CN115956558A - 细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法 - Google Patents
细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115956558A CN115956558A CN202211622598.9A CN202211622598A CN115956558A CN 115956558 A CN115956558 A CN 115956558A CN 202211622598 A CN202211622598 A CN 202211622598A CN 115956558 A CN115956558 A CN 115956558A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- dextran
- cell cryopreservation
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了一种细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法,涉及细胞技术领域,本发明的发明人通过大量实验筛选,提供了一种特定组分和特定用量的细胞冻存剂,该细胞冻存剂能很好保存细胞活性,同时成分明确,所用组分均为注射级别,临床安全性高,并且不含有血清,能够有效避免污染和过敏原,满足直接用于注射使用的条件。
Description
技术领域
本发明涉及细胞技术领域,尤其是涉及一种细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法。
背景技术
目前,大约有50多种试剂被用作冻存保护剂,按冻存保护剂是否能渗透到细胞内,将其分为渗透性冻存保护剂和非渗透性冻存保护剂。渗透性保护剂有二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇甲酰胺等,其主要作用是进入细胞内,与水分子结合,减少冰晶形成。非渗透性冻存保护剂有海藻糖、蔗糖、羟乙基淀粉、低分子右旋糖酐、白蛋白等,其主要的作用是通过减弱渗透压变化引起的细胞脱水,从而起到保护作用。
目前常用的细胞细胞冻存剂通常是由二甲基亚砜(DMSO)和胎牛血清混合而成,DMSO是具有强溶解能力和渗透能力的化学物质,在许多研究中,DMSO是最常用的细胞冻存保护剂,用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较,具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。但DMSO对细胞有一定的毒性作用,浓度过高会引起较高的渗透压,不利于细胞复苏。因此,目前DMSO常规使用浓度为5%-10%。FBS属于动物源性物质,成分复杂,并存在引入污染和过敏源的风险,不适合临床应用。特别在细胞治疗中,动物源物质的存在可能是未知的不良反应。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种细胞冻存剂,以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供上述细胞冻存剂的制备方法。
本发明的目的之三在于提供上述细胞冻存剂的应用。
本发明的目的之四在于提供一种应用了上述细胞冻存剂的细胞冻存方法。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
本发明提供了一种细胞冻存剂,每100mL中包括:二甲基亚砜1~10mL、右旋糖酐10~20mL、人血白蛋白10~20mL和余量的基质缓冲液。
进一步的,每100mL中包括:二甲基亚砜3~7mL、右旋糖酐15~18mL、人血白蛋白11~15mL和余量的基质缓冲液。
进一步的,每100mL中包括:二甲基亚砜5mL、右旋糖酐16.67mL、人血白蛋白12.5mL和基质缓冲液65.83mL。
进一步的,所述右旋糖酐选自右旋糖酐40和/或右旋糖酐60。
进一步的,所述基质缓冲液包括复方电解质注射液。
本发明还提供了上述的细胞冻存剂的制备方法,向配方量的基质缓冲液中加入二甲基亚砜,然后再加入右旋糖酐和人血白蛋白,混合均匀后得到所述细胞冻存剂。
进一步的,待溶液恢复至室温后,再加入右旋糖酐和人血白蛋白。
本发明还提供了上述的细胞冻存剂在冻存宫血干细胞中的应用。
此外,本发明还提供了了一种细胞的冻存方法,调整细胞密度为7.0~8.0×105cells/ml,每12.0~13.0×106cells用15~18mL上述的细胞冻存剂进行冻存。
进一步的,所述细胞包括宫血干细胞。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明的发明人通过大量实验筛选,提供了一种特定组分和特定用量的细胞冻存剂,该细胞冻存剂能很好保存细胞活性,同时成分明确,所用组分均为注射级别,临床安全性高,并且不含有血清,能够有效避免污染和过敏原,满足直接用于注射使用的条件。
具体实施方式
除非本文另有定义,连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰,然而,在任何潜在不明确性的情况下,本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中,除非另有说明,″或”的使用意味着″和/或”。此外,术语″包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地,连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明,本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知,且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行,所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的发明人通过对FDA批准的已上市细胞类药品的冻存制剂处方的调研,进行了大量的实验,最终确认了一种细胞冻存剂,每100mL中包括:二甲基亚砜1~10mL、右旋糖酐10~20mL、人血白蛋白10~20mL和余量的基质缓冲液。
其中,二甲基亚砜(DMSO)是一种极性有机溶剂,能溶解许多水溶性和脂溶性有机物,一向被称为″万能溶媒″,作为必不可少的冻存保护剂成分,本发明中每100mL细胞冻存剂中含有二甲基亚砜1~10mL,例如可以为,但不限于1mL、2mL、5mL、8mL或10mL。
右旋糖酐又包括右旋糖酐40和右旋糖酐60,作为细胞外的非渗透性保护剂,在冷冻过程中可以减少细胞内冰晶形成,复苏时还可以减轻由于渗透压的改变而引起的细胞肿胀。其中,右旋糖酐40与DMSO的联合使用能发挥叠加或协同低温保护作用。并且右旋糖酐40输注在临床上原本就被用于扩充血容量,且目前未发现对人体有副作用。在外周血干细胞的冰冻保存和复苏过程,从冻存前后的各项数据比较来看,右旋糖酐40与DMSO联合冷冻保护剂在深低温情况下短期内能有效地保护干细胞。本发明中每100mL细胞冻存剂中含有右旋糖酐10~20mL,例如可以为,但不限于10mL、12mL、15mL、18mL或20mL。
人血白蛋白是由乙型肝炎疫苗免疫健康人的血浆经低温乙醇蛋白分离法提取并经病毒灭活后制成。可保护细胞免受环境压力的作用,同时在保存过程中能阻止细胞贴附在冻存管壁上,能对细胞起到保护作用。本发明中每100mL细胞冻存剂中含有人血白蛋白10~20mL,例如可以为,但不限于10mL、12mL、15mL、18mL或20mL。
基质缓冲液能够使得细胞冻存剂的pH相对稳定,优选勃脉力A作为本发明的基质缓冲液。勃脉力A作为一种等渗的复方电解质,具有不含钙离子、pH值为7.4、抗酸能力好、成分与细胞外液相似以及不含乳酸盐等优点,是一种最生理化的晶体细胞外液补充液,在烧伤、创伤、疾病等外科手术所引起的人体体液和电解质丢失中成为一种理想的补充液。
通过上述特定组分和用量的选择,该细胞冻存剂能很好保存细胞活性,同时成分明确,所用组分均为注射级别,临床安全性高,并且不含有血清,能够有效避免污染和过敏原,满足直接用于注射使用的条件。
需要说明的是,本发明所用的各原料均为医用药典注射级别。例如,复方电解质注射液(勃脉力A)、右旋糖酐40葡萄糖注射液等。
在一些优选的实施方式中,每100mL中包括:二甲基亚砜3~7mL、右旋糖酐15~18mL、人血白蛋白11~15mL和余量的基质缓冲液。
在一些更优选的实施方式中,每100mL中包括:二甲基亚砜5mL、右旋糖酐16.67mL、人血白蛋白12.5mL和基质缓冲液65.83mL。
通过对上述组分用量的进一步调整和优化,得到的细胞细胞冻存剂对细胞具有更好的冻存效果,复苏后对细胞状态影响更小。
第二方面,本发明提供了上述细胞冻存剂的制备方法,包括向配方量的基质缓冲液中加入二甲基亚砜,然后再加入右旋糖酐和人血白蛋白,混合均匀后得到所述细胞冻存剂。
该方法工艺简单,制备方便,对设备或人员没有特定要求,适于推广应用。其中,二甲基亚砜在配置过程中会产生热量,先加DMSO使其热量先散发完,后加入其他成分,可以保护人血白蛋白的活性。
在一些优选的实施方式中,待溶液恢复至室温后,再加入右旋糖酐和人血白蛋白。
在一些具体的实施方式中,主要配制过程包括:
各组分所需体积V计算:V=细胞冻存剂体积*r(细胞冻存剂中各个组分的体积占比),V四舍五入保留1位小数,其中基质缓冲液、右旋糖酐为水溶液密度视作1g/ml,配制过程中称重所得数值即为体积;DMSO、人血白蛋白使用移液管进行量取获得相应体积。
1.加入基质缓冲液
(1)基质缓冲液擦拭消毒传入洁净工作台,启动电子天平,准备一个储液瓶去皮备用;
(2)将基质缓冲液倒入225ml离心管,再逐步加入储液瓶中,以此类推加至接近所需体积(即重量);再使用移液管吸取补充至最终体积。
2.加入DMSO
DMSO擦拭消毒传入洁净工作台,使用止血钳取下轧盖,橡胶塞擦拭消毒后取下,电子天平上取下储液瓶,使用移液管逐步量取DMSO缓慢加入储液瓶中,防止DMSO直接与瓶壁接触;添加完毕后吹打10次进行混匀,将储液瓶置于电子天平上,记录此时液体重量。
3.加入右旋糖酐
(1)右旋糖酐擦拭消毒传入洁净工作台,取1个一次性使用输血器(带针),使用剪刀剪取瓶塞穿刺器;计算加入右旋糖酐的最终重量m1=V右旋*1g/ml。
(2)取下袋口拉环,将穿刺器插入橡胶塞中,挤压袋身取出部分溶液至50ml离心管,再次挤压瓶身使溶液流入储液瓶中,直至接近所需浓度,再使用移液管吸取加至最终体积(即重量),吹打混匀10次。
4.加入人血白蛋白
人血白蛋白擦拭消毒传入洁净工作台,用止血钳取下轧盖,橡胶塞擦拭消毒后取下,电子天平上取下储液瓶,使用移液管逐步量取人血白蛋白加入储液瓶中,添加完毕后吹打10次进行混匀;
5.溶液过滤
(1)过滤装置准备:准备一个铁架台,取一次性无菌注射器,将注射筒置于夹具上,取1个40μm细胞滤网置于注射筒端口,下端放置一个储液瓶,用于收集滤液。
(2)过滤:从储液瓶中逐步取出混匀的溶液,通过过滤装置进行过滤,收集所有滤液即为细胞冻存剂。
第三方面,基于本发明提供的细胞冻存剂的有益效果,本发明还提供了该细胞冻存剂在冻存宫血干细胞中的应用。
此外,本发明的第四方面还提供了一种细胞的冻存方法,包括调整细胞密度为7.0~8.0×105cells/ml,每12.0~13.0×106cells用15~18mL细胞冻存剂进行冻存。
以特定的细胞密度和细胞数量匹配本发明提供的细胞冻存剂,能够实现冻存效果最优化。
当冻存的细胞为宫血干细胞时,冻存效果更好。
在一些具体的实施方式中,细胞冻存:
取1个1000ml储液瓶,称重去皮;细胞使用5ml移液管分2次共吸取10ml细胞冻存剂吹打(20次)重悬均匀,细胞悬液合并至储液瓶中,离心管分别使用约20ml细胞冻存剂荡洗1遍,清洗液合并至储液瓶中;逐步配制至800g。取1个20-100μm细胞滤网置于注射筒上进行过滤。取样进行细胞数量计数。将细胞调整至7.72×105cells/ml,每袋体积为16.2ml,细胞量为12.5×106cells进行灌装。最后用程序降温仪进行预冻存,最后转移到液氮罐中进行保存。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明,实施例中的材料为根据现有方法制备而得,或直接从市场上购得。
实施例1宫血干细胞注射液制剂处方筛选
实验过程:
1、细胞处理
选择细胞编号为03503-2-5-P5宫血干细胞,取含约7.0×108cells宫血干细胞的细胞原液,离心300g,6min,↑9、↓7(离心速度的配置:升速为9降速为7)弃培养上清,加入PBS重悬,再次离心300g,6min,↑9、↓7,弃上清,使用PBS重悬至280ml,混匀后取样计数,根据计数结果取4.2×108cells宫血干细胞均分至14个50ml离心管,其余细胞废弃,标记实验分组信息,每组约含宫血干细胞3.0×107cells。使用适量PBS混匀,稀释至48ml/管,以300g、6min,↑9、↓7进行离心清洗,弃上清,各管细胞沉淀备用。
2、冻存剂配制
配制100ml冻存制剂处方各组辅料用量如下表所示:
配置方法为:
各组分所需体积V计算:V=细胞冻存剂体积V*r,V四舍五入保留1位小数,其中复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液为水溶液密度视作1g/ml,配制过程中称重所得数值即为体积;Dimethyl Sulfoxide、人血白蛋白使用移液管进行量取获得相应体积。
S 1.加入复方电解质注射液(勃脉力A)
(1)复方电解质液擦拭消毒传入洁净工作台,启动电子天平,准备一个储液瓶去皮备用。
(2)取下次级包装袋,用剪刀从出液口剪开,将复方电解质倒入225ml离心管,再逐步加入储液瓶中,以此类推加至接近所需体积(即重量);再使用移液管吸取补充至最终体积。
S2.加入Dimethyl Sulfoxide
Dimethyl Sulfoxide擦拭消毒传入洁净工作台,使用止血钳取下轧盖,橡胶塞擦拭消毒后取下,电子天平上取下储液瓶,使用移液管逐步量取Dimethyl Sulfoxide缓慢加入储液瓶中,防止Dimethyl Sulfoxide直接与瓶壁接触;添加完毕后吹打10次进行混匀,将储液瓶置于电子天平上,记录此时液体重量。
S3.加入右旋糖酐40葡萄糖注射液
(1)右旋糖酐40葡萄糖注射液擦拭消毒传入洁净工作台,取1个一次性使用输血器(带针),使用剪刀剪取瓶塞穿刺器;计算加入右旋糖酐40葡萄糖注射液的最终重量m1=V右旋*1g/ml。
(2)取下袋口拉环,将穿刺器插入橡胶塞中,挤压袋身取出部分溶液至50ml离心管,再次挤压瓶身使溶液流入储液瓶中,直至接近所需浓度,再使用移液管吸取加至最终体积(即重量),吹打混匀10次。
S4.加入人血白蛋白
人血白蛋白擦拭消毒传入洁净工作台,用止血钳取下轧盖,橡胶塞擦拭消毒后取下,电子天平上取下储液瓶,使用移液管逐步量取人血白蛋白加入储液瓶中,添加完毕后吹打10次进行混匀;
S5.溶液过滤
(1)过滤装置准备:准备一个铁架台,取一次性无菌注射器,将注射筒置于夹具上,取1个40μm细胞滤网置于注射筒端口,下端放置一个储液瓶,用于收集滤液。
(2)过滤:从储液瓶中逐步取出混匀的溶液,通过过滤装置进行过滤,收集所有滤液即为细胞冻存剂。
3、细胞制剂灌装及程控降温
根据各管信息加入对应分组辅料制剂,混匀后进行灌装,灌装好的细胞暂存于2-8℃,灌装完毕后,各实验组取1袋细胞进行细胞数量、活率、渗透压、pH值等检测,其余各组细胞统一进行程控降温,降温完成后转入液氮保存。
4、细胞解冻
各实验组分别在液氮冻存7天后,取1袋,37℃水浴化冻后,检测细胞数量、活率、渗透压、pH值。
5、相关检测
5.1台盼蓝拒染法检测细胞活率及细胞数量
台盼蓝拒染法检测冻存前、冻存7天解冻后细胞活率、细胞浓度。
5.2pH值、渗透压检测
使用pH计检测冻存前、冻存7天化冻后宫血干细胞注射液pH值。使用渗透压仪检测冻存前、冻存7天化冻后宫血干细胞注射液的渗透压情况。
6、结果
6.1冻存前后细胞活率数量结团率结果分析
各组细胞混匀后取适量体积细胞悬液于1.5ml离心管中,分别用移液枪吸取20μl台盼蓝与20μl细胞悬液在另一1.5ml离心管中混匀后取样20μl加至Countstar细胞计数板点样槽,将计数板插入计数仪,设置好Countstar计数仪软件中计数参数,上机检测细胞浓度、活率。检测结果如下表所示:
冻存前后细胞活率、数量、结团率
冻存7天后细胞数量活率结团率检测结果
样本编号 | <![CDATA[细胞数量(×10<sup>7</sup>cells)]]> | 细胞活率(%) | 结团率(%) |
1 | 1.22 | 91.15 | 12.04 |
2 | 1.42 | 96.37 | 14.53 |
3 | 1.51 | 95.61 | 13.65 |
4 | 1.03 | 90.23 | 13.36 |
5 | 1.37 | 95.8 | 12.05 |
6 | 1.43 | 92.26 | 11.98 |
7 | 1.16 | 92 | 17.61 |
8 | 1.30 | 92.84 | 9.78 |
9 | 1.28 | 91.26 | 14.74 |
10 | 1.18 | 91.36 | 12.59 |
11 | 1.31 | 98.02 | 10.89 |
12 | 1.31 | 96.34 | 13.88 |
13 | 1.30 | 96.97 | 15.32 |
14 | 1.02 | 90.37 | 15.08 |
从各组细胞冻存前后台盼蓝染色细胞计数仪检测结果分析,各组细胞冻存前活细胞活率均在90%以上,冻存7天后直接检测活率也均在90%以上。
6.2冻存前后渗透压、pH值结果分析
6.2.1冻存前后渗透压结果分析
渗透压检测方法:使用标准液对渗透压仪进行校准,用取样器取出各组供试样品60μl,注入测试管中(确保其中无可见气泡),将测试管推入支撑座至停止位置,使测温探头完全浸入测试管内供试样品中,测试完成后按存储,存储当前测试结果;按打印,进入打印界面可进行样品名称和样品编号的设置。
冻存前后渗透压
样本编号 | 冻存前(mOsmol) | 冻存7天后(mOsmol) |
1 | 1139 | 1141 |
2 | 1168 | 1177 |
3 | 1168 | 1168 |
4 | 1660 | 1646 |
5 | 1687 | 1689 |
6 | 1687 | 1690 |
7 | 2251 | 2275 |
8 | 2245 | 2277 |
9 | 2305 | 2304 |
10 | 758 | 771 |
11 | 1158 | 1167 |
12 | 1161 | 1166 |
13 | 1162 | 1171 |
14 | 1168 | 1173 |
渗透压检测结果显示各实验组随着细胞冻存剂处方中DMSO含量的升高,渗透压也呈升高趋势。
6.2.2冻存前后pH值结果分析
pH值检测方法:取各组待检测细胞悬液2ml于15ml离心管内,使用PBS对pH计进行校准,将电极放在待测样品溶液中,使溶液充分浸没电极中并按读数键开始测量,画面上小数点闪动。自动测量终点A是仪表的默认设置。当电极输出稳定后,显示屏自动固定,并显现样品溶液pH值。结果如下表所示。
冻存前后pH值结果
样本编号 | 冻存前(mOsmol) | 冻存7天后(mOsmol) |
1 | 6.98 | 6.88 |
2 | 6.87 | 6.83 |
3 | 6.91 | 6.82 |
4 | 7.01 | 6.92 |
5 | 6.89 | 6.85 |
6 | 6.93 | 6.82 |
7 | 6.9 | 6.94 |
8 | 6.92 | 6.87 |
9 | 6.95 | 6.86 |
10 | 6.83 | 6.79 |
1 1 | 6.92 | 6.82 |
12 | 6.77 | 6.73 |
13 | 6.86 | 6.72 |
14 | 6.91 | 6.84 |
pH值检测各实验组细胞制剂冻存前后pH值在6.72-7.01之间,正常血液pH值在7.3-7.4之间,如果血液的pH值小于7.0或大于7.6时,则不利于生理机能的正常运转,因此在临床应用时需调整使pH值符合注射剂产品要求。
7、结论
综合冻存前后各组台盼蓝拒染细胞活性检测以及pH值、渗透压检测结果,推荐选择细胞注射剂渗透压值相对较低、细胞活性相对较高、冻存7天后细胞活率降低相对较小、且成本较低的第3组与第5组处方作为优选的细胞冻存剂处方用于宫血干细胞冻存,考虑到高浓度DMSO临床使用可能产生的毒性及不良反应,优选第3组制剂处方用于宫血干细胞冻存,其配方为5%DMSO+12.5%人血白蛋白输注溶液+16.67%右旋糖酐40葡萄糖注射液+65.83%勃脉力A。
实验例2制剂生产及冻存后制剂活性趋势研究
1.实验设计
采用第三组组制剂处方用于宫血干细胞冻存,按照宫血间充质干细胞注射液(SC01009)生产相关规程进行批次生产时,在药液配制、灌装过程中以及复苏后各时间点取样进行细胞计数及凋亡检测。具体取样点及要求按照下表所示。
2.实验过程
2.1细胞制备
按照上述实验设计要求进行生产,并进行取样检测。
2.2细胞计数
台盼蓝拒染法检测细胞活率、细胞浓度。
2.3凋亡检测
2.3.1凋亡检测样品处理
用超纯水将10×Annexin V Binding Buffer稀释成1×Annexin V BindingBuffer。
将收集好的样本细胞悬液(细胞量:1×106)4℃条件下,300g离心5min,离心后弃上清。用1mL预冷的1×Annexin V Binding Buffer洗涤细胞一次。4℃条件下,300g离心5min,离心后弃上清。每管加入1mL预冷的1×Annexin V Binding Buffer,轻柔吹打重悬细胞。每个样本取4个EP管进行标记:空白对照管1管、Annexin V单染管1管、PI单染管1管、样本双染管1管,每管加入150μl细胞悬液。空白对照管不加染料。Annexin V单染管和样本双染管加入2.5μl Annexin V。轻轻混匀后,4℃避光孵育10min。PI单染管和样本双染管再加入1.5μl PI,轻柔混匀。每个EP管分别加入200μl1×Annexin V Binding Buffer,混匀后在1小时内上机检测。
2.3.2凋亡上机检测
上样前检查所有液流瓶中的液面高度,确认可以维持仪器正常运行。开启流式细胞仪,待指示灯不闪烁后,打开电脑和软件。在上样前运行超纯水15min,速度设为Fast,纯水运行完后点击Delete Events去除背景。将样本轻轻混匀后放置上样针处,设置采样条件(选择低速或中速,一般不用高速运行),选择样品位置,命名样品名称,点击″run″。点击横坐标将横坐标设置为FSC-H,纵坐标设置为SSC-H,用图标寻找细胞群的最佳视野。根据细胞群体位置,点击切阈值,建议设置FSC-H阈值为1000000。用工具,画门圈定目的细胞群,设置收集门内细胞10000个,根据设定的条件继续采样,后面的样本按顺序依次上样。上机完成后,点击″Dot Plot″绘制双色散点图,设定坐标轴参数,横坐标为FITC,纵坐标为PE。点击图形上的″Gate″,选择该图形需要的相应的门,选择″Include″关系,点击″Apply″。正常细胞组可作为阈值,去除光谱重叠和设置十字门的位置。点击″Set Color Compensation″,选择需要补偿的荧光参数,输入补偿值以调节FITC通道和PI通道的荧光补偿,点击″Save&Close″。根据Annexin V和PI的单染管调节好补偿后,应用到样本管细胞,可以观察最后待测细胞凋亡情况。
2.3.3数据分析
在双变量流式散点图上,左上象限是机械损伤细胞(Annexin V-/PI+)。左下象限是正常活细胞(Annexin V-/PI-),正常细胞有完整细胞膜也没有外翻的PS,所以出现双阴性结果。右上象限是晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+),晚期凋亡细胞不仅有外翻的PS而且细胞膜已经不完整,所以出现双阳性结果。右下象限是早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-),在细胞凋亡早期PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中,能够与标记了荧光素FITC的Annexin V结合呈现阳性;而完整的细胞膜使PI不能进入细胞呈现阴性。
从细胞计数结果中可以看出在整个宫血干细胞制剂生产过程中细胞活率的变化以及最终制剂是否符合宫血间充质干细胞注射液质量标准(细胞活率≥80%)。
从细胞凋亡结果中可以看出在整个宫血干细胞制剂生产过程中细胞细胞凋亡的变化趋势。
3.实验结果
3.1细胞计数结果分析
宫血间充质干细胞制剂灌装过程中,细胞活率呈先下降后上升,总体基本保持平稳,有轻微下降(4%-6%左右),可以认为在整个过程中,时间对细胞活率影响不明显。
制剂灌装过程中细胞计数数据结果
3.2细胞凋亡结果分析
宫血间充质干细胞制剂生产过程中,正常活细胞百分比有些许下降,凋亡细胞百分比有些许上升,总体而言,冻存复苏对细胞活率有影响,但并不显著。
4.结论
动细胞计数仪计数和流式细胞凋亡检测两种方法得到细胞活率有区别,两者实验原理不同。全自动细胞计数仪是通过台盼蓝染色的样本进行计数,其中的活细胞是排除了呈蓝色的细胞,即丧失完整细胞膜的细胞(包括死细胞和部分晚凋细胞);而流式细胞凋亡方法得到的活细胞是排除了早期凋亡、晚期凋亡和死细胞等细胞之外的细胞。所以均是全自动细胞计数仪计数得到数值偏高,流式细胞凋亡得到正常活细胞比例偏低,其中在细胞复苏后两者差异最大。流式细胞凋亡检测得到的正常活细胞比例更能反映当时细胞的状态,从这方面考虑,制剂冻存后复苏会一定程度影响细胞状态,但影响并不显著。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种细胞冻存剂,其特征在于,每100mL中包括:二甲基亚砜1~10mL、右旋糖酐10~20mL、人血白蛋白10~20mL和余量的基质缓冲液。
2.据权利要求1所述的细胞冻存剂,其特征在于,每100mL中包括:二甲基亚砜3~7mL、右旋糖酐15~18mL、人血白蛋白11~15mL和余量的基质缓冲液。
3.根据权利要求2所述的细胞冻存剂,其特征在于,每100mL中包括:二甲基亚砜5mL、右旋糖酐16.67mL、人血白蛋白12.5mL和基质缓冲液65.83mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的细胞冻存剂,其特征在于,所述右旋糖酐选自右旋糖酐40和/或右旋糖酐60。
5.根据权利要求1-3任一项所述的细胞冻存剂,其特征在于,所述基质缓冲液包括复方电解质注射液。
6.权利要求1-5任一项所述的细胞冻存剂的制备方法,其特征在于,向配方量的基质缓冲液中加入二甲基亚砜,然后再加入右旋糖酐和人血白蛋白,混合均匀后得到所述细胞冻存剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,待溶液恢复至室温后,再加入右旋糖酐和人血白蛋白。
8.权利要求1-5任一项所述的细胞冻存剂在冻存宫血干细胞中的应用。
9.一种细胞的冻存方法,其特征在于,调整细胞密度为7.0~8.0×105cells/ml,每12.0~13.0×106cells用15~18mL权利要求1-5任一项所述的细胞冻存剂进行冻存;
优选地,调整细胞密度为7.72×105cells/ml,每12.5×106cells用16.2mL权利要求1-5任一项所述的细胞冻存剂进行冻存。
10.根据权利要求9所述的冻存方法,其特征在于,所述细胞包括宫血干细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211622598.9A CN115956558A (zh) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211622598.9A CN115956558A (zh) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115956558A true CN115956558A (zh) | 2023-04-14 |
Family
ID=87358100
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211622598.9A Pending CN115956558A (zh) | 2022-12-16 | 2022-12-16 | 细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115956558A (zh) |
-
2022
- 2022-12-16 CN CN202211622598.9A patent/CN115956558A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6177841B2 (ja) | 細胞分析の進歩した方法および装置 | |
US20040043505A1 (en) | Collection assembly | |
KR101759995B1 (ko) | 미생물의 분리, 특성규명 및/또는 동정에 사용하기 위한 분리 장치 | |
CN101672853B (zh) | 血细胞分析仪校准品及其制备工艺 | |
SHALGI et al. | Gases and electrolytes of human follicular fluid | |
EP3219320B1 (en) | Method and solution for cryopreservation of umbilical cord blood and peripheral blood | |
CN108641999A (zh) | 一种卵巢组织的冻存与复苏方法 | |
EP2729068B1 (en) | Coagulation controlling agents and devices comprising the same | |
CN108552162A (zh) | 一种尿液保存液、制备方法及其制片装置 | |
CN105758700A (zh) | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品及其制备方法 | |
CN109892320A (zh) | 一种细胞保存液及其制备方法和应用 | |
JP4977325B2 (ja) | 精度管理用疑似組織及びそれを用いた精度管理方法 | |
CN115956558A (zh) | 细胞冻存剂及其制备方法、应用和细胞冻存方法 | |
Chaurasia et al. | Protocol for one-step selective lysis of red blood cells and platelets with long-term preservation of white blood cells (human) at ambient temperature | |
CN113373031B (zh) | 一种喷雾型的游离dna样本保存管及应用 | |
CN114235769B (zh) | 一种血细胞染色方法 | |
EP1021715B1 (en) | Method and kit for separating plasma from whole blood | |
CN113514455B (zh) | 检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法及试剂盒 | |
EP3321372B1 (en) | Blood analysis method and blood test kit | |
CN112986065B (zh) | 一种用于血细胞分析仪的全血质控品及其制备方法 | |
CN110967230B (zh) | 一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒 | |
CN206714762U (zh) | 添加抗edta依赖症试剂的真空采血管 | |
Halberstadt et al. | Isolation of human cadaveric pancreatic islets for clinical transplantation | |
CN117165580B (zh) | 一种用于稳定样本中核酸的组合物、制备方法及其应用 | |
CN107406814B (zh) | 成分分析装置、药剂成分分析装置、成分分析方法及药剂成分分析方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |