KR20190140917A - 암 치료용 의약 조성물 - Google Patents

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시오노기세이야쿠가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 CCR8 에 대한 항체를 함유하는 암 치료용 의약 조성물을 제공한다.

Description

암 치료용 의약 조성물
본 발명은 CCR8 에 대한 항체를 함유하는 암 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
종양 미소 환경 내의 제어성 T 세포 (Treg 세포) 가 매개하는 면역 억제를 비롯한 강력한 부 (負) 의 조절 기구는, 종양의 치료에 있어 큰 장애이다 (비특허문헌 1).
예를 들어, 종양에 침윤하는 CD4 양성 Treg 세포는, 항종양 면역 응답을 강력하게 저해하고 있을 가능성이 있어, 효과적인 암 치료의 큰 장애가 될 수 있다.
CD4 양성 FoxP3 양성 Treg 세포가 매개하는 종양 면역 억제는, 동물 종양 모델에서 충분히 입증되어 있고, 종양 내도 포함한 전신성의 Treg 세포 제거에 의해 항종양 효과가 얻어지지만, 한편으로 50 ％ 정도의 종양 내 침윤 Treg 세포 제거에서는 효과가 확인되지 않는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 2).
인간에 있어서 전체 CD4 양성 T 세포 집단 중의 CD4 양성 CD25 양성 Treg 세포비 (Treg 세포를 포함하는 세포 집단) 의 증대가, 폐, 유방, 및 난소 종양을 비롯한, 각종 암 환자의 종양 내에서 검출되어, 존재비와 환자 생존률에 부의 상관이 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 3 ∼ 8).
항CD25 항체에 의해 CD4 양성 CD25 양성 Treg 세포를 종양 내로부터 제거함으로써, 항종양 효과를 확인하고 있다. 그러나 CD25 는, CD4 양성 CD25 양성 Treg 세포 및 새롭게 활성화 된 이펙터 T 세포의 세포 표면에도 발현하기 때문에, Treg 세포를 특이적으로 제거하고 있다고는 할 수 없다. 또 마우스에 있어서 항CD25 항체 투여에 의한 항종양 효과는 한정적이며, 종양 이식 전의 항체 투여에서만 치료 효과를 나타내고, 종양을 마우스에 생착시킨 후에 항체를 투여하는 경우에는 치료 효과가 거의 없는 것이 각종 종양 모델에서 증명되고 있다. 이식 후 1 일째에 항CD25 항체 투여 개시의 경우, 항종양 효과는 감약하고, 이식 후 2 일째 이후의 투여 개시의 경우, 거의 항종양 효과는 확인되어 있지 않다 (비특허문헌 9).
현재까지 Treg 세포 제거를 목적으로 하여 항체를 마우스에 투여하는 약효 시험이 실시되고 있지만, 항종양 효과를 나타내는 보고는 거의 없고, 이식 전의 항체 투여에 의한 Treg 세포 제거에 의한 항종양 치료 효과의 확인은 매우 곤란하다 (비특허문헌 10).
CCR8 은 CY6, CKR-L1 또는 TER1 이라고도 불리고 있던 흉선이나 비장 등에서 발현하고 있는 G 단백 공액형 7 회 막관통형의 CC 케모카인 수용체 단백질이고, 그 유전자는 인간 크로모솜에서는 3p21 에 유전자가 존재한다. 인간 CCR8 은 355 아미노산으로 이루어진다 (비특허문헌 11). CCR8 에 대한 내인성 리간드로는 CCL1 이 알려져 있다 (비특허문헌 12). 인간 CCR8 cDNA 는 Genbank ACC No. M_005201.3 에 나타내는 염기 배열로 구성되고, 마우스 CCR8 cDNA 는 Genbank ACC No. NM_007720.2 에 나타내는 염기 배열로 구성된다.
Nat. Rev. Immunol., 2006년, 제6권, 제4호, p.295-307 Eur. J. Immunol., 2010년, 제40권, p.3325-3335 J. Clin. Oncol., 2006년, 제24권, p.5373-5380 Nat. Med., 2004년, 제10권, p.942-949 J. Clin. Oncol., 2007년, 제25권, p.2586-2593 Cancer, 2006년, 제107권, p.2866-2872 Eur. J. Cancer, 2008년, 제44권, p.1875-1882 Cell. Mol. Immunol. 2011년, 제8권, p.59-66 Cancer Res., 1999년 Jul 1 ; 제59권, 제13호, p.3128-33 Cancer Res., 2010년, 제70권, 제7호, p.2665-74 J. Immunol., 1996년, 제157권, 제7호, p.2759-63 J. Biol. Chem., 1997년, 제272권, 제28호, p.17251-4
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, Treg 세포 등에 의한 면역 억제를 저해 함으로써, 면역을 부활시키고, 이 기구를 개재한 암 치료를 위한 의약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 예의 연구의 결과, 종양 내 침윤 Treg 세포 및 종양 내 침윤 매크로파지 세포가 CCR8 을 특이적으로 발현하고 있고, CCR8 에 대한 항체를 투여 함으로써, 종양 내 침윤 Treg 세포 및 종양 내 침윤 매크로파지 세포의 세포수가 감소하고, 종양의 증식이 저해되는 것을 찾아냄으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉 본 발명은,
(1) CCR8 에 대한 항체를 함유하는, 암 치료용 의약 조성물,
(2) CCR8 에 대한 항체가 ADCC 활성을 갖는 항체인, (1) 기재의 의약 조성물,
(3) CCR8 에 대한 항체가, CCR8 의 중화 항체인, (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(4) CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 Treg 세포 제거 작용을 갖는, (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(5) CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 매크로파지 세포 제거 작용을 갖는, (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(6) 암이 유방암, 대장암, 신암 또는 육종인, (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(7) CCR8 에 대한 항체, 및 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 조합하여 이루어지는 암 치료용의 의약,
(8) (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 CCR8 에 대한 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 방법,
(8-1) CCR8 에 대한 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 방법,
(8-2) CCR8 에 대한 항체가 ADCC 활성을 갖는 항체인, (8-1) 기재의 치료 방법,
(8-3) CCR8 에 대한 항체가 CCR8 의 중화 항체인, (8-1) 또는 (8-2) 기재의 치료 방법,
(8-4) CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 Treg 세포 제거 작용을 갖는, (8-1) ∼ (8-3) 기재의 치료 방법,
(8-5) CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 매크로파지 세포 제거 작용을 갖는, (8-1) ∼ (8-4) 기재의 치료 방법,
(8-6) 암이 유방암, 대장암, 신암 또는 육종인, (8-1) ∼ (8-5) 기재의 치료 방법,
(8-7) 또한, 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는, (8-1) ∼ (8-6) 기재의 치료 방법,
(9) 암을 치료하기 위한, (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 CCR8 에 대한 항체,
(9-1) 암을 치료하기 위한, CCR8 에 대한 항체,
(9-2) CCR8 에 대한 항체가 ADCC 활성을 갖는 항체인, (9-1) 기재의 CCR8 에 대한 항체,
(9-3) CCR8 에 대한 항체가 CCR8 의 중화 항체인, (9-1) ∼ (9-2) 기재의 CCR8 에 대한 항체,
(9-4) CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 Treg 세포 제거 작용을 갖는, (9-1) ∼ (9-3) 기재의 CCR8 에 대한 항체,
(9-5) CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 매크로파지 세포 제거 작용을 갖는, (9-1) ∼ (9-4) 기재의 CCR8 에 대한 항체,
(9-6) 암이 유방암, 대장암, 신암 또는 육종인, (9-1) ∼ (9-5) 기재의 CCR8 에 대한 항체,
(9-7) 암을 치료하기 위해서 사용되는, (9-1) ∼ (9-6) 기재의 CCR8 에 대한 항체와 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체의 조합,
에 관한 것이다.
본 발명의 항체를 포함하는 의약 조성물은, 암의 치료를 위한 의약으로서 매우 유용하다.
도 1 은, 신암 종양 내 침윤 CD3+ CD4+ T 세포의 FACS 해석이다. CD25 분자 및 FoxP3 분자를 항체로 염색하고, 발현율을 평가하였다. CD25 발현 세포는 FoxP3 도 발현하고 있는 것을 나타낸다.
도 2 는, 동일 환자의 말초혈 단핵 세포 (이하, PBMC 라고 한다.) 중의 CD45RA 및 CD25 발현 강도에 대해 플로 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다. CD3+ CD4+ T 세포에 대해, CD45RA 및 CD25 발현량으로 도면과 같이 6 개 (Fr1 ∼ Fr6) 로 분획하고, 각각 소터로 세포를 회수하였다. 수치는 각 분획의 세포 존재 비율 (％) 이다. 이 경우의 Treg 분획은 Fr1 과 Fr2 이다.
도 3 은, 신암 종양 내 침윤 세포의 CD45RA 및 CD25 발현 강도에 대해 플로 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다. 종양 내 침윤 CD3+ CD4+ T 세포를 CD45RA 및 CD25 발현량으로 도면과 같이 4 개 (Fr2 ∼ Fr5) 로 분획하고, 각각 소터로 세포를 회수하였다. 수치는 각 분획의 세포 존재 비율 (％) 이다.
도 4 는, 도 2, 도 3의 각 분획의 세포의 RNA-Seq 해석을 실시하고, 각 분획 중 어느 것이 Treg 세포를 포함하고 있는지를 Treg 특이적 발현 유전자인 FoxP3 및 IKZF2 의 mRNA 발현량으로 검토한 결과를 나타낸다. 세로축은 정규화 후의 상대적 mRNA 발현량을 나타낸다. 종양 내에서는 양 유전자 모두 Fr2 와 Fr3 에 강한 발현이 확인되었다. 이펙터 세포에서 발현하는 IL-2 나 IFNγ 는 Fr4 와 Fr5 에서 강한 발현이 확인되었다.
도 5 는, 각 분획에 있어서의 FoxP3 유전자 좌위의 Treg 특이적 탈메틸화 영역 (chrX, 49118000-49118500, hg19) 의 해석 결과를 나타낸다. 종양 내 침윤 CD3+ CD4+ T 세포의 Fr2 및 Fr3 분획의 대부분이 Treg 세포인 것을 알 수 있었다.
도 6 은, 도 4 와 마찬가지로 각 분획의 CCR8 의 mRNA 발현량을 해석한 결과를 나타낸다. 종양 내 침윤 Treg 세포 분획인 Fr2 와 Fr3 에서 강한 CCR8 의 발현을 나타내는 데 반해, 말초혈 단핵구 (Peripheral blood mononuclear cell ; PBMC) 중의 Treg 세포에서는 거의 발현은 확인되지 않았다.
도 7 은, 마우스 CCR8 을 발현하는 HEK293 세포의 플로 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다. 마우스 CCR8 유전자를 삽입한 pcDNA3.4 발현 벡터를 HEK293 세포에 도입하고, G418 로 약제 선택하였다. 마우스 CCR8 의 발현 정도는 PE 표지 항마우스 CCR8 항체에서 발현을 확인하였다. pcDNA3.4 벡터를 도입하고, 동일하게 약제 선택을 한 HEK293 세포를 음성 대상으로 하였다. 거의 모든 세포가 마우스 CCR8 을 발현하고 있는 것이 나타났다.
도 8 은, 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 가, Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) 에 필요한 시그널 전달 경로의 활성화능을 갖는 것을 나타낸다.
도 9 는, 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 가 ADCC 활성을 갖는 것을 나타낸다.
도 10 은, 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 가, CCR8 을 개재한 세포 내 칼슘 유입을 저해하는 활성을 갖는 것을 나타낸다. 아이소타입 컨트롤 항체를 음성 대상으로 하여 사용하였다.
도 11 은, 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 가 CT26 세포를 인식하지 않는 것을 나타낸다. 아이소타입 컨트롤 항체를 음성 대상으로 하여 사용하였다.
도 12 는, 3 예의 마우스 대장암 세포주 CT26 세포를 이식한 BALB/c 마우스에, 이식 후 3 일째 (day3) 에 컨트롤 항체를 투여하고, 투여 후 4 일째 또는 7 일째에 종양을 적출하고, 거기에 존재하는 Treg 세포율을 플로 사이토미터로 해석한 결과를 나타낸다.
도 13 은, 도 12 와 동일한 실험에 있어서, CCR8+Treg 세포율을 플로 사이토미터로 해석한 결과를 나타낸다.
도 14 는, 종양 내 CD11b+ Gr1+ CD206+ M2 형 매크로파지 세포 중의 CCR8 양성 세포율을 플로 사이토미터로 해석한 도면이다. 어느 쪽도 40-50 ％ 의 세포가 CCR8 양성 M2 형 매크로파지 세포인 것을 나타낸다.
도 15 는, 대장암 세포주 CT26 세포를 이식한 BALB/c 마우스에, 이식 후 3 일째 (day3) 에 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체를 투여하고, 이식 후 7 일째 또는 10 일째에 종양을 적출, 거기에 존재하는 T 림프구 및 매크로파지 세포 존재율을 검증한 실험의 흐름을 나타낸다.
도 16 은, 이식 후 7 일째 (d7) 또는 10 일째 (d10) 의 CD45+ CD4+ 세포 중의 CD25+ FoxP3+ 세포 비율을 나타낸다.
도 17 은, 이식 후 7 일째 (d7) 의 CD11b+ F4/80+ 매크로파지 세포의 비율을 나타낸다.
도 18 은, 이식 후 7 일째 (d7) 의 IA/IE 양성 (IA/IE＋) 혹은 IA/IE 음성 세포 (IA/IE-) 의 존재 비율을 나타낸다.
도 19 는, 대장암 세포주 CT26 세포를 이식한 BALB/c 마우스에 대하여, 이식 후 3 일째 (d3) 에 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체 (래트 항KLH) 를 400 ㎍/마우스로 단회 투여하고, 이식 후 7 일 후 (d7) 부터 3-4 일 간격으로 21 일 (d21) 후까지 종양경 (腫瘍徑) 을 측정한 실험의 흐름을 나타낸다.
도 20 은, 이식 후의 각 개체의 고형 종양경을 측정, 종양 체적을 계산한 결과이다.
도 21 은, 마우스 각 군의, 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값이다. 표준 편차를 동시에 나타내고 있다. 유의 수준 *** 는 p ＜ 0.001, 유의 수준 ** 는 p ＜ 0.01 (t-test) 을 나타낸다.
도 22 는, 2 x 105 개의 대장암 세포주 Colon26 세포를 BALB/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 이식 후 3 일째 (d3) 에 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체를 400 ㎍/마우스로 단회 투여하였다. 이식 후 3 일 후 (d3) 부터 3-4 일 간격으로 18 일 (d18) 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의, 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다.
도 23 은, 플롯은 개개의 FACS 해석의 형광 강도의 평균값 (MFI), 중앙 가로선은 MFI 값의 14 예의 평균값, 세로선은 표준 편차를 나타낸다. 유의 수준 *** 는, P ＜ 0.001 을 나타낸다.
도 24 는, 14 예의 인간 신암 종양 내의 CD3+ CD4+ FoxP3+ T 세포 또는 CD3+ CD4+ FoxP3- T 세포에 대해, 아이소타입 컨트롤 항체에서의 백그라운드 레벨 이상의 CCR8 양성 시그널을 나타내는 세포의 비율 (양성율 ％) 을, 개체마다 플롯한 것이다. 중앙 가로선은 14 예의 양성율의 평균값, 세로선은 표준 편차를 나타낸다.
도 25 는, The Cancer Genome Atlas (TCGA) 데이터베이스를 이용한 담명세포형 신세포암 환자의 종양 내 세포의 CCR8 의 mRNA 발현량에 기초하여, 발현 높은 군 (High), 낮은 군 (Low) 으로 균등하게 2 군으로 나누고, 그들 각 군의 생존률에 대한 카플란 마이어 곡선을 나타낸다. 세로축은 생존률, 가로축은 월수를 나타낸다. 수치는 각 군의 개체수이다. P 값은 로그랭크 검정값을 나타낸다.
도 26 은, 도 25 와 동일한 방법으로, 전립선암 환자에 대해 해석한 결과이다.
도 27 은, 도 25 와 동일한 방법으로, 방광암 환자에 대해 해석한 결과이다.
도 28 은, 도 11 과 마찬가지로 항마우스 CCR8 항체가 MethA 세포 및 LM8 세포를 인식하지 않는 것을 나타낸다. 아이소타입 컨트롤 항체 (Isotype) 를 음성 대상으로 하여 사용하였다.
도 29 는, 3 x 105 개의 골육종 세포주 LM8 세포를 C3H/He 마우스 등부 피내에 이식하고, 이식 후 3 일째 (d3) 에 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체 (컨트롤 항체) 를 400 ㎍/마우스로 단회 투여하였다. 이식 후 7 일 후부터 3 ∼ 4 일 간격으로 35 일 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의, 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다. 표준 편차를 동시에 나타내고 있다. 유의 수준 *** 는 p ＜ 0.001, 유의 수준 ** 는 p ＜ 0.01, 유의 수준 * 는 p ＜ 0.05 (t-test) 를 나타낸다.
도 30 은, 1 x 105 개의 MethA 세포를 Balb/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 이식 후 3 일째에 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체 (컨트롤 항체) 를 400 ㎍/마우스로 단회 투여하였다. 이식 후 11 일 후부터 3 ∼ 4 일 간격으로 21 일 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다. 유의 수준 * 는 p ＜ 0.05 (t-test) 를 나타낸다.
도 31 은, 1 x 105 개의 유방암 세포주 EMT6 세포를 Balb/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 이식 후 3 일째 및 10 일째에 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체를 100 ㎍/마우스로 투여하였다. 이식 후 4 일 후부터 3-4 일 간격으로 22 일 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의, 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다. 유의 수준 *** 는 p ＜ 0.001, 유의 수준 ** 는 p ＜ 0.01 (t-test) 을 나타낸다.
도 32 는, 2 x 105 개의 대장암 세포주 Colon26 세포를 BALB/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 이식 후 3 일째 및 10 일째에 항아이소타입 컨트롤 항체 (Isotpe 항체), 마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 항PD-1 항체 (RMP1-14) 를 400 ㎍/마우스로 투여하였다. 이식 후 3 일 후부터 3 ∼ 4 일 간격으로 24 일 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다.
도 33 은, 4 x 105 개의 마우스 신암 유래 세포주 RAG 를 BALB/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 종양 이식 6 일 후에 아이소타입 컨트롤 항체, 항마우스 CCR8 항체 또는 항마우스 PD-1 항체 (항PD-1 항체) 를 정맥내에 100 ㎍ (100 ㎕) 투여하고, 이식 후 6 일 후부터 3 ∼ 4 일 간격으로 21 일 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다.
도 34 는, 2 x 105 개의 대장암 세포주 Colon26 세포를 BALB/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 이식 후 3 일째 및 10 일째에 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체 (컨트롤 항체) 를 400 ㎍/마우스로 투여하였다. 이식 24 일 후에 마우스 각 장기를 회수하고, 그 중량을 측정하였다. 각 10 예의 평균값을 나타낸다.
도 35 는, 1 x 105 개의 마우스 유방암 세포주 EMT6 세포를 BALB/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 항마우스 CCR8 항체에 대해서는 이식 후 3 일째 및 10 일째, 항마우스 PD-1 항체에 대해서는 이식 후 8 일째 및 13 일째에 정맥내 투여하였다. 컨트롤군은 이식 후 3 일 후 및 10 일 후에 아이소타입 컨트롤 항체를 정맥내에 투여하였다. 이식 후 6 일 후부터 3 ∼ 4 일 간격으로 27 일 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다.
도 36 은, 도 35 와 동일한 실험에 있어서의, 각 군의 이식 후 각 시점에서의 50 ㎣ 이하로까지 종양이 퇴축한 개체의 비율을 나타낸다.
도 37 은, 4.5 x 105 개의 마우스 신암 유래 세포주 RAG 를 BALB/c 마우스 등부 피내에 이식하고, 종양 이식 8 일 후 및 15 일 후에 생리 식염수, 항마우스 CCR8 항체, 항마우스 PD-1 항체 또는 항마우스 CCR8 항체 및 항마우스 PD-1 항체를 정맥내에 100 ㎕ 투여하고, 이식 후 8 일 후부터 3 ∼ 4 일 간격으로 33 일 후까지 종양 체적을 측정하였다. 각 군의 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 중앙값을 나타낸다.
도 38 은, Balb/c 계통의 야생형 마우스 및 CCR8 유전자 호모 결손 마우스의 등부 피내에 2 x 105 개의 CT26 세포를 이식하고 (N = 5), 이식 후에 아이소타입 컨트롤 항체 또는 항마우스 CCR8 항체를 정맥내에 투여하였다. 이식 후 3 ∼ 4 일 간격으로 종양 체적을 측정하였다. 좌측도는 야생형 마우스에 대한 각 군의 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을, 우측도는 CCR8 유전자 호모 결손 마우스에 대한 각 군의 이식 후 각 시점에서의 종양 체적의 평균값을 나타낸다.
본 발명의 의약 조성물은, CCR8 에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 CCR8 은 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 개, 돼지, 원숭이, 인간을 포함하는 영장류의 포유 동물을 유래로 하는 것을 포함한다. 바람직하게는 인간 CCR8 이다.
CCR8 에 대한 항체는, CCR8 에 결합하는 항체이면, 인간 유래 항체, 마우스 유래 항체, 래트 유래 항체, 토끼 유래 항체 또는 염소 유래 항체 중 어느 항체여도 되고, 또한 그들의 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체여도 되고, 완전형 항체, 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab 또는 Fv 단편), 키메라화 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간형 항체 중 어느 것이어도 된다. 바람직하게는, 인간 유래 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간형 항체이다.
본 발명의 항체는, CCR8 의 전체 길이 단백질 또는 부분 단백질을 항원으로 하여, 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라서 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 세포 표면 상에 발현하는 CCR8 에 결합하는 것이 바람직하기 때문에, 부분 단백질은, CCR8 의 세포외 영역이 바람직하다. 이들 항원은, 공지된 단백질 발현 그리고 정제법에 의해 조제할 수 있다.
상기 이외에, CCR8 에 대한 항체의 작성에 적합한 항원으로는, 예를 들어 발현 벡터 등에 의해 CCR8 을 강제 발현시킨 세포, CCR8 발현 플라스미드 벡터, CCR8 발현 바이러스 벡터 등 (아데노바이러스 벡터 등) 을 들 수 있다.
폴리클로날 항체는, 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 항원 단백질 혹은 그것과 캐리어-단백질의 혼합물로, 적당한 동물에 면역을 실시하고, 그 면역 동물로부터 항원 단백질에 대한 항체 함유물을 채취하여, 항체의 분리 정제를 실시함으로써 제조할 수 있다. 사용되는 동물로는, 마우스, 래트, 양, 염소, 토끼, 모르모트를 일반적으로 들 수 있다. 항체 산생능을 높이기 위해서, 완전 프로인트 애쥬번트나 불완전 프로인트 애쥬번트를 항원 단백질과 함께 투여할 수 있다. 투여는, 통상적으로 약 2 주마다 1 회씩, 합계 약 3 ∼ 10 회 정도 실시하는 것이 일반적이다. 폴리클로날 항체는, 상기의 방법으로 면역된 동물의 혈액, 복수 등에서 채취할 수 있다. 항혈청 중의 폴리클로날 항체가의 측정은, ELISA 법에 의해 측정할 수 있다. 폴리클로날 항체의 분리 정제는, 예를 들어, 항원 결합 고상 혹은 프로테인 A 혹은 프로테인 G 등의 활성 흡착제를 사용한 정제법, 염석법, 알코올 침전법, 등전점 침전법, 전기 영동법, 이온 교환체에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔 여과법 등의 면역 글로불린의 분리 정제법에 따라서 실시할 수 있다.
모노클로날 항체는, 이미 알려진 일반적인 제조 방법에 의해 조제할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 항원을, 필요에 따라 프로인트 애쥬번트와 함께, 포유 동물, 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 또는 토끼의 피하내, 근육내, 정맥내, 풋패드내 혹은 복강내에 1 내지 수 회 주사함으로써 면역 감작을 실시한다. 통상적으로, 첫회 면역으로부터 약 1 ∼ 21 일마다 1 ∼ 4 회 면역을 실시하여, 최종 면역으로부터 약 1 ∼ 10 일 후에 면역 감작된 포유 동물로부터 항체 산생 세포를 취득할 수 있다. 면역을 실시하는 횟수 및 시간적 인터벌은, 사용하는 면역원의 성질 등에 따라, 적절히 변경할 수 있다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마의 조제는, 쾰러 및 밀스타인 등의 방법 (Nature, 1975, vol.256, p495 ∼ 497) 및 그에 준한 방법에 따라서 실시할 수 있다. 즉, 전술한 바와 같이 면역 감작된 포유 동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 혹은 편도 등, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체 산생 세포와, 바람직하게는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유 동물, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간 유래의 자기 항체 산생능이 없는 미엘로마 세포를 세포 융합시킴으로써 하이브리도마를 조제할 수 있다.
세포 융합에 사용되는 미엘로마 세포로는, 일반적으로는 마우스로부터 얻어진 주화 세포, 예를 들어 P3-U1, NS-1, SP-2, 653, X63, AP-1 등을 사용할 수 있다.
모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 중에서 배양하고, 증식이 보인 웰의 배양 상청의, 전술한 마우스 면역 감작에서 사용한 본 발명의 항원에 대한 반응성을, RIA, ELISA, FACS 등의 측정법에 의해 측정하고, 당해 항원 혹은 합텐에 대하여 특이적 결합을 나타내는 모노클로날 항체를 산생하는 클론을 선택함으로써 실시한다. 그리고, 통상적으로는 항원을 고상화하고 거기에 결합하는 배양 상청 중의 항체를, 방사성 물질, 형광 물질, 효소 등으로 표지한 2 차 항체로 검출하는 방법이 이용된다. 또, 항원의 발현 세포를 사용하는 경우에는, 그 세포에 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 다음으로 형광으로 표지한 2 차 항체를 반응시킨 후, 플로 사이토미터 등의 형광 검출 장치로 그 세포의 형광 강도를 측정함으로써, 그 세포막 상의 본 발명의 항원에 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 검출할 수 있다.
선택한 하이브리도마로부터의 모노클로날 항체의 제조는, 하이브리도마를 인비트로 배양하거나, 또는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등, 바람직하게는 마우스 또는 래트, 보다 바람직하게는 마우스의 복수 중 등에서 배양하고, 얻어진 배양 상청, 또는 포유 동물의 복수로부터 단리함으로써 실시할 수 있다. 인비트로 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험 연구의 목적 및 배양 방법 등의 여러 가지 조건에 맞추어, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청 중에 모노클로날 항체를 산생시키기 위해서 사용되는 이미 알려진 영양 배지 혹은 이미 알려진 기본 배지로부터 유도 조제되는 모든 영양 배지를 사용하여 실시하는 것이 가능하다.
기본 배지로는, 예를 들어, Ham'F12 배지, MCDB153 배지 혹은 저칼슘 MEM 배지 등의 저칼슘 배지 및 MCDB104 배지, MEM 배지, D-MEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지 혹은 RD 배지 등의 고칼슘 배지 등을 들 수 있으며, 그 기본 배지는, 목적에 따라, 예를 들어 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 각종 무기 혹은 유기 물질 등을 함유할 수 있다.
모노클로날 항체의 단리, 정제는, 상기 서술한 배양 상청 혹은 복수를, 포화 황산암모늄, 이온 교환 크로마토그래피 (DEAE 또는 DE52 등), 항이뮤노글로불린 칼럼 혹은 프로테인 A 칼럼 등의 어피니티 칼럼 크로마토그래피에 제공하는 것 등에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 항체로서, 항체 유전자를 항체 산생 세포, 예를 들어 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 짜넣어, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생시킨 재조합형 항체를 사용할 수 있다 (예를 들어, Carl 등, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, 1990년 발행).
구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마나 항체를 산생하는 면역 세포, 예를 들어 감작 림프구 등을 암 유전자 등에 의해 불사화시킨 세포로부터, 항체의 가변 영역 (V 영역) 을 코드하는 mRNA 를 단리한다. mRNA 의 단리는, 공지된 방법, 예를 들어 구아니딘 초원심법 (Chirgwin, J. M. 등, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 등에 의해 전체 RNA 를 조제하고, mRNA Purification Kit (파르마시아 제조) 등을 사용하여 mRNA 를 조제한다.
얻어진 mRNA 로부터 역전사 효소를 사용하여 항체 V 영역의 cDNA 를 합성한다. cDNA 의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용하여 실시할 수 있다. 또, cDNA 의 합성 및 증폭을 실시하려면 5'-Ampli FINDER RACEKit (클론테크 제조) 및 PCR 을 사용한 5'-RACE 법 (Frohman, M. A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988년, 제85권, 8998 페이지 등) 을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA 와 연결한다. 또한, 이것으로부터 재조합 벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택해서 원하는 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA 의 염기 배열을 공지된 방법, 예를 들어, 데옥시법에 의해 확인한다.
목적으로 하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 가 얻어지면, 이것을 원하는 항체 정상 영역 (C영역) 을 코드하는 DNA 와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 짜넣는다. 또는, 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 를, 항체 C 영역의 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 짜넣어도 된다. 본 발명에서 사용되는 항체를 제조하려면, 항체 유전자를 발현 제어 영역, 예를 들어, 인핸서/프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 짜넣는다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하고, 항체를 발현시킬 수 있다.
항체 유전자의 발현은, 항체의 중쇄 (H 쇄) 또는 경쇄 (L 쇄) 를 따로 따로 발현 벡터에 짜넣어 숙주를 동시 형질 전환시켜도 되고, 혹은 H 쇄 및 L 쇄를 코드하는 DNA 를 단일의 발현 벡터에 짜넣어 숙주를 형질 전환시켜도 된다 (WO94/11523 참조).
상기 이외의 본 발명의 항체의 제조 방법에는, 이른바 파지 디스플레이 기술 (Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)) 도 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 인간이나 동물 (예를 들어, 토끼, 마우스, 래트, 햄스터 등) 의 B 림프구를 재료로서 공지된 방법에 의해 제조된 항체 유전자 라이브러리, 혹은 인간이나 동물의 Germ Line 배열로부터 선별, 및 개변하여 완전 합성한 항체 유전자 라이브러리를, 박테리아파지, 대장균, 효모, 동물 세포 등의 세포 표면이나 리보솜 상 등에 제시시킨다. 이 때, 세포 표면에 제시시키는 항체의 형태로는 IgG 분자, IgM 분자, Fab 프래그먼트, 1본쇄 Fv (scFv) 프래그먼트 등을 들 수 있다.
이렇게 하여 얻은 항체 프래그먼트 유전자는 공지된 방법에 의해 IgG 항체 유전자의 대응 영역과 재조합함으로써, 항체 유전자를 얻을 수 있다. 그리고, 이와 같이 하여 얻어진 유전자를 적당한 벡터에 짜넣어, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 항체를 산생할 수 있다 (예를 들어, Carl 등, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, 1990년 발행).
본 발명의 항체에는, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 항체, 예를 들어, 키메라화 항체, 인간화 항체나, 완전 인간형 항체 등이 포함된다.
본 발명의 항체는, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 방사성 물질, 톡신, 당사슬 등의 각종 분자와 결합한 콘쥬게이트 항체여도 된다. 이와 같은 콘쥬게이트 항체는, 얻어진 항체에 화학적 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다. 본 발명에 있어서의 항체에는 이들 콘쥬게이트 항체도 포함된다.
본 발명의 항체에는 항체의 Fc 영역에 N-글리코시드 결합 당사슬이 결합하고, 그 N-글리코시드 결합 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 항체가 포함된다. 항체의 Fc 영역에 N-글리코시드 결합 당사슬이 결합하고, 그 N-글리코시드 결합 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 항체로는, 예를 들어 α1,6-푸코오스 전이 효소 유전자가 결손한 CHO 세포 (국제 공개 제2005/035586호, 국제 공개 제02/31140호) 를 사용하여 제조되는 항체를 들 수 있다. 항체의 Fc 영역에 N-글리코시드 결합 당사슬이 결합하고, 그 N-글리코시드 결합 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합하고 있지 않은 본 발명의 항체는, 높은 ADCC 활성을 갖는다.
또 본 발명의 항체는, 그 N 말단 혹은 C 말단에 다른 단백질을 융합해도 된다 (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). 융합하는 단백질은 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
항체 단편이란, 전술하는 본 발명의 항체의 일부로서, 당해 항체와 마찬가지로 CCR8 에 특이적 결합성을 갖는 단편을 의미한다. 항체 단편이란, 구체적으로는, Fab, F(ab')2, Fab', 1본쇄 항체 (scFv), 디술파이드 안정화 항체 (dsFv), 2 량화체 V 영역 단편 (Diabody), CDR 을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다 (엑스퍼트·오피니언·온·테라퓨틱·페이턴트, 제6권, 제5호, 제441 ∼ 456페이지, 1996년).
또, 본 발명의 항체는, 2 개의 상이한 항원 결정 부위를 갖고, 상이한 항원에 결합하는 이중 특이성 항체 (bispecific 항체) 여도 된다.
ADCC (Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity；항체 의존성 세포 개재성 세포 상해) 활성이란, 생체 내에서, 종양 세포 등의 세포 표면 항원 등에 결합한 항체가, 항체의 Fc 영역과 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 Fc 리셉터의 결합을 통해서 이펙터 세포를 활성화 하고, 종양 세포 등을 상해하는 활성을 의미한다. 이펙터 세포로는, 내추럴 킬러 세포, 활성화된 매크로파지 등을 들 수 있다.
또, 본 발명의 항체는, Treg 세포 또는 매크로파지 세포를 제거시킬 수 있는 점에서, CCR8 을 발현하는 세포에 대하여 ADCC 활성을 갖는 항체가 바람직하다. 본 발명의 항체가 이와 같은 ADCC 활성을 갖는지 여부는, 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에 포함되는 CCR8 에 대한 항체는, Treg 세포 또는 매크로파지 세포의 종양 내로의 집적을 억제하는 관점에서, CCR8 의 중화 항체가 바람직하다. CCR8 의 중화 항체란, CCR8 에 대한 중화 활성을 갖는 항체를 의미한다. CCR8 에 대한 중화 활성을 갖는지 여부는, CCL1 의 CCR8 에 대한 생리 작용을 억제하는지 여부를 측정함으로써 판별할 수 있다. 예로는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, CCL1 의 CCR8 에 대한 결합, 혹은 CCL1 에 의한 CCR8 발현 세포의 유주 또는 세포 내 Ca＋＋ 증가 또는 CCL1 자극에 감수성이 있는 유전자의 발현 변동 등을 측정하는 것을 들 수 있다. 또, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수도 있다.
본 발명의 CCR8 에 대한 항체는, 종양 내 침윤 Treg 세포 제거 작용을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체가 종양 내 침윤 Treg 세포 제거 작용을 갖고 있는지 여부는, 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 CCR8 에 대한 항체는, 종양 내 침윤 매크로파지 세포 제거 작용을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체가 종양 내 침윤 매크로파지 세포 제거 작용을 갖고 있는지 여부는, 예를 들어, 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 항체는, 의약 조성물로서 유용하다. 따라서 본 발명의 항체를 포함하는 의약 조성물은, 경구적 또는 비경구적으로 전신 혹은 국소적으로 투여할 수 있다. 비경구적 투여로는, 예를 들어, 점적 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 비강내 투여, 흡입 등을 선택할 수 있다.
본 발명의 「암 치료용 의약 조성물」 에 있어서의 「암」 에는, 모든 고형암 및 혈액암이 포함된다. 구체적으로는, 유방암, 자궁체암, 자궁경암, 난소암, 전립선암, 폐암, 위 (위선) 암, 비소세포 폐암, 췌장암, 두경부 편평 상피암, 식도암, 방광암, 멜라노마, 대장암, 신암, 비호지킨 림프종, 요로 상피암, 육종, 혈구암 (백혈병, 림프종 등), 담관암, 담낭암, 갑상선암, 전립선암, 정소암, 흉선암, 간장암 등을 들 수 있다. 바람직하게는 유방암, 자궁체암, 난소암, 폐암, 대장암, 신암, 육종을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 유방암, 대장암, 신암, 육종을 들 수 있다.
또, 본 발명의 「암 치료용 의약 조성물」 에 있어서의 「암」 은, 종양 특이 항원을 발현하는 암이 바람직하다.
또한, 본 명세서에 기재된 「암」 은, 난소암, 위암 등의 상피성의 악성 종양 뿐만 아니라, 만성 림프액성 백혈병이나 호지킨 림프종 등의 조혈기암을 포함하는 비상피성의 악성 종양도 의미하는 것으로 하고, 본 명세서에 있어서, 「암 (cancer)」, 「암(암종) (carcinoma)」, 「종양 (tumor)」, 「신생물 (neoplasm)」 등의 용어는 서로 구별되지 않고, 상호 교환 가능하다.
본 발명의 CCR8 에 대한 항체는,
(1) 본 발명의 의약 조성물의 치료 효과의 보완 및/또는 증강,
(2) 본 발명의 의약 조성물의 동태, 흡수 개선, 투여량의 저감 및/또는,
(3) 본 발명의 의약 조성물의 부작용의 경감,
을 위해서 다른 약제와 조합하여, 병용제로서 투여해도 된다.
본 발명의 CCR8 에 대한 항체와 다른 약제의 병용제는, 1 개의 제제 중에 양쪽 성분을 배합한 배합제의 형태로 투여해도 되고, 또 별개의 제제로 하여 투여하는 형태를 취해도 된다. 이 별개의 제제로 하여 투여하는 경우에는, 동시 투여 및 시간차에 의한 투여가 포함된다. 또, 시간차에 의한 투여는, 본 발명 항체를 먼저 투여하고, 다른 약제를 후에 투여해도 되고, 다른 약제를 먼저 투여하고, 본 발명 화합물을 후에 투여해도 상관없고, 각각의 투여 방법은 동일해도 되고 상이해도 된다.
본 발명의 CCR8 에 대한 항체와 병용해도 되는 다른 약제로는, 예를 들어 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체 또는 항CTLA-4 항체를 들 수 있다. 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체가 바람직하고, 항PD-1 항체가 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 항PD-1 항체로는, 예를 들어, 니볼루맙 (Nivolumab), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab) 을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 항PD-L1 항체로는, 예를 들어, 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 아벨루맙 (Avelumab), 더발루맙 (Durvalumab) 을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 항CTLA-4 항체로는, 예를 들어, 이필리루맙 (Ipilimumab) 을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 대상 환자는 암 환자이거나 또는 그 의심이 있는 것이 상정된다. 유효 투여량은, 1 회에 대해 체중 1 ㎏ 당 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎ 의 범위에서 선택된다. 혹은, 환자당 5 ∼ 5000 ㎎, 바람직하게는 10 ∼ 500 ㎎ 의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체 또는 그 항체 단편을 포함하는 의약 조성물은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다. 또, 투여 기간은, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은, 투여 경로에 따라 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 된다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카세인, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바셀린, 인간 혈청 알부민 (HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약 첨가물로서 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은, 제형에 따라 상기 중에서 적절히 혹은 조합하여 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 유전자 조작적 수법으로서, 특별히 언급하지 않는 한 Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory) 에 기재되어 있는 방법을 이용하였다.
실시예 1
신암 종양 내 침윤 세포 및 PBMC 의 추출과 해석
수술 전에 항암제나 방사선 등의 치료를 실시하지 않은 담명세포형 신세포암 (clear cell renal cell carcinoma ; ccRCC) 의 환자 (3 예) 로부터 외과적 치료에 의해 적출된 원발 종양 조직의 일부를 사용하여 이하의 해석을 실시하였다. 종양 중량을 측정 후, 종양괴를 가위로 사각 2 ㎜ 로 절단하고, Tumor Dissociation Kit, human (130-095-929, Miltenyi) 및 gentleMACS (TM) Dissociator (Miltenyi, 130-093-235) 를 사용하여 키트의 첨부 프로토콜에 따라서 종양 조직의 호모지네이트를 제조하였다. 호모지네이트를 70 um 의 셀 스트레이너에 통과시키고, 용혈 처리를 실시한 후, 30 ％ 퍼콜/PBS 용액으로 데브리스 및 사세포를 제거하고, 종양 조직 단세포를 얻었다.
동일 환자의 말초혈 단핵구 (PBMC) 는 말초혈로부터 Ficoll-paque PLUS (GE Healthcare 사) 를 사용한 밀도 구배 원심법에 의해 분취하였다. 분리한 종양 내 세포 및 PBMC 는 세포수를 계측 후, Human TruStain FcX (TM) (BioLegend, 422-301) 및 Zombie NIRTM Fixable Viability kit (BioLegend, 423105) 를 첨부 프로토콜에 따라서 처리하고, 빙중 (氷中) 에서 30 분간 염색하였다. 그 후 2 ％ FCS/HEPES/HBSS 로 1 회 세정 후, 이하의 표지 항체, 표지 항체 첨부 프로토콜에 따라서 염색하였다.
종양 내 침윤 세포에 대해서는, 항CD3 항체 (BioLegend, Clone UCHT1), 항CD4 항체 (BioLegend, Clone OKT4), 항CD25 항체 (BioLegend, Clone BC96) 를 사용하여 빙중에서 30 분간 반응시키고, 세포 표면의 염색을 실시하였다. 2 ％ FCS/HEPES/HBSS 로 2 회 세정 후, Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, 00-5523-00) 를 사용하여, 키트 첨부 프로토콜대로 세포를 고정, 막투과 처치를 하였다. 또한 PE 표지 항FoxP3 항체 (eBioscience, Clone PCH010) 를 사용하여 FoxP3 을 염색하였다. 키트 부속의 세정액으로 1 회 세정 후, 플로 사이토메트리 (BD Biosciences, BD LSRFortessa) 에 의해 해석하였다. ccRCC 종양 내 CD4+ CD25+ T 세포는 거의 모두 Treg 세포의 마커인 FoxP3 을 발현하고 있는 것을 확인하였다 (도 1).
이어서, 상기 종양 내 침윤 세포 및 PBMC 를 항CD3 항체, 항CD4 항체, 항CD45RA 항체 (BD Biosciences, Clone HI100) 및 항CD25 항체로 염색하고, CD3+ CD4+ T 세포에 대해, CD45RA 및 CD25 발현량으로 이차원 전개하였다. PBMC 의 결과는 도 2 이고, 종양 내 침윤 세포의 결과를 도 3 에 나타낸다. 종양 내 침윤 세포의 경우에는, 셀 소터 (FACSAriaII) 를 사용하여 CD3+ CD4+ CD45RA- 이고 또한 CD25 발현 강도를 지표에 도 1C 에 나타내는 바와 같이 강양성 세포 (Fr2), 약양성 세포 (Fr3), 음성 세포 (Fr4 와 Fr5) 의 4 개로 분획하여, 각각의 프랙션에 포함되는 세포를 회수하였다. PBMC 도 종양 내 침윤 세포와 마찬가지로 이차원 전개하고, CD45RA 및 CD25 의 발현 강도를 지표로 도 2 에 나타내는 바와 같이 Fr1 ∼ Fr6 으로 분획하고, 각각의 프랙션에 포함되는 세포를 회수하였다.
실시예 2
분획한 세포로부터의 RNA 의 분리와 cDNA 배열 해석
분리 회수된 각 세포는, RLT buffer (Qiagen) 에 용해하고, Agencourt RNAClean XP (Bechman Coulter) 를 사용하여 total RNA 를 추출하였다. 회수한 RNA 는, SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA kit for Sequencing (Clontech) 을 사용하여 cDNA 화 하고, KAPA Hyper Prep Kit for illumina (Kapa Biosystems) 를 사용하여 라이브러리 조정을 실시하였다. cDNA 합성, 라이브러리 조정은, 항상 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilet Technologies) 를 사용하여 퀄리티 콘트롤을 실시하고, 문제 없는 것을 확인하였다. 완성한 cDNA 라이브러리는 KAPA library Quantification kit Illumina Platforms (Kapa Biosystems) 를 사용하여 타이트레이션 후, Hiseq4000 (illumina) 을 사용하여 페어 엔드 리드로 DNA sequencing 을 실시하고, 각 샘플당 100 염기쌍의 배열 데이터를 2000 만 리드 이상 취득하였다 (fastq 파일).
생 데이터 (fastq 파일) 는 FastQC 에 의해 해석하고, 어댑터 배열 및 리피트 배열은 CutAdapt 를 사용하여 제거하였다. 각 페어 엔드 리드는 cmpfastq_pe 프로그램을 사용하여 각 페어를 가지런히 하였다. 게놈 매핑은 hg38 을 참조 배열로 하여, Bowtie2 를 갖는 TOPHAT2 프로그램에 의해 디폴트 세팅으로 게놈에 매핑하였다. 매핑된 리드는 SAMtools 프로그램에 의해 배열 소트되고, HTSEQ 프로그램에 의해 리드 카운트하였다. 카운트 데이터의 정규화는 Deseq2 프로그램을 사용하였다. 얻어진 각 분획에 대해, 어느 분획이 Treg 세포를 포함하고 있는지를 이하의 방법으로 확인하였다.
Treg 세포는 마커 유전자로서 FoxP3 및 Ikzf2 유전자를 항상적으로 발현하고 있고, 또 자극에 의해 활성화 하고 있어도, IFNγ 나 IL2 는 거의 분비하지 않는 것을 알 수 있다. Treg 세포가 포함되어 있는지 여부, 이들 유전자의 발현량을 조사함으로써, 어느 정도 확인하는 것은 가능하다. 상기 RNA-Seq 데이터를 기초로 종양 침윤 세포와 PBMC 의 각 분획에 대해, 이들 유전자의 발현량을 조사한 결과, 종양 침윤 세포 중의 Fr2, Fr3, PBMC 의 Fr2 에 Ikzf2 와 FoxP3 이 특이적으로 발현하고, 그 이외의 분획에는 거의 발현하고 있지 않은 것이 판명되었다 (도 4). 또 종양 침윤 세포의 Fr4, 5 및 PBMC 세포 중의 Fr4, Fr5 에는 IFNγ (IFNgamma) 및 IL2 가 특이적으로 발현하고, 그 이외의 분획에는 발현하고 있지 않은 것이 판명되었다. (도 4). 이상으로부터, 종양 침윤 세포 중의 Fr2, Fr3, PBMC 의 Fr2 에 Treg 세포가 포함되고, 그 이외의 분획에는 포함되어 있지 않은 것이 판명되었다.
실시예 3
FoxP3 영역의 탈메틸화율의 측정
FoxP3 영역의 탈메틸화율은 Treg 세포의 비율을 정확하게 요구하는 지표이기 때문에, 상기에서 얻은 신암 종양 침윤 세포의 Fr2 ∼ Fr5 의 세포에 대해 FoxP3 영역의 탈메틸화율을 검토하였다. FoxP3 유전자의 제 1 인트론 내의 특정한 CpG 영역에는 Treg 세포 특이적으로 탈메틸화되어 있는 영역이 존재한다 (chrX, 49118000-49118500, hg19). 종양 내 침윤 세포의 각 분획에 포함되는 세포에 대해, 이 영역의 탈메틸화를 해석함으로써, 이번 얻어진 분획이 Treg 세포만으로 이루어져 있는지, 아니면 다른 세포도 혼재하고 있는지를 검증 가능하다.
종양 내 침윤 CD4+ T 세포의 각 분획 (Fr2, 3, 4, 5) 을 회수하고, 페놀 추출법을 이용하여 genome DNA 를 회수하였다. Genome DNA 에 대하여, Methyl Easy Xceed 키트 (Human Genetic Signatures) 를 사용하여 Bisulfite 처리를 실시하고, Treg 세포 특이적 탈메틸화 영역인 FOXP3 intron1 영역 (chrX, 49118000-49118500, hg19) 에 대하여 앰플리콘 PCR 을 실시하였다. DNA 메틸화의 검출은, 메틸화 DNA 특이적 FAM 형광 프로브와 탈메틸화 특이적 VIC 형광 프로브를 준비하고, QuantStudio 3D digital PCR 시스템 (Applied Biosystems) 에 의해 실시하였다. 앰플리콘 PCR 후, FAM 및 VIC 형광 프로브의 발광수를 카운트하고, 양쪽 형광수의 비율로부터 DNA 메틸화율을 산출하고, 각 분획 (Fr2 ∼ Fr5) 의 메틸화율로 하였다.
그 결과 종양 내 침윤 세포 중의 Fr2 및 Fr3 에 포함되는 세포에서는, FOXP3 intron1 영역 (chrX, 49118000-49118500) 내의 CpG 배열의 95 ％ 이상이 탈메틸화 되어 있고, Fr4 및 Fr5 의 탈메틸화율은 50 ％ 이하였다. 이로부터, Fr2 및 Fr3 에 포함되는 세포의 거의 전부가 Treg 세포라고 판명되었다 (도 5).
실시예 4
CCR8 의 동정 (同定)
Treg 세포 (종양 침윤 세포 중의 Fr2) 에 특이적으로 발현하는 1 군의 유전자를 동정하기 위해서 종양 유래의 각 CD4+ T 세포 분획과 동일 환자 PBMC 유래 CD4+ T 세포 분획의 유전자 발현 데이터에 대해 계층적 클러스터 해석을 실시하고, Treg 세포 중의 Fr2 에 발현하고, 종양 유래 Fr5 및, PBMC 의 Fr4, Fr5 에는 거의 발현하고 있지 않은 유전자로서 CCR8 을 동정하였다 (도 6).
실시예 5
마우스 CCR8 강제 발현 세포의 제조
마우스 CCR8 (이하, mCCR8 이라고 기재하는 경우가 있다.) 의 ORF 전체 길이를 발현 벡터 (pcDNA3.4) 에 삽입하고, pcDNA3.4-mCCR8 플라스미드를 구축하였다. 염기 배열은 아미노산을 변경하지 않는 범위에서, 포유류에서 사용 빈도가 높은 코돈으로 변경하였다. HEK293 세포에 리포펙타민 3000 을 사용하여 pcDNA3.4 및 pcDNA3.4-mCCR8 발현 플라스미드를 각각 도입하고, Geneticin (G418) 농도 1 ㎎/㎖ 로 2 주간 약제 선택을 실시하였다.
살아 남은 세포를 트립신으로 박리하고, DMEM/10 ％ FCS 배지로 세정 후, PE 표지 항mCCR8 항체 (클론 SA214G2) 를 1/200 희석으로 첨가, 30 분간 빙상에서 항체를 반응시키고, 그 후 DMEM/10 ％ FCS 로 1 회 세정하고, 세포 표면에 발현하는 mCCR8 을 표지하였다. 셀 소터 (FACSAriaII) 에 의해 mCCR8 발현하고 있는 세포 집단을 소팅에 의해 농축하였다. 양성 세포 집단을 DMEM/10 ％ FCS (1 ㎎/㎖ 의 G418 함유 배지) 존재하에서 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 2 주간 배양하였다. pcDNA3.4 를 형질 전환한 세포는 약제 선택만을 실시하고, 소팅는 하지 않았다. 발현 확인을 위해 양쪽 세포를 시판 항PE 표지 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2) 로 염색하고, 플로 사이토미터 (FACSAriaII) 로 해석하였다. 그 결과를 나타낸다 (도 7). pcDNA3.4 를 형질 전환한 세포와 비교하여, pcDNA3.4-mCCR8 을 형질 전환한 세포는, 99 ％ 이상의 세포로 mCCR8 의 발현을 확인하였다.
실시예 6
항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 의 FcγR 자극능의 검토
항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사로부터 구입) 의 ADCC 활성에 필요한 FcgR 자극능을 mFcγRIV ADCC Reporter Bioassays Core kit (Promega 사) 를 사용하여 평가하였다. 본 키트에서는 이펙터 세포 상의 FcγR 의 활성화가 당해 세포의 NFAT 프로모터 하류에 연결된 루시페라아제 유전자의 발현량으로 나타나고, 이것을 정량함으로써 FcγR 시그널의 활성화를 정량 가능해진다.
이하, 간단하게 기술한다. 트립신으로 박리한 mCCR8 발현 HEK293 타겟 세포 (타겟 세포) 1 x 105/well 과 키트 첨부 FcγR 발현 이펙터 세포를 1：1.5 의 비율로, 96 well 플레이트 중에서 혼합하였다. 세포 혼합 후 바로 mCCR8 항체를 첨가하였다. 그 농도는 도 8 에 나타내는 바와 같이 33 ug/㎖ 내지 0.033 ug/㎖ 로 하였다 (N = 2). 이펙터 세포만을 음성 대상으로 하였다. 항체 첨가 후 14 시간 후에 세포를 회수하고, 루시페라아제 활성을 측정하였다 (도 8). N = 2 의 평균값을 표시한다.
결과, 음성 대상에서는 어떠한 항체 농도에서도 루시페라아제 활성은 확인되지 않았던 데 반해, 타겟 세포 첨가군에서는 항체 농도 의존적인 활성이 확인되었다. 세로축은 발광량 상대값을 나타낸다. 도 8 로부터 최대 활성값은 약 6000 Relative Light Unit (R.L.U) 이고, EC50 값 (약 3500 R.L.U) 은 약 0.1 ㎍/㎖ 였다 (도면 중의 라인). 이상의 결과로부터 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 가 FcγRIV 를 활성화할 수 있는 것을 분명히 하였다.
실시예 7
ADCC 활성의 측정
실시예 5 에서 제조한 mCCR8 안정 발현 HEK293 세포를 사용하여, 항mCCR8 항체 (SA214G2) 의 세포 상해 활성을 평가하였다.
C57BL/6 마우스의 비장을 분리하고, 비장 세포를 셀 스트레이너에 통과시켜 회수하였다. 세포를 세정 후, 비오틴화 항CD49b (clone DX5) 항체를 4 ℃ 에서 30 분 반응시키고, 세정 후에 스트렙트아비딘 마이크로비즈 (Miltenyi) 를 사용하여 NK 세포를 정제하고, 이펙터 세포로 하였다. 마우스 CCR8 발현 HEK293 세포는, Cell Trace Violet (CTV) (서모 피셔사, C34557) 을 사용하여 종농도 2.5 uM 으로 염색하고, 표적 세포 (타겟 세포) 로 하였다. 96 well 플레이트 중에서 이펙터 세포 :표적 세포 = 5 :1 (이펙터 세포수는 2.5 x 105) 의 비율로 200 ㎕ 에 혼합하고, 항마우스 CCR8 항체 또는 아이소타입 컨트롤 항체 (래트 IgG2b, clone RTK4530) 를 종농도 1 ㎍/㎖ 로 첨가하고, 37 ℃ 의 CO2 인큐베이터 중에서 하룻밤 배양하였다. 그 후, PE 표지 Annexin V (AnnexinV-PE, MBL 사, 4696-100) 를 첨부 프로토콜에 따라서 1/100 희석으로 첨가하고, 37 ℃ 에서 30 분 염색 후, 1 회 세정하였다. 플로 사이토미터로 CTV 염색된 표적 세포 중의 Annexin V 양성 아포토시스 세포율을 해석하였다. 트리플리케이트 (N = 3) 로 실시하고, 그 평균값과 표준 편차를 나타낸다. 2 회 동일한 실험을 실시한 대표예를 나타낸다. (도 9). 아이소타입 컨트롤 항체와 비교하여, 항마우스 CCR8 항체를 첨가하면, 표적 세포 중의 Annexin V 양성 세포율이 6 배 정도 유의하게 증가하였다. 이상으로부터 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 는 ADCC 활성을 갖는 것이 판명되었다.
실시예 8
CCR8 에 대한 중화 활성의 측정
마우스 CCR8 안정 발현 HEK293 세포를 사용하여 마우스 CCR8 의 리간드인 마우스 CCL1 에 의한 세포 내 칼슘 유입을 지표로 하여 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 의 CCR8 에 대한 중화 활성을 평가하였다.
칼슘 측정에는 이하의 시약을 사용하였다.
HEPES (WAKO CAS. NO7365-45-9)
HBSS (+) without Phenol Red (WAKO)
Fluo3-AM (cat F023 도진 화학)
프로베네시드 (CAS-No : 57-66-9, 나칼라이 테스크)
Pluronic F127 (P3000MP ; Life Technology 사)
10 mM HEPES/HBSS/0.1 ％ BSA Buffer (HBSS 에 종농도 10 mM HEPES 와 종농도 0.1 ％ BSA 가 되도록 각각 첨가)
Fluo3-AM 을 4 μ㏖/ℓ, Pluronic F127 을 0.04 ％ 의 종농도로 10 mM HEPES/HBSS Buffer 에 용해하였다. 이 용액에 세포를 현탁하고, 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트 함으로써, Fluo3-AM 을 세포에 도입시켰다. 그 후 세포를 10 mM HEPES/HBSS/0.1 ％ BSA 용액으로 3 회 세정하고, 1.25 uM 프로베네시드를 포함하는 10 mM HEPES/HBSS/0.1 ％ BSA 용액에 2 x 105/㎖ 의 세포 농도가 되도록 현탁하였다. 그리고, 10 분간 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 인큐베이트하였다. 또한 항mCCR8 항체 (SA214G2) 혹은 Isotype Control 항체 (Clone LTF-2, Bio X Cell) 를 5 ㎍/㎖ 의 농도로 첨가하였다. 또한, 20 분간 37 ℃ 에서 인큐베이트하였다.
세포는 2 ㎖ 용액을 수정 유리제 큐벳에 넣고, 미리 측정실을 35 ℃ 로 온도 설정해 둔 분광 광도계 HITACHI F7000 에 세트하였다. 측정 조건은 하기와 같다.
여기 파장 508.0 ㎚, 형광 (측정) 파장 527.0 ㎚, 여기측 슬릿 5 ㎚, 형광측 슬릿 5 ㎚, 포토멀티플라이어 전압 950 V, 리스폰스 0.5 s
형광 파장이 안정될 때까지 약 30 초간 스터러로 교반하면서 인큐베이트하였다. 파장이 안정되면, 마우스 CCL1 을 종농도 50 nM (4 ㎕) 이 되도록 첨가하고, 측정을 개시하였다. 측정 결과, 항mCCR8 항체를 미리 첨가하는 것으로부터, mCCL1 에 의한 세포 내 칼슘 유입이 거의 완전하게 억제되는 것이 판명되었다 (도 10). 컨트롤 항체 첨가에서는 억제는 확인되지 않았다. 또한, 그래프 중의 갭은 아고니스트를 세포에 투여하기 위해서 기기의 뚜껑의 개폐를 했을 때의 것이다. 이상으로부터 항mCCR8 항체 (SA214G2) 항체는 마우스 CCR8 에 대한 중화 활성을 갖는 것이 판명되었다.
실시예 9
CT26 에 있어서의 mCCR8 의 발현의 확인
CT26 세포를 6 웰 디쉬에서 배양하고, 약 50 ％ 의 컨플루언트 상태가 된 시점에서 배양액을 제거하고, 10 mM EDTA/PBS 를 5 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이트하였다. 그 결과 세포는 거의 모두 박리되고, 피펫으로 서스펜드함으로써, 거의 단일 세포로까지 분리할 수 있었다. 2 회 D-MEM/10 ％ FCS 로 세정하고, D-MEM/10 ％ FCS 에 서스펜드하고, LIVE/DEAD (등록상표) Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (ThermoFisher Scientific, L34975) 와 APC 표지 항mCCR8 (SA214G2) 또는 APC 표지 Isotype Control 항체로, 빙중에서 세포를 염색하였다. 1 시간 후에 3 회 D-MEM/10 ％ FCS 로 세정하고, 플로 사이토미터 (FACSCantoII) 로 mCCR8 발현율을 해석하였다. Isotype Control 항체를 사용하여 백그라운드를 설정하고, 백그라운드 레벨 이상의 양성 세포율 (P6) 과 APC 형광의 중앙값 (Median) 을 산출하였다 (도 11). 그 결과 APC 형광 강도의 중앙값에 차는 확인되지 않고, 또 양성 세포도 0.2 ％ 로 거의 확인되지 않았다. 이상으로부터, CT26 세포는 항mCCR8 항체로는 인식되지 않고, CT26 세포는 mCCR8 을 발현하지 않는 것이 확인되었다.
실시예 10
대장암 세포주의 CT26 세포를 사용하여 종양 내 침윤 세포의 CCR8 발현 확인
마우스 Balb/c 마우스 (7 w, 암컷) 의 등부 피내에 3 x 105 개 (50 ㎕) 의 CT26 세포 (N = 3) 를 이식하고, 이식 3 일째에 래트 항KLH (키홀 림펫 헤모시아닌, Clone LTF-2) 항체 (IgG2b) 400 ㎍ 을 복강내에 투여하였다. 투여 후 4 일째 (4d) 와 7 일 (7d) 째에, 3 예의 개체로부터 종양을 회수하였다 (N = 3). CT26 세포의 종양괴를, 가위로 잘게 절단하고, 시판 키트 (Tumor Dissociation Kit, mouse, Miltenyi 와 the gentle MACS (TM) Dissociator, Miltenyi Biotech cat. 130-095-929) 를 사용하여 첨부 키트 프로토콜에 따라서, 종양 침윤 세포를 조제하였다.
조제된 세포는 70 um 의 셀 스트레이너에 통과시킨 후, 2 회 10 mM HEPES/HBSS/2 ％ FBS 로 세정하였다. 그 후, 적혈구 용해액 (Miltenyi 사) 으로 5 분간 처리하여, 적혈구를 제거하고, 또한 2 ％ FCS (Fetal Calf Serum)/10 mM HEPES/HBSS 버퍼로 2 회 세정하였다. 종양 침윤 세포를 2 개로 나누고, 하나는 Treg 세포의 동정, 다른 일방은 미엘로이드계 (매크로파지) 세포의 동정을 실시하였다. 이하의 방법 및 항체에 의해 세포를 염색하였다. 사용한 항체 및 염색 시약, 어세이 버퍼는 하기하는 바와 같다.
이하가 사용한 항체이다.
(Treg 세포 확인용 항체 세트)
PE anti-mouse/rat FoxP3 (clone FJK-16s) eBiosciences
Anti-mouse CD4 PerCP/Cy5.5 (clone RM4-5) eBiosciences
Anti-mouse CD8a FITC (clone 5H10-1) Biolegend
Bv421 anti-mouse CD25 (clone PC61) BioLegend
Bv510 anti-mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend
AF647 Anti-mouse CCR8 (clone SA214G2) BioLegend
AF647 Isotype Control (clone RTK4530) BioLegend (CCR8 의 음성 컨트롤)
(미엘로이드, 매크로파지 세포 확인용 항체 세트)
AF647 Anti-mouse CCR8 (clone SA214G2) BioLegend
AF647 Isotype Control (clone RTK4530) BioLegend (CCR8 의 음성 컨트롤)
Bv510 anti-mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend
FITC anti-mouse Gr-1 (clone RB6-8 C5) Biolegend
Bv421 anti-mouse F4/80 (clone BM8) BioLegend
PECy7 anti-mouse CD11b (clone M1/70) BioLegend
PerCP/Cy5.5 Anti-mouse MHC classII IA/IE (cloneM5/114.15.2) BioLegend
PE anti-mouse CD206 (cloneC068C2) BioLegend
(그 외, 사용한 시약)
Zombie NIR Fixable Viability Kit (cat no. 423106) BioLegend
BD Pharmingen Transcription Factor buffer Set (cat no. 562574)
BD Pharmingen Lysing Buffer (cat no. 555899)
HBSS(-) Wako 084-08345
FCS (Hyclone cat no. SH30070.03)
염색의 방법은 이하와 같다. 침윤 세포를 Zombie NIR Fixable Viability Kit 시약을 사용하여, 30 분간 빙중에서 염색하였다. 2 ％ FCS/10 mM HEPES/HBSS 로 1 회 세정 후, Treg 및 CCR8 양성 세포에 대해서는, Bv510 표지 항CD45, PerCP.Cy5.5 표지 항마우스 CD4, FITC 표지 항마우스 CD8, Bv421 표지 항마우스 CD25, AF647 표지 항마우스 CCR8 항체 (또는 AF647 표지된 아이소타입 컨트롤 항체) 로 염색하였다. 단구계 세포에 대해서는 Bv510 표지 항CD45, FITC anti-mouse Gr-1, PECy7 anti-mouse CD11b, Bv421 anti-mouse F4/80, PerCP/Cy5.5 표지 MHC 클래스 2 (IA/IE) 항체, PE 표지 anti-mouse CD206 항체로 염색하였다.
염색은 30 분간 빙중에서 실시하였다. 2 ％ FCS/HEPES/HBSS 로 2 회 세정 후, 세포를 시판 키트 (FoxP3 staining kit, eBioscience 사) 를 사용하여 첨부 프로토콜에 따라서 고정시키고, PE 표지 항FoxP3 항체를 사용하여 세포 내 FoxP3 을 염색하였다. 당해 키트 첨부 버퍼로 세정 후, 플로 사이토미터를 사용하여 세포를 해석하였다.
CD45+CD4+T 세포를 해석하였다. CD45+CD4+T 세포 중에서 아이소타입 컨트롤 항체에서의 염색에 의해 음성 세포 영역을 결정하고, 항마우스 CD25 및 항마우스 FoxP3 항체에서 어느 쪽도 양성이 되는 세포를 Treg 세포로 하여, 투여 4 일 후 (이식 7 일 후) 와 투여 7 일 후 (이식 10 일 후) 의 존재 빈도를 산출하였다. 그 결과, 마우스 종양 내의 CD45+CD4+T 세포 중의 약 23 ％ (4d) 와 30 ％ (7d) 가 CD25＋FoxP3＋ 세포였다 (도 12).
다음으로 CD45+CD4+CD25＋FoxP3+T 세포 중의 CCR8 발현을 해석하였다. CD45+CD4+CD25＋FoxP3+T 세포를 아이소타입 컨트롤 항체로 염색하는 것으로부터 음성 세포 영역을 결정하고, 항마우스 CCR8 항체에서 양성이 되는 세포를 CCR8＋Treg 세포로 하여, 투여 4 일 후 (이식 7 일 후) 와 투여 7 일 후 (이식 10 일 후) 의 존재 빈도를 산출하였다 (도 13). 그 결과 마우스 종양 내의 CD45+CD4+CD25＋FoxP3+T 세포 중의 약 50 ％ (4d) 와 약 67 ％ (7d) 가 CCR8＋ 세포였다 (도 13).
미엘로이드계 세포에 대해서는, 플로 사이토미터로 CD45+ 세포와 FSC/SSC 로 미엘로이드계 집단에 게이트하고, 그 중 CD11b+Gr1+CD206＋ 세포 중의 CCR8+ 세포율을 해석하였다. 그 결과 이식 7 일 후 (투여 후 4 일 후) 와 10 일 후 (투여 후 7 일 후) 의 어느 쪽도 40-50 ％ 의 세포에서 CCR8 양성인 것이 판명되었다 (도 14). 또 이것과는 상이한 매크로파지 세포 집단으로서, CD45＋CD11b＋F4/80＋ 세포 (N = 3) 에서의 CCR8 발현율을 동일하게 측정한 바, 이식 10 일째 (7d) 의 시점에서 45.3 ％ (표준 편차 ±8.2 ％) 의 당해 세포에서 발현하고 있는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 종양 내 침윤 세포의 적어도 CD4+CD25+FoxP3+T 세포와 CD11b＋Gr1＋CD206+ 매크로파지 (M2 형 매크로파지라고 일컬어지고 있다) 에서 CCR8 이 발현하고 있는 것이 판명되었다.
실시예 11
항mCCR8 항체 투여에 의한 종양 내 침윤 Treg 세포 혹은 종양 내 침윤 매크로파지 세포의 제거 효과의 검토
마우스 Balb/c 마우스 (7 w, 암컷) 의 등부 피내에 3 x 105 개의 CT26 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 이식 3 일 후에 래트 항마우스 CD198 (CCR8) 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 혹은 아이소타입 컨트롤 항체 (Clone LTF-2) 를 꼬리 정맥내에 400 ㎍ (액량 400 ㎕) 투여하였다 (각 군 N = 3). 종양 이식 7 일 후 (항체 투여 후 4 일) 와 10 일 후 (항체 투여 후 7 일) 에 종양을 회수하고, 종양 내 침윤 세포를 조제하고, 해석하였다 (도 15).
종양 내 침윤 Treg 세포는 실시예 10 과 동일한 방법으로 회수하였다. 사용한 항체는 실시예 10 과 동일하다.
먼저 최초로, 침윤 세포를 Zombie NIR Fixable Viability Kit 를 사용하여, 30 분간 빙중에서 염색하였다. 2 ％ FCS/10 mM HEPES/HBSS 로 1 회 세정 후, Bv510 표지 항CD45, PerCP.Cy5.5 표지 항마우스 CD4, FITC 표지 항마우스 CD8 항체, Bv421 표지 항마우스 CD25, AF647 표지 항마우스 CCR8 항체 (또는 AF647 표지된 아이소타입 컨트롤 항체) 로 염색하였다. 염색은 30 분간 빙중에서 실시하였다. 2 ％ FCS/HEPES/HBSS 로 2 회 세정 후, 세포를 시판 키트 (FoxP3 staining kit, eBioscience 사) 를 사용하여 첨부 프로토콜에 따라서 고정시키고, PE 표지 항FoxP3 항체를 사용하여 세포 내 FoxP3 을 염색하였다. 당해 키트 첨부 버퍼로 세정 후, 플로 사이토미터를 사용하여 세포를 해석하였다.
CD45＋CD4＋FoxP3＋CD25＋ 세포를 마우스 Treg 세포로 하였다. Treg 세포 중에서 AF647 표지된 아이소타입 컨트롤 항체에 의한 염색에 의해 음성 세포 영역을 결정하고, AF647 표지된 항마우스 CCR8 항체로 컨트롤과 비교하여 양성이 되는 세포를 CCR8 양성 세포로서 그 빈도를 산출하였다.
그 결과, 도 16 과 같이 아이소타입 항체 투여 마우스의 종양 내 CD45+CD4＋CD25＋FoxP3＋T 세포 (Treg 세포) 비율을 100 ％ 로 했을 경우의 (10 일 후) 항마우스 CCR8 (SA214G2) 항체 투여 마우스에서의 동 (同) 세포 (Treg 세포) 의 양성율은, 종양 이식 7 일 후 (항체 투여 후 4 일) 에 약 80 ％, 10 일 후 (항체 투여 후 7 일) 에 약 40 ％ 였다 (도 16). 유의 수준 ** 는 P ＜ 0.01 (t 검정) 이었다. 이상으로부터 항CCR8 항체 투여 7 일 후에 종양 내 침윤 Treg 세포의 약 60 ％ 가 항CCR8 항체에 의해 제거되어 있는 것이 나타났다.
상기와 마찬가지로 이식 후 7 일째 (d7) 의 종양으로부터 종양 침윤 세포를 분리하고, CD45+ 세포 중, FSC/SSC 로 미엘로이드 집단에 게이트하고 (FSC/SSC+ 라고 표기한다), 그 세포 중의 CD11b+ F4/80+ 세포에 대해 해석하였다. F4/80 (Ly719) 은 마우스 성숙 매크로파지와 단구의 마커이다. 도 17 에 나타내는 바와 같이, 아이소타입 컨트롤 (N = 3) 과 비교하여 항mCCR8 항체 투여군 (N = 3) 에서, CD11b+ F4/80+ 세포의 존재 비율이 감소하였다 (t 검정 ; P = 0.062). 그래프는 CD45+ FSC/SSC+ 단핵구 세포 집단 중의 F4/80+ 세포의 존재 비율을 나타낸다.
도 17 에서 F4/80+ 세포를 또한 MHC (종양 조직 적합 항원) 클래스 2 분자 중, IA/IE 양성 혹은 클래스 2 (IA/IE) 음성 세포의 존재 비율을 나타낸다. 도 18 에 나타내는 바와 같이, 아이소타입 컨트롤 (N = 3) 과 비교하여, 항mCCR8 항체 투여군 (N = 3) 에서, IA/IE 음성군에서 감소 경향을 나타내고, IA/IE 양성군에서는 유의하게 감소하였다 (t 검정 ; 유의 수준 * ; P ＜ 0.05). 이상으로부터 마우스 CT26 종양 내 단구/매크로파지 집단 혹은 그 일부의 집단의 종양 내 세포수가 감소하고 있는 것이 판명되었다.
실시예 12
대장암 유래 CT26 을 사용한 항mCCR8 항체 투여에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 3 x 105 개의 대장암 유래 CT26 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 종양 이식 3 일 후에 래트 항마우스 CD198 (CCR8) 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 를 정맥내에 400 ㎍ (400 ㎕) 투여하였다 (N = 10). 컨트롤은 아이소타입 컨트롤 항체를 투여하였다 (N = 10). 종양 이식 8 일 후 (항체 투여 후 5 일) 로부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 19).
그 결과 이식 7 일째에는 아이소타입 컨트롤 항체 투여군과 비교하여, 항mCCR8 투여군에서 유의차는 확인되지 않았지만, 11 일째, 14 일째, 17 일째, 21 일째에 있어서 유의하게 항mCCR8 항체 투여군의 종양 체적이 감소하였다 (유의 수준은 11 일째와 14 일째가, ***；P ＜ 0.001, 17 일째와 21 일째가 ** ; P ＜ 0.01). 또 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 14 일째 이후 종양 체적이 감소하고, 17 일째에는 거의 완전히 소실되었다 (개체별 데이터는 도 20, 평균값 데이터는 도 21 에 나타낸다.). 이상의 결과로부터, 항mCCR8 항체 투여에 의해, 면역 억제 세포로서 지적되고 있는 Treg 및 단구/매크로파지에 발현하는 mCCR8 의 기능을 억제하고, 혹은 그들 발현 세포를 항체의 ADCC 활성에 의해 사멸 (제거) 함으로써, 종양 면역이 항진하고, 종양의 퇴축, 소멸로 이어진 것으로 결론지었다.
많은 문헌 등에서 이미 보고되어 있지만, 마우스 Treg 세포의 마커인 마우스 CD25 에 대한 특이적 항체 (항CD25) 를 마우스에 투여하고, 마우스 Treg 세포를 제거한 경우, 종양 이식 전의 투여에서는 약한 항종양 효과를 나타내고, 이식 후 2 일째 이후에서의 투여에서는, 전혀 항종양 효과를 나타내지 않는 것이 보고되어 있다. 우리도 이번과 동일한 CT26 세포계로 항CD25 항체의 이식 후 3 일째에서의 투여를 실시했지만, 전혀 항종양 효과는 확인되지 않았다. 이상으로부터, 항CD25 항체와 비교하여, 항mCCR8 항체 쪽이 강한 약효를 갖고 있는 것으로 결론지었다.
실시예 13
다음으로 CT26 을 사용하여, 마우스 PD-1 에 대한 특이 항체인 항PD-1 항체 (clone RMP1-14, Bio X Cell 사) 의 약효 평가를 실시하고, 항mCCR8 과 비교 검토하였다. 마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 2 x 105 개의 대장암 유래 CT26 세포 (50 ㎕) 를 이식하였다. 이식 후 7 일째부터 항PD-1 항체 (200 ㎍/head, i.p.) 를 3 ∼ 4 일 간격으로 합계 3 회 실시하였다.
그 결과 아이소타입 컨트롤 항체를 투여한 군 (N = 8) 과 비교하여 항PD-1 항체를 투여한 군 (N = 8) 에서 항종양 효과가 확인되었다. 이식 후 14, 17, 20 일째에서의 아이소타입 컨트롤의 종양 체적의 평균과 표준 편차는, 각각 601.7±378.1 ㎣, 956.3±467.7 ㎣ 및 1528.4±774.1 ㎣ 이고, 한편 항PD-1 항체 투여군에서는 각각 175.3±42.6 ㎣, 174.7±55.8 ㎎ 및 209.6±99.8 ㎣ 였다. 항PD-1 항체는 이식 후 14, 17, 20 일째 중 어느 시점에 있어서도 컨트롤과 비교하여 종양 체적의 증가가 유의하게 억제되고 있었다. 그러나 종양이 완전히 소실된 개체는, 관찰 기간 (이식 후 20 일째까지) 에서는 8 마리 중 1 마리였다. 한편 항mCCR8 항체 투여에서는 동 (同) 기간 중에, 10 마리 전체 예에서, 종양의 완전 소실이 확인되었다. 이상으로부터, 표준적인 투여법에서의 항PD-1 항체와 비교하여, 항mCCR8 항체 쪽이 강한 약효를 갖고 있는 것으로 결론지었다.
실시예 14
항mCCR8 항체 투여 마우스에 있어서의 자기 면역 질환의 야기 유무의 확인
다음으로 실시예 12 에서의, 투여 후 18 일째까지의 마우스 상태에 대해 평가하였다. 컨트롤 항체 투여군과 항CCR8 항체 투여군 사이에서, 당해 기간 중의 체중에 유의차는 없었다. 또 어느 쪽의 군도 입모 (立毛) 는 확인되지 않았다. 투여 후 18 일째에 해부하였다. 컨트롤과 비교하여 항CCR8 항체 투여군에서, 림프절 및 장관의 비대가 있는지 검토했지만, 어느 쪽도 차이는 없고, 비대는 확인되지 않았다. 이상의 소견으로부터, 항CCR8 항체 투여 마우스에 있어서, 항종양 효과를 발휘한 기간 중에, 자기 면역 질환의 징후는 확인되지 않는 것으로 결론지었다. 일반적으로는, 항종양 효과가 야기되는 정도까지, 마우스의 전신의 Treg 를 제거하면, 제거 후 14 일 정도에서 위중한 자기 면역 질환이 야기되는 것이 논문으로 보고되어 있고, Treg 억제 요법을 포함하는 종양 면역 요법의 우려 문제로 되어 있다. 이번 결과는, 항CCR8 항체 투여에 의해 강한 항종양 면역 효과가 확인된 마우스에 있어서, 항체 투여 후 18 일째에 있어서도 자기 면역 질환은 전혀 야기되어 있지 않았다. 그 하나의 설명으로서, 마우스 및 인간 CCR8 은 종양 조직과 비교하여, PBMC, 비장, 림프절에서의 발현이 낮은 것이 보고되어 있다. 그러나 이들 말초 조직에서 CCR8 발현 Treg 세포를 제거 혹은 기능 저해했을 경우에, 자기 면역 질환이 야기되는지 여부는 지금까지 보고가 없었다. 이번에 처음으로, 자기 면역 질환을 야기하지 않는 것이 판명되어, 종래의 지견으로부터는 예측할 수 없는 효과라고 생각된다.
실시예 15
대장암 유래 Colon-26 을 사용한 항mCCR8 항체 투여에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 2 x 105 개의 대장암 유래 Colon-26 세포 (50 ㎕) 를 이식하였다. 종양 이식 3 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 를 정맥내에 400 ㎍ (400 ㎕) 투여하였다 (N = 10). 컨트롤은 아이소타입 컨트롤 항체를 투여하였다 (N = 10). 종양 이식 3 일 후 (항체 투여 후 5 일) 부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다. 그 종양이 엔드포인트 체적 (800 ㎣) 에 도달한 시점에서, 각 동물의 엔드포인트로 하였다. 그 결과 이식 후 14 일째 및 18 일째에 아이소타입 컨트롤 항체 투여군과 비교하여, 항mCCR8 투여군에서 종양 체적 증가가 억제되었다. 14 일째에서의 종양 체적의 평균은 아이소타입 컨트롤 항체 투여군에서 451.3 ㎣ (표준 편차는 ±177.5 ㎣), 항CCR8 항체 투여군에서 322.6 ㎣ (표준 편차는 ±146.0 ㎣) 이고, 14 일째의 종양 체적이 350 ㎣ 이상인 개체는 아이소타입 컨트롤군에서 10 예 중 9 예, 항mCCR8 투여군에서 10 예 중 4 예이고, 이 분리 양태에 관해서, 피어슨의 카이 제곱 검정에서는 P = 0.019 로 유의차가 있었다. 따라서 14 일째에 350 ㎣ 의 종양 체적에 도달한 개체수에 차가 확인되었다. 또 이식 후 18 일째에서의 종양 체적의 평균은, 아이소타입 컨트롤 항체 투여군에서 874.7 ㎣ (표준 편차는 ±269.2 ㎣), 항CCR8 항체 투여군에서 585.4 ㎣ (표준 편차는 ±401.7 ㎣) 였다 (도 22). 18 일째의 종양 체적이 600 ㎣ 이상인 개체는 아이소타입 컨트롤군에서 10 예 중 9 예이고, 한편 항mCCR8 투여군에서는 10 예 중 4 예이고, 이 분리 양태에 관해서, 피어슨의 카이 제곱 검정에서는 P = 0.019 이고 유의차가 있었다. 따라서 18 일째에 600 ㎣ 의 종양 체적에 도달한 개체수에 차가 확인되었다. 또한 종양 체적이 800 ㎣ 가 된 시점을 엔드포인트로서 미리 설정하였다. 종양 체적이 800 ㎣ 를 넘어, 사망하였다고 간주한 개체는, 14 일까지는 어느 쪽도 확인되지 않고, 18 일째에 아이소타입 컨트롤군이, 10 예 중 7 예, 항CCR8 항체군이 10 예 중 3 예였다. 18 일째에서의 생존률에 대해, 피어슨의 카이 제곱 검정을 실시하고, 생존률에 차가 있는지 검토한 결과, P = 0.025 로 생존률에 유의차가 있었다.
또 동일한 세포주를 사용한 동일한 실험에서, 아이소타입 컨트롤 항체를 투여한 군과 비교하여 항PD-1 항체 (clone RMP1-14, BioXCell 사) 의 투여군에서, 항종양 효과는 확인되지 않았다. 이상으로부터 항mCCR8 항체는 항PD-1 항체 내성의 Colon26 세포에 대하여 보다 높은 항종양 효과를 나타내었다.
실시예 16
인간 신암 침윤 세포의 CCR8 의 발현 해석
14 예의 인간 신암 종양 내 침윤 세포에서의 CCR8 의 발현 해석을 실시하였다. 14 예의 신암 환자의 배경은, 성별은 남성 11 명과 여성 3 명이며, 연령 중앙값은 68.5 세, 병리 병기는 T1A 가 6 명, T1B 가 2 명, T3A 가 5 명, T3b 가 1 이었다. 구체적으로는, 신암 (Clear Cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC) 환자 14 명의 신암 원발 종양 내 침윤 세포를 실시예 1 의 도 1 과 동일하게 단리하고, Anti-CD4 (BioLegend, Clone OKT4), anti-CD3 (BioLegend, Clone UCHT1), anti-CD45RA (BD Biosciences, Clone HI100), anti-CD8 (Biolegend, RPA-T8), anti-CCR8 (BioLegend, Clone L263G8), anti-FoxP3 (eBioscience, Clone 236A/E7), anti-FoxP3 의 아이소타입 컨트롤 항체로 염색하고, 플로 사이토메트리 (BD Biosciences, BD LSRFortessa) 로 해석하였다. CD3＋CD8＋T 세포 및 CD3＋CD4＋T 세포에 대해 해석하였다. CD3＋CD4＋T 세포에 대해서는, 또한 FoxP3 발현의 유무로 2 군으로 나누어 해석하였다. 아이소타입 컨트롤 항체의 염색에 의해, FoxP3 발현의 음성 대조로 하였다. CCR8 의 발현 강도는 각 환자 샘플의 FACS 해석값의 평균값 (MFI) 을 사용하였다. 표 1 에 항CCR8 항체 및 그 아이소타입 컨트롤 항체에서의 염색의 MFI 값의 평균 및 그 표준 편차를 나타낸다.
Figure pct00001
CD8+ T 세포에는 거의 CCR8 은 발현하고 있지 않은 것이 판명되었다 (표 1). CD4+ FoxP3- T 세포는 조금 발현하고 있지만, CD4+ FoxP3+ T 세포에서는 MFI 값의 평균이 CD4+ FoxP3- T 세포의 8 배 이상이고, CD4+ FoxP3+ T 세포에 CCR8 이 유의하게 강하게 발현하고 있는 것이 판명되었다 (표 1). 도 23 은 표 1 의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 그래프의 각 플롯은 플로 사이토미터에 의한 각 환자 샘플의 CCR8 발현량의 평균값 (MFI) 을 나타낸다. 그래프의 가로선은 각 샘플의 MFI 값의 평균값을 나타낸다. 바는 표준 편차를 나타낸다. 유의 수준 *** 는, P ＜ 0.001 을 나타낸다. 이상의 결과로부터, 인간 신암 (ccRCC) 에 있어서, 종양 내에 침윤하고 있는 CD3+CD4＋FoxP3＋T 세포 표면에 특이적으로, CCR8 단백질이 발현하고 있는 것이 판명되었다. 이 결과는 RNA-Seq 해석에 의한 mRNA 발현 해석과도 일치한다.
상기 ccRCC 의 14 샘플에 대해, 종양 침윤 CD4+ T 세포에 대해, FoxP3 과 CCR8 의 플로 사이토메트리 해석을 실시하였다. FoxP3 양성 세포 중의 CCR8 양성 세포의 비율, FoxP3 음성 세포에서 CCR8 양성 세포의 비율을 샘플마다 플롯하였다. (도 24). FoxP3 및 CCR8 모두 아이소타입 컨트롤 항체에서의 염색을 음성 표준으로서 사용하고, 이 임계값 이상의 세포를 양성 세포로 하였다. 그 결과, 종양 내 CD3+CD4+FoxP3+T 세포의 CCR8 발현율은 약 75 ％ 이고, CD3＋CD4＋FoxP3-T 세포의 CCR8 발현율은, 약 10 ％ 였다.
이상의 결과로부터 인간 신암 종양 내 침윤 세포 중 FoxP3 을 발현하는 Treg 세포 대부분에서 CCR8 이 발현하고, Treg 세포 이외의 CD4 양성 T 세포에서는 약 10 ％ 에 CCR8 이 발현하고 있는 것이 판명되었다. 이상으로부터 인간 종양 내의 FoxP3 양성 Treg 세포 중의 CCR8 발현율은, 마우스 종양 내의 Treg 세포에서의 CCR8 발현율과 유사하고, 마우스와 마찬가지로 항인간 CCR8 특이적 항체에 의해, 종양 내 침윤 FoxP3 양성 Treg 세포의 대부분을 제거할 수 있는 가능성이 나타났다.
실시예 17
각종 암에 있어서의 종양 내 침윤 세포 중의 CCR8 발현율과 생존률의 상관
Treg 세포에 특이적으로 발현하고, 종양 세포 혹은 인간의 대부분의 정상 세포에서도 발현하고 있지 않은 유전자로서 FoxP3 유전자가 동정되어 있다. 이와 같이 어느 특이적 세포에서만 발현하는 이른바 마커 유전자로서, 예를 들어 Treg 세포의 마커 유전자로서 FoxP3 유전자, T 세포 및 NK 세포의 마커 유전자로서 CD3G 유전자, CD8 양성 T 세포의 마커 유전자로서 CD8A 유전자 등이 알려져 있다.
Treg 세포의 마커 유전자인 FoxP3 유전자에 관해서는, 각 종양 내에서의 FoxP3 유전자의 mRNA 발현량을 측정함으로써 Treg 세포의 종양 내에서의 존재 비율의 지표로 하는 것이 가능한 것도 보고되어 있다 (Cell, 2015년, 제160권, p.48-61).
또 동일한 논문에서 보고되어 있는 바와 같이, TCGA 와 같은 RNA-Seq 데이터베이스를 이용하여 마커 유전자의 종양 내 발현율 (Treg 존재 비율) 과 환자 생존률에 대해, 카플란 마이어 생존 곡선을 그림으로써, Treg 세포의 종양 내에서의 존재율이, 생존률과 관련되는지 해석 가능하다. 종양괴의 RNA-Seq 데이터는, 종양 세포 및 거기에 존재하는 침윤 세포 (림프구나 혈관 세포 등) 의 양방의 세포에서 발현하는 mRNA 가 혼재한 데이터이지만, 종양 세포에 발현하고 있지 않은 것이 나타난 유전자이면, 종양 내 침윤 세포에서 발현하는 유전자로 간주하는 것이 가능하고, 그것을 이용하여 상기와 같은 해석, 즉 종양괴의 RNA-Seq 데이터에 있어서의 마커 유전자의 발현 해석에 의해 종양 내 침윤 세포의 동정이 가능하다. 또한 종양괴에서의 마커 유전자의 발현량은, 거기에 침윤하는 마커 유전자에 대응하는 특정 세포의 발현 세포수와 각 발현 세포의 발현량의 곱으로 파악할 수 있다.
여기서 각 세포의 마커 유전자의 발현량은 개체간에서 거의 일정하다고 가정하면, 그 발현량은 침윤 세포수와 정비례한다. 따라서 이 발현량을 사용함으로써, 종양 내의 발현 세포수가 개체마다 산정 가능해져, 개체간 비교가 가능해진다.
(세포 레벨에서의 CCR8 발현 해석)
공공 데이터베이스인 CCLE (Cancer Cell Line Encyclopedia) 에 인간 각종 세포주 1037 종류의 RNA 발현 데이터가 등록되어 있다. 이들 데이터베이스를 사용하여 CCR8 이나 CD3G 유전자가 T 세포 이외의 암 세포 또는 정상 세포에서 발현하고 있는지를 해석하였다.
신암, 전립선암 및 방광암 유래 세포주에 대해, CCLE 데이터베이스를 사용하여 CD3G 와 CCR8 의 mRNA 발현을 해석하였다.
조사한 세포주는, 신암 유래 세포주에서는,
VMRCRCW, SKRC20, SNU34, SKRC31, UOK10, SLR20, OSRC2, TUHR14TKB, SLR24, HK2, A498, RCC4, KMRC1, RCC10RGB, ACHN, SLR25, SNU1272, UMRC6, SLR23, 769P, SLR21, HEKTE, CAKI1, TUHR4TKB, KMRC2, VMRCRCZ, KMRC3, KMRC20, CAKI2, BFTC909, 786O, A704, TUHR10TKB, SLR26, UMRC2, CAL54, FURPNT1, FURPNT2, HEK293, G402 의 40 종이고,
전립선암 유래 세포주에서는,
VCAP, LNCAPCLONEFGC, DU145, PC3, 22RV1, PRECLH, MDAPCA2B, NCIH660 의 8 종이고,
방광암 유래 세포주에서는,
TCBC14TK, TCBC2TKB 의 2 종이었다. 이들 조사한 모든 고형암 세포주에서 CCR8 및 CD3G 의 발현은 백그라운드와 동 레벨의 값이고, mRNA 발현은 전혀 확인되지 않았다 (최대의 발현을 나타내는 값으로도 G3PDH 의 1/500 이하. 그 이외는 모두 G3PDH 의 발현량의 1/1000 이하). 즉, CCR8 및 CD3G 는 고형 암 세포에는 거의 발현하고 있지 않은 것을 확인할 수 있었다. 인간 각 조직 유래의 프라이머리 정상 세포에 대해서도 동일하게 해석하고, CCR8 및 CD3G 는 혈구계 세포의 일부에만 발현하고, 그 이외의 프라이머리 정상 조직 유래 세포에서는, 거의 발현하고 있지 않은 것이 판명되었다.
이상으로부터 이들 3 종의 암 세포에서는, CCR8 과 CD3G 는 발현하고 있지 않은 것이 나타났다. 따라서 신암, 전립선암, 방광암의 종양괴에 대해, TCGA 의 RNA 발현 데이터를 사용한 경우에, CCR8 과 CD3G 는 암 세포 이외의, 종양괴에 존재하는 침윤 정상 세포에서의 mRNA 발현을 반영하는 것으로 결론지었다.
(TCGA 공공 데이터베이스를 이용한 해석)
다음으로 TCGA 공공 데이터베이스를 이용하여, 신암, 전립선암, 방광암의 종양 속에서 발현하는 CD3G 유전자와 CCR8 유전자의 비 (CCR8/CD3G) 와, 환자 생존률에 대해 해석을 실시하였다. 이들 3 종의 종양 내에 대해, CCR8 및 CD3G 유전자와 가장 잘 발현이 상관 (피어슨 상관) 하는 유전자는, T 세포에서 특이적으로 발현하는 각종 유전자인 것이 판명되었다 (FoxP3, CD5, IL7R, 등으로 상관 계수 r 은 0.7 이상). 이 결과는 CCR8 이나 CD3G 가 종양 세포 자체에는 발현하지 않고, 종양 내에 침윤하고 있는 발현 세포 (특히 T 세포) 에 특이적으로 발현하는 것을 나타내고 있다. 단 CCR8 이 T 세포 이외의 침윤 세포에서 발현하고 있는 것을 부정하는 것은 아니기 때문에, 여기서는 CCR8 을 발현하는 세포 집단으로 한다. CD3G 에 대해서는 T 세포 및 NK 세포에 특이적으로 발현하는 것이 이미 논문 등에서 보고되어 있고, 또 T 세포는 종양에 침윤하는 주요한 세포이므로, CD3G 발현량은 침윤하고 있는 T 세포수라고 비정 (比定) 할 수 있다. 따라서 CCR8/CD3G 값은 종양 내에 존재하는, T 세포수당 CCR8 을 발현하는 세포수라고 정의할 수 있다.
이들 3 종의 암종에 대해 CCR8/CD3G 비와 환자 생존률을 카플란 마이어 곡선으로 해석하였다. 신암은 TCGA 데이터 중 Kidney Renal Clear Cell Carcinoma (TCGA, Provisional) 의 데이터를 사용하고, RNA 발현 데이터 및 환자 생존률 데이터가 갖추어져 있는 523 예를 사용하였다. 마찬가지로 전립선암은 TCGA 데이터 중에서 Prostate Adenocarcinoma (TCGA, Provisional) 의 데이터에서 RNA 발현 데이터 및 환자 생존률 데이터가 갖추어져 있는 490 예를 사용하였다.
또 방광암은 TCGA 데이터 중에서 Bladder Urothelial Carcinoma (TCGA, Provisional) 의 데이터를 사용하고, RNA 발현 데이터 및 환자 생존률 데이터가 갖추어져 있는 392 예를 사용하였다.
CCR8/CD3G 의 발현값에 대해, 높은 군과 낮은 군의 2 군으로 등분하고 (신암의 경우에는 홀수이므로 261:262), 카플란 마이어 생존 곡선 해석을, 해석 소프트 R (R-Studio) 을 사용하여 실시하였다. 유의차 검정은 Log-rank 검정을 실시하였다. 신암의 결과는 도 25, 전립선암의 결과는 도 26, 방광암의 결과를 도 27 에 나타낸다. 그래프 중의 세로선은, 환자는 생존하고 있지만, 평가 기간이 이 시점까지 밖에 없기 때문에, 이 시점에서 탈락한 것 (이른바 센서에 해당) 으로서 취급하고 있다. 또 가로축의 값은 모든 그래프에서 월수를 나타낸다.
그 결과, 3 종 모든 암종에 있어서 CCR8/CD3G 값이 높은 군에서 유의하게 환자 생존률이 낮았다. 인간 종양 내에 침윤하고 있는 CCR8 발현 세포의 T 세포 중에서의 비율이 높은 군에서 생존률이 저하되는 것이 판명되고, 이것은 인간에 있어서도 CCR8 발현 세포가 종양 면역에 대하여 억제 작용을 미치고 있는 것이 시사된다. 이로부터, 마우스에서의 항mCCR8 항체 투여에서의 항종양 효과와 마찬가지로, 인간에 있어서도 종양 내CCR8 발현 세포를 어떠한 방법으로 특이적으로 제거 혹은 사멸함으로써, 종양 면역을 높여 생존률을 상승시킬 가능성이 있는 것이 시사된다.
실시예 18
LM8 세포 및 MethA 세포에 있어서의 마우스 CCR8 의 발현의 확인
골육종 유래 LM8 세포 및 피부섬유 육종 유래 MethA 세포를 6 웰 디쉬에서 배양하고, 약 50 ％ 의 컨플루언트 상태가 된 시점에서 배양액을 제거하고, 10 mM EDTA/PBS 를 5 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 인큐베이트하였다. 그 결과 세포는 거의 모두 박리되고, 피펫으로 서스펜드함으로써, 거의 단일 세포로까지 분리할 수 있었다. 2 회 D-MEM/10 ％ FCS 로 세정하고, D-MEM/10 ％ FCS 에 서스펜드하고, LIVE/DEAD (등록상표) Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (ThermoFisher Scientific, L34975) 와 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 또는 Isotype Control 항체로, 빙중에서 세포를 염색하였다. 1 시간 후에 3 회 D-MEM/10 ％ FCS 로 세정하고, 플로 사이토미터 (FACSCantoII) 로 마우스 CCR8 발현율을 해석하였다. Isotype Control 항체를 사용하여 백그라운드를 설정하고, 백그라운드 레벨 이상의 양성 세포율과 형광의 중앙값 (Median) 을 산출하였다 (도 28). 그 결과 어느 세포에 있어서도 PE 의 형광 강도의 중앙값에 차는 확인되지 않고, 또 양성 세포도 전혀 확인되지 않았다. 이상으로부터, 이들 세포는 항마우스 CCR8 항체에는 인식되지 않고, 마우스 CCR8 을 발현하지 않는 혹은 항체가 반응하는 에피토프를 유지하지 않는 것이 확인되었다.
실시예 19
골육종 유래 LM8 을 사용한 항마우스 CCR8 항체 투여에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 C3H/He 마우스 (7 주령, 수컷) 의 등부 피내에 3 x 105 개의 마우스 골육종 유래 LM8 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 종양 이식 3 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 를 복강내에 400 ㎍ (400 ㎕) 투여하였다 (N = 11). 컨트롤은 아이소타입 컨트롤 항체를 투여하였다 (N = 10). 종양 이식 7 일 후 (항체 투여 후 4 일) 부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 29). 그 결과 이식 18 일째 이후 전체 측정 시점에 있어서, 아이소타입 컨트롤 항체 투여군과 비교하여, 항mCCR8 투여군에서 유의하게 종양 체적의 평균값이 감소하였다 (유의 수준은 18 일째가 *；P ＜ 0.05, 21, 24, 27, 31 일째가 ** ; P ＜ 0.01, 35 일째가 *** ; P ＜ 0.001). 또 항체 투여 31 일째 시점에서, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 11 마리 중 6 마리, 아이소타입 컨트롤 항체 투여군에서는 10 마리 중 1 마리의 종양이 소실되었다. 이 분리 양태에 관해서 피어슨의 카이 제곱 검정을 실시한 결과, 유의차가 있었다 (P = 0.031).
실시예 20
피부섬유 육종 유래 MethA 를 사용한 항마우스 CCR8 항체 투여에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 1 x 105 개의 피부섬유 육종 유래 MethA (50 uL) 를 이식하였다. 종양 이식 3 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 를 복강내에 400 ㎍ (400 ㎕) 투여하였다 (N = 5). 컨트롤은 아이소타입 컨트롤 항체를 투여하였다 (N = 5). 종양 이식 11 일 후 (항체 투여 후 8 일) 부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 30).
그 결과 이식 11 일째 이후 전체 측정 시점에 있어서, 아이소타입 컨트롤 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서 유의하게 종양 체적의 평균값이 감소하였다 (유의 수준은 모든 시점에서, *；P ＜ 0.05). 또 항체 투여 21 일째 시점에서, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 5 마리 중 5 마리, 아이소타입 컨트롤 항체 투여군에서는 5 마리 중 0 마리의 종양이 소실되었다. 이 분리 양태에 관해서 피어슨의 카이 제곱 검정을 실시한 결과, 유의차가 있었다 (P = 0.0016).
실시예 21
유방암 유래 EMT6 을 사용한 항마우스 CCR8 항체 투여에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 1 x 105 개의 유방암 유래 EMT6 (50 uL) 을 이식하였다. 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 를 꼬리 정맥내에 100 ㎍ (100 ㎕) 투여하였다 (N = 20). 컨트롤은 아이소타입 컨트롤 항체를 동량 투여하였다 (N = 20). 종양 이식 4 일 후 (항체 투여 후 1 일) 부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 31).
그 결과 이식 10 일째 이후 전체 측정 시점에 있어서, 아이소타입 컨트롤 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서 유의하게 종양 체적의 평균값이 감소하였다 (유의 수준은 10 일째가 **；P ＜ 0.01, 14, 17, 21 일째가 *** ; P ＜ 0.001). 또 항체 투여 21 일째 시점에서, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 20 마리 중 19 마리, 아이소타입 컨트롤 항체 투여군에서는 20 마리 중 2 마리의 종양이 소실되었다. 이 분리 양태에 관해서 피어슨의 카이 제곱 검정을 실시한 결과, 유의차가 있었다 (P ＜ 0.0001).
실시예 22
항마우스 CCR8 항체의 항PD-1 항체에 대한 우위성 확인
마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 2 x 105 개의 대장암 유래 Colon26 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 아이소타입 컨트롤 항체, 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 또는 항마우스 PD-1 항체 (RMP1-14, Bioxcell 사) 를 정맥내에 400 ㎍ (400 ㎕) 투여하였다 (N = 10). 종양 이식 3 일 후부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 32). 그 결과 아이소타입 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 투여군에서, 17, 20, 및 24 일째에 있어서, 유의하게 종양 체적이 감소하였다 (Steel 의 논파라메트릭 검정：유의 수준은 P ＜ 0.05). 항PD-1 항체 투여군에서는 아이소타입 항체 투여군과 비교하여, 어느 시점에 있어서도 유의차는 확인되지 않았다.
또 항체 투여 24 일째 시점에서, 1000 ㎜3 이상 체적의 종양을 유지하는 마우스 개체는 아이소타입 항체 투여군에서는 10 마리 중 7 마리, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 10 마리 중 2 마리, 항PD-1 항체 투여군에서는 10 마리 중 7 마리이며, 항CCR8 투여군은 아이소타입 항체 투여군 및 항PD-1 항체 투여군의 어느 쪽에 대해서도, 분리 양태에 있어서, 피어슨의 카이 제곱 검정에서 유의차가 있었다 (어느 쪽도 P = 0.025). 이상으로부터 대장암 세포주 Colon26 에 있어서, 항마우스 CCR8 항체 투여에 의해 항종양 치료 효과가 확인되었다.
또한 이식 20 일째, 24 일째에 있어서, 항마우스 PD-1 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 투여군에서 유의하게 종양 체적이 감소하였다 (Steel-Dwass 의 논파라메트릭 검정；유의 수준은 P ＜ 0.05). 이상으로부터 마우스 대장 세포주에 있어서, 항PD-1 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여군에 있어서, 보다 강한 항종양 치료 효과가 확인되었다.
실시예 23
신암 유래 세포주 RAG 를 사용한 항마우스 CCR8 항체 투여에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 신암 유래 세포주 RAG 를 사용하여 동일한 검토를 하였다. Balb/c 마우스 (8 주령, 암컷) 의 등부 피내에 4 x 105 개의 신암 유래 RAG 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 또한, RAG 세포는 미리 Balb/c 마우스에 피하 이식하여 생착한 종양을 재차 마우스에 이식하고, 이 조작을 2 회 반복하고, 마우스 피하에 대한 생착 효율을 상승시킨 RAG 세포 (세포 순화주) 를 사용하였다. 종양 이식 6 일 후에 아이소타입 컨트롤 항체 (N = 10, 단 21 일째만 N = 9), 래트 항마우스 CCR8 항체 (N = 10) (클론 SA214G2, BioLegend 사) 또는 항마우스 PD-1 항체 (N = 10) (RMP1-14, Bioxcell 사) 를 정맥내에 100 ㎍ (100 ㎕) 투여하였다. 종양 이식 6 일 후부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 33). 그 결과 아이소타입 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서, 투여 후 14, 17, 및 21 일째에 있어서 유의하게 종양 체적이 감소하였다 (Steel 의 논파라메트릭 검정：유의 수준은 P ＜ 0.05). 아이소타입 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 PD-1 항체 투여군에서는 유의차는 확인되지 않았다. 이상으로부터 신장 암 세포주에 있어서 항마우스 CCR8 항체 투여에 의해 항종양 치료 효과가 확인되었다. 또 이식 14 일째에 있어서, 항마우스 PD-1 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서 유의하게 종양 체적이 감소하였다 (Steel-Dwass 의 논파라메트릭 검정；유의 수준은 P ＜ 0.05). 이상으로부터 마우스 신암 세포주에 있어서, 항마우스 PD-1 항체 투여군과 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여군에 있어서, 보다 강한 항종양 치료 효과가 확인되었다.
실시예 24
항마우스 CCR8 항체 투여 마우스에 있어서의 염증 반응 유무의 해석
마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 2 x 105 개의 대장암 유래 Colon26 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 래트 항마우스 CD198 (CCR8) 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 또는 아이소타입 컨트롤 항체 (LTF-2, Bioxcell 사) 를 정맥내에 400 ㎍ (400 ㎕) 투여하였다 (N = 10). 이식 24 일째에서의 체중 및 마우스 각 장기 (폐, 간장, 비장, 소장, 서경 림프절) 의 중량을 측정하였다 (도 34). 그 결과, 도 34 에 나타내는 바와 같이, 컨트롤 투여군 (N = 10) 과 항마우스 CCR8 항체 투여군 (N = 10) 에서 체중 및 각 장기 중량에 유의차는 확인되지 않았다. 이상으로부터 항마우스 CCR8 항체 투여에 의한 염증 반응 및 자기 면역 질환은 야기되어 있지 않은 것으로 결론지었다.
실시예 25
각종 임상 종양 내 침윤 세포 중의 CCR8 의 발현 해석
인간 신암, 난소암, 자궁체암, 대장암, 및 폐암의 종양 내 침윤 세포에 있어서의 CCR8 의 발현 해석을 실시하였다. 발현 해석에 사용한 각종 임상 종양의 환자수는, 신암이 12 명, 난소암이 14 명, 자궁체암이 21 명, 대장암이 10 명, 및 폐암이 4 명이다. 각종 임상 종양 내 침윤 세포를 실시예 1 의 도 1 과 마찬가지로 단리하고, Anti-CD45 (BioLegend, Clone H130), anti-CCR8 (BioLegend, Clone L263G8) 항체로 염색하고, 플로 사이토메트리 (BD Biosciences, BD LSRFortessa) 로 측정하였다. 종양 중량당의 CCR8 양성 세포수 및 CD45 양성 백혈구 중의 CCR8 양성 세포의 비율에 대해 해석하였다.
표 2 에 종양 중량당의 CCR8 양성 세포수의 평균값 및 그 표준 편차를 나타낸다. 표 3 에 CD45 양성 백혈구 중의 CCR8 양성 세포의 비율의 평균값 및 그 표준 편차를 나타낸다.
Figure pct00002
Figure pct00003
각종 임상 종양에 있어서 신암을 기준으로 한 경우, 종양 중량당의 CCR8 양성 세포수에 대해서는, 난소암 및 대장암에서는 신암보다 낮은 평균값을 나타내고, 자궁체암 및 폐암에서는 신암보다 높은 평균값을 나타내었다. CD45 양성 백혈구 중의 CCR8 양성 세포의 비율에 대해서는, 난소암에서는, 신암과 동일한 정도의 평균값을 나타내고, 폐암에서는, 신암보다 낮은 평균값을 나타내었다. 또, 자궁체암 및 대장암에서는 신암보다 높은 평균값을 나타내었다. 인간 신암 종양 내 침윤 세포 이외에도, 난소암, 자궁체암, 대장암 및 폐암의 종양 내 침윤 세포에 있어서, CCR8 의 발현이 확인되었다. 이상의 결과로부터, 신암에 더하여, 난소암, 자궁체암, 대장암 및 폐암에 있어서, 항인간 CCR8 특이적 항체에 의해, CCR8 양성 종양 내 침윤 세포를 제거할 수 있는 가능성이 나타났다.
실시예 26
유방암 유래 EMT6 을 사용한 항마우스 CCR8 항체와 항PD-1 항체 투여의 병용에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 Balb/c 마우스 (7 주령, 암컷) 의 등부 피내에 1 x 105 개의 유방암 유래 EMT6 (50 uL) 을 이식하였다.
항마우스 CCR8 항체 단독 투여군은, 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 15 ㎍ (클론 SA214G2, BioLegend 사) 를 정맥내에 투여하고 (100 ㎕), 종양 이식 8 일째 및 13 일째에 아이소타입 컨트롤 항체를 200 ㎍ (100 ㎕) 투여하였다 (N = 10). 항PD-1 항체 단독 투여군은, 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 아이소타입 컨트롤 항체 15 ㎍ (100 ㎕) 을, 종양 이식 8 일째 및 13 일째에 항마우스 PD-1 항체 (RMP1-14, Bioxcell 사) 200 ㎍ (100 ㎕) 을 정맥내에 투여하였다 (N = 10). 항PD-1 항체 및 항마우스 CCR8 항체 병용 투여군은, 종양 이식 3 일째 및 10 일째에 래트 항마우스 CCR8 항체 15 ㎍ (100 ㎕) 을 정맥내에 투여하고, 종양 이식 8 일째 및 13 일째에 항PD-1 항체 200 ㎍ (100 ㎕) 을 정맥내에 투여하였다 (N = 10). 컨트롤군은 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 아이소타입 컨트롤 항체 15 ㎍ (100 ㎕) 을 정맥내에 투여하고, 종양 이식 8 일째 및 13 일째에 PBS 100 ㎕ 를 정맥내에 투여하였다 (N = 10). 종양 이식 3 일 후 (항체 투여 후 1 일) 부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 35).
평균 종양 체적에 대한 단독 투여군끼리의 비교에서는, 항PD-1 항체 투여군과 비교하여 10, 14, 17, 20, 23 및 27 일째에 있어서, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서 평균 종양 체적이 유의하게 작았다 (Dunnett 법에 의한 유의 수준：P ＜ 0.05). 또, 각 단독 투여군과 비교하여 병용군에서 종양이 작았다.
또, 이식 후 17 일 및 27 일째에 있어서의 종양의 완전 관해율에 대해서도 비교하였다. 이식 17 일째에 컨트롤군 및 항PD-1 항체 투여군에서는 10 마리 중 0 마리, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 10 마리 중 1 마리가 종양의 완전 관해를 나타냈지만, 항PD-1 항체와 항마우스 CCR8 항체 병용군에서는 10 마리 중 6 마리가 완전 관해하였다. 이식 27 일째에는, 컨트롤군 및 항PD-1 항체 투여군에서는 각각 10 마리 중 2 마리와 3 마리, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 10 마리 중 7 마리가 종양의 완전 관해를 나타냈지만, 항PD-1 항체와 항마우스 CCR8 항체의 병용군에서는 10 마리 중 9 마리가 완전 관해하였다.
또한, 50 ㎣ 이하로까지 종양이 퇴축한 개체의 비율을 산출하였다 (도 36). 항PD-1 항체와 항마우스 CCR8 항체의 병용군에서는 이식 17 일째에 모든 개체에서 종양이 50 ㎣ 이하로 퇴축하고 (100 ％), 그 후 27 일째까지 50 ㎣ 이하였지만, 항PD-1 항체 투여군에서는 17 일째에 10 ％, 27 일째에 30 ％, 또 항마우스 CCR8 항체 투여군에서는 이식 후 17 일째에 70 ％, 27 일째에서도 동일한 70 ％ 였다.
이상의 결과로부터, 다른 단독 투여군과 비교하여 병용군에서는 종양 퇴축까지의 시간이 빠르고, 또 퇴축 효과가 강한 것을 알 수 있었다.
실시예 27
마우스 신암 유래 세포주 RAG 를 사용한 항마우스 CCR8 항체와 항PD-1 항체 투여의 병용에 의한 항종양 효과의 평가
마우스 Balb/c 마우스 (6 주령, 암컷) 의 등부 피내에 4.5 x 105 개의 신암 유래 RAG 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 또한, RAG 세포는 미리 Balb/c 마우스에 피하 이식하여 생착한 종양을 재차 마우스에 이식하고, 이 조작을 2 회 반복하고, 마우스 피하에 대한 생착 효율을 상승시킨 RAG 세포 (세포 순화주) 를 사용하였다.
항PD-1 항체 단독 투여군은 종양 이식 8 일 후 및 15 일 후에 항PD-1 항체 (RMP1-14, Bioxcell 사) 를 정맥내에 50 ㎍ (100 ㎕) 투여하였다 (N = 10). 항마우스 CCR8 항체 단독 투여군은 종양 이식 8 일 후 및 15 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 를 정맥내에 25 ㎍ (100 ㎕) 투여하였다 (N = 10). 항PD-1 항체 및 항마우스 CCR8 항체 병용 투여군은, 종양 이식 8 일 후 및 15 일 후에 항PD-1 항체 (RMP1-14, Bioxcell 사) 50 ㎍ 과 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 25 ㎍ 을 혼합하고 (100 ㎕), 정맥내에 투여하였다 (N = 10). 컨트롤군은 종양 이식 8 일 후 및 15 일 후에 생리 식염수를 정맥내에 100 ㎕ 투여하였다 (N = 10).
종양 이식 8 일 후부터 3 ∼ 4 일마다 종양 체적을 측정하였다. 종양 체적 (㎣) 은 장경 (㎜) x 단경 (㎜) x 단경 (㎜)/2 로 계량하였다 (도 37).
그 결과 항PD-1 항체와 항마우스 CCR8 항체의 병용군이, 항PD-1 항체 혹은 항마우스 CCR8 항체의 단독 투여군과 비교하여, 종양이 작아지는 것을 알 수 있었다.
실시예 28
CCR8 유전자 호모 결손 마우스를 사용한 항마우스 CCR8 항체의 특이성의 해석
Balb/c 계통의 야생형 마우스 (N = 10) 및 CCR8 유전자 호모 결손 마우스 (N = 5) 의 등부 피내에 3 x 105 개의 대장암 유래 Colon26 세포 (50 uL) 를 이식하였다. 야생형 마우스에는 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 또는 아이소타입 컨트롤 항체 (LTF-2, Bioxcell 사) 를 정맥내에 100 ㎍ (100 ㎕) 투여하였다 (N = 5). CCR8 유전자 호모 결손 마우스에 대해서도 종양 이식 3 일 후 및 10 일 후에 래트 항마우스 CCR8 항체 (클론 SA214G2, BioLegend 사) 또는 아이소타입 컨트롤 항체 (LTF-2, Bioxcell 사) 를 정맥내에 100 ㎍ (100 ㎕) 투여하였다 (N = 5). 투여 후 7 일째부터 종양의 크기를 측정하였다.
그 결과, 야생형 마우스에서는, 아이소타입 컨트롤 항체 투여와 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여에 의해, 전체 예에서 유의한 종양의 퇴축과, 최종적인 종양의 완전 퇴축이 확인되었다. 한편, CCR8 유전자 호모 결손 마우스에서는 아이소타입 항체와 비교하여, 항마우스 CCR8 항체 투여군에서 종양의 체적에 변화는 확인되지 않고, 또 종양 퇴축도 확인되지 않았다 (도 38).
CCR8 유전자 호모 결손 마우스에 있어서 항마우스 CCR8 항체의 항종양 효과가 완전히 소실된 것으로부터, 사용하고 있는 항마우스 CCR8 항체 (SA214G2) 는 CCR8 을 통해서 항종양 효과를 발휘하고 있는 것이 증명되었다.
산업상 이용가능성
본 발명의 CCR8 에 대한 항체는, 종양 내 침윤 Treg 세포 등을 감소시킴으로써, 면역을 부활시키는 작용을 갖고 있고, 암 치료를 위한 의약으로서 유용하다.

Claims (9)

  1. CCR8 에 대한 항체를 함유하는 암 치료용 의약 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    CCR8 에 대한 항체가 ADCC 활성을 갖는 항체인, 의약 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CCR8 에 대한 항체가, CCR8 의 중화 항체인, 의약 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 Treg 세포 제거 작용을 갖는, 의약 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    CCR8 에 대한 항체가, 종양 내 침윤 매크로파지 세포 제거 작용을 갖는, 의약 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 유방암, 대장암, 신암 또는 육종인, 의약 조성물.
  7. CCR8 에 대한 항체, 및 항PD-1 항체 또는 항PD-L1 항체를 조합하여 이루어지는 암 치료용의 의약.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 CCR8 에 대한 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 방법.
  9. 암을 치료하기 위한, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 CCR8 에 대한 항체.
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