）、Life Technologies（カールスバド、カリフォルニア）（例えばIon TorrentTM）およびPacific Biosciences（メンロパーク、カリフォルニア）（例えばPacBio(登録商標) RS II）のシステムが含まれる。
有機体あるいは生物種は、その有機体から得られた核酸配列と数々の有機体の配列を収録している様々なデータベースと比較することによって識別され得る。例えば、リボソームRNA配列データは、SIL VA rRNAデータベースプロジェクト（マックスプランク海洋微生物学研究所、ブレーメン、ドイツ（www.arb-silva.de））から入手可能で、例えば Quast 等、 "The SIL VA Ribosomal RNA Gene Database Project: Improved Data Processing and Web-Based Tools," 41 Nucl. Acids Res. D590-D596 (2013), および Pruesse 等、 "SINA: Accurate High-Throughput Multiple Sequence Alignment of Ribosomal RNA Genes," 28 Bioinformatics 1823-1829 (2012) を参照したが、両論文はここにおいての参照によりそれらの全文が本発明の明細書に含まれる。他のリボソームRNA配列データベースは、リボソームデータベースプロジェクト（ミシガン州立大学、イーストランシング、ミシガン（www.rdp.cme.msu.edu）: 例えば、Cole 等、"Ribosomal Database Project: Data and Tools for High Throughput rRNA Analysis" 42 Nucl. Acids Res. D633-D642 (2014) を参照する。この論文はここにおいての参照によりその全文が本発明の明細書に組み入れられる）および Greengenes (ローレンス・バークレイ国立研究所、 バークレイ、 カリフォルニア(www.greengenes.lbl.gov) : 例えば、DeSantis 等、"Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB," 72 Appl. Environ. Microbial. 5069-72 (2006) を参照する。この論文はここにおいての参照によりその全文が本発明の明細書に組み入れられる) を含む。GenBank遺伝子配列データベースは、ほぼ260,000の正式に記述された種の公的に入手可能なヌクレオチド配列（国立衛生研究所, ベセスダ, メリーランド (www.ncbi.nlm.nih.gov)； 例えば、Benson 等、 "GenBank," 41 Nucl. Acids Res. D36-42 (2013) を参照）を収録している。
照合および識別用配列は、16Sリボソーム領域、18Sリボソーム領域あるいは識別情報を提供する何か他の領域を含み得る。所望の変種は、遺伝子型（例えば、単独ヌクレオチド多型（SNP）あるいは他のタイプの変種）あるいは特異遺伝子配列（例えば、酵素あるいはタンパク質の遺伝子暗号を指定する配列）を含む種であり得る。有機体あるいは生物種は、その配列を国内のカスタム配列データベースと照合することによってもまた識別し得る。複数の場合において、もしある位置で試料の一部分から得られた配列がある生物種あるいは微生物から得られる既知のDNA、cDNAあるいはRNA配列に対して少なくとも所定割合の同一性（例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、あるいは100％の同一性）を有するならば、その生物種あるいは有機体はマイクロアレイ上のその位置に見出されると結論できる。
本発明はさらに、試料を塗布する為の複数の位置を有するマイクロアレイを製造する方法に関しており、そこでは少なくとも１つの位置が特有のタグで印づけされているものとする。その方法は、(a) 各々が (i) 位置特異性ヌクレオチド配列および (ii) 標的特異性ヌクレオチド配列を含む核酸分子を含んでいる複数のタグを合成するステップおよび (b) マイクロアレイ上の複数の位置の中の少なくとも１つの位置にタグを配置するステップを含んでいる。別の実施形態においては、本発明は試料を塗布するための複数の位置、その中の少なくとも１つの位置が特有のタグで印づけられている、を有するマイクロアレイを製造する方法に関しているが、その方法は (a) 各々が標的特異性ヌクレオチド配列を含み且つ位置特異性ヌクレオチド配列を含まない核酸分子を含んでいる複数のタグを合成するステップ、および (b) マイクロアレイ上の複数の位置の中の少なくとも１つの位置にタグを配置するステップを有している。標的特異性配列は、マイクロアレイのどの位置でも同じであり得る。上記の実施形態の何れにおいても、ステップ (a) はステップ (b) の前に行われて良い。配置ステップ (b) は、液体処理手続き（例えば、ピペット操作、固形ピンを使うスポッティング、中空ピンを使うスポッティングあるいはインクジェット装置による沈着）によって各位置にタグを配置するステップを含む。少なくとも１つのタグは、核酸分子あるいは合成前の核酸分子の1部分を含み得る。ステップ (a) はステップ (b) と同時に行われても良い。或る複数の実施形態では、少なくとも１つのタグは、インサイチュー合成によって各位置で合成される核酸分子を含んでいる。合成ステップ (a) は、インクジェット印刷合成あるいはフォトリソグラフィ合成を含み得る。
マイクロアレイの各位置は、試料の一部分を受け取るように構成され得る。位置には、少なくとも１つの (i) 位置特異性ヌクレオチド配列（例えばバーコード）および (ii) 標的特異性ヌクレオチド配列を含む核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を使ってタグあるいはラベル付けをすることが出来る。標的特異性ヌクレオチド配列は、試料に見出されるヌクレオチド配列を補完あるいはおおむね補完し得る。その核酸分子の5’末端から3’末端へのヌクレオチド配列の順序は、(1) 位置特異性ヌクレオチド配列、(2) 標的特異性ヌクレオチド配列、であってよい。一方、その核酸分子の5’末端から3’末端へのヌクレオチド配列の順序は、(2) その次に (1) であってもよい。核酸分子は、その5’末端でマイクロアレイに付着し得る。装置（例えばマイクロアレイ）の1つ以上の位置は、タグ無しあるいはラベル無しでもよい。
「補完的」あるいは「おおむね補完的」という語は、例えば２本鎖DNA分子の２本鎖間あるいはオリゴヌクレオチドプライマーと１本鎖核酸上のプライマー結合部位の間のような、ヌクレオチド間あるいは核酸間での混成物形成、塩基対合あるいはデュプレックス形成を意味し得る。補完的ヌクレオチドは、一般的には、AとT/UあるいはCとGである。最適に並べられ、比較され且つ適切なヌクレオチド挿入または削除を伴っている1本鎖のヌクレオチドが、別の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80％、通常は少なくとも約90％から95％、より好ましくは約98％から100％と対合する時、２つの１本鎖RNAあるいはDNA分子が実質的に補完的であると言われる。一方、RNAあるいはDNA鎖が選択的混成物形成条件のもとでその補完物に混成する場合、実質的補完性が存在する。典型的には、少なくとも14から25のヌクレオチドのひと続き区間に亘って少なくとも約65％、少なくとも約75％あるいは少なくとも約90％補完性がある場合、選択的混成物形成が起こる。
「選択的に混成物を形成をする」あるいは「選択的混成物形成」という語は、検出可能に且つはっきり限定して結合することを意味し得る。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異性核酸へのかなりの量の検出可能結合を最少化する混成物形成および洗浄条件の下で核酸鎖に選択的に混成する。「高度に厳格な」あるいは「高度に厳しい」条件は、当技術分野で既知且つここにおいて述べる選択的混成物形成条件を達成するために用いることができる。「高度に厳格な」あるいは「高度に厳しい」条件の一例は、あるポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドを使って培養する方法であって、そこでは一方のポリヌクレオチドを、6ｘSSPEまたはSSC、50％ホルムアルデヒド、5ｘデンハルド試薬、0.5％SDS、100μg/ml 変性断片化鮭精子DNAの混成物形成バッファー内で、42℃の混成物形成温度で12〜16時間の間、膜のような固体表面に付着させ、次いで１ｘSSC、0.5％SDSの洗浄バッファーを使って55℃で２回洗浄をしている。
位置タグの一部である核酸分子は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドあるいは少なくとも１つのリボヌクレオチドを含み得る。その核酸分子は、１本鎖でも２本鎖でもよい。核酸分子は、一本鎖張り出しを有する２本鎖であってもよい。
複数の実施形態において、位置タグは、アニールする核酸分子を増幅するために用いられ得る。従って、位置タグは、増幅プライマー結合部位を更に有する核酸配列を含み得る。増幅プライマー結合部位は、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、あるいは少なくとも30のヌクレオチドの長さであってよい。核酸分子の5’末端から3’末端までのヌクレオチド配列の順序は、例えば、（1）増幅プライマー結合部位、（2）位置特異性ヌクレオチド配列、および（3）標的特異性ヌクレオチド配列、であり得る。
複数の実施形態において、核酸分子は位置特異性ヌクレオチド配列を含むことなく標的特異性ヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態では、核酸分子は位置特異性ヌクレオチド配列あるいは増幅結合部位配列のいずれかを含むことなく標的特異性ヌクレオチド配列を含み得る。更なる実施形態では、核酸分子は標的特異性ヌクレオチド配列のみを含み得る。なお更なる実施形態では、核酸分子は標的特異性ヌクレオチド配列のみで構成され得る。増幅プライマー結合部位は、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、多重ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、入れ子ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、リガーゼ連鎖反応プライマー、リガーゼ検出反応プライマー、鎖置換プライマー、転写をベースとしたプライマー、核酸配列をベースとしたプライマー、ローリングサークルプライマー、あるいは超分岐ローリングサークルプライマーに結合可能であってよい。追加のプライマーが増幅反応中にマイクロアレイに添加され得る。例えば、5’と3’プライマーの両方がPCR反応に必要とされ得る。標的特異性ヌクレオチド配列は、標的核酸分子の収容位置で増幅され、例えば qPCR、エンドポイントPCRおよび/または染料によって検出され得て増幅核酸分子が検出される。
位置タグあるいは核酸分子に基づいて増幅された生成物にアニールするそのような核酸分子の配列を読み取ることが望ましい場合がある。位置タグは、アダプターヌクレオチド配列を更に含む核酸配列を含み得る。ある特定の実施形態においては、アダプターヌクレオチド配列が、位置タグ内に見出されないかもしれないが、副次的PCR反応においてあるいは連結反応によって試料核酸分子に加えられる。アダプターヌクレオチド配列は、汎用アダプターあるいは特異配列決定プラットホーム（例えば、Illumina(登録商標)あるいはIon TorrentTM）用アダプターであり得る。アダプターヌクレオチド配列は、配列決定プライマー結合部位を含み得る。配列決定プライマー結合部位は、サンガー配列決定、混成物形成による配列決定、連結反応による配列決定、定量増分蛍光ヌクレオチド付加配列決定（QIFNAS）、段階的連結および切断、蛍光共鳴エネルギー移動、分子標識、TaqManレポータプローブ消化、パイロシークエンシング、蛍光インサイチュー配列決定（FISSEQ）、ゆらぎ配列決定、多重配列決定、重合コロニー（POLONY）配列決定（例えば米国特許No. 2012/0270740を参照）、ナノグリッドローリングサークル（ROLONY）配列決定（例えば米国特許No. 2009/0018024を参照）、対立特異性オリゴ連結結合分析配列決定、NGSプラットホームでの配列決定あるいは任意の適切な配列決定手続きの為のプライマーを結合可能であり得る。NGSプラットホームの非限定例には、Illumina(登録商標)（サンディエゴ、カリフォルニア）（例えば、MiSeqTM、NextSeqTM、HiSeqTM および HiSeqXTM）、Life Technologies（カールスバド、カリフォルニア）（例えば Ion TorrentTM）および Pacific Biosciences（メンロパーク、カリフォルニア）（例えばPacBio(登録商標) RS II）からのシステムが含まれる。
位置特異性ヌクレオチド配列（例えば、バーコード）は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、あるいは少なくとも30のヌクレオチドの長さであってよい。
標的特異性ヌクレオチド配列は、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、あるいは少なくとも100のヌクレオチドの長さであってよい。
マイクロアレイ上の少なくとも1つの位置は、特有の分子識別子タグで更に印づけされ得る。特有の分子識別子タグは、増殖（例えば、微生物コロニーの増殖あるいはその位置での細胞複製）を定量化するために用い得る。特有の分子識別子は、無秩序ヌクレオチド配列であり得る。特有の分子識別子使用方法および特有の分子識別子例は当技術分野において記述されてきており、例えばWO 2013/173394を参照するが、ここにおいての参照によりその全文が本発明の明細書に組み入れられる。例えば、特有の分子識別子タグは、ヌクレオチド配列 NNNANNNCNNNTNNNGNNNANNNCNNN (SEQ ID NO: 1) を有することが出来るが、そこでは増幅された各分子が特有の (特異的）DNA 配列バーコード（4^Nバーコード、あるいはこの例において4^21〜4兆）を獲得するように、幾つものＮ (ACGTの同じ無秩序混合) が大きな符号化空間を創り出している。この配列を、増幅バイアスあるいは他の問題からの妨害を受けることなく、数え上げることができる。SED ID NO: 1 の固定塩基（A、C、G、T）がバーコードの正確な読み取り、例えば挿入欠失の取扱い、を助けている。
本発明は、試料内に複数の標的特異性ヌクレオチド配列（例えば多重化）の存在あるいは量を観察・記録するための位置特異性タグを使うことを抱合する。マイクロアレイ上の少なくとも1つの位置は、例えば (i) 増幅プライマー結合部位、(ii) 位置特異性ヌクレオチド配列、および (iii) 標的特異性ヌクレオチド配列を含む核酸分子を有する第２の特異タグで更に印づけられ得る。
複数の実施形態において、核酸分子は位置特異性ヌクレオチド配列を含むことなく標的特異性ヌクレオチド配列を含み得る。或る特定の実施形態では、核酸分子は位置特異性ヌクレオチド配列あるいは増幅結合部位配列のいずれかをふくむことなく標的特異性ヌクレオチド配列を含み得る。更なる実施形態では、核酸分子は標的特異性ヌクレオチド配列のみを含み得る。なお更なる実施形態では、核酸分子は標的特異性ヌクレオチド配列のみで構成され得る。そのような標的特異性ヌクレオチド配列は、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも75、あるいは少なくとも100のヌクレオチドの長さであってよい。或る特定の実施形態では、標的特異性配列は、マイクロアレイのどの位置でもみな同じであり得る。追加の標的特異性ヌクレオチド配列が観察・記録され得る。例えば、1つ以上の位置が、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75あるいは少なくとも100の特異タグで印づけられ得るが、そこでは各タグは、その位置でのタグの中のその他の標的特異性ヌクレオチド配列とは異なる1つの標的特異性ヌクレオチド配列を含んでいる。
対象物のどの遺伝子座も、標的特異性ヌクレオチド配列を与え得る。例えば、バクテリア16SリボソームRNA (rRNA)、18SリボソームRNA、ポリ(A) RNA、RNAポリメラーゼ遺伝子、DNAポリメラーゼ遺伝子、RecA遺伝子、トランスポザーゼ遺伝子の配列類、リボソーム内部転写スペーサ―領域 (ITS) 配列、酵素符号化遺伝子、制御領域DNA配列類、結合部位DNA配列類、あるいはこれらの配列類のなかのいずれのものの一部分でも、標的特異性ヌクレオチド配列として役立ち得る。開示のシステム、キット、装置あるいは方法は、Sundquist 等、"Bacterial Flora-Typing with Targeted, Chip-Based Pyrosequencing," 7:108 BMC Microbiology (2007)およびWang 等、"Conservative Fragments in Bacterial l6S rRNA Genes and Primer Design for l6S Ribosomal DNA Amplicons in Metagenomic Studies," 4:10PLoS ONE e7401(2009) に記述されたバクテリア16S rRNAプライマーの中の1つ以上を使い得る。尚これらの文献の各々は、ここにおいての参照によりその全文が本発明の明細書に組み入れられる。
開示した装置および方法に使われる試料は、複数の核酸分子を含み得る。試料は少なくとも1つのDNA分子あるいは少なくとも１つのRNA分子を含み得る。試料は、制限酵素消化作用によって形成された少なくとも１つの核酸分子を含み得る。試料は、少なくとも1つの細胞（例えば、古細菌細胞、真正細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および/または動物細胞）を含み得る。試料は、少なくとも１つの微生物を含み得る。試料は、宿主細胞の供給が必要であり得る1種以上のウイルス（例えば、バクテリオファージ）を含み得る。マイクロアレイの1つの位置にある試料の１部分は、単独細胞あるいは単独細胞が増殖したコロニーであってもよい。例えば、微生物あるいは細胞を個別にマイクロウェルに配置することができ、それら個々の微生物あるいは細胞は、各微生物あるいは細胞が置かれた各マイクロウェル内部でコロニーが生長するように、分割あるいは複製を可能にされ得る。こうして、マイクロアレイの１つの位置は、単独微生物種あるいは互いの生長を助け合う微生物品種の混合共同体を収容し得る。試料は、あらゆる適切な希釈物を含み得る。試料が非限定例に含み得るものは、土壌、下水、糞便、体腔内容物、生物液、生きている有機物、死んだ有機物、微生物懸濁液、天然の真水、飲料水、海水、廃水、空気、超臨界二酸化炭素、ミネラル、気体、緩衝剤、アルコール、有機溶媒、および/または油である。複数の実施形態では、(a) (i) １つの位置特異性ヌクレオチド配列および (ii) 1つ以上の標的特異性ヌクレオチド配列、あるいは (b) 1つ以上の標的特異性ヌクレオチド配列（即ち、位置特異性ヌクレオチド配列を含まない）が、マイクロアレイの少なくとも1つの位置に、その位置に試料の1部分が置かれる前に、置かれる。その他の実施形態では、(a) (i) 位置特異性ヌクレオチド配列および (ii) 1つ以上の標的特異性ヌクレオチド配列、あるいは (b) 1つ以上の標的特異性ヌクレオチド配列（即ち、位置特異性ヌクレオチド配列を含まない）が、マイクロアレイの少なくとも1つの位置に、その位置に試料の1部分が置かれた後で、置かれる。1つの例では、試料あるいは試料の1部分が１つのマイクロアレイに、そのマイクロアレイに (i) １つの位置特異性ヌクレオチド配列と (ii) 1つ以上の標的特異性ヌクレオチド配列の中の少なくとも1つを含む１つの核酸分子が配置される前に、配置されそして培養され得る。複数の実施形態では、試料のその部分の1部が、そのマイクロアレイの少なくとも１つの位置から取り除かれて別の入れ物に保管されても、あるいはそのマイクロアレイの少なくとも1つの位置にそれらの核酸分子が置かれる前あるいは後のいずれかでそのマイクロアレイが分割されてもよい。
少なくとも1つの位置特異性タグは、あらかじめ合成されそして液体処理手続きによってその位置に配置される核酸分子あるいはその1部分を含み得る。例えば、液体処理手続きは、ピペット操作、固形ピンを使うスポッティング、中空ピンを使うスポッティングあるいはインクジェット装置による沈着であり得る。タグは、別に予め合成された多数の核酸分子を使ってその位置で生成され得る。少なくとも１つのタグは、インサイチュー合成（例えば、インクジェット印刷あるいはフォトリトグラフィー）によってその位置で合成される核酸分子を含み得る。
（生物種のデジタル列挙）
高密度マイクロウェルを有する表面を備えた高密度チップデバイスを此処に述べる。微生物叢試料の微生物が希釈されて、それらのウェルが１占有ウェル当たりほぼ1つの微生物を収容するように、そのデバイスへ塗布される。次に、そのチップは、微生物がウェル内で複製されるように、培養目的で温められてよい。更に、各ウェルにどの様な生物種が存在するかを決定するために、DNAによる位置索引作成システムをここに述べる。この索引作成システムは、ウェルを識別するアドレス指定バーコード類を含む各ウェルへ予め装填された幾つものPCRプライマー並びに種の情報を提供するあるいは所望の遺伝子配列を標的とする微生物ゲノム内の特有遺伝子要素（例えば、16S）を対象にしたプライマー配列を有することを伴い得る。培養後、微生物DNA が放出され、それらのPCRプライマーが標的バクテリアDNA領域を増幅し、そしてチップ上の種々のウェルからの増幅産物が貯留され、更に次世代配列決定法で解読され得る。
ここに述べたシステム、キット、装置および方法論は、1つの試料内の各微生物種あるいは変種の数の絶対集計を行うのに利用され得る。各ウェルは、元の希釈試料内での単独微生物の存在を表すデジタル事象を意味し得る。位置索引作成システムは、どんなバクテリア種がウェル内にいるのかをユーザが決定することを可能にし得る。測定のある１つの構成単位は、「ある１つのバクテリア種がある１つのウェル内にいる」であってよく、そのウェルにいるバクテリアの数とは無関係であってよい。
一例では、微生物の混合試料は、生物種1を50％、生物種2を30％および生物種3を20％含んでいる。その試料は希釈され、次に各占有ウェルが、大部分、1つの微生物を有する様にチップに塗られる。その微生物が複製される。尚、生物種が異なると複製率は異なり得る。次に、ウェル内微生物からのDNAが放出され、そして16Sまたはある他の標的配列が増幅される様に、チップが処理される。各ウェルからのDNA増幅生成物が貯留され、次世代配列決定法を使って配列決定され得る。次世代配列決定データが解析されて、どの生物種が各占有ウェル内にあるかを、各ウェルに対して決定し得る。多くのウェルが、全く占有されていない場合がある。各生物種の存在度は、各生物種で占められたウェルの総数を占有ウェルの総数で割ることによって決定され得る。絶対存在度決定は、ステップからの各生物種の%存在率に元の試料内の微生物の総数を掛けることによって、成され得る。配列決定データは、公的に入手できる配列決定データベースと比べられて、どんな生物種が各占有ウェル内にあるかが決定され得る。例えば、リボソームRNA配列は、上記したSIL VA rRNAデータベースプロジェクトで入手され得る。その他のリボソームRNA配列データベースとしては、上記したRibosomal Database Project、Greengenes、および GenBank(登録商標)遺伝子配列データベース等がある。
試料内微生物種存在度推定の現行方法は、顕微鏡、染色法、選択培地、代謝/生理遮蔽物およびペトリ皿を使う培養のような伝統的技法の利用を伴っている。これらの方法は、特異性の不足（顕微鏡、染色法、代謝/生理遮蔽物）あるいは試料内の全ての種を明らかにする能力の不足（選択的培地、培養）のために往々にして不正確であり、それによって伝統的手法では多くの種がよく増殖せずあるいは全く増殖を起こさない。
微生物叢試料内の微生物種の相対存在度を決定する現行の分子方法は、試料から微生物DNAを抽出し、種または他の情報を提供する16Sまたは他のDNA領域のPCR増幅を行い、次に結果として得たPCR生成物について次世代配列決定（NGS）を行うことを伴っている。元の試料内の各生物種の相対存在度は、NGSデータ内の種特異性DNA配列の相対的頻度から推測される。このタイプの解析の文献は数多くあり、そしてこの方法が多くの微生物叢の研究を支えている。
現行の方法論の問題は、異なった微生物に存在し得る異なった数の16S遺伝子、異なった微生物種からの配列が異なった率で増幅されるPCRバイアス、および異なった微生物種からの配列が異なった率で配列され得る配列決定バイアスに対して調整を行っていないことにある。その結果は、現行の方法論を使って導き出した相対存在度データの正確さに関して多くの不確実性があるということになる。
異なる生物種の集計は、単独ウェルにおける生物種の存在に基づき得る。これは、装填中にそのウェルへ分割する元の試料からの単独微生物と直接関係がある。PCR/NGSのみが、各ウェルにどんな微生物種が存在するかを識別するのに使用し得る。識別された配列の数は、計算の一部を形成していない。それ故、方法にPCR、NGSあるいは標的配列複写数変動あるいは偏りがあるかどうかは重要ではない。
複数の実施形態は、微生物叢研究、微生物産物発見および開発、医療診断、および試料内の微生物種の正確な集計が求められる他の如何なる分野にも応用され得る。
従って、複数の実施形態は、生物叢試料内各生物種の相対存在度の更に一層の正確な測定、およびこの相対存在度測定を（希釈を明らかにするおよび/または元の試料内の微生物の総数の測定と組み合わせることによって）元の試料内各生物種の絶対存在度あるいは直接集計に変換する能力を提供し得る。複数の実施形態は、微細加工高密度チップの新しい応用を（微生物の培養および選別の外に）提供し得る。
図18は、複数の実施形態に従う集計方法を説明する作業ステップ図である。ステップ1800において、試料を取得する。ステップ1802において、少なくとも１つの細胞を取得した試料から抽出する。ステップ1804において、微細加工デバイスあるいはチップの少なくとも１つの高密度マイクロウェルアレイに少なくとも１つの抽出細胞を装填する。ステップ1804は、その少なくとも1つの抽出細胞を伴う細胞濃度を用意し、少なくとも１つの栄養素/培地を選択し、および/または少なくとも1枚の膜を選択することを含んでいる。ステップ1806において、マイクロアレイの少なくとも1部分を少なくとも1枚の選択された膜で密閉してマイクロウェルに関して細胞濃度を保持する。ステップ1808において、チップを培養目的で温める。ステップ1808は、温度を選択、（例えば、好気性かあるいは嫌気性か）雰囲気の決定、および/または培養の時間調整を含んでいる。ステップ1810において、培養細胞を識別のために犠牲にする場合がある。ステップ1810は、PCR、配列決定、および/または種々のデータ解析を含んでいる。ステップ1812において、試料についての情報（例えば、微生物共同体構造）を評価および/または判定し得る。
図19は、複数の実施形態に従う集計方法を図解する一覧図である。パネル1900は、複合試料の例、具体的には微生物叢試料1902と土壌試料1904、を示している。パネル1906では、少なくとも１つの細胞が、例えば図５A および図５Bに示したプロトコルを使って複合試料から抽出されている。パネル1908では、その少なくとも１つの抽出細胞（および何らかの環境抽出物および/または希釈物）が、少なくとも１つの高密度マイクロウェルアレイ1910を備えた微細加工デバイスあるいはチップに装填されている。チップ1910と試薬カートリッジ1912が、培養器1914へ挿入され得る。試薬は、増殖に必要な栄養を維持するための液体補給および/または種々の選別目的に有用であり得る。パネル1916は出力、即ち配列および培養細胞の相対存在度、を示している。
（小液滴を用いたプラットホーム）
孤立性の小液滴を用いたプラットホームは、チップが用いられるのと殆ど同じ方法で分離、培養、およびまたは選別のために使用し得る。小液滴は、ナノあるいはピコリットル容器として機能するマイクロウェルの類似物である。小液滴生成方法は、特にチップ上細胞分類器型の計測装置と組み合わされる場合、複合環境試料から微生物を分離するために利用され得る。小液滴添加は、微生物を供給するのに利用され得る。小液滴分割は、生物試料を後に残しながらも、配列決定あるいは何か他の分解試験用に利用され得る。配列決定に必要なすべての予備作業は、小液滴方式でも同様に成され得る。
複数の実施形態は、複合環境から微生物を取り出して小液滴に入れるために利用され得る。例えば、細胞懸濁液を含む小液滴生成用モジュール式システムは、１つあるいは少数の細胞を含み得る。水性小液滴は、互いに近づかないように又いかなる表面にも触れたり汚したりしないように非混和性液体に懸濁した状態にあり得る。小液滴は各マイクロウェルにおいて、例えば30Hzで、これは言い換えると毎日数百万ということになるが、生成され得る。
液滴をベースとしたミクロ流体システムは、小液滴（例えば、約30 pL）をカプセル化、操作、および/または培養を行い得る。細胞生存および繁殖は、大容量溶液の制御実験に類似していることが注目される。小液滴は、数百Hzで生成され、これは数百万の液滴が数時間で生成され得ることを意味している。単独チップをベースとしたデバイスは、小液滴を生成する為に用いることが出来、そしてそれらの小液滴は単独細胞を含む様に設計され得る。
複数の実施形態は、小液滴内の細胞を選別するのに利用され得る。小液滴培養後の蛍光選別は、例えば1秒当たり500液滴の速度で、チップ上で行われ得る。小液滴は、多くの異なった測定用に構成された落射蛍光顕微鏡の焦点で１つのチャンネルを通して流され得る。これは、非常に小さい液滴に閉じ込められたために局所濃度が相当高いので、代謝物を対象にした選別を行う特に効果的な方法であり得る。
複数の実施形態は、小液滴を分類するために利用され得る。一旦細胞が単離され、増殖されおよび/または選別されたら、それらは、有用な試料が取り出されるように、分類され得る。小液滴は、通常用いられるFACS機構と類似のやり方で分類され得る。
複数の実施形態は、小液滴を分割する為に利用され得る。複数の実施形態は、試料を取得して、1部分は配列決定（破壊ステップ）へ送りそして生育可能な培地であるもう１つの部分は保持するために、その試料を分割する能力を必要とし得る。小液滴を分割するやり方はいろいろ数多くあり、例えば液滴が流れ続けながら分裂することになる注意深く計算された大きさを有するT型接合を構築すること、あるいはエレクトロウェッティング（高すぎる電圧を加えて細胞溶解を起こさないように注意）等を含むが、これに限定されるものではない。
複数の実施形態は、小液滴同士を合体させるおよび/または小液滴に試薬を添加するために利用され得る。例えば、細胞の長期（例えば。数週間）培養は、増殖に必要な栄養の維持のために液を加える機能を必要とする。種々の選別目的用に試薬を添加できることもまた有効であり得る。小液滴選別は、化合物コードを含む小液滴と単独細胞を含む小液滴を合体させ得ることに依拠している。そして次に小液滴は、培養されおよび/または分析チップへ戻されてそれらのコードを介して化合物を識別し得る。これは、必要に応じて小液滴同士を正確に合体させる能力を必要とし得る。
複数の実施形態は、小液滴内でPCRを行うために利用され得る。PCRは、微生物を識別する為に特異性遺伝子要素（例えば、16S領域）を最終的に配列決定する為に用いられ得る。このことは、各ウェル内でどんなタイプの微生物が増殖しているかを決定するのに使われ得る。小液滴を用いたシステムにおいて、この手法は、適正なプライマー配列が遺伝子の正しい領域を増幅するように設計されている限り各小液滴内にどんな微生物が存在するかを決定するのに用いられ得る。
複数の実施形態は、小液滴からの（例えば、PCRステップで発生した）DNAの配列決定および/またはDNAライブラリーを作成するのに利用され得る。
（高密度チップ用位置特異性タグ）
高密度マイクロウェルを備えた表面を有する高密度チップデバイスが使用され得る。微生物叢試料からの微生物は、１占有ウェル当たりほぼ１つの微生物をウェルが収容する様に希釈されて上記デバイスに塗布され得る。そのチップは、微生物がウェル内で複製され、そして結果として生じた固体群が単一の種を示す様に、培養目的で温められ得る。DNAによる位置索引作成システムは、各ウェルにどんな生物種が存在するかを決定するのに使用し得る。この索引作成システムは、ウェルを識別するアドレス指定バーコードを含む各ウェルに予め装填されたPCRプライマー、および生物種の情報を提供する特異性遺伝子要素（例えば、微生物遺伝子の16S）を対象とするプライマー配列を有することを必要とし得る。培養後に微生物DNAが放出され得て、PCRプライマーが標的バクテリアDNA領域を増幅でき、そしてチップ上の様々なウェルからの増幅産物が貯留され得て、次に次世代配列決定法によって解読される。
上記の位置索引作成システムは、マイクロチップ上の各ウェルに対して異なった位置コードを組み込むことを伴い得る、言い換えると所定数のウェルをコード化するのに必要なコードの総数が減じられる様に各ウェルに複合位置コードを組み込み得る。例えば、ある１つのチップに100のウェルがあるとすると、１ウェルに付き１つのコードである場合、100のコードが必要とされる。各ウェルから２つのコードが解読されたとすると、同じチップは20コードだけでコード化（即ち、グリッドのｘ軸に対して10のコード化、ｙ軸に対して10のコード化）ができることになる。
１ウェル当たり２コードを組み込むPCR戦略の１例を表２に示す。
Figure 2018515133
１ウェル当たり３コードを組み込むPCR戦略の１例を表３に示す。
Figure 2018515133
３つのオリゴプライマーが、単独PCR生成物を作るのに用いられる。分子の１つの末端に多くの部分からなるバーコードを装着するために２つのオリゴを使うこのシステムの利点は、例えば必要とされるオリゴの最大長さを減じることあるいは格別長いバーコードを作ること、を含み得る。
この手法は、１反応に付きｎ個のバーコード組込みに一般化できる。手法はまた、標的配列領域の同じ側に幾つものバーコードがあるようないろいろな実施状況を含むこともできる。NGS配列決定アダプターが加えられて、バーコード化されたPCR生成物の個体群に対する全配列が、次世代配列決定法によって解読され得る。
別の実施状況において、固定コードが試料番号あるいはプレート番号を識別する為に加えることができ、そして表４に示されるような２つのバーコードに向けての1行程において複合試料/プレートの貯留を可能にし得る。
Figure 2018515133
さらなる実施状況において、固定コードが試料番号あるいはプレート番号を識別する為に加えることができ、そして表５に示されるような３つのバーコードに向けての1行程において複合試料/プレートの貯留を可能にし得る。
Figure 2018515133
全ての場合において配列内のコードの位置が情報を伝えているので、従ってコード１、コード２およびコード３のバーコードは必ずしも個々のウェル内で互いに異なっている必要はない。
単独コードのコード化システムを使って幾つものオリゴの作成をすることおよび幾つものチップを印刷することは高コストである。例えば、10,000ウェルチップは、チップ上のウェル中にバーコードを配置するのに10,000の単独バーコードと独立した印刷を10,000回繰り返すことを必要とする。2コードシステムを用いる場合、それらチップを製造するのに印刷をただ200回繰り返すとすると僅か200のバーコードが場合によっては必要とされるにすぎない。このことは、オリゴ費用、印刷時間および印刷資本投資の大幅な節約を意味する。
デュアルバーコード化PCRプライマーの使用の後で増幅と配列決定解析を行って、微細加工チップ上へ無作為に分割された部分を含有するDNAあるいはRNAに関する位置データを得ることは、高い有用性と比較的低いコストを持ち得る。
図20は、複数の実施形態に従う索引作成システムを説明する一覧図である。マイクロウェル2000は、N個の横列とM個の縦列を有し、それによってN×M個の特有指標を生成する。チップ2000内マイクロウェルの位置は、座標（N、M）を有すると考え得る。各縦列は共通の逆方向プライマー配列（例えば、R1、R2、R3、...RM）を有し、並びに各横列は共通の順方向プライマー配列（例えば、F1、F2、F3、...FN）を有する。例えば16Sリボソームリボ核酸 (rRNA)内のある特定の遺伝子要素を対象とした特異タグは、順方向プライマー配列F515並びに逆方向プライマー配列R806を含み得る。チップ2000のPCRに続き、標的遺伝子要素の存在が、順方向プライマー配列と逆方向プライマー配列の存在に基づく元の特有マイクロウェルにマッピングし戻すことができる。例えば、F515とR806の存在が、チップ2000内で座標（515、806）を有するマイクロウェルへ ユーザを導く。
（バクテリア含有マイクロウェル全体にわたるPCR増幅生成物に対する変動性低減）
DNAによる位置索引作成システムは、各ウェルにどんな生物種が存在するかを決定するのに使用され得る。この索引作成システムは、ウェルを識別するアドレス指定バーコードを含む各ウェルに予め装填されたPCRプライマー、および生物種の情報を提供する微生物遺伝子内の特異性遺伝子要素（例えば、16S）を標的とするプライマー配列を有することを要し得る。培養後に微生物DNAが放出されて、PCRプライマーが標的バクテリアDNA領域を増幅し、そしてチップ上の様々なウェルからの増幅産物が貯留され、そして次世代配列決定法によって解読され得る。
ウェル全体にわたるPCR生成物の量の変動を制限するための複数の実施形態は、予想される試料DNA濃度の大部分に対してPCRプライマーの量がDNA増幅反応において制限的であるように、チップの製造中にウェル内PCRプライマー量の制限を組み込むことができ、従ってPCR生成物の生成量がウェル全体にわたってそれほど変わり易くは無いことになる。
ウェル全体にわたるPCR生成物の量の変動を制限するための複数の実施形態は、PCR生成物の生成量がウェル全体にわたって、全サイクルPCR増幅プロトコルと対比して、変動がより少ないように、チップ上のPCRサイクル数を３サイクル未満、あるいは５サイクル未満、あるいは10サイクル未満、あるいは15サイクル未満、あるいは20サイクル未満、あるいは25サイクル未満、あるいは30サイクル未満に制限することを含み得る。
ウェル全体にわたるPCR生成物の量の変動を制限するための複数の実施形態は、PCR増幅産物の生成数が元の試料内のDNA量よりもヌクレオチド量により関連するように、反応混合物中のヌクレオチド量を制限することを含み得る。大量の標的DNAを有するマイクロウェルは、サイクリングステップの初期にヌクレオチドを使い尽くすのに対して、少量の標的DNAを有するマイクロウェルはサイクリングステップの後の方でヌクレオチドを使い尽くすが、ほぼ同じ量の増幅生成物を生成する。
ウェル全体にわたるPCR生成物の量の変動を制限するための複数の実施形態は、培地が使い尽くされて複製を停止するまで細胞が自己複製をするように、ウェル内で増殖する微生物に利用可能な栄養素の量を制限することを含み得る。
ウェル全体にわたるPCR生成物の量の変動を制限するための複数の実施形態は、PCR生成物がより多く生成されるにつれて信号がより輝くようにPCR生成物を識別する染料を各ウェルに配置することを含み得る。各PCRサイクル中に染料輝度を計測管理して、一旦望みの信号強度を観測したらそのウェルから試料を取り出すことができる。
ウェル全体にわたるPCR生成物の量の変動を制限するための複数の実施形態は、各ウェルからの増幅DNAを選択的に混成化する為に各ウェルに特異的なバーコードに補完的なオリゴで覆った混成物作成ビーズの混合物を用いることを含み得る。いったんビーズが飽和したなら、未結合DNAを洗い流し、結合DNAをビーズから解放する。次に、各ウェルからのDNAの量をビーズの飽和限界で正規化する。
ウェル全体にわたるPCR生成物の量の変動を制限するための複数の実施形態は、速く増殖する微生物は急速にウェルを満たして複製を止め、より遅く増殖する微生物は徐々にウェルを満たし、もしほぼ同じ数の細胞がウェル内にあるようになれば増殖を止めるように長期間にわたってチップを培養目的で温めることを含み得る。
複数の実施形態において、チップ形式と方法の状況内でのバーコード化プライマーおよび次世代配列決定法（NGS）の使用は、どの生物種が高密度マイクロチップ上のどのウェル内で増殖しているかを識別するのに利用され得る。ほぼ同数のバクテリアがチップ内の各マイクロウェルを占める時、NGSデータの各ウェルからの信号は殆ど同じであり得る。
例えば、1千２百万の配列読み取りを生じる典型的NGSの実行において、各々が10,000のマイクロウェルを有する24チップがその実行において配列決定され、１ウェル当たり同数のバクテリアがいるとすると、１ウェル当たり平均して50読み取りがあることになる。
しかしながら、異なるバクテリアが異なる速度で増殖すると、複数のウェルは少数のバクテリアを有し、複数のウェルは多数のバクテリアを有することになる。これは、少数のバクテリアを有するウェルがNGS分析では検出されないほどにNGSの実行をともすれば歪めてしまう。
こういう訳で、1千2百万の配列読み取りを生じる典型的NGSの実行例において、各チップが10,000のマイクロウェルを有し、それらのマイクロウェルの半分は他の半分の100倍多いバクテリアをその中に有する24のチップが１実行に付き配列決定されるとする。ゆっくりと増殖するウェル内のバクテリアが検出される確率は著しく低下する。この場合、
(10,000ｘ24)/2ｘ100 = 12,000,000
(10,000ｘ24)/2 = 120,000
低頻度ウェルは、全体の１％に相当している。こうして、NGSの1実行においての12,000,000の読み取りの中で、120,000が低頻度ウェルから、即ち１ウェル当たり平均１読み取り、である。
この現象の衝撃を最小化するために、NGS実行において全てのウェルが検出されるようにウェル全体に亘ってPCR生成物量を均一化するのを助ける新しい方法が開発される必要がある。
（微生物の単離、増殖、選別および解析用シリコンをベースとしたマイクロウェルチップ）
微細加工デバイスあるいはチップは、ウェル毎の電気的測定を考慮して、プラスチック、ガラスおよび/またはポリマーの代わりまたはそれらに加えて、少なくとも一部がシリコンで構成され得る。例えば、各ウェルの壁面は、マイクロコンデンサを創り出すために絶縁される。別の例では、各ウェル内のFETが、ゲート表面がウェル内容物に曝されるように絶縁され得る。純粋にシリコンだけを用いるチップの代わりに、メッキ、蒸着、および/またはアーク/火炎噴霧によって既存のチップの最上面に金属薄層が生成されてもよい。これにより、より多くの機能性の追加、より安価および/またはよりクリーンな代替製造方法の利用、および/または手持ち式および/または携帯型のデバイスの小型軽量化を見込み得る。
複数の実施形態は、電気的測定によって増殖を計測管理する場合を考慮し得る。インピーダンスの定期的測定は、微生物（例えば、バクテリア）増殖の測定に適用され得る。例えば、大腸菌（E. coli）を収容する管の両端のインピーダンスは、Ur等、“Impedance Monitoring of Bacterial Activity”、8:1 J. Med. Microbiology 19-28 (1975) においてその管の細胞数にたとえられている。そしてこの論文はここにおいての参照によりその全文が本発明の明細書に組み込まれる。この効果が一般的であることを証明するために、ジュードモナス、クレブシエラおよび連鎖球菌を含む他のタイプのバクテリアに関して測定を行ってよい。異なった配合物全体に亘って増殖条件をテストする為に、ウェルが異なった培地で満たされてもよい。
複数の実施形態は、電気的測定による選別を見込み得る。電気的測定は、選別を見込むウェル毎になされ得る。1例は、pHであった。ISFETやpHメータ等を含むウェル内デバイスのゲートからpH依存性の応答を得るための多数の様々なやり方がある。埋め込みpHセンサを備えたウェルアレイは、酸性あるいは塩基性の代謝物を生成する微生物をどのウェルが含有するかを電気的に決定しうる。単純な例は、ラクトースからの乳酸生成を対象とした検査である。バクテリアは希釈されてウェル中へ分配され、増殖され、そして次にラクトースを供給される。pHの低下を記録するウェルは、ラクトースを乳酸に分解できる微生物を含んでいる。
複数の実施形態は、酸化還元プローブの電気測定を見込み得る。電気測定に影響を及ぼすもう一つの方法は、ウェル内のバクテリアが如何にして既知の酸化還元プローブに影響するかを見ることにある。基本的には、定義が明確な応答を有するシステムは、バクテリアの存在下で測定出来、予想された挙動からの逸脱はバクテリア試料に帰せられ得る。典型的な酸化還元プローブは、フェリシアン化物、[Fe(CN)6]3-/4-、に似た何かである。フェリシアン化物のフェロシアン化物への還元は、特に電極からの電子移動周辺の小さな挙動変化が見出し可能なものとして非常によく特徴づけられる。このシステムは、バクテリア自身を直接変更する必要なく検出できるので、「ラベル無し」である。
微生物（例えば、大腸菌）の認識が可能な抗体を、ITO電極に固定化し得る。電極からフェリシアン化物含有溶液への電子移動抵抗を測定し得る。電極表面に結合している大腸菌は、表面上の大腸菌濃度に比例して上記抵抗を増加させる。このことは、酸化還元プローブを使って特異型の有機体あるいは代謝産物を検出せしめる得る一群の測定の一例である。
シリコン（あるいは少なくとも金属または金属被覆プラスチック）に備わる働きは、（例えば、既存技術への便乗による）より廉価なチップ生産、小型および/または携帯版を可能にする総合検出能力、他の材料（例えば、LCR、CV等）には無い更なる測定能力、新しく見出されたチップによる検出様式の既存デバイスへの統合、電気測定と配列決定の組み合わせ等を含むいろいろな長所を提供する。これらの長所は、干渉計による検出法を用いるあらゆる顧客に恩恵をもたらすことになる。
（チップ上のウェル特異的化学作用物質を保護する剥離可能障壁）
図21A〜図21Eは、複数の実施形態に従うウェル特異的化学作用物質を有するチップを示す一覧図である。図21Aには、微細加工で作られ、複数のマイクロウェルを有するデバイスあるいはチップが示されている。図21Bでは、マイクロウェル特異的化学作用物質が、チップ上の各マイクロウェルに割り振られている。図21Cでは、チップの各マイクロウェル内のマイクロウェル特異的化学作用物質上を封止剤が覆っており、それによってウェルへの更なる添加物とのそれら化学作用物質の相互作用を阻止している。図21Dでは、試料が充填され、そしてマクロウェル内の試料に対して実験が行われる。図21Eでは、トリガー（例えば、熱）により、マイクロウェル特異的化学作用物質がウェル内試料との相互作用のために解放される。
マイクロウェルチップが製造され、洗浄されおよび/またはそれらの表面が処理される。特異的化学作用物質は別途に調製され、次に、例えば1組の特異的化学物質が特定の１つのウェル（あるいは複数のウェル）への誘導を可能にする方法および/または機器を使って、ウェル内に入れられる。その後すぐに、種々の化学作用物質を環境からおよび/または何らかの限定的外部トリガーによる除去、放出および/また妨害から守るために封止剤を施し得る。
微細加工デバイスあるいはチップは、特定のデザインで製造され、例えば洗浄されおよび/または濡れを高めるために表面処理が施され得る。PCRプライマーを特定ウェルへ印刷するあるいはピンで点在させ得る。チップを乾燥させてよく、その後ワックス層をエタノール溶液の蒸発によって沈積させ得る。最適濃度は約1% v/vである。溶融ワックスが直接塗布されても、あるいはワックスの水溶液あるいはアルコール溶液が噴霧されてもよい。別法として、スピンコーティングあるいは蒸着法が使われてもよい。種々のワックスが使用可能であり、それらの例としてポリエチレングリコールを含むあるいは含まないステアリン酸グリセリル、セテアリルアルコール、１−ヘキサデカノール、ステアリン酸グリセリルエステル、セテアレス−20（CAS登録No. 68439-49-6）、およびLotionproTM 165 (Lotioncrafter(登録商標)、イーストサウンド、ワシントン、から入手可能) および PolawaxTM (Croda, Inc.、エジソン、ニュージャージー、から入手可能) 等の複数の市販製品等が挙げられる。下に横たわる化学作用物質は、例えばワックスが溶ける迄に加熱されることによって、後で放出され得る。これらの組成物に対して、加熱は50℃と70℃の間である。加熱温度は、どの化学成分にも損傷を与えずあるいは我々の水性溶液を沸騰させないために十分低いことが重要である。
重要な概念には、実験者がトリガーを解除するまでチップと仕切られているウェル特異的化学作用物質がある。この方法は、ウェル内でのバーコード化に用いられ得るが、より広く別の問題の全般にわたっても適用され得る。チップ上での封止に役立つ種々の化学作用物質は、抗生物質、蛍光物質、染料、PCRプライマー、溶解促進剤、抗体、色々の代謝生成物用試薬等を含むが、これらに限定されるものではない。ワックスは加熱によって後で放出され得る物を封止するのに良い手段ではあるが、露光、音波処理および/または何か他のトリガーに対しての封止および解除に他の物質が使われてもよい。チップに試薬を単に添加することに比べてこの方が優位である点は、ウェル毎に制御することにある。同様な効果が、微生物試験を行った後でウェルに化学作用物質を印刷することによっても達成されるかもしれないのだが、これは時間の問題（印刷ステップが1日掛りであり得る）および、もし微生物がチップ上に存在した後で各ウェルが個々に塞がれるとするならば、全てのウェルを同じ時間量で作用を受けさせることは不可能であるという事実問題を持ち込むことになる。解除機構をもってすれば、どのウェルもみな同時に作用を受けることができる。1つの例では、ワックスを溶媒流し込みによってチップ上へ付着させ得る。
（簡単および/または相対存在度制御用隔離マイクロウェル）
高密度チップデバイスは、高密度マイクロウェルを有する表面を備え得る。微生物叢試料からの微生物、あるいは他の細胞種は、１占有ウェル当たり略１つの微生物あるいは細胞をウェルが収容するように希釈されてデバイスに塗布され得る。これらのマイクロウェルは、栄養素のマイクロウェルへの拡散を可能にするが微生物あるいは細胞の全てあるいは少なくとも幾つかがマイクロウェルから外へ移動するのを防ぐ半透過膜で封じられ得る。
微生物あるいは細胞の試料は調製され、次に不透過性あるいは気体のみを透過する膜を使ってチップ中へ封じ込まれ得る。如何なる液体貯留層もチップ上部あるいは膜上に置かれないので、封止時のウェル内栄養素のみがマイクロウェルに於ける微生物あるいは細胞の増殖を助けるために利用可能である。この特徴についての２つの根拠として、（１）構造およびデバイスとしての作業流れの単純さが半透過性膜あるいは貯留層を有することを必要とせず、栄養素を添加しなければならないことは無く、且つ汚染の恐れが少ないこと、並びに（２）栄養素の入手を制限することによって早成生物の相対存在度を抑えることが挙げられる。複数の早成生物と複数の晩成生物を含む試料については、早成生物はそれらのマイクロウェル内で速やかに供給源限界になり生長が止まるかあるいは遅くなるが、一方晩成生物は増殖し続ける。この事が、早成生物の栄養素量に制限がない場合に比べて、チップ全般にわたる微生物の個体群の中でより高い相対存在度で晩成生物が示されるようにしている。これは、チップ上の全ての配列決定時の下流処理にとって重要になる。それは又、希少種の増殖がそれらの検出用システムの性能を制限する点にまで早成種によってより速められることがないので、希少種に対しより良い検出限界を提供する。
現行の方法は、本来早成種あるいは晩成種であるかに関わらず全ての生物種を増殖せしめるよう試みている。このことは、早成種が共同体を席巻し、時間と共に相対存在度を高めるだけという必然的結果を生む。配列決定あるいは蛍光選別のような川下解析の多くのタイプは、所定固体郡の中の或る限定相対存在度を上回る生物種以外のすべての生物種を分析ができない。目標が多様性を保持して希少種を検出することであれば、その時には何らかの方法で早成種が制限される必要がある。
この考えを論証する1例として、２つの生物種を含む試料の単純な実例、即ち表６に示す様に、１つの生物種は毎日倍増し、もう一つの生物種は1週間毎に倍増するものとする、を考察する。晩成種が初めは相対存在度が5％と希少であるとすると、両生物種が増殖するにつれてそれは直ぐに非常に希少となる。
Figure 2018515133
Figure 2018515133
 （バイオバンク細胞用高密度微細加工アレイ）
バイオバンクは、例えば疾患関連の生物標識発見のような或るタイプの研究を推進する為に大きな個体群から多数の試料を研究者が入手する道を開くように設計されている。ビイオバンキングにおける技術の現状は、管あるいは、例えば96-ウェルまたは384-ウェルプレートのような、低密度プレート形態に保管すべき試料に備えている。これは、仕込まれるべき試料の数が比較的小さく且つ試料自体が離散、孤立性の固体群である時に機能する。バイオバンキングへの既存の取り組み方では、微生物試料のような試料を保管する時に複雑で非能率的となり、そこでは試料の数が多い場合があり、各試料内の異なる種または変種の数が１試料当たり数百から数千あるいは数百万に及ぶ場合もある。既存の方法を使うとすると、所望の種あるいは変種を入手するために保管ステップに先立つあるいは後に続くかのいずれかで個々の種あるいは変種を分離するために骨の折れる隔離プロトコルが実施されなければならない。
ここに記述するシステム、キット、装置および方法論は、バイオバンク細胞、微生物、ウイルスおよび他の生物学的存在に適用し得る。高密度マイクロウェルを有する表面を備える高密度チップデバイスは、1チップ当たり数千、数十万あるいは数百万のマイクロウェルを有し得る。例えば、微生物叢試料からの微生物（または異なったタイプの細胞あるいはウイルスのような他の生物学的存在）が希釈されて、ウェルが微生物を１占有ウェル当たり略１つ収容するようにデバイスへ塗布される。そして次に、微生物がウェル内で複製されて結果として生じた個体群が単一の種であるように、チップが温められる。各ウェルにどんな種が存在するかを決定するために、核酸による位置指標付けシステムを利用し得る。この指標付けシステムは、各ウェルが予め装填するPCRプライマーを有することを必要とし得る。それらのPCRプライマーは、ウェルを識別する番地付けバーコードおよび種情報を提供あるいは所望の遺伝子配列を標的にする微生物遺伝子の特異性遺伝要素（例えば、16S）を対象にしたプライマー配列を含有し得る。培養後に、微生物DNAが放出され、そしてPCRプライマーが標的バクテリアDNA領域を増幅する。チップ上の種々のウェルからの増幅産物が貯留されて、その後に次世代配列決定法によって解読され得る。
バイオバンキング用高密度微細加工チップの使用は、保管前あるいは保管後のいずれかで骨の折れる隔離プロトコルを実行することを必要とせずに別々の個体群として保管される各試料内の多数の種あるいは変種に備えている。DNAによる位置指標付けシステムあるいは特定用途向け試験法の使用は、各マイクロウェルの内容物の遺伝標識あるいは特性の識別へのより平易な一般的取り組みを可能にして、例えば種の情報のような、情報を与える。その上、チップデバイスは、細胞隔離集団を保管する極めて空間効率の大きい方法に備えている。例えば、100,000のウェルを備えた単式顕微鏡スライド寸法のチップは、対応する従来の保管形態よりも大幅に小さな空間を占める。チップ形式はまた、単一対象物からの多くの異なった試料を1つのチップに収容させることによって、試料を適切に記録保存して管理するおよび/または被験者（例えば、患者）情報のデータベースを取り扱うために有用であり得る。
この装置を使って細胞を列状に並べるために、細胞を装置のマイクロウェルに配置および/または位置付けし得る。マイクロウェル内の細胞を、保管の影響を改善するように処理してから適切な保管条件に置き得る。例えば、細胞をグリセロールのような薬剤で処理して凍結の影響を改善し得る。次にチップを、冷凍庫のような適切な保管条件下に置き得る。細胞を脱水、凍結乾燥および/または真空凍結乾燥してよく、且つチップを乾燥細胞防護のための適切な条件下に置き得る。保管デバイスとしての有用性を更に高めるために追加の構造物がチップに加えられてよい。例えば、膜あるいは他の構造部品をチップの上面に配置して保管に先立ってウェルの少なくとも幾つかを封じてよい。
チップは、チップ上のマイクロウェルの1部分の各々が略１つの細胞で占められる様に、細胞を装填され得る。チップは、細胞の複製を見越して温められる。チップは複製がつくられ、元のチップあるいは複製チップのいずれかがチップの各ウェルに存在する細胞あるいは生物種あるいは遺伝子標識を（例えば、上記した位置索引付けシステムを使って）識別するために用いられる。そのチップを、適切な条件で処理および/または保管し得る。複製ステップおよび/または識別ステップは、保管前よりは保管後に行われてよい。
予め存在する単離菌株ひと組の各菌株からの１つ以上の細胞が、チップ上の別々のマイクロウェルに配置され得る。各菌株あるいは細胞タイプのものが配置されているマイクロウェルの位置が記録され、そしてそのチップは適切な条件で処理およびまたは保管され得る。
各ウェル内のワックス障壁の真下に保存の化学作用が隔離されている１種のチップを創り得る。単離物はチップ内部に封印されて増殖でき、次にバンキング前に保存剤の熱誘発放出によって後日から保護され得る。
その様な装置は、土壌、人の腸、海水、口腔、皮膚等からの微生物群系試料の様な混合微生物群系試料を保管/バイオバンクするために使用しうる。チップは、菌類、古細菌、人の細胞（生殖細胞を含む）、動物細胞およびウイルスの様な別タイプの生物学的存在を保管するために使用し得る。
DNA位置標識付けシステムは、各ウェルの内容物に関する情報をあらゆる種類の生物学的存在にわたって作成するために使用できる。チップ全体を、抗体あるいは基材による分析のように特化された分析法を使って所望の活性について検査し得る。例えば、T細胞のバンク個体群を備えるチップを獲得免疫活性について検査し得る。
説明に役立つ１つの例では、人の糞便微生物叢試料を研究参加者から集める場合がある。個々人の糞便微生物が、後日に標的微生物の供給源として使用するための微生物叢の試料としてだけでなくその個人の微生物叢の記録を維持するためにチップ上にバイオバンクされ得る。別の例では、臨床あるいは調査研究中にあるいは治療のワークフロー（例えば、生体外で処理した細胞を用いる治療）の一部としてT細胞あるいは他の獲得免疫細胞の混合個体群のサンプルを個々人から取って調べる場合がある。更に別の例では、土壌生物群系が種子バンキングと協力して保管される場合がある。
（高分解能採取）
高度に正確/精密な採取装置あるいはシステムを、上述した微細加工チップ上のマイクロウェルからのおよび/またはマイクロウェルに対しての色々な採取機能を実行するように設計し得る。標的基材あるいはチップは、１つの表面に射出成形された機構を有する顕微鏡スライド型（約25ｍｍｘ75mmｘ1mm）であり得る。マイクロウェルを、チップの辺の周りに約4〜8ｍｍのウェル無し縁端部を有する格子模様に配列し得る。ウェルの大きさと間隔は、採取器の性能に基づいて決めることが出来る。マイクロウェルは、各辺に沿った寸法が約25μｍから約200μｍの正方形であってよく、ウェル端とウェル端の間に約25μｍから約100μｍの間隔を設け得る。マイクロウェルは代わりに円形であっても、六角形であってもよい。ウェルの深さは、約25μｍから約100μｍであってよい。例えば、7mmの縁端部、ウェル端間に100ミクロンの間隔を有する100μｍ角のウェルを有する75mmｘ25mmのスライドは、約16,775のマイクロウェルを有することになる。
高度に正確/精密な採取システムを、上述したような微細加工チップ上のマイクロウェルに対応する膜の一部からのおよび/またはその膜の一部に対しての色々な採取機能を実行するように設計し得る。膜は、増殖バクテリアをマイクロウェルへ封入するために既に使っていた薄いシートであってもよい。チップから剥がされる時、膜はチップからの分離後にその表面にバクテリア試料ばかりでなくマイクロウェルアレイの圧痕を保持し得る。こうして、剥離膜はチップで増殖したバクテリアの複製として機能し得る。
高分解能採取器は、ユーザからのデータ入力を受け取ることができる。その入力は、少なくとも1対のチップマイクロウェル座標を含んでおり、従って採取器は少なくとも１つの入力対の座標からおよび/または少なくとも１つの入力対の座標に対して採取し得る。機械的な殺菌作業がサイクルとサイクルの間に行われ得る。高分解能採取器は、嫌気性室内で操作可能であってよい。
高分解能採取器システムはチップを受け取り、例えば基準標識および/または参照ウェルを使って、採取器をチップに合わせることができる。採取器は、例えばチップ上のマイクロウェルで増殖した細胞を、例えば培養培地を含有する96−ウェルあるいは384−ウェルのプレート中へ採取し得る。採取器は、単一採取ピンあるいは複数の採取ピンを含み得る。
高分解能採取器システムは膜を受け取り、例えば膜上の参照ウェル標識を使って、採取器を膜に合わせ得る。採取器は、例えば膜からの細胞を、例えば培養培地を含有する96−ウェルあるいは384−ウェルのプレート中へ採取し得る。採取ピンは、いろいろな形（例えば、キノコ形）および/または膜からの採取用表面（例えば、肌理）を有し得る。システムはまた、膜を保持および/または平らにするための１つ以上の機構（例えば、浮ピンおよび/または真空）を含み得る。
高分解能採取器システムは、チップ間移動を介してチップの複製を可能にし得る。採取器は、基準標識および/または参照ウェルに基づいて第１のチップを受け取って位置合わせをし得る。採取器はまた、基準標識および/または参照ウェルに基づいて第2のチップを受け取って位置合わせをし得る。採取器は、例えば第１チップ上のマイクロウェルで増殖した細胞を第2チップ上のマイクロウェルへ移し得る。
微細加工デバイスで培養された少なくとも１つの生物学的実体の複数生物種の中の標的種を自動的に採取するためのハイスループットシステムは、その微細加工デバイスを受け入れるポートを含み得る。微細加工デバイスは、マイクロウェルの高密度アレイを画定する。マイクロウェルの高密度アレイの各マイクロウェルは、少なくとも１つの生物学的実体の少なくとも１つの生物種を単離し培養するように構成され且つ複数の特異タグの中の少なくとも1つを含んでいる。複数の特異タグの各タグは核酸分子を含み、その核酸分子はその少なくとも1つの生物学的実体にアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列並びにマイクロウェルの高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルと相関関係にある位置特異性ヌクレオチド配列を含むものとする。当システムはまた、マイクロウェルの高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルから少なくとも１つの生物学的実体を採取するための少なくとも１つの突起物を備えた高分解能採取装置を組み込んでいる。当システムは更に、少なくとも１つの標的特異性ヌクレオチド配列の表示を受け取るための入力デバイス並びに入力デバイスおよび高分解能採取装置と通信可能に接続する少なくとも１つの処理装置を組み込んでいる。その少なくとも１つの処理装置は、入力デバイスから少なくとも１つの標的特異性ヌクレオチド配列を取得し、その少なくとも１つの標的特異性ヌクレオチド配列を複数の特異タグと比較し、その比較に基づいて高密度マクロウェルアレイの中の標的種を含む少なくとも１つのマイクロウェルを決定し、そしてマクロウェルの高密度アレイの中の少なくとも１つの決定されたマイクロウェルから少なくとも１つの生物学的実体を採取するように高分解能採取装置を制御する。
ハイスループットシステムは、微細加工デバイスで培養された少なくとも１つの生物学的実体の複数の生物種の中の標的種を自動的に採取するために開示されている。その微細加工デバイスは、マイクロウェルの高密度アレイを画定し、そのマイクロウェル高密度アレイの各マイクロウェルは、複数の特有プライマーの中の少なくとも１つの特有プライマーと対応付けられている。当システムは、微細加工デバイスから取り除かれた膜を受け入れるポートを含んでおり、その膜はマイクロウェルの高密度アレイ内に少なくとも１つの生物学的実体を保持するためにマイクロウェルの高密度アレイの各マイクロウェルを密封していたので、マイクロウェルの高密度アレイに対応する少なくとも１つの生物学的実体の一部が膜除去後の膜に付着して残っている。当システムはまた、マイクロウェルの高密度アレイの少なくとも1つのマイクロウェルに対応する少なくとも１つの膜位置から少なくとも１つの生物学的実体を採取するための少なくとも１つの突起物を含む高分解能採取装置、標的種と対応付けられる少なくとも１つの標的特異性ヌクレオチド配列の表示を受け取る入力デバイス、および入力デバイスおよび高分解能採取装置と通信可能に接続する少なくとも１つの処理装置を組み込んでいる。少なくとも１つの処理装置は、入力デバイスから少なくとも１つの標的特異性ヌクレオチド配列表示を獲 得し、少なくとも１つの標的特異性ヌクレオチド配列を複数の特異タグと比較し、その比較にもとづいて標的種を有するマイクロウェルの高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに対応する少なくとも１つの膜位置を決定し、そしてその少なくとも１つの決定した膜位置から少なくとも１つの生物学的実体の一部を採取するように高分解能採取装置を制御する。
上記の実施形態は、非常に多くの方法のいずれにおいても実現することができる。例えば、実施形態をハードウエア、ソフトウェアあるいはそれらの組み合わせを用いて実現しうる。ソフトウェアでの実現の場合、ソフトウェアコードが、単独のコンピュータに設けられようと多数のコンピュータに分配されようと、全ての適切な処理装置あるいは処理装置の集合体上で実行され得る。
その上、コンピュータは、パーソナルデジタルアシスタント（PDA）、スマートフォンあるいは適切な他のすべての携帯あるいは固定の電子機器を含む一般にはコンピュータと見做されないが適切な処理能力を有するデバイスで具現化され得る。
更にまた、コンピュータは１つ以上の入力および出力デバイスを有し得る。これらのデバイスは、とりわけユーザインターフェイスを提供するために用いることが出来る。ユーザインターフェイスを提供する為に用い得る出力デバイスの例は、出力の視覚提示用のプリンターあるいは表示スクリーンおよび出力の可聴提示用のスピーカあるいは他の音声発生デバイスを含む。ユーザインターフェイス用に使うことの出来る入力デバイスの例は、キイボードおよび例えばマウス、タッチパッドやデジタル化タブレットのような位置決めデバイスを含む。もう１つの例として、コンピュータは会話認識あるいは他の聴音方式を介して入力情報を受け取り得る。
そのようなコンピュータ類は、例えば企業通信網およびインテリジェントネットワーク（IN）またはインターネットのような、域内情報通信網あるいは広域情報通信網を含むあらゆる適切な形の１つ以上の情報通信網によって相互接続され得る。そのような情報通信網は、適切な如何なる科学技術にも基づかせることが出来、好適な如何なるプロトコルにも従って稼働させることができ、且つ無線通信網、有線通信網あるいは光ファイバー通信網を含み得る。
ここに概略を記した種々の方法またはステップは、様々な操作システムあるいはプラットホームのどれか１つを用いる１つ以上の処理装置上で実行可能なソフトウェアとして符号化できる。それに加えて、そのようなソフトウェアは、数多くの好適なプログラム作成言語および/またはプログラム作成あるいはスクリプト作成手段を使って書き込みが出来、且つ枠組みあるいは仮想機械上で実行される実行可能な機械言語コードあるいは中間コードとして変換もされ得る。
（更なる実施例）
微細加工デバイスは、一連の機能層を備えた基材を含み得る。一連の機能層は、実験ユニット（例えばウェル）の第１アレイを画定する第１機能層および先行機能層の各実験ユニット内に実験ユニット（例えばマイクロウェル）の次のアレイ画定する少なくとも１つの次の機能層を含んでいる。実験ユニットの各々は、少なくとも１つの細胞を受け取って培養し、少なくとも１回の選別、およびまたは少なくとも１つの栄養素を試験するように構成され得る。
ある１つの実施形態では、細胞の母材に対するいろいろな条件を選別するための装置は基材を組み込んでいる。基材には第１の表面が伴う。その表面は、ウェルの第１アレイを画定する。各ウェルには、内部表面が伴う。各内部表面は、マイクロウェルの第２アレイを画定する。各マイクロウェルは、少なくとも１つの細胞を受け取って培養するように構成される。
ある１つの実施形態では、細胞の母体に対するいろいろな条件を選別するための装置は、一連の機能層を備えた基材を組み込んでいる。一連の機能層は、実験ユニットの第１アレイを画定する第１機能層および先行機能層の各実験ユニット内に実験ユニットの次のアレイ画定する少なくとも１つの次の機能層を含んでいる。実験ユニットの各々は、少なくとも１つの細胞を受け取って培養するように構成される。
ある１つの実施形態には、第１の表面を含む基材に細胞を隔離するための１方法が開示されている。第１の表面は、実験ユニットの第１のアレイを画定する。各実験ユニットは、少なくとも１つの細胞を受け取るように構成される。各実験ユニットの少なくとも１部分は、細胞を引き付けおよび/または実験ユニットを占有する傾向を増大させる第１の表面特性を伴った状態で構成される。一方あるいは加えて、第１の表面の少なくとも１部分は、細胞を寄せ付けないおよびまたは第１の表面に細胞が固着する傾向を減じる第２の表面特性を伴った状態で構成され得る。当方法はまた、少なくとも１つの細胞が少なくとも１つの実験ユニットを占めるように細胞を含む組成物を第１の表面に塗布することも含んでいる。
ある１つの実施形態では、基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、基材の第１の表面に採取デバイスを接触させることによって少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を取って調べることを含む。そのデバイスは、第１の表面に面する少なくとも１つの突起物を組み込んでいる。その少なくとも１つの突起物は、各マイクロウェルの開口直径よりも小さな直径を有する。その少なくとも１つの突起物は、少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の一部がその少なくとも１つの突起物に接着および/または付着するように、細胞の個体群を保持するその少なくとも１つのマイクロウェルに挿入される。当方法はまた、少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の一部分が少なくとも１つの突起物に粘着および/または付着して残るようにデバイスを基材の第１の表面から取り除くことによってその少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を回収することをも含む。
ある１つの実施形態では、基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、基材の第１の表面に採取デバイスを接触させることによって少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の試料を取って調べることを含む。そのデバイスは、第１の表面に面する少なくとも１つの突起物を組み込んでいる。その少なくとも１つの突起物は、各マイクロウェルの開口直径よりも小さな直径を有する。その少なくとも１つの突起物は、少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の一部がその少なくとも１つの突起物に接着および/または付着するように、細胞の個体群を保持するその少なくとも１つの実験ユニットに挿入される。当方法はまた、少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の一部分が少なくとも１つの突起物に粘着および/または付着して残るようにデバイスを基材の第１の表面から取り除くことによってその少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の試料を回収することをも含む。
ある１つの実施形態では、マイクロウェルの第１アレイを画定する第１の表面とその第１の表面と向き合う第２の表面を含む基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、基材の第２の表面に採取デバイスを接触させることを含む。そのデバイスは、第２の表面に向き合う少なくとも１つの突起物を組み込んでいる。その少なくとも１つの突起物は、各マイクロウェルの直径に略等しいかあるいはより小さい直径を有している。その少なくとも１つの突起物は、細胞の個体群を保持する少なくとも１つのマイクロウェルに対応する位置で第２の表面に押し付けられそして/または細胞の個体群を保持するその１つのマイクロウェルへ挿入されて、その少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の一部分がウェルの内部表面上方および/または基材の第１表面上方に移動させられる。当方法はまた、細胞の個体群の移動させられた部分を回収することによって、その少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を取って調べることも含んでいる。
ある１つの実施形態では、実験ユニットの第１アレイを画定する第１の表面とその第１の表面と向き合う第２の表面を含む基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、基材の第２の表面に採取デバイスを接触させることを含む。そのデバイスは、第２の表面に向き合う少なくとも１つの突起物を組み込んでいる。その少なくとも１つの突起物は、少なくとも１つの実験ユニットの直径に略等しいかあるいはより小さい直径を有している。その少なくとも１つの突起物は、細胞の個体群を保持する少なくとも１つの実験ユニットに対応する位置で第２の表面に押し付けられそして/または細胞の個体群を保持するその１つの実験ユニットへ挿入されて、その少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の一部分が基材の第１表面上方に移動させられる。当方法はまた、細胞の個体群の移動した部分を回収することも含んでいる。
ある１つの実施形態では、ウェルの第１アレイを画定する第１の表面を含む基材、それらウェルの各々がマイクロウェルの第２アレイを画定する内部表面を有し、その各マイクロウェルが開口直径を有している、そんな基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、微細加工で作られたその基材の第１の表面に採取デバイスを接触させることを含む。そのデバイスは、第１の表面に向き合う少なくとも１つの突起物を組み込んでいる。その少なくとも１つの突起物は、各マイクロウェルの直径よりも小さな直径を有している。その少なくとも１つの突起物は、細胞の個体群を保持する少なくとも１つのマイクロウェルへ挿入されて、その少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の１部分がウェルの少なくとも１つの内部表面上方および基材の第１表面上方に体積移動させられる。当方法はまた、細胞固体群の体積移動した部分を回収することによって少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞固体群の試料を取って調べることも含んでいる。
ある１つの実施形態では、実験ユニットの第１のアレイを画定する第１の表面を含む基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、微細加工で作られたその基材の第１の表面に採取デバイスを接触させることを含む。そのデバイスは、第１の表面に向き合う少なくとも１つの突起物を組み込んでいる。その少なくとも１つの突起物は、少なくとも１つの実験ユニットの直径よりも小さな直径を有している。その少なくとも１つの突起物は、細胞の個体群を保持する少なくとも１つの実験ユニットの中へ挿入されて、その少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の１部分が基材の第１表面上方に体積移動させられる。当方法はまた、細胞固体群の体積移動した部分を回収することによって少なくとも１つの実験ユニット内の細胞固体群の試料を取って調べることも含んでいる。
１つの実施形態では、ウェルの第１アレイを画定する第１の表面を含む基材、それらウェルの各々が内部表面を伴い、その各内部表面がマイクロウェルの第２アレイを画定し、その各マイクロウェルが開口直径を有している、そんな基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、その基材の第１の表面に採取デバイスを接触させることにより少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を取って調べることを含む。そのデバイスは、第１の表面に向き合う少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットを組み込んでいる。その少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットは、各マイクロウェルの開口直径よりも小さな外径と標的細胞直径に対応できる内径とを有する。少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットは、細胞個体群を保持するマイクロウェル中へ挿入される。当方法はまた、細胞個体群の１部分を少なくとも１つのマイクロウェルからデバイスへ引きだす圧力を使って少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞固体群の試料を回収することを含んでいる。
ある１つの実施形態では、実験ユニットの第１アレイを画定する第１の表面を含む基材内の細胞固体群の試料を取って調べる方法は、その基材の第１表面に採取デバイスを接触させることによって少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を取って調べることを含む。そのデバイスは、第１の表面に向き合う少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットを組み込んでいる。その少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットは、各マイクロウェルの開口直径よりも小さな外径と標的細胞直径に対応できる内径とを有する。少なくとも１つの注射針および/またはナノピペットは、細胞個体群を保持する実験ユニット中へ挿入される。当方法はまた、細胞個体群の１部分を少なくとも１つの実験ユニットからデバイスへ引きだす圧力を使って少なくとも１つの実験ユニット内の細胞固体群の試料を回収することを含んでいる。
ある１つの実施形態では、ウェルの第１アレイを画定する第１の表面を含む基材、それらウェルの各々がマイクロウェルの第２アレイを画定する内部表面を含む、そんな基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、流体内に細胞の個体群を保持する少なくとも１つのマイクロウェルに集束音響エネルギーを加えることによって少なくとも１つのマイクロウェル内の流体状態にある細胞個体群の試料を取って調べることを含む。その集束音響エネルギーは少なくとも１つの実験ユニットから１つの小滴を射出するのに効果的な手法で加えられる。その小滴は、少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を含んでいる。
ある１つの実施形態では、実験ユニットの第１アレイを画定する第１の表面を含む基材内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、流体内に細胞の個体群を保持する少なくとも１つの実験ユニットに集束音響エネルギーを少なくとも１つの実験ユニットから１つの小滴を射出するのに効果的な手法で加えることによって、少なくとも１つの実験ユニット内の流体状態にある細胞個体群の試料を取って調べることを含む。その小滴は、少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の試料を含んでいる。
ある１つの実施形態では、基材は第１表面と第2表面を含む。第１表面はウェルの第１アレイを画定している。各ウェルは、マイクロウェルの第2アレイを画定する内部表面を有している。基材は、第１表面の少なくとも一部を含む第１片および第2表面の少なくとも1部を含む第2片を少なくとも含んでいる。第1片と第2片は、第１表面と第2表面に平行な平面の少なくとも1部分に沿って着脱可能に接続されている。その平面は、マイクロウェルの第２アレイを分割している。第１アレイおよび/または第2アレイは、実質的に平坦であり得る。少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の第１の部分が第１片に付着して残り且つその少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の第2の部分が第２片に付着して残るように、第1片と第2片を取り外すことを含む。
ある１つの実施形態では、基材は第１表面と第2表面を含む。第１表面は実験ユニットの第１アレイを画定している。基材は、第１表面の少なくとも一部を含む第１片および第2表面の少なくとも1部を含む第2片を少なくとも含んでいる。第1片と第2片は、第１表面と第2表面に平行な平面の少なくとも1部分に沿って着脱可能に接続されている。その平面は、実験ユニットの第１アレイを分割している。第１アレイは、実質的に平坦であり得る。少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の第１の部分が第１片に付着して残り且つその少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の第2の部分が第２片に付着して残るように、第1片と第2片を取り外すことを含む。
ある１つの実施形態では、基材はウェルの第1アレイを画定する第１の表面を含んでおり、それらウェルの各々は内部表面を伴い、各内部表面はマイクロウェルの第2アレイを画定しているものとする。少なくとも１つの内部表面の少なくとも1部分に着脱可能膜は、少なくとも1つのマイクロウェル内の細胞個体群の1部がその着脱可能な膜に付着する様に、貼りつけられる。少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の部分が着脱可能な膜に付着して残るように、着脱可能膜を引き剥がすことを含む。
着脱可能膜は、少なくとも1つの実験ユニット内の細胞個体群の1部がその着脱可能膜に付着する様に、第１の表面の少なくとも1部分に貼りつけられる。少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の部分が着脱可能膜に付着して残るように、着脱可能膜を引き剥がすことを含む。
ある1つの実施形態では、基材は第１の表面と第2の表面を含んでいる。第１の表面は、ウェルの第１アレイを画定する。各ウェルは、内部表面を有し、各内部表面はマイクロチャンネルの第2アレイを画定している。各マイクロチャンネルは、第１の表面に第１の開口を、第2の表面に第２の開口を有している。第１の着脱可能膜は、少なくとも１つのマイクロチャンネル内の細胞個体群の幾つかがその第１の着脱可能膜に付着する様に、少なくとも１つの内部表面の少なくとも1部分に貼り付けられる。第2の着脱可能膜は、少なくとも１つのマイクロウェル内の細胞個体群の幾つかがその第2の着脱可能膜に付着する様に、第２表面の少なくとも1部分に貼り付けられる。少なくとも１つのマイクロチャンネル内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、少なくとも1つのマイクロチャンネルの細胞個体群の少なくとも幾つかが第１の着脱可能膜に付着して残るように第１の着脱可能膜を引き剥がし、および/またはその少なくとも1つのマイクロチャンネル内の細胞個体群の少なくとも幾つかが第２の着脱可能膜に付着して残るように第2の着脱可能膜を引き剥がすことを含んでいる。
ある1つの実施形態では、基材は第１の表面と第2の表面を含む。第１の表面は、実験ユニットの第１アレイを画定している。各実験ユニットは、第１の表面に第１開口を、第2の表面に第2開口を有している。第１の着脱可能膜は、少なくとも１つの実験ユニット内の細胞固体群の少なくとも幾つかがその第1の着脱可能膜に付着する様に、第１の表面の少なくとも１部分に貼り付けられる。第2の着脱可能膜は、少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の少なくとも幾つかがその第2の着脱可能膜に付着するように、第2の表面の少なくとも1部分に貼り付けられる。少なくとも１つの実験ユニット内の細胞個体群の試料を取って調べる方法は、少なくとも1つの実験ユニットの細胞個体群の少なくとも幾つかが第１の着脱可能膜に付着して残るようにその第１の着脱可能膜を引き剥がし、および/またはその少なくとも1つの実験ユニット内の細胞個体群の少なくとも幾つかが第２の着脱可能膜に付着して残るようにその第2の着脱可能膜を引き剥がすことを含んでいる。
ある1つの実施形態では、自然環境から採取した細胞を培養するための方法は、少なくとも1つの細胞が少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットを占めるようにその細胞を基材の第１の表面に塗布すること、第1の表面の少なくとも1部分へ半透過性の膜を貼り付けて、栄養素が少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット中へ拡散するように且つその少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットから占有細胞が逃散するのを予防しおよび/または軽減すること、そしてその少なくとも１つの栄養素を使って、少なくともその１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内を一旦は占有する細胞を培養することを含む。
ある１つの実施形態では、自然環境から採取した試料内の細胞を基材内で培養おうよび適応させるための方法は、少なくとも1つの細胞が少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットを占めるようにその細胞を基材の第１の表面に塗布すること、栄養素が少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット中へ拡散するように且つその少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットから占有細胞が逃散するのを予防しおよび/または軽減するように第1の表面の少なくとも1部分へ半透過性の膜を貼り付けること、その少なくとも１つの栄養素を使って少なくともその１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニット内で少なくとも１つの占有細胞を培養すること、進行性部分交換を使ってその少なくとも１つの栄養素から少なくとも１つの代替の栄養素配合物へある期間にわたって徐々に移行させること、およびその少なくとも１つのマイクロウェル、ウェルあるいは実験ユニットの少なくともその１つの占有細胞の増殖を検出することを含む。
複数の実施形態では、プールした分子分析試験データ要素を元の個々の位置への割り当ておよび/または相関的関連に戻し得る。ある１つの実施形態では、マイクロアレイは試料を割り当てる複数の位置を包含している。マイクロアレイ上の各位置は、試料の１部分を受け取るように構成されている。各位置は、試料の１部分がどの位置から来たかを試料のその部分がマイクロアレイから取り除かれた後で識別可能にする特異タグで印付けがなされている。
ある１つの実施形態では、少なくとも１つの核酸分子を含む試料の１部分がマイクロアレイのどの位置から来たものかをその試料のその部分が取り除かれた後で識別する方法は、(a) マイクロアレイ上の複数の位置の中の１つ以上の位置へ試料の１つ以上の割り当て部分を塗りつけるステップを含む。各位置は、核酸分子を含む特異タグで印付けがなされている。その核酸分子は、(i) 位置特異性ヌクレオチド配列および (ii) 第１標的特異性ヌクレオチド配列を含んでいる。当方法はまた、(b) 試料の少なくとも１部分に見出される核酸分子を位置印づけタグにアニールさせるステップも含んでいる。当方法は更に、(c) アニールされた核酸分子個体群に対してプライマー伸張、逆転写、一本鎖連結反応あるいは二本鎖連結反応を行うステップを含んでおり、それによってプライマー伸張、逆転写、一本鎖連結反応あるいは二本鎖連結反応で生じた各核酸分子中に位置特異性ヌクレオチド配列を組み込む。当方法は更にまた、(d) ステップ (c) で生成された核酸分子個体群を組み合わせるステップ、(e) 組み合わせた核酸分子の個体群を順序づけし、それによって１つ以上の位置特異性ヌクレオチド配列の連接を得るステップ、および (f) 組み合わされた核酸分子の個体群から得た少なくとも１つの位置特異性ヌクレオチド配列の順序とその位置特異性ヌクレオチド配列を含むタグで印づけられたマイクロアレイ上の位置を互いに関連付けるステップを含み、それによって少なくとも１つの核酸分子を含む試料の１部分がマイクロアレイ上のどの位置から来たかを識別している。その試料は、少なくとも１つの細胞を含んでよく、その細胞はステップ (a) の後で且つステップ (b) の前に複製され得る。試料の割り当て分の１部がステップ (b) の前に少なくとも１つの位置から取り除かれ得て、試料割り当て分のその１部がマイクロアレイ上のその試料割り当て分の元の位置と相互に関連する別の容器に保存され得る。
１つの実施形態では、試料を割り当てる複数の位置を備えるマイクロアレイ、そこでは少なくとも１つ位置が特異タグで印付けられているとする、を製造する方法は、(a) 複数のタグを合成するステップを含む。各タグは、(i) 位置特異性ヌクレオチド配列と (ii) 第１の標的特異性ヌクレオチド配列を含む核酸分子を含んでいる。当方法はまた、(b) マイクロアレイ上の複数の位置の中の少なくとも１つの位置にタグを置くステップを含む。特異タグは、(i) 位置特異性ヌクレオチド配列と (ii) 第１標的特異性ヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み得る。そのタグは更に、増幅プライマー結合部位および/またはアダプターヌクレオチド配列を含み得る。
微細加工デバイスは、環状オレフィンポリマーを使い射出成形によって製造することができる。基材またはチップは、約１インチｘ約３インチの大きさの実質的に平坦な表面を有し得る。その表面は更に、約200,000のウェルを画定でき、各ウェルは約50 μmの直径を有する。あるいはまた、その表面は約800,000 のマイクロウェルを画定でき、各マイクロウェルは約25 μmの直径を有する。その表面は、コロナプラズマ処理を施こされることにより親水性とされ得る。
土壌から単離された微生物（例えば、バクテリア）は、土壌抽出栄養分中へ希釈されてチップの表面に塗られ得る。次に、膜がチップの表面に施され得る。その膜は、例えばヒドロゲル塗布膜であってよい。その膜は、例えばラミネート加工によってチップへ可逆的あるいは不可逆的に結合あるいは付着されてもよい。それから、別のデバイスが、チップの表面を幾つもの区画に分割するために、膜とチップ表面の内の初出の物の上に置かれ得る。その表面の各区画は、その中にウェルあるいはマイクロウェルのある程度の部分集合を有している。
オンチップ適合において、各区画に自然環境から得た栄養培地が装填され得る。培養期間中、マイクロウェル内でバクテリアが増殖した際の差異を検出するため例えば光学システムを使ってバクテリアの増殖を観察すべくチップを計測管理し得る。ある期間にわたって、その栄養培地が実験室環境の中でバクテリアを増殖するのに用い得る完全に配合された培地となるまで栄養培地を徐々に調整し得る。
オフチップ適合においては、バクテリア増殖が観察されるあらゆるウェルあるいはマイクロウェルは、試料を取って調べられ得る。バクテリア試料は、配合培地への適合用の例えばプレート、別のチップあるいはペトリ皿のような従来の器具に移され得る。
複数の実施形態が培地の最適化に用いられ得る。例えば、単一種のバクテリアをチップの１表面に塗りつけ得る。次に、膜をチップのその表面に貼りつけ得る。その膜は、例えばヒドロゲル塗布膜とすることが出来る。その膜は、例えばラミネート加工によって、可逆的にあるいは不可逆的にチップへ接合あるいは付着させてもよい。それから、膜および/またはチップの表面を幾つもの区画に分割するために、別のデバイスを膜の上部表面および/またはチップ表面に配置し得る。その膜および/またはチップ表面の各区画は、膜の下およびまたはチップ表面にあるウェルあるいはマイクロウェルのなんらかの部分集合を有している。各区画には異なった培地（例えば、異なった環境から採取した培地）が装填されてよい。培養期間中、異なった栄養配合物を備えたウェルあるいはマイクロウェル内の増殖速度を観察するためにチップを計測管理し得る。
複数の実施形態は、リン酸塩を可溶化する微生物についての検査に、特に農業への応用に、利用し得る。燐は、植物にとっての主要必須多量養素である。土壌の燐は、首尾よく作物生産の最適化を成し遂げ得るが、リン酸塩肥料の形で土壌に施されている。しかしながら、リン酸塩肥料として土壌に施された可溶無機リン酸塩の大部分は、急速に不動化されて植物にとって利用できなくなる。リン酸可溶化バクテリア菌株は、不溶化合物から有機および無機燐を加水分解するので、植物の生長および産出量を向上させるために使用し得る。微生物を含む試料は自然環境、例えば土壌（特に、もし有機あるいは無機燐が環境内の不溶化合物から効果的に加水分解され続けられるならば）、から採取されてよい。ひとつの実施形態によれば、微生物の少なくとも幾つかが複数の実験ユニットを占めるように、実験ユニットの少なくとも１つのアレイを備えた基材の表面にその試料を装着し得る。占有微生物は、様々な形のリン酸塩を備えた複数の実験ユニット内で培養でき、様々な形の燐酸塩を加水分解するそれらの能力について比較/選別され得る。
複数の実施形態は、より高い増殖速度を有する突然変異株についての選別に利用され得る。微生物（例えば、バクテリア）試料は、突然変異原で処理されていた単一の実験室培養物から採取され得る。1つの実施形態によれば、その試料を実験ユニットの少なくとも１つのアレイを備えた基材の表面へ、バクテリアの少なくとも幾つかがその実験ユニットの複数個所を占めるように、装着し得る。占有バクテリアは、少なくとも１つの栄養素によって実験ユニットの複数個所で培養され、より高い増殖速度を有する実験ユニットを識別するために観察/比較され得る。
複数の実施形態は、例えば新奇な抗生物質、防かび剤あるいは抗ウイルス剤を識別するのに利用され得る。微生物（例えば、バクテリア）を含む試料は自然環境から採取され得る。ある１つの実施形態によれば、その試料を実験ユニットの少なくとも１つのアレイを備えた基材の表面へ、バクテリアの少なくとも幾つかがその実験ユニットの複数個所を占めるように、装着し得る。占有バクテリアをある期間にわたり複数の実験ユニット内で培養し、次に指標バクテリアの層を占有バクテリアの初物上に成長させる（これには寒天の薄層が必要とされる場合がある）。指標バクテリアの層に明確な溶菌斑が生じている実験ユニットは抗生物質が生成したことを知らせている。
複数の実施形態は、特殊な酵素活性について検査するのに利用され得る。ある１つの実施形態によれば、細胞を含む試料が実験ユニットの少なくとも1つのアレイを備えた基材の表面上へ、細胞の少なくとも１つが複数の実験ユニットを占めるように、装着され得る。それらの占有細胞はある期間にわたり実験ユニットの複数個所で培養され、次に酵素によって切断される時に色を生成する基質が加えられる。この着色反応を生じる実験ユニットが、望んだ酵素活性があることを示している。
複数の実施形態は、バイオ修復を行うための、特に環境浄化用途のための、微生物について検査するのに利用され得る。公害および環境汚染は複雑である。例えば、自然環境への油流出あるいは液状石油炭化水素の放出の影響は、多くの要因に左右される。海洋環境においては、油の種類、海水の温度および海岸線の形式の全てが浄化に影響する。微生物を含む試料が自然環境、例えば石油含有岩石層、から採取し得る。ある１つの実施形態によれば、その試料を、実験ユニットの少なくとも１つのアレイを備えた基材の表面上へ、微生物の少なくとも幾つかが複数の実験ユニットを占めるように、装着し得る。それらの占有微生物は、色々な種類の石油を有する複数の実験ユニット内で培養され、その石油を除去あるいは無害化する能力について比較/検査され得る。
（結論）
本発明の種々の実施形態をこの明細書中に述べ、且つ実証してきたが、当業者であれば、機能を実行して上述した結果および/または１つ以上の有利点を得る多様なその他の手段および構造体を容易に想像するはずであり、その様な変形および/または改修の各々はここに述べた本発明の実施形態の範囲内であると考える。より一般的には、当業者であれば、ここに述べた全てのパラメータ、寸法、材料および構成は代表的なものであることを意味しており、実際のパラメータ、寸法および/または構成は、本発明の教示が利用される特定の１つあるいは複数の用途に左右されることは容易に分かる筈である。当業者であれば、慣例実験だけを用いて、ここで述べた本発明の特定実施形態と等価な多くの物を認めあるいは確かめ得る筈である。それ故、上記の実施形態は例としてのみ提示されており、最後に添える特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、具体的に述べられ且つ特許請求されたままよりは違ったやり方で発明の実施形態が実行され得ることは、理解されるべきである。本発明の実施形態は、ここに述べた個々の機能、システム、物品、材料、キットおよび/または方法に向けられている。さらに、その様な機能、システム、物品、材料、キットおよび/または方法が互いに矛盾していないならば、それらの機能、システム、物品、材料、キットおよび/または方法の中の２つ以上の組み合わせは本発明の範囲内に含まれる。
しかも、種々の発明概念は、１つ以上の方法として具現化されており、その実施例が提供されている。その方法の１環として行われる動作は、任意の好適なやり方で順序づけられ得る。従って、動作が例示されたものとは異なる順序で行われる実施形態が構成されてもよく、例示の実施形態においてたとえ順次動作として示されていたとしても、複数の動作が同時に行われることを含んでよい。
この中で言及した全ての著作、特許出願、特許、および他の参考文献の各々の全文を参照文献としてここに組み込む。
全ての定義は、この文書中で明確化されそして使用されたように、辞書定義、参照文献として組み込まれた文献での定義および/または定義された用語の通常の意味を統制すると理解されるべきである。
本願の明細書および請求の範囲において使われている不定冠詞「a」および「an」を、「ある１つの」とする場合又は明確に数を指定しない場合、「少なくとも１つの」を意味すると理解されるべきである。
本願の明細書および請求の範囲において使われている語句「および/または」は、そのように結び付けられた要素、即ち或る場合には共役的に他の場合には分離的に存在する要素、の「いずれか１方あるいは両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または」を伴って列挙されている数多くの要素も同様に、即ち要素の１つ以上がそのように結び付けられていると、解釈されるべきである。「および/または」という語句によって具体的に特定された要素以外に他の要素も、それら特定された要素と関連が在ろうと無かろうと、オプションとして存在し得る。従って、非制限例として、「Aおよび/またはB」への参照は、「含んでいる」のような無限定の語句と一緒に使われる場合、ある実施形態では（B以外の要素をオプションとして含むが）Ａのみを参照でき、別の実施形態では（A以外の要素をオプションとして含むが）Bのみを参照でき、更に別の実施形態では（他の要素をオプションとして含むが）AとBの両方を参照できる等である。
本願の明細書および特許請求の範囲に用いられているような「あるいは」は、上記で定義された「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストに於いて種目を分ける場合、「あるいは」あるいは「および/または」でも一切を含んでいる、即ち数多くのあるいは一覧の要素の中の少なくとも１つを包含するばかりでなく１つ以上を含み且つオプションとして追加のリストに載っていない項目をも含む、と解釈するものとする。反対に、例えば「１つだけの」あるいは「ちょうど１つの」あるいは特許請求の範囲で用いられる「・・・から成る」のように、明確に指定された種目のみが、数多くのあるいは一覧の種目の中の正に１つの要素の包含に当てはまることになる。一般的に、この文書中で用いるような用語「あるいは」は、例えば「どちらか１方の」、「１つの」、「１つだけの」あるいは「ちょうど１つの」のような排他性用語が先行する場合にのみ、代わりになるものの排除（即ち、一方あるいは他方のものであって両方ではない）を指示すると解釈されるものとする。特許請求の範囲で用いられる場合、「から実質的に成る」は、特許法の分野で用いられるようなその通常の意味を有するものとする。
本願の明細書および特許請求の範囲で用いられているような１つ以上の要素のリストに関連しての語句「少なくとも１つ」は、要素リストの中のいずれか１つ以上から選ばれた少なくとも１つを意味すると理解されるべきで、必ずしも要素リストの中に具体的に挙げられたあらゆる要素の中の少なくとも１つを含むとは限らず、要素リスト中の要素の如何なる組み合わせも排除しないことを意味していると理解されるべきである。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が関連する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、それら特定要素に関連が在ろうと無かろうと、オプションとして存在することを可能にしている。従って、非限定例として、「AおよびBの少なくとも１つ」（言い換えると、AあるいはBの少なくとも１つ、言い換えるとAおよび/またはBの少なくとも１つ）は、１つの実施形態では、Bが存在していない（B以外の要素をオプションとして含んでいる）状態での少なくとも１つの、オプションとして１つ以上を含む、A；別の実施形態では、Aが存在していない（A以外の要素をオプションとして含んでいる）状態での少なくとも１つの、オプションとして１つ以上を含む、B；更に別の実施形態では、少なくとも１つの、オプションとして１つ以上を含む、Aおよび少なくとも１つの、オプションとして１つ以上を含む、B（およびオプションとして他の要素を含んでいる）；等を意味し得る。
特許請求の範囲においても、上記の明細書に於けると同様に、例えば「含む」、「などがある」、「携える」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「構成されている」等の全ての移行句は、開放型、即ち「およびその他も含む」、を意味すると理解されるべきである。移行句「から成る」および「から実質的に成る」だけが、米国特許庁マニュアルの特許審査手続き、第2111.03項、に明示されているように、それぞれ閉鎖型あるいは半閉鎖型の移行句である。

Claims (43)

  1. 試料の少なくとも１つの細胞を培養するためのマイクロウェル高密度アレイを画定する微細加工デバイスを得るステップであって、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種が培養されるマイクロウェル高密度アレイの中の少なくとも１つのマイクロウェルを識別するためにそのマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに少なくともその１つの細胞および少なくとも1つの特異タグを含み、
    その特異タグが、対象物のその少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種に存在する標的核酸断片にアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列と、
    マイクロウェルの高密度アレイの中のその少なくとも１つのマイクロウェルを識別するための位置特異性ヌクレオチド配列と、を含んでなる１つの核酸分子からなる、微細加工デバイスを得るステップと、
    そのマイクロウェルの高密度アレイの中の少なくとも１つの細胞から複数の細胞を増殖させるために上記微細加工デバイスを培養目的で加温するステップと、
    上記少なくとも１つの特異タグが複数の細胞の第１の部分と共に残るように、マイクロウェル高密度アレイの中のその少なくとも１つのマイクロウェル内のそれら複数の細胞を、それら複数の細胞の第１の部分とそれら複数の細胞の第２の部分に分割するステップと、
    対象物のその少なくとも１つの種を決定することと、
    上記の少なくとも１つの特異タグに基づいてその対象物の少なくとも１つの種が培養されたマイクロウェル高密度アレイ内のその少なくとも１つのマイクロウェルを識別することと、
    その対象物の少なくとも１つの種が培養されたマイクロウェル高密度アレイ内のその１つのマイクロウェルの識別に基づいて、それら複数の細胞の第２の部分内でその対象物の少なくとも１つの種の位置を特定することとからなる、
    複数細胞の第1の部分を解析するステップと含む方法。
  2. 前記複数の細胞の第２の部分から対象物の少なくとも１つの細胞を採取するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記少なくとも１つの特異タグは第１の特異タグと第２の特異タグを含み、
    その第１の特異タグはマイクロウェル高密度アレイ内のマイクロウェルの第１の次元を識別するために予め決められた第１の位置特異性ヌクレオチド配列を含み、
    その第２の特異タグはマイクロウェル高密度アレイ内のマイクロウェルの第２の次元を識別するために予め決められた第２の位置特異性ヌクレオチド配列を含み、
    その第１の位置特異性ヌクレオチド配列とその第２の位置特異性ヌクレオチド配列が共同してマイクロウェル高密度アレイの中のその少なくとも１つのマイクロウェルを識別することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１の特異タグは、順方向ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを含む第１の標的特異性ヌクレオチド配列を含み、
    第２の特異タグは、逆方向PCRプライマーを含む第２の標的特異性ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 前記微細加工デバイスを得るステップが、少なくとも１つの特異タグをその微細加工デバイスの少なくとも１つのマイクロウェル内に配置するステップを含む請求項１に記載の方法。
  6. 前記微細加工デバイスを得るステップが、少なくとも１つの細胞を含む試料をその微細加工デバイスに装填するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 前記微細加工デバイスを得るステップが、マイクロウェル高密度アレイ内の少なくとも１つの細胞を保持するために膜を貼るステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記膜は、気体のみを透過するものおよび不透過なものの中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記膜は、マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル中への栄養培地の拡散を可能にすることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  10. 前記マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内の複数の細胞を分割するステップが、複数の細胞の第１の部分がマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに残り、そして複数細胞の第２の部分が膜の表面に結びついて残るように、マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルから膜を取り除くステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
  11. 前記対象物の少なくとも１つの種の位置を複数の細胞の第２の部分内で特定するステップが、その対象物の少なくとも１つの種が培養されたマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに対応する膜表面上の範囲を識別するステップを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. 前記マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内の複数の細胞を分割ステップが、それら複数の細胞の第１の部分は膜の表面に結びついて残り、それら複数の細胞の第２の部分はマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに残るように、マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルから膜を取り除くステップを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
  13. 前記複数の細胞の第１の部分を分析して対象物の少なくとも１つの種の存在あるいは不存在を判別するステップは、それら複数の細胞の第１の部分に対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、少なくとも１つの特異タグの標的特異性ヌクレオチド配列に基づいて、それら複数の細胞の第１の部分に存在する標的核酸断片のいずれをも増幅するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  14. 前記複数の細胞の第１の部分を分析して対象物の少なくとも１つの種の存在あるいは不存在を決定するステップが、あらゆるＰＣＲ増幅標的核酸断片の配列決定を行うステップを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 前記配列決定ステップが、次世代配列決定(ＮＧＳ)を行うステップを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種を培養するための少なくとも１つの栄養素を供給するステップを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  17. 前記少なくとも1つの細胞の少なくとも1つの種を培養する為のその少なくとも１つの栄養素が、
    少なくとも1つの細胞の少なくとも1つの種の自然環境からの抽出物と、
    少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境から派生した培地と、
    少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境に似ているように配合された培地と、
    少なくとも１つの細胞の少なくとも1つの種のみを培養する為の選択的培地と、
    少なくとも１つの細胞の少なくとも1つの種を区別する為の鑑別培地と、
    の中の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境が、生物組織、生物生成物、微生物懸濁液、空気、土壌、堆積物、生命のある有機物、馬草、石油、汚水、および／または水の中の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つの細胞が、古細菌細胞、細菌細胞および真核生物細胞の中の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  20. 前記対象物の少なくとも１つの種が、核酸および遺伝子の中の少なくとも１つに基づいて選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  21. 試料の少なくとも１つの細胞を培養する方法であって、
    少なくとも１つのマイクロウェルにその少なくとも１つの細胞を含有させるマイクロウェル高密度アレイを画定する微細加工デバイスを得るステップと、
    そのマイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つの細胞から複数細胞へ増殖させるためその微細加工デバイスを培養目的で温めるステップと、
    それら複数細胞の中の対象物の少なくとも１つの種の存在あるいは不存在を判別するためにそれら複数細胞を選別するステップと、
    対象物の少なくとも1つの種が存在する場合、対象物のその少なくとも1つの種が培養されたマイクウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルから対象物の少なくとも1つの種の少なくとも１つの細胞を採取するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
  22. 前記対象物の少なくとも１つの種についてそれら複数細胞を選別するステップが、代謝産物、代謝経路、酵素、タンパク質、核酸、表現型、遺伝子、突然変異、適応性および性能の中の少なくとも１つに基づいて分析試験を行うステップを含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  23. 前記マイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルが、少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種が培養されたそのマイクロウェル高密度アレイのその少なくとも1つのマイクロウェルを識別するための少なくとも１つの特異タグをさらに含み、
    その少なくとも１つの特異タグが、
    対象物のその少なくとも１つの種に存在する標的核酸分子断片にアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列と、
    そのマイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルを識別するために予め決められた位置特異性ヌクレオチド配列とを含むその核酸分子からなり、
    その方法はさらに、対象物のその少なくとも１つの種が存在する場合、その対象物の少なくとも１つの種が培養されたマイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルを識別する為にその位置特異性核酸分子配列を使うステップを含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  24. 前記対象物の少なくとも１つの種が、標的核酸断片が存在する少なくとも１つの細胞を含み、その標的核酸断片が代謝産物、代謝経路、酵素、タンパク質、核酸、表現型、遺伝子、突然変異、適応性および性能の中の少なくとも１つに関する遺伝コードを含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  25. 前記複数細胞の中の対象物の少なくとも１つの種の存在あるいは不存在を判別する為にそれら複数細胞を選別するのに先立ち、マイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内の複数細胞をそれら複数細胞の第１の部分とそれら複数細胞の第２の部分に分割するステップと、
    それら複数細胞を選別することはそれら複数細胞の中の対象物の少なくとも１つの種の存在あるいは不存在を判別する為にそれら複数細胞の第１の部分のみを選別するステップと、
    対象物のその少なくとも１つの種の少なくとも１つの細胞を採取することはそれら複数細胞の第２の部分から対象物のその少なくとも１つの種の少なくとも１つの細胞を採取するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  26. 前記試料から少なくとも１つの細胞を培養するためのマイクロウェル高密度アレイを画定する微細加工デバイスを得るステップであって、
    そのマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルはその少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種が培養されたそのマイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルを識別するために少なくとも１つの特異タグを備え、
    その少なくとも１つの特異タグが、
    その少なくとも１つの細胞の対象物の少なくとも１つの種に存在する標的核酸断片へアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列と、
    そのマイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルを識別するために予め決定された位置特異性ヌクレオチド配列とを含む核酸分子かならなる、微細加工デバイスを得るステップと、
    少なくとも１つの細胞の中のただ１つの細胞だけが多数のマイクロウェル高密度アレイの各マイクロウェルに配置されるように試料を準備して装着するステップと、
    マイクロウェル高密度アレイの中の少なくとも１つの細胞を含むマイクロウェルの第１数と、
    マイクロウェル高密度アレイの中のマイクロウェルの第２数と、
    第1数と第2数に基づいて、試料中での対象物の少なくとも１つの種の相対存在度を
    少なくとも１つの特異タグに基づいて求めるステップとを含む方法。
  27. 前記試料からの細胞の総数を求め、
    求めた試料の細胞の総数とその試料内での対象物の少なくとも１つの種の相対存在度に基づいて、その試料内対象物の少なくとも１つの種の絶対存在度を求めるステップをさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
  28. その少なくとも１つの細胞を培養するためのマイクロウェル高密度アレイを画定している微細加工デバイスと、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種が培養されるマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルを識別するためにそのマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに配置する少なくとも１つの特異タグとを備えた、少なくとも１つの細胞を含む試料の収容用キットであって、
    その少なくとも１つの特異タグが、
    その核酸分子は少なくとも１つの細胞の標的核酸断片にアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列と、
    マイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルを識別するための位置特異性ヌクレオチド配列とを含む核酸分子からなることを特徴とするキット。
  29. その少なくとも１つの特異タグが、そのマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに配置されていることを特徴とする請求項28に記載のキット。
  30. 試料が微細加工デバイスに装着された後にそのマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内に少なくとも１つの細胞を保持するための膜を備えることを特徴とする請求項２８に記載のキット。
  31. その膜はマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェル内への少なくとも１つの栄養素の拡散を可能にすることを特徴とする請求項３０に記載のキット。
  32. その膜が気体のみ透過性のものと不透過性のものの中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項３０に記載のキット。
  33. 少なくとも1つの細胞の少なくとも1つの種を培養する為の少なくとも１つの栄養素を含むことを特徴とする請求項２８に記載のキット。
  34. その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種を培養する為のその少なくとも１つの栄養素が、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境からの抽出物と、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境から派生した培地と、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境に類似するように配合された培地と、
    少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種だけを培養するための選択性培地と、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種を区別すための鑑別培地と
    の中の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
  35. その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種のその自然環境が、生物組織、生物生成物、微生物懸濁液、空気、土壌、堆積物、生命のある有機物、馬草、石油、汚水、および水の中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項３４に記載のキット。
  36. 少なくとも１つの細胞を含む試料の収容用キットであって少なくとも１つの細胞を培養する為のマイクロウェル高密度アレイを画定する微細加工デバイスと、
    その試料をその微細加工デバイスに装着した後でマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルにその少なくとも１つの細胞を保持するための膜と、
    を備えているキット。
  37. その膜はマイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェル内への少なくとも１つの栄養素の拡散を可能にすることを特徴とする請求項３６に記載のキット。
  38. その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種を培養する為の少なくとも１つの栄養素を含むことを特徴とする請求項３６に記載のキット。
  39. その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種を培養する為のその少なくとも１つの栄養素が、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境からの抽出物と、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境から派生した培地と、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種の自然環境に類似するように配合された培地と、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種だけを培養するための選択性培地と、
    その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種を区別すための鑑別培地と、
    の中の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項３８に記載のキット。
  40. その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種のその自然環境が、生物組織、生物生成物、微生物懸濁液、空気、土壌、堆積物、生命のある有機物、馬草、石油、汚水、および水の中の少なくとも１つであることを特徴とする請求項３９に記載のキット。
  41. その少なくとも１つの細胞の少なくとも１つの種が培養されるマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルを識別するためにそのマイクロウェル高密度アレイの少なくとも１つのマイクロウェルに配置する少なくとも１つの特異タグをさらに備え、
    その少なくとも１つの特異タグが、
    少なくとも１つの細胞の標的核酸断片にアニールするための標的特異性ヌクレオチド配列と、
    マイクロウェル高密度アレイのその少なくとも１つのマイクロウェルを識別するための位置特異性ヌクレオチド配列とを含む核酸分子かなることを特徴とする請求項３６に記載のキット。
  42. 試料の少なくとも１つの生物学的実体を培養するための実験ユニット高密度アレイを画定する微細加工デバイスを得るステップであって、
    その実験ユニット高密度アレイの少なくとも１つの実験ユニットが、少なくとも１つの生物学的実体およびその少なくとも１つの生物学的実体の少なくとも１つのタイプが培養される実験ユニット高密度アレイの中の少なくとも１つの実験ユニットに関する空間情報を識別するための少なくとも１つの特異タグを含んでおり、
    その１つの特異タグが
    その少なくとも１つの生物学的実体の対象物のその少なくとも１つのタイプに存在する生体分子に結合するための標的特異性成分と、
    実験ユニット高密度アレイの中のその少なくとも１つの実験ユニットに関する空間情報を識別するための位置特異性成分とを含み、
    その少なくとも１つの生物学的実体は有機体、細胞、細胞成分、細胞生成物およびウイルスの中の少なくとも１つであり、
    タンパク質、核酸、炭水化物、脂質及び薬剤の中の少なくとも１つである第１の結合分子からなる、微細加工デバイスを得るステップと、
    実験ユニット高密度アレイの中の少なくとも１つの実験ユニット内の少なくとも１つの生物学的実体から複数の生物学的実体に増殖させるために上記微細加工デバイスを培養目的で加温するステップと、
    その少なくとも１つの生物学的実体の対象物のその少なくとも１つのタイプを決定し、
    その少なくとも１つの生物学的実体の対象物の少なくとも１つのタイプが培養された実験ユニット高密度アレイ内のその少なくとも１つの実験ユニットに関する空間情報を上記の少なくとも１つの特異タグに基づいて識別するために、
    実験ユニット高密度アレイの中のその少なくとも１つの実験ユニット内のそれら複数の生物学的実体を解析するステップと
    を含む方法。
  43. 少なくとも１つの生物学的実体を含む試料の収容用キットであって、その少なくとも１つの生物学的実体を培養する為の実験ユニット高密度アレイを画定する微細加工デバイスと、
    その少なくとも１つの生物学的実体の対象物の少なくとも１つのタイプが培養された実験ユニット高密度アレイの少なくとも１つの実験ユニットに関する空間情報を識別するように実験ユニット高密度アレイの少なくとも１つの実験ユニットに配置するための少なくとも１つの特異タグと備えたキットであって、
    その少なくとも１つの特異タグが、
    その少なくとも１つの生物学的実体の対象物のその少なくとも１つのタイプに存在する生体分子に結合するための標的特異性成分と、
    実験ユニット高密度アレイの中のその少なくとも１つの実験ユニットに関する空間情報を識別するための位置特異性成分とを含み、
    その少なくとも１つの生物学的実体は有機体、細胞、細胞成分、細胞生成物およびウイルスの中の少なくとも１つであり、
    その第１の結合分子は、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質及び薬剤の中の少なくとも１つである第１の結合分子からなることを特徴とするキット。
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