CN1214636A - Hcv感染的光渗透治疗 - Google Patents

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Abstract

公开一种治疗慢性HCV感染病人的方法。该方法包括利用干扰素α对病人的选择性治疗和利用一种补骨脂素化合物接着通过利用紫外光活化该补骨脂素处理病人的血液的治疗。将按照一种称之为体外光渗透方法这样处理的病人的血液返回到病人体内。

Description

HCV感染的光渗透治疗
体外光渗透(Extracorporeal photopheresis)治疗是一种治疗方法，其中在治疗之前两小时将一种天然的光敏化合物8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)通过口服给药；然后从病人体内抽血，抗凝，利用离心法分离血液白细胞，并收集白细胞富集部分。然后利用紫外光(UVA)照射这些含8-MOP的白细胞，该紫外光使8-MOP与DNA中的嘧啶碱基和细胞内-以及外-蛋白质结合。然后将这些经处理的白细胞送回病人体内，这是一种免疫调节方法，已经发现其在很多疾病中有很好的临床效果。
有很多疾病被认为主要与T细胞有关或者是T细胞介导的疾病如皮肤T细胞淋巴瘤、在移植之后的器官同种异体的移植排斥，以及一些被认为是T细胞介导的疾病例如渐进性全身硬化(PSS)、类风湿性关节炎和幼年起病型糖尿病(JODM)。
皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)是一种渐进性的恶性肿瘤疾病。治疗方法是有限的。Edelson等人进行一种多中心实验2，表明29名患者中，24人(83％)的红皮炎经过治疗疾病状况明显改善。这些积极的反应在开始治疗后的22.4星期的中间阶段就可以观察到。就临床显著性而言，这些患者是其疾病对以前的治疗有抗药性的那些病人，所述治疗被认为是很难预测那一类。此外，观察到外周血(Sezary细胞)数量减少。实际数据已经表明，与小于30个月的存活中等时间相比，该中等存活从治疗的开始起增加到60个月以上。在这原有一组的病人中，患有白血病的实验对象中的8个维持减轻状态。与光渗透相关的不良反应很少。
自身免疫性疾病的特征是免疫系统的失调，其特征还在于，病人体内特定器官或组织中的特异性细胞或体液介导的破坏。这类疾病的实例是类风湿性关节炎和进行性全身性硬化。
类风湿性关节炎(R.A.)是一种炎症疾病，最终导致关节损坏并且是一种涉及很多器官系统的全身性疾病。有很多种药剂用于R.A.，然而，由于该疾病是终生性的，就同样需要对于疾病能提高潜力的更加耐久的药剂。特别是，对于开始第二种R.A.治疗之后，在大量的病人中已观察到效力的丧失和疾病逐渐发展。很多第二种药剂是抑制免疫剂，并且本身成为引起主要副反应例如感染的原因。因此需要开发一种更特异性的无毒性的改进免疫调节治疗方法3。
进行性的全身性硬化(PSS)是一种结缔组织疾病，其特征在于，在皮肤和内脏中有炎症和纤维性病变。治疗是很困难的。抗炎药物和皮质类固醇在疾病的早期阶段是有帮助的，但不能影响疾病的发展。利用D-青酶氨、氨甲喋呤，环孢菌素、钙通道阻断剂以及前列腺素的试验正在进行，不过这些药物不能影响疾病的总体发展。因为这些疾病被认为是由T细胞介导的，Rock和他的同事已经利用光渗透来治疗PSS病人4。在这一实验中，将56名病人随机分配进行非盲临床实验。与用D-青酶氨(对照)组(32％反应率)相比，观察到采用光渗透治疗的组(68％反应率)有明显高的反应率。
青少年发作性糖尿病(JODM)被认为是免疫系统介导的，导致生成胰岛素的胰细胞的破坏。患有这种疾病的病人不仅他们的血糖失调，而且该疾病的特征在于，由于血管病产生导致有显著发病率和死亡率的特定器官损伤。
其它由T细胞介导的现象包含对宿主外源组织的排异。在器官同种异体移植的情况下，需要防止对被移植器官的排异，然而，还要维持免疫系统的能力，以便使身体能抵抗感染以及发挥其它正常的身体防御能力。在移植之后的常规治疗限于用于引起全身免疫抑制状态的免疫抑制方案，这会引起这种治疗所常见的有害反应，再次感染，可能是细菌感染或机遇性感染。
不具有免疫抑制性的免疫调节更理想。光渗透已经表明是有效的，在Loyola大学的研究人员用光渗透已经成功地治疗了常规的免疫抑制药剂难以治疗的14例心脏排异病例中13例。在一种不同情况中，已经成功地将光渗透于(Rossetti等人5)成功地治疗一个患有慢性移植抗宿主病的病人。这种疾病特征在于，是一种无免疫能力的宿主，其中免疫感受态细胞(骨髓或者外周干细胞)被注入到这种状态的病人体内作为对各种恶性肿瘤和白血病的治疗。这里，移植的免疫活性细胞攻主该病人(宿主)。这里还应指出，其结果是调节免疫活性细胞，而不会引起进一步抑制免疫和其副作用。
光渗透包含将外周血白细胞体外暴露于用紫外线A光光激活的8-甲基补骨质素(8-MOP)，接着再输注经处理的白细胞。
血液中的8-甲基补骨质素分子进入白细胞核和插入双链DNA螺旋中。在体外循环中，UVAR光渗透系统内，长波长的紫外光照射白细胞富集的血液部分。经光活化的药物，对应UVA能量与DNA螺旋中的胸苷碱基结合。这样就形成胸苷碱的交联，在转录过程中，防止DNA的解旋。然后将血浆和经转变的白细胞重新注入病人体内。再输注光渗透损伤的白细胞会延缓对这些受损伤白细胞的免疫攻击，而未经修饰的WBC显示相同的细胞表面抗原。
UVAR系统
治疗由3个阶段组成：1)采集血况棕黄色部分(白细胞富集的)，2)照射所采集的血沉棕黄色层部分；以及3)重新输注处理过的白细胞。采集阶段包含6次循环的抽血、离心和再输注步骤。在每个循环的过程中，用儿科迁动碗，将全血离心并分离。从所述分离中，在每一采集循环中保存血浆(在每一循环中的体积是由UVAR仪器的操作人员确定的)和40毫升血沉棕黄色层。在开始下一次采集循环之前，将红细胞和所有其他血浆重新注入到病人体内。最后，分离得到总共240毫升的血沉棕黄色层和300毫升的血浆，并保存用于UVA照射。
在第一采集循环的血沉棕黄色层采集过程中，开始照射在照射环路内的白细胞富集的血液。将采集的血浆和血沉棕黄色层与200毫升的肝素化的生理盐溶液和200毫克的UVADEX(可溶于水的8-甲氧基补骨脂素)相混合。这一混合物按1.4毫米厚的流层流动通过插入在PHOTOSETTE的两排UVA灯之间的PHOTOCEPTOR光活化室，PHOTOSETTEUVA灯照射这一UVA透过PHOTOCEPTOR室的两侧，使得能够照射180分的紫外(A)光，形成平均照射能量为每个淋巴细胞为1-2焦尔/平方厘米。最终的血沉棕黄色层制备物包含估计为20％到25％的总外周血单核细胞成分并且血球比为2.5％-7％。在光活化期之后，用30到45分钟将该体积(血液)重新注入到病人体内。
采用这种技术的系统是公知的，因此可进行对病人血液的体外处理。例如，在Goss的4573960号美国专利中，向病人提供一种需要光活化的药物，然后抽出病人的血液，并将其成分分离。将未经处理的成分(红血球、一些血浆等)送回病人体内。然后将病人和治疗设备分开，将分离的一些成分例如白细胞暴露于紫外光。在光活化之后，将经处理的细胞送回病人体内。
在授予Edelson的4321919、4398906和4464166号美国专利中，已经讨论了一种疾病的体外治疗方法，其中发生淋巴细胞的病理学增加，例如皮肤的T细胞淋巴瘤。按照这些方法，将病人的血液在存在化学药品或抗体的情况下利用紫外光照射。紫外光影响淋巴细胞和化学药品或抗体之间的结合，因此抑制淋巴细胞的代谢过程。
各种人体病毒能够感染并在单核细胞内复制，或者感染性病毒颗粒可以保持于单核细胞内。单核细胞或者可以用作为病毒的复制传播源，或者用作为免疫系统难以消除的感染性病毒颗粒储库。不消除这些感染性病毒源可能导致形成慢性病。能够感染、在单核细胞内部复制或驻留的病毒包含，但不限于节肢动物传播病毒，肠道病毒、副粘病毒(RSV)、疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、G型肝炎病毒(HGV)以及HIV。
各种人体非病毒病原体可以感染并在单核细胞内复制，或者感染性非病毒病原体可以保持于单核细胞内。单核细胞可以或者用作为非病毒病原体的复制传播源，或者用作为免疫系统难以消除的感染性非病毒病原体的储库。不消除这些感染性非病毒病原体源可以导致形成慢性病。可以感染、在单核细胞内复制或驻留在其内的非病毒病原体包含，但不限于各种细菌，例如节肢动物传播细菌，支原体、分枝杆菌类；以及各种寄生虫例如原虫类和其它节肢动物传播的寄生虫。
体外光渗透已成功地用于治疗HIV感染(4960408号美国专利)，以及补骨脂素化合物与长波紫外光的结合已表明在体外能使某些病毒失活，所述病毒例如HIV(Quinnan,G.V等人；1986,Transfusion(输血)，26,481页，Bisaccia,A等人；1990；Ann.Infem.Med.,113,270页；Bisaccia,A等人，1991,Am.NY Acad.Sci.,636,PP321)，以及流感病毒和单纯性疱疹病毒(Redfield.D.C等人；1981；Infect andImmun,32,1216页)。来自哥伦大学的Bisaccia在中试实验已经研究了ECP治疗患有与AIDS相关症群侯的病人。其原理是将补骨脂素与UVA活化相结合，可以在体外杀伤HIV病毒，以及重新输注受损伤的病毒可以引发免疫反应。该作者发现，ECP使HIV抗体生产增加、CD8(+)淋巴细胞增加，p24抗原滴度降低，以及使HIV不能在3位病人身上繁殖。20个病人中的11人他们的皮肤抗原反应性增加。
此外，已有报告在移植手术后接受关于抑制免疫的光渗透治疗的一些病人中感染发病率降低(Meiser,B.M等人，Transplantation(移植术)57,563页)。然而，对于进行移植手术的病人的观察结果与光渗透治疗无关，这是由于包括接受各种治疗以防止排斥移植的器官的病人通常都有感染。
本发明提供了一种利用体外光渗透来治疗慢性HCV的方法。特别是，利用本发明的方法治疗患有慢性HCV感染病的病人，使得经过治疗的病人体内HCV遗传物质的数量降低或达到检测不出的水平。本发明的方法包含利用一种可光活化或光敏化合物来处理治疗病人的血液，该化合物通过紫外光活化后能够结合受感染的有核细胞中的核酸。利用常规给药技术可以将可光活化的或光敏化合物体外或体内施用到病人血液中。
然后将病人的一部分血液利用光渗透在体外进行处理，包括利用紫外光照射该血液，最好为波长范围320到400纳米的长波长紫外光，通常称为UVA光。在体外光渗透后将经处理的血液或其部分送回到病人体内，以便刺激病人免疫系统的抗感染的细胞种和/或抗HCV的免疫反应，从而抑制病毒感染的发展。通过这种处理还能损伤病毒遗传物质，使得病毒不能复制，因此中止病毒传播并中和驻留在细胞内的感染性病毒颗粒。
附图描述
图1A、1B和1C分别表示第1组、第2组和第3组病人的治疗结果。
发明详述
本发明涉及光渗透使HCV失活利或杀死已感染HCV之血细胞的用途。本发明的范围并不局限操作的具体原理，但应认识到利用本发明的光渗透损伤受感染的有核血细胞(例如单核细胞)可以治疗不由病人的正常免疫反应控制的HCV感染。然后利用经处理的细胞以及被杀死的和/或减毒病毒、肽、病毒本身的天然亚单位(它们是当细胞破裂和/或脱开进入血液中时释放的)和/或致病的非感染性病毒产生免疫反应。
HCV能够感染并在单核细胞内复制，或者感染性病毒颗粒可以保留在单核细胞内。所述单核细胞可以作为病毒的复制和传播源，或者可以作为各种免疫系统难以消除的感染性病毒颗粒的储库。不消除这些感染性病毒源，可能导致形成慢性病。
根据权利要求所要求保护的方法，首先将一种可光活化的或光敏化合物施用给HCV慢性感染的病人血液中。可以将可光活化或光敏化合物体内给药(例如口服或通过静脉注射)，或者通过采用常规的抽血技术体外施用到由病人体内抽出的病人血液中。
根据本发明，可光活化的或光敏的化合物在受到规定频谱的电磁射线例如紫外光照射而活化后，应能与核酸结合。
接着，通过利用紫外光对该部分血液进行光渗透处理，以便对已施用了光活性化合物的病人血液进行处理。优选利用一体外光渗透装置体外实施光渗透步骤。本发明的光渗透步骤也可以在体内完成。目前用于本发明方法的优选体外光渗透装置，是以UVAR名称由Therakos,Inc.,Westchester,Pa制造的。对于这一装置的介绍可以在1987年8月14授权给R.L.Edelson的4683889号美国专利中找到。在光渗透装置中用紫外线照射血液是本技术领域中的一般技术人员能够做到的。
在体外实施光渗透步骤时，将至少一部经处置的血液送回到病人体内，以便增强病人对于感染细胞种群和对HCV本身的免疫反应。优选，这里所述的治疗方法按照约每周一次到约每隔三周一次的时间间隔重复进行。用于本发明的优选光活化化合物是在4321919号美国专利中所介绍的称之为补骨脂素(或呋喃并香豆精)的化合物。另外，病人的血液可在一标准的光渗透型装置上分离并在一单独的装置上进行光活化。
用于本发明的优选可光活化的或光敏化合物包括：
补骨脂素；8-甲氧基补骨脂素；4,5’,8-三甲基补骨脂素；5-甲氧基补骨脂素；4-甲基补骨脂素；4,4-二甲基补骨脂素；4,5’-二甲基补骨脂素，4’-氨甲基-4,5’,8三甲基补骨脂素；4’-羟甲基-4,5’,8-三甲基补骨脂素；以及4’,8-甲氧基补骨脂素。用于本发明特别优选的光敏化合物是8-甲氧基补骨脂素。
当要体内施用于患者血液中时，优选将光敏化合物通过口服施用，不过也可以通过静脉内和/或通过其它常规给药途径施用。
光敏化合物的优选的口服剂量为约0.3-0.7毫克/公斤，最好为约0.6毫克/公斤。当通过口服服用时，光敏化合物应在进行光渗透处理之前至少约一个小时之前以及在进行光渗透处理之前不大于约三个小时服用。如果通过静脉内施用，时间应更短。
另外，光敏化合物可以在抽出病人血液之后以及在利用紫外光照射之前或同时施用到病人的血液中。只要靶血细胞或血液成分接受了光敏化合物，则光敏化合物可以施用到全血或其一部分中。
优选利用320到400纳米波长范围内的长波长紫外光(UVA)完成本发明的治疗方法中的光渗透处理。在光渗透治疗过程中，紫外光的照射时间应足够长，以便向血液输送约1-2焦尔/平方厘米。
当在体内实施本发明的光渗透治疗时，应认真注意控制最大辐射剂量，以避免对患者的不必要伤害。计算紫外光的最大辐射剂量的方法是本领域已知的。
本发明还提供了制备抗HCV的疫苗的方法。根据本发明，可按如下所述利用一受感染HCV的供体来生产抗其病毒感染的疫苗。
首先，在抽血前，经口或静脉内将如上所述的光敏化合物施用到供体病人的至少一部分的血液中，在病人抽血之后，体外施用上述化合物。以可供选择的方式，首先利用公知的方法对供体的一部分血液进行处理，以便基本上除去红细胞，然后将光活化化合物施用到所得的富集白细胞部分中。
总之，已经提供有光敏化合物的血液部分(或其富集的白细胞部分)都要利用紫外光优选UVA按照前述方式进行光活化处理。然后将经处理的血液或经处理富集白细胞部分返还注入到供体体内。
提供如下的一些实施例用以说明本发明，并不构成对本发明的限定。
                实施例1
减少在慢性HCV感染的病人身上的HCV。
在急性HCV感染之后形成C型慢性肝炎的基本缺陷是未知的。几位研究人员都认为受损的细胞免疫无论是T细胞还是自然杀伤细胞都可以起作用。来自Chiron Corporation的Weiner和合作者已经证明在E2/NS1片段中存在HCV基因组的超可变区。这一区域编码分离物特异性的，B细胞抗体一结合线性表位，这些表位是在HCV颗粒包膜表面上表达的。这一结构域的特性与人免疫缺陷性病毒l’s gp 120蛋白的V3环相似。在这一区域内的快速突变可以解释免疫识别的丧失和丙型肝炎病毒的清除。
其它作者则主张对于干扰素蛋白治疗的抗性或许有其它可能性。有证据表明，病毒基因型在影响治疗效果方面是很重要的。似乎丙型肝炎病毒的某些基因型(亚型)对干扰素α治疗的抗性可能强于其它类型。其它的人员发现，丙型肝炎病毒预处理的病毒滴度与利用干扰素α治疗之后的效果有关。
不过，导致丙型肝炎病毒清除的基本免疫基理仍然是未知的。国家癌症研究中心的Shirai已经证明，CD8(+)细胞毒淋巴细胞能识别与RNA聚合酶同源的非结构蛋白质，所述RNA聚合酶的表达与肝细胞表面上的Ⅰ型HLA抗原有关7。这样就导致病毒感染之肝细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒破坏作用。这与清除乙型肝炎病毒的作用过程相似。
丙型肝炎病毒是一种通过生成作为模板的负链RNA来复制的正链病毒。在活性HCV病毒复制的过程中，这些负链RNA模板存在于病人肝内。研究人员还发现，活性的正在复制的丙型肝炎病毒颗粒存在于病人的外周血单核细胞中8。单核细胞、巨噬细胞、T细胞和B细胞可含有负链HCV RNA。
在利用干扰素α治疗的过程中，当利用RT-PCR测量时发现丙型肝炎病毒可由病人的肝和血液中消失。尽管在某些病人身上这样显然清除了病毒，但在干扰素治疗之后，有很高的复发率(80-85％)。研究人员已经证明，在治疗结束时，在PBMC中没有检测到HCV复制的(少数)病人在干扰素治疗之后没有复发并且明显痊愈9,10,11.。似乎单核细胞可以作为丙型肝炎免于免疫系统识别和攻击的免疫保护位点。一旦干扰素α治疗取消，病毒可能脱离PBMC并重新感染病人的血液和肝。
很明显理想治疗应当是同时从肝、血液和受感染的单核细胞清除丙型肝炎病毒。体外光渗透的作用机理能形成一种抗异常T细胞的免疫作用，使异常T细胞形成更强的免疫原性。在ECP照射之后，再注入这些改变的T细胞引起反疫反应，所述免疫反应针对未受照射的带有相同表面抗原的T细胞12。这样就会产生抵抗那些异常细胞(或者癌克隆、或者为在其表面上表达病毒抗原的T细胞)的高度特异性的免疫反应。
此外，理想的治疗应当不受丙型肝炎有突变倾向的超可变E2/NS1区的影响。病毒颗粒被膜抗原的这种变化使之能摆脱B细胞中和抗体。光渗透还可诱导对经照射的血液中的任何游离病毒颗粒损害。这种治疗形式还可导向任何新形成的丙型肝炎脱(escape)突变体。
在1986年，Hoofnagle 13等人公开了第一份在无对照的实验中成功地用干扰素α治疗慢性丙型肝炎的报告。10个患有慢性丙型肝炎的病人接受了长达一年的干扰素皮下注射治疗。七年之后，6个病人仍然具有正常的LFT和利用RT-PCR未能检测到的HCV RNA。
时至今日，干扰素α-2b，即重组体(内含子A)是在美国仅有获得FDA批准的用于慢性肝炎的治疗方法。Davis等人报告说，按照每周三次3百万单位的剂量施用干扰素α-2b的6个月的疗程中，最终18％保持了反应，停止了治疗14。多个其它的实验重现了这一反应比率。生化反应复发发生在停止治疗之后的大多数病人中。利用RT-PCR对血清中HCV RNA的检测也已表明与血清转氨酶正常化有关，一旦停止治疗，生化反应复发发生(文献16,17)。
研究人员继续研究新的疗法以提高该较低的反应比率。更高的干扰素剂量18、更长的治疗时间19。不同的干扰素20、21以及用于除去过量铁的辅助治疗放血术22都已进行实验，获得了不同程度的成功。其它的治疗方式有效性更低，并经常带来副作用。皮质类固醇和无环鸟苷已表明没什么好处。
15个病人被随机分组，或者单独用ECP单一治疗(5个病人)，或者用ECP和干扰素α-3MIU TIW联合治疗(5个病人)，或者用ECP和干扰素α6MIU TIW联合治疗(5个病人)。所有的病人都在宾夕法尼亚大学医院的临床研究中心(CRC)接受ECP治疗。
组Ⅰ(单独用ECP)
病人都随机分组，以便接受单独ECP的两种治疗方式，每隔一星期连续两天接受治疗。病人在6个月的时间内接受24次ECP治疗。
组Ⅱ(ECP和IFN-(3MIU)
在组Ⅰ开始ECP之后三个月，病人被随机分组，以便接受以ECP和干扰素α-3MIU开始的治疗。病人开始在每隔一周连续两天接受ECP治疗。在ECP开始之后两个星期，病人一周3次皮下接受干扰素-α3MIU治疗。如果耐受性好，病人将每隔一周连续两天接受ECP治疗，持续另外6个月，同时联用干扰素α。在6个月内病人接受24次ECP治疗。
组Ⅲ(PUAV和IFN-(6MIU))
在组Ⅱ开始ECP之后三个月，将病人随机分组，以便接受以ECP和干扰素α6MIU开始的治疗。病人每隔一周连续两天接受ECP治疗。在开始ECP之后的两周，病人每周三次皮下接受干扰素-α6MIU。
筛选期
筛选期的测量包含病历和身体检查，症状评定，体重和血压检查。实验室化验包含：区分的进行全血计数、甲状腺功能测试、凝血酶原时间，化学化验项目(panel)以及血清HCG(如果说明的话)。血清妊娠HCG在开始治疗的24小时之内进行。完整的血液计数据包括：血细胞比容、血红蛋白、血小板计数以及按照包含嗜中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜曙红细胞和嗜碱粒细胞示差的总的WBC。化学化验项目包含：总蛋白、白蛋白、总胆红素、ALT、AST、碱性磷酸酶、γGT、氯化钠、钾、CO2含量、脲氮、肌酸酐、葡萄糖、钙、磷酸盐、胆固醇、甘油三脂以及尿酸。收集血清和外周血单核细胞(PBMC)以便用RT-PCR测定HCV-RNA滴度并用于HCV基因型分析。收集来自7毫升全血的血清并在-70℃下冷冻，以便进一步研究。
治疗期
在治疗过程中在第2星期，然后每隔3个星期进行症状评定、体重、血压、全血计数以及ALT测量。在治疗过程中在第2星期，然后每隔3个星期监测血清中的HCV-RNA滴度。在治疗结束时测量PBMC中的HCV RNA滴度。每隔7个星期收集来自7毫升全血液的血清并在-70℃下冷冻以便进一步研究。在治疗结束时，进行随访病历和身体检查、化学化验项目、甲状腺功能测试和凝血酶原时间测试。
随访期
在随访期内每隔7周和最后一次随访时，进行症状评定、体重、血压、全血计数和血清HCV RNA测试。在最后一次随访时测量PBMC的HCV RNA滴度。每隔3星期并在最后一次随访时，测量ALT。在随访的过程中每隔7星期收集来自7毫升全血液的血清并在-70℃下冷冻以便进一步研究。在随访期内的最后一次探访时进行随访病历和身体检查、化学化验项目，甲状腺功能测试和凝血酶原时间测试。
血清收集
利用血清分离器(BD SST)试管收集血清。在抽血后2小时之内，将血液收集试管进行离心分离，按1500xg持续20分钟。立即收集血清并在-70℃下存储。
单核细胞制备
用8毫升容量真空容器型CPT单核细胞制备试管(Becton Dickinson)收集血液。以1500xg,18-25℃将这些试管进行离心20分钟。在不破坏细胞层的情况下取出血浆，并按照1毫升等份在-70℃下冷冻。将细胞层用滴管移到15毫升的锥形瓶中并加入10毫升PBS(磷酸盐缓冲的盐)。将该试管平缓地进行混合五次，然后以300xg离心15分。一旦细胞沉淀在试管底部后，取出上清液并丢弃。将该沉淀重新悬浮在2毫升的PBS中，然后将其分成1毫升等份倒入1.5毫升Sarstedt管中。将该Sarstedt管在一微离心分离器高速旋转持续10分钟。除去上清液并存储在-70℃下，直到进行PCR分析。利用Amplicor检测(如下)进行PCR分析。
血清或单核细胞HCV的扩增子检测
HCV RNA检测是利用来自HCV的5’非翻译区的单引物对(经生物素化的下游引物)所进行的原型PCR检测。加入尿嘧啶-N-糖基化酶，以防止扩增子污染。将HCV靶RNA在存在Mn++的情况下反转录并用rTth DNA聚合酶用单一试管反应扩增。扩增之后，将该产物经碱变性并与HCV特异性探针杂交。利用带抗生物毒蛋白辣根过氧化酶在96微孔平板进行检测。用标准微孔平板读数器，将检测的结果用A450单位来表示。
效力标准
利用如下的病毒学和生物化学标准测量对治疗的反应：
病毒学标准(初步标准)
研究前，治疗过程中监测血清中的HCV-RNA，以确定反应，在24星期的随访期内进行监测以便测定反应的稳定性。根据如下标准，记录治疗反应：a)无反应：在治疗过程中和随访期，利用PCR仍可检测到HCV RNA。b)完全反应在治疗结束时利用PCR检查治疗未检测到HCV RNA，而在随访期结束前是可检测到的。c)痊愈：在治疗结束时利用PCR未能检测到HCV RNA，在随访期结束时仍未能检测到。
这一研究表明，单独用光渗透或与干扰素治疗相结合，可明显降低HCV遗传物质的水平。
单独采用光渗透降低了对先前的其它治疗无效的慢性HCV病人的病毒水平。表1(和图1A)描述了每个病人原始和经8星期治疗后(图1A中的方块区)的HCV水平。
正如利用RT-PCR所检测的，光渗透和干扰素α的联合治疗消除了在慢性感染HCV的病人的外周血中的病毒。图1B和1C描述了关于病人在治疗过程中和完成治疗之后的HCV水平。在光渗透治疗被中断后，治疗效果也消失了。
                  表1
                丙型肝炎
          组Ⅰ：仅用光渗透治疗
    HCV(log以10为底)
    病人号码     零星期治疗     8星期治疗
    1     5.51     5.27
    2     6.07     5.54
    3     5.32     4.39
     4     5.27     5.00
     5     5.91     5.47
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Claims (9)

1、一种用于治疗慢性HCV感染病人的方法，包括：
a)将一种可光活化的化合物施用到所述病人的血液中；以及
b)利用一种其波长适于活化所述可光活化的化合物的光处理在步骤a)中所述的病人的至少一部分血液，并将经处理的血液送回到所述病人身上。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述可光活化的化合物是补骨脂素。
3、如权利要求2所述的方法，其中所述的补骨脂素是8-甲氧基补骨脂素。
4、一制用于治疗慢性HCV感染病人的方法，其中所述病人以前已利用干扰素α治疗过，该方法包含：
a)将一种可光活化的化合物施用到病人的血液中；以及
b)利用一种其波长适于活化所述可光活化的化合物的光处理在步骤a)中所述病人的至少一部分血液，并将经处理的血液送回到所述病人身上。
5、如权利要求4所述的方法，其中所述的可光活化的化合物是补骨脂素。
6、如权利要求5所述的方法，其中所述的补骨脂素是8-甲氧基补骨脂素。
7、一种用于治疗慢性HCV感染的病人的方法，包括：
a)干扰素α施用给所述病人；
b)一种可光活化的化合物施用到病人的血液中；以及
c)利用一种其波长适于活化所述可光活化的化合物的光处理步骤b)的所述病人的至少一部分血液，并将经处理的血液送回到所述病人。
8、如权利要求7所述的方法，其中所述可光活化的化合物是补骨脂素。
9、如权利要求8所述的方法，其中所述补骨脂素是8-甲氧基补骨脂素。
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