CN101484586A - 检测移植物抗宿主疾病易感性或移植相关死亡率的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供测定GvHD可能性和/或严重性以及移植相关死亡率发生可能性的方法。

Description

检测移植物抗宿主疾病易感性或移植相关死亡率的方法和试剂
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明未使用任何政府基金。
发明背景
在移植中会发生移植物抗宿主疾病(GVHD)。在GVHD中，供者T-细胞通过对受体身体发动攻击排斥受体组织和器官。许多其它疾病涉及扰乱宿主免疫系统。一些疾病最好采用药物治疗，一些采用生物制品治疗，另一些采用例如体外光分离置换法，其余疾病的治疗选择非常有限。
现已证实体外光分离置换法(extracorporeal photopheresis，ECP)可有效治疗一些T-细胞介导疾病。在GVHD中，光分离置换法用于与局部曲安西龙软膏、抗真菌药、抗病毒药、抗生素、免疫球蛋白和甲氨喋呤的联合治疗。ECP也可与免疫抑制剂例如麦考酚酸吗乙酯、他克莫司、泼尼松、环孢霉素A、羟氯喹、类固醇、FK-506以及用于cGVHD和顽固性cGVHD的沙利度胺联合使用。对实体(solid)器官移植，ECP可与免疫抑制剂联合使用以降低与肾脏同种异体移植及心脏移植相关的急性同种异体移植物排斥反应的数量。例如，ECP可与OKT3和/或免疫抑制剂泼尼松、硫唑嘌呤、环孢霉素A联合使用以逆转急性肾脏同种异体移植物排斥。ECP还可与环磷酰胺、分次全身照射、用于同种骨髓移植的依托泊苷联合用于急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓白血病、非何杰金氏淋巴瘤或重度再生障碍性贫血。
发明概述
数种试验性策略已鉴定出ECP的药效学生物标记。pGvHD试验中患者试样的流式细胞计数分析表明特定树突状细胞亚型的相对丰度可预测GvHD发生倾向，也可反映ECP对该病变的影响。
流式细胞计数数据与中心实验室数据的相关性产生其它与DC细胞比例相关的候选生物标记，进而消除了对流式细胞计数研究的需求。此外，已鉴定出与研究中DC细胞亚型相关的B细胞亚型。本发明提供一组易测定的并在共同分析时提供ECP作用和疾病进展的统计学上有力(statistically robust)测定的标记。
附图简述
图1显示了临床试验和研究设计。
图2显示了PBMC的细胞计数表型分析。
图3显示了预测严重GvHD的DC谱(profiles)。DC亚型随GvHD级别变化。DC丰度热图以及(B.)中显示的CD11c+/CD11cDC曲线例证了之后患有GvHD的患者中这些DC亚型相对表达的差异。(C.)和(D.)显示了细胞表面标对数(logistic)回归分析的结果。此处，ROC反映了应用该标记区分介于0或1级和严重GvHD人群。较好检查的ROC接近1，最坏的检查ROC为0.5。
图4显示了预测TRM的DC谱。
图5显示了用不同生物标记建模并显示了本研究发现的TRM的最佳预测因子是包括CD11c+DC和NK细胞的模型。
图6显示了A)预测GvHD的模型。在59个结果中，只有单核细胞(ROC＝0.66)和中性粒细胞计数(ROC＝0.69)接近DC亚型对GvHD的预测能力。B)预测TRM的模型。实验室数据与患者人口统计学联合产生出对TRM有显著预测能力的模型。结果以独立方式(左下方)和联合建模方式(右下方的ROC曲线)显示。该模型的ROC曲线包括白蛋白、BUN/肌酸酐比例、供体匹配、匹配-亲缘关系和白蛋白相互作用。C)相关细胞表面标记和实验室数据。使用Pearson′s相关性将细胞表面标记数据与实验室结果进行比较以鉴别细胞谱和细胞计数分析中的相关变化。
发明详述
本申请文件中引用的所有参考文献均完整并入本说明书。术语“受试者”或“患者”可替换使用，并指动物，优选哺乳动物且更优选人类。
“细胞群”一般包括血液中存在的细胞类型。该术语可包括一个或多个血细胞类型，尤其是红细胞、血小板以及白细胞。细胞群可包含白细胞亚型，例如，T细胞、树突状细胞、B细胞等等。在一个实施方案中，细胞群可包含多种细胞类型的混合或集合。或者，细胞群可包含基本上纯化的细胞类型，例如，T细胞或树突状细胞。
“ECP方法”或“ECP”指体外光分离置换法，也称为体外光疗法。它是使细胞群接受紫外光和光激活化合物的疗法。优选来自器官或组织的细胞群；更优选血液部分的细胞群；最优选血沉棕黄层细胞群。ECP有时用于指在DNA交联剂例如补骨脂素(优选8-MOP)存在下用紫外光对细胞群进行凋亡诱导的方法。
在本发明最优选的实施方案中，ECP用于诱导细胞凋亡。其涉及向细胞群体外的加入光活化化合物。在从受试者、受体或供体采集之后(如可能的情况)以及暴露于紫外线之前或同时可将光活化化合物给予包含血细胞的细胞群。如果目标血细胞或血液成分可接受光活化化合物，可将光活化化合物可给予包含全部或部分血液的细胞群。在另一个实施方案中，可首先使用已知方法处理受试者血液、受体血液或供体血液的一部分以基本上去除红细胞，然后将光活化化合物给予所得到的含有白细胞富集部分的细胞群。
在另一种实施方案中，可体内给予光活化化合物。当体内给予包含受试者血液、受体血液或供体血液(如可能的情况)的细胞群时，感光化合物不仅可口服给药，还可静脉和/或其它常规给药途径给药。感光化合物的口服剂量在约0.3至0.7mg/kg的范围内，更具体而言，约0.6mg/kg。在口服给药时，可在光分离置换法治疗之前至少约一小时且不超过光分离置换法治疗之前约三小时给予感光化合物。
根据本发明所使用的光活化化合物包括但不限于如美国专利第4321919号和美国专利第5399719号所述如补骨脂素(或呋喃并香豆素)以及补骨脂素衍生物的化合物。优选化合物包括8-甲氧基补骨脂素、4，5′，8-三甲基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基补骨脂素、4，4-二甲基补骨脂素、4，5′-二甲基补骨脂素、4′-氨甲基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-羟甲基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′，8-甲氧基补骨脂素、以及4′-((ω-氨基-2-氧杂(oxa))烷基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，包括但不限于4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，所用感光化合物包含补骨脂素衍生物、amotosalen(S-59)(Cerus，Corp.，Concord，Calif.)。在另一个实施方案中，感光化合物包含8-甲氧基补骨脂素(8MOP)。
用某一波长的光线处理已加入光活化化合物的细胞群以活化光活化化合物。这一活化光活化化合物的治疗步骤优选使用长波长紫外光(UVA)进行，例如，波长在320至400nm的范围内。光分离置换法治疗中暴露的紫外光优选以给予足够长的时间以向细胞群传递约1-2J/cm2。
可用于根据本发明方法的体外光分离置换法装置包括Therakos，Inc(Exton，Pa.)生产的商品名UVARTM的装置。该装置的描述见美国专利第4683889号。该UVARTM系统使用一种治疗系统并由三个阶段组成，包括：1)收集血沉棕黄层(富集白细胞)，2)照射收集的血沉棕黄层，和3)再次输注已处理的白细胞。收集阶段包括六个循环的采血、离心和再输注步骤。在每一个循环中，将全血在分离杯中离心并分离。从这一分离中开始，每个收集循环可获得血浆(各循环的体积由UVARTM仪器操纵器测定)和40ml血沉棕黄层。在开始下一收集循环之前将红细胞和所有其它的血浆输注患者。最后总共分离得到240ml血沉棕黄层和300ml血浆，将其保存用于UVA照射。
在第一个收集循环的血沉棕黄层收集过程中开始在辐射回路中对白细胞富集血液进行照射。将收集的血浆和血沉棕黄层与200ml肝素化生理盐水和200mg UVADEXTM(水溶性8-甲氧补骨脂素)混合。该混合物以1.4mm厚层流过PHOTOCEPTORTM光活化室，其插在PHOTOSETTETMUVA灯的两个边缘之间。PHOTOSETTETMUVA等照射该UVA透过性PHOTOCEPTORTM室的两边，允许暴露于紫外A光线180分钟，使得每个淋巴细胞的平均照射量为1-2J/cm2。终血沉棕黄层试样预计包含20％至25％的全外周血单核细胞成分和约2.5％至7％的血细胞比容。光活化阶段之后，在30至45分钟内将该体积输注患者。美国专利申请第09/480893号(以参考形式并于本文)描述了用于给予ECP的另一种系统。美国专利第5951509、5985914、5984887、4464166、4428744、4398906、4321919号；PCT出版物WO97/36634和WO97/36581也包含对用于这一目的的设备和方法的描述。
美国专利申请第09/556832号描述了可用于本发明方法的另一系统。该系统包括可在ECP中减少自受试者收集或去除的静流体体积的装置。可使用美国专利第6129584号描述的方法和系统测定传递至一种细胞群的光能有效量。
在细胞群中诱导细胞凋亡的许多方法为本领域已知并可被采用于本发明中。一种该类治疗包括将细胞群电离照射(γ射线、x射线等)和/或非电离电磁照射包括紫外线、加热、冷却、去血清、去生长因子、酸化、稀释、碱化、离子强度变化、去血清、照射或其组合。或者可通过将细胞群超声诱导细胞凋亡。
另一种诱导凋亡的方法包括对细胞群体外应用氧化胁迫。可通过使用化学氧化剂例如过氧化氢，其它过氧化物和氢过氧化物、臭氧、高锰酸盐、高碘酸盐等处理混悬的细胞群完成。生物可接受氧化剂可用于减少与由此形成的凋亡诱导细胞群的残留和污染物相关的潜在问题。
在制备凋亡诱导细胞群时应注意不应用过量水平的氧化胁迫、照射、药物处理等，因为否则会引起至少一些被治疗的细胞坏死的显著风险。坏死使细胞膜破裂并释放细胞内容物并带来生物学有害结果，尤其是发炎，因此最好避免坏死细胞及其成分以及包含凋亡细胞的细胞群的存在。本领域技术人员可轻松测定诱导凋亡的适当细胞群治疗水平以及所选择的治疗类型。
依据本发明的一种方法包括来自受试者或相容哺乳动物细胞系的细胞培养物。然后可体外处理这些培养的细胞以诱导凋亡并在其中产生细胞群。该体外处理可选自抗体、化疗药物、辐射、体外光分离置换法、超声、蛋白质和氧化剂。然后将悬浮于受试者的血浆中或另一种适当悬浮介质(例如生理盐水或平衡哺乳动物细胞培养基)中的细胞给予患者。
用于检测和定量凋亡的方法可用于测定给予本发明受试者的制剂中是否存在凋亡及其水平。在受试者中获得需要的临床作用所要求的细胞群中的凋亡细胞数量可随细胞来源、受试者的病症、受试者年龄和体重以及其它相关因子而变化，这些均可通过熟知的方法测定。给予病人的凋亡细胞数量优选1-500亿。更优选10-100亿，最优选25至75亿。
在一个实施方案中，可通过在琼脂糖凝胶电泳上观察到的特征性梯状条带(由于DNA被断裂成一系列的片段)鉴定发生凋亡的细胞。在另一个实施方案中，磷脂酰丝氨酸在细胞上的表面表达可用于鉴定和/或定量凋亡诱导细胞群。检测线粒体膜电位的变化(可反应线粒体膜渗透性的改变)为鉴定细胞群的另一公认方法。在科学文献中还描述了其它许多鉴定发生凋亡的细胞和细胞群的方法，其中许多都使用细胞群特异性标记的单克隆抗体。
由于免疫抑制剂的成功使用，急性实体器官抑制排斥发生在肺移植之后30％至60％的患者中，肝脏、肾脏和心脏的程度更低。对移植抗原的淋巴细胞(细胞)介导免疫反应为急性排斥的主要机制。延迟或慢性排斥造成移植后数月至数年内对移植物的破坏并以导致移植组织坏死的血管损害为特征。通过标准疗法并不能较大幅度降低该排斥，因此对更持续的免疫耐受的需求是最显著的未被满足的需求。
偶尔会出现晚期移植物退化，尽管增强免疫抑制疗法但该慢性类型的排斥通常隐性发展。其病理图与急性排斥不同。主要涉及动脉内皮，其大量增殖可逐渐堵塞血管内腔，引起缺血和移植物纤维化。
目前广泛使用免疫抑制剂控制排斥反应并主要因此取得了移植成功。但是这些药物抑制所有的免疫反应，因此引起暴发性感染导致(移植物受体死亡的主要原因)。
现有免疫抑制疗法根据移植物的不同类型而变化。肝同种异体移植物比其它同种异体移植物的排斥较小。例如，肝脏移植的超急性排斥反应并不常常发生在对HLA抗原或ABO不相容性预先致敏的患者中。成人的典型免疫抑制疗法包括使用环孢霉素A，一般从移植时间开始静脉内给药4-6mg/kg/日，当对剂量耐受之后给予8-14mg/kg/日。如果出现肾功能不全可下调剂量，使用血药浓度作为适当剂量的近似测量。
在心脏移植中，免疫抑制疗法与用于肾脏或肝脏移植的疗法相似。但是在肺和心-肺移植物中>80％的患者出现急性排斥，但是可有效控制。用皮质激素(以高剂量快速静脉内给药)、ATG或OKT3治疗患者。在移植后的前两周也经常给予预防性ALG或OKT3。在血管化器官移植物中胰脏移植与众不同。它并不是用于拯救生命而是用于稳定或防止I型糖尿病的破坏性靶器官并发症。由于患者用胰岛素注射的风险替换了免疫抑制的风险，所以胰脏移植一般被限制性用于已需要接受免疫抑制药物的患者(即接受肾脏移植的肾衰竭患者)。
急性骨髓或成淋巴细胞白血病患者可从骨髓移植(BMT)中获益。由于其治疗患有遗传疾病(例如，地中海贫血、镰刀状细胞性贫血、免疫缺陷、遗传性代谢缺陷)儿童的潜能，儿科BMT已扩大应用范围。BMT的另一选择为自体移植(当诱导了完全缓解时去除患者自身骨髓，然后消融治疗患者寄希望于破坏任何残留肿瘤并拯救患者自身骨髓)。由于使用了自身移植物，除了用于根除肿瘤和骨髓消融的短期高剂量化疗外不必进行免疫抑制；GVHD的移植后问题最小。
来自HLA相同供体的移植物在白血病患者中的排斥率<5％。对于患有再生障碍性贫血经过多次输血的患者，由于在移植物诱导过程中增强了免疫抑制所以该排斥率也会被显著降低。但是可发生并发症包括宿主对骨髓移植物的排斥、急性GVHD和感染。之后的并发症包括慢性GVHD、长期免疫缺陷和疾病复发。
本发明方法也可用于移植物手术，例如，普遍用于美容或非美容整形手术中的移植手术。该类移植物可包括牙齿、脂肪移植(例如面颊、嘴唇和臀部)、面部移植，包括用于鼻子、面颊、前额、下颚和颅骨者，臀部移植物、胸部移植物等。其它移植物包括但不限于角膜环、皮质、眼眶、耳蜗、肌肉(所有的肌肉，包括胸部、臀部、腹部、腓肠肌、比目鱼肌、二头肌、三头肌)、异体关节和骨置换、椎发(vertebralhair)、胎细胞或干细胞移植。
树突状细胞(DCs)和强效抗原递呈细胞(APCs)的造血发育不同并且沿行数种与单核细胞紧密联系的前体途径。DCs可衍生自淋巴样前体。Thomas等，(1993)J.Immunol.150：821834。与血液中相似，存在于胸腺中的DCs有三个不同的亚型：1)类浆细胞CD4+CD11c-DCs；2)CD4+CD11c+DCs和3)指状突DCs。
最近通过与细胞因子一起体内培养祖细胞可产生大量用于潜在临床使用的DCs。采取多种方法将抗原导入树突状细胞这样在共刺激环境下它们可以被更有效地递呈给T细胞。也显示树突状细胞可影响对抗原的T细胞应答以沿行体液途径或全身途径。
DCs为起始初次免疫应答和产生耐受必须的APC。DCs表达MHC，其对于激活初始T细胞群是必需的。DCs的造血发育不同，可沿行数种前体途径，其中一些与单核细胞紧密相关。参见Avigan(1999)BloodRev，13：5164作为综述。不同的DC亚型具有不同的发育途径。日益形成的观念为一种DC亚型具有可辅助诱导自身抗原耐受的调节功能。Austyn(1998)Curr.Opin.Hematol.5：3-15。
由于该类细胞的缺乏和DC-特异性细胞表面标记的缺乏阻碍了对血液中DC的研究。分离DC的方法基于经过短期培养之后的成熟变化，例如获得低浮力密度，或者DC活化/成熟抗原(CD83、CMRF-44和CMRF-56)的表达。Young等，(1988)Cell Immunol.111：167；以及Voorhis等，(1982)I.Exp，Med.155：1172。
过去从血液中分离DCs依赖于许多免疫表型标准，如缺乏一组白细胞谱系(lin)特异性抗原(例如CD3、CD4、CD19和CD56)和存在HLA-DR、CD4或CD33。Romani等，(1996)J.Immunol.Met.196：137151。
对于分离自非培养血液的DC的分析可明显看出血液DC并不是同源细胞群而是至少两个群的混合物。Thomas等，(1994)。第一个血液DC亚群为CD123brightCD11c-DC，其具有类浆细胞形态和强效T细胞激活功能。第二类DC亚群为CD123dimCD11Cbright，其外表为单核细胞样，即使在没有外源细胞因子的条件下培养也表达CD45R0并同时发育成典型的成熟DCs。类浆细胞CD123brightCD11c-DC呈现出一些特点，例如表达前T细胞受体的α链，这表明它们可能来自淋巴样前体。Bruno等，(1997)J.Exp.Med.185：875 884。CD123dimCD11Cbright呈现所有骨髓样DCs的标准。在淋巴组织的T-细胞富集区检测出类似于类浆细胞CD123brightCD11c-DC的DCs，由于它们的形态和表型最初被错误地认定为类浆细胞T细胞或类浆细胞单核细胞。Grouard等，(1997)J.Exp.Med.185：1101 111。
我们现已发现一种DC亚型及其法分析方法，可作为检测GVHD易感性、进程和治疗GVHD的方法以及作为ECP的生物标记。
预防GVHD和临床结果(至少部分由ECP引起)反映于外周血CD11c+与CD11c-的比例及其在ECP之后的变化。
如其在临床试验中的鉴定所示，该生物标记可被可靠检测，对医生的要求不超过静脉切开术的复杂程度。而且，流式细胞计数测量是一项复杂的技术并且需要比大多数应用中所需要的更多的技术经验。来自pGvHA试验的丰富数据组创造了数种机会鉴定与该DC亚型存在相关并更容易被检测的其他生物标记(见下文)。
生物标记为所指示标记基因表达水平的任何标记。该标记可为直接或间接标记并且在给定生理参数并与内部对照、正常组织或另一中癌瘤对比时检测该基因的过表达或失表达。生物标记包括但不限于核酸(过表达和失表达二者以及直接和间接)。使用核酸作为生物标记可包括本领域已知的任何方法，包括但不限于检测DNA扩增、RNA、微小RNA、杂合现象(LOH)缺失、单核苷酸多态性(SNPs，Brookes(1999))、微卫星DNA、DNA低甲基化和高甲基化。使用蛋白质作为生物标记包括本领域已知的任何方法，包括但不限于测定数量、活性、修饰例如糖基化、磷酸化ADP-核糖基化、泛素化等或免疫组织化学(IHC)。其他生物标记包括成像、细胞计数和凋亡标记。
当其包含该序列时标记核酸对应于SEQ ID NO阐明的序列。当其包含所指序列的一部分或其补体足以区别其为该基因的序列时基因节段或片段对应于该基因的序列。当其RNA、mRNA、miRNA或cDNA与含有该序列(例如探针)的组合物杂交或在肽或蛋白质情况下其由该mRNA编码时基因表达产物对应于该类序列。当其包含所指基因表达产物的一部分或其补体足以将其区分为该基因或基因表达产物的序列时基因表达产物节段或片段对应于该类基因或基因表达产物的序列。
本申请描述和要求的发明方法、组合物、组件(articles)和试剂盒包括一个或多个标记基因。本申请全文中使用的“标记”或“标记基因”指对应于其过表达或失表达与GvHD或TRM发生概率相关的任何基因的基因和基因表达产物。
本发明进一步提供实施本文所述方法的微阵列或基因芯片。
本发明进一步提供诊断/预后组合物，其包含适用于检测生物标记(例如本文所述基因组合的已分离核酸序列、它们的补体或其一部分，其中该组合物足以检测或特性研究生物试样中的基因表达)的试剂。
本发明描述的任何方法可进一步包括检测至少一个在试样中组成型表达的基因。
本发明进一步提供通过根据本文所述方法测定GvHD或TRM可能性并鉴定其适当治疗方法而提供疗法指导的方法。
本发明进一步提供通过根据本文所述方法测定GvHD或TRM可能性并鉴定其相应预后方法而提供预后方法。
本发明进一步提供寻找生物标记的方法，其包括根据本文所述方法测定标记基因的表达水平、检测标记基因的生物标记以测定其表达、分析该标记基因的表达并测定该标记基因是否对GvHD或TRM具有有效特异性。
本发明进一步提供试剂盒、组件、微阵列或基因芯片、诊断/预后组合物用于进行本文所述分析以及用于报告通过本发明方法所得结果的病例报告。
仅组织试样中存在或不存在特定的核酸序列很少被发现具有诊断或预后价值。另一方面，各种蛋白质、肽或mRNA表达的信息越来越受重视。在基因组中自身具有潜能表达蛋白质、肽或mRNA(该类序列指“基因”)的核酸序列的存在不能确定蛋白质、肽或mRNA是否在给定细胞中表达。能够表达蛋白质、肽或RNA的给定基因是否进行了表达以及表达至何种程度(如果表达的话)取决于许多复杂因素。不考虑理解和分析这些因素的困难，分析基因表达可提供重要事件例如GvHD或TRM以及其他临床相关现象的可用信息。可在基因表达谱中发现基因活性或非活性程度的相对指征。
建立基因表达谱的优选方法包括测定可编码蛋白质或肽的基因产生的RNA的量。可通过逆转录酶PCR(RT-PCR)、竞争RT-PCR、实时RT-PCR、差异显示RT-PCR、northern杂交分析和其他相关检测完成。虽然可以使用单独PCR反应进行实施技术但是最好扩增由mRNA产生的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)并通过微阵列进行分析。本领域技术人员已知许多不同的阵列结构和它们的生产方法，例如描述于5445934、5532128、5556752、5242974、5384261、5405783、5412087、5424186、5429807、5436327、5472672、5527681、5529756、5545531、5554501、5561071、5571639、5593839、5533695、5624711、5658734和5700637。
微阵列技术允许同时检测成千上万个基因的稳态mRNA或miRNA水平，提供了鉴定如GvHD发病或调节等作用的有力工具。目前有两种微阵列技术被广泛使用，cDNA和寡聚核苷酸阵列。虽然这些芯片的结构存在差异，但是基本所有的下游数据分析和输出都是相同的。这些分析的产物通常来自标记探针的信号强度的检测，该探针用于检测来自试样中与阵列上已知位点的核酸序列杂交的cDNA序列。通常该信号强度与cDNA数量成比例，因此与相同细胞中表达的mRNA或miRNA成比例。优选的方法见6271002、6218122、6218114、6004755，以及Keene等，(2006)RIP-芯片：细胞提取物的核蛋白复合物的mRNA、microRNA和蛋白组分的分离和鉴定，Nature Protocols1：302-307。
通过比较这些信号强度进行表达水平的分析。最好通过生成待测试样基因表达强度与对照试样基因表达强度的比值矩阵进行。例如，可将患病组织中的基因表达强度与相同类型的正常组织中的表达强度进行比较。这些表达强度的比值可表明待测和对照试样中基因表达的改变倍数。
筛选可基于统计学检测，该检测可产生与GvHD或TRM相关因子之间各基因差异表达的显著性证据相关的等级列表。该类检测的实例包括ANOVA和Kruskal-Wallis。该等级评分可用作被设计用于解释该类权重总和的模型的加权直至截断，由于证据优势支持一个而非另一个类别。文献中描述的先前证据也可用于调节该加权。
可以数种方式呈现基因表达谱。最常用的方式为将原始荧光强度或比值矩阵排列在树状图中，其中列代表代测试样，行代表基因。将这些数据排列，这样具有相似表达谱的基因相互接近。各基因的表达比值以一种颜色来表示。例如，小于1的比值(下调)出现在该谱的蓝色区域而大于1的比值(上调)出现在该谱的红色区域。可使用市售计算机软件程序显示这些数据包括“GeneSpring”(Silicon Genetics，Ins)和“Discovery”以及“Infer”(Partek.Inc)。
在检测蛋白质水平测定基因表达时可使用本领域已知的任何方法只要它可得到足够的特异性和灵敏度。例如，可通过与对该蛋白具有特异性的抗体或抗体片段结合并测定抗体-结合蛋白质的量检测蛋白质水平。可用放射性、荧光或其他可检测试剂标记抗体以辅助检测。检测方法包括但不限于酶联免疫吸附检测法(ELASA)和免疫印记技术。
本发明的基因表达谱也可与其他非基因诊断方法联合用于诊断、预防或治疗监控。例如，某些情况下将上述基于基因表达的诊断技术与来自传统标记例如血清蛋白质标记的数据结合是有利的。在一个该类方法中，周期性从患者采血然后对血清标记例如白蛋白进行酶免疫检测。当标记浓度显示GvHD或TRM可能性时，采集可进行基因表达分析的试样。当其他检测方法产生不明确的结果时这一方法尤其有效。
根据本发明制造的试剂盒包括用于测定生物标记表达的格式化检测。这些可包括进行该检测所需的一些或全部材料，例如试剂、使用说明以及检测生物标记的介质。
本发明组件包括可用于治疗、诊断、预后或者评价疾病的生物标记表达的描述。将这些谱图(profile representations)还原至可被仪器自动识别的介质，例如计算机可识别的介质(磁性、光学等)。组件也可包括在该基质中评价基因表达谱的使用说明。例如，该组件包含具有比较上述基因组合(portfolios)的基因表达谱的计算机使用说明的CDROM。该组件也可具有数字记录于其中的基因表达谱，这样可将它们与来自其他患者的基因表达数据比较。或者，以不同的描述格式记录该谱。图形记录就是这样一种格式。上述Partek.Inc的“DISCOVERY”和“INFER”整合了合群集算法可最优辅助这些数据的可视化。
根据本发明的不同类型的生产组件为用于揭示基因表达谱的介质或格式化检测。这些可包括，例如微阵列，其中序列补体或探针被固定于基质上，指示相关基因的序列与其结合并产生可确定它们存在的可读数据。或者根据本发明的组件可做成试剂盒用于进行可指示相关基因表达水平的杂交、扩增和信号产生用于预测GvHD或TRM。
以下实施例用于举例说明并不限制已要求的发明。本文引用的所有参考文献均以参考形式并于本文。
实施例1
1.候选生物标记1：外周血树突状细胞亚型：(疾病预测生物标记、生物标记的作用机制(MOA)、治疗功效的生物标记)
对于来自GvHD预防试验的亚组研究试样的流式细胞计数分析表明未发展成为或仅为轻度GvHD(“无GvHD”，零级或一级)的患者与患有二、三或四级GvHD的患者相比外周血中CD11c+和CD11c-树突状细胞(lin-/HLADR+单核细胞，以单核细胞组分表达)二者的比例存在统计学显著差异。结果见表1和2。图1列出该试验，图2显示了PBMC的细胞计数表型分类。
表1
Figure A200780025301D00161
我们检测了来自32个ECP-治疗亚组患者的血液以鉴定可预测GvHD或TRM的外周血细胞表面标记。在ECP之前和之后但是在清髓性预处理之前立即采样(基线)，然后用流式细胞计数仪检测。将细胞计数数据分组并建模，单独或与临床实验数值一起评价它们的预测准确性。对数回归表明清髓之前存在的特异DC亚型的标记可以最好地预测结果。当基线lin-/HLADR+CD11c+骨髓细胞以预测准确性组成循环lin-/HLADR+细胞地一部分时II-IV级GvHD(aGvHD)可能性增加，反映于0.83的受试者工作曲线(ROC)下面积。TRM的最佳预测模型为基线处更低的循环lin-/HLADR+CD123+类浆细胞DC的绝对丰度(ROC＝0.86)。在包括实验数值之后没有增加更多对GvHD和TRM的预测能力。但是结合了一些临床实验室结果和人口统计因素的模型也预测出这些结果并提供了复杂细胞流式计数检测的另一选择。最好的该类模型包括用于预测TRM的BUN/肌酸肝比值、血清白蛋白以及移植物供体和受体的匹配/亲缘性(ROC＝0.82，n＝59)的基线检测量，而基线中性粒细胞技术可最佳预测GvHD(ROC＝0.69，n＝60)。总而言之，我们已鉴定出至少在接受ECP的患者中在预处理之前存在并可预测结果的生物标记、包括宿主DC亚群、易检测的临床试验和人口统计学因素。
当考虑绝对DC细胞计数时，CD11c+和CD11c-DC对于给定外周血细胞群的相对贡献明显可以测预该病人中GvHD的最后发展。具体而言，给定患者试样中CD11c+和CD11c-DC细胞的比值与之后未发展为严重(2至4级)GvHD的病人偏离1至与之后发展为严重GvHD的病人偏离低至0.006。
数据的模式表明了这一生物标记的粗放度(ruggedness)。虽然下面显示的绝对计数在每毫升基础上较小，但考虑相关CD123+/-细胞群的计数就绝对计数和比值而言该结果具可重现。这一比较显示了标记(-)绝对计数的合理重现(duplication)以及CD123-和CD11c-群之间的紧密关系。确实，在ECP之前和之后二者的试样中lin-/HLADR+CD11c和lin-/HLADR+CD123-高度相关(Pearson相关系数r分别为0.95和0.985)，表明这些测量值可代表相同的细胞群。此外，这些绝对计数与之前报道的正常人群和GvHD人群的DC计数一致。我们研究的独特性在于它检验了CD11-和CD123-群，而绝大多数研究检测抗体阳性，更多成熟DC群。因此我们已鉴定出与临床结果相关的一类新的DC群。
表2
ECP前DC绝对值
GvHD       HLA-         HLA-          HLA-         HLA-      淋巴
                                                                        白细胞
等级    DR+/CD123+   DR+/CD123-   DR+/CD11c+   DR+/CD11c-    吸光值
0       7            15           10           12            670        3300
0       5            12           9            8             401        2400
0       1            8            3            6             383        1200
0       2            15           9            8             947        3200
0       4            11           6            8             847        5800
0       3            4            3            4             252        3500
0       3            6            5            4             462        1600
0       5            19           16           6             1290       2300
0       0            2            1            1             597        3000
0       5            5            3            7             578        5300
0       3            17           15           5             672        4700
1       5            18           9            14            984        4600
1       4            8            6            6             585        3800
1       5            7            5            7             942        2700
1       1            103          44           59            1643       8300
2       7            19           11           15            332        2200
2       4            34           13           25            492        6000
2       31           27           7            50            1085       2700
2      2     14     2       14       2845     10900
2      1     6      5       2        1502     3500
2      0     267    7       260      1288     3700
2      3     11     4       9        832      3300
3      0     2      1       1        1140     3700
3      1     4      1       3        499      5200
3      2     7      3       5        779      4100
3      1     487    3       485      1705     3500
3      163   25     4       187      2415     11500
4      0     2      0       2        274      11900
4      1     29     5       23       611      8600
4      0     4      3       1        281      2300
4      2     24     3       23       422      1500
4      1     9      3       8        352      4000
Cd11c+与Cd11c-的比值对GvHD等级的曲线显示该比值与最终患者中GvHD严重性的关系。图3、图4-6显示了预测TRM的DC曲线。
其它模式包括该比值在ECP治疗后向阳性偏移的倾向以及具有前-BMT比值的患者向死亡率更低的数值更靠近的倾向(0-1死亡2例比2-4组死亡5例)。测量值的差异性和供体与受体之间的关系均与GvHD等级无关，进一步表明受体-特异性特点驱动向GvHD的倾向。
已提出在许多相关条件下包括塞扎里氏综合征(Sezarysyndrome)、实体器官和骨髓移植包括GvHD、实体肿瘤、异位性皮炎、炎性肠病和全身病毒感染中DC1/DC2比值和未成熟DC的比例可作为疾病进展和治疗结果的预后指标。
抗原阴性DC的数量与活化B细胞群有很大相关性。在所有亚组研究参与者中DC11c-的数量和很可能CD123-DC的数量与CD19+/CD27+以及CD19+/CD40+(r分别为0.91和0.8)相关，而与总CD19+/CD20+B细胞计数(r＝0.64)相关性较小。这些数据表明循环中CD11c-/CD123-DC的绝对数量可反应B细胞的活化程度(GvHD中的相关考虑因素)。
实施例2
II候选生物标记2和3，血清GGT和LDH(用于疾病预测的生物标记、MOA、治疗功效)
使用DC11c+/DC11c-比值，检测中心实验室数据寻找DC亚型比例和GvHD严重性二者的相关物。在移植前试样中出现了两个新的相关物、升高的血清GGT和LDH。这些标记的升高以及显著被抑制的血小板计数可以将之后患有高等级GvHD的个体和0级个体区分开来，基线和后-ECP试样中均有一个GvHD。
由于衍生自DC11c比例，这些中心实验室标记满足流式细胞计数所需的所有标准，但是具有方便检测和解释的附加优点。GGT被广泛用作硬化症肝损伤和其它肝病的标记，LDH通常被认为是细胞溶解的量度。由于移植前患者中的这些标记升高并似乎与之前鉴定的GvHD风险因子(低血小板计数)相关，它们可提供比上述流式细胞计数测量更多的优点。
GvHD诊断的实现
这些观察结果表现出用于急性GvHD发病或严重性的第一预测标记或标记组。有资质的实验室可容易地使用流式细胞计量法进行DC亚型的绝对或相对定量以预测发病。或者，使用单核细胞或中性粒细胞计数与其它易感性标记一起增强预测并指导骨髓移植后的治疗。
与其它诊断方法一起使用这些预测性细胞亚型可鉴定具有预测性协同变异被分析物(即血浆或血清成分或其它生物标记)或可增加DC亚型的预测能力。这一观测和随之而来的诊断学也相关并广泛适用于接受骨髓移植的患者。
实施例3
对数回归分析用于鉴定给予ECP的高危病人(移植引起死亡和II-IV级GvHD)，使用基线标记、实验室和人口统计变量预测结果。收集来自62个受试者的人口统计信息，其中13名受试者为移植相关死亡，22名受试者患有II/IV级的急性GvHD。缺失了一名受试者的III/IV级急性GVHD，该受试者不属于该标记亚组。由于缺失的数据引起受试者数量以及实验室数值变化。收集标记数值的患者亚组的患者总数为23名，9名患者为移植相关死亡以及15名患者患有III/IV级急性GVHD。
标记数值n＝32
分析具有基线标记数值的患者亚组以测定该标记数值是否有助于预测各结果(移植引起的死亡和II-IV级GvHD)。表3和4提供的变量为所有收集的标记变量中的最佳预测因子。将这些标记变量置于模型中作为持续变量。
表3
Figure A200780025301D00201
表4
Figure A200780025301D00202
在该患者亚组中最佳的移植引起死亡预测因子为HLAmDRsCD123cs的降低。II-IV级GvHD的最佳预测因子为p_HLAmDRsCD11cs的降低。
实验室和人口统计学数值N＝62
分析所有接受ECP的患者以测定基线实验室数值或人口统计学数值是否有助于预测各结果。基于饱和模型和基础模型的-2log可能性数值的差异测定的显著性水平筛选模型作为“最佳”模型。由最佳模型得到的结果见表5-10.
预测移植引起死亡的最佳模型包含变量L_BUN_CREATININE_RATIO，L_ALBUMIN_G_DL_，以及未匹配与匹配比。
表5
Figure A200780025301D00211
预测II-IV级GVDH的最佳模型仅含变量L_NEUTROPHIL_。
表6
Figure A200780025301D00212
结果：实验室和基线数值
前述表格总结自以下数据
表7和8
 
                              死亡           总体标记数值                           无n＝23n＝9           n＝32
HLAmDRsCD11cs    <＝3     n    8.0    5.0    13.0％   88.9   21.7   40.63-5      n    1.0    5.0    6.0％   11.1   21.7   18.85-9      n    0      7.0    7.0％   0      30.4   21.99<       n    0      6.0    6.0％   0      26.1   18.8CD3mCD16sCD56s   <＝110   n    5.0    4.0    9.0％   55.6   17.4   28.1110-206  n    2.0    6.0    8.0％   22.2   26.1   25.0206-385  n    1.0    8.0    9.0％   11.1   34.8   28.1>385     n    1.0    5.0    6.0％   11.1   21.7   18.8
结果：实验室和基线数值
表9和10
 
                              死亡实验室和基线数值                   无n＝49  总体n＝62n＝13
L_BUN_CREATININE_RA    <＝11      n     3.0    12.0    15.0TIO％    23.1   24.5    24.211-14      n     0      15.0    15.0％    0      30.6    24.214-19      n     3.0    14.0    17.0％    23.1   28.6    27.4>19        n     6.0    6.0     12.0
 
                        ％    46.2   12.2    19.4缺失       n     1.0    2.0     3.0％    7.7    4.1     4.8L_ALBUMIN<＝3.9     n     6.0    10.0    16.0_G_DL_％    46.2   20.4    25.83.9-4.15   n     4.0    11.0    15.0％    30.8   22.4    24.24.51-4.5   n     2.0    16.0    18.0％    15.4   32.7    29.0>4.5       n     1.0    12.0    13.0％    7.7    24.5    21.0匹配对不匹不匹配     n     11.0   22.0    33.0配％     84.6   44.9    53.2匹配       n      2.0    27.0    29.0％      15.4   55.1    46.8
结果：2-4级GVHD
 
标记数GVHD n＝15  无n＝17  总体n＝32值
p_HLAmDRsC      <＝20.6       n     8.0     0       8D11cs％    53.3    0       2520.6-35.44    n     4.0     4.0     8％    26.7    23.5    2535.44-46.67   n     1.0     7.0     8％    6.7     41.2    25>46.67        n     2.0     6.0     8％    13.3    35.3    25
 
实验室GVHD n＝22   无n＝39   总体n＝61数值
L_NEUTROPH    <＝42.1      n    7.0000    4.0000    11.0000IL_％   31.8000   10.3000   18.000042.1-57.65   n    6.0000    9.0000    15.0000％   27.3000   23.1000   24.600057.64-70.45  n    5.0000    9.0000    14.0000％   22.7000   23.1000   23.0000>70.45       n    4.0000    16.0000   20.0000％   18.2000   41.0000   32.8000缺失         n    0         1.0000    1.0000％   0         2.6000    1.6000
注：缺失了1名受试者的GVHDY/N
实施例4
预测
骨髓移植为有白血病患者或其它危及生命的遗传疾病患者的普遍接受的治疗方法。不幸地是，20-50％的同种造血干细胞移植受体都患有移植物抗宿主病，其为供体T-细胞介导的对受体组织的攻击。目前，预防GvHD主要依靠针对T细胞的全身免疫抑制(CSA等)。去除供体群中的T细胞可显著降低移植物抗宿主反应但是会另外影响移植物移入、抑制根除受体中的恶性细胞以及影响供体免疫力的重建(使受体易复发白血病)。
由于其免疫调节作用，ECP已显示出可在数种炎性和自身免疫疾病中提供有利(拯救生命)保护，包括皮肤T细胞淋巴瘤、硬皮病、类风湿性关节炎、移植排斥、急性和慢性GvHD。用ECP预治疗BMT患者被认为是通过调节抗原递呈细胞区域发挥作用。更具体而言，移植物和受体二者中的树突状细胞(DCs)可能刺激了对同种BM移植物的排斥。DCs的成熟是通向移植排斥刺激的关键步骤。为了评价ECP是否对免疫细胞(T细胞、NK细胞和DCs)具有免疫调节作用，进行该亚组分析以检测免疫细胞区域的表型变化。在光分离置换法之前和之后但在全身照射(TBI)之前收集各病人的血样。接受移植物一年之后收集第三个血样。
研究目的
与单独标准清髓性预处理疗法对正进行同种同胞或非亲缘骨髓移植或外周血干细胞移植(PBST)用于治疗血液恶性肿瘤的患者的急性或慢性GvHD发病率的作用相比通过
Figure A200780025301D00251
研究ECP对之前接受标准清髓性预处理治疗的患者的外周血树突状细胞和T细胞区域的免疫调节作用。
研究涉及和样本量
该多中心亚组研究通过测定ECP对接受ECP后在骨髓移植前进行环磷酰胺和TBI标准清髓性预处理方案的患者外周血树突状细胞、T细胞和NK细胞区域的免疫调节作用。只包括符合GvHD试验入选标准并给予知情同意的患者。因此样本量取决于提供知情同意参加pGvHD试验的患者数量。
约5-6个中心参加了该预防GvHD研究。在参加预防GvHD研究的总共50-60名患者中每中心约10名患者接受ECP，约20-30名患者预期给予知情同意参加该临床亚组研究。患者参加该亚组研究365天。
亚组研究操作的具体说明
采样时间
为了进行该亚组研究，在以下时间点从每名患者中总共采集3个血液试样：
◆试样PT1：ECP治疗21至10天前采集
◆试样PT2：接受移植后7天采集
◆试样PT3：接受移植后365天采集
将患者血液收集于肝素化真空采血管(vacutainer)中并标注患者编号、就诊编号、日期和采血具体时间。将血样连夜运输至Esoterix，Inc.(Tennessee)。通过Ficoll梯度离心机从全血中分离白细胞。用对多个谱系、活化和分化标记具有特异性的荧光标记抗体与单核细胞反应。用于患者血样免疫表型分类的组包括但不限于T细胞、NK细胞和树突状细胞特异性抗体。在Becton Dichinson FACScan上通过流式细胞计数法进行抗原表达水平的分析。
技术操作
在每一个采样点，通过静脉穿刺从前臂静脉采集8ml血样至含有肝素钠的玻璃试管中。通过倒置混合试样并在包装至所提供的运输容器之前于室温下保存。
统计方法
对所得数据进行统计学检验以测定是否可在DC、T细胞、或NK表型和疾病或治疗结果之间建立联系。
实施例5
miRNA表达谱
如上所述获得DCs，如之前所述获得miRNA并进行分析。Keene等，(2006)RIP-芯片：细胞提取物的核蛋白复合物的mRNA、microRNA和蛋白组分的分离和鉴定，Nature Protocols 1：302-307。所得结果见表11。
表11
 
列ID 平均值(前_ECP*无_gvhd) 平均值(后_ECP*无_gvhd) 平均值(前_ECP*严重) 平均值(后_ECP*严重)
hsa_miR_223 12.70 11.91 11.60 13.79
hsa_miR_15b 9.76 10.55 12.88 10.68
hsa_miR_486 9.64 10.59 12.40 8.97
hsa_miR_185 8.70 10.38 11.54 9.08
hsa_miR_23a 9.62 9.16 9.32 11.58
hsa_miR_106b 7.86 11.15 9.93 8.81
hsa_miR_92 7.16 8.29 10.39 7.92
hsa_miR_18a 6.69 9.14 7.99 6.88
hsa_miR_194 6.81 7.45 9.04 6.46
mo_miR_363_3p 6.60 7.61 8.62 6.28
hsa_miR_363 6.69 7.61 8.49 6.14
hsa_miR_182 6.49 8.13 8.36 5.03
hsa_miR_27a 6.79 5.96 5.34 8.21
hsa_miR_145 6.48 5.71 5.01 8.13
hsa_miR_140 7.77 5.09 3.96 6.00
 
hsa_miR_130a 3.96 5.22 7.81 5.66
ambi_miR_11541 4.77 5.47 6.78 4.50
ambi_miR_3998 4.93 4.04 4.96 7.51
hsa_miR_143 5.02 3.74 3.91 7.25
hsa_miR_489 2.47 2.47 10.60 3.04
hsa_miR_101 3.06 4.44 6.50 3.75
hsa_miR_151 2.25 4.99 6.06 4.24

Claims (15)

1.预测患者中移植物抗宿主疾病(GvHD)的发病和/或严重性的方法，其包括以下步骤：
a.从患者获得含有树突状细胞(DCs)的试样；
b.检测与DC表面CD11c相关的生物标记；以及
c.测定CD11c+和CD11c-细胞之间的比例，
其中比值小于约1表明存在GvHD。
2.根据权利要求1的方法，其中在用自体凋亡细胞治疗患者之后获得所述试样。
3.根据权利要求2的方法，其中通过用体外光分离置换法(ECP)治疗患者获得所述细胞。
4.预测患者中移植物抗宿主疾病(GvHD)的发病和/或严重性的方法，其包括以下步骤：
a.从患者获得血清试样；
b.检测与γ-谷氨酰转移酶(GGT)和乳酸脱氢酶(LDH)相关的生物标记；以及
c.测定这些生物标记的水平是否升高，
其中移植前这些生物标记的升高表明存在GvHD。
5.预测患者中移植物抗宿主疾病(GvHD)的发病和/或严重性的方法，其包括以下步骤：
a.从患者获得含有中性粒细胞的试样；
b.检测已知体积中中性粒细胞的数量；
其中移植前中性粒细胞数量减少表明存在GvHD。
6.通过根据权利要求1、4或5测定GvHD存在的可能性并鉴定其适当疗法而提供疗法指导的方法。
7.通过根据权利要求1、4或5测定GvHD存在的可能性并鉴定其相应预后方法而进行预后的方法。
8.用于进行权利要求1、4或5的检测方法的试剂盒，其包括生物标记检测试剂。
9.用于进行权利要求1、4或5的方法的微阵列或基因芯片。
10.预测患者中移植相关死亡(TRM)的发生和/或严重性的方法，其包括以下步骤：
a.从患者获得含有树突状细胞(DCs)的试样；
b.检测与类浆细胞DC表面lin、HLA-DR和CD123相关的生物标记；
其中基线处lin-HLA-DR+CD123+类浆细胞DCs的较低绝对丰度表明存在TRM。
11.预测患者中移植相关死亡(TRM)的发生和/或严重性的方法，其包括以下步骤：
a.获得血清γ-谷氨酰转移酶和乳酸脱氢酶的基线测量值，
其中移植前这些生物标记的升高表明存在TRM。
12.通过根据权利要求10或11测定TRM存在的可能性并鉴定其适当疗法而提供疗法指导的方法。
13.通过根据权利要求10或11测定TRM存在的可能性并鉴定其相应预后方法而进行预后的方法。
14.用于进行根据权利要求10或11的检测方法的试剂盒，其包括生物标记检测试剂。
15.用于进行权利要求10或11的方法的微阵列或基因芯片。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093504A1 (en) * 2012-12-11 2014-06-19 Duke University Microrna biomarkers for graft versus host disease
CN106461679B (zh) 2014-03-12 2018-10-09 西奈山伊坎医学院 鉴定处于慢性损伤风险的肾异体移植物接受者的方法
EP3161158B1 (en) 2014-06-26 2021-10-06 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Methods for diagnosing risk of renal allograft fibrosis and rejection
US11572587B2 (en) 2014-06-26 2023-02-07 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Method for diagnosing subclinical and clinical acute rejection by analysis of predictive gene sets
WO2017100259A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Pretransplant prediction of post-transplant acute rejection
US11214839B2 (en) * 2017-01-09 2022-01-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Circulating microRNA signatures for ovarian cancer
BR112020019972A2 (pt) 2018-04-16 2021-01-05 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Métodos para identificar um receptor de aloenxerto renal e para identificar um receptor de aloenxerto renal em risco de rejeição aguda do aloenxerto antes do transplante, kit para identificar receptores de aloenxerto renal e método para selecionar um paciente com aloenxerto renal
JP2022104118A (ja) * 2020-12-28 2022-07-08 浜松ホトニクス株式会社 被験者の腎臓以外の臓器及び組織のミトコンドリア機能を評価する方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4428744A (en) 1979-12-11 1984-01-31 Frederic A. Bourke, Jr. Method and system for externally treating the blood
US4398906A (en) 1979-12-11 1983-08-16 Frederic A. Bourke, Jr. Method for externally treating the blood
US4321919A (en) 1979-12-11 1982-03-30 Leukocyte Research, Inc. Method and system for externally treating human blood
US4464166A (en) 1981-06-12 1984-08-07 Frederic A. Bourke, Jr. Method for externally treating the blood
US4683889A (en) 1983-03-29 1987-08-04 Frederic A. Bourke, Jr. Method and system for externally treating the blood
US5399719A (en) 1993-06-28 1995-03-21 Steritech, Inc. Compounds for the photodecontamination of pathogens in blood
CA2250919C (en) 1996-03-29 2008-05-13 Therakos, Inc. Photopheresis treatment of leukocytes
ES2251020T3 (es) 1996-03-29 2006-04-16 Therakos, Inc. Tratamiento por fotoferesis de infecciones por hcv cronicas.
US5951509A (en) 1996-11-22 1999-09-14 Therakos, Inc. Blood product irradiation device incorporating agitation
DK0994743T3 (da) 1997-07-10 2006-10-02 Therakos Inc Behandling af inflammatoriske lidelser i tarm eller urinblære
US6218114B1 (en) 1998-03-27 2001-04-17 Academia Sinica Methods for detecting differentially expressed genes
US6004755A (en) 1998-04-07 1999-12-21 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Quantitative microarray hybridizaton assays
US6218122B1 (en) 1998-06-19 2001-04-17 Rosetta Inpharmatics, Inc. Methods of monitoring disease states and therapies using gene expression profiles
AU3862200A (en) * 1999-03-01 2000-09-21 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Rapid assay for infection in small children
US6219584B1 (en) 1999-07-09 2001-04-17 Therakos, Inc. Method and system for determining an effective amount of light energy to delivery to fluids having targets for the light energy
US6271002B1 (en) 1999-10-04 2001-08-07 Rosetta Inpharmatics, Inc. RNA amplification method
JP2002014104A (ja) * 2000-06-30 2002-01-18 Mochida Pharmaceut Co Ltd Ｇｖｈｄの検出方法
CN1327927C (zh) * 2001-04-10 2007-07-25 生物功效学股份有限公司 细胞分离组合物和方法
US20030022252A1 (en) * 2001-07-13 2003-01-30 Thomson Angus W. Method for identifying tolerance in graft recipients
US7465555B2 (en) * 2002-04-02 2008-12-16 Becton, Dickinson And Company Early detection of sepsis
US7476514B2 (en) * 2002-04-11 2009-01-13 Cylex, Inc. Method for monitoring the immune response and predicting clinical outcomes in transplant recipients

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