JP3463143B2 - 糖鎖認識抗体及びｈｉｖ感染症治療剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な糖鎖認識抗
体、より詳しくはＨＩＶ感染細胞に発現する糖鎖を認識
するＩｇＭに属する抗体及びこれを有効成分とするＨＩ
Ｖ感染症治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＡＩＤＳ（Acquired immunodeficiency
syndrome）は、１９８１年にサンフランシスコにおい
て、ホモセクシャルの男性の致命的な免疫不全症として
初めて発見された（Gottlieb,M.S., Schroff,R., et a
l., N.Engl.J.Med., 305, 1425-1430 (1981)）。その２
年後には、フランスのパスツール研究所のモンタニエの
グループにより、その原因ウイルスが発見された（Barr
e-Sinoussi,F., Chermann,J. C., et al., Science, 22
0, 868-871 (1983)）。１９８５年になり、この原因ウ
イルスは、ＨＩＶ（Human immunodeficiency virus）
（Coffin,J., Haase,A., et al., Science, 232, 697
(1986)）と命名統一された。

【０００３】上記ＡＩＤＳは、セックス、輸血等を介し
てその原因ウイルスであるＨＩＶに感染し、このＨＩＶ
が感染者の免疫機能を破壊し、後天的に免疫系を不完全
なものとし、その結果、下痢症、肺炎等の種々の症候を
発現して宿主を死に至らしめる疾患である。

【０００４】現在、上記ＡＩＤＳの治療剤も多くの研究
者によりその開発が進められており、例えば満屋らによ
るアジドチミジン（ＡＺＴ）の発見（Mitsuya,H., et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 82, 7096 (1985)）以
来、ｄｄＩ（2',3'-dideoxyinosine）やｄｄＣ（2',3'-
dideoxycytidin）等が臨床上で検討されてきているが、
未だ満足な効果を示す薬剤は、開発されるに至っていな
い。

【０００５】ＨＩＶの感染から発症までの期間（潜伏期
間）には、かなりの個人差が認められるが、約５０％の
ヒトは１０年以内に確実に発症し、発症後１〜３年以内
でほぼ全員が死亡する。小児及び４０歳以上では、感染
後の進行は速い。感染から発症までのばらつきの原因と
しては、感染者の全般的な健康状態や遺伝的素因、合併
症、その他の宿主要因や、感染ウイルスの株の違い等が
挙げられる。

【０００６】血液製剤による感染の場合でも、ＨＩＶ感
染者の殆どはＡＩＤＳを発症して死亡するが、感染後１
０数年経った後も発症しない症例や、発症までに長時間
かかる患者も認められる。このような例は、世界的に散
見され、ＨＩＶ感染者の５％位が長期生存すると報告さ
れている。かかるＨＩＶ感染者の中に長期間無症状でい
る、いわゆる長期生存者については、之等がＨＩＶに対
する抵抗性を示したり、発症を予防したりするための機
序を解明する手がかりを与えるのではないかとして注目
され、また之等長期生存者について種々の調査、研究等
が行なわれている。

【０００７】しかしながら、之等長期生存者がＨＩＶに
感染してもＡＩＤＳを発症しない理由については、未だ
充分には解明されておらず、ＨＩＶに対する抵抗性の解
明及び当該理由に基づくＨＩＶ感染症治療剤の開発が望
まれていた。

【０００８】本発明者らも、上記ＨＩＶ感染者の内の発
症する症例と発症しない症例との相違につき、種々検討
を重ね、その過程において、一部の感染者が有するある
種の糖鎖に対する自然抗体のうちＩｇＭが、上記発症に
関与することを見いだした。即ち、この抗原となる糖鎖
は、普段は体内に微量しか存在しないか又は全く存在し
ないと考えられるが、ＨＩＶ感染細胞では、この糖鎖が
Ｔ細胞又はマクロファージの表面に出現する（一般に、
細胞がウイルスに感染したり、腫瘍化すると特殊な糖鎖
が細胞表面に発現することはよく知られている）。

【０００９】この糖鎖に対するＩｇＭに属する抗体が、
自然抗体として血清中に存在する場合には、該抗体がＨ
ＩＶ感染細胞を認識してこれと結合し、この反応に、局
所で活性化された補体成分が関与して、上記ＨＩＶ感染
細胞が溶解され、かくして上記自然抗体ＩｇＭを有する
血清はＨＩＶ感染細胞が増殖しにくい環境を成立させる
ことを見いだした。更に、上記ＨＩＶ感染細胞は、補体
感受性が高まっていることも見いだした。之等の事実
は、インビトロ(in vitro)で確認されると共に、ＨＩＶ
に感染しながらも長期生存している感染者が実際にこの
ＨＩＶ感染細胞に反応性を有するＩｇＭに属する抗体を
保持することからも確認された。

【００１０】また、通常補体に対して抵抗性を有する細
胞は、これにガングリオテトラオース（Ｇｇ４）に対す
る抗体が結合することによって、補体により溶解される
ことが判った。更に、感染細胞に結合性を有するＩｇＭ
に属する抗体は、補体の活性化による細胞溶解によっ
て、感染細胞を消失させた。従って、このＨＩＶ感染細
胞に反応するＩｇＭに属する抗体の投与は、ＨＩＶ感染
患者の処置に有用であるとの知見が得られた。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明はＨＩ
Ｖ感染患者に投与することによって、該患者の処置、即
ち、ＨＩＶ感染症の治療、ひいては、エイズの治療及び
予防を行ない得る新しい糖鎖抗体及びこれを含むＨＩＶ
感染症治療剤を提供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、Ｇｇ４
Ｃｅｒ（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ
１−４ＧｌｃβＣｅｒ）又はＧＭ２を認識し、ＩｇＭに
属する糖鎖認識抗体及び該抗体を含有するＨＩＶ感染症
治療剤乃至ＨＩＶ感染症治療用組成物が提供される。

【００１３】本明細書における糖鎖の略号による表示
は、当該分野で通常用いられている慣用法に従うもので
あり、Ｇｇはガングリオ（Ganglio）を、Ｃｅｒはセラ
ミド（Ceramid）を、Ｇａｌはガラクトース（Galactos
e）を、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトース（N-a
cetylgalactose）を、Ｇｌｃはグルコース（Glucose）
を、それぞれ示す。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明抗体は、Ｇｇ４Ｃｅｒ又は
ＧＭ２（ガングリオシドＧＭ２：II³αＮｅｕＡｃ−Ｇ
ｇＯｓｅ₃Ｃｅｒ）を認識し、免疫グロブリンクラスが
ＩｇＭに属するものであれば、ヒト血清から分離するこ
ともできるし、またＣｇ４Ｃｅｒ又はＧＭ２を抗原とし
て用いる通常の抗体製造法に従って製造することもでき
る。

【００１５】まず、ヒト血清からの本発明抗体の分離
は、Ｇｇ４Ｃｅｒ又はＧＭ２を抗原として通常の抗体ス
クリーニング法に従って実施することができる。用いる
血清としては、血清ネガティブなＨＩＶ感染患者血清又
は健常人血清のいずれでも良い。抗原として用いられる
Ｇｇ４Ｃｅｒ及びＧＭ２は、常法、例えばＥＢウイルス
によるプラスト化法やハイブリドーマ法等により得るこ
とができる。

【００１６】また、上記スクリーニングに利用される技
術としては、通常のＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体
法、ドット−イムノバインディングアッセイ、ウエスタ
ン−ブロッティング法、⁵¹Ｃｒ−放出法等を例示するこ
とができる。

【００１７】前記血清からの本発明抗体の精製は、一般
によく知られている免疫グロブリンの精製手段を用い
て、容易に実施することができる。該精製手段として
は、例えば塩析法、ゲル濾過法等の他、アフィニテイク
ロマトグラフィー（マンノース結合蛋白（ＭＢＰ）の除
去に適したマンノースのポリマーを結合させたマンナン
カラム使用）等を例示できる。

【００１８】また、本発明抗体は、Ｇｇ４Ｃｅｒ又はＧ
Ｍ２を抗原として用いた通常の細胞融合法によっても製
造することができる。本発明抗体はＧｇ４Ｃｅｒ及び／
又はＧＭ２を認識し、ＩｇＭクラスに属するものであれ
ばモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも良
い。

【００１９】本発明抗体は、ＨＩＶ感染症の治療に有用
である。このことは、以下のことから確認される。

【００２０】即ち、本発明者らはＨＩＶ−１感染Ｔ細胞
株の細胞溶解を引き起こすヒト血清試料を得、これを用
いて、ＨＩＶ−１のＨＴＬＶ−IIIＢ株に感染したヒト
Ｔ細胞（ＭＯＬＴ４）が、ＨＩＶキャリヤーの血清を含
む試験した多くの血清によっては溶解されないが、ＨＩ
Ｖ抗体がネガティブの健康成人から得た新鮮血清（ＮＨ
Ｓ）によって溶解されることを見いだした。ＨＩＶ感染
細胞を溶解する活性を有する血清は、新鮮血清サンプル
を最初に採取した１年後においても、同程度の溶解活性
を有していた。ＮＨＳ−１の細胞溶解活性は、血清を５
６℃で３０分間熱処理すると失活した。これに溶解活性
のない新鮮血清（ＮＨＳ−５）を加えると活性が戻っ
た。これはこの溶解活性が補体を介していることを示唆
している。なぜなら、熱処理により補体が不活性化する
ことは知られているからである。

【００２１】血清中にマンノースと結合する蛋白質（Ｍ
ＢＰ；mannose binding protein）が、ｇｐ４１（C.F.E
benbichler et al., J.Exp.Med., 174, 1417 (1991)）
とＨＩＶのｇｐ１２０（C.Sual et al., J.Immunol.Me
d., 152, 6028 (1994)）と反応し、補体の活性を開始す
ると報告されている。マンナンカラムを用いてＮＨＳ−
１からＭＢＰを除いても細胞溶解活性は減少しなかっ
た。

【００２２】ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷでゲル濾過によ
りＮＨＳ−１を分画後、ＩｇＭ画分がＮＨＳ−５のよう
な細胞溶解活性のない血清によるＨＩＶ感染ＭＯＬＴ４
細胞（ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４）の細胞溶解活性に対する感
受性を付与する効果があることを見いだした。それ故
に、分画物中の細胞溶解活性に対する感受性を付与する
効果は、マウス抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体を結合
したアフィニティカラムを通すことにより完全に除け
た。このことは、ＩｇＭに属する抗体は血清補体による
ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４の細胞溶解に対する感受性を付与す
るためであると考えられた。しかし、このＩｇＭ抗体
は、ウエスタンブロットでＨＩＶ抗原とは反応しなかっ
た。それ故、本発明者らはこの抗体に認識される抗原エ
ピトープは、ＨＩＶ感染によって生じる糖部分であろう
と考えた。そこで、感染していないＭＯＬＴ４細胞のノ
イラミニダーゼによる処理を試みた所、アシアログリコ
結合が認められるＩｇＭと反応することを見いだした。
更に、ノイラミニダーゼ処理したＭＯＬＴ４細胞でＩｇ
Ｍ分画を吸収すると、ヒト正常血清による細胞溶解活性
誘起性を有意に減少させた。

【００２３】ＩｇＭ分画は、ＧＭ１からシアル酸の除か
れてできたＧｇ４Ｃｅｒ（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ
β１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃβＣｅｒ）のようなある
種のグリコシドと反応する。更に、Ｇｇ４を組み込んだ
リポゾームは細胞溶解のためのＩｇＭの活性を吸収し
た。ノイラミニダーゼ処理ＭＯＬＴ４と同じくＨＩＶ−
ＭＯＬＴ４のＧｇ４の抗原認識部位の存在は、抗マウス
Ｇｇ４モノクローナル抗体で免疫染色することにより確
かめられた。また、之等の作用はＨＩＶ感染Ｕ−９３７
細胞のＧＭ２を認識するＩｇＭにおいても確認された。

【００２４】一方、細胞膜上において、補体活性は、
（１）膜補体阻害剤である崩壊刺激因子（ＤＡＦ、Deca
y Accelerating Factor, A.Nicholson-Weller, J.Burg
e, D.T.Fearon, P.F.Weller, K.F.Austen, J.Immunol.,
129, 184 (1982)）、（２）膜補助蛋白（ＭＣＰ、Memb
rane Cofactor Protein, T.Seya, J.R.Tumer, J.P.Atki
nson, J.Exp.Med., 163, 837 (1986)）やＣＤ５９（Ｈ
ＲＦ２０； 20kDa Homologous Restriction Factor, N.
Okada, R.Harada, T.Fujita, H.Okada, Int.Immunol.,
1, 205 (1989) ; A.Davies et al., J.Exp.Med., 170,
637 (1989)）のような特異的膜阻害剤により抑制される
ことが知られている。

【００２５】他方、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＤ５９等の発現
は、Ｆａｓ抗原の発現を通して、ダウン・レギュレイト
されており、ＨＬＡ−ＤＲの発現に変化は認めなかっ
た。特に、ＨＩＶ感染細胞におけるＣＤ５９の発現は、
未感染ＭＯＬＴ４細胞のそれの５０％以下に低下してい
た。ＣＤ５９発現のダウン・レギュレイトは、ノーザン
・ブロットにより測定されたｍＲＮＡのレベルでも認め
られた。

【００２６】更に、ＣＤ５９の発現低下により補体反応
に対する抵抗性が弱まり、ＨＩＶ感染−ＭＯＬＴ４は、
ＩｇＭと正常ヒト血清補体により選択的な細胞溶解を起
こす。溶解した細胞と溶解しなかった細胞との間のｐｇ
１２０発現の程度に違いはなかった。ＤＡＦ、ＭＣＰ、
特にＣＤ５９のダウン・レギュレイションは、抗原−Ｉ
ｇＭ複合体で活性化されるヒト補体によるＨＩＶ感染細
胞の細胞溶解亢進に係わっているものと考えられる。

【００２７】更に、ＨＩＶ感染細胞膜上の末端シアル酸
の減少は、補体の活性化を助長する。しかし、ＨＩＶ感
染細胞は、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出
されるＩｇＧが結合していてもＨＩＶ抗体ネガティブ血
清補体によって細胞溶解を受けない。

【００２８】古典的経路を経るＩｇＧによる補体の活性
化のためには、極めて接近した２分子のＩｇＧの反応が
必要であるのに対して、ＩｇＭは１分子で充分である。
それ故に、補体活性化は、ＩｇＧよりもＩｇＭの方がよ
り効果的な引き金となる。

【００２９】更に、ＩｇＭによって開始された補体の活
性化は、ＩｇＭは分子量が９００ｋｄと巨大分子で、分
子に結合した補体成分は、ＤＡＦやＭＣＰのような標的
細胞膜上の補体抑制分子の作用が及ばない故に、補体の
膜上抑制や分子による拘束から逃れることが可能とな
る。他方、補体の活性化により生じた膜障害複合体（Me
mbrane Attack Complex）は、細胞膜の脂質二重層に結
合する。

【００３０】ＣＤ５９は、膜に結合した之等の抗原−抗
体複合体の形成を抑制して細胞障害から守る役割を果た
しているが、ＨＩＶ感染細胞上でのＣＤ５９の発現低下
は、膜障害複合体に対する細胞の抵抗性を損なわせ、細
胞溶解を助長することになる。

【００３１】ＭＯＬＴ４細胞と同じ結果が、ＣＥＭやＭ
Ｔ４細胞のような、他のＴ細胞系でも得られた。ＨＩＶ
感染ＣＥＭ細胞はＣＤ５９発現が減少し、ＩｇＭと補体
による細胞溶解に感受性があった。しかし、ＨＩＶ感染
Ｕ９３７細胞等のマクロファージ系細胞では、ＣＤ５９
発現低下は認められず、ＩｇＭと補体による細胞溶解に
抵抗性を示した。

【００３２】ＩｇＭと補体を介する細胞溶解反応は、生
体内(in vivo)でＨＩＶ感染Ｔ細胞を除去する役割を担
っていると考えられる。ＨＩＶ感染Ｔ細胞上に現われる
Ｇｇ４やＧＭ２のような糖鎖抗原と反応する自然ＩｇＭ
を持っているヒトは、ＨＩＶ感染に対して抑制的に作用
し、ＨＩＶ感染の広がりを抑えることができると考えら
れた。しかし、ＨＩＶ感染マクロファージは、ＩｇＭと
補体による障害反応を免れて生き残り、ＨＩＶの貯蔵庫
として残る可能性は残るだろうが、感染Ｔリンパ球は除
去されるので、ＩｇＭ血清は、ＨＩＶキャリヤーの長期
生存の１つの機構であろう。実際に、ＨＩＶ感染後１２
年以上生存している長期生存者２０名について調べた
所、その全てがＩｇＭ保有者であり、短期発症者の５名
はＩｇＧのみでＩｇＭを保有していなかった。

【００３３】ＩｇＭが防御作用を示すという同様の機構
が、メラノーマ患者の場合に認められている（Ones,P.
C., Sze,L.L., Morton,D.L. and Irie,R.F., J.Natl.Ca
ncerInst., 66, 249, (1980)）。

【００３４】以上のことより、本発明糖鎖認識抗体Ｉｇ
Ｍは、ＨＩＶ感染患者に投与することによって、自然抗
体を体内に保有させることができ、エイズの治療及び予
防に有用である。

【００３５】本発明糖鎖認識抗体ＩｇＭは、通常之を含
む適当な形態、代表的には、注射剤等の非経口投与に適
した形態等の製剤形態に調製され、治療を要望される患
者に投与される。上記製剤形態の調製は、常法に従うこ
とができ、該製剤形態への調製に利用される賦形剤等も
一般的な、例えば糖、アミノ酸、蛋白質等の各種のもの
でよく、製剤中には、有効成分とする本発明ＩｇＭの他
に、適当な添加剤、例えば各種無機塩類等を適宜添加配
合することができる。

【００３６】上記各種形態での本発明製剤の投与量は、
特に限定されるものではないが、一般には糖鎖に対する
ＩｇＭの量（力価）が試験館内で１０μｇ／ｍｌ〜５０
μｇ／ｍｌで、ＨＩＶ感染細胞を殺す活性を持つものと
するのがよい。

【００３７】本発明抗体の上記投与によれば、ＨＩＶ感
染患者（エイズ）の治療、予防ができる。即ち、本発明
糖鎖認識抗体をＨＩＶ感染患者に投与することによっ
て、自然抗体の抗体価を体内で上昇させることができ、
かくしてエイズの治療及び予防効果を期待できる。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するため、実
施例を挙げる。

【００３９】

【実施例１】 細胞の培養 ヒトＴ細胞系株ＭＯＬＴ４細胞は、１０％牛胎児血清
（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニ
シリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地で培養し、マイコプラズマの存在し
ない状態で保存した。細胞は、ＨＴＬＶ−IIIＢ（ＨＩ
Ｖ−１）を感染させ、ＨＩＶ感染標的細胞として用いる
前に４週間以上培養した。０．５βモノクローナル抗体
（ＨＴＬＶ−IIIＢのｇｐ１２０に対する抗体）を用い
てフローサイトメトリーにより測定した結果、細胞の９
５％以上がＨＩＶ−ｅｎｖ抗原（ｐｇ１２０）陽性で、
殆どの細胞にＨＩＶ−１の感染が行き亘っていることを
確認した。

【００４０】５×１０⁶ＨＩＶ感染ＭＯＬＴ４細胞と、
対照としてＨＩＶ未感染のＭＯＬＴ４細胞（normal Ｍ
ＯＬＴ４）とを、それぞれ⁵¹Ｃｒで標識した。標識後、
細胞を洗浄し、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地
に、２×１０⁵／ｍｌに再懸濁させた。

【００４１】細胞懸濁液の１００μｌを新鮮血清又は熱
不活性血清の１００μｌと共にＵ型マイクロプレートに
入れた。上記血清は、４人のＨＩＶ抗体ポジティブ患者
と、１３人の健常ＨＩＶ抗体ネガティブな人から得た。

【００４２】上記プレートを３７℃で１．５時間反応さ
せ、遠心分離を行なった。細胞を含まない上清の⁵¹Ｃｒ
放出％を次式により算出した。

【００４３】⁵¹Ｃｒ放出％＝（新鮮血清で放出された量
−熱処理血清で放出された量）／（５％トリトンＸ１０
０で放出した量−熱処理血清で放出された量）

【００４４】

【実施例２】 ノイラミニダーゼ処理 １００μｌのノイラミニダーゼを２×１０⁶細胞懸濁液
１００μｌに加え、３７℃で４５分反応させた。ＭＯＬ
Ｔ４、Ｎｅｕ−ＭＯＬＴ４又はＨＩＶ−ＭＯＬＴ４細胞
の２×１０⁶に対して溶解活性を強く示した血清である
ＮＨＳ−１から分画精製したＩｇＭ（２５０μｇ／ｍ
ｌ）を２５０μｌ加えて、４℃で３０分間反応させた。
遠心分離後、上清は感受性の度合いを測定するために、
他の試験管に移した。

【００４５】細胞は洗浄後、ＦＩＴＣ−結合マウス抗ヒ
トＩｇＭで染色し、ＦＡＣＳｃａｎで測定した。

【００４６】ＭＯＬＴ４、Ｎｅｕ−ＭＯＬＴ４又はＨＩ
Ｖ−ＭＯＬＴ４の培養後得られた上清は、細胞溶解活性
を測定するために、溶解活性陰性のヒト血清（ＮＨＳ−
５）の存在下でＨＩＶ−ＭＯＬＴ４と共に反応させた。

【００４７】

【実施例３】正常人９６名の血清中から、実施例１と同
様の方法により、⁵¹Ｃｒを取り込ませた標識感染ＭＯＬ
Ｔ４細胞の溶解活性法でスクリーニングした結果、感染
細胞溶解活性が１５％以上の人が１６名認められた。次
いで、Ｕ９３７細胞及びＭＯＬＴ４細胞の感染細胞を用
いて、この二種類の感染細胞に対して溶解活性を有する
血清２例を選別した。この血清のＩｇＭ画分を採取して
以下の実験に供した。

【００４８】リポソームは文献（Immunology, 48, 129-
140 (1983））記載の方法に準じて作成した。即ち、コ
レステロール、ジミリストイル−ホスファチジルコリン
及び挿入すべき各種脂質を１：１：０．１の割合で混合
し、溶媒のクロロホルムをロータリーエバポレーターで
揮発除去して、脂質のフィルムをフラスコ内面に作成し
た。コントロールのリポソームはコレステロールとジミ
リストイルホスファチジルコリンを１：１にしたものを
用いた。

【００４９】脂質フィルムにＰＢＳを加えてボルテック
ス攪拌機で強く振動させて、リポソーム（多重層型）を
作成した。これにＰＢＳを加えて遠心洗浄し、リポソー
ム浮遊液を作った。

【００５０】このリポソーム浮遊液から１０ｎｍｏｌの
糖脂質を含む量をとり、これを遠心してリポソームをペ
レットにして、上清を捨てた。このペレットにＩｇＭ分
画（２００μｇ／２００μｌ）（ＴＳＫ−３０００で抗
体活性陽性血清をゲル濾過分画したもの）を加えて攪拌
した後、室温で６０分間放置して、リポソーム膜上の糖
脂質に対する抗体を吸収する操作とした。反応後、遠心
してリポソームを沈殿させ、上清を回収した。

【００５１】この吸収操作後のＩｇＭ分画のＨＩＶ−感
染ＭＯＬＴ４細胞（ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４）に対する細胞
障害活性の測定を行なった。即ち、⁵¹Ｃｒで標識した２
×１０⁵／ｍｌの⁵¹Ｃｒ−ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４（コント
ロールには非感染の⁵¹Ｃｒ−ＭＯＬＴ４を用いた）を１
００μｌとり、これに５０μｌの吸収あるいは吸収前の
ＩｇＭ分画と、５０μｌの抗体陰性正常人血清（補体源
として）を加え、３７℃、９０分間反応後、プレートを
遠心して、上清に放出した⁵¹Ｃｒ量を測定して細胞障害
の度合を算出した。

【００５２】即ち、対照リポソーム（CONT liposome
s）、Ｇｇ４リポソーム（Gg4 liposomes）、ＧＭ２リポ
ソーム（GM2 liposomes）は、それぞれリポソームのみ
のもの、リポソームにＧｇ２及びＧＭ２をそれぞれつけ
たものを、新鮮血清に２５％ＩｇＭ画分を加え、抗原抗
体反応を起こさせた後、その上清で溶解活性を調べた。

【００５３】その結果（自然抗体のエピトープ解析結
果）を、図１（検体番号１使用）及び図２（検体番号５
６使用）に示す。

【００５４】各図は、２５％供試血清検体番号１又は５
６(25% No.1 serum又は25% No.56 serum)、２５％Ｉｇ
Ｍ分画のみ(25% IgM fraction only)、２５％ＩｇＭ分
画＋ＦＳ(25% IgM fraction with FS)、対照リポソーム
（absorbed with CONT liposomes）、Ｇｇ４リポソーム
（absorbed with Gg4 liposomes）及びＧＭ２リポソー
ム（absorbed with GM2 liposomes）の各検体を横軸と
して、各検体の溶解活性％（LYSIS％）を示した棒グラ
フであり、図中MOLT4は、ＨＩＶ未感染ＭＯＬＴ４細胞
を、IIIＢは、ＨＩＶ感染ＭＯＬＴ４細胞をそれぞれ示
す。

【００５５】之等の図より、検体番号１と５６と共に、
対照とＧｇ４リポソームでは溶解活性は残存していた
が、ＧＭ２リポソームに接触させると溶解活性は完全に
消失することが判った。この結果から、健常者血清のＨ
ＩＶ感染細胞に対するＩｇＭ自然抗体は、ＧＭ２を抗原
エピトープとするものであることが判明した。

【００５６】

【実験例１】 ＩｇＭ抗体を含むＨＩＶ抗体ネガティブ
な正常ヒト血清によるＨＩＶ−ＭＯＬＴ４の細胞溶解性 前記各実施例において、各検体の細胞溶解活性を求めた
結果を、図１及び図２と同様にして図３（但し、図中、
ＨＩＶ感染ＭＯＬＴ４細胞はHIV-MOLT4として、ＨＩＶ
未感染ＭＯＬＴ４細胞はnormal MOLT4として示す）に示
す。

【００５７】図において、横軸は細胞溶解活性％（％ C
ytolysis）を、縦軸は供試患者血清（ＮＨＳ−〜ＮＨＳ
−１３及びＰＳ−１〜ＰＳ−４）をそれぞれ示す。また
図３には、ＮＨＳ１、ＮＨＳ−及びＰＳ−１の各血清試
料と、ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４細胞との反応後の免疫染色結
果（縦軸：染色細胞数（Cell number）、横軸：標識強
度（Fluorescence intencity））を求めたグラフを
（ａ）（ＩｇＭ抗体利用の場合）及び（ｂ）（ＩｇＧ抗
体利用の場合）として併記する。

【００５８】該図より、次のことが明らかである。

【００５９】（Ａ） 健康なＨＩＶ抗体ネガティブの供
与者１３人の内、１人だけ（ＮＨＳ−１）が、ヒト血清
による⁵¹Ｃｒを標識したＨＩＶ−ＭＯＬＴ４の細胞溶解
を起こした。

【００６０】該ＮＨＳ−１では、４３％以上の細胞溶解
が見られたのに対して、健常者（ＮＨＳ−２からＮＨＳ
−１３の１２人）からの他の血清は、細胞溶解作用は殆
ど認められなかった。また、ＨＩＶ抗体ポジティブの患
者血清（ＰＳ−１〜ＰＳ−４）でも溶解活性は殆ど認め
られなかった。

【００６１】（Ｂ） ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４細胞をＮＨＳ
−１、ＮＨＳ−５又はＰＳ−１のそれぞれの血清試料の
等容量と室温で３０分間反応処理し、洗浄後、ＦＩＴＣ
標識抗ヒトＩｇＭ抗体又はＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗
体で免疫染色した。

【００６２】結果は図３の（ａ）（ＩｇＭの場合）及び
（ｂ）（ＩｇＧの場合）に示す通りであり、ＮＨＳ−１
で処理したＨＩＶ−ＭＯＬＴ４細胞は、抗ＩｇＭ抗体と
結合し、ＰＳ−１は抗ＩｇＧに結合したが抗ＩｇＭ抗体
には反応しなかった。

【００６３】

【実験例２】ノイラミニダーゼで処理したＭＯＬＴ４、
未処理ＭＯＬＴ４及びＨＩＶ−ＭＯＬＴ４の各細胞を、
ＮＨＳ−１由来ＩｇＭ抗体分画で処理後、蛍光標識した
抗ヒトＩｇＭ抗体で免疫染色した結果を図３の（ａ）と
同様にして、図４に示す。

【００６４】尚、ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４に反応したＩｇＭ
抗体は、ノイラミニダーゼで処理したＨＩＶ−ＭＯＬＴ
４細胞とも反応した。

【００６５】図４の（ａ）に示す通り、ＮＨＳ−１から
のＩｇＭ画分は、ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４との反応性と同様
の強さでＮｅｕ−ＭＯＬＴ４とも反応した。

【００６６】また、同様に試験した抗ｇｐ１２０モノク
ローナル抗体（anti-gp120、０．５β）は、同図４の
（ｂ）に示すように、ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４のみに染色し
た。

【００６７】ヒト血清による細胞溶解を誘導するＩｇＭ
分画の活性は、このＩｇＭ分画をＮｅｕ−ＭＯＬＴ４細
胞で吸収処理することによって、ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４と
同様に活性を吸収した。即ち、之等の細胞で吸収処理を
行なったＩｇＭ分画は、正常ヒト血清（溶解活性陰性の
ＮＨＳ−５）に溶解力を誘導する力価を失った。

【００６８】

【実験例３】ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４に反応性を有するＩｇ
Ｍは、Ｇｇ４Ｃｅｒに反応する。

【００６９】（Ａ） 下記１〜７の各グリコリピッドに
つき、プラスチックＴＬＣプレート上でクロマトグラフ
を行なって、（ａ）オルシノール−硫酸試薬と、ＮＨＳ
−１から得たＩｇＭ分画で免疫染色を行なってスポット
を検出した。また、（ｂ）ＮＨＳ−１から得たＩｇＭ分
画でＴＬＣ免疫染色法でスポットを検出した。

【００７０】１．ＬａｃＣｅｒ ２．Ｇｇ３Ｃｅｒ ３．ｎＬｃ４Ｃｅｒ ４．Ｌｃ４Ｃｅｒ ５．Ｇｂ４Ｃｅｒ ６．Ｇｇ４Ｃｅｒ ７．ＩＶ³Ｇａｌα−ｎＬｃ４Ｃｅｒ その結果、Ｇｇ４Ｃｅｒは明らかに染色された。また、
ＬａｃＣｅｒ，Ｇｇ３ＣｅｒとＬｃ４Ｃｅｒはごく僅か
に染色された。しかし、ＩｇＭ画分はｎＬｃ４Ｃｅｒ，
Ｇｂ４Ｃｅｒ，ＩＶ³Ｇａｌα−ｎＬｃ４Ｃｅｒと、そ
してＧＭ３，ＧＭ２，ＧＭ１，ＧＤｌａ，ＧＤ１ｂ，Ｇ
Ｔ１ｂ，ＧＱ１ｂ，ＩＶ³ＮｅｕＡｃα−ｎＬｃ４Ｃｅ
ｒ，シアリルＬｅ^aとＬｅ^Xのようなシアリル化されたグ
リコリピッドが僅かに反応した。

【００７１】Ｃｇ４Ｃｅｒを１００として比較すると、
ＬａｃＣｅｒは２５．８，Ｇｇ３Ｃｅｒは３１．８，ｎ
Ｌｃ４Ｃｅｒは０，Ｌｃ４Ｃｅｒは２９．３，Ｇｂ４Ｃ
ｅｒは０、そしてＩＶ³Ｇａｌα−ｎＬｃ４Ｃｅｒは２
４．６であった。

【００７２】リポソームは岡田等の方法（Okasa,N.,Yos
hida,T.,Okada,H., Nature, 299, 261,(1982)）により
調製した。ＩｇＭ分画（５０μｇ／２００μｌ）を各リ
ポソーム標品の５nmolと混合し、遠心分離後、上清の細
胞溶解活性を、実施例２に従って測定した。

【００７３】結果は、同様にして図５に示す通りであ
り、溶解活性陰性のヒト血清（ＮＨＳ−５）によるＨＩ
Ｖ−ＭＯＬＴ４の細胞溶解を誘起するＩｇＭ分画の活性
は、Ｇｇ４−リポソームの処理により半分以下に低下し
た（図５のＡ参照）。

【００７４】Ｇｇ４に対するマウスモノクロナール抗体
は、フローサイトメトリーで測定したところ、正常（no
rmal）ＭＯＬＴ４細胞とは反応しなかったが、ＨＩＶ−
ＭＯＬＴ４細胞とＮｅｕ−ＭＯＬＴ４は反応した（図５
のＢ参照）。

【００７５】

【実施例４】 ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４細胞上のＣＤ５９の
有意な減少。

【００７６】結果は図６に示す通りであり、次のことが
明らかとなった。

【００７７】（Ａ） フローサイトメトリーで測定した
結果、ＨＩＶ感染細胞上の膜上補体制御因子（ＤＡＦ，
ＭＣＰ及びＣＤ５９）の発現は減少していた。Ｆａｓ抗
原とＨＬＡ−ＤＲの発現はＨＩＶ感染後も低下していな
かった（図６参照）。

【００７８】（Ｂ） 膜上補体制御因子のｍＲＮＡのノ
ーザン・ブロット解析は、非感染（Ｎ）とＨＩＶ感染し
た（Ｈ）ＭＯＬＴ４細胞から全ＲＮＡの５μｇを文献
（Thomas,P.S., Methods Enzymol., 100, 255-2 (198
3)）の方法により抽出し、グリオキサールとＤＭＳＯで
変性させた。ＣＤ５９，ＤＡＦ，ＭＣＰとＧＡＰＤＨ
（Glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase）のｃＤ
ＮＡフラグメントをプロープとして用いた。ＣＤ５９ｍ
ＲＮＡの明瞭な減少が見られた。

【００７９】１×１０⁶個の細胞とＮＨＳ−１とを３７
℃で３０分反応させた後、ＨＩＶ−ＭＯＬＴ４に対して
Ｔｗｏ ｃｏｌｏｒ分析を行なった。死細胞を染色する
沃化プロピオジュウム（ＰＩ）を用いた。これにより、
該ＰＩで染色する死細胞と染色しない生細胞を分別でき
る。そして、Ｃ５ｂ−９（ＭＡＣ），ＣＤ５９とｇｐ１
２０はそれらを抗原とするＦＩＴＣ標識モノクローナル
抗体で染色した。その結果は次の通りである。

【００８０】（ａ） ＮＨＳ−１と共に反応させた後の
ＰＩ染色細胞（死細胞）は、Ｃ５ｂ−９の量が多く、生
細胞であることを示すＰＩ染色陰性細胞よりもやや強く
染色した。

【００８１】（ｂ） １０ｍＭ ＥＤＴＡ存在下でＮＨ
Ｓ−１は、ＰＩ染色細胞を生じさせない。

【００８２】（ｃ）ＣＤ５９の発現量の低い細胞がＮＨ
Ｓ−１との処理後のＰＩ染色される結果を示しており、
Ｃｄ５９の発現量の低い細胞がよく殺されやすいことが
判る。

【００８３】（ｄ）ｇｐ１２０の発現はＰＩ染色（死細
胞）と非染色（生細胞）細胞で本質的に同じであり、抗
ｐｇ１２０抗体量とＮＨＳ−１による殺細胞活性とは直
接関係しない。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３に従う試験における検体番号１の血清
についてのエピトープ解析結果を示すグラフである。

【図２】実施例３に従う試験における検体番号５６の血
清についてのエピトープ解析結果を示すグラフである。

【図３】実験例１に従い行なわれたＩｇＭを含むＨＩＶ
抗体ネガティブな正常ヒト血清によるＨＩＶ感染−ＭＯ
ＬＴ４の細胞溶解活性を示すグラフである。

【図４】実験例２に従い行なわれたノイラミニダーゼ処
理したＭＯＬＴ４、未処理ＭＯＬＴ４、及びＨＩＶ−Ｍ
ＯＬＴ４の各細胞を、正常ヒト血清−１（ＮＨＳ−１）
由来ＩｇＭ分画で処理後、蛍光標識した抗ヒトＩｇＭ抗
体で免疫染色した結果を示すグラフである。

【図５】実験例３に従い行なわれた種々の糖鎖でコート
されたリポソームで吸収されたＩｇＭの残存細胞溶解活
性及び該リポソームで処理された細胞の免疫染色した結
果を示すグラフである。

【図６】実験例４に従い行なわれたＨＩＶ感染−ＭＯＬ
Ｔ４細胞上の補体不活性化膜蛋白因子の発現量をフロー
サイトメトリーで測定した結果を示すグラフである。

フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，1987，Ｖｏ ｌ．102，Ｎｏ．１，ｐｐ．59−67 Ｂｉｏｃｈｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，1988，Ｖｏｌ. 958，ｐｐ．３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，1989，Ｖｏ ｌ，49，ｐｐ．6645−6651 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，1989，Ｖｏ ｌ．49，ｐｐ．7045−7050 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，1990，Ｖｏ ｌ．50，ｐｐ．5497−5503 Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ，1993，Ｖｏｌ．13，ｐｐ．331− 336 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ, 1994，Ｖｏｌ．169，ｐ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，1995，Ｖｏｌ. 56，ｐｐ327−33 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1987，Ｖｏｌ．84，ｐｐ. 2911−291 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1987，Ｖ ｏｌ．262，Ｎｏ．35，ｐｐ．17149− 17155 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1988，Ｖ ｏｌ．263，Ｎｏ．９，ｐｐ．4369− 4373 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1993，Ｖ ｏｌ．268，Ｎｏ．28，ｐｐ．21028− 21034 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，1994，Ｖｏ ｌ．54，ｐｐ．1511−1516 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 39/395 A61P 31/18 C07K 16/28 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Gl
   cβCer)又はGM2を認識し、IgMに属する糖鎖認識抗体を
   有効成分として含有することを特徴とするHIV感染症治
   療剤。
2. 【請求項２】 糖鎖認識抗体が、補体の活性化を介して
   HIV感染細胞を溶解させるものである請求項2に記載の治
   療剤。
3. 【請求項３】 AIDSの発症を防止するためのものである
   請求項1に記載の治療剤。
4. 【請求項４】 Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Gl
   cβCer)又はGM2を認識し、IgMに属する糖鎖認識抗体を
   有効成分として含有することを特徴とするHIV感染症治
   療用組成物。
5. 【請求項５】 糖鎖認識抗体が、補体の活性化を介して
   HIV感染細胞を溶解させるものである請求項4に記載の組
   成物。
6. 【請求項６】 AIDSの発症を防止するためのものである
   請求項4に記載の組成物。