CN101351118B - 凋亡细胞在离体产生调节t细胞中的应用 - Google Patents

凋亡细胞在离体产生调节t细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

体内许多细胞类型都可以把凋亡细胞和细胞碎片从组织中清除掉；然而，只有专职吞噬细胞或抗原呈递细胞(“APC”)才具有很高的清除能力。凋亡细胞(“AC”)的识别是通过APC上识别相应凋亡细胞相关分子模式(“ACAMP”)并与之结合的一系列进化上保守的AC相关分子模式受体(“ACAMPR”)而实现的。这些受体识别凋亡细胞上存在的磷脂酰丝氨酸和氧化脂质等配体(Savill等(2002)和Gregory等(2004))。

Description

凋亡细胞在离体产生调节T细胞中的应用
本申请涉及并要求根据35USC§119(e)于2005年11月2日申请的美国临时专利申请顺序号60/732,847的权益，该专利的全部内容通过引用结合到本文中。
发明背景
体内许多细胞类型都可以把凋亡细胞和细胞碎片从组织中清除掉；然而，只有专职吞噬细胞或抗原呈递细胞(“APC”)才具有很高的清除能力。凋亡细胞(“AC”)的识别是通过APC上识别相应凋亡细胞相关分子模式(apoptotic-cell-associated molecular pattern，“ACAMP”)并与之结合的一系列进化上保守的AC相关分子模式受体(AC-associatedmolecular-pattern receptor，“ACAMPR”)而实现的。这些受体识别凋亡细胞上存在的磷脂酰丝氨酸和氧化脂质等配体(Savill等(2002)和Gregory等(2004))。
在体外(in vitro)和体内( in vivo)两种情况下，由体内抗原呈递细胞清除凋亡细胞都能调节免疫应答(Savill等(2002))。这种免疫调节似乎主要是通过抗原呈递细胞功能的改变而发生的，具有诱导耐受的抗原呈递细胞的几个特点。这些耐受原性抗原呈递细胞通过包括产生调节T细胞(“Treg”)在内的多种机制诱导耐受性。
Treg包括不同种类的T淋巴细胞，主动抑制免疫应答(Groux等(1997)、Sakaguchi等(2001)和Roncarolo等(2001))。因此，有开发用于多种疾病的Treg疗法的巨大潜力。
在体内产生Treg的一种方法是通过输注凋亡细胞。动物模型和人体治疗中有证据显示，凋亡细胞输注(例如发生在体外光泳(extracorporeal photophoresis，“ECP”)过程中的输注)诱导Treg(Maeda等(2005)、Lamioni等(2005)、Aubin等(2004)、Mahnke等(2003)和Saas等(2002))。
离体(ex vivo)产生Treg的其它方法包括将T细胞暴露于多种物质，包括：IL-10(Roncarolo等(2001)和Zeller等(1999))；TGFβ(Zheng等(2004)、Gray等(1998)、Horwitz等(1999)、Ohtsuka等(1999a)、Ohtsuka等(1999b)、Stohl等(1999)、Gray等(2001)、Horwitz(2001)、Yamagiwa等(2001)、Horwitz等(2002)和Zheng等(2002))；αMSH(Luger等(1999)、Taylor(2005)、Namba等(2002)、Nishida等(1999)、Nishida等(2004)、Streilin等(2000)、Taylor等(1992)、Taylor等(1994a)、Taylor等(1994b)、Taylor等(1996)、Taylor(1999)、Taylor(2003)和Taylor等(2003))；维生素D3(Willheim等(1999)、Penna等(2000)、Pedersen等(2004)、May等(2004)、Koren等(1989)、Gregori等(2001)、Cobbold等(2003)和Barrat等(2002))；地塞米松(Pedersen等(2004)、Barrat等(2002)和O′Garra等(2003))；然后纯化(Earle等(2005)、Schwarz等(2000)、Chatenoud等(2001)、Tang等(2004)和Masteller等(2005))。
自身免疫性疾病包括对自身组织起反应的免疫细胞的不当活化。这些活化的免疫细胞促进产生参与疾病病理的细胞因子和自身抗体。涉及T细胞的其它疾病包括发生在移植中的移植物抗宿主病(Graftversus Host Disease，GVHD)。GVHD中，供体T细胞通过向受体身体发起攻击而排斥受体的组织和器官。许多其它疾病涉及宿主免疫系统失调。这些疾病中的一些最好用药物治疗，还有一些可用生物制品治疗，另外一些需要用例如体外光泳(ECP)治疗，还有另外一些只有非常有限的治疗选择。
有研究表明，在某些T细胞介导的疾病中，ECP是有效的疗法。在移植物抗宿主病的情况下，光泳与局部用曲安西龙软膏、抗真菌药、抗病毒药、抗生素、免疫球蛋白和甲氨蝶呤联合用于治疗。体外光泳还与例如麦考酚酸吗乙酯、他克莫司、泼尼松、环孢菌素、羟氯喹、类固醇、FK-506等免疫抑制药及用于慢性移植物抗宿主病(“cGVHD”)和难治性cGVHD的沙利度胺一起使用。对于实体器官移植，体外光泳与免疫抑制药联用以降低与同种异体肾移植和心脏移植相关的急性同种异体移植排斥发作的次数。例如，体外光泳与OKT3和/或免疫抑制药泼尼松、硫唑嘌呤和环孢菌素一起使用以逆转急性同种异体肾移植排斥。体外光泳还与环磷酰胺、分次全身照射和依托泊苷一起使用，用于急性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)或严重再生障碍性贫血的同种异体骨髓移植。
发明概述
在同种异体系统中，与白细胞离体孵育，导致产生具有调节活性的T细胞。这样就产生了具有抑制针对同种异体抗原的免疫应答活性的调节T细胞(“Treg细胞”或“T reg”)。
在抗原特异性和多克隆活化系统中，可通过加入抗原或具有自体凋亡细胞(“AC”)的其它刺激成分而获得抗原特异性结果。
本发明包括将白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而产生具有调节活性的T细胞(T reg)的方法。
本发明包括将白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物。
本发明包括治疗自身免疫性疾病或改善该病的一种或多种症状的方法，该方法通过给予有需要的患者有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
本发明包括治疗特应性疾病或改善该病的一种或多种症状的方法，该方法通过给予有需要的患者有效量的具有调节活性的T细胞(Treg)群体的组合物，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
本发明包括给予移植受体有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物的方法，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
本发明包括给予移植物抗宿主病患者有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物的方法，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
本发明包括通过测试患者以确定患者是否患有某种疾病，并且给予有需要的患者有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物来治疗患有疾病或有易患疾病体质的患者的方法，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
附图简述
图1是示意图，A：表示Treg的产生；B：表示T调节细胞产生后，将Treg细胞加到MLR中。
图2显示通过与体外光泳处理的PBMC共孵育所产生的调节T细胞抑制同基因T细胞的增殖。
图3显示通过与体外光泳处理的PBMC共孵育所产生的调节T细胞比标准Tr1细胞更好地抑制T细胞增殖。
图4显示通过与体外光泳处理的PBMC共孵育产生调节T细胞可以通过加入白介素-2而逆转。
图5显示通过与体外光泳处理的PBMC共孵育所产生的调节T细胞的抑制活性是接触依赖性的。
发明详述
应用凋亡细胞离体产生Treg
体内出现产生Treg的系统相当复杂，依赖于一系列的细胞类型和形态学定位。然而，本发明表明在本文所述条件下体外产生这些细胞是可能的。在同种异体系统中，与白细胞离体孵育，导致产生具有调节活性的T细胞。这样就产生了具有抑制针对同种异体抗原的免疫应答活性的调节T细胞(“Treg细胞”)，这在多种疾病中十分重要，所述疾病包括但不限于自身免疫性疾病、移植物抗宿主病(“GVHD”)和实体器官移植。在抗原特异性和多克隆活化系统中，可通过加入抗原或具有自体凋亡细胞(“AC”)的其它刺激成分而获得抗原特异性结果。
这一离体产生方法提供了优于前述药物诱导方法的几个优势。重要的是，避免了这些所加入分子可能的毒性作用和非天然作用。
另外，离体产生优于体内利用凋亡细胞的优势包括但不限于加强了对这些细胞的数目、活性和功能的控制。这种治疗性控制给患者提供了改进的治疗方案。
用一系列方法(例如纯化、活化和添加例如TGFβ、αMSH、抗CD46、IL-10、维生素D3和地塞米松等分化因子)产生T reg证实，这些细胞可以离体产生。凋亡细胞通过产生耐受原性抗原呈递细胞提供更“似体外(in vitro-like)”的方法，诱导这些细胞。
本发明包括将白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而产生具有调节活性的T细胞(T reg)的方法。
本发明包括将白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物。
本发明包括治疗自身免疫性疾病或改善该病的一种或多种症状的方法，该方法通过给予有需要的患者有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
自身免疫性疾病包括但不限于急性横贯性脊髓炎、斑秃、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、肌萎缩性侧索硬化、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome)、动脉粥样硬化、自身免疫性艾迪生病(autoimmune Addison′s disease)、自身免疫性溶血性贫血、贝赫切特病(Behcet′s disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮炎(celiac sprue-dermatitis)、小脑性脊髓小脑疾病(CerebellarSpinocerebellar Disorder)、脊髓小脑变性(脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调(Friedreich′s ataxia)、小脑皮质变性)、慢性酒精中毒、酒精诱导性肝炎、自身免疫性肝炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性肠病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、疤痕性类天疱疮、冷凝集素病、CResT综合征、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、克罗恩病(Crohn′s disease)、代-托萎缩(Dejerine Thomas atrophy)、拳击运动员痴呆、糖尿病、弥漫性雷维小体病(Diffuse Lewy body disease)、盘状狼疮、基底神经节疾病、弥散性血管内凝血、中年唐氏综合征(Down′s Syndrome in middle)、药物诱导的运动障碍、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎(fibromyalgia-fibromyositis)、移植物抗宿主病、格雷夫斯病(Graves′disease)、急性热病性多神经炎(Guillain-Barrésyndrome)、哈-施病(Hallerrorden-Spatz disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、亨廷顿老年性舞蹈病(Huntington′sChorea senile chorea)、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、婴幼儿或青少年脊髓性肌萎缩、胰岛素依赖型糖尿病、青少年关节炎、川崎病(Kawasaki′s pathology)、皮质脊髓系统病变、白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、扁平苔藓、梅尼埃病(Ménière′s disease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、多系统变性(Mencel、代-托综合征(Dejerine-Thomas)、夏-德雷格综合征(Shy-Drager)、神经系统亚速尔病(Machado-Joseph))、重症肌无力、神经原性肌萎缩(neurogenic muscular)、帕金森病(Parkinson′s disease)、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎性皮肌炎、原发性丙球蛋白缺乏血症、原发性胆汁性肝硬化、进行性核上麻痹、牛皮癣、雷诺现象(Raynaud′sphenomenon)、赖特综合征(Reiter′s syndrome)、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、雷维小体型老年性痴呆(Senile Dementia of Lewybody type)、斯耶格伦综合征(syndrome)、僵人综合征、亚急性硬化性全脑炎、系统性疾病(雷弗素姆病(Refsum′s disease)、血β脂蛋白缺乏症(abetalipoprotemia)、共济失调、毛细血管扩张症、线粒体多系统病(mitochondrial multi-system disorder))、系统性红斑狼疮(SLE)、过氧化氢酶缺乏症(Takayasu arteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、甲状腺炎(thyroidosis)、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、脉管炎、白斑、韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、韦-科综合征(Wemicke-Korsakoff syndrome)。
本发明包括治疗特应性疾病或改善该病的一种或多种症状的方法，该方法通过给予有需要的患者有效量的具有调节活性的T细胞(Treg)群体的组合物，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
特应性疾病包括但不限于慢性炎症病理和血管炎症病理，包括慢性炎症病理例如结节病、慢性炎性肠病、溃疡性结肠炎和克罗恩病理(Crohn′s pathology)；和血管炎症病理，例如但不限于弥散性血管内凝血、动脉粥样硬化和川崎病。
本发明包括给予移植受体有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物的方法，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
本发明包括给予移植物抗宿主病患者有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物的方法，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
本发明包括通过测试患者以确定患者是否患有某种疾病，并且给予有需要的患者有效量的具有调节活性的T细胞(T reg)群体的组合物来治疗患有疾病或有易患疾病体质的患者的方法，所述调节T细胞群体通过将自体白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育而获得。
可按预定时间表给予患者T reg，包括但不限于两天，移植前一周；三天，获取所述移植物前一周；一周两天，持续两周，移植前；和一周三天，持续三周，移植前。
用于本发明治疗方法以使受治疗者获得所需临床益处的T reg的有效量可随细胞来源、受治疗者的状况、年龄、受治疗者的体重和其它相关因素而变化，易于用众所周知的方法加以确定。优选给予患者的T reg量为约1×105/kg至约1×107/kg。更优选给予患者的T reg量约为1×106/kg。
本发明的方法包括将AC与白细胞在足以产生T reg的时间和条件下孵育。孵育可以在本领域已知的适于白细胞的任何条件下进行，时间为约1天至约14天。优选孵育约为8天。
本发明的方法还可包括筛选表达CD4的白细胞以获得CD4+细胞。优选细胞为CD4+。
本发明的方法包括在任何合适浓度的AC和CD4+细胞中孵育。优选细胞中CD4+∶AC的比率为约1∶10至约10∶1。更优选细胞中CD4+∶AC的比率为2∶1至约1∶2。
用本领域已知的细胞凋亡诱导处理获得本发明的AC。优选细胞凋亡诱导处理是体外光泳法，体外光泳法使用光活化化合物(photoactivable compound)以及激活光活化化合物波长的光。优选光活化化合物为补骨脂素，光为UVA。优选补骨脂素为8-MOP。
本发明的方法可包括与进一步提高T reg产生或功能而添加的因子一起孵育。合适的因子包括但不限于激素、蛋白质、药物或抗体。优选因子包括但不限于TGFβ、αMSH、抗CD46、IL-10、维生素D3、地塞米松、雷帕霉素和IL-2中的一种。优选因子为IL-10。优选IL-10存在的浓度为约1ng/ml至约100ng/ml。优选IL-10存在的浓度约为20ng/ml。
本发明的方法包括在孵育时加入抗原以产生调节针对该抗原的免疫应答的Treg。优选抗原为同种异体抗原。这种抗原可用本领域任何已知方法筛选。
用于本发明方法的细胞群体包括“凋亡细胞”，它包括具有或将具有一种或多种细胞凋亡特有特征的细胞和胞体(即凋亡体)。凋亡细胞可包括处于诱导期、效应期或降解期的任何细胞。本发明疗法中的细胞群体还可包含用细胞凋亡诱导剂处理后仍存活的细胞。这些细胞在某一时刻(例如给予受治疗者后)可具有细胞凋亡特有的特征。优选AC是用细胞凋亡诱因处理过的自体PBMC。优选细胞凋亡诱因为体外光泳(ECP)。
体外光泳直接诱发显著的细胞凋亡水平。例如在CTCL、GVHD和硬皮病患者的淋巴细胞中观察到这种情况。凋亡细胞有助于临床观察效果。
细胞凋亡特有的特征可包括但不限于磷脂酰丝氨酸的表面暴露，按公认的标准检测方法例如膜联蛋白V染色检测；线粒体膜通透性的改变，通过公认的标准方法测量，证实DNA断裂，例如从细胞提取DNA后电泳，琼脂糖凝胶中DNA梯条带的出现或者通过原位标记。Salvioli等(1997)、Teiger等(1996)和Gavrieli等(1992)。
诱导用于本发明的细胞群体成为离体(即体外)凋亡细胞群体，并使之与受治疗者、供体或受体的细胞相容。基本上可由包括培养细胞系在内的任何类型的哺乳动物细胞制备细胞群体。例如，可从由哺乳动物受治疗者自身(自体)或从建立的细胞系中得到的细胞类型制备细胞群体。准确地讲，可由与哺乳动物受治疗者细胞相容的血液白细胞制备细胞群体，更准确地讲，可由受治疗者自身的白血细胞，甚至更准确地讲，可由受治疗者自身的白细胞或T细胞制备。
还可由已建立的细胞系制备细胞群体。可用于本发明方法的细胞系包括例如Jurkat细胞(ATCC保藏号TIB-152)。适用于本发明方法的其它细胞系可由本领域普通技术人员鉴定和/或确定。细胞群体可在给予受治疗者、供体或受体之前在体外制备。因此，在一个实施方案中，例如通过静脉穿刺抽取受治疗者血液、受体血液或供体血液后再进行等分，使其中至少部分白细胞处于体外细胞凋亡诱导条件下。
在一个实施方案中，细胞群体还包括特殊的细胞亚群，包括但不限于白细胞或根据CD4表达而与白细胞分离开的细胞，即CD4+T细胞。血液成分的分离和纯化为本领域普通技术人员所熟知。实际上，血液成分疗法的出现，产生了被设计用于收集特定血液成分的无数个系统。这些收集系统有一些可购自例如Immunicon Corp.(HuntingdonValley，Pa.)、Baxter International(Deerfield，Ill.)和Dynal Biotech(Oslo，Norway)。
Immunicon公司的分离系统用包被有抗体的磁性纳米粒子(铁磁液体)来分离血液成分，所述抗体与血样中的目标成分缀合(即形成复合体)。然后，将血样在强磁场中孵育，目标复合体从其余样品中迁移开，因而可被收集起来。参见例如美国专利第6,365,362、6,361,749、6,228,624、6,136,182、6,120,856、6,013,532、6,013,188、5,993,665、5,985,153、5,876,593、5,795,470、5,741,714、5,698,271、5,660,990、5,646,001、5,622,831、5,597,531、5,541,072、5,512,332、5,466,574、5,200,084、5,186,827、5,108,933和4,795,698号。
Dynal′s Dynabeads生物磁分离系统用包被有抗体的磁珠分离血液成分，所述抗体与血样中的目标成分缀合，形成Dynabeads-目标复合体。然后用磁性颗粒集中仪(Magnetic Particle Concentrator)(DynalMPC)，从样品取出复合体。可用该分离系统收集数个不同的细胞类型。T细胞和T细胞亚群还可用例如以下方法从全血、血沉棕黄层、梯度单核细胞或组织消化物中，经正性或负性分离或排除：CELLectionTM CD2试剂盒(产品目录号116.03)、DynabeadsM-450CD2(产品目录号111.01/02)、DynabeadsCD3(产品目录号111.13/14)、Dynabeadsplus DETACHaBEAD(产品目录号113.03)、DynabeadsM-450CD4(产品目录号111.05/06)、CD4负性分离试剂盒(T辅助细胞/诱导细胞)(产品目录号113.17)、CD8正性分离试剂盒(产品目录号113.05)、DynabeadsCD8(产品目录号111.07/08)、CD8负性分离试剂盒(产品目录号113.19)、T细胞负性分离试剂盒(产品目录号113.11)、DynabeadsCD25(产品目录号111.33/34)和DynabeadsCD3/CD28T细胞增容剂(产品目录号111.31)。Baxter International公司根据离心性质开发出几种单采血液成分系统，包括CS-3000血液细胞分离器、Amicus分离器和Autopheresis-C系统。CS-3000Plus血液细胞分离器收集细胞单采血液成分术产物和血浆。它包括收集单采血液成分术产物的连续流动分离器与双室离心系统。Amicus以连续流或间隙流模式进行操作以收集单个供体的血小板和血浆。Autopheresis-C系统被设计成用来收集供体血浆，可收集250ml以上的血浆。一般参见美国专利第6,451,203、6,442,397、6,315,707、6,284,142、6,251,284、6,033,561、6,027,441和5,494,578号。
在本发明最优选的实施方案中，体外光泳用于诱导细胞凋亡。该方法包括加到离体细胞群体中的光活化化合物。可将光敏化合物(photosensitive compound)加到细胞群体中，该细胞群体包含从受治疗者、受体或供体抽取后的血细胞，正如情况可能是在紫外光暴露之前或同时。可将光敏化合物加到包含全血或其部分的细胞群体中，前提条件是目标血细胞或血液成分接受光敏化合物。在另一个实施方案中，部分受治疗者的血液、受体血液或供体血液可首先用已知方法处理以基本上除去红细胞，然后可将光活化化合物加到所得的包含富含PBMC部分的细胞群体中。
用于本发明的光活化化合物包括但不限于称为补骨脂素(或呋喃香豆素)以及补骨脂素衍生物的化合物，例如参见4,321,919和5,399,719。优选的化合物包括8-甲氧基补骨脂素、4，5′8-三甲基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、4-甲基补骨脂素、4，4-二甲基补骨脂素、4，5′-二甲基补骨脂素、4′-氨甲基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-羟甲基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′，8-甲氧基补骨脂素和4′-(ω-氨基-2-氧杂)烷基-4，5′8-三甲基补骨脂素，包括但不限于4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，可使用的光敏化合物包含补骨脂素衍生物氨托沙林(amotosalen)(S-59)(Cerus Corp，Concord，CA)。在另一个实施方案中，光敏化合物包含8-甲氧基补骨脂素(8MOP)。
向其中加入了光活化化合物的细胞群体，用激活光活化化合物的波长的光进行处理。激活光活化化合物的处理步骤优选用长波长紫外光(UVA)进行，例如在320-400nm范围内的波长。在光泳处理期间暴露在紫外光中优选经过足够长的时间以向细胞群体递送约1-2J/cm2。
用于本发明方法的体外光泳设备包括Therakos公司(Exton，Pa.)制造的设备，商标为UVAR。该设备的描述参见美国专利第4,683,889号。UVAR系统使用处理系统并由三个阶段组成，包括：1)收集血沉棕黄层部分(富含白细胞)，2)照射所收集的血沉棕黄层部分，和3)再输回经处理过的白细胞。收集阶段包括血液抽取、离心和再输回步骤，共循环6次。每次循环中，将全血离心，并在碗形提取机(pheresis bowl)中分离。在每次收集循环中，自该分离步骤开始保留血浆(每次循环体积由UVAR仪器操作员确定)和40ml血沉棕黄层。在下轮收集循环开始前将红细胞和所有剩下的血浆再输回给患者，分离出总计240ml的血沉棕黄层和300ml的血浆，保留用于UVA照射。
对放在照射回路内富含白细胞血液的照射始于第一次收集循环的血沉棕黄层收集期间。将所收集的血浆和血沉棕黄层与200ml肝素化生理盐水和200mg UVADEX(水溶性8-甲氧基补骨脂灵(psoralin))相混合。该混合物在通过PHOTOCEPTOR光活化室1.4mm厚的层中流动，光活室插在PHOTOSETTE两边的UVA灯之间。PHOTOSETTEUVA灯照射这一可透过UVA的PHOTOCEPTOR室的两侧，允许暴露在紫外光中180分钟，产生的平均暴露量为1-2J/cm2/淋巴细胞。最终的血沉棕黄层制备物估计占PBMC总成分的20％-25％，血细胞比容为2.5％-7％。光活化期之后，在30-45分钟时间内，将所述体积再输回给患者。美国专利申请顺序号09/480,893描述了用于给予ECP的另一个系统。5,951,509、5,985,914、5,984,887，4,464,166、4,428,744、4,398,906、4,321,919、WO 97/36634和WO97/36581也包括了用于这方面的装置和方法的描述。
可用于本发明方法的另一个系统参见美国专利申请顺序号09/556,832。该系统包括可在体外光泳期间减少由受治疗者体内收集或提取的净体液体积(net fluid volume)的设备。递送至细胞群体的光能的有效量可用6,219,584所述方法和系统确定。
诱导细胞群体凋亡的其它多种方法是众所周知的，可能都适用于本发明。一种这样的处理方法包含对细胞群体进行电离辐射(γ射线、X射线等)和/或非电离电磁辐射，包括紫外线、加热、冷却、血清剥夺(serum deprivation)、生长因子剥夺、酸化、稀释、碱化、离子强度改变、血清剥夺、照射或其组合。或者，可通过使细胞群体经超声处理来诱导细胞凋亡。
诱导细胞凋亡的又一种方法包含体外向细胞群体施予氧化应激。这可通过用化学氧化剂(例如过氧化氢、其它过氧化物和氢过氧化物、臭氧、高锰酸盐、高碘酸盐等)处理悬液中的细胞群体而实现。可采用生物学上可接受的氧化剂减少与细胞凋亡诱导所形成的细胞群体残余物和污染有关的潜在问题。
在制备诱导细胞凋亡的细胞群体时，应当注意不要施加过度水平的氧化应激、辐射、药物处理等，否则的话可能引起处理时至少一些细胞坏死的重大风险。坏死引起细胞膜破裂并释放出常常造成生物学上有害后果(特别是炎症反应)的细胞内容物，因此，最好避免存在坏死细胞及其成分以及包含凋亡细胞的细胞群体。要诱导细胞凋亡的细胞群体的适当处理水平和所选择的诱导细胞凋亡的处理类型很容易由本领域技术人员确定。
本发明的一种方法包括培养得自受治疗者或适宜的哺乳动物细胞系的细胞。然后，可体外处理培养细胞以体外诱导细胞凋亡并产生细胞群体。体外处理法可选自抗体、化疗药物、辐射、体外光泳、超声、蛋白质和氧化剂。然后，悬浮于受治疗者血浆或其它合适的悬液介质(例如盐水或平衡的哺乳动物细胞培养基)中的细胞可按下述方法孵育。
细胞凋亡的检测和定量方法可用于本发明以确定与白细胞或T细胞一起孵育过的制备物中细胞凋亡的存在和水平。在一个实施方案中，可通过琼脂糖凝胶电泳中所观察到的特征性DNA“梯”来鉴定经历细胞凋亡的细胞，DNA“梯”因DNA被切割成一系列片段而形成。在另一个实施方案中，可以用磷脂酰丝氨酸在细胞的表面表达来鉴定和/或定量测定诱导细胞凋亡的细胞群体。线粒体膜电位变化的测定，反映出线粒体膜通透性的变化，是另一种鉴定细胞群体的公认方法。科学文献中记载了用抗细胞群体特异性标记的单克隆抗体，鉴定经历细胞凋亡的细胞和鉴定细胞群体的其它多种方法。
给予T reg可用于治疗关节炎和其它自身免疫性疾病。T reg还可用于治疗或预防细胞、组织、器官、动物或患者的至少一种与自身免疫相关的疾病，包括但不限于急性横贯性脊髓炎、斑秃、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、动脉粥样硬化、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、贝赫切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻-皮炎、小脑性脊髓小脑疾病、脊髓小脑变性(脊髓性共济失调、弗里德赖希共济失调、小脑皮质变性)、慢性酒精中毒、酒精诱导性肝炎、自身免疫性肝炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性肠病、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、丘-施综合征、疤痕性类天疱疮、冷凝集素病、CResT综合征、克罗伊茨费尔特-雅各布病、克罗恩病、代-托综合征、拳击运动员痴呆、糖尿病、弥漫性雷维小体病、盘状狼疮、基底神经节疾病、弥散性血管内凝血、中年唐氏综合征、药物诱导的运动障碍、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、急性热病性多神经炎、哈-施病、桥本甲状腺炎、亨廷顿老年性舞蹈病、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、婴幼儿或青少年脊髓性肌萎缩、胰岛素依赖型糖尿病、青少年关节炎、川崎病、皮质脊髓系统病变、白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、扁平苔藓、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、多系统变性(Mencel、代-托综合征、夏-德雷格综合征、神经系统亚速尔病)、重症肌无力、神经原性肌萎缩、帕金森病、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎性皮肌炎、原发性丙球蛋白缺乏血症、原发性胆汁性肝硬化、进行性核上麻痹、牛皮癣、雷诺现象、赖特综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、雷维小体型老年性痴呆、斯耶格伦综合征、僵人综合征、亚急性硬化性全脑炎、系统性疾病(雷弗素姆病、血β脂蛋白缺乏症、共济失调、毛细血管扩张症、线粒体多系统病)、系统性红斑狼疮(SLE)、过氧化氢酶缺乏症、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、甲状腺炎、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、脉管炎、白斑、韦格纳肉芽肿病、韦-科综合征。
本发明还可用于治疗移植物排斥或移植物抗宿主病(GVHD)。肺移植后有30％-60％的患者发生急性实体器官移植排斥，由于免疫抑制药的成功应用，因此肝、肾、心脏等实体器官的急性移植排斥程度降低。淋巴细胞介导(细胞介导)的针对移植抗原的免疫反应是急性排斥的主要机制。延迟排斥或慢性排斥引起在移植后数月至数年内移植物破坏，其特征是导致移植组织坏死的血管破坏。目前无法通过标准方案将这种排斥抑制到任何较大的程度，因此，免疫耐受性更持久的需求明显未得到满足。
延迟的移植物退化时有发生，而且尽管增加了免疫抑制疗法，但是这种慢性排斥类型常常不知不觉地发展。所述病理情况不同于急性排斥的病理情况。主要涉及动脉内皮，伴以逐步使脉管腔闭塞的广泛性增殖，导致移植物局部缺血和纤维化。
目前，免疫抑制剂被广泛用来控制排斥反应，主要是为了保障移植的成功。然而，这些药物抑制所有的免疫反应，因此无法抵挡的感染成为移植受体最主要的死亡原因。
在不同类型移植物的情况下，现有的免疫抑制剂治疗可以不同。同种异体肝移植要比其它器官同种异体移植的排斥攻击性小。例如，肝移植物的过急性排斥不总是发生在对HLA抗原或ABO不相容性预敏化的患者中。成人中典型的免疫抑制疗法包括使用环孢菌素，通常在移植开始时按4-6mg/kg/天静脉给药，然后当出现耐药时，便按8-14mg/kg/天口服给药。如果发生肾功能障碍，则下调剂量，使用血液水平作为合适剂量的近似估值。
在心脏移植中，免疫抑制方案类似于肾移植或肝移植的方案。然而，在肺移植和心肺移植中，80％以上的患者发生急性排斥，但却可以成功地加以控制。患者用皮质类固醇治疗，按高剂量经静脉给予ATG或OKT3。预防药ALG或OKT3还常常在移植后头两周内给予。在血管化器官移植中，胰腺移植是独特的：它只是试图稳定或防止I型糖尿病退化的靶器官并发症，而不是用于拯救生命。因为受体将胰岛素注射风险换成了免疫抑制风险，所以胰腺移植通常主要限于已经必需接受免疫抑制药物的患者(也就是说，患肾衰竭准备接受肾移植的糖尿病患者)。
急性髓细胞白血病或成淋巴细胞白血病的患者可从骨髓移植(BMT)中获益。由于儿科BMT治愈儿童遗传疾病(例如珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞性贫血、免疫缺陷、先天性代谢病)的潜力，因此得到推广。骨髓移植的另一选择是自体移植(当诱导出完全缓解(complete remission)时，取出患者自身的骨髓，之后患者通过切除治疗以期破坏任何残留肿瘤，再用患者自身的骨髓进行挽救)。由于使用自体移植物，不需要任何免疫抑制法，而只是需要短期高剂量化学疗法用于根除肿瘤和分离骨髓；伴随移植物抗宿主病的移植后问题最少。
HLA相同供体的白血病患者移植中，排斥率＜5％。对于多次输血的再生障碍性贫血患者，排斥率也显著降低，因为移植物导入时免疫抑制增强。但是，可能发生并发症，包括骨髓移植物宿主的排斥、急性GVHD和感染。后期的并发症包括慢性GVHD、长期的免疫缺陷和疾病复发。
用本发明的治疗可使其它几种移植更为有效。实例包括角膜移植、皮肤同种异体移植、软骨同种异体移植、骨移植和小肠移植。
可用本发明的方法更有效地治疗许多其它疾病。例如，皮肤T细胞淋巴瘤是其中T淋巴细胞变成恶性并累及皮肤的疾病。通常使用三种治疗：辐射、化疗和光泳。皮肤T细胞淋巴瘤的治疗取决于疾病的阶段和患者的年龄和总的健康状况。由于在过往研究中标准治疗法对患者的效力，因此可予以考虑，或者可考虑参加临床试验。患皮肤T细胞淋巴瘤的大多数患者无法用标准疗法治愈，一些标准治疗法可能要比理想情况下的副作用更多。使用本发明方法的治疗也可用于治疗该病。
本发明方法还可用于移植手术，例如通常在整容整形手术或非整容整形手术中进行的移植手术。这些植入物可包括牙、脂肪植入(例如植入到面颊、嘴唇和臀部)、面部植入物(包括鼻、面颊、前额、下巴和头骨的植入物)、臀部植入物、乳房植入物等。其它植入物包括但不限于角膜环、皮质、眶、耳蜗、肌肉(所有肌肉，包括胸肌、臀肌、腹肌、腓肠肌、比目鱼肌、二头肌、三头肌)植入物、异质成形关节(alloplastic joint)和骨置换(bone replacement)、骨修复植入物(螺钉、杆、梁、板、弹簧)、金属板、棘(spinal)、毛状椎骨(vertebral hair)、A型肉毒毒素/胶原/眼科用透明质酸凝胶/美容用透明质酸凝胶注射剂、阴茎植入物、前列腺种子植入物(prostate seed implant)、乳房植入物(美容和重塑)、宫内节育器、激素植入物、胎儿细胞或干细胞植入、起搏器、去纤颤器、人造动脉/静脉/瓣膜和人造器官。
用本发明的方法可更有效地治疗自身免疫性疾病。这些是免疫系统针对内源抗原产生自身抗体，继而损害组织的疾病。可通过几种方法鉴定个体是否患有疾病，这些方法包括但不限于HLA连锁分型、基于血液或血清的测定、或遗传变异(例如单核苷酸多态性(SNP))的鉴定。例如，一旦确定个体有HLA DR4连锁，并已诊断患有类风湿性关节炎，即可开出T reg治疗的处方。与自身免疫性疾病相关的其它HLA等位基因(亦称MHC等位基因)包括B27(强直性脊椎炎)；DQA1*0501和DQB1*0201(腹腔疾病)；DRB1*03、DRB 1*04、DQB1*0201、DQB1*0302和DMA*0101(I型糖尿病)和Cw6(牛皮癣)。这些等位基因还可用来确定个体是否正受累于自身免疫性疾病，因此确定T reg治疗是否可有效。
基于血液或血清的测定法还可用来评价易患疾病的体质。例如有一种检测血清中自身核抗体(autonuclear antibodies)存在的测定法，该自身核抗体可导致狼疮发作。基于血清的测定法还可用于预测自身免疫性心肌炎。另外，基于血清的测定法可用来测定胰岛素水平(糖尿病)或其它疾病的肝酶或心脏酶。T3水平可预测桥本甲状腺炎。用基于血液或血清的测定法确定个体患有疾病后，可应用本发明的方法防止或延迟这些疾病的发作，或者减少这些疾病的作用。通过鉴定遗传变异(包括但不限于SNP)，可以鉴别个体易患疾病的体质。因此，在本发明又一方面，首先确定患者是否患有自身免疫性疾病或者易患自身免疫性疾病，然后开出T reg治疗的处方。
本发明方法还适用于治疗特应性疾病，这是一种变应性疾病，其中个体对外部变应原十分敏感。特应性疾病包括但不限于特应性皮炎、外因性支气管哮喘、荨麻疹、变应性鼻炎、变应性肠胃炎等。标准诊断测试可用来确定患者是否患有上述类型的疾病。
下面的实施例用于说明但不限制所要求保护的本发明的内容。本文所引用的所有参考文献都通过引用结合到本文中。
实施例1
通过8MOP/UVA的凋亡诱导
使正常人供体白细胞通过菲可帕克无菌分离介质(Ficoll-paque)，收集和洗涤PBMC后，按大约107个细胞/ml接种到T-75组织培养瓶中。向该瓶中加入200ng/ml 8-MOP后，进行UVA照射(～3J/cm2)。为了避免贴壁，将细胞快速从瓶中取出，并按适当浓度接种以产生Treg。
Treg的产生
使正常人供体白细胞通过菲可帕克无菌分离介质(Ficoll-paque)，收集PBMC。使用磁激活细胞分选仪(magnetically activated cell sorter)柱和CD4+负选择抗体混合物(antibody cocktail)(Miltenyi Biotec)，从PBMC中纯化出T淋巴细胞。将纯化幼稚CD4T细胞和经ECP处理的PBMC按2∶1比率(CD4∶PBMC)与20ng/ml IL-10共孵育8天(图1A)。8天后，CD4+T细胞用MAC和CD4正选择抗体混合物(Miltenyi Biotec)进行纯化。IL-10不是必需的，但是在某些情况下，它能诱导较一致的表型。
Treg评价
通过二次混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，“MLR”)评价Treg抑制活性(图1B)。将同基因CD4+T细胞按10,000个细胞/孔接种到96孔板中。将异基因树突细胞按2000个细胞/孔加到孔中。开始按1个Treg细胞对4个效应T细胞的比率，将Treg滴定到MLR中。第5天用Roche细胞增殖BRDU化学发光ELISA(Roche’s CellProliferation BRDU chemiluminescent ELISA)，通过掺入溴脱氧尿苷(“BRDU”)，来测定增殖。化学发光用TopCount(Perkin Elmer)测量。
实施例2
用本发明方法产生的T细胞具有T reg活性
在20ng/mlIL-10存在下，将CD4+T细胞与经ECP处理的外周血细胞一起孵育8天。用MAC和CD4正选择抗体混合物(MiltenyiBiotec)将T reg从培养物中纯化出来。为了评价其调节活性，故将T reg加到由10,000个同基因CD4+T细胞和2000个异基因树突细胞组成的MLR中。第5天通过掺入BRDU，来测定这些培养物的增殖。结果见图2。
实施例3
用本发明方法产生的T细胞具有T reg活性
在20ng/ml IL-10存在下，通过孵育CD4+T细胞产生了Tr1细胞。在20ng/ml IL-10存在下，将CD4+T细胞与经ECP处理的外周血细胞一起孵育8天，产生了T reg。用MAC和CD4正选择抗体混合物(Miltenyi Biotec)将T reg从培养物中纯化出来。为了评价其调节活性，故将T reg加到由10,000个同基因CD4+T细胞和2000个异基因树突细胞组成的MLR中。第5天通过掺入BRDU，来测定这些培养物的增殖。结果见图3。
实施例4
用本发明方法产生的T细胞具有T reg表型
在20ng/ml IL-10存在下，将CD4+T细胞与经ECP处理的外周血细胞一起孵育8天。用MAC和CD4正选择抗体混合物(MiltenyiBiotec)将T reg从培养物中纯化出来。然后将T reg加到由10,000个同基因CD4+T细胞和2000个异基因树突细胞组成的MLR中。将2ng/ml IL-2加到MLR中。第5天通过掺入BRDU，来测定这些培养物的增殖。结果见图4。
实施例5
用本发明方法产生的T细胞具有T reg表型
用24孔transwell插入系统(transwell insert system)(Nunc组织培养0.2μM Anopore插入系统#136935)，评价MLR中通过与经ECP处理的PBMC共孵育所产生的Treg。将由500,000个同基因CD4+T细胞和100,000个异基因树突细胞组成的MLR接种到transwell的底部。将250,000Treg接种到transwell插件中，或者与效应T细胞和异基因树突细胞一起直接接种到底孔。第5天，取出插件，第5天通过掺入BRDU测定增殖。结果见图5。
实施例6
(小鼠模型体内应用)(预防性)
小鼠
雄性C3H/HeJ(C3H；H2k)、(B6XC3H)F1(H2bXk)、(B6XDBA/2)F1(H2bXd)、C57BL/6(B6；H2b)和CBA/JCr(CBA；H2k)小鼠可购自美国国家癌症研究所研究与发展中心(National Cancer Institute Researchand Development Center)(Frederick，Md.)。B10.BR(H2k)小鼠可购自Jackson实验室(Bar Harbour，ME)。用于实验的小鼠介于6-10周周龄之间，关养在无特定病原体的设施内的无菌微型隔离笼中，食用经过高压灭菌的食物，任意饮水。
培养基
补充了0.1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma Chemical Co.，St Louis，Mo.)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)将用于供体骨髓和淋巴细胞的所有体外操作。临注射前，将细胞洗涤并重悬浮于单独的PBS中。为了维持细胞系并用于体外测定，使用补充了10％胎牛血清(FBS；GIBCO，GrandIsland，N.Y.)、2mmol/L L-谷氨酰胺、50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基(Mediatech，Herndon，Va.)。
抗体
实验性光泳
从同基因同窝生的健康小鼠中获取脾细胞，加入PBS后用注射器后端研磨，制成单细胞悬液。将这些细胞重新悬浮，用PBS洗涤细胞两次后，再按12.5×106细胞/ml PBS重新悬浮。洗涤细胞后，将细胞重新悬浮于冰冷的培养基中，按大约106个细胞/ml接种到T75瓶中。加入补骨脂素(UVADEX溶液)至终浓度为200ng/ml，这是Therakos所提供母液的100倍稀释液。将该瓶横放在UVA照射室中，给予大约1.5J/cm2的光照，相当于当托盘距光源6cm时底部光照1.5分钟。从瓶中快速取出细胞以避免贴壁，置于适当浓度下供注射用。如果发生贴壁，则轻轻刮擦该瓶或者轻叩该瓶以取出大部分细胞。
骨髓移植
用含有0.01％BSA的PBS(PBS/BSA)冲洗供体小鼠胫骨和股骨，从中获取骨髓。在37℃下，骨髓细胞用按1∶100稀释的抗Thy 1.2nAb(J1j；美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.)和按1∶6稀释的豚鼠补体(Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，Pa.)消耗T细胞45分钟。从供体小鼠脾和淋巴结中分离出淋巴细胞。脾细胞用含有0.7％氯化铵(NH4Cl)的Gey平衡盐裂解溶液(Gey′s balanced salt lysing solution)处理，除去红细胞(RBC)。RBC耗尽后，将脾细胞和淋巴结细胞合并，通过在塑料培养皿淘选而耗尽B细胞，该培养皿已用5mg/ml山羊抗小鼠IgG的稀释液在4℃下预包被1小时。预期这些处理产生大约90％-95％CD3+细胞的供体群体，如荧光流式细胞术定量测定所测。然后，用抗CD8(3.168)或抗CD4mAb(RL172)和补体，通过负选择分离出T细胞亚群。预期这些处理降低目标T细胞亚群至本底水平，如流式细胞分析所测。将受体小鼠暴露于13Gy，由137CS源按1.43Gy/分钟全身照射，按每次6.5Gy的分剂量递送，间隔3小时。然后，这些小鼠通过尾静脉经静脉内(i.v.)移植2×106个抗Thy 1.2处理的骨髓细胞(ATBM；T细胞耗尽)以及规定数目的合适T细胞(富含供体CD4或CD8的T细胞)。小鼠在移植前1天及移植后第0天、第4天、第8天和第12天用T reg治疗(全都为0.5mg，腹膜内)。对于GVL实验，用类似于T reg治疗的时间表，在供体ATBM和T细胞移植前一天，B6受体小鼠因注射T reg而受到攻击。在GVHD和GVL这两个实验当中，每天检查小鼠的发病率和死亡率直到实验完成。合并2-3次独立实验的数据，通过所有死亡天数据点(包括零)的线性回归，根据内插50％存活点求出半数存活时间(MST)。运用非参数威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed rank test)进行各实验组之间存活的统计比较。权重比较的显著性将用各个时间点的T检验测定。
流式细胞术
将体积为25μl的合适mAb与2-5×105个细胞，在96孔U型底微量培养板各孔中于4℃孵育30分钟，以1500rpm离心3分钟，用含有0.1％BSA和0.01％叠氮化钠的PBS(洗涤缓冲液)洗涤。计算各样品阳性细胞百分比和荧光强度算术平均值。
病理分析
从各个不同治疗组的小鼠中，采集全厚度耳活检样品(3×2mm)，并迅速放在4％戊二醛中固定过夜，然后用0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)漂洗。组织用2％四氧化锇后固定2小时，在梯度乙醇中脱水，包埋于Epon 812中。用Porter-Blum MT2B超薄切片机切成1微米厚的切片，用甲苯胺蓝染色，最后浸入95％乙醇供光学显微镜分析用。在光学显微镜100倍物镜及10倍目镜下，统计前述测定的角化不良表皮细胞/linear mm的数目。对每只动物和每个时间点，对不超过10个表皮的linear mm进行评价。对于治疗组，在盲法条件下进行分析。
举例来说，20030157073；Kohm，A等(2002)；Tang，Q等(2004)和Schwarz，A等(2004)提供了用于T reg的其它动物模型。
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Claims (19)

1.一种产生具有调节活性的T细胞(T reg)的方法，该方法包括将CD4+白细胞与自体凋亡的外周血单核细胞(AC)一起孵育，其中所述孵育在CD4+∶AC比率为1∶10至10∶1下进行。
2.权利要求1的方法，其中所述孵育在足以产生T reg的时间和条件下进行。
3.权利要求1的方法，该方法还包括筛选表达CD4的白细胞以获得CD4+细胞的步骤。
4.权利要求1的方法，其中所述孵育在CD4+∶AC比率为2∶1至1∶2下进行。
5.权利要求1的方法，其中所述AC通过细胞凋亡诱导处理获得。
6.权利要求5的方法，其中细胞凋亡诱导处理是ECP方法，该方法使用光活化化合物以及激活光活化化合物波长的光。
7.权利要求6的方法，其中所述光活化化合物是补骨脂素，所述光是UVA。
8.权利要求7的方法，其中所述补骨脂素是8-MOP。
9.权利要求1的方法，其中所述孵育还包括加入进一步提高T reg产生或功能的因子。
10.权利要求9的方法，其中所述因子包括激素、蛋白质和药物中的至少一种。
11.权利要求9的方法，其中所述因子是抗体。
12.权利要求10的方法，其中所述因子选自至少一种以下的因子：TGFβ、αMSH、抗CD46、IL-10、维生素D3、地塞米松、雷帕霉素和IL-2。
13.权利要求12的方法，其中所述因子是IL-10。
14.权利要求13的方法，其中IL-10存在的浓度为1ng/ml至100ng/ml。
15.权利要求14的方法，其中IL-10存在的浓度约为20ng/ml。
16.权利要求1的方法，其中所述孵育进行1天至14天。
17.权利要求16的方法，其中所述孵育进行约8天。
18.权利要求1的方法，该方法还包括在孵育时加入抗原以产生调节针对该抗原的免疫应答的Treg。
19.权利要求18的方法，其中所述抗原是同种异体抗原。
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