JPH02501534A

JPH02501534A - 細胞表面決定基の発現および機能を選択的に調節する方法およびこれによりつくられる新規な人間細胞の産生

Info

Publication number: JPH02501534A
Application number: JP63507944A
Authority: JP
Inventors: バンデンバーク・アーサー・アレン; オフナー・ハリナ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-09-22
Filing date: 1988-09-16
Publication date: 1990-05-31
Also published as: EP0331716A1; AU2523888A; WO1989002918A1; EP0331716A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１４、前記ガングリオシド組成物を七ノーシアレーテッドガングリオシド、ジー　シアレーテッド　ガングリオシド、トリーシアレーテッド　ガングリオシド、テトラ−シアレーテッド　ガングリオシド、修飾ガングリオシドおよびその混合物からなる群から選択した請求項１２記載のヒト細胞。

１５、前記ＣＤ４紺胞表面決定基を他の細胞表面決定基の発現に影響を及ぼさないで選択調節した請求項１２記載のヒト細胞。

１６、７−ヘルパー細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。

１７、ヒト上皮細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。

１８、大食細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。

１９、脳ダリア細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。

２０、　ＣＤ４紺胞表面決定基に対する結合を介してヒト細胞に感染するウィルスによって人間が感染するのを抑制するガングリオシド組成物を含む化学薬品の使用方法。

２１、前記ウィルスがヒト免疫不全ウィルスである請求項２゜記載の方法。

２２、前記ガングリオシド組成物をモノ−シアレーテッドガングリオシド、ジー　シアレーテッド　ガングリオシド、トリーシアレーテッド　ガングリオシド、テトラ−シアレーテッド　ガングリオシド、修飾ガングリオシドおよびその混合物からなる群から選択する請求項２ｏ記叙の方法。

２３、前記ガングリオシド組成物を人間の皮膚に局所的に与えて前記ウィルスによって更に感染するのを抑制する請求項２０記戦の方法。

２４、前記ガングリオシド組成物をヒト細胞に局所的に与えて前記ウィルスによる感染を予防的に抑制する請求項２゜記載の方法。

２５、前記ヒト細胞がヒト上皮細胞を含む請求項２ｏ記載の方２６、前記ＣＤ４紺胞表面決定基の前記選択調節を他の細胞表面決定基の発現に影響を及ぼさずに行う請求項２０記載の方法。

２７、ガングリオシド組成物を前記ヒト細胞における前記ＣＤ４紺胞表面決定基の再発現を抑制するのに十分なレベルで与えることによって前記選択調節を維持する段階を含む請求項２０記載の方法。

２８、前記ガングリオシド組成物の添加を停止し、ＣＤ４発現に依存する細胞機能を回収して前記ヒト細胞における前記ＣＤ４　ｍ胞表面決定基に再発現を生じさせる段階を含む請求項２０記載の方法。

２９、前記ヒト細胞における前記ＣＤ４紺胞表面決定基を再発現する段階をガングリオシド組成物の前記添加を停止した後２４時間以内に実質的に完了させる請求項２０記載の方法。

３０、　ＣＤ４細胞−表面決定基を有するヒト細胞のウィルス感染を抑制する方法において、ガングリオシド組成物を与え：前記ヒト細胞を前記ＣＤ４細胞−表面決定基の発現を選択的に調節するのに十分な量の前記ガングリオシド組成物で処置し、これにより前記ウィルスに対する前記調節したヒト細胞の感染性を抑制することを特徴とするヒト細胞のウィルス感染を抑制する方法。

３１、ガングリオシド組成物を前記ヒト細胞における前記ＣＤ４紺胞表面決定基の再発現を抑制するのに十分なレベルで与えることによって前記選択調節を維持する段階を含む請求項３０記載の方法。

３２、前記ガングリオシド組成物の添加を停止し、ＣＤ４発現に依存する細胞機能を回収して前記ヒト細胞における前記ＣＤ４　ｌｉｔ胞表面表面決定基発現を生じさせる段階を含む請求項３０記載の方法。

３３、前記ヒト細胞における前記ＣＤ４紺胞表面決定基を再発現する段階をガングリオシド組成物の前記添加を停止した後２４時間以内に実質的に完了させる請求項３０記載の方法。

３４、前記ＣＤ４紺胞表面決定基の前記選択調節を他の細胞表面決定基の発現に影響を及ぼさずに行う請求項３０記載の方法。

３５、前記ウィルスがヒト免疫不全ウィルスを含む請求項３０記戦の方法。

３６、　ＣＤ４紺胞−表面決定基に対する結合を介してヒト細胞に感染する人間のウィルスによる感染を治療する方法に、おいて、ヒト血液細胞を患者から試験管内で分離し：前記ＣＤ４細胞−表面細胞決定基の発現および機能を選択的に調節することによってヒト細胞からＣＤ４１！Ｉ胞− 表面決定基の選択消失を誘導することのできるガングリオシド組成物を含む化学薬剤で前記分離したヒト血液細胞を処理し、これにより前記ウィルスによる前記ヒト血液細胞の受容性を選択的に抑制し；および前記ＣＤ４−’Ｊ節ヒト血液細胞を前記患者に再注入することを特徴とする人間のウィルス感染治療方法。

明　細　書細胞表面決定基の発現および機能を選択的に調節する方法およびこれによりつくられる新規な人間細胞の産生背景技術本発明は一般にヒト細胞表面決定基の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）および機能を選択的に調節する方法およびこの方法により産生される新規な選択的に調節されたヒト細胞に関するものである。特定のヒト細胞表面決定基の発現および機能を選択的に調節することにより、成るヒト細胞は順次緩和剤から保護されこれによりもとのまま維持され有効に機能することができる。

人間の免疫系は、機能している場合には、ビールス、バクテリア、寄生虫等を含む病原体から身体を保護する。これ等の病原体または身体の免疫系により異種として認められるほかの物質（抗原）と戦う個人の能力は健康および生存に絶対的である。普通の環境下、免疫系は大部分の伝染病を含むことができ、従って完全な回復が゛可能である。しかし免疫系が不適当である場合には、ひどい感染を受けることがある。

全血細胞、大食細胞およびリンパ細胞の２４種類が最初に免疫に応答する。大食細胞が病原体を消化し破壊し、次いでリンパ細胞にこれ等の病原体について構造上の情報を示す、リンパ細胞は２つの一般的種類にわけられる。一つの種類のリンパ細胞、Ｂ細胞は病原体に応答して抗体を産生ずる。抗体は個々の抗原の顕著な構造上の特徴を認める独特の結合位置を有する。抗体分子が抗原に結合する場合には、相互作用が異種物質の作用を中和し得る事象の鎖（ａｃｈａｉｎ　ｏｆ　ｅｖｅｎｔｓ　）を動かす、他の種類のリンパ細胞、Ｔ細胞は大食細胞により生ずる個々の抗原構造を認める独特の膜リセブタを産生ずる。Ｔ細胞が抗原と相互作用する場合、種々のホルモン（リンホカイン）が遊離しこれ等が炎症を誘発し、Ｂ細胞による抗体の形成を拡大または抑制するか、或いは腫瘍の如き異′＃Ｊ細胞または移植した器官を直接破壊する。

Ｔ細胞、Ｂ細胞と大食細胞との間の相互作用は伝染病に対する人間の応答の強さおよび深さを決定する。一般にこれ等の免疫細胞の活性はリンホカインおよびモノカイン（ｍｏｎｏｋｉｎｅ）　（大食細胞ホルモン）により、広範囲に、制御されると考えられる。多くの異なるリンホカインおよびモノカインがあり、これ等のそれぞれは独特の化学的および機能的性質を有する。「ザ　ＣＤ４モレキュール：ファンクション・アンド・ストラフチャーｊと題するダルブレラシュ、ニー・ジーによるザ・ジャーナル・エンタイトルド・イミュノロジー・トーキヨウ、第７巻、第１４２頁（１９８６）の論文において、一般に特定の細胞表面決定基、即ちＣＤ４分子はクラス■主組織適合性（１１Ｈｃ　）抗原により制限される抗原識別後、種々の調節およびエフェクター作用を実施する成熟したＴリンパ球のサブポピュレーシッンを規定すると記載されている。　ＣＤ４細胞表面決定基の混乱はまた明らかにＴ細胞へ負の信号を伝えＴ細胞機能を遮断する作用をし得る。バンク、アイ等「パーターベーシッン・オプ・ザ・Ｔ−４・モレキュラー・トランスミッッ・ア・ネガティブ・シグナル・ツー・Ｔ−セルス」ジャーナル・オプ・エクスペリメンタル・メトシン、第１６２巻、第１２９４頁（１９８５）参照。

ガングリオシドはオリゴ糖鎖上の１個以上のシアル酸単位の存在により特徴づけられる種々のグループのグリコスフィンゴ脂質である。ガングリオシドはＴ細胞の増殖および機能を抑制することが見出された。このことは次の論文：シングル、イー・イー等、「インヒビジョン・オプ・レクチン−インシュースト・ミトゲニック・レスポンス・オプ・チモサイッ・パイ・グリコリヒッズ」キャンサー・リサーチ・第３９巻、第８１７頁（１９７９）およびライスラー、アール・エル、等「レギュレーション・オブ・リンホカイン・レスボンシズ・パイ・ヒユーマン・ガングリオシズ：キャラクタリスチックス・オプ・インヒビトリー・エフェクタ・アンド・ジ・インダクション・オブ・インペアード・アクチベーション」ザ・ジャーナル・オプ・イミュノロジー、第１２５巻、第２１０６頁（１９８０）で提案された。またガングリオシドは起脳炎活性を抑制しＴ−ヘルパー細胞表現型の発現に影響することが報告されている。ガングリオシドは試験管内でＢＰ −１ラツトのＴ−ヘルパー細胞ラインでＷ３／２５モノクロナール抗体の蛍光染色を抑制することが見出された。

この抑制作用は、−３／１３　（Ｔ−）−タル）　、０Ｘ−８（Ｔ−ノン−ヘルパー）または０Ｘ−（Ｉａ）抗体で染色した細胞により示されなかった。オフナー、エッチ、およびニー、ニー、バンデンバーグ、「ガングリオシドズ・インヒビト・フェノタイピック・アンド・ファンクシヨナル・プロパーティーズ・オブ・アン・エンセファリドジェニック・Ｔ−ヘルパー・リンホサイト・ライン」セルニラ−・イミュノロジー、第９５巻、第８４頁（１９８５）参照。

共有結合したガングリオシドを含む多糖類誘導体の可溶カラムが米国特許第４．１２５．４９２号においてクロマトグラフされた試料のコレラトキシンを定量的に吸収するために使用された。米国特許第４．４６４．３６０号において成る種グリコスフィック脂質が人間の尿道上皮細胞にバクテリアの付着するのを抑制するため医薬調剤に使用された。最後に、米国特許第４．４７６、１１９号；同第４．５９３，０９１号および同第４．６３９゜４３７号はガングリオシド分子内エステル誘導体の製造方法、医薬組成物におけるその使用並びに神経発芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　）を刺戟することにより神経の再生を促進するため、かかるガングリオシドを含む吸入キットを提供する方法に関する。

人間において生物学的に活性な物質の極めて重要な性質はその識別能力、即ち所定の細胞表面決定基の発現および機能を選択的に調整する能力である。従ってこの性質により免疫保護に関連する未調節ヒト細胞のすべてを普通の必要な方法で増殖し作用させることができる。抗体は特定のヒト細胞の特定細胞表面決定基に選択的に結合する識別体である。然し、この識別選択結合の所定細胞に対する作用効果は予期することができず、この目的のための基準で実験を介して決定しなければならない。

他方、医薬等の如き化学薬品組成物は差別されず多くの種類のヒト細胞に影響を及ぼし得る０例えばメチルトレキセート（ｓｅｔｈｙｌｔｒｅｘａｔｅ　）　、癌治療用化学療法剤の如き化学薬品組成物はすべての活性に分割されるヒト細胞の増殖を抑制することにより作用する。この化学薬品は選択的でないので、悪性および非悪性細胞の破壊の差別がない、従って、２、速に分割される細胞を含む必要な人間の多くの機能（例えば免疫系）はこの化学療法剤による処置の結果として役に立たなくなる。

従って、特定のヒト細胞の特定の細胞表面決定基を調節してかかるヒト細胞の作用能力を破壊することなくヒト細胞の感染を防止するため化学薬品組成物の性能で差別され選択される化学薬品組成物が必要とされる。

発明の開示本発明は、ヒト細胞上の特定の細胞表面決定基、即ちＣＤ４分子の発現を化学薬剤により選択的に調節することにより人間における感染を抑制する方法に関する。ヘルパー下リンパ球のＣＤ４　（Ｔ４）抗原はエイズ　レトロウィルスに対するリセプターの必須成分であると考えられる。ダルグリッシュ、ニー、ジー等「ザ・ＣＤ４　（Ｔ４）　・アンチゲン・オブ・ザ・リセプター・フォア・ジ・エイズ・レトロウィルスノ」ネイチャー、第３１２巻、第７６３頁（１９８４）参照。

この化学薬剤は人間細胞からＣＤ４細胞表面決定基の急速で且つ選択的消失を誘導するガングリオシド組成物である。

このガングリオシド組成物による治療後ヒト細胞は、細胞表面ＣＤ４分子を発現せず、即ち、普通エイズとして知られている後天的免疫不全症候群を生ずるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ　）を含むウィルス、またはＣＤ４細胞表面分子を介してターゲット細胞を感染する、レトロウィルスの如き他のウィルスによる受容性（感染）を選択的に抑制する。

免疫Ｔリンパ球および大食細胞は伝染病に対する保護に重要な役割をはたす、　ＨＩＶの如き成る種ウィルスは細胞表面にＣＤ４分子を有するこれらの型の細胞を選択的に攻撃する。これ等のＴリンパ球および大食細胞が旧Ｖの感染後攻撃され破壊される場合、全体の免疫不全が生じ、二次感染により重い合併症および死に導く、このようにして、ガングリオシドによる旧Ｖ感染の予防および有効なＴ大食細胞応答の維持がエイズにおける普及した予防および治療の可能性を有する。

ＨＩＶをＣＤ４細胞表面決定基との相互作用前に抑制することによりエイズによる健康の危険を克服する試みが研究者によりなされてきた。更に、他の科学者はＣＤ４受容機構をブロックして旧Ｖがこれと結合しないようにすることにより問題を解決しようと試みた。今日まで、これ等の試みは結果もむなしく、伝染病は阻止されぬままである。

今回ＣＤ４細胞表面決定基の発現および機能を選択的に調節し、ヒト細胞からＣＤ４細胞表面決定基の急速且つ選択的消失を誘導するガングリオシド組成物を使用することにより、ＣＤ４細胞表面決定基を介してヒト細胞に感染するウィルス、例えばＦＩＩＶに対するＴ−ヘルパー細胞への付着する点および入口が排除され、これ等のヒト細胞の受容性が、他の細胞表面決定基を抑制することなく、抑制されることを見出した。

選択的に調節されたＣＤ４細胞表面決定基を含むヒト細胞はガングリオシド組成物で調節されるヒト細胞を含む、これ等の細胞は細胞表面からＣＤ４細胞表面決定基の不存在により容易に同定される。これ等の選択的に調節したヒト細胞は、人間における感染、特に旧Ｖによる感染を抑制するのに有効である。

本発明の目的のため、「ガングリオシド」と称するのは、脂質（セラミド）、または化学的に変性した脂質、およびシアレーテッド（ｓｉａｌａｔｅｄ）オリゴ糖または化学的に変性したシアレーテッドオリゴ糖をそれぞれ含む任意の化合物を意味するものとする。ＣＤ４−調節したヒト細胞を産生ずるのに使用するガングリオシド組成物はモノ−シアレーテッド　ガングリオシド、ジ−シアレーテッド　ガングリオシド、トリーシアレーテッド　ガングリオシド、テトラ−シアレーテッド　ガングリオシド、変性ガングリオシドおよびこれ等の混合物から成る群から選定すのるが好ましい。

ヒト細胞の選択的調節はガングリオシド組成物に対する血清の中性作用を防止するため著しく低い血清濃度の環境下で行うのが好ましい、従って、有効濃度のガングリオシド組成物を添加してかかる血清の中和を克服する。

ＣＤ４細胞表面決定基の調節の選択性は、他の細胞表面決定基の発現および機能なしに行われる。この方法で任意の他の決定基の望ましい有効な作用を危険にさらせることなく　ＣＤ４細胞表面決定基の受容性を抑制することができる。

本発明における選択的調節は有効量の上記ガングリオシド組成物をヒト細胞上の上記ＣＤ４細胞表面決定基の再現を防止するのに十分な量で供給することにより維持することができる。従って、使用者が必要であると考える場合には、ガングリオシド添加工程を続けることができる。然し、使用者が望む場合には、上記ガングリオシド組成物の添加をやめることができこれにより上記ヒト細胞上の上記ＣＤ４細胞表面決定基が再現される。このことにより使用者は必要な場合にＣＤ４分子の受容性を再発現することができかかる受容性をウィルスにより回避する必要がある場合にはこれを調節することができる。このことによりＣＤ４発現に依存する細胞作用の回復が行われる。ガングリオシドの添加が終了する場合には、上記ヒト細胞上の上記ＣＤ４細胞表面決定基の再発現は代表的には上記ガングリオシド組成物の添加が終了した後２４時間以内でほとんど完成される。

本発明の好適例においては、ガングリオシド組成物を局所的に人間の皮膚、特に膣および直腸領域に投与してウィルスによるＣＤ４の正の上皮細胞の感染を防止する。代表的にかかる局所的投与はヒト細胞に予防として行いこれによりウィルスの感染を防止する。

本発明の前記のおよび他の目的、特徴および利点は実施例に関して行う具体例の詳細な次の記載から更に容易に明らかになる。

好適例の詳細な記載本発明は選択的に調節したＣＤ４紺胞細胞決定基を含むヒト細胞およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ　）による人間における感染を抑制する方法に関する。

主題のヒト細胞をヒト細胞からＣＤ４細胞表面決定基の急速且つ選択的消失を誘導し得るガングリオシド組成物で選択的に調節する。この方法で、ヒト免疫不全ウィルスに対する調節したヒト細胞の受容性は選択的に抑制される。

裏庭■よガングリオシド組成物を含む化学薬剤を使用するヒト細胞におけるＣＤ４細胞表面決定基の発現および機能の選択的抑制および消失を実験的に証明した。

ヒトＴリンパ球細胞を混合ガングリオシドの種々の濃度で培養した。混合ガングリオシド組成物は２１％のＭＧ、（モノ−シアレーテッド　ガングリオシド）、４０％のＧＤ、、　（ジ−シアレーテッド　ガングリオシド）、１６％のＧＪｂ　（）リーシアレーテッド　ガングリオシド）、および１９％のＧＴ、ｂ（テトラ−シアレーテッド　ガングリオシド）を含み、１７５６ダルトンの平均分子量を有した。本例で使用した抗ＣＤ４抗体はＬｅｕ　３ａであった。ＣＤ３抗体（Ｌｅｕ　４　）も試験した。

染色した細胞集団の平均蛍光強度（＋’ｌＦＩ　）を使用したガングリオシド組成物の各濃度で評価することにより、ガングリオシドの必要量を定量して蛍光の５０％抑制（■ｓ。値）を産生ずることが可能である。ヒトＴ−リンパ球に対する■、。

値は５ａＭであった。　ＭＦＩを０％に低減する即ちＣＤ４細胞表面決定基の完全な選択的調節および消失を行うためのガングリオシドの濃度もまた実験的に決定した。

更に特に、人間の血液細胞を塩水または種々の濃度の混合ガングリオシドで血清の不存在下３７℃で１時間培養した。

細胞を２回洗浄し、最適濃度（予め決定する）の種々のモノクロナール抗体およびフルオレセイン標識したヤギ抗マウス第二抗体（ｇｏａｔ　ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ　５ｅｃｏｎｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）で染色し、再び洗浄し１％ホルマリン中で固定し、オルト　システムス５０シトフルオログラフを用い４８８ｎｍレーザー光で励起した後ＤＩの分析をした。モノクロナール抗体を正角（ｆｏｒｗａｒｄ　ａｎｇｌｅ　）および直角散乱に基づきゲートし、染色した細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ　）を１０，０００個のヒト細胞のシトグラム（ｃｙｔｏｇｒａｓ）から決定した。ガングリオシド処置した細胞のＭＦＩを未処置細胞のＭＦＩ　と比較しＣＤ４発現の抑制割合を第２抗体で染色した細胞のＭＦＩを減じた後きめた。細胞表面抗体染色のガングリオシド抑制を次式により計算した。

上記値を混合ガングリオシドに対し２　ｕｇ＋　５　ｕｇ＋　１０ｕｇ。

２０ｕｇおよび５０ｕｇの濃度で夫々計算した。第１表に示す如く、濃度値をプロットし■、。値を最も適合した線から補間した。

■、。はＭＦ１チャンネルを５０％減するガングリオシド濃度と定義される。この滴定曲線を基にして、■、。＝７．ａｕｇ／ｍｌ！（４，９ａＭ　）。

」」ヨ良２Ｌｅｕ　３ａ　（ＣＤ４）　ｉｏ。

Ｌｅｕ　４　（ＣＤ３）　１００５　Ｌｅｕ　３ａ　（ＣＤ４）　８０Ｌｅｕ　４　（ＣＤ３）　１００１０　Ｌｅｕ　３ａ　（ＣＤ４）　２８Ｌｅｕ　４　（ＣＤ３）　１００２０　Ｌｅｕ　３ａ　（ＣＤ４）　５Ｌｅｕ　４　（ＣＤ３）　１００第１表からガングリオシドを５０ｕｇの濃度まで添加することによりＭＦＩが試験した人間Ｔ−ヘルパー細胞上のＣＤ４細胞表面決定基が消失し従って調節されたことを示すこと力く全く明らかである。従って旧Ｖ　（ニーズウィルス）の受容性に対する位置が抑制された。

選択的に調節すべきヒト細胞上のＣＤ４細胞表面の発現のために、ＣＤ４は同じヒト細胞上のＣＤ３細胞表面の発現および機能に影響を及ぼすことなく、前記の如く、消失に導力１れる。このことは表１に示されておりガングリオシドで処置した細胞は他のＴ細胞メンバー（Ｌｅｕ　４モノクロナ一ル抗体により規定される）に比較して抗体で染色する場合蛍光強度を変えない。

１隻■叉ガングリオシド組成物で処置することによりＣＤ４細胞決定基の発現の調節の高い選択性を実験的に証明した。

下記第２表に示す如く、ガングリオシド組成物はと）Ｔ細胞上のＣＤ４細胞表面決定基の発現の選択性損失を導くが、第２表に示す特定のモノクロナール抗体により認められる如くあらゆる他のヒト細胞決定基の表現型に影響を及ぼさなかった。ガングリオシド予備処理はヒトＴ細胞上のＣＤ４分子に特有の９つの異なるモノクロナール抗体により検出される染色にほぼ同様に影響を及ぼした。

実験的に人間の血液細胞を塩水中でまたは種々の濃度の混合ガングリオシド中で実施例１に記載した方法と同様の方法で培養した。塩水予備処置した対照例に対してガングリオシド予備処置した後ＭＦＩが９５％減する抗体特異性は有効なガングリオシド予備処置とみなした。前述の如く、第２表に挿入されているＩ、。

値はＭＦＩが５０％低減するガングリオシドの濃度を示す。ガングリオシド予備処置により影響されなかった抗体特異性は３００ｕＭのガングリオシドで予備培養した場合１０％以下の肝Ｔ［少を示した。

男」Ｌ支Ｌｅｕ　３ａ　（４，９）　Ｌｅｕ　４．　ＯＫＴ　３．　５３３．　Ｔ２８Ｌｅｕ　３ｂ　（６，０）　Ｅロセ・　ト　レセプ　−に・し：ＯＫＴ　４　（４，８）　Ｌｅｕ　５０ＫＴ　４ａ　（４，９）　Ｔ−サブレ・サー　に・し二〇ＫＴ　４ｂ　（５，３）　Ｌｅｕ　２．　ＯＫＴ　８０ＫＴ　４ｃ　（４，２）　ν月１１５Ｌ引し二ＯＫＴ　４ｄ　（４，９）　Ｌｅｕ　７．　Ｌｅｕ　１１０ＫＴ　４ｅ　（４，９）　Ｂ二　！：：　１Ｌ　上ＯＫ７４ｆ　（４，６）　ＯＫ　Ｂ７．　Ｋ十り、Ｉｇ第２表のデータに基づいて、ＣＤ４細胞表面決定基が人間Ｔ−ヘルパー細胞から除去されたが、この理由は特に人間細胞上のＣＤ４決定基を検出するすべてのモノクロナール抗体が殆ど抑制されたからである。他方、ＣＤ４と異なる細胞表面決定基はガングリオシドによる処置により影響されなかった。従って、ガングリオシドはＣＤ４分子の発現を選択的に調節するが一方他の細胞表面分子の発現に影響をもたなかった。更に、Ｔ−ヘルパーのガングリオシド処置は他の細胞表面分子の発現に影響を及ぼすことな（ＣＤ４細胞表面決定基の選択的損失をまねいた（第１表参照）。同様の方法で、ＣＤ４以外の細胞表面決定基に特有の抗体により同定されるＴ細胞および他の型の細胞上の種々の他の決定基はガングリオシド処理により影響されなかった（第２表参照）。従ってガングリオシドはヒト細胞上のＣＤ４分子の選択的調節を導いた。

ヒト細胞上のＣＤ４細胞表面決定基の発現および機能の選択的調節は存在する血清の中和作用を克服するのに十分なガングリオシド組成物の存在下で導かれた。

一つの方法は先づ血清を中和し次いでまたＣＤ４細胞表面決定基を選択的に調節する分量のガングリオシドを添加することである。

他の方法はヒト細胞の選択的調節が著しく低い血清濃度の領域に導かれることである。例えばこの血清レベルを約５容量％以下に維持した場合には、選択的調節が影響された。

選択的調節法を殆んど血清が不存在下で行った場合ＣＤ４発現の１００％の抑制があったことは明らかでありこの場合一層低い濃度のガングリオシドを使用してヒト細胞を処置した。　ＣＤ４細胞表面決定基の発現および機能を選択的に調節する方法は一般にＣＤ４を発現するすべての細胞に広がるが、選択的調節に好ましいヒト細胞はＴ−ヘルパー細胞、上皮細胞、大食細胞および脳、グリアル細胞を夫々含む。

裏施訳主Ｃ１１４細胞表面決定基を選択的に調節するのに、ガングリオシド組成物の個々の成分でない、ガングリオシド組成物の使用について実験的に確かめた。

ガングリオシド構造の成分がＣＤ４発現の損失を誘導するために必要とされることを評価するために、Ｔ−ヘルパ細胞を異なる濃度の混合ガングリオシド、個々の精製ガングリオシド、変性ガングリオシド、およびガングリオシド成分、すなわち、個々の脂質、オリゴ糖、およびシアリン酸部分と温間した。

ＣＤ４細胞−表面決定基の発現におけるガングリオシドおよびガングリオシド成分の活性を調べた。この結果を第３表に示す。リンパ球集団（１０６＃＋＋ｊりを抗−ＣＤ４または対照抗体およびフルオレセイン標識第二抗体で染色する前に、ガングリオシド組成物、またはガングリオシド成分の種々の希釈度により３７ °Ｃで１時間にわたって予備処理した。使用した染色手順は実施例１において用いた手順と同様に行った。

茅−」Ｌ−表混合ガングリオシド８５ＧＭＩ（七ノーシアレーテッド）　６ＧＤ、（ジ−シアレーテッド）　７ＧＴ＋ｂ（）リー　シアレーテッド）　４ＧＱ＋ｂ（テトラ−シアレーテッド）　６ガラクトセレブロシド　非抑制セラミド　非抑制アシアロガングリオシド　非抑制シアル酸　非抑制オリゴ糖（誘導ガングリオシド）　非抑制修飾ガングリオシド（シアル酸と第２ＩＮ（２ｎａｓｕｇｅｒ）とのエステル化）１００本２１％ＧＭ＋、４０％ＧＤ、、　、　１６％ＤＧ＋ｂ　、および１９％ＧＴ＋ｂを含有する。

第３表において、混合ガングリオシドおよび異なるシアル酸部分を有する個々のガングリオシド組成物は類似する■、。値を有していた。ヒトＴ細胞のＣＤ４発現のガングリオシド調節はそれぞれのセラミド、オリゴ糖およびシアル酸部分を必要とした。炭水化物部分の内部エステル化によるガングリオシドの修飾はヒトＴ細胞におけるガングリオシド作用を減少した。分離した個々のセラミド、オリゴ塘、および／またはシアル酸化合物は抑制活性を有していなかった。また、シアル酸を含まないアシアロガングリオシドおよびガラクトセレブロシドが抑制活性を有していないことから、ガングリオシドを他のグリコスフィンゴ脂質と識別するシアル酸はＣＤ４　ｍ節について必要な成分である。

また、本発明の方法はＣＤ４細胞−表面決定基の再発現、すなわち、ヒト細胞におけるＣＤ４細胞−表面決定基の再現を抑制するのに十分なレベルで得られた付加量のガングリオシド組成物の形態で継続使用することによって上述する選択調節を維持する段階を含んでいる。

裏施■土（ａ）ヒトＴ細胞をガングリオシド組成物で連続処理することによって、ヒト細胞におけるＣＤ４細胞決定基の再発現が抑制されたことを確めた。

上記再発現の抑制を調べるために行った試験において、Ｔ−ヘルパ細胞を４時間、２４時間および４８時間後に洗浄し、アリコートを染色するために除去した後、残留細胞を６７ｎＭのガングリオシドに再懸濁した。この結果、ガングリオシドの連続使用および存在することによってＣＤ４発現が１００％抑制した。

（ｂ）また、ガングリオシドによる調節後、ＣＤ４細胞−表面決定基がガングリオシド除去後２４時間以内に細胞表面に再現したことから、ガングリオシド予備処理がＣＤ４細胞決定基により細胞に毒性を与えないことを試験的に確かめた。

ガングリオシド組成物の連続添加を、ヒト細胞におけるＣＤ４細胞決定基の再発現の生成によって停止した。一連の試験において、ヒト細胞を実施例１に記載する手順に従って処理し、抑制率を種々の時間において測定した。

これらの結果は、第４表に示すようにガングリオシド除去してから２４時間後に抑制率が１００％から９％に低下した。

ＨＩＶウィルスで感染する患者を医学的に治療する１方法を、本発明により患者の細胞におけるＣＤ４細胞−表面決定基の調節によって行い、次いで調節細胞を患者に再注入した０例えば、「ザ　ニュー　イングランド　ジャーナルオプ　メディシン（Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｔｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）ＪＶｏｌ、３１３．　Ｎａ２３．ページ１４８５〜１４９２に掲載されている医師スティーフ゛ン　ニー、ローゼンベルク氏ほかによる題目「転移癌を存する患者に対する自己リンフ才力イン活性化キラー細胞および組換え体インターロイキン−２の系統的投与による観察」の特定レポートには、白血球＆出、リンパ球採収および培養、インターロイキン−２処理、およびＬＡＮ細胞および組換え体インターロイキン−２の投与を含む方法が記載されている。特に１４８６〜７ページに記載されているこの方法は、上述するｉｎν１ｔｒｏＪ節を行うのに通用することができる。

例えば、ヒト免疫不全ウィルスで感染した患者の治療方法は白血球搬出およびリンパ球採収および培養のそれぞれにおけるように患者からヒト血液細胞を試験管中に分離する第１段階を含んでいる０次いで、分離ヒト血液細胞を、上記ＣＤ４細胞−表面決定基の発現および機能を選択的に調節することによってヒト細胞から上記ＣＤ４紺胞−表面決定基を選択的に消失することのできるガングリオシド組成物からなる化学薬品で処理し、これによりローゼンベルク氏はかにより記載された白血球搬出手順を用いてウィルスによるヒト血液細胞の感染性を選択的に抑制した。最後に、ＣＤ４調節ヒト血液細胞を患者に注入した。

特に、代表的な白血球搬出手順は次のように行うことができる：多量のリンパ球および大食細胞（１処理当り５Ｘ１０”〜５Ｘ１０”）を連続フロー細胞分離器による反復リンパ球搬出によって採収した。酸−クエン酸塩−デキストロースを採集処理中、抗凝血物質として用い、付加ヘパリンを語頭音消失（ａｐｈｅｒｅｉｓ）時に採集バッグに添加した。各白血球搬送バックの最終容量は３００〜４００　ｄであり、このバッグをツェナツル（Ｐｅｎｗａｌ）輸送バッグに画集した６次いで、単核細胞をフィコルーヒバキュ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配を用いて好中球（ｎｅｕｔｒａｐｈｉｌｓ）および赤血球から分離した０分離したリンパ球を集め、２回洗浄し、１２回転びんにおいて付加血清を存在しない７５ｕＭ混合ガングリオシド、およびペニシリン、ストレプトマイシン　サルフェート、グルタミンおよびゲンナマイシン　サルフェートを含有するハンクス平衡塩類溶液に１−１．５　Ｘｌ０−細胞／１１１の濃度で再懸濁した。細胞を１時間０．５〜１回転／分で連続回転しながら温置した。細胞のアリコートをＣＤ３およびＣＤ４に対する抗体で染色するために除去してＣＤ４発現におけるガングリオシド作用を確かめた。ガングリオシド処理細胞を１１びんにおいて５１０Ｘｇで１５分間にわたり遠心し、ペレットを２５０−遠心分離管にプールし、カルシウム、マグネシウム、またはフェノール　レッドを含まないハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、細胞を１％ヒト血清アルブミンを含有する０、９％塩化ナトリウム２００Ｉｄを含む注入媒体に再懸濁した。最終細胞懸濁物を滅菌ナイテックス（Ｎｙｔｅｘ）を通して濾過した。ガングリオシド処理細胞を中心静脈カテーテルを介してまたは大末梢静脈に静脈内投与した。約１０”個の細胞を最初に注入し、残部を約２０分経過後５分間に注入した。いずれの場合も５分間ゆるやかにかきまぜた。注入ラインにはフィルターを使用しなかった。

２隻■エヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）によるＣＤ４陽性標的細胞の感染の抑制にガングリオシドを用いることを試験的に確かめた。

ガングリオシドが）ＩＩＶ感染を抑制できることを証明するために、Ｈ９またはＣＥ？＋標的細胞を旧Ｖ感染培養物からの１０％旧Ｖ感染細胞または上澄み液とガングリオシドの存在させまたは存在させないで温置した。　ＨＩＶ感染を拡大した後、アリコートの感染細胞および対照細胞を毎日数え、■Ｖ感染の結果として発現する匪抗原に対して特異な単クローン性抗体で染色した。この分子がガングリオシドで調節した場合に、他のアリコートの細胞を抗−ＣＤ４抗体で染色した。

各アリコートからの１０００個の細胞を実施例１に記載するように流動細胞計測法により評価して匪抗原およびＣＤ４の蛍光強度のレベルを調べた。

次の第５表には６個の類似試料を示している。ガングリオシドは感染培養上澄み液として添加したＣＤ４０発現および旧ＶによるＨ９標的細胞の感染を完全に抑制した。ガングリオシドを存在させない場合には、旧Ｖｌ！ｌ抗原の発現が感染後４日までに７％〜１１％確認できるように増加し、６日目に６４％の最大１１合に達し、８日までに３８％に減少した。

５０ｎＭ混合ガングリオシドを存在させる場合には、旧Ｖ発現が３日目で３％だけ、４日目で１１％、６日目で２７％（対照物より５８％以下）、および８日目で１３％（対照物より６６％以下）であった。感染投与量の旧Ｖを存在させない場合には、検出された匪抗原の割合はガングリオシドを存在させまたは存在させない場合でも、約３％残留していた（データを示していない）。

メユ」Ｌ−衷上述するように、旧Ｖ感染標的細胞のガングリオシドによる処理はＣＤ４のその発現を軽減するばかりでなく、旧Ｖによるその感染を有意に抑制することを証明している。

上述する好適例において本発明の詳細な説明しおよび記載しているけれども、本発明はかかる原理から逸脱しないかぎり変更を加えることができる。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＣＤ４細胞表面決定基に対する結合を介してヒト細胞に感染するウイルスが人間に感染するのを抑制する方法において、ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基の発現および機能を前記ヒト細胞から前記ＣＤ４細胞表面決定基を急速に且つ選択的に実質的に消失させることのできるガンダリオシド組成物を含む化学薬品で選択的に調節し、これにより前記ウイルスによる前記ヒト細胞の受容性を抑制することを特徴とするウイルス感染を抑制する方法。
２．前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルスを含む請求項１記載の方法。
３．前記ヒト細胞が脳ダリア細胞を含む請求項１記載の方法。
４．前記ヒト細胞がヒトＴ−ヘルパー細胞を含む請求項１記載の方法。
５．前記ヒト細胞がヒト上皮細胞を含む請求項１記載の方法。
６．前記ヒト細胞がヒト大食細胞を含む請求項１記載の方法。
７．前記ＣＤ４細胞表面決定基の前記選択調節を他の細胞表面決定基の発現に影響を及ぼさずに行う請求項１記載の方法。
８．前記ガンダリオシド組成物をモノ−シアレーテッドガングリオシド、ジ、シアレーテッドガングリオシド、トリ−シアレーテッドガングリオシド、テトラ− シアレーテッドガングリオシド、修飾ガンダリオシドおよびその混合物からなる群から選択する請求項１記載の方法。
９．ガンダリオシド組成物を前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基の再発現を抑制するのに十分なレベルで与えることによって前記選択調節を維持する段階を含む請求項１記載の方法。
１０．前記ガンダリオシド組成物の添加を停止し、ＣＤ４発現に依存する細胞機能を回収して前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基に再発現を生じさせる段階を含む請求項９記載の方法。
１１．前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基を再発現する段階をガンダリオシド組成物の前記添加を停止した後２４時間以内に実質的に完了させる請求項１０記載の方法。
１２．ヒト細胞をＣＤ４細胞表面決定基に対する結合を介して感染するウイルスによる感染に通常敏感なＣＤ４細胞表面決定基を含む修飾ヒト細胞において、前記決定基の発現の選択調節を誘導することのできるガンダリオシド組成物で選択的に調節したヒト細胞を含み、これにより前記調節ヒト細胞の前記ウイルスによる感染性を抑制したことを特徴とする修飾ヒト細胞。
１３．前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルスを含む請求項１２記載のヒト細胞。
１４．前記ガンダリオシド組成物をモノ−シアレーテッドガングリオシド、ジ− シアレーテッドガングリオシド、トリ−シアレーテッドガングリオシド、テトラ −シアレーテッドガングリオシド、修飾ガンダリオシドおよびその混合物からなる群から選択した請求項１２記載のヒト細胞。
１５．前記ＣＤ４細胞表面決定基を他の細胞表面決定基の発現に影響を及ぼさないで選択調節した請求項１２記載のヒト細胞。
１６．Ｔ−ヘルパー細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。
１７．ヒト上皮細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。
１８．大食細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。
１９．脳ダリア細胞を含む請求項１２記載のヒト細胞。
２０．ＣＤ４細胞表面決定基に対する結合を介してヒト細胞に感染するウイルスによって人間が感染するのを抑制するガンダリオシド組成物を含む化学薬品の使用方法。
２１．前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項２０記載の方法。
２２．前記ガンダリオシド組成物をモノ−シアレーテッドガングリオシド、ジ− シアレーテッドガングリオシド、トリ−シアレーテッドガングリオシド、テトラ −シアレーテッドガングリオシド、修飾ガンダリオシドおよびその混合物からなる群から選択する請求項２０記載の方法。
２３．前記ガンダリオシド組成物を人間の皮膚に局所的に与えて前記ウイルスによって更に感染するのを抑制する請求項２０記載の方法。
２４．前記ガンダリオシド組成物をヒト細胞に局所的に与えて前記ウイルスによる感染を予防的に抑制する請求項２０記載の方法。
２５．前記ヒト細胞がヒト上皮細胞を含む請求項２０記載の方法。
２６．前記ＣＤ４細胞表面決定基の前記選択調節を他の細胞表面決定基の発現に影響を及ぼさずに行う請求項２０記載の方法。
２７．ガンダリオシド組成物を前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基の再発現を抑制するのに十分なレベルで与えることによって前記選択調節を維持する段階を含む請求項２０記載の方法。
２８．前記ガンダリオシド組成物の添加を停止し、ＣＤ４発現に依存する細胞機能を回収して前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基に再発現を生じさせる段階を含む請求項２０記載の方法。
２９．前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基を再発現する段階をガンダリオシド組成物の前記添加を停止した後２４時間以内に実質的に完了させる請求項２０記載の方法。
３０．ＣＤ４細胞−表面決定基を有するヒト細胞のウイルス感染を抑制する方法において、ガンダリオシド組成物を与え；前記ヒト細胞を前記ＣＤ４細胞−表面決定基の発現を選択的に調節するのに十分な量の前記ガンダリオシド組成物で処置し、これにより前記ウイルスに対する前記調節したヒト細胞の感染性を抑制することを特徴とするヒト細胞のウイルス感染を抑制する方法。
３１．ガンダリオシド組成物を前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基の再発現を抑制するのに十分なレベルで与えることによって前記選択調節を維持する段階を含む請求項３０記載の方法。
３２．前記ガンダリオシド組成物の添加を停止し、ＣＤ４発現に依存する細胞機能を回収して前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基に再発現を生じさせる段階を含む請求項３０記載の方法。
３３．前記ヒト細胞における前記ＣＤ４細胞表面決定基を再発現する段階をガンダリオシド組成物の前記添加を停止した後２４時間以内に実質的に完了させる請求項３０記載の方法。
３４．前記ＣＤ４細胞表面決定基の前記選択調節を他の細胞表面決定基の発現に影響を及ぼさずに行う請求項３０記載の方法。
３５．前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルスを含む請求項３０記載の方法。
３６．ＣＤ４細胞−表面決定基に対する結合を介してヒト細胞に感染する人間のウイルスによる感染を治療する方法に、おいて、ヒト血液細胞を患者から試験管内で分離し：前記ＣＤ４細胞−表面細胞決定基の発現および機能を選択的に調節することによってヒト細胞からＣＤ４細胞−表面決定基の選択消失を誘導することのできるガンダリオシド組成物を含む化学薬剤で前記分離したヒト血液細胞を処理し、これにより前記ウイルスによる前記ヒト血液細胞の受容性を選択的に抑制し；および前記ＣＤ４−調節ヒト血液細胞を前記患者に再注入することを特徴とする人間のウイルス感染治療方法。