ES2633102T3 - El uso de células apoptóticas ex vivo para generar linfocitos T reguladores - Google Patents

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Abstract

Un método ex vivo de generación de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) que comprende: a. seleccionar leucocitos que expresan CD4 para obtener células CD4+; b. incubar leucocitos autólogos CD4+ con células mononucleares de sangre periférica apoptóticas autólogas (AC), donde las AC se obtienen mediante un tratamiento inductor de la apoptosis que es un procedimiento de ECP que emplea un compuesto fotoactivable junto con luz de una longitud de onda que activa el compuesto fotoactivable.

Description

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DESCRIPCION
El uso de celulas apoptoticas ex vivo para generar linfocitos T reguladores Antecedentes de la invencion
Muchos tipos de celulas del organismo pueden eliminar los restos apoptoticos y celulares de los tejidos; sin embargo, el fagocito profesional, o celula presentadora de antigeno (APC), tiene una alta capacidad para hacerlo. El reconocimiento de las celulas apoptoticas (“AC”) se produce a traves de una serie de receptores de patrones moleculares asociados a las AC, evolutivamente conservados, ("ACAMPR") en APC que reconocen y se unen a los patrones moleculares asociados a celulas apoptoticas correspondientes ("ACAMP"). Estos receptores reconocen ligandos tales como fosfatidil serina y lfpidos oxidados que se encuentran en las celulas apoptoticas. Savill et al. (2002); y Gregory et al. (2004).
Tanto in vitro como in vivo, ese aclaramiento de AC por las APC in vivo regula las respuestas inmunes. Savill et al. (2002). Esta modulacion inmune parece ocurrir principalmente a traves de una alteracion de la funcion de las APC con varias marcas distintivas de una APC inductora de la tolerancia. Estas APC tolerogenicas inducen tolerancia a traves de una variedad de mecanismos incluyendo la generacion de linfocitos T reguladores ("T reg").
Los T reg comprenden un grupo heterogeneo de linfocitos T, que inhiben activamente las respuestas inmunes. Groux et al. (1997); Sakaguchi et al. (2001); y Roncarolo et al. (2001). Existe la posibilidad de desarrollar terapias con T reg para una variedad de enfermedades.
Una forma de generar T reg in vivo es a traves de la infusion de AC. Hay pruebas de tanto modelos animales como tratamientos humanos de que la infusion de AC, como ocurre durante la fotoforesis extracorporal (ECP), induce T reg. Maeda et al. (2005); Lamioni et al. (2005); Aubin et al. (2004); Mahnke et al. (2003); y Saas et al. (2002).
Otros metodos de generacion de T reg ex vivo incluyen exponer los linfocitos T a una variedad de sustancias incluyendo: IL-10 (Roncarolo et al. (2001); y Zeller et al. (1999)); TGFp (Zheng et al. (2004); Gray et al. (1998); Horwitz et al. (1999); Ohtsuka et al. (1999a); Ohtsuka et al. (1999b); Stohl et al. (1999); Gray et al. (2001); Horwitz (2001); Yamagiwa et al. (2001); Horwitz et al. (2002); y Zheng et al. (2002)); aMSH (Luger et al. (1999); Taylor (2005); Namba et al. (2002); Nishida et al. (1999); Nishida et al. (2004); Streilin et al. (2000); Taylor et al. (1992); Taylor et al. (1994a); Taylor et al. (1994b); Taylor et al. (1996); Taylor (1999); Taylor (2003); y Taylor et al. (2003)); vitamina D3 (Willheim et al. (1999); Penna et al. (2000); Pedersen et al. (2004); May et al. (2004); Koren et al. (1989); Gregori et al. (2001); Cobbold et al. (2003); y Barrat et al. (2002)); dexametasona (Pedersen et al. (2004); Barrat et al. (2002); y O'Garra et al. (2003)); y purificacion (Earle et al. (2005); Schwarz et al. (2000); Chatenoud et al. (2001); Tang et al. (2004); y Masteller et al. (2005)).
Las enfermedades autoinmunes implican la activacion inapropiada de las celulas inmunes que son reactivas contra el propio tejido. Estas celulas inmunes activadas potencian la produccion de citocinas y autoanticuerpos implicados en la patologfa de las enfermedades. Otras enfermedades en las que participan los linfocitos T incluyen la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), que se produce en el contexto del trasplante. En la GVHD, los linfocitos T del donante rechazan los tejidos y organos del receptor generando un ataque contra el organismo del receptor. Una serie de otras enfermedades implican la desregulacion del sistema inmune del hospedador. Algunos se tratan mejor con productos farmaceuticos, algunos con productos biologicos, otros con tratamientos tales como la fotoforesis extracorporal (ECP), y otros tienen opciones de tratamiento muy limitadas.
La ECP ha demostrado ser una terapia eficaz en ciertas enfermedades mediadas por los linfocitos T. En el caso de la GVHD, se ha usado la fotoferesis como tratamiento en asociacion con pomada topica de triamcinolona, antifungica, antiviral, antibioticos, inmunoglobulinas y metotrexato. La ECP tambien se ha usado con agentes inmunosupresores tales como el micofenolato de mofetilo, tacrolimus, prednisona, ciclosporina, hidroxicloroquina, esteroides, FK-506 y talidomida para la GVHD cronica ("cGVHD") y la cGVHD refractaria. Para los trasplantes de organos solidos, la ECP se ha usado junto con agentes inmunosupresores para reducir el numero de episodios de rechazo agudo de aloinjertos asociados con los aloinjertos renales y los trasplantes cardfacos. Por ejemplo, la ECP se ha usado con OKT3 y/o los agentes inmunosupresores prednisona, azatioprina y ciclosporina para revertir el rechazo agudo de los aloinjertos renales. La ECP tambien se ha usado con la ciclofosfamida, la irradiacion corporal total fraccionada y el etoposido para el trasplante alogenico de medula para la leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide cronica, linfoma no Hodgkin o anemia aplasica severa.
Sumario de la invencion
La incubacion ex vivo con leucocitos en un sistema alogenico conduce a la generacion de linfocitos T con actividad reguladora. Esto genera linfocitos T reguladores ("linfocitos T reg" o "T reg") con actividad para suprimir las respuestas inmunes contra el aloanrtgeno.
En sistemas espedficos del anrtgeno y de activacion policlonal, se puede obtener un resultado espedfico del
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antigeno mediante la adicion de antigeno u otra estimulacion con celulas autologas apoptoticas ("AC").
La presente invencion engloba un metodo de generacion de linfocitos T con actividad reguladora segun lo definido por la reivindicacion 1. Las caractensticas opcionales estan definidas por las reivindicaciones dependientes.
La presente divulgacion incluye un metodo de tratamiento de un trastorno autoinmune o de mejora de uno o mas de sus smtomas, mediante la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye un metodo de tratamiento de una enfermedad atopica o de mejora de uno o mas de sus smtomas, mediante la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye un metodo de administracion a un receptor de un transplante de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye un metodo de administracion a un paciente de GVHD de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye un metodo de tratamiento de un paciente con un trastorno o predisposicion a padecer un trastorno mediante el analisis del paciente para determinar si tiene un trastorno y mediante la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es una representacion esquematica de A: Generacion de T reg; B: Tras la generacion de los linfocitos T reguladores, colocacion de los linfocitos T reg en MLR.
La Figura 2 muestra que los linfocitos T reguladores generados mediante la incubacion junto con PBMC tratadas con ECP inhiben la proliferacion de los linfocitos T singenicos.
La Figura 3 muestra que los linfocitos T reguladores generados mediante la incubacion junto con PBMC tratadas con ECP inhiben la proliferacion de los linfocitos T mejor que los linfocitos Tr1 convencionales.
La Figura 4 muestra que la generacion de linfocitos T reguladores mediante la incubacion junto con PBMC tratadas con ECP se puede invertir a traves de la adicion de interleucina 2.
La Figura 5 muestra que la actividad supresora de los linfocitos T reguladores generados mediante la incubacion junto con PBMC tratadas con ECP depende del contacto.
Descripcion detallada
Generacion ex vivo de T reg usando AC
Los sistemas que se producen in vivo para generar T reg son bastante complejos y se basan en una serie de tipos de celulas y en la ubicacion morfologica. Sin embargo, la presente invencion muestra que es posible generar estas celulas in vitro en las condiciones descritas en el presente documento. La incubacion ex vivo con leucocitos en un sistema alogenico conduce a la generacion de linfocitos T con actividad reguladora. Esto genera linfocitos T reguladores ("linfocitos T reg") con actividad para suprimir las respuestas inmunes contra el aloantfgeno, importantes en una amplia variedad de trastornos incluyendo, sin limitacion, enfermedades autoinmunes, enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) y trasplante de organos solidos. En sistemas espedficos del antfgeno y de activacion policlonal, se puede obtener un resultado espedfico del antfgeno mediante la adicion de antfgeno u otra estimulacion con celulas autologas apoptoticas ("AC").
Este metodo de produccion ex vivo ofrece varias ventajas frente a los metodos inducidos por farmacos descritos anteriormente. Es importante destacar que se evitan los posibles efectos toxicos y no naturales de estas moleculas anadidas.
Ademas, existen ventajas de la generacion ex vivo frente a la utilizacion in vivo de celulas apoptoticas incluyendo, sin limitacion, un mayor control frente al numero, la actividad y la funcion de estas celulas. Este control terapeutico proporciona mejores protocolos de tratamiento al paciente.
Mediante la generacion de T reg usando una serie de metodos tales como la purificacion, activacion y adicion de factores de diferenciacion tales como TGFp, aMSH, anti-CD46, IL-10, vitamina D3 y dexametasona, se ha
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demostrado que estas celulas se pueden generar ex vivo. Las celulas apoptoticas proporcionan un metodo de tipo mas "in vitro" para inducir estas celulas mediante la generacion de APC tolerogenas.
La presente divulgacion incluye un metodo de generacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) mediante la incubacion de leucocitos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye composiciones de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye un metodo de tratamiento de un trastorno autoinmune o de mejora de uno o mas de sus smtomas, mediante la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
Los trastornos autoinmunes incluyen, sin limitacion, mielitis transversa aguda, alopecia areata, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, espondilitis anquilosante, smdrome antifosfolfpido, aterosclerosis, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemolttica autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatfa, esprue-dermatitis por enfermedad celfaca trastornos espinocerebelosos cerebelosos, degeneraciones espinocerebelosas (ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelosas), alcoholismo cronico, hepatitis inducida por el alcohol, hepatitis autoinmune, smdrome de disfuncion inmunologica cronica de fatiga (CFIDS), enfermedad inflamatoria intestinal cronica, polineuropatfa desmielinizante inflamatoria cronica, enfermedad de Churg-Hodgkin, penfigoide cicatricial, enfermedad de aglutinina fna, smdrome de CResT, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Crohn, atrofia de Dejerine-Thomas, demencia pugilfstica, diabetes mellitus, enfermedad difusa de cuerpos de Lewy, lupus discoide, trastornos de ganglios basales, coagulacion intravascular diseminada, smdrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por farmacos, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de hospedador contra injerto, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, corea de Huntington, corea senil, fibrosis pulmonar idiopatica, purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), nefropatfa por IgA, atrofia muscular espinal infantil o juvenil, diabetes dependiente de insulina, artritis juvenil, patologfa de Kawasaki, lesiones del sistema corticoespinal, leucemias, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, liquen plano, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis multiple, degeneraciones de multiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, Machado-Joseph), miastenia gravis, neurogenica muscular, enfermedad de Parkinson, penfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, smdromes poliglandulares, polimialgia reumatica, polimiositis dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, paralisis supranuclear progresiva, soriasis, fenomeno de Raynaud, smdrome de Reiter, fiebre reumatica, artritis reumatica, sarcoidosis, esclerodermia, demencia senil de tipo cuerpos de Lewy, smdrome de Sjogren, smdrome de la persona ngida, panencefalitis esclerosante subaguda, trastornos sistemicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia, trastorno del sistema multiple mitocondrial), lupus eritematoso sistemico (LES), arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de celulas gigantes, tiroidiasis, colitis ulcerosa, uveftis, vasculitis, vitiligo, granulomatosis de Wegener, smdrome de Wernicke-Korsakoff.
La presente divulgacion incluye un metodo de tratamiento de una enfermedad atopica o de mejora de uno o mas de sus smtomas, mediante la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
Los trastornos atopicos incluyen, sin limitacion, patologfas inflamatorias cronicas y patologfas inflamatorias vasculares, incluyendo patologfas inflamatorias cronicas tales como sarcoidosis, enfermedad inflamatoria intestinal cronica, colitis ulcerosa y patologfa de Crohn y patologfas inflamatorias vasculares, tales como, pero sin limitacion, coagulacion intravascular diseminada, aterosclerosis y patologfa de Kawasaki.
La presente divulgacion incluye un metodo de administracion a un receptor de un transplante de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye un metodo de administracion a un paciente de GVHD de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
La presente divulgacion incluye un metodo de tratamiento de un paciente con un trastorno o predisposicion a padecer un trastorno mediante el analisis del paciente para determinar si tiene un trastorno y mediante la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion de una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
Los T reg pueden administrarse al paciente de acuerdo con un programa que incluye, sin limitacion, dos dfas, una
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semana antes del trasplante; tres dfas, una semana antes de la extraccion de dicho trasplante; dos d^as a la semana durante dos semanas antes del trasplante; y tres dfas a la semana durante tres semanas antes del trasplante.
Las cantidades eficaces de T reg para su uso en los metodos de tratamiento de la presente invencion para obtener el beneficio clmico requerido en un sujeto pueden variar dependiendo del origen de las celulas, el estado del sujeto, la edad y el peso del sujeto y otros factores relevantes, que son facilmente determinates mediante metodos bien conocidos. Preferentemente, el numero de T reg administrados a un paciente es de aproximadamente 1 x 105/kg a aproximadamente 1 x 107/kg. Mas preferentemente, el numero de T reg administrados a un paciente es de aproximadamente 1 x 106/kg.
El metodo de la presente invencion engloba la incubacion de las AC y los leucocitos durante un tiempo y en condiciones suficientes para generar T reg. La incubacion puede ser bajo cualquier condicion conocida en la tecnica que sea adecuada para los leucocitos y durante aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dfas. Preferentemente, la incubacion es durante aproximadamente 8 dfas.
El metodo de la presente invencion incluye ademas la seleccion de leucocitos que expresan CD4 para obtener celulas CD4+. Preferentemente, las celulas son CD4+.
El metodo de la presente invencion incluye la incubacion a cualquier concentracion adecuada de AC y celulas CD4+. Preferentemente, las celulas estan en una proporcion de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1 de CD4+:AC. Mas preferentemente, las celulas estan en una proporcion de 2:1 a aproximadamente 1:2 de CD4+:AC.
Las AC de la presente invencion se obtienen mediante un tratamiento inductor de la apoptosis conocido en la tecnica. Preferentemente, el tratamiento inductor de la apoptosis es un procedimiento de ECP que emplea un compuesto fotoactivable junto con luz de una longitud de onda que activa el compuesto fotoactivable. Preferentemente, el compuesto fotoactivable es un psoraleno y la luz es UVA. Preferentemente, el psoraleno es 8- MOP.
El metodo de la presente invencion puede incluir la incubacion con factores anadidos que potencien ademas la generacion o funcion de los T reg. Los factores adecuados incluyen, sin limitacion, hormonas, protemas, farmacos o anticuerpos. Preferentemente, los factores incluyen, sin limitacion, uno de TGFp, aMSH, anti-CD46, IL-10, vitamina D3, dexametasona, rapamicina e IL-2. Preferentemente, el factor es IL-10. Preferentemente, la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml. Preferentemente, la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 20 ng/ml.
El metodo de la presente invencion puede incluir la adicion de un antfgeno a la incubacion para generar T reg que regulen la respuesta inmune al antfgeno. Preferentemente, el antfgeno es un aloantfgeno. Dichos antfgenos pueden seleccionarse de cualquiera conocido en la tecnica.
Las poblaciones de celulas utiles en los metodos de la presente invencion comprenden "celulas apoptoticas" que incluyen celulas y cuerpos celulares, es decir, cuerpos apoptoticos que presentan o presentaran una o mas rasgos caracterizadores de la apoptosis. Una celula apoptotica puede comprender cualquier celula que este en la fase de induccion, en la fase efectora o en la fase de degradacion. Las poblaciones de celulas en las terapias de la invencion tambien pueden comprender celulas que se han tratado con un agente inductor de la apoptosis que todavfa son viables. Dichas celulas pueden presentar rasgos caracterizadores de la apoptosis en algun momento, por ejemplo, despues de la administracion al sujeto. Preferentemente, las AC son PBMC autologas que se han tratado con un inductor de la apoptosis. Preferentemente, el inductor de la apoptosis es ECP.
La ECP induce directamente niveles significativos de apoptosis. Esto se ha observado, por ejemplo, en los linfocitos de pacientes con CTCL, GVHD y esclerodermia. Las celulas apoptoticas contribuyen al efecto clmico observado.
Los rasgos caracterizadores de la apoptosis pueden incluir, pero sin limitacion, la exposicion superficial de la fosfatidilserina, como se detecta mediante metodos de deteccion convencionales aceptados, tales como tincion con Anexina V; alteraciones en la permeabilidad de la membrana mitocondrial medidas mediante metodos convencionales aceptados; la evidencia de fragmentacion del ADN, tal como el aspecto escalonado del ADN en electroforesis en gel de agarosa tras la extraccion del ADN de las celulas o mediante el marcaje in situ. Salvioli et al. (1997); Teiger et al. (1996); y Gavrieli et al. (1992).
La poblacion de celulas para su uso en la presente invencion se induce a convertirse en apoptotica ex vivo, es decir, extracorporalmente, y es compatible con las del sujeto, donante o receptor. Una poblacion de celulas puede prepararse a partir de esencialmente cualquier tipo de celula de mairnfero incluyendo estirpes celulares cultivadas. Por ejemplo, una poblacion de celulas puede prepararse a partir de un tipo de celula derivado del propio cuerpo del sujeto mamffero (autologo) o de una estirpe celular establecida. En concreto, una poblacion de celulas puede prepararse a partir de globulos blancos de sangre compatible con la del sujeto mamffero, mas concretamente, de los propios globulos blancos del sujeto e, incluso mas concretamente, de los propios leucocitos o linfocitos T del sujeto.
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Tambien se puede preparar una poblacion de celulas a partir de una estirpe celular establecida. Una estirpe celular que puede ser util en los metodos de la presente invencion incluye, por ejemplo, celulas Jurkat (ATCC n.° TIB-152). Otras estirpes celulares apropiadas para su uso de acuerdo con los metodos de la presente invencion pueden ser identificadas y/o determinadas por los expertos en la materia. La poblacion de celulas puede prepararse extracorporalmente antes de la administracion al sujeto, donante o receptor. Asf pues, en una realizacion, puede retirarse una almuota de sangre del sujeto, sangre del receptor o sangre del donante, por ejemplo, mediante venopuncion, y someterse al menos una parte de sus globulos blancos extracorporalmente a condiciones que induzcan la apoptosis.
En una realizacion, la poblacion de celulas puede comprender un determinado subconjunto de celulas que incluye, pero sin limitacion, leucocitos o celulas separadas de leucocitos basandose en su expresion de CD4, que son linfocitos T CD4+. La separacion y purificacion de los componentes sangumeos es bien conocida por los expertos en la materia. De hecho, el advenimiento de la terapia con componentes sangumeos ha dado lugar a numerosos sistemas disenados para la recoleccion de componentes sangumeos espedficos. Varios de estos sistemas de recoleccion se encuentran disponibles en el mercado, por ejemplo, Immunicon Corp. (Huntingdon Valley, Pa.), Baxter International (Deerfield, III) y Dynal Biotech (Oslo, Noruega).
El sistema de separacion de Immunicon separa los componentes sangumeos usando nanopartmulas magneticas (ferrofluidos) recubiertas con anticuerpos que conjugan, es decir, forman un complejo, con los componentes diana en una muestra de sangre. A continuacion, se incuba la muestra de sangre se incuba en un campo magnetico potente, y el complejo diana emigra hacia fuera del resto de la muestra donde se puede recoger. Veanse, por ejemplo, patentes de EE.UU. n.° 6.365.362; 6.361.749; 6.228.624; 6.136.182; 6.120.856; 6.013.532; 6.013.188; 5.993.665; 5.985.153; 5.876.593; 5.795.470; 5.741.714; 5.698.271; 5.660.990; 5.646.001; 5.622.83.1; 5.597.531; 5.541.072; 5.512.332; 5.466.574; 5.200.084; 5.186.827; 5.108.933; y 4.795.698.
El sistema de separacion biomagnetica Dynabeads® de Dynal separa los componentes sangumeos usando perlas magneticas recubiertas con anticuerpos que se conjugan con los componentes diana en una muestra de sangre, formando un complejo de Dynabeads-diana. El complejo se retira entonces de la muestra usando un concentrador de partmulas magneticas (Dynal MPC®). Se pueden recoger varios tipos de celulas diferentes usando este sistema de separacion. Los linfocitos T y los subconjuntos de linfocitos T tambien pueden aislarse o retirarse positiva o negativamente de la sangre entera, capa leucodtica, celulas mononucleares en gradiente o tejidos digeridos usando, por ejemplo, el kit CELLection™ CD2 (n.° de producto 116.03), Dynabeads® M-450 CD2 (n.° de producto 111.01/02), Dynabeads® CD3 (n.° de producto 111.13/14), Dynabeads® plus DETACHaBEAD (n.° de producto 113.03), Dynabeads® M-450 CD4 (n.° de producto 111.05/06), kit de aislamiento negativo de Cd4 (linfocitos T auxiliares/inductores) (n.° de producto 113.17), kit de aislamiento positivo de CD8 (n.° de producto 113.05), CD8 Dynabeads® (n.° de producto 111.07/08), kit de aislamiento negativo de CD8 (n.° de producto 113.19), kit de aislamiento negativo de linfocitos T (n.° de producto 113.11), CD25 Dynabeads® (n.° de producto 111.33/34), y expansor de linfocitos T CD3/CD28 Dynabeads® (n.° de producto 111.31). Baxter International ha desarrollado varios sistemas de aferesis basados en las propiedades de la centrifugacion, incluyendo el separador de celulas sangumeas CS-3000, el separador Amicus y el sistema Autopheresis-C. El separador de celulas sangumeas CS- 3000 Plus recoge tanto los productos de aferesis celular como el plasma. Comprende un separador de flujo continuo con un sistema centnfugo de doble camara que recoge los productos de la aferesis. El Amicus funciona en un formato bien de flujo continuo o de flujo intermitente para recoger las plaquetas y el plasma de un solo donante. El sistema Autopheresis-C esta disenado para la recoleccion de plasma de donantes, y puede recoger mas de 250 ml de plasma. Vease, en general, las patentes de EE.UU. n.° 6.451.203; 6.442.397; 6.315.707; 6.284.142; 6.251.284; 6.033.561; 6.027.441; y 5.494.578.
La ECP se usa para inducir la apoptosis. Esto implica un compuesto fotoactivable anadido a una poblacion de celulas ex vivo. El compuesto fotosensible puede administrarse a una poblacion de celulas que comprende celulas sangumeas tras su retirada del sujeto, receptor o donante, segun sea el caso, y antes o simultaneamente con la exposicion a la luz ultravioleta. El compuesto fotosensible puede administrarse a una poblacion de celulas que comprende sangre entera o una fraccion de la misma siempre que las celulas sangumeas diana o los componentes sangumeos reciban el compuesto fotosensible. En otra realizacion, se podna procesar primero una parte de la sangre del sujeto, sangre del receptor o sangre del donante usando metodos conocidos para retirar esencialmente los eritrocitos, pudiendose administrar luego el compuesto fotoactivo a la poblacion de celulas resultante que comprende la fraccion de PBMC enriquecida.
Los compuestos fotoactivables para su uso de acuerdo con la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, compuestos conocidos como psoralenos (o furocumarinas), asf como derivados de psoraleno tales como los descritos en, por ejemplo, los documentos 4.321.919; y 5.399.719. Los compuestos preferidos incluyen 8- metoxipsoraleno; 4,5'8-trimetilpsoraleno; 5-metoxipsoraleno; 4-metilpsoraleno; 4,4-dimetilpsoraleno; 4-5' dimetilpsoraleno; 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4'-hidroximetil-4,5',8-trimetilpsoraleno; 4',8-metoxipsoraleno; y un 4'-(omega-amino-2-oxa)alquil-4,5'8-trimetilpsoraleno, incluyendo, pero sin limitacion, 4'-(4-amino-2-oxa)butil- 4,5',8-trimetilpsoraleno. En una realizacion, el compuesto fotosensible que puede usarse comprende el derivado de psoraleno, amotosaleno (S-59) (Cerus Corp., Concord, AC). En otra realizacion, el compuesto fotosensible comprende 8-metoxipsoraleno (8 MOP).
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La poblacion de celulas a la que se ha anadido el compuesto fotoactivable se trata con una luz de una longitud de onda que activa el compuesto fotoactivable. La etapa de tratamiento que activa el compuesto fotoactivable se lleva a cabo preferentemente usando luz ultravioleta de longitud de onda larga (UVA), por ejemplo, a una longitud de onda en el intervalo de 320 a 400 nm. La exposicion a la luz ultravioleta durante el tratamiento con fotoferesis se administra preferentemente durante un tiempo suficiente para suministrar aproximadamente 1-2 J/cm2 a la poblacion de celulas.
Los aparatos de fotoferesis extracorporal utiles en los metodos de acuerdo con la invencion incluyen los fabricados por Therakos, Inc., (Exton, Pa.) con el nombre de UVAR®. En la patente de EE.UU. n.° 4.683.889, se encuentra una descripcion de dicho aparato. El sistema UVAR® usa un sistema de tratamiento y consiste en tres fases que incluyen: 1) la recoleccion de una fraccion de capa leucocftica (enriquecida en leucocitos); 2) la irradiacion de la fraccion de capa leucocftica recoleccion; y 3) la reinfusion de los globulos blancos tratados. La fase de recoleccion tiene seis ciclos de etapas de extraccion de sangre, centrifugacion y reinfusion. Durante cada ciclo, se centrifuga la sangre entera y se separa en un recipiente de feresis. A partir de esta separacion, se reservan el plasma (el volumen de cada ciclo es determinado por el operador del instrumento UVAR®) y 40 ml de capa leucocftica en cada ciclo de recoleccion. Se vuelven a infundir los globulos rojos y todo el plasma adicional al paciente antes de comenzar el siguiente ciclo de recoleccion. Finalmente, se separa un total de 240 ml de capa leucocftica y 300 ml de plasma, y se reserva para la irradiacion con UVA.
La irradiacion de la sangre enriquecida en leucocitos dentro del circuito de irradiacion comienza durante la recoleccion de la capa leucocftica del primer ciclo de recoleccion. Se mezclan el plasma y la capa leucocftica recogidos con 200 ml de solucion salina normal heparinizada y 200 mg de UVADEX® (8-metoxipsoralina hidrosoluble). Esta mezcla fluye en una capa de 1,4 mm de espesor a traves de la camara de fotoactivacion PHOTOCEPTOR®, que se inserta entre dos bancos de lamparas UVA del PHOTOSETTE®. Las lamparas PHOTOSETTE® UvA irradian ambos lados de esta camara PHOTOCEPTOR® transparente a la radiacion UVA, permitiendo una exposicion de 180 minutos a la luz ultravioleta A, produciendo una exposicion media por linfocito de 1-2 J/cm2. El preparado final de capa leucocftica contiene del 20 % al 25 % del componente de PBMC total, y tiene un hematocrito del 2,5 % a 7 %. Tras el penodo de fotoactivacion, se vuelve a infundir el volumen al paciente durante un penodo de 30 a 45 minutos. La solicitud de patente de EE.UU. n.° 09/480.893 describe otro sistema para su uso en la administracion de ECP. Los documentos 5.951.509; 5.985.914; 5.984.887. 4.464.166; 4.428.744; 4.398.906; 4.321.919; WO 97/36634; y WO 97/36581 tambien contienen la descripcion de dispositivos y metodos utiles en este sentido.
Otro sistema que puede ser util en los metodos de la presente invencion se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° 09/556.832. Ese sistema incluye un aparato mediante el que el volumen neto de fluido recogido o retirado de un sujeto puede reducirse durante la ECP. La cantidad eficaz de energfa luminosa que se suministra a una poblacion de celulas se puede determinar usando los metodos y sistemas descritos en el documento 6.219.584.
Hay una variedad de otros metodos de induccion de la apoptosis en una poblacion de celulas que son bien conocidos. Uno de dichos tratamientos comprende someter una poblacion de celulas a radiacion ionizante (rayos gamma, rayos X, etc.) y/o a radiacion electromagnetica no ionizante que incluye luz ultravioleta, calentamiento, enfriamiento, privacion de suero, privacion del factor de crecimiento, acidificacion, dilucion, alcalinizacion, cambio de fuerza ionica, privacion de suero, irradiacion o una combinacion de los mismos. Como alternativa, la apoptosis puede inducirse sometiendo una poblacion de celulas a ultrasonidos.
Otro metodo de induccion de la apoptosis comprende la aplicacion extracorporal de estres oxidativo a una poblacion de celulas. Esto puede conseguirse tratando la poblacion de celulas, en suspension, con agentes oxidantes qmmicos tales como peroxido de hidrogeno, otros peroxidos e hidroperoxidos, ozono, permanganatos, peryodatos y similares. Pueden usarse agentes oxidantes biologicamente aceptables para reducir los posibles problemas asociados con residuos y contaminaciones de la poblacion de celulas inducida por apoptosis asf formada.
Al preparar la poblacion de celulas inducida por apoptosis, se debe tener cuidado de no aplicar niveles excesivos de estres oxidativo, radiacion, tratamiento con farmacos, etc., porque, de lo contrario, podna haber un riesgo significativo de causar necrosis en al menos algunas de las celulas bajo tratamiento. La necrosis provoca la ruptura de la membrana celular y la liberacion de los contenidos celulares, a menudo, con resultados biologicamente daninos, en particular, inflamaciones, de modo que es mejor evitar la presencia de celulas necroticas y sus componentes junto con la poblacion de celulas que comprende las celulas apoptoticas. Los niveles adecuados de tratamiento de la poblacion de celulas para inducir la apoptosis y el tipo de tratamiento seleccionado para inducir la apoptosis son facilmente determinables por los expertos en la materia.
Un proceso implica el cultivo de celulas del sujeto o una estirpe celular compatible de mairftfero. Las celulas cultivadas pueden tratarse entonces extracorporalmente para inducir la apoptosis y crear una poblacion de celulas en las mismas. El tratamiento extracorporal puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpos, agentes quimioterapeuticos, radiacion, ECP, ultrasonidos, protemas y agentes oxidantes. Las celulas, suspendidas en el plasma del sujeto u otro medio de suspension adecuado, tal como solucion salina o un medio de cultivo de celulas de mamfero equilibrado, pueden incubarse despues como se indica a continuacion.
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Los metodos de deteccion y cuantificacion de la apoptosis son utiles para determinar la presencia y el nivel de apoptosis del preparado que se va a incubar con leucocitos o linfocitos T en la presente invencion. Las celulas sometidas a apoptosis pueden identificarse mediante un “escalonamiento" caracteristico del ADN observado en electroforesis en gel de agarosa, como resultado de la escision del ADN en una serie de fragmentos. En otra realizacion, se puede usar la expresion superficial de la fosfatidilserina en celulas para identificar y/o cuantificar una poblacion de celulas inducida por la apoptosis. La medicion de los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial, que refleja los cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial, es otro metodo reconocido de identificacion de una poblacion de celulas. Tambien se ha descrito en la literatura cientifica una serie de otros metodos de identificacion de celulas sometidas a apoptosis y de una poblacion de celulas, muchos de los cuales usan anticuerpos monoclonales contra marcadores espedficos para una poblacion de celulas.
La administracion de T reg encuentra utilidad en el tratamiento de la artritis y otras enfermedades autoinmunes. Tambien son utiles en el tratamiento o la profilaxis de al menos una enfermedad autoinmune en una celula, un tejido, un organo, un animal o un paciente incluyendo, pero sin limitacion, mielitis transversa aguda, alopecia areata, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, espondilitis anquilosante, smdrome antifosfotipido, aterosclerosis, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemotitica autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatia, esprue-dermatitis por enfermedad cetiaca trastornos espinocerebelosos cerebelosos, degeneraciones espinocerebelosas (ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelosas), alcoholismo cronico, hepatitis inducida por el alcohol, hepatitis autoinmune, smdrome de disfuncion inmunologica cronica de fatiga (CFIDS), enfermedad inflamatoria intestinal cronica, polineuropatia desmielinizante inflamatoria cronica, enfermedad de Churg-Hodgkin, penfigoide cicatricial, enfermedad de aglutinina fria, smdrome de CResT, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Crohn, atrofia de Dejerine-Thomas, demencia pugitistica, diabetes mellitus, enfermedad difusa de cuerpos de Lewy, lupus discoide, trastornos de ganglios basales, coagulacion intravascular diseminada, smdrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por farmacos, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de hospedador contra injerto, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, corea de Huntington, corea senil, fibrosis pulmonar idiopatica, purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), nefropatia por IgA, atrofia muscular espinal infantil o juvenil, diabetes dependiente de insulina, artritis juvenil, patologfa de Kawasaki, lesiones del sistema corticoespinal, leucemias, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, liquen plano, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis multiple, degeneraciones de multiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, Machado-Joseph), miastenia gravis, neurogenica muscular, enfermedad de Parkinson, penfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, smdromes poliglandulares, polimialgia reumatica, polimiositis dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, paralisis supranuclear progresiva, soriasis, fenomeno de Raynaud, smdrome de Reiter, fiebre reumatica, artritis reumatica, sarcoidosis, esclerodermia, demencia senil de tipo cuerpos de Lewy, smdrome de Sjogren, smdrome de la persona rigida, panencefalitis esclerosante subaguda, trastornos sistemicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia, trastorno del sistema multiple mitocondrial), lupus eritematoso sistemico (LES), arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de celulas gigantes, tiroidiasis, colitis ulcerosa, uveitis, vasculitis, vitiligo, granulomatosis de Wegener, smdrome de Wernicke-Korsakoff.
La presente invencion tambien es util en el tratamiento del rechazo a injertos o la enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD). El rechazo agudo de trasplante de organos solidos se produce en del 30 % al 60 % de los pacientes tras el trasplante de pulmon y, en menor grado, con el ttigado, el rinon, el corazon, etc. debido al exito de los agentes inmunosupresores. La reaccion inmune mediada por los linfocitos (celulas) contra antigenos de trasplante es el principal mecanismo de rechazo agudo. Un rechazo retardado o cronico provoca la destruccion del injerto en meses o anos despues del trasplante y se caracteriza por la destruccion vascular que conduce a la necrosis del tejido trasplantado. En la actualidad, dicho rechazo no se suprime en gran medida mediante los regfmenes convencionales y, por tanto, la necesidad de una tolerancia inmunologica mas sostenible es una necesidad significativa no satisfecha.
En ocasiones, se produce el deterioro tarotio del injerto, y este tipo cronico de rechazo suele progresar insidiosamente a pesar del aumento de la terapia inmunosupresora. La imagen patologica difiere de la del rechazo agudo. Se ve afectado principalmente el endotelio arterial, con una proliferacion extensa que puede obstruir gradualmente la luz del vaso, produciendo la isquemia y la fibrosis del injerto.
Los inmunosupresores se usan en la actualidad ampliamente para controlar la reaccion de rechazo, y son los principales responsables del exito del trasplante. Sin embargo, estos farmacos suprimen todas las reacciones inmunologicas, por lo que la infeccion generalizada es la principal causa de mortalidad en los receptores de trasplantes.
El tratamiento con inmunosupresores existente puede diferir en el caso de los diferentes tipos de trasplantes. Los aloinjertos de ttigado se rechazan de forma menos agresiva que los aloinjertos de otros organos. Por ejemplo, el rechazo hiperagudo de un trasplante de htigado no se produce invariablemente en pacientes que fueron previamente sensibilizados a antigenos HLA o incompatibilidades de ABO. La terapia inmunosupresora tipica en un adulto implica el uso de ciclosporina, en general, administrada i.v. a 4 a 6 mg/kg/dfa a partir del momento del trasplante y luego a 8 a 14 mg/kg/dfa p.o. cuando se tolera la comida. Las dosis se ajustan a la baja si se produce disfuncion renal, y se
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usan los niveles sangumeos como medidas aproximadas de la dosificacion adecuada.
En el trasplante cardfaco, las pautas inmunosupresoras son similares a las del trasplante renal o hepatico. Sin embargo, en los trasplantes de pulmon y corazon-pulmon, se produce el rechazo agudo en mas del 80 % de los pacientes, pero puede tratarse con exito. Los pacientes son tratados con corticosteroides, administrados rapidamente i.v. a dosis altas, ATG u OKT3. Con frecuencia, tambien se administran ALG o OKT3 profilacticamente durante las dos primeras semanas posteriores al trasplante. El trasplante de pancreas es unico entre los trasplantes de organos vascularizados: en lugar de usarse para salvar una vida, intenta estabilizar o prevenir las devastadoras complicaciones de organos diana de la diabetes de tipo I. Debido a que el receptor intercambia los riesgos de la inyeccion de insulina con los riesgos de la inmunosupresion, el trasplante de pancreas se ha limitado, en general, principalmente a pacientes que ya necesitan recibir farmacos inmunosupresores (es decir, diabeticos con insuficiencia renal que reciben un trasplante de rinon).
Los pacientes con leucemia mieloide o linfoblastica aguda pueden beneficiarse del trasplante de medula osea (BMT). El BMT pediatrico se ha expandido debido a su potencial para curar a ninos con enfermedades geneticas (por ejemplo, talasemia, anemia de celulas falciformes, inmunodeficiencias, errores innatos del metabolismo). Otra opcion para el BMT es el trasplante autologo (extraccion de la propia medula del paciente cuando se ha inducido una remision completa, seguido del tratamiento ablativo del paciente con la esperanza de la destruccion de cualquier tumor residual y el rescate con la propia medula osea del paciente). Dado que se usa un autoinjerto, no es necesaria la inmunosupresion distinta de la quimioterapia de dosis alta a corto plazo usada para la erradicacion de tumores y la ablacion de la medula osea; los problemas posteriores al transplante con la GVHD son mmimos.
La tasa de rechazo es < 5 % en los trasplantes para los pacientes con leucemia de donantes identicos a HLA. Para los pacientes con transfusion multiple con anemia aplasica, la tasa de rechazo tambien se ha reducido significativamente debido al aumento de la inmunosupresion durante la induccion del trasplante. Sin embargo, pueden surgir complicaciones incluyendo el rechazo por el hospedador del injerto de medula osea, la GVHD aguda e infecciones. Las complicaciones posteriores incluyen GVHD cronica, inmunodeficiencia prolongada y recurrencia de la enfermedad.
Se pueden realizar otros numerosos trasplantes mas eficaces con el tratamiento de la presente invencion. Los ejemplos incluyen trasplante de cornea, aloinjertos de piel, aloinjertos de cartflago, injertos oseos y trasplantes de intestino delgado.
Es posible tratar una serie de otros trastornos mas eficazmente usando los metodos de la presente invencion. Por ejemplo, el linfoma cutaneo de linfocitos T es una enfermedad en la que los linfocitos T se vuelven malignos y afectan a la piel. Hay tres tipos de tratamiento de uso comun: la radiacion; la quimioterapia; y la fotoferesis. El tratamiento del linfoma cutaneo de linfocitos T depende de la etapa de la enfermedad, de la edad del paciente y de su estado general de salud. Se puede considerar el tratamiento convencional debido a su eficacia en pacientes en estudios anteriores o se puede considerar la participacion en un ensayo clmico. La mayona de los pacientes con linfoma cutaneo de linfocitos T no se cura con la terapia convencional y algunos tratamientos convencionales pueden tener mas efectos secundarios de los deseados. El tratamiento usando el metodo de la presente invencion tambien se puede usar en el tratamiento de esta enfermedad.
Los metodos de la presente invencion tambien pueden usarse en la cirugfa de implantes, por ejemplo, con la cirugfa de implante realizada comunmente en cirugfa plastica cosmetica o no cosmetica. Dichos implantes pueden incluir injertos dentales, injertos de grasa, por ejemplo, en las mejillas, los labios y los gluteos, implantes faciales, incluyendo los de la nariz, las mejillas, la frente, la barbilla y el craneo, los implantes de las nalgas, los implantes mamarios, etc. Otros implantes incluyen, pero sin limitacion, anillo corneal, cortical, orbital, coclear, musculo (todos los musculos, incluyendo pectorales, gluteos, abdominales, gastrocnemios, soleo, biceps, triceps), implantes aloplasticos de articulaciones y huesos, implantes de reparacion osea (tornillos, varillas, barras, resortes), placas de metal, inyecciones espinales, de cabello vertebral, de botox/colageno/restilano/perlano, implantes de pene, implantes de prostata, implantes mamarios (cosmeticos y reconstructivos), dispositivos intrauterinos, implantes hormonales, implante de celulas fetales o madre, marcapasos, desfibriladores, arterias/venas/valvulas artificiales y organos artificiales.
Las enfermedades autoinmunes tambien pueden tratarse mas eficazmente usando los metodos de la presente invencion. Se trata de enfermedades en las que el sistema inmune produce autoanticuerpos contra un anrtgeno endogeno, con la consecuente lesion de los tejidos. Los individuos pueden ser identificados como aquellos que tienen una enfermedad mediante varios metodos, incluyendo, pero sin limitacion, la tipificacion de enlace HLA, ensayos basados en sangre o en suero, o identificacion de variantes geneticas, por ejemplo, polimorfismos de un solo nucleotido (SNP). Por ejemplo, una vez que se determina que un individuo tiene el enlace HLA DR4 y ha sido diagnosticado de artritis reumatoide, se puede prescribir un tratamiento con T reg. Otros alelos de HLA, tambien conocidos como alelos de MHC, que estan asociados con las enfermedades autoinmunes incluyen B27 (espondilitis anquilosante); DQA1*0501 y DQB1*0201 (enfermedad celfaca); DRB1*03, DRB1*04, DQB1*0201, DQB1*0302 y DMA*0101 (diabetes de tipo I); y Cw6 (soriasis). Estos alelos tambien se pueden usar para determinar si un individuo esta experimentando una enfermedad autoinmune y, por lo tanto, si el tratamiento con T reg puede ser
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Se pueden usar ensayos basados en sangre o en suero para evaluar la predisposicion a una enfermedad. Existe, por ejemplo, un ensayo que detecta la presencia de anticuerpos autonucleares en el suero, que puede conducir al inicio del lupus. Tambien existen ensayos basados en suero para predecir la miocarditis autoinmune. Ademas, se pueden usar ensayos basados en suero para determinar los niveles de insulina (diabetes), o enzimas hepaticas o cardfacas para otras enfermedades. Los niveles T3 pueden ser predictivos de la tiroiditis de Hashimoto. Despues de que se determine que un individuo tiene una enfermedad usando un ensayo basado en sangre o en suero, los metodos de la presente invencion pueden usarse para prevenir o retrasar la aparicion de o reducir los efectos de estas enfermedades. Los individuos pueden ser identificados como predispuestos a la enfermedad a traves de la identificacion de variaciones geneticas, incluyendo, pero sin limitacion, los SNP. Por lo tanto, en un aspecto adicional de la invencion, primero se determina si un paciente tiene un trastorno autoinmune o esta predispuesto al mismo, y se prescribe a ese paciente entonces el tratamiento con T reg.
Los metodos de la presente invencion tambien son aplicables al tratamiento de enfermedades atopicas, que son enfermedades alergicas en las que los individuos son muy sensibles a alergenos extrmsecos. Las enfermedades atopicas incluyen, pero sin limitacion, la dermatitis atopica, asma bronquial extrmseca, urticaria, rinitis alergica, enterogastritis alergica y similares. Se pueden usar ensayos de diagnostico convencionales para determinar si un paciente tiene un trastorno del tipo descrito anteriormente.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invencion reivindicada. Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan en el mismo por referencia.
Ejemplo 1
Induccion apoptotica mediante 8MOP/UVA
Se pasaron leucocitos humanos de donantes normales sobre una placa de Ficoll, y se recogieron las PBMC y se lavaron antes de colocarlas a aproximadamente 107 celulas/ml en un matraz de cultivo de tejidos T-75. A este matraz, se anadieron 200 ng/ml de 8-MOP antes de la irradiacion con UVA (~3 J/cm2). Las celulas se retiraron rapidamente del matraz, con el fin de evitar la adherencia, y se colocaron a la concentracion apropiada para la generacion de T reg.
Generacion de T reg
Se pasaron leucocitos humanos de donantes normales sobre una placa de Ficoll, y se recogieron las PBMC. Se purificaron los linfocitos T de las PBMC usando columnas clasificadoras de celulas activadas magneticamente y coctel de anticuerpos de seleccion negativos en CD4+ (Miltenyi Biotec). Se incubaron los linfocitos T CD4 sin tratamiento previo purificados junto con las PBMC tratadas con ECP en una proporcion 2:1 (CD4:PBMC) con 20 ng/ml de IL-10 durante 8 dfas (Figura 1A). Despues de 8 dfas, se purificaron los linfocitos T CD4+ usando MAC y coctel de anticuerpos de seleccion positivos en CD4 (Miltenyi Biotec). IL-10 no es necesario pero, en algunos casos, induce un fenotipo mas consistente.
Evaluacion de T reg
Se evaluo la actividad supresora de T reg mediante una reaccion secundaria de linfocitos mixtos ("MLR") (Figura 1 B). Se dispusieron linfocitos T CD4+ singenicos en una placa de 96 pocillos a 10.000 celulas/pocillo. Se anadieron celulas dendnticas alogenicas al pocillo a 2.000 celulas por pocillo. Se titularon los T reg en la MLR a partir de una proporcion de 1 linfocito T reg con respecto a 4 linfocitos T respondedores. La proliferacion se midio el dfa 5 mediante la incorporacion de bromodesoxiuridina ("BRDU") usando ELISA de quimioluminiscencia BRDU de proliferacion celular de Roche. La quimioluminiscencia se midio usando TopCount (Perkin Elmer).
Ejemplo 2
Se encuentra actividad de T reg en la generacion de linfocitos T mediante el presente metodo
Se incubaron linfocitos T CD4+ con celulas sangumeas perifericas tratadas con ECP durante 8 dfas en presencia de 20 ng/ml de IL-10. Se purificaron los T reg del cultivo usando MAC y coctel de anticuerpos de seleccion positivos en CD4 (Miltenyi Biotec). Para evaluar su actividad reguladora, a continuacion, se anadieron los T reg a una MLR que consistfa en 10.000 linfocitos T CD4+ singenicos y 2.000 celulas dendnticas alogenicas. Se midio la proliferacion en estos cultivos al dfa 5 mediante la incorporacion de BRDU. Los resultados se muestran en la Figura 2.
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Ejemplo 3
Se encuentra actividad de T reg en la generacion de linfocitos T mediante el presente metodo
Se generaron celulas Tr1 mediante la incubacion de linfocitos T CD4+ en presencia de 20 ng/mg de IL-10. Se generaron T reg mediante la incubacion de linfocitos T CD4+ con celulas sangumeas perifericas tratadas con ECP durante 8 dfas en presencia de 20 ng/ml de IL-10. Se purificaron los T reg del cultivo usando MAC y coctel de anticuerpos de seleccion positivos en CD4 (Miltenyi Biotec). Para evaluar su actividad reguladora, a continuacion, se anadieron los T reg a una MLR que consistfa en 10.000 linfocitos T CD4+ singenicos y 2.000 celulas dendnticas alogenicas. Se midio la proliferacion en estos cultivos al dfa 5 mediante la incorporacion de BRDU. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 4
Se encuentra el fenotipo T reg en la generacion de linfocitos T con el presente metodo
Se incubaron linfocitos T CD4+ con celulas sangumeas perifericas tratadas con ECP durante 8 dfas en presencia de 20 ng/ml de IL-10. Se purificaron los T reg del cultivo usando MAC y coctel de anticuerpos de seleccion positivos en CD4 (Miltenyi Biotec). A continuacion, se anadieron los T reg a una MLR que consistfa en 10.000 linfocitos T CD4+ singenicos y 2.000 celulas dendnticas alogenicas. Se anadio IL-2 a la MLR a 2 ng/ml. Se midio la proliferacion en estos cultivos al dfa 5 mediante la incorporacion de BRDU. Los resultados se muestran en la Figura 4.
Ejemplo 5
Se encuentra el fenotipo T reg en la generacion de linfocitos T con el presente metodo
Se evaluaron T reg generados mediante la incubacion junto con PBMC tratadas con ECP en una MLR usando un sistema de insertos de transpocillos de 24 pocillos (Sistema de insertos Anopore 0,2 pM de cultivo titular Nunc n.° 136935). Se coloco una MLR compuesta de 500.000 linfocitos T CD4+ singenicos y 100.000 celulas dendnticas alogenicas en la parte inferior del transpocillo. Se dispusieron 250.000 T reg bien en el inserto del transpocillo o directamente en el fondo con los linfocitos T respondedores y celulas dendnticas alogenicas. El dfa 5, se retiraron los insertos y se midio la proliferacion el dfa 5 mediante la incorporacion de BRDU. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Ejemplo 6
(Aplicacion in vivo en modelo de raton) (Profetico)
Ratones
Los ratones C3H/HeJ (C3H; H2k), (B6XC3H)F1 (H2bXk), (B6XDBA/2)F1 (H2bXd), C57BL/6 (B6; H2b) y CBA/JCr (CBA; H2k) macho se adquiriran del National Cancer Institute Research and Development Center (Frederick, Md.). Los ratones B10.BR (H2k) se adquiriran de los laboratorios Jackson (Bar Harbour, ME). Los ratones usados para los experimentos tendran entre 6 y 10 semanas de vida, y se alojaran en jaulas microaislantes esteriles dentro de un centro espedfico libre de patogenos, recibiendo comida y agua esterilizadas en autoclave a voluntad.
Medios
Se usara solucion salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con albumina de suero bovino al 0,1 % (BSA, Sigma Chemical Co., St Louis, Mo.) para todas las manipulaciones in vitro de la medula osea y los linfocitos de donantes. Inmediatamente antes de la inyeccion, las celulas se lavaran y se volveran a suspender en PBS solo. Para mantener las estirpes celulares y para ensayos in vitro, se usara medio RPMI 1640 (Mediatech, Herndon, Va), suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, GIBCO, Grand Island, NY), L-glutamina a 2 mmol/l, 50 UI/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina.
Anticuerpos
Fotoferesis experimental
Se recogeran esplenocitos de ratones sanos singenicos de la misma camada y se transformaran en suspension de celulas individuales mediante molienda con el extremo posterior de una jeringa en PBS. Se volveran a suspender estas celulas y las celulas se lavaran dos veces con PBS antes de volver a suspenderlas a 12,5 x 106 celulas/ml de PBS. Tras lavar las celulas, se volveran a suspender en medio enfriado con hielo y se sembraran a aproximadamente 106 celulas/ml en un matraz T75. Se anadira Psoraleno (solucion UVADEX) a una concentracion final de 200 ng/ml, que es una dilucion de 100 veces la solucion madre proporcionada por Therakos. Se dispondra el matraz acostado en la camara de irradiacion UVA y se aplicaran aproximadamente 1,5 J/cm2 de luz correspondiente
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a 1,5 minutos de luz inferior cuando la bandeja esta a 6 cm de la fuente de luz. Se retiraran las celulas rapidamente del matraz para evitar la adherencia y se colocaran a la concentracion apropiada para inyeccion. Si hay adherencia, se raspara o se golpeara el matraz suavemente para eliminar la mayona de las celulas.
Trasplante de medula osea
Se extraera medula osea de la tibia y los femures de los ratones donantes mediante lavado abundante con PBS que contiene BSA al 0,01 % (PBS/BSA). Se extraeran las celulas de medula osea de los linfocitos T usando un anti-Thy 1.2nAb (J1j, Coleccion americana de cultivos tipo, Rockville, Md.) a una dilucion 1:100 y complemento de cobaya (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, Pa.) a una dilucion de 1:6 durante 45 minutos a 37 °C. Se aislaran linfocitos de bazos y ganglios linfaticos de ratones donantes. Se trataran los esplenocitos con una solucion de lisis salina equilibrada de Gey que contenga cloruro de amonio al 0,7 % (NH4Cl) para eliminar los globulos rojos (RBC). Tras el agotamiento de los RBC, se agruparan las celulas del bazo y de los ganglios linfaticos y se agotaran de linfocitos B mediante la filtracion en una placa de Petri de plastico, previamente recubierta con una dilucion de 5 mg/ml de IgG de cabra anti-raton durante 1 hora a 4 °C. Se espera que estos tratamientos den lugar a poblaciones de donantes del aproximadamente 90 % al 95 % de celulas CD3+, cuantificadas mediante citometna de flujo fluorescente. A continuacion, se aislaran subconjuntos de linfocitos T mediante seleccion negativa usando anticuerpos monoclonales anti-CD8 (3,168) o anti-CD4 (RL172) y complemento. Se espera que estos tratamientos reduzcan las poblaciones de subconjuntos de linfocitos T dirigidas hasta los niveles de fondo, segun lo determinado mediante analisis de citometna de flujo. Se expondran los ratones receptores a una irradiacion de 13 Gy del cuerpo entero procedente de una fuente de 137CS a 1,43 Gy/min, administrada a una dosis dividida de 6,5 Gy cada una, con 3 horas de separacion. A continuacion, estos ratones recibiran el transplante de 2 x 106 celulas de medula osea tratadas con anti-Thy1.2 (ATBM, sin linfocitos T) junto con el numero indicado de linfocitos T apropiados (linfocitos T enriquecidos en CD4 o CD8 donantes), por via intravenosa (i.v.) a traves de la vena de la cola. Los ratones se trataran con T reg 1 dfa antes del trasplante y de nuevo en los dfas 0, 4, 8 y 12 (todos a 0,5 mg, i.p.). Para los experimentos de GVL, los ratones receptores B6 seran expuestos a una inyeccion de T reg un dfa antes del trasplante de ATBM y linfocitos T de donantes, con un programa similar de tratamiento con T reg. En los experimentos tanto de GVHD como de GVL, los ratones se verificaran diariamente para determinar la morbilidad y la mortalidad hasta su terminacion. Se agruparan los datos de 2-3 experimentos separados, y se determinaran las medianas de los tiempos de supervivencia (MST) como el punto del 50 % de supervivencia interpolado de una regresion lineal a traves de todos los puntos de datos del dfa de la muerte, incluyendo el cero. Las comparaciones estadfsticas para la supervivencia entre los grupos experimentales se realizaran mediante la prueba no parametrica de Wilcoxon. La significacion para las comparaciones de peso se determinara mediante la prueba T en puntos de tiempo individuales.
Citometna de flujo
Se incubaran anticuerpos monoclonales apropiados en volumenes de 25 pl con 2-5 x 105 celulas en los pocillos de una microplaca de 96 pocillos de fondo en U a 4 °C durante 30 minutos, se centrifugaran a 1.500 rpm durante 3 minutos y se lavaran con PBS que contendra BSA al 0,1% y azida de sodio al 0,01 % (tampon de lavado). Se calcularan el porcentaje de celulas positivas y la intensidad de fluorescencia media aritmetica para cada muestra.
Analisis patologico
Se tomaran muestras de biopsias de ofdo de espesor completo (3 x 2 mm) de cada raton de los diversos grupos de tratamiento y se fijaran inmediatamente en glutaraldehfdo al 4 % durante una noche, y luego se aclararan con tampon de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4). Los tejidos se fijaran despues con tetroxido de osmio al 2 % durante 2 h, se deshidrataran en etanol graduado y se introduciran en Epon 812. Se cortaran secciones de un micrometro de espesor con un ultramicrotomo Porter-Blum MT2B, se teniran con azul de toluidina y, finalmente, se sumergiran en etanol al 95 % para un analisis al microscopio optico. Se hara el recuento del numero de celulas epidermicas disqueratosicas/mm lineal, segun se ha determinado previamente, bajo un objetivo de 100 aumentos y una pieza ocular de 10 aumentos de un microscopio optico. Se evaluaran mas de diez mm lineales de la epidermis de cada animal y cada punto de tiempo. El analisis se realizara en condiciones de ocultacion en cuanto a los grupos de tratamiento.
El documento 20030157073; Kohm, A. et al. (2002); Tang, Q. et al. (2004); y Schwarz, A et al. (2004) proporciona modelos de animales adicionales para T reg.
A continuacion, se proporcionan ejemplos comparativos adicionales utiles para comprender la invencion:
1. Un metodo de generacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) que comprende la incubacion de
leucocitos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
2. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 1, donde la incubacion es durante un tiempo y en condiciones
suficientes para generar T reg.
3. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 1, que comprende ademas la etapa de seleccion de leucocitos que
expresan CD4 para obtener celulas CD4+.
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4. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 3, donde la incubacion es a una proporcion de CD4+:AC de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1.
5. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 4, donde la incubacion es a una proporcion de CD4+:AC de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2.
6. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 1, donde las AC se obtienen mediante un tratamiento de induccion de la apoptosis.
7. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 6, donde el tratamiento inductor de la apoptosis es un procedimiento de ECP que emplea un compuesto fotoactivable junto con luz de una longitud de onda que activa el compuesto fotoactivable.
8. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 7, donde el compuesto fotoactivable es un psoraleno y la luz es UVA.
9. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 8, donde el psoraleno es 8-MOP.
10. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 1, donde la incubacion comprende ademas la adicion de factores que potencian adicionalmente la generacion o funcion de los T reg.
11. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 10, donde los factores son hormonas, protemas, farmacos o anticuerpos.
12. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 11, donde los factores se seleccionan de al menos uno de TGFp, aMSH, anti-CD46, IL-10, vitamina D3, dexametasona, rapamicina e IL-2.
13. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 12, donde el factor es IL-10.
14. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 13, donde la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
15. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 14, donde la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 20 ng/ml.
16. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 1, donde la incubacion es durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dfas.
17. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 16, donde la incubacion es durante de aproximadamente 8 dfas.
18. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 1 que comprende ademas la adicion de un antigeno a la incubacion para generar T reg que regulen la respuesta inmune hacia el antigeno.
19. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 18, donde el antfgeno es un aloantfgeno.
20. Una composicion que comprende una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida mediante la incubacion de los leucocitos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
21. La composicion acuerdo con el Ejemplo 20, donde la incubacion es durante un tiempo y en condiciones suficientes para generar T reg.
22. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 20, que comprende ademas la etapa de seleccion de leucocitos que expresan CD4 para obtener celulas CD4+.
23. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 22, donde la incubacion es a una proporcion de CD4+:AC de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1.
24. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 23, donde la incubacion es a una proporcion de CD4+:AC de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2.
25. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 20, donde las AC se obtienen mediante un tratamiento de induccion de la apoptosis.
26. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 25, donde el tratamiento inductor de la apoptosis es un procedimiento de ECP que emplea un compuesto fotoactivable junto con luz de una longitud de onda que activa el compuesto fotoactivable.
27. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 26, donde el compuesto fotoactivable es un psoraleno y la luz es UVA.
28. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 27, donde el psoraleno es 8-MOP.
29. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 20, donde la incubacion comprende ademas la adicion de factores que potencian adicionalmente la generacion o funcion de los T reg.
30. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 29, donde los factores son hormonas, protemas, farmacos o anticuerpos.
31. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 30, donde la incubacion comprende ademas la adicion de los factores seleccionados de al menos uno de TGFp, aMSH, anti-CD46, IL-10, vitamina D3, dexametasona, rapamicina e IL-2.
32. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 31, donde el factor es IL-10.
33. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 32, donde la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
34. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 33, donde la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 20 ng/ml.
35. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 20, donde la incubacion es durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dfas.
36. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 35, donde la incubacion es durante aproximadamente 8 dfas.
37. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 20 que comprende ademas la adicion de un antfgeno a la incubacion para generar T reg que regulen la respuesta inmune hacia el antfgeno.
38. La composicion de acuerdo con el Ejemplo 37, donde el antfgeno es un aloantfgeno.
39. Un metodo de tratamiento de un trastorno autoinmune o de mejora de uno o mas de sus smtomas, que
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comprende la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion que comprende una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
40. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 39, donde el tratamiento inductor de la apoptosis es un procedimiento de ECP que emplea un compuesto fotoactivable junto con luz de una longitud de onda que activa el compuesto fotoactivable.
41. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 40, donde el compuesto fotoactivable es un psoraleno y la luz es UVA.
42. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 41, donde el psoraleno es 8-MOP.
43. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 40, donde la incubacion comprende ademas la adicion de factores que
potencian adicionalmente la generacion o funcion de los T reg.
44. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 43, donde los factores son hormonas, protemas, farmacos o anticuerpos.
45. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 44, donde los factores se seleccionan de al menos uno de TGFp, aMSH, anti-CD46, IL-10, vitamina D3, dexametasona, rapamicina e IL-2.
46. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 45, donde el factor es IL-10.
47. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 46, donde la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml.
48. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 47, donde la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 20 ng/ml.
49. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 40, donde la incubacion es durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dfas.
50. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 49, donde la incubacion es durante de aproximadamente 8 dfas.
51. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 40 que comprende ademas la adicion de un antigeno a la incubacion para generar T reg que regulen la respuesta inmune hacia el antigeno.
52. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 51, donde el antigeno es un aloantigeno.
53. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 40, donde el trastorno autoinmune es al menos uno de mielitis transversa aguda, alopecia areata, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, espondilitis anquilosante, smdrome antifosfolfpido, aterosclerosis, enfermedad de Addison autoinmune, anemia hemolftica autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatia, esprue-dermatitis por enfermedad celfaca trastornos espinocerebelosos cerebelosos, degeneraciones espinocerebelosas (ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelosas), alcoholismo cronico, hepatitis inducida por el alcohol, hepatitis autoinmune, smdrome de disfuncion inmunologica cronica de fatiga (CFIDS), enfermedad inflamatoria intestinal cronica, polineuropatia desmielinizante inflamatoria cronica, enfermedad de Churg-Hodgkin, penfigoide cicatricial, enfermedad de aglutinina fria, smdrome de CResT, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Crohn, atrofia de Dejerine-Thomas, demencia pugilfstica, diabetes mellitus, enfermedad difusa de cuerpos de Lewy, lupus discoide, trastornos de ganglios basales, coagulacion intravascular diseminada, smdrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por farmacos, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, enfermedad de hospedador contra injerto, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, corea de Huntington, corea senil, fibrosis pulmonar idiopatica, purpura trombocitopenica idiopatica (ITP), nefropatia por IgA, atrofia muscular espinal infantil o juvenil, diabetes dependiente de insulina, artritis juvenil, patologfa de Kawasaki, lesiones del sistema corticoespinal, leucemias, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, liquen plano, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, esclerosis multiple, degeneraciones de multiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, Machado-Joseph), miastenia gravis, neurogenica muscular, enfermedad de Parkinson, penfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, smdromes poliglandulares, polimialgia reumatica, polimiositis dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, paralisis supranuclear progresiva, soriasis, fenomeno de Raynaud, smdrome de Reiter, fiebre reumatica, artritis reumatica, sarcoidosis, esclerodermia, demencia senil de tipo cuerpos de Lewy, smdrome de Sjogren, smdrome de la persona ngida, panencefalitis esclerosante subaguda, trastornos sistemicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia, trastorno del sistema multiple mitocondrial), lupus eritematoso sistemico (LES), arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de celulas gigantes, tiroidiasis, colitis ulcerosa, uveftis, vasculitis, vitiligo, granulomatosis de Wegener, smdrome de Wernicke-Korsakoff.
54. Un metodo de tratamiento de un trastorno atopico o de mejora de uno o mas de sus smtomas, que comprende la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion que comprende una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
55. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 54, donde el trastorno atopico es al menos uno de patologfas inflamatorias cronicas y patologfas inflamatorias vasculares, incluyendo patologfas inflamatorias cronicas tales como sarcoidosis, enfermedad inflamatoria intestinal cronica, colitis ulcerosa y patologfa de Crohn y patologfas inflamatorias vasculares, tales como, pero sin limitacion, coagulacion intravascular diseminada, aterosclerosis y patologfa de Kawasaki.
56. Un metodo que comprende la administracion a un receptor de un transplante de una cantidad eficaz de una composicion que comprende una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
57. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 56, donde los T reg se administran al receptor del transplante de acuerdo con un programa seleccionado del grupo que consiste en dos dfas, una semana antes del trasplante;
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tres d^as, una semana antes de la extraccion de dicho trasplante; dos d^as a la semana durante dos semanas antes del trasplante; y tres dfas a la semana durante tres semanas antes del trasplante.
58. Un metodo que comprende la administracion a un paciente de GVHD de una cantidad eficaz de una composicion que comprende una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
59. El metodo de acuerdo con el Ejemplo 58, donde los T reg se administran al receptor del transplante de acuerdo con un programa seleccionado del grupo que consiste en dos dfas, una semana antes del trasplante; tres dfas, una semana antes de la extraccion de dicho trasplante; dos dfas a la semana durante dos semanas antes del trasplante; y tres dfas a la semana durante tres semanas antes del trasplante.
60. Un metodo de tratamiento de un paciente con un trastorno o una predisposicion a padecer un trastorno que comprende el analisis del paciente para determinar si tiene un trastorno y la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de una composicion que comprende una poblacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) obtenida incubando leucocitos autologos con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC).
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Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo ex vivo de generacion de linfocitos T con actividad reguladora (T reg) que comprende:
    a. seleccionar leucocitos que expresan CD4 para obtener celulas CD4+;
    b. incubar leucocitos autologos CD4+ con celulas mononucleares de sangre periferica apoptoticas autologas (AC), donde las AC se obtienen mediante un tratamiento inductor de la apoptosis que es un procedimiento de ECP que emplea un compuesto fotoactivable junto con luz de una longitud de onda que activa el compuesto fotoactivable.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la incubacion es durante un tiempo y en condiciones suficientes para generar T reg.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la incubacion es a una proporcion de CD4+:AC de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, preferentemente a una proporcion de CD4+:AC de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2.
  4. 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el compuesto fotoactivable es un psoraleno y la luz es UVA.
  5. 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, donde el psoraleno es 8-MOP.
  6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la incubacion comprende ademas la adicion de factores que potencian adicionalmente la generacion o funcion de los T reg, opcionalmente, donde los factores son hormonas, protemas, farmacos o anticuerpos.
  7. 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, donde los factores se seleccionan de al menos uno de TGFp, aMSH, anti-CD46, IL-10, vitamina D3, dexametasona, rapamicina e IL-2.
  8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el factor es IL-10.
  9. 9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, donde la IL-10 esta presente a una concentracion de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, preferentemente, a una concentracion de aproximadamente 20 ng/ml.
  10. 10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la incubacion es durante de aproximadamente 1 a aproximadamente 14 dfas, preferentemente, durante aproximadamente 8 dfas.
  11. 11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende ademas la adicion de un antfgeno a la incubacion para generar T reg que regulen la respuesta inmune hacia el antfgeno, opcionalmente, donde el antfgeno es un aloantfgeno.
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