JP6247253B2 - 白血病幹細胞マーカー - Google Patents

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Description

本発明は、白血病幹細胞マーカーに関し、急性骨髄性白血病の治療分野に関するものである。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、最も一般的な頻度（発症率）の高い成人白血病であり、稀な白血病幹細胞（ＬＳＣ）から始まる未熟な骨髄芽球のクローン性の増殖によって特徴付けられる（非特許文献１〜３）。ヒトＬＳＣの機能的特徴および分子的特徴は、大部分が不明である。従来の化学療法剤はＡＭＬを一時的に寛解し得るものの、後になって再発することが患者を救うことができない困難な問題となっており、有効な治療剤および治療方法の開発のためには、これまでに知られていない白血病の性質を明らかにすることによる再発メカニズムの解明が強く望まれている。
最近の研究は、白血病ならびに癌の一定の割合が不均一な細胞画分からなり、クローン性に増殖可能な均一な細胞集団から構成されていないことを明らかにした。ＬａｐｉｄｏｔとＤｉｃｋは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）でそのような不均一性を同定し、ＣＢ１７−ｓｃｉｄおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞が選択的に移植することを報告した（非特許文献４）。
本発明者らは、マウスでなくヒトのＡＭＬ、特に細胞株でない個々の患者のＡＭＬの特徴を再現することができ、長期間評価にたえ得る動物モデルの開発に成功した（非特許文献５、特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８８９２）。最も高感度のヒト幹細胞アッセイの１つである新生ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯマウスモデルを用いて、本発明者らは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＡＭＬ細胞がアメリカ癌学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）が推奨する癌幹細胞のすべての基準に合致することをさらに同定した（非特許文献６）。具体的には、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＡＭＬ細胞は自己複製し、非幹白血病細胞を発生させ、生体内でＡＭＬを発症させる独占的能力を有する。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯマウスで原発性ヒトＡＭＬを繰り返すことにより、本発明者らは、本疾患の実体において最も重大な問題である化学療法耐性および再発の根底にあるメカニズムを探求し、ヒトＡＭＬ幹細胞に関して下記２つの必須の特性を同定した。第一に、ＡＭＬ幹細胞は骨髄の骨内膜領域に優先的に存在し、ヒトＡＭＬ移植マウスを化学療法剤で処置した場合、化学療法耐性ＡＭＬ細胞の大多数が骨芽細胞ニッチ内に見いだされた。第二に、ＡＭＬ幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋およびＣＤ３４−ＡＭＬ細胞ではない）は静止しており、それ故、細胞周期依存性の化学療法剤に対して耐性を示す。これらの組織学的実験および細胞周期解析は、多数のＡＭＬ患者が化学療法誘導を介して寛解を獲得するが最終的には再発を経験するという臨床的経験と一致する。ＬＳＣを根絶させるように設計された新規治療戦略の開発は、ＡＭＬの再発を克服する厳密なステップであると思われる。
Ｐａｓｓｅｇｕｅ， Ｅ．， Ｊａｍｉｅｓｏｎ， Ｃ．Ｈ．， Ａｉｌｌｅｓ， Ｌ．Ｅ． ＆ Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｉ．Ｌ． Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ： ａｒｅ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｏｒ ａ ｒｅａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ？ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １００ Ｓｕｐｐｌ １， １１８４２−１１８４９ （２００３）． Ｈｏｐｅ， Ｋ．Ｊ．， Ｊｉｎ， Ｌ． ＆ Ｄｉｃｋ， Ｊ．Ｅ． Ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｌａｓｓｅｓ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒ ｉｎ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５， ７３８−７４３ （２００４）． Ｊｏｒｄａｎ， Ｃ．Ｔ． ＆ Ｇｕｚｍａｎ， Ｍ．Ｌ． Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３， ７１７８−７１８７ （２００４）． Ｌａｐｉｄｏｔ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｅｌｌ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ３６７， ６４５−６４８ （１９９４）． Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ＡＭＬ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｈｏｍｅ ｔｏ ａｎｄ ｅｎｇｒａｆｔ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｅｎｄｏｓｔｅａｌ ｒｅｇｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１３１５−１３２１ （２００７）． Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ−−ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ： ＡＡＣＲ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６， ９３３９−９３４４ （２００６）．
解決しようとする課題は、ヒト白血病幹細胞（ＬＳＣ）に特異的な分子標的を見出し、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の根治につながる治療手段などの提供である。
本発明者らは、ＬＳＣと非幹細胞との間で示差的に発現する遺伝子群を見出し、これらの遺伝子がＡＭＬの治療標的となる可能性を提案してきた（Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｆ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１３１５−１３２１， ２００７およびＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８８９２）が、同時に正常の造血幹細胞（ＨＳＣ）においても示差的に発現している可能性を排除しきれていなかった。すなわち、ＬＳＣと非幹細胞との比較のみならず、ＬＳＣとＨＳＣとの間で示差的に発現する遺伝子群を標的として同定することにより、初めて副作用の少ないＡＭＬの治療剤ならびに治療方法が実現されるのである。本発明者らは、ヒトＡＭＬが再現できるモデルマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウスにヒトＡＭＬ患者由来の白血病幹細胞含有物を移植したマウス）を開発し、少量のＡＭＬ患者由来の骨髄細胞を移植し、当該モデル動物内でＡＭＬの病態を再構築することに成功した。そしてＡＭＬ患者由来およびＡＭＬ移植マウス由来のＬＳＣならびに健常ドナー由来の骨髄試料および臍帯血試料（ＨＳＣが含まれる）を準備して網羅的に解析を進め、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための試験方法であって、
（１）被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
（２）測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程
を含み、当該白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＺＵ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＬＣＲＬ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ９３、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＦＤ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣＬ１、ＣＯＣＨ、ＣＳＴ７、ＣＸＣＬ１、ＤＯＫ２、ＥＭＲ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ１０９Ｂ、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＡＶＣＲ２、ＨＢＥＧＦ、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＦＩ３０、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＡＭＤＣ２、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ１４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＢＰ、ＰＲＧ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＰＴＸ３、ＲＥＥＰ５、ＲＮＡＳＥ２、ＲＸＦＰ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ７Ａ６、ＳＴＸ７、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＩＭＰ１、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＴＳ２およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；
ＡＵＲＫＡ、Ｃ１３ｏｒｆ３４、ＣＣＮＡ１、ＤＳＣＣ１、ＦＡＭ３３Ａ、ＨＰＧＤ、ＮＥＫ６、ＰＹＨＩＮ１、ＲＡＳＳＦ４、ＴＸＮＬ４ＢおよびＺＷＩＮＴからなる細胞周期関連遺伝子；
ＭＰＯ、ＩＥＲ３、ＢＩＫ、ＴＸＮＤＣ１、ＧＡＤＤ４５ＢおよびＮＡＩＰからなるアポトーシス関連遺伝子；
ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＡＲＲＢ１、ＤＵＳＰ６、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＭＳ４Ａ３、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＤ、ＰＸＫ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＢＩＦ、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＧＳ１８およびＳ１００Ａ１１からなるシグナル伝達関連遺伝子；
ＷＴ１、ＭＹＣおよびＨＬＸからなる転写因子遺伝子；ならびに
ＡＣＴＲ２、ＡＬＯＸ５、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＡＴＬ３、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｄ、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｃ１７ｏｒｆ６０、Ｃ１８ｏｒｆ１９、Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１、Ｃ１ｏｒｆ１３５、Ｃ１ｏｒｆ１６３、Ｃ１ｏｒｆ１８６、Ｃ６ｏｒｆ１５０、ＣＡＬＭＬ４、ＣＣＴ５、ＣＬＣ、ＣＯＭＭＤ８、ＣＯＴＬ１、ＣＯＸ１７、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴＡ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＧ、ＣＹＢＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＤＥＮＮＤ３、ＤＨＲＳ３、ＤＬＡＴ、ＤＬＥＵ２、ＤＰＨ３、ＥＦＨＤ２、ＥＮＣ１、ＥＸＯＳＣ３、ＦＡＭ１０７Ｂ、ＦＡＭ１２９Ａ、ＦＡＭ３８Ｂ、ＦＢＸＯ２２、ＦＬＪ１４２１３、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＮＰＤＡ１、ＧＲＰＥＬ１、ＧＴＳＦ１、ＨＩＧ２、ＨＮ１、ＨＶＣＮ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ３Ａ、ＩＫＩＰ、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＹＮＵ、ＬＣＭＴ２、ＭＥ１、ＭＩＲＮ２１、ＭＫＫＳ、ＭＮＤＡ、ＭＴＨＦＤ２、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ１Ｆ、ＮＡＧＡ、ＮＣＦ２、ＮＣＦ４、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＰ、ＮＲＩＰ３、ＯＢＦＣ２Ａ、ＰＡＲＰ８、ＰＤＬＩＭ１、ＰＤＳＳ１、ＰＧＭ２、ＰＩＧＫ、ＰＩＷＩＬ４、ＰＰＣＤＣ、ＰＰＩＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＵＳ７、ＲＰＰ４０、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｚ、ＳＡＭＨＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＰＣＳ２、ＳＰＰＬ２Ａ、ＴＥＳＣ、ＴＨＥＸ１、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＥＭ３３、ＴＲＩＰ１３、ＴＵＢＢ６、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＧＣＧ、ＶＳＴＭ１、ＷＤＲ４、ＷＩＴ１、ＷＳＢ２およびＺＮＦ２５３からなるその他の遺伝子
からなる群より選ばれる２〜２１８の遺伝子であり、被験者における２以上の白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現が基準値に比べて有意に高い場合、採取した生体試料中または被験者の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される、試験方法。
［２］白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ５、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＲＮＡＳＥ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＵＣＮＲ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；ＺＷＩＮＴ、ＮＥＫ６およびＴＸＮＬ４Ｂからなる細胞周期関連遺伝子；ＢＩＫからなるアポトーシス関連遺伝子；ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＣＤ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８ＡおよびＲＡＢＩＦからなるシグナル伝達関連遺伝子；ＷＴ１およびＨＬＸからなる転写因子遺伝子；ならびにＣＹＢＢ、ＣＴＳＣおよびＮＣＦ４からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる２〜５８の遺伝子である、［１］に記載の試験方法。
［３］下記遺伝子群：
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＺＵ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＬＣＲＬ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ９３、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＦＤ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣＬ１、ＣＯＣＨ、ＣＳＴ７、ＣＸＣＬ１、ＤＯＫ２、ＥＭＲ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ１０９Ｂ、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＡＶＣＲ２、ＨＢＥＧＦ、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＦＩ３０、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＡＭＤＣ２、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ１４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＢＰ、ＰＲＧ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＰＴＸ３、ＲＥＥＰ５、ＲＮＡＳＥ２、ＲＸＦＰ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ７Ａ６、ＳＴＸ７、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＩＭＰ１、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＴＳ２およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；
ＡＵＲＫＡ、Ｃ１３ｏｒｆ３４、ＣＣＮＡ１、ＤＳＣＣ１、ＦＡＭ３３Ａ、ＨＰＧＤ、ＮＥＫ６、ＰＹＨＩＮ１、ＲＡＳＳＦ４、ＴＸＮＬ４ＢおよびＺＷＩＮＴからなる細胞周期関連遺伝子；
ＭＰＯ、ＩＥＲ３、ＢＩＫ、ＴＸＮＤＣ１、ＧＡＤＤ４５ＢおよびＮＡＩＰからなるアポトーシス関連遺伝子；
ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＡＲＲＢ１、ＤＵＳＰ６、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＭＳ４Ａ３、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＤ、ＰＸＫ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＢＩＦ、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＧＳ１８およびＳ１００Ａ１１からなるシグナル伝達関連遺伝子；
ＷＴ１、ＭＹＣおよびＨＬＸからなる転写因子遺伝子；ならびに
ＡＣＴＲ２、ＡＬＯＸ５、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＡＴＬ３、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｄ、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｃ１７ｏｒｆ６０、Ｃ１８ｏｒｆ１９、Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１、Ｃ１ｏｒｆ１３５、Ｃ１ｏｒｆ１６３、Ｃ１ｏｒｆ１８６、Ｃ６ｏｒｆ１５０、ＣＡＬＭＬ４、ＣＣＴ５、ＣＬＣ、ＣＯＭＭＤ８、ＣＯＴＬ１、ＣＯＸ１７、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴＡ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＧ、ＣＹＢＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＤＥＮＮＤ３、ＤＨＲＳ３、ＤＬＡＴ、ＤＬＥＵ２、ＤＰＨ３、ＥＦＨＤ２、ＥＮＣ１、ＥＸＯＳＣ３、ＦＡＭ１０７Ｂ、ＦＡＭ１２９Ａ、ＦＡＭ３８Ｂ、ＦＢＸＯ２２、ＦＬＪ１４２１３、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＮＰＤＡ１、ＧＲＰＥＬ１、ＧＴＳＦ１、ＨＩＧ２、ＨＮ１、ＨＶＣＮ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ３Ａ、ＩＫＩＰ、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＹＮＵ、ＬＣＭＴ２、ＭＥ１、ＭＩＲＮ２１、ＭＫＫＳ、ＭＮＤＡ、ＭＴＨＦＤ２、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ１Ｆ、ＮＡＧＡ、ＮＣＦ２、ＮＣＦ４、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＰ、ＮＲＩＰ３、ＯＢＦＣ２Ａ、ＰＡＲＰ８、ＰＤＬＩＭ１、ＰＤＳＳ１、ＰＧＭ２、ＰＩＧＫ、ＰＩＷＩＬ４、ＰＰＣＤＣ、ＰＰＩＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＵＳ７、ＲＰＰ４０、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｚ、ＳＡＭＨＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＰＣＳ２、ＳＰＰＬ２Ａ、ＴＥＳＣ、ＴＨＥＸ１、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＥＭ３３、ＴＲＩＰ１３、ＴＵＢＢ６、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＧＣＧ、ＶＳＴＭ１、ＷＤＲ４、ＷＩＴ１、ＷＳＢ２およびＺＮＦ２５３からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤。
［４］白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ５、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＲＮＡＳＥ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＵＣＮＲ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；ＺＷＩＮＴ、ＮＥＫ６およびＴＸＮＬ４Ｂからなる細胞周期関連遺伝子；ＢＩＫからなるアポトーシス関連遺伝子；ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＣＤ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８ＡおよびＲＡＢＩＦからなるシグナル伝達関連遺伝子；ＷＴ１およびＨＬＸからなる転写因子；ならびにＣＹＢＢ、ＣＴＳＣおよびＮＣＦ４からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、［３］に記載の治療剤。
［５］白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＧＲ２Ａ、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＰＴＨ２Ｒ、ＲＮＡＳＥ２、ＴＮＦ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰおよびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；ＮＥＫ６からなる細胞周期関連遺伝子；ＢＩＫからなるアポトーシス関連遺伝子；ＡＫ５、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＣＤおよびＲＡＢ２０からなるシグナル伝達関連遺伝子；ＷＴ１からなる転写因子遺伝子；ならびにＣＴＳＣおよびＮＣＦ４からなるその他の遺伝子からなる群より選ばれる、［３］に記載の治療剤。
［６］白血病幹細胞マーカー遺伝子が、骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性の幹細胞に発現するマーカーであって、ＡＫ５、ＢＩＫ、ＤＯＫ２、ＦＣＧＲ２Ａ、ＩＬ２ＲＡ、ＬＲＧ１、ＳＵＣＮＲ１およびＷＴ１からなる群より選ばれる、［３］に記載の治療剤。
［７］遺伝子の発現を抑制し得る物質がアンチセンス核酸またはＲＮＡｉ誘導性核酸である、［３］〜［６］のいずれか一に記載の治療剤。
［８］翻訳産物の活性を抑制し得る物質がアプタマーまたは抗体である、［３］〜［６］のいずれか一に記載の治療剤。
［９］抗体が抗体と抗癌物質とのイムノコンジュゲートである、［８］に記載の治療剤。
［１０］急性骨髄性白血病患者に対する自家移植または同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法であって、
ａ）当該患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程、
ｂ）採取した試料と、下記遺伝子群：
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＺＵ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＬＣＲＬ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ９３、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＦＤ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣＬ１、ＣＯＣＨ、ＣＳＴ７、ＣＸＣＬ１、ＤＯＫ２、ＥＭＲ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ１０９Ｂ、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＡＶＣＲ２、ＨＢＥＧＦ、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＦＩ３０、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＡＭＤＣ２、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ１４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＢＰ、ＰＲＧ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＰＴＸ３、ＲＥＥＰ５、ＲＮＡＳＥ２、ＲＸＦＰ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ７Ａ６、ＳＴＸ７、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＩＭＰ１、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＴＳ２およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；
ＡＵＲＫＡ、Ｃ１３ｏｒｆ３４、ＣＣＮＡ１、ＤＳＣＣ１、ＦＡＭ３３Ａ、ＨＰＧＤ、ＮＥＫ６、ＰＹＨＩＮ１、ＲＡＳＳＦ４、ＴＸＮＬ４ＢおよびＺＷＩＮＴからなる細胞周期関連遺伝子；
ＭＰＯ、ＩＥＲ３、ＢＩＫ、ＴＸＮＤＣ１、ＧＡＤＤ４５ＢおよびＮＡＩＰからなるアポトーシス関連遺伝子；
ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＡＲＲＢ１、ＤＵＳＰ６、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＭＳ４Ａ３、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＤ、ＰＸＫ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＢＩＦ、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＧＳ１８およびＳ１００Ａ１１からなるシグナル伝達関連遺伝子；
ＷＴ１、ＭＹＣおよびＨＬＸからなる転写因子遺伝子；ならびに
ＡＣＴＲ２、ＡＬＯＸ５、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＡＴＬ３、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｄ、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｃ１７ｏｒｆ６０、Ｃ１８ｏｒｆ１９、Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１、Ｃ１ｏｒｆ１３５、Ｃ１ｏｒｆ１６３、Ｃ１ｏｒｆ１８６、Ｃ６ｏｒｆ１５０、ＣＡＬＭＬ４、ＣＣＴ５、ＣＬＣ、ＣＯＭＭＤ８、ＣＯＴＬ１、ＣＯＸ１７、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴＡ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＧ、ＣＹＢＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＤＥＮＮＤ３、ＤＨＲＳ３、ＤＬＡＴ、ＤＬＥＵ２、ＤＰＨ３、ＥＦＨＤ２、ＥＮＣ１、ＥＸＯＳＣ３、ＦＡＭ１０７Ｂ、ＦＡＭ１２９Ａ、ＦＡＭ３８Ｂ、ＦＢＸＯ２２、ＦＬＪ１４２１３、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＮＰＤＡ１、ＧＲＰＥＬ１、ＧＴＳＦ１、ＨＩＧ２、ＨＮ１、ＨＶＣＮ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ３Ａ、ＩＫＩＰ、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＹＮＵ、ＬＣＭＴ２、ＭＥ１、ＭＩＲＮ２１、ＭＫＫＳ、ＭＮＤＡ、ＭＴＨＦＤ２、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ１Ｆ、ＮＡＧＡ、ＮＣＦ２、ＮＣＦ４、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＰ、ＮＲＩＰ３、ＯＢＦＣ２Ａ、ＰＡＲＰ８、ＰＤＬＩＭ１、ＰＤＳＳ１、ＰＧＭ２、ＰＩＧＫ、ＰＩＷＩＬ４、ＰＰＣＤＣ、ＰＰＩＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＵＳ７、ＲＰＰ４０、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｚ、ＳＡＭＨＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＰＣＳ２、ＳＰＰＬ２Ａ、ＴＥＳＣ、ＴＨＥＸ１、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＥＭ３３、ＴＲＩＰ１３、ＴＵＢＢ６、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＧＣＧ、ＶＳＴＭ１、ＷＤＲ４、ＷＩＴ１、ＷＳＢ２およびＺＮＦ２５３からなるその他の遺伝子
から選ばれる少なくとも１種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程、ならびに
ｃ）前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程を含む、製造方法。
［１１］白血病幹細胞マーカー遺伝子が、
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＹ８６、Ｐ２ＲＹ５、ＰＴＨ２Ｒ、ＳＵＣＮＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＹＲＯＢＰおよびＶＮＮ１から選ばれる少なくとも１種の細胞表面マーカー遺伝子である、［１０］に記載の製造方法。
［１２］下記遺伝子群：
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＺＵ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＬＣＲＬ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ９３、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＦＤ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣＬ１、ＣＯＣＨ、ＣＳＴ７、ＣＸＣＬ１、ＤＯＫ２、ＥＭＲ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ１０９Ｂ、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＡＶＣＲ２、ＨＢＥＧＦ、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＦＩ３０、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＡＭＤＣ２、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ１４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＢＰ、ＰＲＧ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＰＴＸ３、ＲＥＥＰ５、ＲＮＡＳＥ２、ＲＸＦＰ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ７Ａ６、ＳＴＸ７、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＩＭＰ１、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＴＳ２およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；
ＡＵＲＫＡ、Ｃ１３ｏｒｆ３４、ＣＣＮＡ１、ＤＳＣＣ１、ＦＡＭ３３Ａ、ＨＰＧＤ、ＮＥＫ６、ＰＹＨＩＮ１、ＲＡＳＳＦ４、ＴＸＮＬ４ＢおよびＺＷＩＮＴからなる細胞周期関連遺伝子；
ＭＰＯ、ＩＥＲ３、ＢＩＫ、ＴＸＮＤＣ１、ＧＡＤＤ４５ＢおよびＮＡＩＰからなるアポトーシス関連遺伝子；
ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＡＲＲＢ１、ＤＵＳＰ６、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＭＳ４Ａ３、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＤ、ＰＸＫ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＢＩＦ、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＧＳ１８およびＳ１００Ａ１１からなるシグナル伝達関連遺伝子；
ＷＴ１、ＭＹＣおよびＨＬＸからなる転写因子遺伝子；ならびに
ＡＣＴＲ２、ＡＬＯＸ５、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＡＴＬ３、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｄ、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｃ１７ｏｒｆ６０、Ｃ１８ｏｒｆ１９、Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１、Ｃ１ｏｒｆ１３５、Ｃ１ｏｒｆ１６３、Ｃ１ｏｒｆ１８６、Ｃ６ｏｒｆ１５０、ＣＡＬＭＬ４、ＣＣＴ５、ＣＬＣ、ＣＯＭＭＤ８、ＣＯＴＬ１、ＣＯＸ１７、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴＡ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＧ、ＣＹＢＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＤＥＮＮＤ３、ＤＨＲＳ３、ＤＬＡＴ、ＤＬＥＵ２、ＤＰＨ３、ＥＦＨＤ２、ＥＮＣ１、ＥＸＯＳＣ３、ＦＡＭ１０７Ｂ、ＦＡＭ１２９Ａ、ＦＡＭ３８Ｂ、ＦＢＸＯ２２、ＦＬＪ１４２１３、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＮＰＤＡ１、ＧＲＰＥＬ１、ＧＴＳＦ１、ＨＩＧ２、ＨＮ１、ＨＶＣＮ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ３Ａ、ＩＫＩＰ、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＹＮＵ、ＬＣＭＴ２、ＭＥ１、ＭＩＲＮ２１、ＭＫＫＳ、ＭＮＤＡ、ＭＴＨＦＤ２、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ１Ｆ、ＮＡＧＡ、ＮＣＦ２、ＮＣＦ４、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＰ、ＮＲＩＰ３、ＯＢＦＣ２Ａ、ＰＡＲＰ８、ＰＤＬＩＭ１、ＰＤＳＳ１、ＰＧＭ２、ＰＩＧＫ、ＰＩＷＩＬ４、ＰＰＣＤＣ、ＰＰＩＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＵＳ７、ＲＰＰ４０、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｚ、ＳＡＭＨＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＰＣＳ２、ＳＰＰＬ２Ａ、ＴＥＳＣ、ＴＨＥＸ１、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＥＭ３３、ＴＲＩＰ１３、ＴＵＢＢ６、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＧＣＧ、ＶＳＴＭ１、ＷＤＲ４、ＷＩＴ１、ＷＳＢ２およびＺＮＦ２５３からなるその他の遺伝子
からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質の有効量を対象に投与することを含む、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の予防または治療方法。
本発明は、ヒト原発性ＡＭＬ由来の白血病幹細胞（ＬＳＣ）の網羅的発現プロファイリングを解析し、ＨＳＣからＬＳＣを分離するＬＳＣ特異的標的の同定に成功したことにより、完成したものである。したがって、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーは、非幹細胞とＬＳＣとの識別のみならず、これまで識別が困難とされてきた正常の造血幹細胞（ＨＳＣ）とＬＳＣとの識別を可能ならしめるものである。本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを分子標的とすることにより、ＡＭＬの発症源または再発源であるＬＳＣに特異的に作用する治療剤を提供することができる。
また、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標としてＦＡＣＳ等の細胞選別装置を用いて、患者またはドナーの骨髄細胞からＬＳＣを特異的に除去することができる。これにより、ＡＭＬの真の発症源または再発源を有効に除去することにつながる。したがって、ＡＭＬの再発を有意に防止することができる。
さらに、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標として、採取した生体試料中または生体内でＬＳＣの存否を測定することができ、これにより急性骨髄性白血病の再発または初発を予測することもできる。
図１は正常ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣおよびＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＬＳＣの移植結果を示す。（上図）正常ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の移植はヒトＣＤ４５＋造血細胞の効率的な再構成という結果になった。ヒトＣＤ４５＋細胞内で、ＣＤ１１ｃ＋の通常の樹状細胞、ＣＤ１２３ｈｉｇｈ形質細胞様樹状細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞など正常ヒト免疫細胞が分化することからＣＤ３４＋ＣＤ３８−が造血幹細胞であることがわかる。（下図）ＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を移植したところ、レシピエントマウスでのＡＭＬが発症した。レシピエントのＢＭは、マウスの細胞でなく、完全にヒトＣＤ４５＋細胞で占有された。移植されたヒト細胞は、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞等の正常な免疫サブセットのいずれも含まなかったことから、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞に正常造血幹細胞が含まれず、白血病幹細胞であることが確認された。 図２は正常ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣよりもＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＬＳＣにおいて大量に発現する遺伝子を示す。ヒートマップは３５個の突出したＬＳＣマーカーに関するｑＰＣＲデータを含む：１）その機能および局在が抗ＡＭＬ薬剤の開発に適する、２）そのｍＲＮＡ量がＨＳＣよりもＬＳＣにおいて有意に（Ｐ＜０．０５）高い、３）そのｍＲＮＡ量のメジアン値がＨＳＣよりもＬＳＣにおいて５倍以上高い、および４）試験したすべてのＬＳＣ試料において、そのｍＲＮＡ量が各ＨＳＣ試料中のｍＲＮＡ量よりも高い。このパネルにおいて、赤、黄および緑は、本図の左下の参照色コードで示すように、それぞれ、高、中程度、低発現を示す。値１はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣ中のｍＲＮＡの平均値を示す。 図３はフローサイトメトリーを示す。ＬＳＣ特異的分子候補（ＣＤ３２、ＩＴＧＢ２、ＣＤ９３およびＣＤ３３）の発現をフローサイトメトリーで解析した。ヒストグラムは、正常ＨＳＣと５名のＡＭＬ患者から得られたＬＳＣの相対的発現を示す。 図４はＣＤ３２の機能アッセイおよび組織学的実験の結果を示す。ＦＡＣＳにより、ＣＤ３２の発現とＣＤ１３３の発現とを再度解析した。ＣＤ３２の発現パターンに従い、ＡＭＬ患者をＡＭＬ−ａとＡＭＬ−ｂのカテゴリーに分類した。正常ＨＳＣは、ＣＤ３２−画分内に独占的に同定された。同様に、白血病誘発活性は、ＡＭＬ−ａ群のＣＤ３２−画分に見られた。対照的に、ＡＭＬ−ｂにおいて、ＣＤ３２＋細胞はインビボＡＭＬ開始能を示した。ＡＭＬ−ｂにおいて、ＣＤ３２＋細胞は、骨髄の骨髄膜領域および中央領域の両方に検出された。 図５は、正常ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣよりもＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＬＳＣにおいて転写物が高発現している遺伝子候補のヒートマップ図を示す。２１７遺伝子を、ジーンオントロジーに基づいて６つのカテゴリー：１）細胞膜および細胞外、２）細胞周期、３）アポトーシス、４）シグナル伝達、５）転写因子および６）その他に分類した。２つのマイクロアレイプラットフォーム（Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２．０およびＧｅｎｅ １．０ＳＴ）での遺伝子発現レベルを別々に示した。各パネルにおいて、赤、黄および緑はそれぞれ、高、中程度および低発現を示す。 図６は、化学療法後のＡＭＬ患者において上記候補遺伝子のひとつであるＣＤ３２の発現がダウンレギュレートしないことを示すフローサイトメトリーの図である。 図７は、骨髄ニッチに存在し、細胞周期が静止した、白血病幹細胞における各マーカー遺伝子の発現を免疫蛍光染色で調べた図である。各遺伝子について４枚の写真をセットにし、左上の青色染色がＤＡＰＩ抗体（核染色）、左下の赤色染色が各マーカーに対する抗体、右上の緑色染色が細胞周期マーカーであるＣＤ３４に対する抗体（ＦＣＧＲ２Ａ，ＡＫ５，ＤＯＫ２， ＬＲＧ１，ＢＩＫの場合）またはＫｉ６７抗体（ＩＬ２ＲＡ，ＷＴ１，ＳＵＣＮＲ１の場合）を用いた結果を示す。右下は、Ｍｅｒｇｅを示す。
（定義）
本発明において、白血病の初発とは、白血病を初めて発症した、または発症が見込まれる状態をいい、白血病の再発とは、初発白血病の治療後または寛解後に再び発症した、または発症が見込まれる状態をいう。再発する組織または再発が見込まれる組織は、初発組織に限定されるものではなく、別の組織であってもよい。したがって、再発という概念には浸潤または転移も含まれる。
本発明において、白血病の治療とは、抗癌剤投与、放射線療法、骨髄移植を始めとしたあらゆる治療を包含する。
本発明において、白血病幹細胞（ＬＳＣ）とは、骨髄由来のＣＤ３４＋細胞画分であってよく、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞画分が好ましい。粗ＬＳＣ含有物は常法により被験者または患者の骨髄より採取することができ、ＬＳＣを含む細胞画分は、ＣＤ３４およびＣＤ３８の細胞表面マーカー分子を用いたフローサイトメトリーなどにより得ることができる。さらに、本発明により見出された白血病幹細胞マーカーから選択した別の細胞表面マーカー分子を指標にして、ＬＳＣをさらに選別することも可能である。
（試験方法）
本発明は、急性骨髄性白血病の初発または再発を予測するための試験方法を提供する。本発明の試験方法は、
（１）被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
（２）測定工程で得られた発現レベルを健常人の発現レベルと比較する工程を含む。
（１）被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程
本発明が標的とする白血病幹細胞マーカー遺伝子とは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞画分に比べてＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞画分で示差的に発現される遺伝子群の中から本発明者らが独自の視点に基づいて選別した、白血病幹細胞特異的マーカーであり、下記白血病幹細胞マーカー遺伝子（以下、単に「マーカー遺伝子」または「マーカー」と省略する場合がある）（１）から選ばれる２〜２１８の遺伝子から構成される。マーカー遺伝子（１）は、好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。
マーカー遺伝子（１）：
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＡＺＵ１、Ｃ３ＡＲ１、ＣＡＣＮＢ４、ＣＡＬＣＲＬ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＤ９３、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＦＤ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣＬ１、ＣＯＣＨ、ＣＳＴ７、ＣＸＣＬ１、ＤＯＫ２、ＥＭＲ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ１０９Ｂ、ＧＰＲ１６０、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＡＶＣＲ２、ＨＢＥＧＦ、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＦＩ３０、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＡＭＤＣ２、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ１４、Ｐ２ＲＹ５、ＰＬＡＵＲ、ＰＰＢＰ、ＰＲＧ２、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＰＴＸ３、ＲＥＥＰ５、ＲＮＡＳＥ２、ＲＸＦＰ１、ＳＬＣ３１Ａ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＬＣ６Ａ６、ＳＬＣ７Ａ６、ＳＴＸ７、ＳＵＣＮＲ１、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＩＭＰ１、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＭ９ＳＦ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、ＵＴＳ２およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；
ＡＵＲＫＡ、Ｃ１３ｏｒｆ３４、ＣＣＮＡ１、ＤＳＣＣ１、ＦＡＭ３３Ａ、ＨＰＧＤ、ＮＥＫ６、ＰＹＨＩＮ１、ＲＡＳＳＦ４、ＴＸＮＬ４ＢおよびＺＷＩＮＴからなる細胞周期関連遺伝子；
ＭＰＯ、ＩＥＲ３、ＢＩＫ、ＴＸＮＤＣ１、ＧＡＤＤ４５ＢおよびＮＡＩＰからなるアポトーシス関連遺伝子；
ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＡＲＲＢ１、ＤＵＳＰ６、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＭＳ４Ａ３、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＤ、ＰＸＫ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＢＩＦ、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＧＳ１８およびＳ１００Ａ１１からなるシグナル伝達関連遺伝子；
ＷＴ１、ＭＹＣおよびＨＬＸからなる転写因子遺伝子；ならびに
ＡＣＴＲ２、ＡＬＯＸ５、ＡＮＸＡ２Ｐ２、ＡＴＬ３、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｄ、Ｃ１２ｏｒｆ５、Ｃ１７ｏｒｆ６０、Ｃ１８ｏｒｆ１９、Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１、Ｃ１ｏｒｆ１３５、Ｃ１ｏｒｆ１６３、Ｃ１ｏｒｆ１８６、Ｃ６ｏｒｆ１５０、ＣＡＬＭＬ４、ＣＣＴ５、ＣＬＣ、ＣＯＭＭＤ８、ＣＯＴＬ１、ＣＯＸ１７、ＣＲＩＰ１、ＣＳＴＡ、ＣＴＳＡ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＧ、ＣＹＢＢ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＤＥＮＮＤ３、ＤＨＲＳ３、ＤＬＡＴ、ＤＬＥＵ２、ＤＰＨ３、ＥＦＨＤ２、ＥＮＣ１、ＥＸＯＳＣ３、ＦＡＭ１０７Ｂ、ＦＡＭ１２９Ａ、ＦＡＭ３８Ｂ、ＦＢＸＯ２２、ＦＬＪ１４２１３、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＧＮＰＤＡ１、ＧＲＰＥＬ１、ＧＴＳＦ１、ＨＩＧ２、ＨＮ１、ＨＶＣＮ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ３Ａ、ＩＫＩＰ、ＫＩＦ２Ｃ、ＫＹＮＵ、ＬＣＭＴ２、ＭＥ１、ＭＩＲＮ２１、ＭＫＫＳ、ＭＮＤＡ、ＭＴＨＦＤ２、ＭＹＯ１Ｂ、ＭＹＯ１Ｆ、ＮＡＧＡ、ＮＣＦ２、ＮＣＦ４、ＮＤＵＦＡＦ１、ＮＰ、ＮＲＩＰ３、ＯＢＦＣ２Ａ、ＰＡＲＰ８、ＰＤＬＩＭ１、ＰＤＳＳ１、ＰＧＭ２、ＰＩＧＫ、ＰＩＷＩＬ４、ＰＰＣＤＣ、ＰＰＩＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＵＳ７、ＲＰＰ４０、ＲＲＭ２、Ｓ１００Ａ１６、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ｐ、Ｓ１００Ｚ、ＳＡＭＨＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＰＣＳ２、ＳＰＰＬ２Ａ、ＴＥＳＣ、ＴＨＥＸ１、ＴＭＥＭ３０Ａ、ＴＭＥＭ３３、ＴＲＩＰ１３、ＴＵＢＢ６、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＧＣＧ、ＶＳＴＭ１、ＷＤＲ４、ＷＩＴ１、ＷＳＢ２およびＺＮＦ２５３からなるその他の遺伝子。
前記白血病幹細胞マーカー遺伝子を構成する個々の遺伝子は公知であり、その塩基配列およびアミノ酸配列も既知である。ＩＬ２ＲＡを除くマーカー遺伝子のシンボル名、Ｇｅｎｅ ＩＤ、位置する染色体およびその特徴などを表１に示す。ＩＬ２ＲＡは、ＣＤ２５とも称し、Ｇｅｎｅ ＩＤ：３５５９、第１０染色体に位置し、インターロイキン２受容体アルファをコードする。ＩＬ２ＲＡタンパク質は、細胞膜に局在する膜貫通型受容体である。
本発明の試験方法がＬＳＣとＨＳＣとをより明確に識別することを目的とする場合、上記マーカー遺伝子（１）の中から、例えば、下記マーカー遺伝子（２）を指標とすることが好ましい。この実施態様において、マーカー遺伝子（２）は２〜５８の遺伝子から構成され、より好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。また、ＬＳＣとＨＳＣとをさらにより明確に識別することを目的とする場合、マーカー遺伝子（２）の中から、下記マーカー遺伝子（３）を指標とすることが好ましい。マーカー遺伝子（３）は、ＨＳＣに比べてＬＳＣにおいて、通常５倍以上の示差的発現が観察されるのでより好ましい。この実施態様において、マーカー遺伝子（３）は２〜３５の遺伝子から構成され、より好ましくは３以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上または２５以上の遺伝子から構成される。
マーカー遺伝子（２）：
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＵＣＡ２、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＬＹ８６、ＭＧＡＴ４Ａ、Ｐ２ＲＹ５、ＰＲＳＳ２１、ＰＴＨ２Ｒ、ＲＮＡＳＥ２、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＵＣＮＲ１、ＴＩＭＰ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰ、およびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；ＺＷＩＮＴ、ＮＥＫ６およびＴＸＮＬ４Ｂからなる細胞周期関連遺伝子；ＢＩＫからなるアポトーシス関連遺伝子；ＡＫ５、ＡＲＨＧＡＰ１８、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＣＤ、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ８ＡおよびＲＡＢＩＦからなるシグナル伝達関連遺伝子；ＷＴ１およびＨＬＸからなる転写因子遺伝子；ならびにＣＹＢＢ、ＣＴＳＣおよびＮＣＦ４からなるその他の遺伝子。
マーカー遺伝子（３）：
ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＣＬ５、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＧＲ２Ａ、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＴＧＢ２、ＬＧＡＬＳ１、ＬＲＧ１、ＰＴＨ２Ｒ、ＲＮＡＳＥ２、ＴＮＦ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＹＲＯＢＰおよびＶＮＮ１からなる細胞膜または細胞外局在遺伝子；ＮＥＫ６からなる細胞周期関連遺伝子；ＢＩＫからなるアポトーシス関連遺伝子；ＡＫ５、ＦＹＢ、ＨＣＫ、ＬＰＸＮ、ＰＤＥ９Ａ、ＰＤＫ１、ＰＲＫＣＤおよびＲＡＢ２０からなるシグナル伝達関連遺伝子；ＷＴ１からなる転写因子遺伝子；ならびにＣＴＳＣおよびＮＣＦ４からなるその他の遺伝子。
本発明の試験方法における被験者は、ヒトを始めとする哺乳動物であれば特に限定されるものではないが、白血病の初発または再発が疑われるヒトが好ましい。
本発明の試験方法が測定対象とする生体試料は、哺乳動物、好ましくはヒトから採取可能なものであれば特に限定されるものではなく、血液、骨髄液、リンパ液などの体液試料、リンパ節、血管、骨髄、脳、脾臓、皮膚などの固形試料があげられる。
本発明の試験方法において、マーカー遺伝子の発現レベルは、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する。転写産物を対象とする場合、常法に従い、ＲＮＡを生体試料から単離することができる。ＲＮＡを抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。具体的には、Ｑｉａｇｅｎなどの製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼを用いて、製造業者の指示に従ってＲＮＡ単離を行うことができる。
転写産物を対象とするマーカー遺伝子の発現レベルの測定方法としては、特に限定されるものではないが、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３（１９９９））；ＲＮａｓｅプロテクション・アッセイ法（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２−８５４（１９９２））；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４（１９９２））；リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４（１９９６））；ならびにマイクロアレイ解析法などがある。マイクロアレイ解析法は、製造業者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ技術、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのマイクロアレイ技術またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いるなどして、市販されている装置によって実施することができる。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲの詳細は、後述する実施例に記載されている。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲに好適に用いられるプライマーおよびプローブの塩基配列の例は、表３および配列表にリストされている。
マーカー遺伝子の翻訳産物を対象とする場合、常法に従い、タンパク質を生体試料から単離することができる。タンパク質を抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。なお、製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼインヒビターを用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質の単離を行うことができる。
翻訳産物を対象とするマーカー遺伝子の発現レベルの測定方法としては、特に限定されるものではないが、免疫組織化学法、プロテオミクス法などがあげられる。免疫組織化学法は、各マーカー遺伝子産物に対して特異的な抗体を用いて発現を検出する。免疫組織化学法のプロトコールおよびキットは、当技術分野において周知されていて市販されている。プロテオミクス法は、あるサンプルにおけるタンパク質発現の全体的な変化を調べることを含む。プロテオミクス法は、一般的に以下の工程を含む：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）によるサンプル中の各タンパク質の分離、（２）このゲルから回収された各タンパク質の同定、例えば、質量分析またはＮ−末端配列決定法、および（３）バイオインフォマティクスを用いたデータ解析。プロテオミクス法は、他の遺伝子発現プロファイリング法の有用な補助法であり、本発明のマーカー遺伝子の産物を検出するために単独または他の方法と組み合わせて使用することができる。また、細胞表面マーカーを標的とする場合、フローサイトメトリーを用いた測定方法が可能である。
（２）測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程
生体試料中のマーカー遺伝子の２〜２１８種類の発現レベルを測定した結果、それらの２種以上の発現レベルが基準値と比べて有意に高い（遺伝子の発現に約２倍以上、好ましくは約４倍以上、より好ましくは約６倍以上、最も好ましくは約１０倍以上の違いがある）場合、当該試料中または被験者の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される。ここで、基準値としては、健常人の発現レベルの平均値あるいは被験者の発症前の平均値など比較対照となる値が用いられる。白血病幹細胞の存在可能性の示唆は、被験対象において白血病の初発または再発の予想につながる。白血病の初発または再発の有無を、さらに別の検査によって確認することが好ましい。
本発明の試験方法において、生体試料中のマーカー遺伝子の２〜２１８種類の発現レベルを測定した結果、それらの２種以上の発現レベルが基準値と比べて有意に高い（遺伝子の発現に約２倍以上、好ましくは約４倍以上、より好ましくは約６倍以上、最も好ましくは約１０倍以上の違いがある）場合、当該試料中または試料の採取元の生体内に白血病幹細胞の存在可能性が示唆される。ここで、基準値としては、健常人の発現レベルの平均値あるいは被験者の発症前の発現レベルなど比較対照となる値が用いられる。この場合、白血病幹細胞の存在可能性は、白血病患者において癌の治療効果が完全に奏していないとの予測につながる。逆に、前記２種以上の発現レベルが有意に低い（例えば、実質的にゼロ）場合、当該試料中に白血病幹細胞が存在しないと予測することができる。この場合、白血病の治療によって白血病幹細胞が消失し、治療が奏効していると考えられる。さらに、その他の検査と組み合わせて、白血病の治療効果を多面的に確認することが好ましい。
このように、本発明の試験方法を適用することにより、生体内に存在する白血病幹細胞を白血病が初発または再発する前に検出して、発症を予測することが可能である。あるいは、白血病の発症を初期のステージで検出して癌患者の早期治療に導くことも可能である。さらに、白血病患者に対する治療効果を白血病幹細胞の存否を指標にして評価することも可能である。
（治療剤）
また、本発明は、白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤を提供する。
本発明の治療剤の分子標的は、前述した白血病幹細胞マーカー遺伝子であり、治療目的に応じてどのマーカーを選択してもよい。本発明の治療剤が、白血病幹細胞の中でも、骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性を示す幹細胞を標的とする場合、ＡＫ５、ＢＩＫ、ＤＯＫ２、ＦＣＧＲ２Ａ、ＩＬ２ＲＡ、ＬＲＧ１、ＳＵＣＮＲ１およびＷＴ１からなる群より選ばれる遺伝子（以下、マーカー遺伝子（４）とも称する）の発現を抑制し得る物質または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質を選択することが推奨される。マーカー遺伝子（４）を構成する８の遺伝子から２〜８（好ましくは２〜５）を選択して分子標的とすることにより、多数の症例の白血病幹細胞を駆逐できる可能性が高い。したがって、本発明の治療剤に含まれる有効成分は、少なくとも１つであり、治療目的に応じて２以上を組み合わせることが好ましい。２以上の有効成分は、１つの医薬製剤に含まれていてもよく、別々の医薬製剤に含まれていてもよい。
以下、有効成分について説明する。
白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現を抑制し得る物質としては、例えば、アンチセンス核酸またはＲＮＡｉ誘導性核酸などがあげられる。
白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質としては、例えば、アプタマーまたは抗体などがあげられる。当該物質は、各マーカーに直接または間接に作用する阻害物質であってもよい。
以下、本発明の治療剤の有効成分について説明する。
１．アンチセンス核酸
アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等があげられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５個のヌクレオチド程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５個以上のヌクレオチド、好ましくは約１５個〜約１００個のヌクレオチド、より好ましくは約１８個〜約５０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
２．ＲＮＡｉ誘導性核酸
ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）効果を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡである。ＲＮＡｉ効果とは、ｍＲＮＡと同一の核酸配列またはその部分配列を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する現象をいう。ＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも１９の連続する標的ｍＲＮＡと同一の核酸配列（またはその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどがあげられるが、ｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘導できる限り特に制限されないが、例えば１９〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長である。
３．アプタマー
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性（または阻害活性）を有するポリヌクレオチドをいう。アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチドまたはそれらの混合物である。アプタマーはまた、直鎖状または環状の形態であってもよい。アプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１６〜約２００個のヌクレオチドであるが、例えば約１００個のヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０個のヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０個のヌクレオチド以下である。また、アプタマーの長さは、例えば約１８個、約２０個、約２５個または約３０個ヌクレオチド以上であってもよい。アプタマーは、結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位および／または４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどがあげられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化、Ｓ−アリル化およびアミノ化があげられる（例、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １９， ７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １９， ２６２９−２６３５参照）。アプタマーはまた、プリン、ピリミジンが改変されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルでの置換があげられる。また、ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基が、チオエート、ジチオエートまたはアミデートで置換されていてもよい。アプタマーは、既報（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ， ３４６， ８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ５０５−５１０）に従って作製できる。
４．抗体
抗体は、ポリクローナル抗体（抗血清）、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよいが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭである。
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物があげられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。
キメラ抗体は、その可変領域および定常領域が互いに異なる動物種のイムノグロブリンに由来するモノクローナル抗体を意味する。例えば、キメラ抗体は、その可変領域がマウスイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であるマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体であり得る。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。
キメラ抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、既報（例、実験医学（臨時増刊号）， Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ．１０， １９８８および特公平３−７３２８０号公報）に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つまたは別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。
ヒト化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、例えば、その超可変領域の相補性決定領域の一部または全部がマウスモノクローナル抗体に由来し、その可変領域の枠組領域およびその定常領域がヒトイムノグロブリンに由来するヒト型モノクローナル抗体を意味する。超可変領域の相補性決定領域は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）であり、可変領域の枠組領域は、該３つの相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）である。換言すれば、例えばマウスモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部または全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。
ヒト化抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換えヒト化抗体は、既報（例、特表平４−５０６４５８号公報および特開昭６２−２９６８９０号公報）に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。または、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト化抗体産生細胞を得、該細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト化抗体を得ることができる。
ヒト抗体は、イムノグロブリンを構成するＨ鎖およびＬ鎖の可変領域および定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体を意味する。
ヒト抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、ヒト抗体は、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．１５， ｐ．１４６−１５６， １９９７；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ．７， ｐ．１３−２１， １９９４；特表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３６８， ｐ．８５６−８５９， １９９４；および特表平６−５００２３３号公報）に従って作製できる。
抗体はまた、前述の抗体（例、モノクローナル抗体）の一部であり得る。このような抗体としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ等のフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
前記抗体は、種々の抗癌物質などを常法により結合したイムノコンジュゲートの形態であってもよい。この場合、抗体は、ＬＳＣに抗癌剤を送達するための薬物送達システムとして機能する。組み合わせる抗癌物質としては、シスプラチン、カルボプラチン、シクロフォスファミド、メルファラン、カルムスリン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、シタラビン（ＡｒａＣ）、メルカプトプリン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、チオグアニン、アザシチジン、アムサクリン、ドキソルビシン、トレチノイン、アロプリノール、プレドニゾン（プレドニゾロン）、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン（アクチノマイシン）、マイトマイシンＣ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、エトポシド、コルヒチン、デフェロキサミンメシレート、カンプトテシンなどがあげられるが、これに限定されるものではない。さらに、放射線核種、毒素等とのイムノコンジュゲートであってもよい。
本発明の剤は、白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現または当該遺伝子の翻訳産物の活性を抑制し得る物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどがあげられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤があげられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約５．０ｇである。
本発明の剤の投与対象としては造血組織（骨髄）を有し、急性骨髄性白血病に羅患する可能性がある動物種であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
（製造方法）
また、本発明は、急性骨髄性白血病患者に対する自家移植または同種移植のための造血細胞を含む試料の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、
ａ）当該患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程、
ｂ）採取した試料と、少なくとも１種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程、ならびに
ｃ）前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程を含む。すなわち、本発明は、自家移植または同種移植用の造血細胞を含む試料から白血病幹細胞を実質的に除去し、再発の懸念のない移植用試料を提供することができる。
白血病幹細胞マーカー遺伝子は、前述の通りであるが、パージング目的のためには、下記遺伝子群：
ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＹ８６、Ｐ２ＲＹ５、ＰＴＨ２Ｒ、ＳＵＣＮＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＹＲＯＢＰおよびＶＮＮ１から選ばれる少なくとも１種の細胞表面マーカー遺伝子を標的とすることが好ましい。
ａ）急性骨髄性白血病患者またはドナーから造血細胞を含む試料を採取する工程
試料は、通常、骨髄穿刺または末梢血採取により行われる。骨髄穿刺は、例えば、Ｓ． Ｅ． Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｂｏｎｅ， １３， ８１ （１９９２）に記載された方法等に基づき胸骨または腸骨から骨髄穿刺を行う。具体的には、骨髄穿刺を行う場所の皮膚面を消毒し、局所麻酔を行う。特に骨膜下を充分に麻酔する。骨髄穿刺針の内筒を抜き、５０００単位のヘパリンを入れた１０ｍＬ注射器を装着して必要量の骨髄液を速やかに吸引する。平均的には１０ ｍＬ〜２０ ｍＬの骨髄液を吸引する。骨髄穿刺針を取り外し、１０分間程圧迫止血する。取得した骨髄液を１，０００×ｇの遠心分離により骨髄細胞を回収した後、該骨髄細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄する。洗浄工程を数回繰り返した後、造血細胞を含む試料を得ることができる。
末梢血の場合は、静脈から採取を行う。具体的には、末梢血採取を行う場所の皮膚面を消毒する。注射針の内筒を抜き、５０００単位のヘパリンを入れた１０ｍＬ注射器を装着して必要量の末梢血を速やかに吸引する。平均的には１０ｍＬ〜２０ｍＬの末梢血を吸引する。注射針を取り外し、１０分間程圧迫止血する。取得した末梢血を１，０００×ｇの遠心分離により末梢血細胞を回収した後、該末梢血細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄する。洗浄工程を数回繰り返した後、造血細胞を含む試料を得ることができる。
ｂ）採取した試料と、少なくとも１種の白血病幹細胞マーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質とを接触させる工程
本工程で用いるマーカー遺伝子の翻訳産物を認識する物質は、前述した抗体があげられ、特に、ＡＤＦＰ、ＡＬＯＸ５ＡＰ、ＣＡＣＮＢ４、ＣＤ３３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ９３、ＣＤ９７、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＤＯＫ２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８４、ＨＣＳＴ、ＨＯＭＥＲ３、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＢ２、ＬＹ８６、Ｐ２ＲＹ５、ＰＴＨ２Ｒ、ＳＵＣＮＲ１、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＹＲＯＢＰおよびＶＮＮ１から選ばれる少なくとも１種の細胞表面マーカーに対する抗体が好ましい。抗体は蛍光標識されていることが好ましく、標識に用いる蛍光色素はフローサイトメトリーに一般的に用いられている蛍光物質であることが好ましい。蛍光色素の具体例としては、ＦＩＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−ＴＲ（ＰＥ−テキサスレッド）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）およびＡＰＣ−Ｃｙ７などがあげられる。接触は、前記細胞表面マーカー（抗原）と抗体との結合が達成される条件であれば特に限定されない。
ｃ）前記物質が結合した細胞を選別し、白血病幹細胞がパージングされた試料を得る工程
本工程において、細胞の選別は、フローサイトメトリーと組み合わせることで容易に達成することができる。蛍光標識した抗体と接触させた試料をフローサイトメーターにセットし、抗体と結合した細胞を選別し、当該試料から白血病幹細胞を分離することができる。
このようにして得られたＬＳＣがパージングされた試料は、ＬＳＣが効率的に除去され、ＨＳＣは除去されずに逆に濃縮されることによって、再発の懸念なくＡＭＬの患者の治療に用いることができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
ヒト試料
すべての実験は、理化学研究所免疫・アレルギー科学総合研究センターのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈからの承認により実施した。ＡＭＬ患者由来の白血病細胞は、書面によるインフォームドコンセントにより収集した。健常ドナー由来のＣＢ（臍帯血）は、書面によるインフォームドコンセントとともにＴｏｋｙｏ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋにより収集した。健常ドナー由来のＢＭＭＮＣ（骨髄単核球細胞）は、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手した。ＡＭＬ患者由来のＢＭＭＮＣおよびＣＢＭＮＣ（臍帯血単核球細胞）は、密度勾配遠心分離を使用して単離した。
ＦＡＣＳおよびフローサイトメトリーによる解析
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）のため、ＡＭＬ患者のＢＭＭＮＣ細胞を、蛍光色素結合マウス抗ｈＣＤ３、抗ｈＣＤ４、抗ｈＣＤ８、抗ｈＣＤ３４および抗ｈＣＤ３８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で標識し、レシピエントＢＭＭＮＣ細胞を、マウス抗ｈＣＤ４５、抗ｈＣＤ３４および抗ｈＣＤ３８モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、ＦＡＣＳＡｒｉａ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞をソーティングした。ＦＳＣ／ＳＳＣ高さおよびＦＳＣ／ＳＳＣ幅の分析によって、ダブレットを排除した。ソーティング後のｈＣＤ３４＋ｈＣＤ３８−およびｈＣＤ３４＋細胞の純度は、９８％よりも高かった。フローサイトメトリー解析のため、ＡＭＬ患者のＢＭＭＮＣ、レシピエント末梢血またはレシピエントＢＭを、上述した蛍光色素結合マウス抗ｈＣＤ３、抗ｈＣＤ４、抗ｈＣＤ８、抗ｈＣＤ３４および抗ｈＣＤ３８モノクローナル抗体またはマウス抗ｈＣＤ４５、抗ｈＣＤ３４および抗ｈＣＤ３８モノクローナル抗体で標識した。
マイクロアレイ解析
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて当該ＲＮＡの完全性を評価した。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２．０ジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に対して、Ｔｗｏ−Ｃｙｃｌｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてビオチン化ｃＲＮＡを合成した。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ＳＴジーンチップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に対して、第１ラウンドのｃＤＮＡ合成およびｃＲＮＡ増幅を、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、続く第２ラウンドのｃＤＮＡ合成、ビオチン化および断片化を、ＷＴ ｃＤＮＡ合成およびＴｅｒｍｉｎａｌ Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて行った。ハイブリダイゼーション、洗浄、染色およびスキャニングを、製造業者の指示書に従って行った。まず、各プラットフォームについて、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／）を用いて、マイクロアレイデータを別々に解析した。マイクロアレイプラットフォーム上のプローブセットのシグナル強度を、ＧＣ−ＲＭＡプログラム（Ｚｈｉｊｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｔａｔ． Ａｓｓｏｃ．， ９９， ９０９−９１７， ２００４）を用いて正規化した。各プラットフォームに対して、正規化したデータをＲａｎｋＰｒｏｄプログラム（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２２， ２８２５−２８２７， ２００６）により解析し、カットオフｐ値０．０１かつ擬陽性推定０．０５％として、ＬＳＣとＨＳＣとの間で示差的に発現した遺伝子を選択した。ＨＳＣに比べてＬＳＣで有意に高いレベルの発現が両方のマイクロアレイプラットフォームで共通して観察された場合、当該遺伝子を顕著なＬＳＣマーカーの遺伝子候補として選択した（図５、表１）。さらに、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ＳＴジーンチップにおいて高率にヒットした遺伝子ＩＬ２ＲＡも、タンパク質レベルでの解析結果がよく、後述する抗癌剤抵抗性の幹細胞で発現しているという観点から、マーカー遺伝子候補として選択した（表１）。候補の局在および生物学的機能は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓデータベース（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびジーンオントロジーアノテーションデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＧＯＡ／）の情報に基づいてアノテーションした。
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析
ＨＳＣおよびＬＳＣから１０ｎｇの全ＲＮＡを、ＷＴ−Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ増幅システム（Ｎｕｇｅｎ）を用いるｃＤＮＡ増幅に供した。ｃＤＮＡ産物をＴＥで１：７．５に希釈し、２５μｌのｑＰＣＲ反応あたり１μｌの希釈産物を使用した。二重標識した蛍光プローブおよび遺伝子特異的プライマー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の配列を、表３に記載した。ＰＣＲ反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。各転写物の存在量は、標準曲線法（Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２５， ３８６−４０１， ２００１）により計算した。Ｋａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈソフトウェアパッケージ中のＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定のいずれかがＰ＜０．０５を示した場合、ＬＳＣとＨＳＣとの間で発現レベルが有意に異なるとみなした。
動物
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／Ｓｚ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ）マウスは、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子座の完全ヌル変異をＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）系統と戻し交雑することによって、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）で開発された（Ｓｈｕｌｔｚ， Ｌ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４， １８０−１９１ （１９９５））。マウスを、理研およびＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの動物施設で、各施設でＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって確立されたガイドラインに従って、照射した食物および酸性化した水を用いて飼育し、規定された細菌叢のもとで維持した。
異種移植
新生仔（誕生後２日以内） ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウスに、１３７Ｃｓ源照射器を使用して、１５０ｃＧｙの全身照射を与え、その後２時間以内にＡＭＬ細胞の静脈内注射を行なった。レシピエントは、３〜４週間毎に後眼窩から採血し、末梢血ヒトＡＭＬ移植キメリズムを調べた。
免疫蛍光標識およびイメージング
原発ＡＭＬ移植レシピエントの大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製した。標識に使用した一次抗体は、マウス抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ， Ｄｅｎｍａｒｋ）およびウサギ抗ＣＤ３２モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ， ＵＫ）であった。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ＥｘｃｉｔｅｒおよびＬＳＭ ７１０ （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た。
免疫蛍光標識およびイメージング（２）
原発ＡＭＬを移植し、抗癌剤処置したレシピエントの大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製し、ＤＡＰＩ（核染色：青）；各マーカー（ＦＣＧＲ２Ａ， ＡＫ５， ＤＯＫ２， ＬＲＧ１， ＢＩＫ， ＩＬ２ＲＡ， ＷＴ１， ＳＵＣＮＲ１：赤）；静止細胞マーカー（緑：ＣＤ３４（ＦＣＧＲ２Ａ， ＡＫ５， ＤＯＫ２， ＬＲＧ１， ＢＩＫ）またはＫｉ６７（ＩＬ２ＲＡ， ＷＴ１， ＳＵＣＮＲ１）に対する抗体で標識した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ＥｘｃｉｔｅｒおよびＬＳＭ ７１０ （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た（図７）。
表２：正常ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣｓよりもＡＭＬ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＬＳＣｓで転写物が大量に発現している遺伝子のリスト
表３：ｑＲＴ−ＰＣＲで用いたプライマー、プローブおよびＰＣＲ産物のリスト
マイクロアレイ実験で同定された２１７遺伝子の中から、次なるｑＰＣＲ解析のため、以下のカテゴリー中の分子をコードする１２１遺伝子を選択した：
１）細胞膜または細胞外間隙に位置するもの、
２）サイトカイン、成長因子、膜貫通型受容体、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、転写制御分子、および／またはシグナル伝達分子、ならびに
３）免疫調節、細胞周期、アポトーシス、および／または細胞接着に関与するもの。
リストは５７遺伝子を含み、当該遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＨＳＣよりもＬＳＣにおいて有意に（Ｐ＜０．０５ ；Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−検定による）高かった。表２中の左欄から順に、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ（Ｃｏｌｕｍｎ Ａ）、ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｂ）、局在（Ｃｏｌｕｍｎ Ｃ）、分子の機能（Ｃｏｌｕｍｎ Ｄ）、生物学的プロセス（Ｃｏｌｕｍｎ Ｅ）、各統計学的検定のＰ−ｖａｌｕｅ（Ｃｏｌｕｍｎｓ Ｆ−Ｈ）、ｍＲＮＡレベルのメジアン値の比（Ｃｏｌｕｍｎ Ｉ）およびＨＳＣ試料のｍＲＮＡレベルよりも高い発現レベルを示すＬＳＣ試料の数（Ｃｏｌｕｍｎ Ｊ）を示す。
本発明者らは、以前、ＡＭＬ患者起源の骨髄（ＢＭ）由来のＬＳＣおよびＡＭＬ患者ＢＭを移植したマウスのＢＭ由来のＬＳＣが類似した転写プロファイルを共有することを報告した（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００７、上述）。この知見に基づき、本発明者らは、２つのアレイプラットフォーム：Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（１６名のＡＭＬ患者由来および５つのＡＭＬ移植マウス由来のＢＭを２名の健常ドナー由来のＢＭおよび５名の健常ドナー由来の臍帯血（ＣＢ）と比較）およびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅ １．０ＳＴ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（１名のＡＭＬ患者由来ＢＭおよび５つのＡＭＬ移植マウス由来のＢＭを健常ドナー１名のＣＢおよび４名のＢＭと比較）を用いて、ＬＳＣと正常造血幹細胞（ＨＳＣ）とを比較する網羅的トランスクリプトーム解析を行った。以前の研究によりＡＭＬ幹細胞が独占的にＣＤ３４＋ＣＤ３８−画分内に存在することが見出されていたので、＞１．２ｘ１０４個のＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を＞９８％の純度で回収した（図１）。また、同様の方法で、正常ＢＭおよびＣＢ試料からＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＨＳＣも精製した（図１）。新生ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯマウスに前記精製したＨＳＣおよびＬＳＣを静脈内注射することにより、ＬＳＣによるＡＭＬの発症および正常免疫再構成の欠如を確認し、ＨＳＣによる長期移植および多系統（Ｔ／Ｂ／骨髄）分化を確認した（図１）。ＡＭＬ移植マウスに由来するＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞またはＣＤ３４−細胞ではなく、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−骨髄細胞が、二次レシピエントにおいて白血病を引き起こした。これらのデータは、移植したＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞はＨＳＣによって混入したのではなくＬＳＣの性質を保持していることを示唆する。得られた発現データセットを解析するため、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージに実装されたＲａｎｋＰｒｏｄ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２， ２８２５， ２００６）を用いて、両方のマイクロアレイプラットフォームでＨＳＣよりもＬＳＣにおいて有意に高い（ｐ値＜０．０１、擬陽性のパーセント＜０．０５）アレイシグナルを示す遺伝子を抽出した。全部で２１７遺伝子候補がこの基準に適合し（図５、表１）、さらにＩＬ２Ｒを追加し、２１８遺伝子候補とした。
次に、ＬＳＣとＨＳＣとを分離する候補の発現レベルを実証するため、５名のＡＭＬ患者起源のＢＭ由来のＬＳＣおよび４名のＢＭ由来のＨＳＣを用いて、各候補遺伝子について定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った（表３）。同定した２１７遺伝子の中から、医薬の開発に最も適する候補として、以下のカテゴリーの中の分子をコードする１２１遺伝子を選んでその後の解析を行った。前記カテゴリーは、以下の３つである：
１）細胞膜または細胞外間隙に位置するもの、
２）サイトカイン、成長因子、膜貫通型受容体、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、転写調節分子、および／またはシグナル伝達分子、ならびに
３）免疫調節、細胞周期、アポトーシス、および／または細胞接着に関与するもの。
表２に示すように、１２１遺伝子のうちの５７遺伝子に関するｍＲＮＡ含量はＨＳＣに比べてＬＳＣにおいて統計学的に高かった。前記５７遺伝子のうち、３５遺伝子を優れたＬＳＣマーカーとして同定した。その理由は、１）ＬＳＣにおいて、それらの遺伝子のメジアン発現レベルが５倍よりも高かったこと、および２）試験したすべてのＬＳＣ試料において、それらのｍＲＮＡ含量が試験した各ＨＳＣ集団のものよりも高かったことである（図２）。
これらのＬＳＣ特異的候補分子の発現をタンパク質レベルで確認するために、３５候補分子のそれぞれに対する利用可能なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の品質を検証し、有効性を確認した抗体および３２のＡＭＬ患者試料を用いてフローサイトメトリー解析を行った。フローサイトメトリー解析を通じて、各候補分子における以下の側面を調べた：１）局在（細胞表面または細胞内）、２）陽性細胞の頻度および３）発現強度。このように評価した５７の候補分子の中から、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２）、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＣＤ９３、ＣＤ３３、ＣＤ３ＤおよびＴＮＦ（ＴＮＦａ）がＬＳＣ特異的マーカー／標的として最も有望な発現レベル／パターンを有していることを見出した。特に、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２）発現は、試験したＡＭＬ症例の有意な割合でＬＳＣとの強い相関を示し、さらなる機能解析のために選択した。試験した３２のＡＭＬ症例のうちの９つの症例で、ＡＭＬ幹細胞の大多数（＞８０％）がこの抗原を発現する（図３）。ＣＤ３２発現が機能と排他的に相関することを確認するため、ＡＭＬの３症例由来の精製ＬＳＣを用いて、インビボＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯ移植アッセイを行った。精製したＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３２＋およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３２−細胞を亜致死的に照射したレシピエントに移植した場合、ＣＤ３２＋画分からＡＭＬが独占的に発症した（図４）。ＬＳＣを標的とするいかなる治療も非ＬＳＣ ＡＭＬ細胞を除去するのに有効な慣用の化学療法剤ともに最良に使用されると考えられるので、化学療法後でも標的分子が連続して発現されることを確認することが重要である。したがって、本発明者らは、ＣＤ３２の発現が化学療法後に維持されるかどうかを調べ、ＡｒａＣ処置後のＡＭＬ移植マウスのＢＭ、脾臓および末梢血（ＰＢ）のＣＤ３２の発現を確認した（図６）。また、ＣＤ３２発現細胞は、免疫蛍光標識により、骨髄の骨髄膜領域および中央領域内の両方に見出された（図４）。本知見は、化学療法耐性ＬＳＣがＢＭ骨芽細胞ニッチ内に存在するという本発明者らの以前の報告に照らし合わせて、ＬＳＣ標的療法の候補としてＣＤ３２をさらに支持する（Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１３１５−１３２１， ２００７およびＰＣＴ／ＪＰ２００８／０６８８９２）。
次に、正常ヒトＨＳＣ中のＣＤ３２の発現を評価した。原始ヒトＣＢ ＣＤ３４＋ＣＤ３８−集団内で、ＣＤ３２＋細胞の頻度は、９．８％ ＋／− ＳＤであった（図４Ａ）。本画分内のＣＤ１３３の発現を解析したとき、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ１３３−画分内にＣＤ３２＋細胞を独占的に検出した（図４ａ）。異種移植アッセイにより、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３２＋画分ではなくＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ１３３＋ＣＤ３２−画分がＨＳＣを含むことを見出した（図４Ｂ）。さらに、インビトロコロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイにより、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３２＋細胞ではなくＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３２−細胞が骨髄系および赤血球系造血コロニーを生じる能力を有することが示唆された。ＣＤ３２＋正常ＨＳＣにおけるインビボ長期免疫造血再構成能の欠如は、ＣＤ３２発現細胞を標的とする治療剤がＨＳＣに危害を与えず、正常な造血および免疫系に関する重大な副作用の回避を助長する可能性を示唆する。
ＬＳＣがＣＤ３２を発現しないＡＭＬ患者試料において、本発明者らは、新生ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯマウス移植アッセイにより、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞がＬＳＣ機能を保有することを最初に確認し（図１）、次に、フローサイトメトリーによりＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、ＣＤ９３、（その他に、ＣＤ２５、ＣＤ１３２、ＯＸ４１、ＣＤ９７）、ＣＤ３３、ＣＤ３ＤおよびＴＮＦαの発現を調べた。抗原ＣＤ３２、ＩＴＧＢ２、ＣＤ９３、９７および３３の併用は、４７症例の中の３１症例において正常ＨＳＣからＬＳＣを良好に分離することが可能である。
２つのセットのマイクロアレイおよび定量ＰＣＲにより同定されたＬＳＣ特異的遺伝子リスト（表２）は、骨髄後代で優先的に発現される遺伝子を含むが、ＨＳＣでは発現が限定されている。例えば、ＦＣＧＲ２Ａ、ＨＣＫおよびＮＣＦ４は成熟骨髄細胞で高度に発現し、免疫複合体の食作用およびその後のスーパーオキシド産生に関与する（Ｐｒｏｔ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９７， １７２５；２０００；Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１， ６６９， ２０００；Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ３， ６７９， ２００１；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９， １４１５， ２００４）。他方、ＣＤ３複合体の構成成分であるＣＤ３Ｄは、成熟Ｔリンパ球において、そのＩＴＡＭモチーフを介するＴ細胞受容体シグナルを伝達する。したがって、ＡＭＬの少なくとも一定の割合は幹細胞ステージで分化の異常調節を介して発症する可能性がある。
リストの別の特徴は、癌細胞および白血病細胞で顕著に発現された遺伝子の関与である。例えば、ＣＤ３３はＡＭＬ細胞のよく認識された免疫学的マーカーであり、ゲムツズマブ オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）等の抗体医薬の標的である（Ｌｅｕｋｅｍｉａ １９： １７６， ２００５）。さらに、ＣＤ９７はリンパ管内に浸潤する結腸直腸癌に蓄積されることが報告されている（Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６１， １６５７， ２００２）。ＬＳＣにおけるこれらの分子の過剰発現は、これらの分子を標的にする治療法がＬＳＣばかりでなく成熟ＡＭＬ細胞にも有効であるかもしれない。ＢＩＫ、ＨＯＭＥＲ３、ＷＴ１（Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ４７， ８−２０， ２００８）およびＣＬＥＣ１２Ａ （ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＣＬＬ−１）（Ｂｌｏｏｄ １１０， ２６５９−２６６６， ２００７）などの遺伝子産物はＬＳＣ／ＡＭＬブラスト（ｂｌａｓｔｓ）に対するマーカー分子として提案されてきたことに注目すべきであり、このことは、本発明の知見が既報と一致することを示している。
発現レベル／パターンの解析により、候補遺伝子が以下のセットに分類された：
１）ＲＮＡおよびタンパク質レベルでＬＳＣの有意な割合で発現するが、ＨＳＣの少ない割合でしか発現しない（または無発現）分子をコードする遺伝子群、ならびに
２）ＬＳＣおよびＨＳＣにおいてタンパク質レベルで発現するが、フローサイトメトリーによる発現強度がＨＳＣからＬＳＣの分離を可能にする遺伝子群。
遺伝子セット１は、ＬＳＣを特異的に標的化し、ＨＳＣに危害を加えない、例えば、正常ＨＳＣに前記候補が欠如していることに基づく抗体医薬などの治療剤の開発にとって有力な候補を含む。遺伝子セット２に含まれる遺伝子（最も有望な候補としてＣＤ３３）は、自家造血幹細胞移植の背景で、ＨＳＣからＬＳＣを分離するＬＳＣのエクスビボパージング等での適用に有力な利用可能性をもつバイオマーカーをコードする。
図７では、各マーカー（ＦＣＧＲ２Ａ，ＡＫ５，ＤＯＫ２，ＬＲＧ１，ＢＩＫ，ＩＬ２ＲＡ，ＷＴ１及びＳＵＣＮＲ１）に対する抗体と静止細胞特異的マーカーを用いて、場所と細胞周期をイメージングにて同定することで、抗がん剤抵抗性を示す幹細胞の存在する骨内膜（ニッチ）にこれらの分子が多く存在すること、さらに、細胞周期の静止期にある白血病幹細胞に発現していることが判明した。したがって、これらの各マーカー分子を標的とすることが、白血病の再発克服に大きく貢献すると考えられる。
尚、ＷＴ１は、白血病をはじめ、多くの腫瘍にて発現が確認されている。しかし、この分子が再発や抗がん剤抵抗性を示す幹細胞レベルに発現しているかどうかについては、知られていなかった。本発明者らは、細胞周期が静止した、ニッチに存在する白血病幹細胞に発現することを見出したことから、これまでの化学療法や放射線治療では死滅させることができなかった白血病幹細胞を殺すための標的分子として意義があることを示している。
また、４７名の様々なステージのＡＭＬの症例から末梢血を採取して造血細胞を含む試料を調製し、試料中に含まれる白血病幹細胞でのＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２ａ），ＦＣＧＲ２Ｂ（ＣＤ３２ｂ），ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５），ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）およびＣＤ９３の陽性率を調べた。結果を表４に示す。
表４より、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２ａ），ＩＬ２ＲＡ（ＣＤ２５），ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）およびＣＤ９３の４種類のマーカーを組み合わせることにより、高率に白血病幹細胞を識別でき、これら４種類の遺伝子を標的とする医薬を組み合わせることにより、６０％を超える白血病細胞が駆逐できることが示された。
本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを分子標的とすることにより、ＡＭＬの発症源または再発源であるＬＳＣに特異的に作用する治療剤を提供することができる。本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標としてＦＡＣＳ等の細胞選別装置を用いて、患者またはドナーの骨髄細胞からＬＳＣを特異的に除去することができる。これにより、自家または同種骨髄移植の際のパージングの効率が高くなり、急性骨髄性白血病の再発または初発を有意に防止することができる。さらに、本発明で見出された白血病幹細胞マーカーを指標として、採取した生体試料中または生体内でＬＳＣの存否を測定することができ、これにより急性骨髄性白血病の再発または初発を予測することもできる。
本出願は、日本で出願された特願２００９−０７２４００（出願日：平成２１年３月２４日）を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。

Claims (2)

  1. 急性骨髄性白血病の再発を予測するための試験方法であって、
    （１）急性骨髄性白血病の再発の予測の対象とする被験者から採取した生体試料における白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の転写産物または翻訳産物を対象として測定する工程、および
    （２）測定工程で得られた発現レベルを基準値と比較する工程
    を含み、当該白血病幹細胞マーカー遺伝子が、ＡＫ５、ＤＯＫ２、ＦＣＧＲ２Ａ、ＩＬ２ＲＡ、ＬＲＧ１、およびＳＵＣＮＲ１からなる群より選ばれる２〜６の遺伝子であり、被験者における２以上の白血病幹細胞マーカー遺伝子の発現が基準値に比べて有意に高い場合、被験者の生体内に、骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性の白血病幹細胞の存在可能性が示唆され、それにより被験者において急性骨髄性白血病の再発の可能性が示唆される、試験方法。
  2. 骨髄のニッチに存在し、細胞周期が静止し、かつ抗癌剤抵抗性の幹細胞に発現するマーカーであって、ＤＯＫ２、ＦＣＧＲ２Ａ、ＩＬ２ＲＡ、ＬＲＧ１、およびＳＵＣＮＲ１からなる白血病幹細胞マーカー遺伝子から選ばれる遺伝子の翻訳産物に対する抗体と抗癌物質とのイムノコンジュゲートを有効成分として含有する、白血病幹細胞を標的化した急性骨髄性白血病の治療剤。
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