DE69734450T2

DE69734450T2 - Photopherese-behandlung von hcv-infektionen

Info

Publication number: DE69734450T2
Application number: DE69734450T
Authority: DE
Inventors: N. Susan McLAUGHLIN; C. Bruce STOUCH; B. Christopher O'BRIEN
Original assignee: Therakos Inc
Current assignee: Therakos Inc
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2017-03-27
Also published as: DE69734450D1; AU717624B2; WO1997036634A1; ES2251020T3; EP0910428A4; EP0910428B1; BR9708406A; IL126365A0; JP2000510003A; DK0910428T3; CN1214636A; AU2544197A; ATE307634T1; CA2250920A1; US20040062754A1; EP0910428A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die extrakorporale Photopherese ist ein Verfahren, bei dem 8-Methoxypsoralen (8-MOP), eine natürlich vorkommende lichtempfindliche Verbindung, zwei Stunden vor der Behandlung oral verabreicht wird. Dann wird dem Patienten Blut entnommen, dieses mit Gerinnungshemmern behandelt, und die weißen Blutzellen werden durch Zentrifugation getrennt und als eine mit Leukozyten angereicherte Fraktion gewonnen. Diese 8-MOP enthaltenden Leukozyten werden mit Ultraviolett A-Licht (UVA) bestrahlt, wodurch das 8-MOP an Pyrimidinbasen in der DNA und an intra- und extrazelluläre Proteine gebunden wird. Diese behandelten Leukozyten werden dem Patient zurückgegeben, und das Ergebnis ist eine Immunmodulation, für die festgestellt worden ist, dass sie bei einer Reihe von Krankheitszuständen klinisch vorteilhaft ist¹.
Es gibt eine Reihe von Erkrankungen, von denen angenommen wird, dass hauptsächlich T-Zellen daran beteiligt sind oder dass sie durch T-Zellen vermittelt werden. Von Erkrankungen, wie etwa dem kutanen T-Zell-Lymphom, von einer Abstoßung eines allogenen Organs nach Transplantation und von Erkrankungen, wie etwa der progredienten systemischen Sklerose (PSS), der rheumatoiden Arthritis und einem Diabetes mellitus mit Beginn im Jugendalter (juvenile onset diabetes mellitus, JODM) wird angenommen, dass diese T-Zell-vermittelt sind.
Das kutane T-Zell-Lymphom (cutaneous T-cell lymphoma, CTCL) ist eine maligne Erkrankung, die progredient ist. Die therapeutischen Möglichkeiten sind begrenzt. Edelson et al. führten eine multizentrische Studie² durch, die zeigte, dass 24 von 29 (83%) von erythrodermen Patienten eine wesentliche Verbesserung ihrer Erkrankung erfuhren. Diese positiven Antworten wurden zu einer Zeit von im Mittel 22,4 Wochen nach Therapiebeginn beobachtet. Von klinischer Bedeutung ist, dass diese Patienten solche waren, deren Erkrankung sich bei einer früheren Therapie resistent zeigte und von denen angenommen wurde, dass sie zu einer Gruppe mit einer schlechten Prognose gehörten. Weiterhin wurde eine Abnahme des Ausmaßes der Beteiligung von peripherem Blut (Sézary-Zellen) beobachtet. Versicherungsmathematische Daten haben gezeigt, dass die mittlere Überlebensrate auf mehr als 60 Monate von Beginn der Behandlung im Vergleich zu einer historischen mittleren Überlebensrate von weniger als 30 Monaten zunahm. In dieser ursprünglichen Gruppe von Patienten blieben bei acht der Individuen, die unter Leukämie litten, Remissionen bestehen. Nachteilige Reaktionen, die mit der Photopherese zusammenhingen, waren selten.
Autoimmunerkrankungen sind durch eine Fehlregulation des Immunsystems charakterisiert, die durch eine bestimmte zellulär oder humoral vermittelte Zerstörung bestimmter Organe oder Gewebe im Patienten charakterisiert ist. Beispiele für solche Erkrankungen sind die rheumatoide Arthritis und die progrediente systemische Sklerose.
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine entzündliche Erkrankung, die schließlich zu einer Zerstörung von Gelenken führt und eine generalisierte Erkrankung darstellt, an der viele Organsysteme beteiligt sind. Zur Behandlung von RA sind viele Wirkstoffe in Benutzung, allerdings werden gut tolerierte Wirkstoffe mit einem Potential zum Modifizieren der Erkrankung benötigt insofern, als die Erkrankung eine lebenslange ist. Insbesondere wird ein Verlust der Wirksamkeit und ein Fortschreiten der Erkrankung bei einer großen Anzahl von Patienten nach Beginn einer Therapie der zweiten Linie gegen RA beobachtet. Viele der Wirkstoffe der zweiten Linie wirken immunsuppressiv und sind selbst die Ursache für erhebliche Nebenwirkungen, wie etwa eine Infektion. Der Bedarf an der Entwicklung einer spezifischeren, nicht toxischen immunmodulatorischen Therapie³ ist groß.
Die progrediente systemische Sklerose (PSS) ist eine Erkrankung des Bindegewebes, die durch entzündliche und fibrotische Änderungen in der Haut und den Viszera charakterisiert ist. Eine Behandlung ist schwierig gewesen. Entzündungshemmende Arzneimittel und Kortikosteroide sind in den frühen Phasen der Erkrankung hilfreich, scheinen jedoch das Fortschreiten der Erkrankung nicht zu beeinflussen. Studien mit D-Penicillamin, Methotrexat, Cyclosporin, Kalziumkanal-Blockern und Prostaglandinen werden derzeit durchgeführt, jedoch scheinen diese Wirkstoffe das Fortschreiten der Erkrankung insgesamt nicht zu beeinflussen. Da von dieser Erkrankung angenommen wurde, dass sie T-Zell-vermittelt ist, haben Rock und Kollegen Patienten mit PSS mit der Photopherese behandelt⁴. Bei dieser Studie waren 56 Patienten an einer zufallsverteilten klinischen Nichtblindstudie beteiligt. Eine we sentlich höhere Antwortrate wurde bei der mit Photopherese behandelten Gruppe (68% Antwortrate) im Vergleich zu der D-Penicillamin-Gruppe (Kontrolle, 32% Antwortrate) beobachtet.
Vom Jugend-Diabetes (JODM) wird angenommen, dass diese Form des Diabetes durch das Immunsystem vermittelt wird, was zu einer Zerstörung der Zellen im Pankreas führt, die für die Produktion von Insulin verantwortlich sind. Patienten mit dieser Störung weisen nicht nur eine Fehlregulation ihrer Blutzuckerspiegel auf, sondern die Erkrankung ist charakterisiert durch eine Vasculopathie, die zu einem spezifischen Organschaden führt, der zu einer erheblichen Morbidität und Mortalität führt.
Andere T-Zell-vermittelte Phänomene schließen eine Abstoßung von Geweben ein, die für den Wirt fremd sind. Im Fall der Abstoßung eines transplantierten allogenen Organs ist es wünschenswert, diese Abstoßung im Hinblick auf das transplantierte Organ zu verhüten, ansonsten allerdings die Kompetenz des Immunsystems zu erhalten, um es dem Körper zu ermöglichen, eine Infektion zu bekämpfen und um ihm andere normale Körperabwehrreaktionen zu ermöglichen. Die Standardbehandlungen nach Transplantation sind begrenzt auf die immunsuppressiven Behandlungen, die verwendet werden, um einen Zustand allgemeiner Immunsuppression bewirken, was zu der häufigsten nachteiligen Reaktion auf diese Behandlung führt, nämlich, wie schon erwähnt, einer Infektion, die eine bakterielle oder opportunistische Infektion sein kann. Eine Immunmodulation, die keine immunsupprimierenden Eigenschaften aufweist, dies wäre wünschenswerter. Es ist gezeigt worden, dass die Photopherese wirksam ist. Forscher an der Loyola Universität waren in der Lage, mit einer Photopherese 13 von 14 Fällen einer cardialen Abstoßungsreaktion, die gegenüber immunsupprimierenden Standardwirkstoffen refraktär war, erfolgreich zu behandeln. Bei einer Abwandlung dieser Situation ist die Photopherese erfolgreich verwendet worden (Rosetti et al.⁵ und andere), um einen Patienten mit einer chronischen Abstoßungsreaktion des Wirts gegen ein Transplantat erfolgreich zu behandeln. Diese Störung ist charakterisiert durch einen introgen induzierten immuninkompetenten Wirt, wobei immunkompetente Zellen (Knochenmark- oder periphere Stammzellen) in solchen Situationen als eine Behandlung verschiedener maligner Erkrankungen und Leukämie in einen Patienten infundiert werden. Hier greifen die transplantierten immunkompetenten Zellen den Patienten (den „Wirt") an. Auch hier ist das Ziel wieder, die immunkompetenten Zellen zu modulieren, ohne eine weitere Immunsuppression und die damit verbundenen Nebenwirkungen auszulösen.
Eine Photopherese umfasst die extrakorporale Exposition von peripheren Blutleukozyten gegenüber 8-Methoxypsoralen (8-MOP), das durch Ultraviolett A-Licht aktiviert wurde, gefolgt durch die Rückinfusion der behandelten weißen Blutzellen.
Die 8-Methoxypsoralen-Moleküle im Blut dringen in die Nuclei der weißen Blutzellen ein und interkalieren in die doppelsträngige DNA-Helix. In einem extrakorporalen Kreislauf wird langwelliges ultraviolettes Licht auf die mit Leukozyten angereicherte Blutfraktion innerhalb des UVAR-Photopheresesystems gerichtet. Das photoaktivierte Heilmittel, das auf die UVA-Energie antwortet, verknüpft sich mit der Thymidinbase in der DNA-Helix. Dies führt zu einer Quervernetzung von Thymidinbasen, wodurch das Entwinden der DNA während der Transkription verhindert wird. Das Plasma und die veränderten Leukozyten werden dann in den Patienten rückinfundiert. Die Rückinfusion der durch Photopherese beschädigten Leukozyten führt zu einem verzögerten Immunangriff gegen diese beschädigten Leukozyten ebenso wie gegen ansonsten unmodifizierte weiße Blutzellen (white blood cells, WBCs), welche die gleichen Zelloberflächenantigene zeigen.
UVAR-Sys
Die Behandlung besteht aus drei Phasen, einschließlich 1) dem Sammeln einer Buffy Coat-Fraktion (angereichert mit Leukozyten), 2) der Bestrahlung der gesammelten Buffy Coat-Fraktion und 3) der Rückinfusion der behandelten weißen Blutzellen. Die Phase des Sammelns umfasst sechs Zyklen aus Blutentnahme-, Zentrifugations- und Rückinfusionsschritten. Während jedes Zyklus wird das Vollblut zentrifugiert und in einer pediatrischen Phereseschale getrennt. Aus diesem Trennschritt werden in jedem Sammelzyklus Plasma (das Volumen wird in jedem Zyklus durch den Bediener des UVAR-Instruments bestimmt) und 40 ml Buffy Coat aufbewahrt. Die roten Zellen und alles weitere Plasma werden dem Patienten rückinfundiert, bevor der nächste Sammelzyklus gestartet wird. Schließlich werden insgesamt 240 ml Buffy Coat und 300 ml Plasma getrennt und zur UVA-Bestrahlung aufbewahrt.
Die Bestrahlung des mit Leukozyten angereicherten Bluts innerhalb des Bestrahlungskreislaufs beginnt während des Sammelns von Buffy Coat im ersten Sammelzyklus. Das gesammelte Plasma und der Buffy Coat werden mit 200 ml heparinisierter normaler Kochsalzlösung und 200 mg UVADEX (wasserlösliches 8-Methoxypsoralen) gemischt. Diese Mischung fließt in einer 1,4 mm dicken Schicht durch die PHOTOCEPTOR-Photoaktivierungs-kammer, die zwischen zwei Reihen von UVA-Lampen der PHOTOSETTE eingefügt ist. Die PHOTOSETTE-UVA-Lampen bestrahlen beide Seiten dieser UVA-transparenten PHOTOCEPTOR-Kammer, was eine 180-minütige Exposition gegenüber Ultraviolett A-Licht erlaubt, was eine mittlere Exposition pro Lymphozyt von 1–2 J/cm² verursacht. Die Endpräparation von Buffy Coat enthält schätzungsweise 20% bis 25% des Gesamtbestandteils an peripheren mononukleären Blutzellen und weist einen Hämatocrit von 2,5% bis 7% auf. Nach der Photoaktivierungsphase wird das Volumen dem Patienten über eine Zeitdauer von 30 bis 45 Minuten rückinfundiert.
Systeme, welche diese Techniken einsetzen, sind bekannt, wobei eine extrakorporale Behandlung des Bluts eines Patienten unternommen wird. In dem US-Patent Nr. 4,573,960 (Goss) beispielsweise wird einem Patienten ein Heilmittel verabreicht, das eine Photoaktivierung erfordert, und dem Patienten wird dann Blut entnommen und das Blut wird in seine Bestandteile getrennt. Die unbehandelten Bestandeile (rote Blutzellen, etwas Plasma etc.) werden dem Patienten zurückgegeben. Der Patient wird dann von dem Behandlungsgerät abgeklemmt und die getrennten Bestandteile, z. B. weiße Blutzellen, werden ultraviolettem Licht ausgesetzt. Nach der Photoaktivierung werden die behandelten Zellen dem Patienten zurückgegeben.
In den US-Patenten Nr. 4,321,919, 4,398,906 und 4,464,166, erteilt an Edelson, sind die Verfahren bei Erkrankungen, bei denen eine pathologische Zunahme an Lymphozyten auftritt, wie etwa dem kutanen T-Zell-Lymphom, diskutiert worden. Bei diesen Verfahren wird Blut des Patienten in Gegenwart einer Chemikalie oder eines Antikörpers mit ultraviolettem Licht bestrahlt. Ultraviolettes Licht bewirkt eine Bindung zwischen den Lymphozyten und der Chemikalie oder dem Antikörper, wodurch die metabolischen Prozesse der Lymphozyten gehemmt werden.
Eine Vielzahl menschlicher Viren ist in der Lage, mononukleäre Zellen zu infizieren und sich darin zu replizieren, oder es können infektiöse Viruspartikel in den mononukleären Zellen vorhanden bleiben. Die mononukleären Zellen können entweder als eine Quelle für die virale Replikation dienen und das Virus verbreiten oder als ein Reservoir an infektiösen Viruspartikeln dienen, die für das Immunsystem schwer zu entfernen sind. Scheitert ein Entfernen dieser Quellen von infektiösem Virus, kann dies zu der Etablierung eines chronischen Zustands führen. Viren, die mononukleäre Zellen infizieren, sich darin replizieren oder darin verbleiben können, schließen folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein: Arthropode-borne-Viren (Ar boviren), Enteroviren, Paramyxoviren (RSV), Herpesviren, Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV), Hepatitis B-Virus (HBV), Hepatitis C-Virus (HCV), Hepatitis D-Virus (HDV), Hepatitis G-Virus (HGV) und HIV.
Eine Vielfalt von menschlichen nicht-viralen pathogenen Agenzien ist in der Lage, mononukleäre Zellen zu infizieren und sich darin zu replizieren, oder die infektiösen nicht-viralen pathogenen Agenzien können in den mononukleären Zellen vorhanden bleiben. Die mononukleären Zellen können entweder als eine Quelle für die Replikation dienen und die nicht-viralen pathogenen Agenzien verbreiten oder als ein Reservoir an infektiösen nicht-viralen pathogenen Agenzien dienen, die für das Immunsystem schwer zu entfernen sind. Scheitert ein Entfernen dieser Quellen von infektiösen nicht-viralen pathogenen Agenzien, kann dies zur Etablierung eines chronischen Zustands führen. Nicht-virale pathogenen Agenzien, die mononukleäre Zellen infizieren, sich darin replizieren oder darin verbleiben können, schließen folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein: Bakterien, wie etwa Arthropode-borne-Bakterien, Mycoplasma-Arten und Arten von Mycobakterien und Parasiten, wie etwas Plasmodium-Arten und andere Arthropode-borne-Parasiten.
Die extrakorporale Photopherese ist erfolgreich angewendet worden, um eine HIV-Infektion zu behandeln (US-Patent Nr. 4,960,408), und es ist gezeigt worden, dass Psoralen-Verbindungen zusammen mit langwelligem ultravioletten Licht bestimmte Viren in vitro inaktivieren, wie etwa das HIV (Quinnan, G. V. et al., 1986, Transfusion, 26, S. 481; Bisaccia, A. et al., 1990, Ann. Intern. Med., 113, S. 270; Bisaccia, A. et al., 1991, Am. NY Acad. Sci., 636, S. 321) und das Influenzavirus und das Herpes-simplex-Virus (Redfield, D. C. et al., 1981; Infect. and Immun., 32, S. 1216). Bisaccia von der Columbia University hat ECP in einer Pilotstudie als Therapie für Patienten mit dem AIDS-related-complex untersucht. Das Grundprinzip war, dass eine Kombination von Psoralen mit UVA-Aktivierung das HIV-Virus in vitro schädigen könnte und dass eine Rückinfusion des beschädigten Virus eine Immunantwort auslösen könnte. Die Autoren stellten fest, dass die ECP bei drei Patienten eine Zunahme der HIV-Antikörperproduktion, eine Zunahme der CD8(+)-Lymphozyten, eine Abnahme des p24-Antigentiters und der Fähigkeit, das HIV-Virus zu kultivieren, verursacht. Elf der 20 Patienten wiesen eine Verbesserung der Reaktivitäten ihrer Haut-Testantigene auf.
Zusätzlich wurde von einer verringerten Inzidenz für Infektionsepisoden bei Patienten berichtet, die eine Photopherese-Behandlung zur Immunsuppression nach Transplantationsoperation erhielten (Meiser, B. M. et al., 1994, Transplantation, 57, S. 563). Allerdings korrelierten die bei Patienten mit einer Transplantationsoperation beobachteten Ergebnisse nicht mit der Photopherese-Behandlung, da Infektionsepisoden im Allgemeinen bei einschließlich solchen Patienten verzeichnet wurden, die eine Vielfalt von Behandlungen erhielten, um eine Abstoßung des transplantierten Organs zu vermeiden.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Behandeln chronischer HCV-Infektionen unter Verwendung der extrakorporalen Photopherese. Insbesondere werden Patienten mit chronischen HCV-Infektionen durch ein Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt, und die Menge oder das Vorhandensein von genetischem HCV-Material wird bei den auf diese Weise behandelten Patienten verringert oder dieses wird nicht nachweisbar. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die Behandlung von Blut eines Patienten mit einer photoaktivierbaren oder photoempfindlichen Verbindung, die in der Lage ist, an Nukleinsäuren in infizierten kernhaltigen Zellen nach Aktivierung der Verbindung durch ultraviolettes Licht zu binden. Die photoaktivierbare oder photoempfindlichen Verbindung kann dem Blut des Patienten in vitro oder in vivo durch herkömmliche Verabreichungstechniken verabreicht werden.
Ein Teil des Bluts des Patienten wird dann extrakorporal unter Verwendung der Photopherese behandelt, wobei die Behandlung ein Exponieren des Bluts gegenüber ultraviolettem Licht, vorzugsweise langwelligem ultraviolettem Licht im Wellenlängenbereich von 320 bis 400 nm, allgemein als UVA-Licht bezeichnet, umfasst. Das behandelte Blut oder eine Fraktion davon wird dem Patienten nach der extrakorporalen Photopherese zurückgegeben, um eine immunologische Antwort des Immunsystems des Patienten auf die Population infizierter Zellen und/oder gegen das HCV zu stimulieren, um das Fortschreiten der viralen Infektion zu hemmen. Das virale genetische Material wird durch diese Behandlung auch beschädigt, was den Virus unfähig macht, sich zu replizieren, wodurch die Verbreitung des Virus unterbrochen wird und die infektiösen viralen Partikel, die in den Zellen verbleiben, neutralisiert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1, Tafel A, Tafel B und Tafel C zeigen die Ergebnisse der Patienten der Behandlungsgruppen 1, 2 bzw. 3.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von Photopherese gerichtet, um HCV zu inaktivieren und/oder Blutzellen, die mit HCV infiziert worden sind, abzutöten. Während nicht beabsichtigt ist, den Umfang der vorliegenden Erfindung durch irgendeine spezifische Theorie zu einem Vorgang zu beschränken, wird angenommen, dass HCV-Infektionen, die nicht durch die normale immunologische Antwort eines Patienten gesteuert werden, durch Beschädigen von infizierten kernhaltigen Blutzellen (wie etwa mononukleären Zellen) unter Verwendung einer Photopherese-Behandlung gemäß der Erfindung behandelt werden können. Die behandelten Zellen, ebenso wie das abgetötete und/oder abgeschwächte Virus, Peptide, native Untereinheiten des Virus selbst (die nach Aufbrechen der Zellen und/oder Abwerfen in das Blut freigesetzt werden) und/oder pathogene nicht-infektiöse Viren werden dann verwendet, um eine Immunantwort zu erzeugen.
HCV ist entweder in der Lage, mononukleäre Zellen zu infizieren und sich darin zu replizieren, oder es können infektiöse Viruspartikel innerhalb der mononukleären Zellen vorhanden bleiben. Die mononukleären Zellen können entweder als eine Quelle für die virale Replikation dienen und das Virus verteilen, oder sie können als ein Reservoir an infektiösen Viruspartikeln dienen, die für das Immunsystem schwer zu entfernen sind. Scheitert das Entfernen dieser Quellen an infektiösem Virus, kann dies zur Etablierung eines chronischen Zustands führen.
Gemäß der beanspruchten Verfahren wird eine photoaktivierbare oder photoempfindliche Verbindung zunächst an das Blut eines Patienten verabreicht, der mit HCV chronisch infiziert ist. Die photoaktivierbare oder photoempfindliche Verbindung kann in vivo verabreicht werden (z. B. oral oder intravenös), oder sie kann in vitro an einen Teil des Bluts des Patienten, das dem Patienten unter Einsatz von herkömmlichen Techniken zur Blutentnahme entnommen worden ist, verabreicht werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sollte die photoaktivierbare oder photoempfindliche Verbindung in der Lage sein, Nukleinsäuren nach ihrer Aktivierung durch Exposition gegenüber elektromagnetischer Strahlung mit einem vorgeschriebenen Spektrum, z. B. ultraviolettem Licht, zu binden.
Als nächstes wird der Teil des Patientenbluts, dem die photoaktive Verbindung verabreicht worden ist, behandelt, indem der Teil des Bluts einer Photopherese unter Verwendung von ultraviolettem Licht unterzogen wird. Der Photopherese-Schritt wird vorzugsweise in vitro unter Verwendung einer extrakorporalen Photopherese-Apparatur durchgeführt. Der Photopherese-Schritt gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch in vivo durchgeführt werden. Eine gegenwärtig bevorzugte extrakorporale Photopherese-Apparatur zur Verwendung bei den Verfahren gemäß der Erfindung wird gegenwärtig durch Therakos, Inc., Westchester, Pa. unter der Bezeichnung UVAR hergestellt. Eine Beschreibung einer solchen Apparatur kann in dem US-Patent Nr. 4,683,889, erteilt an R. L. Edelson am 14. August 1987, gefunden werden. Die Exposition von Blut gegenüber ultraviolettem Licht in einer Photopherese-Apparatur liegt im Bereich der Fähigkeiten von Personen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind.
Wenn der Photopherese-Schritt in vitro durchgeführt wird, wird mindestens eine Fraktion des behandelten Bluts dem Patienten zurückgegeben, um die Immunantwort des Patienten auf die Population infizierter Zellen und auf das HCV selbst zu steigern. Vorzugsweise wird das hier beschriebene Behandlungsverfahren in einem Intervall von ungefähr einmal pro Woche bis ungefähr einmal in vier Wochen wiederholt. Bevorzugte photoaktive Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, die als Psoralene (oder Furocumarine) bekannt sind, welche im US-Patent Nr. 4,321,919 beschrieben werden. Alternativ kann das Patientenblut in einer Standardvorrichtung vom Photopherese-Typ getrennt und in einer getrennten Vorrichtung photoaktiviert werden.
Die bevorzugten photoaktivierbaren oder photoempfindlichen Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Verbindung schließen die folgenden ein: Psoralen, 8-Methoxypsoralen, 4,5',8-Trimethylpsoralen, 5-Methoxypsoralen, 4-Methylpsoralen, 4,4-Dimethylpsoralen, 4,5'-Dimethylpsoralen, 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-Hydroxmethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und 4',8-Methoxypsoralen. Die am meisten bevorzugte photoempfindliche Verbindung zur Verwendung gemäß der Erfindung ist 8-Methoxypsoralen.
Die photoempfindliche Verbindung wird, wenn sie dem Patientenblut in vivo verabreicht wird, vorzugsweise oral verabreicht, kann jedoch auch intravenös und/oder durch andere herkömmliche Verabreichungswege verabreicht werden.
Die bevorzugte orale Dosierung der photoempfindlichen Verbindung liegt im Bereich von ungefähr 0,3 bis ungefähr 0,7 mg/kg, und sie beträgt am meisten bevorzugt ungefähr 0,6 mg/kg. Wenn die photoempfindliche Verbindung oral verabreicht wird, sollte sie vorzugsweise mindestens eine Stunde vor der Photopherese-Behandlung und nicht früher als ungefähr drei Stunden vor der Photopherese-Behandlung verabreicht werden. Falls sie intravenös verabreicht wird, wären die Zeiten kürzer.
Alternativ kann die photoempfindliche Verbindung an das Patientenblut verabreicht werden, nachdem dieses dem Patienten entnommen worden ist, oder vor oder zeitgleich mit der Exposition gegenüber ultraviolettem Licht. Die photoempfindliche Verbindung kann an Vollblut oder eine Fraktion davon verabreicht werden, vorausgesetzt, dass die Zielblutzellen oder Zielblutbestandteile die photoempfindliche Verbindung erhalten.
Die Photopherese-Behandlung im Rahmen der Behandlungsverfahren gemäß der Erfindung wird vorzugsweise unter Verwendung von langwelligem ultraviolettem Licht (UVA) bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 400 nm durchgeführt. Die Exposition gegenüber ultraviolettem Licht während der Photopherese-Behandlung hat vorzugsweise eine Dauer von befriedigender Länge, um ungefähr 1 bis 2 J/cm² an das Blut abzugeben.
Wenn die Photopherese-Behandlung gemäß der Erfindung in vivo durchgeführt wird, muß sorgfältig darauf geachtet werden, die maximale Strahlenexposition zu kontrollieren, um eine unnötige Verletzung des Patienten zu vermeiden. Verfahren zum Berechnen der maximalen Strahlenexposition gegenüber ultraviolettem Licht ist im Stand der Technik bekannt.
Die Erfindung macht auch Verfahren zum Herstellen von Impfstoffen gegen das HCV verfügbar. Gemäß der Erfindung kann ein Spender, der mit HCV infiziert ist, verwendet werden, um einen Impfstoff gegen seine Virusinfektion herzustellen, wie folgt.
Zuerst wird eine photoempfindliche Verbindung, wie hier oben beschrieben, an mindestens einen Teil des Spenderbluts vor Entnahme des Bluts entweder oral oder intravenös verarbeitet, oder sie wird verabreicht, nachdem dem Patienten Blut entnommen wurde, wobei die Verbindung in diesem Fall in vitro verabreicht wird. Wahlweise könnte ein Teil des Spenderbluts zuerst unter Verwendung bekannter Verfahren weiterverarbeitet werden, um im Wesentlichen die Erythrozyten zu entfernen, und die photoaktive Verbindung wird dann an die sich ergebende angereicherte Leukozytenfraktion verabreicht.
In jedem Fall wird der Teil des Bluts (oder die angereicherte Leukozytenfraktion davon), an den die photoempfindliche Verbindung verabreicht worden ist, einer photoaktivierenden Behandlung unter Verwendung von ultraviolettem Licht, vorzugsweise UVA, auf die oben beschriebene Weise unterzogen. Das behandelte Blut oder die behandelte angereicherte Leukozytenfraktion (je nachdem) wird dem Spender dann zurückgegeben.
Die folgenden Beispiele werden verfügbar gemacht, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen und sollen nicht als deren Beschränkung ausgelegt werden.
Beispiel 1
Reduktion von HCV in chronisch HCV-infizierten Patienten
Die fundamentalen Defekte, die eine Etablierung von chronischer Hepatitis C im Anschluß an eine akute HCV-Infektion ermöglichen, sind nicht bekannt. Etliche Forscher haben nahe gelegt, dass eine beeinträchtigte zelluläre Immunität, die entweder die T-Zellen oder die natürlichen Killerzellen betrifft, eine Rolle spielen könnte. Weiner und Mitarbeiter von der Firma Chiron Corporation haben das Vorhandensein einer hypervariablen Region des HCV-Genoms in dem E2/NS1-Segment gezeigt⁶. Dieser Bereich kodiert isolatspezifische, B-Zell-Antikörper bindende lineare Epitope, die auf der Hülloberfläche des HCV-Partikels exprimiert werden. Die Kennzeichen dieser Domäne sind denjenigen der V3-Schleife des Proteins gp120 des menschlichen Immundefizienzvirus 1 ähnlich. Die rasche Mutation innerhalb dieser Region kann einen Verlust an Immunerkennung und der Clearance des Hepatitis C-Virus erklären.
Andere Autoren postulieren, dass es andere Möglichkeiten einer Resistenz gegenüber einer Interferon-Behandlung gibt. Es gibt Hinweise, dass der Genotyp des Virus beim Beeinflussen des Ergebnisses der Therapie genauso wichtig sein kann. Es scheint, dass einige Genotypen (Subtypen) des Hepatitis C-Virus gegenüber einer Therapie mit Interferon-alpha resistenter sind als andere Typen. Andere Forscher finden eine Korrelation zwischen dem Virustiter des Hepatitis C-Virus vor der Behandlung und dem Erfolg nach Behandlung mit Interferon-alpha.
Der zugrundeliegende Immunmechanismus, der zur Clearance des Hepatitis C-Virus führt, ist allerdings noch nicht bekannt. Shirai vom National Cancer Institute hat gezeigt, dass CD8(+)-zytotoxische Lymphozyten ein nicht-strukturelles Protein mit Homologie zur RNA-Polymerase erkennen, das im Zusammenhang mit einem HLA Klasse I-Antigen auf der Oberfläche der Hepatozyten exprimiert wird⁷. Dies führt zu dem Prozeß der Antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxischen Zerstörung des mit dem Virus infizierten Hepatozyten. Dies wäre dem Prozeß ähnlich, der verwendet wird, um die Clearance von Hepatitis B-Virus zu veranlassen.
Das Hepatitis C-Virus ist ein Positivstrang-Virus, das sich durch das Produzieren einer Negativstrang-RNA als einer Matrize repliziert. Während einer aktiven Replikation des HCV-Virus sind diese Negativstrang-RNA-Matrizen in der Leber des Patienten vorhanden. Forscher haben auch die Anwesenheit von aktiven, sich replizierenden Hepatitis C-Viruspartikeln in mononukleären Zellen des peripheren Patientenbluts festgestellt⁸. Es kann gezeigt werden, dass mononukleäre Zellen, Makrophagen, T-Zellen und B-Zellen Negativstrang-HCV-RNA enthalten.
Während einer Therapie mit Interferon-alpha kann das Hepatitis C-Virus aus der Leber des Patienten und dem Blut verschwinden, wie durch RT-PCR gemessen wird. Trotz dieser offensichtlichen Clearance des Virus in einigen Patienten gibt es eine sehr hohe (80–85%) Rückfallrate nach Interferon-Therapie. Forscher haben gezeigt, dass die (wenigen) Patienten, bei denen keine HCV-Replikation in den PBMCs am Ende der Therapie nachgewiesen wurde, nach Interferon-Therapie keinen Rückfall erleiden und offensichtlich gesunden^9,10,11. Es würde scheinen, dass die mononukleäre Zelle als ein immunologisch geschützter Ort dienen kann, der das Hepatitis C-Virus vor der Erkennung und Angriffen durch das Immunsystem schützt. Sobald die Therapie mit Interferon-alpha abgesetzt wird, kann das Virus die PBMCs verlassen und das Blut und die Leber des Patienten erneut infizieren.
Eine ideale Therapie würde eine Clearance des Hepatitis C-Virus gleichzeitig aus der Leber, dem Blut und infizierten mononukleären Zellen veranlassen. Der Wirkungsmechanismus der extrakorporalen Photopherese verursacht eine Immunisierung gegen die abnormalen T-Zellen, wodurch sie stärker immunogen werden. Nach ECP-Exposition verursacht eine Rückinfusion dieser veränderten T-Zellen eine immunologische Reaktion, die auf unbestrahlte T-Zellen, welche dieselben Oberflächenantigene tragen, abzielt¹². Dies führt zur Produktion einer hochspezifischen Immunantwort auf diese abnormalen Zellen (entweder den Krebsklon oder vielleicht T-Zellen, die virale Antigene auf ihrer Oberfläche exprimieren).
Zusätzlich sollte eine ideale Therapie durch die Neigung der hypervariablen E2/NS1-Region des Hepatitis C-Virus, zu mutieren, nicht beeinflußt werden. Diese Änderung der Hüllantigene des Viruspartikels verursacht eine Flucht vor den B-Zell-neutralisierenden Antikörpern. Die Photopherese kann auch eine Schädigung jedes freien Viruspartikels in dem bestrahlten Blut induzieren. Diese Form von Therapie würde auch auf jede neugebildete Hepatitis C-Fluchtmutante abzielen.
1986 publizierten Hufnagel et al.¹³ den ersten Bericht über eine erfolgreiche Interferon-alpha-Therapie von chronischer Hepatitis C in einer unkontrollierten Studie. Zehn Patienten mit chronischer Hepatitis C erhielten subkutane Injektionen von Interferon für bis zu einem Jahr. Sechs Patienten wiesen sieben Jahre später normale LFTs und durch RT-PCR nicht nachweisbare HCV-RNA auf.
Heutzutage ist rekombinantes Interferon-alpha-2b (Intron A) die einzige von der FDA zugelassene Behandlung von chronischer Hepatitis in den Vereinigten Staaten. Davis et al. berichteten, dass Interferon-alpha-2b im Verlauf von sechs Monaten in einer Dosis von drei Millionen Einheiten (3 MIU) drei Mal pro Woche zu einer zu 18% aufrechterhaltenen Antwort nach der Behandlung führt¹⁴. Eine Vielzahl anderer Studien haben diese Antwortrate reproduziert. Ein biochemischer Rückfall tritt in dem größten Teil an Patienten nach Absetzen der Therapie auf¹⁵. Durch Nachweis von HCV-RNA in Serum durch RT-PCR ist gezeigt worden, dass die RNA mit der Normalisierung von Serumtransaminasen unter Behandlung korreliert, und es ist auch gezeigt worden, dass sie einem biochemischen Rückfall vorausgeht, wenn die Therapie abgesetzt wird^16,17.
Forscher fahren damit fort, neue Therapien zu entwickeln, um die niedrigen Antwortraten zu verbessern. Höhere Interferon-Dosen¹⁸, eine längere Behandlungsdauer¹⁹, verschiedene Arten von Interferon^20,21 und eine unterstützende therapeutische Phlebotomie, um einen Überschuß an Eisen zu entfernen²², sind mit verschiedenen Graden an Erfolg versucht worden. Andere Formen einer Therapie sind sogar weniger wirksam und sind mit häufigen Nebenwirkungen verbunden. Für Kortikosteroide und Acyclovir ist gezeigt worden, dass sie wenig Erfolg haben.
Fünfzehn (15) Patienten wurden zufallsverteilt entweder einer Monotherapie mit ECP alleine (5 Patienten) oder einer Kombinationstherapie mit ECP und Interferon-alpha, 3MIU TIW, (5 Patienten) oder ECP und Interferon-alpha, 6 MIU TIW, (5 Patienten) zugeordnet. Alle Patienten erhielten eine ECP-Behandlung im Clinical Research Center (CRC) am Hospital of the University of Pennsylvania.
Gruppe I (nur ECP)
Patienten, die zufallsbedingt nur ECP erhielten, hatten zwei Behandlungen an zwei aufeinanderfolgenden Tagen alle zwei Wochen. Die Patienten erhielten 24 ECP-Behandlungen über einen Zeitraum von sechs Monaten.
Gruppe II (ECP und IFN-alpha (3 MIU))
Drei Monate nachdem Gruppe I mit der ECP-Behandlung begonnen hatte, begannen die Patienten, die zufallsverteilt ECP und 3 MIU Interferon-alpha erhielten, mit der Therapie. Die Patienten begannen mit ECP-Behandlungen an zwei aufeinanderfolgenden Tagen alle zwei Wochen. Zwei Wochen nach dem Beginn der ECP-Behandlung erhielten die Patienten 3 MIU Interferon-alpha dreimal pro Woche subkutan. Wenn die Verträglichkeit gut war, wurden die ECP-Behandlungen der Patienten für zwei aufeinanderfolgende Tage alle zwei Wochen über sechs zusätzliche Monate im Kombination mit Interferon-alpha fortgesetzt. Die Patienten erhielten 24 ECP-Behandlungen über einen Zeitraum von sechs Monaten.
Gruppe III (PUVA und IFN-alpha (6 MIU))
Drei Monate, nachdem Gruppe II mit der ECP-Behandlung begonnen hatte, begannen Patienten, die zufallsverteilt ECP und 6 MIU Interferon-alpha erhielten, mit der Therapie. Die Patienten begannen mit den ECP-Behandlungen an zwei aufeinanderfolgenden Tagen alle zwei Wochen. Zwei Wochen, nachdem die ECP-Behandlung begonnen worden war, erhielten die Patienten 6 MIU Interferon-alpha dreimal pro Woche subkutan.
Untersuchungszeitraum
Messungen während des Untersuchungszeitraums schlossen eine historische und physische Untersuchung, eine Beurteilung der Symptome sowie eine Messung von Gewicht und Blutdruck ein. Die Labortests schließen folgende ein: vollständiges Blutbild, einschließlich Differenzialblutbild, Schilddrüsenfunktionstests, Prothrombinzeit, chemische Parameter und Serum-HCG (falls indiziert). Die Messung des Schwangerschafts-HCG-Serumspiegels wurde innerhalb von 24 Stunden nach Beginn der Behandlung durchgeführt. Ein vollständiges Blutbild schloß die Bestimmung von Hämokrit, Hämoglobin, Plättchenzahl und Gesamt-WBC ein, wobei das Differenzialblutbild Neutrophile, Lymphozyten, mononukleäre Zellen, Eosinophile und Basophile einschloß. Ein chemisches Bild schloß das Gesamtprotein, Albumin, Gesamtbilirubin, die ALT, AST, alkalische Phosphatase, gamma-GT, Natrium, Kaliumchlorid, den CO₂-Gehalt, Harnstoff-Stickstoff, Creatinin, Glukose, Kalzium, Phosphat, Cholesterin, Triglyceride und Harnsäure ein. Serum und mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMCs) wurden zur Bestimmung des HCV-RNA-Titers durch RT-PCR und zur HCV-Genotyp-Analyse gesammelt. Serum aus 7 ml Vollblut wurde gesammelt und bei –70°C für zukünftige Untersuchungen eingefroren.
Behandlungszeitraum
Eine Beurteilung der Symptome, eine Messung von Gewicht und Blutdruck, eine Bestimmung des Gesamtblutbilds und der ALT wurde nach zwei Wochen und alle vier Wochen während der Behandlung durchgeführt. Der HCV-RNA-Titer im Serum wurde nach zwei Wochen und alle vier Wochen während der Behandlung überwacht. Der HCV-RNA-Titer in den PBMCs wurde am Ende der Behandlung gemessen. Serum aus 7 ml Vollblut wurde alle acht (8) Wochen gesammelt und bei –70°C für zukünftige Studien eingefroren. Eine Katam nese und physische Untersuchung, die Messung chemischer Parameter, ein Schilddrüsenfunktionstest und eine Bestimmung der Prothrombinzeit wurden am Ende der Behandlung durchgeführt.
Katamnese-Zeitraum
Eine Beurteilung der Symptome, eine Messung von Gewicht und Blutdruck, eine Bestimmung des Gesamtblutbilds und der Serum-HCV-RNA wurde alle acht Wochen während und bei der letzten Visite des Katamnese-Zeitraums durchgeführt. Der HCV-RNA-Titer in den PBMCs wurde bei der letzten Katamnese-Visite gemessen. Die ALT wurde alle vier Wochen und bei der letzten Visite der Katamnese gemessen. Serum aus 7 ml Vollblut wurde alle acht (8) Wochen während der Katamnese gesammelt und bei –70°C für zukünftige Studien eingefroren. Eine Katamnese-Geschichte und physische Untersuchung, eine Bestimmung der chemischen Parameter, ein Schilddrüsenfunktionstest und die Bestimmung der Prothrombinzeit wurden bei der letzten Visite der Katamnese-Periode durchgeführt.
Sammeln des Serums
Blut wurde in Röhrchen zur Serumtrennung (BD SST-Röhrchen) gesammelt. Innerhalb von zwei Stunden nach Blutentnahme wurden die Röhrchen mit dem Blut bei 1500 × g 20 Minuten zentrifugiert. Das Serum wurde sofort gesammelt und bei –70°C gelagert.
Präparation der mononukleären Zellen
Es wurde Blut in einem CPT Vakutainer-Röhrchen zur Präparation mononukleärer Zellen (Becton Dickinson) mit einer Kapazität von 8 ml gesammelt. Die Röhrchen wurden 20 Minuten bei 1500 × g und 18 bis 25°C zentrifugiert. Das Plasma wurde entfernt, ohne die Zellschicht zu zerstören, und in Aliquots von 1 ml bei –70°C eingefroren. Die Zellschicht wurde in ein konisches 15 ml-Röhrchen pipettiert, und es wurden 10 ml PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) zugegeben. Der Inhalt des Röhrchens wurde vorsichtig fünfmal gemischt und dann bei 300 × g 15 Minuten zentrifugiert. Sobald die Zellen am Boden des Röhrchens pelletiert waren, wurde der Überstand entfernt und verworfen. Das Pellet wurde in 2 ml PBS resuspendiert und dann in Aliquots von 1 ml auf 1,5 ml-Röhrchen (Sarstedt) verteilt. Die Sarstedt-Röhrchen wurden in einer Mikrozentrifuge bei hoher Drehzahl 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und bei –70°C gelagert, bis eine PCR-Analyse durchgeführt wurde. Die PCR-Analyse wurde unter Verwendung des Amplicor-Tests (siehe unten) durchgeführt.
Amplicor-Test auf HCV in Serum oder in mononukleären Zellen
Der HCV-RNA-Test ist ein Prototyp-Test auf der Grundlage von PCR unter Verwendung eines einzelnen Primer-Paars (biotinylierter stromabwärts gelegener Primer) von der 5'-untranslatierten Region von HCV. Uracil-N-Glycosylase wurde einbezogen, um eine Amplicon-Kontaminierung zu verhüten. Die HCV-Ziel-RNA wurde rückwärts (revers) transkribiert und in einer einzigen Röhrchen-Reaktion unter Verwendung des Enzyms rTth-DNA-Polymerase in Gegenwart von Mn²⁺ amplifiziert. Nach der Amplifizierung wurden die Produkte alkalisch denaturiert und mit einer HCV-spezifischen Sonde hybridisiert. Der Nachweis wurde in einer 96-Mikrowell-Ausführung unter Verwendung von Avidin-Meerrettich-Peroxidase durchgeführt. Das Ergebnis des Tests wurde in A450-Einheiten, wie mit einem Standard-Mikrotiterplattenlesegerät ermittelt, exprimiert.
Effizienzkriterien
Eine Antwort auf die Behandlung wurde unter Verwendung der folgenden virologischen und biochemischen Kriterien gemessen:
Virologische Kriterien (Kriterien ersten Grades)
HCV-RNA im Serum wurde vor der Studie und während der Therapie überwacht, um die Antwort zu bestimmen, und während des 24-wöchigen Katamnese-Zeitraums, um die Stabilität der Antwort zu bestimmen. Eine Einteilung der Antwort auf die Behandlung wurde nach den folgenden Kriterien vorgenommen:

a) Keine Antwort: HCV-RNA bleibt während des Behandlungs- und Katamnese-Zeitraums durch PCR nachweisbar.
b) Vollständige Antwort: HCV-RNA ist unter Therapie am Ende des Behandlungszeitraums durch PCR nicht nachweisbar und wird vor dem Ende des Katamnese-Zeitraums nachweisbar.
c) Heilung: HCV-RNA ist am Ende des Behandlungszeitraums durch PCR nicht nachweisbar und bleibt am Ende des Katamnese-Zeitraums nicht nachweisbar.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass eine Photopherese allein oder in Verbindung mit einer Interferon-Behandlung die Menge an genetischem HCV-Material wesentlich reduziert.
Die Verwendung von Photopherese alleine senkte die Menge an Virus bei chronischen HCV-Patienten, bei denen andere Behandlungen zuvor versagt hatten. Tabelle 1 (und 1, Tafel A) stellt die Menge an HCV bei jedem Patienten zu Beginn und nach acht Wochen unter Therapie dar (Bereich innerhalb des gestrichelt dargestellten Kastens in 1, Tafel A).
Die Kombination aus Photopherese und Interferon-alpha entfernt das Vorhandensein von Virus, wie durch RT-PCR nachgewiesen, aus dem peripheren Blut von chronisch infizierten HCV-Patienten. Die 1B und 1C stellen die HCV-Spiegel der Patienten vor, während und nach Abschluss der Behandlung dar. Die Wirkung der Behandlung ging verloren, nachdem die Photopherese beendet wurde.
Tabelle 1 Hepatitis C Gruppe 1: nur Photopherese
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Claims

Verwendung einer photoaktivierbaren Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion durch Exponieren von Blut des Patienten, das die photoaktivierbare Verbindung enthält, gegenüber Licht einer Wellenlänge, das die photoaktivierbare Verbindung aktiviert.
Verwendung einer photoaktivierbaren Verbindung und Interferon alpha bei der Herstellung eines Medikaments für die sequentielle Behandlung eines Patienten mit chronischer HCV-Infektion durch Exponieren von Blut des Patienten, das die photoaktivierbare Verbindung enthält, gegenüber Licht einer Wellenlänge, das die photoaktivierbare Verbindung aktiviert.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung an zwei aufeinanderfolgenden Tagen alle zwei Wochen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung über eine Dauer von drei Monaten ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Behandlung mit Interferon alpha zwei Wochen nach der Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung beginnt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Behandlung mit Interferon alpha dreimal pro Woche stattfindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die photoaktivierbare Verbindung ein Psoralen ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Psoralen 8-Methoxypsoralen ist.