CN113373031A - 一种喷雾型的游离dna样本保存管及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种喷雾型的游离DNA样本保存管及其在血液游离DNA保存方面的应用。本发明使用PET材质的cfDNA样本保存管，并且内壁上附着专门设计的保存剂。本发明的cfDNA样本保存管解决了PET管保水性能差的缺点，大大延长样本保存管的保质期，且有利于采集的体液样本与cfDNA保护剂充分混匀，有效抑制体液样本中的核酸酶，稳定其中的cfDNA，效避免样本中有核细胞基因组DNA的释放。

Description

一种喷雾型的游离DNA样本保存管及应用

技术领域

本发明主要涉及生物材料保存装置领域，具体涉及一种喷雾型的游离DNA样本保存管及其在血液游离DNA保存方面的应用。

背景技术

循环游离DNA(Circulating cell free DNA，cfDNA)是存在于人体体液（包括外周血、胸腹水、脑脊液等）中的一种胞外DNA，主要来源于凋亡细胞。研究发现，肿瘤细胞和孕妇体内的胎儿都向体液中释放游离DNA。而且，随着对恶性肿瘤精确诊治要求的不断提高，以循环游离DNA(cfDNA)为代表的液态活检(liquid biopsy)技术近年来成为国内外研究热点。近年来，体液特别是外周血中的cfDNA在临床上的应用越来越多，成为肿瘤筛查诊断和无创产前基因检测的重要标志物。目前，在产前诊断中，主要通过检测孕妇外周血中来自胎儿的游离DNA进行无创产前遗传病诊断和分型；在肿瘤液态活检中，主要通过检测患者外周血中来自肿瘤细胞的游离DNA进行肿瘤早期筛查、动态检测、耐药基因突变分析、肿瘤异质性及复发风险评估等。但是，cfDNA应用于临床诊断中面临的一个关键问题是来自胎儿或者肿瘤细胞的游离DNA数量通常不到循环cfDNA总量的10%，并且cfDNA半衰期短，极易被体液中的核酸酶降解。此外，体液中有核细胞（如外周血中的白细胞）破裂也会导致基因组DNA（genomic DNA, gDNA）释放进入到体液样本中，造成巨大的背景噪音，严重影响检测结果的准确性和灵敏度。因此，为了保证cfDNA的完整性和防止它们受gDNA的污染，采样后及时利用超高速离心分离血浆并及时分离提取或冻存是最直接有效的保存 cfDNA的方法。但是实际样本的采集通常要在资源有限的条件下开展，往往不具备高速离心和冷冻保存的条件，立即处理血液进行冷冻保存通常是不可能的，样本通常都是被运送到二级分析中心进行处理和分析，因此，游离核酸样本采集保存管应运而生。

目前商业化的游离核酸采集保存管生产企业主要包括海外生产企业美国Streck公司、加拿大Norgen公司、瑞士罗氏公司等，国内也有100多家真空采血管生产企业，包括康为世纪、康健、阳普、诺唯赞等公司。但是市场上的游离DNA保存管通常都为玻璃管，并且保存液都是以液体形式存在的。保存液以液体形式存在的优点是有利于采样管中保存液和体液样本充分混匀，采用玻璃管作为材质是因为玻璃管的保水性优于其它材质。但是玻璃管运输不便，在运输过程中容易破碎，造成样品浪费及环境污染，因此，近些年来PET材质由于质量轻、耐压、不易碎、便于运输等优点，逐渐替代玻璃管被临床医疗广泛采用。但是PET材质的保存管密封性和保水性较差，PET管结合大体积液体保存液（约1ml）制成的PET体液样本保存管，室温放置过程中，保存管内的保存液逐渐挥发，数月后，溶液基质（如水分）即挥发殆尽，在管底形成保存液中有效组分的结晶物。这类保存管在使用过程中，加入血液等体液以后，按照常规使用操作流程进行颠倒混匀，结晶状的成分不易溶解完全，增加了使用过程中的操作难度，样本保存效果也会受到影响。而且，由于不同保存期的保存管中残留的保存液体积不同，造成采血后不同样本管中样本溶液总体积高高低低各不相同，后续按照固定操作流程进行取样处理时，实际取样一致性无法得到保证，进而造成样本检测结果的稳定性无法有效保证。此外，样本保存液基质挥发，采样后样本溶液总体积变小，样本溶液中有效保存成分浓度变高，溶液渗透压发生改变，可能会引起样本中的细胞破裂，导致gDNA释放，造成基因组核酸污染。

为了解决以上这些问题，本发明提供一种PET材质的游离DNA样本采集保存管，经过优化的保存剂以雾化形式附着于管壁，解决了PET管保水性能差的缺点，大大延长样本保存管的保质期，又有利于采集的体液样本与游离DNA保护剂充分混匀，采集后样本溶液总体积基本一致；而为在PET管中雾化使用而特别设计优化的保存剂能有效抑制体液样本中的核酸酶，稳定其中的cfDNA，并有效避免样本中有核细胞基因组DNA的释放，减少基因组DNA背景噪音。

发明内容

本发明的一方面提供一种产品保质期长、游离DNA样本保存效果好的PET材质的一次性cfDNA样本采集保存管（如图1所示），所述保存管包括PET材质的管体、在管体开口端的管盖（带胶塞）、管体外的标签。

另一方面，本发明提供一种经过优化的cfDNA样本保存剂，所述保存剂主要包括抗凝剂、防腐剂、核酸酶抑制剂、DNA与蛋白交联抑制剂、细胞及膜稳定剂；优选的，所述保存及还包含一种细胞及膜稳定肽。

另一方面，本发明提供一种包含本发明所述cfDNA样本保存剂的样本采集管，其中，所述cfDNA样本保存剂以雾化形式附着于管壁，可直接用于血样等体液样本的采集与运输，稳定保存其中的cfDNA，并避免体液中有核细胞基因组DNA的释放。

本发明的一次性cfDNA样本保存管如附图1所示，包括塑料盖1、胶塞2、PET试管3和标签4，所述胶塞2置于塑料盖1内，并能够塞紧在PET试管3的管口，保证PET管内为真空环境；优选地，本发明的cfDNA样本保存液以雾化形式均匀附着于保存管内壁。

所述cfDNA样本保存剂中抗凝剂包括EDTA钾盐、EDTA钠盐、柠檬酸钠中的一种或多种组合，其主要作用为防止血液等体液样本凝固；更选优选为EDTA钾盐。

所述防腐剂为咪唑烷基脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、DTT（Dithiothreitol，二硫苏糖醇）、NaF、DU（重氮烷基脲）、恶唑烷的一种或多种，其在运输和保存过程中防止体液样本变质；更优选为咪唑烷基脲。

所述的核酸酶抑制剂可以为EDTA盐、草酸盐、柠檬酸盐、DTT、甲酰胺、蛋白酶K、肝素、硫酸铵、尿素、SDS（十二烷基硫酸钠）、异硫氰酸胍的一种或多种，其可抑制样本中的核酸酶活性，保护样本中游离DNA免受核酸酶降解。

所述交联抑制剂为甘氨酸、聚乙烯醇、甜菜碱、海藻糖、吐温20的一种或多种，其防止游离DNA与蛋白发生交联；优选为甘氨酸。

所述细胞及膜稳定剂包括咪唑烷基脲、NaF、丙三醇、山梨醇、海藻糖、鼠李糖、丝氨酸、半胱氨酸或谷氨酰胺、甘氨酸及其同系物或衍生物中的一种或多种，能增强细胞及细胞膜的稳定性，防止样本中有核细胞破裂，避免细胞基因组DNA释放；更优选为咪唑烷基脲和甘氨酸。

优选的，所述的cfDNA样本保存剂中，所述抗凝剂和核酸酶抑制剂为EDTA钾盐，所述防腐剂和细胞及膜稳定剂为咪唑烷基脲和甘氨酸，所述游离DNA与蛋白交联抑制剂为甘氨酸。

此外，特别的，本申请发明人针对上述需求设计得到一细胞及膜稳定肽，其能够显著延长增加cfDNA样本保存管的血液保存能力，能够在显著长久的时间内控制保存管中样本的cfDNA的释放。所述稳定肽的序列如下所示：

MNLLSAIVNLLSAIRVSTLTHTISRIAVSYQQLEEGAEAKPWYEPFKGQLTHTIVNLLSAIWYEKQVLFKGQLTHVAKPWQRRATLTHTISRRTPSDGAEAKPWYEPIAKPWYEPIYLPEGAEAKPWYECQRETLTHTISRIAVSQLVVPSEGLYANPQRRANALPIYLINRPDYNLL。

优选的，每支5ml的cfDNA样本保存管中含有： 6mg~15 mg/支的EDTA·K2·2H2O，甘氨酸含量为1mg~5 mg/支的甘氨酸，10mg~20mg/支的咪唑烷基脲，更优选地还含有5-10mg/支的细胞及膜稳定肽。

本发明的cfDNA保存管具有以下优点：（1）cfDNA保存管为PET材质，质量轻，便于运输，管壁破损机率极小，标本在运输、离心及试验过程发生泄漏的可能性极小；（2）样本保存剂以雾化形式均匀附着于内管壁，既能使保存剂与样本溶液迅速充分混匀，又解决了PET管保水性能差的缺点，大大延长样本保存管的保质期，防止使用过程中由于样本溶液总体积差异造成的渗透压变化导致的细胞破裂和基因组DNA污染，以及后续样本检测过程中由于实际取样不一致造成的检测结果稳定性差异；（3）能够有效抑制体液样本中的核酸酶，并避免有核细胞中基因组DNA的释放，在6-37℃可稳定保存cfDNA；（4）本发明所有组分均为自主研发，并实现了量产，成本低，具有广泛的应用前景和市场推广价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1.一次性真空cfDNA样本保存管示意图：1为塑料盖、2为胶塞、3为PET试管、4为标签；

图2.样本保存管抗凝能力测试：每组中，第1管均为康健采血管，第2和3管为本申请cfDNA样本保存管1，第4和5管为本申请cfDNA样本保存管2。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：cfDNA保存管的制备

cfDNA样本保存剂1的配制：称取乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA·K₂·2H₂O）80g，甘氨酸30g，咪唑烷基脲150g，加入到900ml无菌去离子水中，完全溶解后，定容至1L。

cfDNA样本保存剂2的配制：称取乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA·K₂·2H₂O）80g，甘氨酸30g，咪唑烷基脲150g，细胞及膜稳定肽60mg，加入到900ml无菌去离子水中，完全溶解后，定容至1L。

cfDNA保存管1使用保存剂1的配方，cfDNA保存管2使用保存剂2的配方。

保存剂雾化加样：采用精密喷雾机进行样本保存剂雾化加样，喷嘴的压力阀要全部打开，压力控制3-4kg，计量泵的调节要逐个调整，每个试管雾化添加含量为90-110μl保存剂。

烘干：采用多组烘干机，循环对雾化的保存管进行烘干，保证内壁保存液水溶液挥发。

真空压塞：将试管按规格放入相配套的模架，在试管上放上复合好的胶塞和塑料盖，无需塞紧，真空值按照默认的数值进行确认，压塞5ml真空度730pa，真空压塞后，即得单支一次性使用真空游离DNA样本保存管。

实施例2：一次性真空游离DNA样本保存管强度测试

（1）实验材料：

本发明提供的一次性真空游离DNA样本保存管：全新，10支；

（2）试剂与仪器：

水，室温20℃～25℃；

摆臂式离心机，能使容器底部承受3000gn（纵向）离心加速度10min(gn =9.80665m/s2）。

（3）试验方法：

用采血针注水的方式向10支样本保存管内加入公称容量的水，确保保存管在离心管中正确支撑和充分平衡，启动离心机，使保存管底部承受3000gn的纵向离心加速度10min（不包括规定加速度之前的时间）。离心结束后，取下采血管，检查是否有物理损坏。

（4）结果分析

3000gn（纵向）离心加速度离心10min后，实验的10支保存管均无破损，无断裂、坍塌、裂缝或其他可见缺陷。

实施例3：一次性真空cfDNA样本保存管的抽吸体积检测

选择101.3kPa（海拔高度0米）、96.4kPa（海拔高度约400米）、91.7kPa（海拔高度约800米）的环境下，进行真空采血管抽吸体积试验。编号1-10为本发明提供的一次性真空游离DNA样本保存管（5mL管）。注：本部分参考并符合中华人民共和国医药行业标准《一次性使用人体静脉血样采集容器（YY0314-2007）》“附录NA 推荐的环境大气校准方法判断标准：真空度（采血量）在其公称采血量的±10%以内”。

表1：真空抽吸体积检测结果

预期使用地区试验结果如表1所示，在海拔高度约800m以下环境(对应大气压91.7kPa），本发明提供的游离DNA样本保存管抽吸体积差异不大，真空度（采血量）在其公称采血量的±10%以内；符合国家标准要求。

实施例4：一次性真空游离DNA样本保存管的抗凝能力测试评估

采用江苏康健医疗用品有限公司已取得注册证的血常规类采血管和与本发明提供的cfDNA样本保存管做采血后的抗凝能力参数比对。

（1）实验材料：

EDTA采血管：全新，3支；

本发明提供的cfDNA样本保存管1（喷雾型）：全新，6支；

本发明提供的cfDNA样本保存管2（喷雾型）：全新，6支；

（2）试验步骤

采用EDTA采血管和本发明提供的cfDNA样本保存管（喷雾型）对3名志愿者分别进行采血操作，每名志愿者采血5管，第1管为EDTA采血管，第2和3管为cfDNA样本保存管1，第4和5管为cfDNA保存管2，采血后，立即上下颠倒5-8次混匀，室温放置72小时后观测结果。

（3）实验结果

实验结果如图2所示，采血后室温放置72h内，均无凝血现象产生。

实施例5：一次性真空游离DNA样本保存管的抗溶血能力和运输保存能力测试

（1）实验材料

EDTA采血管：全新，4支；

本发明提供的游离DNA样本保存管1（喷雾型）：新，4支；

本发明提供的游离DNA样本保存管2（喷雾型）：全新，4支；

（2）实验方法

血液样本来自康为世纪公司在江苏泰州募集的4名健康的志愿者，志愿者有男有女，并假定是健康的。分别采集4名志愿者的血液，并放入3种不同的采集管中： EDTA管（康健)，本发明cfDNA样本保存管1和2（喷雾型，康为世纪）。 血液采集后，立即上下颠倒旋5-8次，轻轻混匀。

将上一步采集的血样放置于37℃摇床60rpm/min进行模拟运输实验，0天、4天、7天、14天进行观察和取样分析。

在时间点为0时，分离出等份未进行模拟运输的样本作为对照，然后在4天、7天和14天后再分离等份。随机对等份样本分离DNA，通过PCR进行靶基因检测。

对于在EDTA管（康健）和本发明提供的cfDNA样本保存管（喷雾型，康为世纪）内收集的血液，室温以1600g速度离心20分钟，从各等份血液中分离出血浆。分别各取200μl血浆，采用康为世纪的游离DNA小量提取试剂盒（CW2603）来分离血浆组分中的DNA，具体操作按照生产厂商的使用指南进行。样本在50μL中洗脱，使用Qubit荧光定量仪检测游离DNA的浓度，在进行定量PCR分析前，提取的游离DNA保存在-20°C。

血浆中总的DNA水平通过扩增人内参基因LINE1 (正向引物 5′-TGCCGCAATAAACATACGTG-3′；反向引物5′-AACAACAGGTGCTGGAGAGG-3′)来评估。使用康为世纪qPCR检测试剂（CW0957）对提取得到的核酸样本进行荧光定量PCR检测，具体操作参考说明书。DNA模板在终体积20μL 的PCR反应体系中的输入量为4μL。反应体系采用16μl PCR反应液（包括10μl ΜltraSYBR Mixture + 0.4μl正向引物+ 0.4μl反向引物+ 5.2μl无核酸酶水）+ 4μl 核酸提取液模板。在ABI7500（美国Thermofisher公司）型荧光定量PCR仪上进行血浆中总DNA核酸检测，反应条件如下： 94℃ 10 min→94 ℃ 10 s, 60℃30 s（42 个循环），SYBR通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，CT）进行计算。

（3）实验结果与分析

溶血的测定：模拟运输0天、4天、7天、14天，观察使用3种采血管收集的4名受试者的血浆的溶血情况，结果显示，37℃模拟运输4天后，3组采血管均无明显溶血现象出现；37℃模拟运输7天后，EDTA采血管血液样品溶血现象明显，而本发明提供的游离DNA保存管1和2控制溶血性能较好，说明本发明提供的游离DNA保存管（喷雾型）有助于防止运输和储存过程中全血的溶血。

运输对血浆总DNA水平的影响：使用Qubit检测提取的游离DNA的浓度并计算出200μl血浆中DNA总量，并通过定量PCR检测人内参基因LINE1来分析血浆总DNA的相对水平。结果如表2所示，采用EDTA管（康健）模拟运输7天后，qubit检测血浆中总DNA量明显增加，PCR检测人内参基因扩增CT值明显变小（p ＜ 0.05），说明模拟运输导致EDTA管保存样本中血浆总DNA水平明显增加，在EDTA管（康健）中收集的原始样本和运输7 天、14天的血样相比，具有显著性差异；而采用本发明提供的游离DNA保存管1和2（喷雾型）模拟运输7天后，无论是qubit检测血浆中总DNA量，还是PCR检测人内参基因扩增CT值，均无明显变化（p ＞0.05），14天后保存管1虽然差异显著，但保存管2仍基本无变化。

表2. 模拟运输前后保存管对游离DNA保存能力测试

（4）实验结论

通过检测模拟运输后保存样本的溶血情况，以及qubit和定量PCR检测模拟运输前后血浆总DNA相对水平的变化情况，显示，在14天时，本发明提供的游离DNA样本保存管1（喷雾型）已经开始出现游离DNA的释放趋势，而本发明提供的游离DNA样本保存管2（喷雾型）则仍基本无变化，保持一致的DNA量，因此，本发明的DNA样本保存管1和2均有助于防止运输过程中样本的溶血和防止gDNA向全血中释放，而本发明的DNA样本保存管2更是优于保存管1，能更有效保存运输cfDNA。

实施例6：一次性真空游离DNA样本保存管的产品保质期测试

（1）实验材料

EDTA采血管：全新，2支；

本发明提供的游离DNA样本保存管1（喷雾型）：3个生产批次，每批次2支，共计6支；

本发明提供的游离DNA样本保存管2（喷雾型）：3个生产批次，每批次2支，共计6支；

（2）实验方法

供试游离DNA样本保存管每批次的2管一组，（喷雾型）产品置于40℃的温度下分别放置50天、100天，与最新生产批次的保存管2管（放置0天）和2支EDTA管一起进行保存管性能检测。

血液样本来自康为世纪公司在江苏泰州募集的2名志愿者（1男1女）。分别采集2名志愿者的血液，放入EDTA管（康健)和在40℃的温度下放置了不同时间的样本采集管中：游离DNA样本保存管1和2（喷雾型，康为世纪，0天、50天、100天）。 血液采集后，立即上下颠倒旋5-8次，轻轻混匀。

将上一步采集的血样放置于37℃摇床60rpm/min进行模拟运输实验，0天、14天进行观察和取样分析。

在时间点为0天时， 分离出等份未进行模拟运输的样本作为对照，然后在14天后再分离等份,随机对等份样本分离DNA，通过PCR进行靶基因检测。

具体实验操作同实施例4中此步操作流程。

（3）实验结果与分析

溶血的测定：观察使用在40℃的温度下放置了0天、50天、100天的保存管收集的2名受试者血浆的溶血情况， 40℃的温度下放置50天和100天的保存管与放置0天的保存管相比，溶血现象差异不显著，说明本发明提供的游离DNA保存管1和2（喷雾型）在40℃的温度下放置100天后依然能有效防止全血样本运输和储存过程中发生溶血。

表3. 放置不同时间后保存管对游离DNA保存能力的测试

保存游离DNA的能力：使用Qubit荧光定量仪检测提取的游离DNA的浓度并计算出200μl血浆中DNA总量，并通过定量PCR检测人内参基因来分析血浆总DNA的相对水平。结果如表3所示，本发明提供的游离DNA保存管1和2（喷雾型）在40℃的温度下放置了0天、50天、100天后，采集的血样在37℃模拟运输7天后，无论是qubit检测血浆中总DNA量，还是PCR检测人内参基因扩增CT值，均无明显变化，CT值差异大部分在1以内，差异不显著（p ＞0.05）；而在模拟运输14天后，本发明的游离DNA保存管1虽然发生了一定的变化，但游离DNA保存管2保存样本仍基本无变化。因此，说明本发明提供的游离DNA保存管（喷雾型）在室温条件下放置100天后其对血浆游离DNA的保存效果依然出色，产品保质期长，稳定性好；而其中的cfDNA保存管2更是具备长达14天不发生显著变化的优势。

Claims (6)

1.一次性cfDNA样本保存管，所述保存管包括塑料盖（1）、胶塞（2）、PET试管（3）和标签（4），所述胶塞（2）置于塑料盖（1）内，并能够塞紧在PET试管（3）的管口，保证PET管内为真空环境；所述保存管内包含以雾化形式附着于保存管内壁的保存剂，所述保存剂主要包括抗凝剂、防腐剂、核酸酶抑制剂、DNA与蛋白交联抑制剂、细胞及膜稳定剂和细胞及膜稳定肽，所述细胞及膜稳定肽氨基酸序列如下所示：MNLLSAIVNLLSAIRVSTLTHTISRIAVSYQQLEEGAEAKPWYEPFKGQLTHTIVNLLSAIWYEKQVLFKGQLTHVAKPWQRRATLTHTISRRTPSDGAEAKPWYEPIAKPWYEPIYLPEGAEAKPWYECQRETLTHTISRIAVSQLVVPSEGLYANPQRRANALPIYLINRPDYNLL。

2.根据权利要求1所述的样本保存管，其特征在于：所述抗凝剂包括EDTA钾盐、EDTA钠盐、柠檬酸钠中的一种或多种组合。

3.根据权利要求1所述的样本保存管，其特征在于：所述防腐剂为咪唑烷基脲、钠羟甲基甘氨酸、二羟甲基脲、DTT、NaF、DU、恶唑烷的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的样本保存管，其特征在于：所述的核酸酶抑制剂为EDTA盐、草酸盐、柠檬酸盐、DTT、甲酰胺、蛋白酶K、肝素、硫酸铵、尿素、SDS、异硫氰酸胍的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的样本保存管，其特征在于：所述交联抑制剂为甘氨酸、聚乙烯醇、甜菜碱、海藻糖、吐温20的一种或多种；所述细胞及膜稳定剂包括咪唑烷基脲、NaF、丙三醇、山梨醇、海藻糖、鼠李糖、丝氨酸、半胱氨酸或谷氨酰胺、甘氨酸及其同系物或衍生物中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的样本保存管，其特征在于：所述保存剂组成为：6mg~15 mg/支的EDTA·K₂·2H₂O，甘氨酸含量为1mg~5 mg/支的甘氨酸，10mg~20mg/支的咪唑烷基脲和5-10mg/支的细胞及膜稳定肽，每支样本保存管为5ml保存管。

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