ES2251020T3 - Tratamiento por fotoferesis de infecciones por hcv cronicas. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA TRATAR INFECCIONES CRONICAS POR HCV. EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE EL TRATAMIENTO OPCIONAL DE UN PACIENTE CON INTERFERONA ALFA Y EL TRATAMIENTO DE LA SANGRE DEL PACIENTE CON UN COMPUESTO DE PSORALEN SEGUIDO POR LA ACTIVACION POR LUZ ULTRAVIOLETA DE COMPUESTO DE PSORALEN. LA SANGRE TRATADA DE ESTA FORMA SE HACE VOLVER AL PACIENTE EN UN PROCESO CONTENIDO POR FOTOFERESIS EXTRACORPORAL.

Description

Tratamiento de fotoferesis de infecciones por HCV crónicas.

Antecedentes de la invención

La fotoferesis extracorpórea es un proceso en el que se administra 8-metoxipsoralen (8-MOP), un compuesto natural sensible a la luz, por vía oral dos antes del tratamiento; se extrae sangre del paciente, se anticoagula y se separan los glóbulos blancos por centrifugado y se recogen como una fracción enriquecida en leucocitos. Estos leucocitos que contienen 8-MOP se irradian después con luz ultravioleta A (UVA) que une 8-MOP con las bases pirimidina del ADN o con proteínas intra- y extra-celulares. Se retornan estos leucocitos tratados al paciente, y el resultado es una inmunomodulación que ha sido considerada como beneficiosa clínicamente en una serie de estados patoló-
gicos.^{1}

Existe una serie de enfermedades en las que, según se cree, participan principalmente células T o están mediadas por células T. Enfermedades como linfoma de células T cutáneo, rechazo a aloinjerto de órgano después de transplante y enfermedades como esclerosis sistémica progresiva (PSS), artritis reumatoide y diabetes melitus de inicio en la juventud (JODM), son estados patológicos que según se cree, están mediados por células T.

El linfoma de células T cutáneo (CTCL) es una enfermedad maligna que es progresiva. Las opciones terapéuticas están limitadas. Edelson y cols. llevaron a cabo una prueba^{2} en varios centros que demostró que 24 de cada 29 (83%) pacientes eritrodérmicos experimentaron una significativa mejora en su enfermedad. Estas respuestas positivas fueron consideradas en un período medio de 224 semanas tras el inicio de la terapia. Hay que destacar como dato importante desde el punto de vista clínico que se trataba de los mismos pacientes que habían presentado resistencia a una terapia anterior, y considerados como un grupo de pronóstico pobre. Por otra parte, se observó una disminución de la cantidad de sangre periférica que participaba (células Sezary). Los datos de Actuarial han indicado que la supervivencia media aumentó a más de 60 meses desde el inicio del tratamiento en comparación con un tiempo de supervivencia medio histórico de menos de 30 meses. En este grupo de pacientes original, se mantuvieron las remisiones en ocho de los sujetos que eran leucémicos. Las reacciones negativas asociadas con la fotoforesis fueron raras.

Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por una disregularización del sistema inmune, caracterizada por una destrucción mediada por humores o células específicas de órganos o tejidos específicos del paciente. Entre los ejemplos de dichas enfermedades se incluyen artritis reumatoide y esclerosis sistémica progresiva.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria que conduce finalmente a la destrucción de las articulaciones y es una enfermedad generalizada que implica a muchos sistemas orgánicos. Existen muchos agentes en uso para combatir la RA, sin embargo, son necesarios agentes que se toleren bien con un potencial de modificación de la enfermedad, en la medida en que la enfermedad es crónica. En particular, se observa una pérdida de la eficacia y la progresión de la enfermedad en un alto número de pacientes tras el comienzo de la terapia de línea secundaria para A.R. Muchos de los agentes de segunda línea son inmunosupresores y son en sí mismos la razón de los principales efectos secundarios, como por ejemplo infección. Existe una gran necesidad de desarrollar una terapia^{3} de inmunomodulación no tóxica, más específica.

La esclerosis sistémica progresiva (PSS) es una enfermedad de los tejidos conectivos que se caracteriza por cambios inflamatorios y fibróticos en la piel y las vísceras. El tratamiento ha resultado complicado. Los fármacos anti-inflamatorios y los corticosteroides son útiles en los primeros estadios de la enfermedad, pero no parecen influir en la progresión de la enfermedad. Se han puesto en marcha pruebas con D-penicilamina, metotrexato, ciclosporina, bloqueadores del canal de calcio y prostaglandinas, pero estos agentes no parecen influir en la progresión global de la enfermedad. Dado que se ha considerado que esta enfermedad está mediada por células T, Rock y sus colegas han tratado a los enfermos afectados por PSS con fotoferesis^{4}. En dicha prueba, participaron 56 pacientes en una prueba clínica que no era ciega al azar. Se observó una respuesta significativamente más alta en el grupo tratado con fotoferesis (68% de índice de respuesta) en comparación con el grupo tratado con D-penicilamina (control) (32% de índice de respuesta).

Se cree que la diabetes melitus de inicio en la juventud (JODM) está mediada por el sistema inmune con el resultado de la destrucción de las células en el páncreas responsables de la producción de insulina. Los enfermos afectados por este trastorno no solamente sufren una disregulación de sus niveles de azúcar en la sangre, sino que dicha enfermedad se caracteriza además por una vasculopatía, que deriva en un daño orgánico específico que conduce a una morbididad y mortalidad significativas.

Otros fenómenos mediados por células T incluyen el rechazo de tejidos que son extraños para el huésped. En el caso de transplante de aloinjerto de órgano, es deseable prevenir dicho rechazo en lo que se refiere al órgano trasplantado, al mismo tiempo que se mantiene sin embargo la competencia del sistema inmune, de manera que el cuerpo pueda combatir la infección y dar cabida a otras defensas del cuerpo normales. Los tratamientos normales tras el trasplante están limitados ya que los regímenes de inmunosupresión usados causan un estado de inmunosupresión general, que lleva a la reacción negativa más común a este tratamiento, de nuevo la infección, que podía consistir en una infección bacteriana u oportunista.

La inmunomodulación que no tiene propiedades inmunosupresoras podría ser más deseable. Se ha demostrado que la fotoferesis es eficaz; los investigadores de la universidad de Loyola han sido capaces de tratar con éxito por fotoferesis 13 de 14 casos de rechazo cardíaco refractario a los agentes inmunosupresores normales. En una variación de esta situación, se ha utilizado con éxito la fotoferesis (Rossetti y cols^{5} y otros) para tratar a un paciente con enfermedad de injerto contra huésped crónico. Este trastorno se caracteriza por un huésped inmunoincompetente por inducción introgenética, en el que se administran por infusión células competentes inmunes (médula ósea o células madre periféricas) al paciente en situaciones como puedan ser el tratamiento de diversas malignidades y leucemia. En este punto, las células inmunocompetentes transplantadas atacan al paciente (el "huésped"). También en este caso, la cuestión consiste en modular las células inmunocompetentes sin causar una mayor inmunosupresión y los efectos secundarios de la misma.

La fotoferesis implica la exposición extracorpórea de leucocitos de sangre periférica a 8-metoxipsoralen (8-MOP) fotoactivado con luz ultravioleta A, seguido de la reinfusión de los glóbulos blancos tratados.

Las moléculas de 8-metoxipsoralen en la sangre entran en los núcleos de los glóbulos blancos y se intercalan en la hélice de ADN de doble hebra. En un circuito extracorpóreo, se dirige luz ultravioleta de onda larga a la fracción de sangre enriquecida en leucocitos dentro del sistema de fotoforesis UVAR. El fármaco fotoactivado, que responde a la energía UVA, se une a la base timidina de la hélice de ADN. Esto tiene como resultado la reticulación de bases de timidina lo que previene el desenrollamiento del ADN durante la transcripción. A continuación, se vuelven a administrar por reinfusión el plasma y los leucocitos alterados al paciente. La reinfusión de los leucocitos dañados por fotoferesis tiene como resultado un retraso en el ataque inmune contra estos leucocitos dañados, así como los glóbulos blancos sin modificar que despliegan los mismos antígenos de superficie celular.

Sistema UVAR

El tratamiento consiste en tres fases, incluyendo 1) la recogida de una fracción de leucocitario (enriquecida con leucocitos), 2) irradiación de la fracción de leucocitario recogida, y 3) reinfusión de los glóbulos blancos tratados. La fase de recogida tiene seis ciclos de extracción de sangre, centrifugado y etapas de reinfusión. Durante cada uno de los ciclos, se centrifuga sangre completa y se separa en un recipiente de feresis pediátrico. A partir de esta separación, se reservan plasma (el volumen de cada ciclo lo determina el operador que maneja el instrumento UVAR) y 40 ml de leucocitario de cada ciclo de recogida. Se administran por reinfusión glóbulos rojos y todo el plasma adicional al paciente antes de comenzar el siguiente ciclo de recogida. Finalmente, se separan un total de 240 ml de leucocitario y 300 ml de plasma y se reservan para irradiación UVA.

La irradiación de la sangre enriquecida en leucocitos dentro del circuito de irradiación comienza durante la recogida de leucocitario en el primer ciclo de recogida. Se mezclan el plasma recogido y el leucocitario con 200 ml de solución salina normal heparinizada y 200 mg de UVADEX, (8-metoxipsoralina hidrosoluble). La mezcla fluye en una capa de 1,4 mm de espesor a través de la Cámara de Fotoactivación PHOTOCEPTOR, que se inserta entre dos bancos de lámparas UVA del PHOTOSETTE. Las lámparas UVA de PHOTOSETTE irradian ambas caras de esta cámara PHOTOCEPTOR transparente a los UVA, permitiendo una exposición de 180 minutos a la luz ultravioleta A, rindiendo una exposición media por linfocito de 1-2 J/cm^{2}. La preparación de leucocitario final contiene un 20% a 25% estimado del total de componente de célula mononuclear de sangre periférica y tiene un hematocrito de 2,5% a 7%. Tras el período de fotoactivación, se administra por reinfusión el volumen al paciente a lo largo de un período de 30 a
45 minutos.

Los sistemas en los que se emplean estas técnicas en las que se lleva a cabo un tratamiento extracorpóreo de sangre del paciente son conocidos. Por ejemplo, en la patente EE.UU. Nº 4.573.960-Goss, se administra a un paciente un fármaco que requiere fotoactivación y a continuación, se extrae sangre del paciente y se separa en sus componentes. Los componentes sin tratar (glóbulos rojos, algo de plasma, etc.) se retornan al paciente. A continuación, se desconecta al paciente del aparato de tratamiento y se exponen los componentes separados, v.g., glóbulos blancos, a luz ultravioleta. Tras la fotoactivación, las células tratadas se retornan al paciente.

En las patentes EE.UU. Nº 4.321.919; 4.398.906; y 4.464.166, publicadas para Edelson, se explican los métodos de tratamiento externo de enfermedades en las que se da un aumento patológico de linfocitos, tales como linfoma de células T cutáneo. En estos métodos, se irradia la sangre del paciente en presencia de una sustancia química o un anticuerpo con luz ultravioleta. La luz ultravioleta lleva a efecto una unión entre los linfocitos y la sustancia química o anticuerpo inhibiendo así los procesos metabólicos de los linfocitos.

Existen diversos virus humanos que pueden infectar y replicarse dentro de células mononucleares, o es posible que las partículas virales infecciosas permanezca presentes dentro de células mononucleares. Las células mononucleares pueden actuar o bien como fuente para replicación viral y propagación del virus, o bien como reservorio de partículas de virus infecciosas que resultan difíciles de eliminar para el sistema inmune. El hecho de que no se eliminen estas fuentes de virus infeccioso puede conducir al restablecimiento de un estado patológico crónico. Los virus que pueden infectar, replicarse dentro de las células mononucleares o residir en las células mononucleares incluyen, sin limitarse sólo a ellos, virus alojados en antropodo, enterovirus, paramixovirus (RSV), herpes virus, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis D (HDV), virus de la hepatitis G (HGV) y VIH.

Existen diversos agentes patógenos no virales humanos que pueden infectar y replicarse dentro de células mononucleares, o es posible que los agentes patógenos no virales infecciosos permanezcan presentes dentro de las células mononucleares. Las células mononucleares pueden actuar como fuente de replicación y propagación de agentes patógenos no virales, o bien como reservorio de agentes patógenos no virales infecciosos que resultan difíciles de eliminar para el sistema inmune. El hecho de que no se eliminen estas fuentes de agentes patógenos no virales infecciosos puede conducir al establecimiento de un estado patológico crónico. Los agentes patógenos no virales que pueden infectar, replicarse dentro de las células mononucleares o residir en las células mononucleares incluyen, sin limitarse sólo a ellas, bacterias como, por ejemplo, bacterias alojadas en antropodo, especies de micoplasma y especies de micobacterias y parásitos como especies de plasmodio y otros parásitos de alojados en artrópodo.

La fotoferesis extracorpórea se ha utilizado con éxito para tratar infección por VIH (patente EE.UU. Nº 4.960.408) y se ha demostrado que compuestos de psoralen con luz ultravioleta de longitud de onda larga inactivan ciertos virus in vitro, tales como VIH (Quinnan, G.V. y cols., 1986, Transfusion, 26, pp. 481; Bisaccia, A. y cols., 1990, Ann. Intern. Med. 113, pp. 270; Bisaccia, A. y cols. 1991, Am. NY Acad. Sci. 636, pp. 321) y virus de la influenza y virus de herpes simplex (Redfield, D.C. y cols., 1981); Infect. and Immun., 32, pp. 1216). Bisaccia de la universidad de Columbia ha estudiado la fotoferesis extracorpórea (ECP) en una prueba piloto como terapia para pacientes con complejo relacionado con SIDA. El análisis consistió en que una combinación de psoralen con activación UVA podría dañar virus VIH in vitro y que la reinfusión de los virus dañados puede iniciar una respuesta inmune. Los autores concluyeron que ECP producía un aumento en la producción de VIH-Ab, un aumento en linfocitos CD8(+), una disminución de la concentración de antígeno p24 y la incapacidad para cultivar virus VIH en 3 pacientes. Once de los 20 pacientes experimentaron una mejora en sus reactividades de antígeno de ensayo
cutáneo.

Por otra parte, se registró una menor incidencia de episodios de infección en los pacientes que recibieron un tratamiento de fotoferesis para inmunosupresión tras cirugía de transplante (Meiser, B.M. y cols., 1994, Transplantation, 57, pp. 563). No obstante, los resultados observados para los pacientes de cirugía de transplante no se correspondieron con el tratamiento de fotoferesis ya que se registraron episodios de infección en general incluyendo los pacientes que recibieron diversos tratamientos para prevenir el rechazo del órgano trasplantado.

Compendio de la invención

La presente invención está dirigida a un método de tratamiento de infecciones HCV (virus de la hepatitis C) crónicas utilizando fotoferesis extracorpórea. En particular, se ha tratado a pacientes afectados por infecciones HCV crónicas según el método de la presente invención y se ha reducido el nivel o presencia de material genético HCV, o ha dejado de detectarse, en los pacientes tratados de este modo. El método de la presente invención implica el tratamiento de sangre del paciente con un compuesto fotoactivable o fotosensible que es capaz de unirse a ácidos nucleicos de células nucleadas infectadas tras la activación del compuesto por luz ultravioleta. El compuesto fotoactivable o fotosensible puede administrarse a la sangre del paciente in vitro o in vivo a través de técnicas de administración convencionales.

A continuación, se trata una porción de la sangre del paciente extracorpóreamente empleando fotoferesis, que consiste en exponer la sangre a luz ultravioleta, preferiblemente luz ultravioleta de longitud de onda larga en el intervalo de longitud de onda de 320 a 400 nm, comúnmente llamada luz UVA. Se retorna la sangre tratada, o una fracción de la misma, al paciente tras la fotoferesis estracorpórea para estimular una respuesta inmunológica a través del sistema inmune del paciente contra la población de células infectadas y/o contra el HCV para inhibir la progresión de la infección viral. A través de este tratamiento se daña también el material genético viral, haciendo que el virus no pueda replicarse, interrumpiendo así la propagación del virus y neutralizando las partículas virales infecciosas que residen en las células.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1, panel A, panel B y panel C, muestra los resultados de paciente del grupo de tratamiento 1, el grupo 2 y el grupo 3, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida al uso de fotoferesis para inactivar HCV y/o eliminar células de la sangre que han sido infectadas con HCV. Si bien no se pretende que el marco de la presente invención quede limitado con ninguna teoría de funcionamiento específica, se cree que las infecciones por HCV que no están controladas por la respuesta inmunológica normal del paciente se pueden tratar dañando células de la sangre nucleadas infectadas (como por ejemplo células mononucleares) utilizando un tratamiento de fotoferesis con arreglo a la invención. Las células tratadas, así como los virus eliminados y/o atenuados, péptidos, subunidades nativas de los propios virus (que se liberan tras la descomposición de la célula y/o se desprenden hacia la sangre) y/o virus no infecciosos patógenos, se utilizan después pare generar una respuesta inmune.

HCV es a la vez capaz de infectar y de replicarse dentro de células mononucleares, o las partículas virales infecciosas pueden permanecer presentes dentro de las células mononucleares. Las células mononucleares pueden actuar o bien como una fuente para replicación viral y propagación del virus, o bien como reservorio de partículas de virus infecciosas que resultan difíciles de eliminar para el sistema inmune. El hecho de que no se eliminen dichas fuentes de virus infecciosos puede conducir al establecimiento de un estado patológico crónico.

De acuerdo con los métodos que se reivindican, se administra en primer lugar un compuesto fotosensible o fotoactivable en la sangre del paciente que está infectado con HCV de forma crónica. Se puede administrar el compuesto fotoactivable o fotosensible in vivo (v.g., por vía oral u intravenosa) o se puede administrar in vitro en una porción de la sangre del paciente que ha sido extraída del paciente mediante el empleo de técnicas de extracción de sangre convencionales.

De acuerdo con la presente invención, un compuesto fotoactivable o fotosensible deberá ser capaz de unirse a ácidos nucleicos tras la activación por exposición a radiación electromagnética de un espectro prescrito, v.g., luz ultravioleta.

A continuación, se trata la porción de la sangre del paciente a la que se ha administrado el compuesto fotoactivo sometiendo dicha porción de sangre a fotoferesis utilizando luz ultravioleta. La etapa de fotoferesis se lleva a cabo preferiblemente in vitro utilizando un aparato de fotoferesis extracorpóreo. La etapa de fotoferesis de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo también in vivo. Un aparato de fotoferesis extracorpórea preferible actualmente para su uso en los métodos según la invención es el fabricado actualmente por Therakos, Inc., Westchester, Pa. con la marca UVAR. Se puede encontrar una descripción de dicho aparato en la patente EE.UU. Nº 4.683.889, concedida a R.L. Edelson el 14 de agosto de 1987. La exposición de la sangre a luz ultravioleta en un aparato de fotoferesis dependerá de la capacidad de las personas especializadas en este campo de la técnica.

Cuando se lleva a cabo la etapa de fotoferesis in vitro, se retorna al menos una fracción de la sangre tratada al paciente para aumentar la respuesta inmune del paciente a la población de células infectadas y el propio HCV. Preferiblemente, el método de tratamiento aquí descrito se repite en un intervalo de aproximadamente una vez a la semana a aproximadamente una vez cada cuatro semanas. Los compuestos fotoactivos preferibles para su uso de acuerdo con la presente invención son compuestos conocidos como psoralenos (o furocoumarinas) que se describen en la patente EE.UU. Nº 4.321.919. Alternativamente, se puede separar la sangre del paciente sobre un dispositivo de tipo fotoferesis normal y fotoactivar en un aparato distinto.

Los compuestos fotoactivables o fotosensibles preferibles para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes:

psoralen; 8-metoxipsoralen; 4,5'8-trimetilpsoralen; 5-metoxipsoralen; 4-metoxipsoralen; 4,4-dimetilpsoralen;
4-5'-dimetilpsoralen; 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoralen; 4'-hidroximetil-4,5',8-trimetilpsoralen; y 4',8-metoxi-
psoralen. El compuesto fotosensible que se prefiere más particularmente para su uso de acuerdo con la presente invención es 8-metoxipsoralen.

El compuesto fotosensible, cuando se administra a la sangre del paciente in vivo, se administra preferiblemente por vía oral, si bien también se puede administrar por vía intravenosa y/o a través de otras rutas de administración convencionales.

La dosis oral preferible del compuesto fotosensible se encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,7 mg/kg, siendo sobre todo preferible aproximadamente 0,6 mg/kg. Cuando se administra por vía oral, el compuesto fotosensible deberá administrarse preferiblemente al menos aproximadamente una hora antes del tratamiento de fotoferesis y como mucho aproximadamente tres horas antes del tratamiento de fotoferesis. Si se administra por vía intravenosa, los tiempos deberían ser más cortos.

Alternativamente, se puede administrar el compuesto fotosensible a la sangre del paciente después de extraerla del paciente, y antes o de manera simultánea a la exposición a luz ultravioleta. El compuesto fotosensible se puede administrar a la sangre completa o una fracción de la misma siempre que las células de sangre o los componentes de sangre diana reciban el compuesto fotosensible.

El tratamiento de fotoferesis en los métodos de tratamiento según la invención se lleva a cabo preferiblemente utilizando luz ultravioleta de longitud de onda larga (UVA) a una longitud de onda dentro del intervalo de 320 a
400 nm. La exposición a luz ultravioleta durante el tratamiento de fotoferesis tiene preferiblemente una duración suficiente como para suministrar aproximadamente 1-2 J/cm^{2} a la sangre.

Cuando se lleva a cabo el tratamiento de fotoferesis según la invención in vivo, deberá prestarse una especial atención al control de la exposición radiante máxima, con el fin de evitar dañar innecesariamente al paciente. Los métodos para calcular la exposición de radiante máxima a la luz ultravioleta son conocidos dentro de la especialidad.

La invención proporciona asimismo métodos para producir vacunas contra HCV. De acuerdo con la invención, se puede utilizar un donante que esté infectado con HCV para producir una vacuna contra su infección de virus del siguiente modo.

En primer lugar, se administra un compuesto fotosensible tal como se ha descrito anteriormente a al menos una porción de la sangre del donante, ya sea antes de la extracción de la sangre, por vía oral o intravenosa, o tras la extracción al paciente, en cuyo caso se administra in vitro. Opcionalmente, se podría tratar primero una porción de la sangre del donante utilizando métodos conocidos para eliminar sustancialmente los eritrocitos y administrar a continuación el compuesto fotoactivo a la fracción de leucocitos enriquecida resultante.

Sea cual sea el caso, se somete la porción de sangre a la que se ha administrado el compuesto fotosensible (o una fracción de leucocitos enriquecida de la misma) a un tratamiento de fotoactivación usando luz ultravioleta, preferiblemente UVA según la manera que se ha descrito antes. A continuación, se administra la sangre tratada o la fracción de leucocitos enriquecida (según el caso) de nuevo al donante.

A continuación, se exponen los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invención sin pretender con ello que se consideren como una limitación de la misma.

Ejemplo 1 Reducción de HCV en pacientes infectados con HCV crónicos

Se conocen los defectos fundamentales que permiten el establecimiento de hepatitis C crónica tras infección HCV aguda. Algunos investigadoras han sugerido que es posible que pueda tener relación con un deterioro de la inmunidad celular, ya sea células T o células asesinas naturales. Weiner y sus colaboradores del Chiron Corporation han demostrado la existencia de una región hipervariable del genoma HCV en el segmento E2/NS1^{6}. Esta área codifica epitopos lineales de unión a anticuerpo de células B específicos para aislado que se expresan en la superficie de envoltura de la partícula HCV. Las características de este dominio son similares a las del bucle V3 de la proteína 1's gp 120 del virus de inmunodeficiencia humana. La rápida mutación dentro de esta región puede explicar la pérdida de reconocimiento inmune y la desaparición del virus de hepatitis C.

Otros autores postulan que pueden existir otras posibilidades para la resistencia al tratamiento de interferón. Existe evidencia de que el genotipo del virus puede ser igual de importante en influir en el resultado de la terapía. Parece ser que algunos genotipos (subtipos) del virus de la hepatitis C pueden ser más resistentes a la terapia con interferón alfa que otros tipos. Otros investigadores creen que existe una correlación entre la concentración viral previa al tratamiento del virus de la hepatitis C y el resultado tras el tratamiento con alfa interferón.

Sin embargo, el mecanismo inmune básico que resulta en la desaparición del virus de la hepatitis C sigue siendo desconocido. Shirai del National Cancer Institute ha demostrado que los linfocitos CD8(+) citotóxicos reconocen una proteína no estructural con homología para ARN polimerasa expresada en asociación con un antígeno de Clase I HLA en la superficie de los hepatocitos^{7}. Esto tiene como resultado el proceso de la destrucción citotóxica mediada por célula dependiente de anticuerpo del hepatocito infectado viral. Esto sería similar al proceso usado para hacer desaparecer el virus de la hepatitis B.

El virus de la hepatitis C es un virus de hebra positiva que se replica a través de la producción de un ARN de hebra negativa como plantilla. Durante la replicación viral de HCV activo, estas plantillas de ARN de hebra negativa están presentes en el hígado del paciente. Los investigadores han observado también la presencia de partículas virales de hepatitis C replicantes activas en las células mononucleares de la sangre periférica del paciente^{8}. Se puede demostrar que las células mononucleares, macrófagos, células T y células B contienen ARN HCV de hebra negativa.

Durante la terapia con interferón alfa puede desaparecer el virus de hepatitis C del hígado del paciente y la sangre tal como se mide por RT-PCR. A pesar de esta desaparición aparente del virus en algunos pacientes, existe una recurrencia muy alta (80-85%) tras la terapia con interferón. Los investigadores han demostrado que los (pocos) pacientes en los que no se ha detectado la replicación de HCV en las PBMC (células mononucleares de sangre periférica) al final de la terapia, no presentan recurrencia tras la terapia con interferón y aparentemente se curan ^{9,10,11}. Se podría pensar que las células mononucleares pueden servir como un sitio protegido inmunológicamente que refugia a la hepatitis C del reconocimiento y ataque del sistema inmune. Una vez que se retira la terapia con interferón alfa, el virus puede abandonar las PBMC y reinfectar la sangre y el hígado del paciente.

La terapia ideal debería hacer desaparecer el virus de hepatitis C del hígado, la sangre y las células mononucleares infectadas simultáneamente. El mecanismo de acción de la fotoferesis extracorpórea causa una inmunización contra las células T anormales que las hace más inmunogénicas. Después de la exposición a ECP, la reinfusión de estas células T alteradas causa una reacción inmunogénica que va dirigida a células T no radiadas que llevan los mismos antígenos de superficie^{12}. Esto tiene como resultado la producción de una respuesta inmune altamente específica contra estas células anormales (ya sea el clon de cáncer, o tal vez células T que expresan antígenos virales en su superficie).

Por otra parte, la terapia ideal no deberá llevarse a efecto a través de la tendencia de la región E2/NS1 hipervariable de la hepatitis C a mutar. Este cambio en los antígenos de envuelta de partícula viral causa un escape desde los anticuerpos neutralizantes de células B. La fotoferesis puede inducir también al daño de cualquiera de las partículas virales en la sangre irradiada. Esta forma de terapia también iría dirigida a los mutantes de escape de hepatitis C recién formados.

En 1986, Hoofnagle y cols.^{13} publicaron el primer informe sobre terapia de la hepatitis C crónica con interferón alfa con éxito en una prueba no controlada. Diez pacientes con hepatitis C crónica recibieron inyecciones subcutáneas de interferón durante un año. Seis pacientes siguen teniendo LFTs normales y ARN HCV no detectable por RT-PCR siete años después.

Hasta la fecha, interferón alfa-2b, recombinante (Intron A) es el único tratamiento aprobado por la FDA para hepatitis crónica en los Estados Unidos. Davis y cols., han descrito que un curso de tratamiento de seis meses de interferón alfa-2b a una dosis de 3 millones de unidades tres veces a la semana, tuvo como resultado un 18% de respuesta sostenida fuera del tratamiento.^{14} Otras múltiples pruebas han reproducido este índice de respuesta. En la mayoría de los pacientes se da una recurrencia bioquímica tras la retirada de la terapia^{15} Se ha demostrado que la detección de ARN HCV en suero por RT-PCR se corresponde con la normalización de transaminasas en suero durante el tratamiento y se ha demostrado también que precede a una recurrencia bioquímica una vez que se retira la terapia.^{16,17}

Los investigadores continúan diseñando nuevas terapias para mejorar los bajos índices de respuesta. Se han realizado pruebas de dosis más altas de interferón,^{18} duración más prolongada del tratamiento,^{19} diferentes especies de interferón,^{20,21} y flebotomía terapéutica adyuvante para eliminar el exceso de hierro,^{22} con distintos grados de éxito. Otras formas de terapia son incluso menos eficaces y están asociadas con frecuentes efectos secundarios. Se ha demostrado que los croticosteroides y acyclovir presentan un escaso beneficio.

Se distribuyeron al azar quince (15) pacientes para monoterapia con ECP solamente (5 pacientes), o para una terapia combinada con ECP e interferón alfa 3 MIU TIW (5 pacientes) o con ECP e interferón-alfa 6 MIU TIW (5 pacientes). Todos los pacientes recibieron un tratamiento de ECP en el Clinical Research Center (CRC) en el Hospital de la Universidad de Pensilvania.

Grupo I

Solamente ECP

Los pacientes seleccionados al azar para recibir ECP solamente fueron sometidos a dos tratamientos, en dos días consecutivos cada dos semanas. Los pacientes recibieron 24 tratamientos con ECP durante un período de 6 meses.

Grupo II

ECP y IFN-(3 MIU)

Tres meses después de que el grupo I comenzara con ECP, los pacientes seleccionados al azar para recibir ECP e interferón-alfa 3 MIU comenzaron la terapia. Los pacientes empezaron con tratamientos con ECP durante dos días consecutivos cada dos semanas. Dos semanas después del comienzo con ECP, los pacientes recibieron interferón-alfa 3 MIU tres veces a la semana subcutáneamente. Si lo toleraban bien, los pacientes continuaron con los tratamientos con ECP durante dos días consecutivos cada dos semanas durante seis meses más en combinación con interferón-alfa. Los pacientes recibieron 24 tratamientos con ECP durante un período de 6 meses.

Grupo III

PUVA y IFN-(6-MIU)

Tres meses después de que el Grupo II comenzara con ECP, los pacientes seleccionados al azar para recibir ECP e interferón alfa 6 MIU comenzaron la terapia. Los pacientes empezaron con tratamientos con ECP durante dos días consecutivos cada dos semanas. Dos semanas después del comienzo de ECP, los pacientes recibieron interferón alfa 6 MIU tres veces a la semana subcutáneamente.

Período de detección selectiva

Las medidas de la detección selectiva incluyeron una historia y un examen físico, valoración de los síntomas, peso y presión sanguínea. Los análisis de laboratorio incluyen: recuento de sangre completa con análisis de la función tiroides, diferencial, tiempo de protrombina, panel de química y HCG en suero (si se indica). Se llevó a cabo la prueba de HCG en suero del embarazo a las 24 horas del comienzo del tratamiento. Un recuento de sangre completa incluyó hematocrito, hemoglobina, recuento de plaquetas y total de glóbulos blancos con diferencial incluyendo neutrófilos, linfocitos, células mononucleares, eosinófilos y basófilos. Un panel de química incluyó total de proteínas, albúmina, total de bilirrubina, ALT, AST, fosfatasa alcalina, gamma GT, sodio, cloruro potásico, contenido en CO_{2}, nitrógeno de urea, creatinina, glucosa, calcio, fosfato, colesterol, triglicéridos y ácido úrico. Se recogieron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y de sueropara determinar las concentraciones HCV-ARN por RT-PCR y por análisis de genotipo HCV. Se recogió el suero de 7 ml de sangre completa y se congeló a -70ºC para estudios en el
futuro.

Período de tratamiento

Se llevó a cabo una valoración de los síntomas, el peso, la presión sanguínea, el recuento de la sangre completa y ALT a las 2 semanas y cada 4 semanas durante el tratamiento. La concentración de HCV ARN en suero fue vigilada a las 2 semanas y cada cuatro semanas durante el tratamiento. Se midió la concentración de HCV ARN en las PBMC al final del tratamiento. Se recogió suero de 7 ml de sangre completa cada ocho (8) semanas y se congeló a -70ºC para estudios futuros. Al final de tratamiento se llevaron a cabo una historia de seguimiento y examen médico, panel de química, análisis de la función tiroides y tiempo de protrombina.

Período de seguimiento

Se llevó a cabo una valoración de los síntomas, el peso, la presión sanguínea, el recuento de sangre completa y HCV ARN en suero cada 8 semanas durante y en la última visita del período de seguimiento. Se midió la concentración de HCV ARN en PBMC y en la última visita de seguimiento. Se midió ALT cada cuatro semanas y en la última visita de seguimiento. Se recogió suero de 7 ml de sangre completa cada ocho (8) semanas durante el seguimiento y se congeló a -70ºC para estudios futuros. En la última visita del período de seguimiento se llevaron a cabo una historia de seguimiento y examen físico, panel de química, análisis de la función tiroides y tiempo de pro-
trombina.

Recogida de suero

Se recogió sangre en tubos separadores de suero (BD SST)

Al cabo de 2 horas de la extracción de sangre, se centrifugaron los tubos a 1500 x g durante 20 minutos. Se recogió inmediatamente suero y se almacenó a -70ºC.

Preparación de célula mononuclear

Se recogió sangre en un tubo de preparación de célula mononuclear CPT vacutainer de 8 ml de capacidad (Becton Dickinson). Se centrifugaron los tubos durante 20 minutos a 1500 x g 17-25ºC. Se extrajo el plasma sin disturbar la capa de células y se congeló en partes alícuotas de 1 ml a -70ºC. Se pipeteó la capa de células en un tubo cónico de 15 ml y se añadieron 10 ml de PBS (Solución Salina tamponada con fosfato). Se mezcló el tubo suavemente 5 veces y después se centrifugó a 300 x g durante 15 minutos. Una vez que se aglomeraron las células en el fondo del tubo, se separó el sobrenadante y se descartó. Se resuspendió el aglomerado en 2 mls de PBS y después se dividió en partes alícuotas de 1 ml en tubos Sarstedt de 1,5 ml. Se hicieron girar los tubos Sarstedt en una microcentrífuga al máximo durante 10 minutos. Se separó el sobrenandante y se almacenó a -70ºC hasta que se llevó a cabo el análisis PCR. Se realizó el análisis PCR utilizando el ensayo Amplicor (ver más adelante).

Ensayo Amplicor para HCV de célula mononuclear o suero

El ensayo HCV ARN es un prototipo del ensayo basado en PCR utilizando un par cebador único (cebador corriente abajo biotinilado) de la región 5'-no traducida de HCV. Se incorporó Uracil-N-glucosilasa para prevenir la contaminación de amplicon. Se trancribió inversamente ARN diana HCV y se amplificó en una racción de tubo único utilizando la enzima rTth ADN en presencia de Mn^{++}. Tras la amplificación, se sometieron a desnaturalización alcalina los tubos y se hibridaron con una sonda específica para HCV. Se llevó a cabo la detección en un formato de 96 micropocillos utilizando peroxidasa de rábano picante-avidina. El resultado del ensayo fue expresado en unidades A450 según se detectó en un lector de placa de micropocillos normal.

Criterios de eficacia

Se midió la respuestas de tratamiento utilizando los siguientes criterios virológicos y bioquímicos:

Criterios virológicos (criterios de cebador)

Se vigiló HCR-ARN en suero previo al estudio, durante la terapia, para determinar la respuesta y durante el período de seguimiento de 24 semanas para determinar la estabilidad de la respuesta. Se puntuó la respuesta de tratamiento con arreglo a los siguientes criterios:

a) Sin respuesta: HCV ARN permanece detectable por PCR durante el tratamiento y los períodos de seguimiento.

(b) Respuesta completas: HCV ARN no es detectable por PCR durante la terapia, al final del período de tratamiento y se hace detectable antes del final del período de seguimiento.

c) Cura: HCV ARN por PCR no es detectable al final del período de tratamiento y sigue sin ser detectado al final del período de seguimiento.

Los resultados de este estudio demustran que fotoferesis en solitario o en combinación con tratamiento de interferon reduce sustancialmente el nivel de material genético HCV.

El uso de fotoferesis solamente redujo el nivel de virus en pacientes HCV crónicos que habían fallado con otros tratamientos anteriores. En la tabla 1 (y en la figura 1 panel A) se representa el nivel de HCV de cada paciente en la línea de referencia y al cabo de 8 semanas de terapia (región en el recuadro de la figura 1, panel A).

La combinación de fotoferesis e interferón-alfa elimina la presencia del virus, tal como se detecta por RT-PCR, en la sangre periférica de pacientes HCV infectados crónicamente. Las figuras 1B y 1C representan los niveles de HCV para los pacientes, antes, durante y después de completar el tratamiento. Se perdió el efecto del tratamiento una vez que se interrumpió la fotoferesis.

TABLA 1 Hepatitis C Grupo 1: Fotoferesis solamente

	HCV (referencia Log 10)
Número paciente	Semana 0 de tratamiento	Semana 8 de tratamiento
1	5,51	5,27
2	6,07	5,54
3	5,32	4,39
4	5,27	5,00
5	5,91	5,47

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Claims (8)

1. Uso de un compuesto fotoactivable en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente afectado de infección HCV crónica por exposición de la sangre de dicho paciente que contiene dicho compuesto fotoactivable a luz de una longitud de onda que activa dicho compuesto fotoactivable.

2. Uso de un compuesto fotoactivable e interferón alfa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento secuencial de un paciente afectado de infección HCV crónica por exposición la sangre de dicho paciente que contiene dicho compuesto fotoactivable a luz de longitud de onda que activa dicho compuesto fotoactivable.

3. Uso de la reivindicación 2, en el que el uso de dicho compuesto fotoactivable se lleva a cabo durante dos días consecutivos cada dos semanas.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que el uso del compuesto fotoactivable se realiza durante un período de 3 meses.

5. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho tratamiento con interferón alfa comienza dos semanas después del uso del compuesto fotoactivable.

6. Uso según la reivindicación 6, en el que dicho tratamiento con interferón alfa tiene lugar tres veces a la semana.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho compuesto fotoactivable es un psoralen.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que dicho psoralen es 8-metoxipsoralen.