ES2863412T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer - Google Patents

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Takayuki Kanazawa
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Kanji Hojo
Naganari Ohkura
Shimon Sakaguchi
Atsushi Tanaka
Hisashi Wada
Atsunari KAWASHIMA
Norio Nonomura
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Abstract

Un anticuerpo contra CCR8 que tiene actividad ADCC, para usar en un método de tratamiento de un cáncer, en donde el anticuerpo contra CCR8 es opcionalmente un anticuerpo neutralizante de CCR8.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer que comprende un anticuerpo contra CCR8.
[Técnica anterior]
Los potentes mecanismos de regulación negativa, incluyendo la inmunosupresión, mediados por células T reguladoras (células Treg) en el microambiente tumoral son obstáculos importantes para el tratamiento de tumores (bibliografía no de patente 1).
Por ejemplo, las células Treg positivas para CD4 que infiltran tumores pueden ser capaces de inhibir fuertemente la respuesta inmunitaria antitumoral y pueden convertirse en un obstáculo importante para el tratamiento eficaz del cáncer.
La inmunosupresión tumoral mediada por células Treg FoxP3 positivas CD4 positivas se ha demostrado suficientemente en modelos de tumores animales.Se ha descrito de que el agotamiento de células Treg sistémico (incluyendointratumoral) produce un efecto antitumoral, en donde el agotamiento de aproximadamente 50% de las células Treginfiltrantes de tumores no es eficaz (bibliografía no de patente 2).
Se ha descrito que la mayor relación de células Treg CD25 positivas CD4 positivas (población celular que incluye células Treg) a la población total de células T CD4 positivas en seres humanos se detecta de manera intratumoral en pacientes con diversos cánceres que incluyentumores de pulmón, mama y ovario, y la relación de abundancia se correlaciona negativamente con las probabilidades de supervivencia de los pacientes (bibliografía no patente 3 a 8). Se ha confirmado que el agotamiento de células Treg CD4 positivas CD25 positivas de tumores usando un anticuerpo anti-CD25 produce un efecto antitumoral.Sin embargo, este agotamiento no es específico para las células Treg porque CD25 se expresa en la superficie celular de las células Treg CD25 positivas CD4 positivas, así como de las células T efectoras recién activadas.Además, la administración de un anticuerpo anti-CD25 a ratones produce un efecto antitumoral limitado.Se ha demostrado en varios modelos tumorales que solo la administración de anticuerpos antes de la inoculación del tumor presenta un efecto terapéutico, mientras que la administración del anticuerpo después del injerto del tumor en ratones rara vez produce un efecto terapéutico. El efecto antitumoral se atenuaba en el caso de iniciar la administración de un anticuerpo anti-CD25 el día 1 posterior al trasplante, y raramente se observaba en el caso de iniciar la administración de un anticuerpo anti-CD25 el día 2 posterior al trasplante o más tarde. (Bibliografía no de patente 9).
Hasta ahora se han llevado a cabo ensayos de eficacia farmacológica administrando anticuerpos a ratones con el fin de agotar las células Treg.No obstante, hay pocos informes que muestren un efecto antitumoral. Por tanto, es muy difícil confirmar un efecto terapéutico antitumoral producido por el agotamiento de las células Tregpor la administración de anticuerpos antes de la inoculación (bibliografía no de patente 10).
CCR8, también llamado previamente CY6, CKR-L1 o TER1, es una proteína receptora de quimioquinas CC de 7-dominios transmembranales acoplada a proteína G expresada en el timo, bazo, etc. Un gen que codifica esta proteína reside en el cromosoma 3p21 humano. El CCR8 humano consta de 355 aminoácidos (bibliografía no de patente 11). CCL1 se conoce como un ligando endógeno para CCR8 (bibliografía no de patente 12). El ADNc de CCR8 humano está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por el n° ACC de GenBank M_005201.3, y el ADNc de CCR8 de ratón está constituido por la secuencia de nucleótidos representada por el n° ACC de GenBankNM_007720.2.
La bibliografía no de patente 13 describe que una serie de genes de receptores de citoquinas y quimiocinas, más en particular CCR8, estaban regulados por aumento en células Treg residentes en tumores en comparación con las que residen en tejidos normales.
La bibliografía de patentes 1 describe métodos y composiciones relacionados con el diagnóstico, tratamiento o prevención del cáncer usando un agente que interacciona con células reguladoras T que se infiltran en tumores (TITR).Se proporcionan ejemplos con anticuerpos anti-CD30 y anticuerpos anti-CCR8.
[Lista de citas]
[Bibliografía no de patente]
[Bibliografía no de patente 1] Nat. Rev. Immunol., 2006, Vol. 6, No. 4, pág. 295-307
[Bibliografía no de patente 2] Eur. J. Immunol., 2010, Vol. 40, pág. 3325-3335
[Bibliografía no de patente 3] J. Clin. Oncol., 2006, Vol. 24, pág. 5373-5380
[Bibliografía no de patente 4] Nat. Med., 2004, Vol. 10, pág. 942-949
[Bibliografía no de patente 5] J. Clin. Oncol., 2007, Vol. 25, pág. 2586-2593
[Bibliografía no de patente 6] Cáncer, 2006, Vol. 107, pág. 2866-2872
[Bibliografía no de patente 7] Eur. J. Cáncer, 2008, Vol. 44, pág. 1875-1882
[Bibliografía no de patente 8] Cell. Mol. Immunol. 2011, Vol. 8, pág. 59-66
[Bibliografía no de patente 9] Cáncer Res., 1 de Jul de 1999; Vol. 59, No. 13, pág. 3128-33
[Bibliografía no de patente 10] Cancer Res., 2010, Vol. 70, No. 7, pág. 2665-74
[Bibliografía no de patente 11] J. Immunol., 1996, Vol. 157, No. 7, pág. 2759-63
[Bibliografía no de patente 12] J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, No. 28, pág. 17251-4
[Bibliografía no de patente 13] Immunity, 2016, 45(5), pág. 1122-1134
[Bibliografía de patente 1] WO 2018/112032
[Resumen de la invención]
[Problema técnico]
Un objeto de la presente invención es activar la inmunidad inhibiendo la inmunosupresión mediada por células Treg o similares y proporcionar una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer a través de este mecanismo.
[Solución al problema]
Los autores de la presente invención han llevado a cabo estudios diligentes y, en consecuencia, han completado la presente invención al encontrar que las células Treg infiltrantes de tumores y las células macrófagos infiltrantes de tumores expresan específicamente CCR8, y la administración de un anticuerpo contra CCR8 disminuye los recuentos de células Treg infiltrantes de tumores y las células macrófagos infiltrantes de tumores e inhibe el crecimiento del tumor.
Específicamente, la presente invención proporciona anticuerpos contra CCR8 que tienen actividad ADCC, para usar en un método de tratamiento de un cáncer, como se define en las reivindicaciones. La invención también proporciona: anticuerpos anti-PD-1 o anticuerpos anti-PD-L1 para usar en un método de tratamiento de un cáncer en combinación con anticuerpos anti-CCR8 de la invención; combinaciones de un anticuerpo anti-CCR8 de la invención y un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1 para usar en métodos de tratamiento del cáncer; todo como se define en las reivindicaciones.
[Efectos ventajosos de la invención]
Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención es farmacéuticamente muy útil para el tratamiento de cánceres.
[Breve descripción de los dibujos]
[Figura 1] La Figura 1 muestra los resultados del análisis de FACS de células T CD3+ CD4+ infiltrantes de tumores de cáncer de riñón. Una molécula CD25 y una molécula FoxP3 se tiñeron cada una con un anticuerpo y se evaluaron sus tasas de expresión. Se encontró que las células que expresaban CD25 también expresaban FoxP3.
[Figura 2] La Figura 2 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo en la intensidad de expresión de CD45RA y CD25 en células mononucleares de sangre periférica (en lo sucesivo, denominadas PBMC) del mismo paciente. Las células T CD3+ CD4+ se fraccionaron en 6 fracciones (Fr1 a Fr6) como se muestra en el dibujo de acuerdo con los niveles de expresión de CD45RA y CD25, y las células de cada fracción se recuperaron usando un separador. Los valores numéricos indican la relación de abundancia celular (%) de cada fracción. En este caso, las fracciones de Treg son Fr1 y Fr2.
[Figura 3] La Figura 3 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de la intensidad de expresión de CD45RA y CD25 en células infiltrantes de tumores de cáncer de riñón. Las células T CD3+CD4+infiltrantes de tumores se fraccionaron en 4 fracciones (Fr2 a Fr5) como se muestra en el dibujo según los niveles de expresión de CD45RA y CD25, y las células de cada fracción se recuperaron usando un separador.Los valores numéricos indican la relación de abundancia celular (%) de cada fracción.
[Figura 4] La Figura 4 muestra los resultados de llevar a cabo el análisis de ARN-Seq de células en cada una de las fracciones de las Figuras 2 y 3 y estudiar si alguna de estas fracciones contendría células Tregbasándose en los niveles de expresión de ARNm de genes de FoxP3 e IKZF2 expresados específicos de Treg.La ordenada representa un nivel de expresión de ARNm relativo después de la normalización.La fuerte expresión intratumoral de ambos genes se observó en Fr2 y Fr3.La fuerte expresión de IL-2 o IFNy, que se expresa en células efectoras, se [observó en Fr4 y Fr5.
[Figura 5] La Figura 5 muestra los resultados del análisis en una región de desmetilación específica de Treg (chrX, 49118000-49118500, hg19) en un locus del gen FoxP3 en cada fracción.Se encontró que la mayoría de las células T CD3+CD4+infiltrantes de tumores en las fracciones Fr2 y Fr3 eran células Treg.
[Figura 6] La Figura 6 muestra resultados que analizan el nivel de expresión de ARNm de CCR8 en cada fracción de la misma manera que en la Figura 4.Las fracciones de células Treg infiltrantes de tumores Fr2 y Fr3 presentaban expresión fuerte de CCR8, en donde la expresión se observó raramente en células Treg en células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
[Figura 7] La Figura 7 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de células HEK293 que expresan CCR8 de ratón.Se transfectaron células HEK293 con un vector de expresión pcDNA3.4 que tenía un inserto del gen de CCR8 de ratón y se seleccionaron con fármaco usando G418.En cuanto al grado de expresión de CCR8 de ratón, la expresión se confirmó con un anticuerpo anti-CCR8 de ratón marcado con PE.Se usaron como control negativo células HEK293 transfectadas con un vector pcDNA3.4 y seleccionadas con fármaco de la misma forma que antes. Se encontró que casi todas las células expresaban CCR8 de ratón.
[Figura 8] La Figura 8 muestra que un anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) tiene la capacidad de activar una ruta de señalización necesaria para la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).
[Figura 9] La Figura 9 muestra que el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) tiene actividad ADCC.
[Figura 10] La Figura 10 muestra que el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) tiene actividad de inhibicióndela entrada de flujo de calcio intracelular mediado por CCR8.Se usó un anticuerpo de control de isotipo como un control negativo.
[Figura 11] La Figura 11 muestra que el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) no reconoce las células CT26.Se usó un anticuerpo de control de isotipo como un control negativo.
[Figura 12] La Figura 12 muestra los resultados de administrar un anticuerpo de control el día 3 posterior al trasplante a tres ratones BALB/c en los que se trasplantaron células CT26 de línea celular de cáncer colorrectal de ratón, extirpando los tumores el día 4 o 7 posterior a la administración, y analizando la proporción de células Treg presentes en el mismo usando un citómetro de flujo.
[Figura 13] La Figura 13 muestra los resultados del análisis de la proporción de células Treg CCR8+ usando un citómetro de flujo en el mismo experimento que en la Figura 12.
[Figura 14] La Figura 14 muestra los resultados del análisis de la proporción de células CCR8 positivas en células macrófagosM2 CD11b+ Gr1+ CD206+ intratumoralesusando un citómetro de flujo.En ambos casos, se encontró que de 40 a 50% de las células eran células macrófagos M2 CCR8 positivas.
[Figura 15] La Figura 15 muestra el flujo de un experimento de administración del anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo el día 3 posterior al trasplante a ratones BALB/c en los que se trasplantaron células CT26 de la línea celular de cáncer colorrectal, extirpando los tumores el día 7 o 10 posterior al trasplante, y examinando las relaciones de abundancia de linfocitos T y células macrófagos presentes en ellos. [Figura 16] La Figura 16 muestra la relación de células CD25+ FoxP3+ a células CD45+ CD4+el día 7 (d7) o 10 (d10) posterior al trasplante.
[Figura 17] La Figura 17 muestra la proporción de células macrófagos CD11b+ F4/80+ el día 7 posterior al trasplante (d7).
[Figura 18] La Figura 18 muestra la relación de abundancia de células IA/IE positivas (IA/IE+) o IA/IE negativas (IA/IE-) el día 7 posterior al trasplante (d7).
[Figura 19] La Figura 19 muestra el flujo de un experimento de administración del anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo (anti-KLH de rata) en una dosis única de 400 pg/ratón el día 3 posterior al trasplante (d3) a ratones BALB/c en los que se trasplantaron células CT26de línea celular de cáncer colorrectal, y medicióndel tamaño del tumor cada 3 a 4 días desde el día 7 (d7) posterior al trasplante hasta el día 21 (d21 ).
[Figura 20] La Figura 20 muestra los resultados de medir el tamaño del tumor sólido de cada individuo después de la inoculación y calcular el volumen tumoral.
[Figura 21] La Figura 21 muestra el volumen tumoral medio de cada grupo de ratones en cada tiempo de medición después de la inoculación.También se muestra una desviación estándar.El nivel de significación *** indica p <0,001, y el nivel de significación ** indica p <0,01 (prueba t).
[Figura 22] Se trasplantaron por vía intracutánea 2 x 105 células Colon26 de la línea celular de cáncer colorrectal al lomo de cada ratón BALB/c. El día 3 posterior al trasplante (d3), se administró el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo en una dosis única de 400 pg/ratón.Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días desde el día 3 (d3) posterior al trasplante hasta el día 18 (d18).Se muestra el volumen tumoral medio de cada grupo en cada tiempo de medición después de inoculación.
[Figura 23] El gráfico muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada individuo en el análisis de FACS.Las líneas horizontales centrales representan la MFI media de 14 casos, y las líneas verticales representan las desviaciones estándar.El nivel de significación *** indica P <0,001.
[Figura 24] La Figura 24 muestra un gráfico individual de la relación de células que presentaban señales de CCR8 positivo (porcentaje de positividad) igual o mayor que un nivel de fondo obtenido en un anticuerpo de control de isotipo, para células T CD3+CD4+ FoxP3+ o células T CD3+CD4+ FoxP3- en los tumores de cáncer de riñón humano de 14 casos. Las líneas horizontales centrales representan el porcentaje medio de positividad de los 14 casos, y las líneas verticales representan las desviaciones estándar.
[Figura 25] La Figura 25 muestra una curva de Kaplan-Meier como la probabilidad de supervivencia de cada grupo obtenida dividiendo por igual pacientes con carcinoma de células renales de células claras en 2 grupos con expresión alta (alta) y con expresión baja (baja) basado en los niveles de expresión de ARNm de CCR8 de células intratumorales mediante el uso de la base de datos TheCancerGenome Atlas (TCGA).La ordenada representa la probabilidad de supervivencia y la abscisa representa el número de meses.Los valores numéricos indican el número de individuos en cada grupo.El valor P indica un valor de prueba de rango logarítmico.
[Figura 26] La Figura 26 muestra los resultados del análisis de pacientes con cáncer de próstata de la misma forma que en la Figura 25.
[Figura 27] La Figura 27 muestra los resultados del análisis de pacientes con cáncer de vejiga de la misma forma que en la Figura 25.
[Figura 28] La Figura 28 muestra que el anticuerpo anti-CCR8 de ratón no reconoce ni células MethA ni células LM8, como en la Figura 11.Se usó un anticuerpo de control de isotipo (Isotipo) como un control negativo.
[Figura 29] Se trasplantaron por víaintracutánea 3 x 105 células LM8 de la línea celular de osteosarcoma al lomo de cada ratón C3H/He.El día 3 posterior al trasplante (d3), se administró el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo (anticuerpo de control) en una dosis única de 400 pg/ratón.Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días desde 7 días hasta 35 días después de la inoculación del tumor.Se muestra el volumen tumoral medio de cada grupo en cada tiempo de medición después de inoculación.También se muestra una desviación estándar.El nivel de significación *** indica p <0,001, el nivel de significación ** indica p <0,01 y el nivel de significación * indica p <0,05 (prueba t).
[Figura 30] Se trasplantaron por vía intracutánea 1 x 105 células MethA al lomo de cada ratón Balb/c.El día 3 posterior al trasplante, se administró el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo (anticuerpo de control) en una dosis única de 400 pg/ratón.Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días desde 11 días hasta 21 días después de la inoculación del tumor.Se muestra el volumen tumoral medio de cada grupo en cada tiempo de medición después de inoculación.El nivel de significación * indica p <0,05 (prueba t).
[Figura 31] Se trasplantaron por vía intracutánea 1 x 105 células EMT6 de la línea celular de cáncer de mama al lomo de cada ratón Balb/c.A los 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, se administró el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo en 100 pg/ratón.Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días desde 4 días hasta 22 días después de la inoculación del tumor.Se muestra el volumen tumoral medio de cada grupo en cada tiempo de medición después de inoculación.El nivel de significancia *** indica p <0,001, y el nivel de significancia ** indica p <0,01 (prueba t).
[Figura 32] Se trasplantaron por vía intracutánea 2 x 105células Colon26 de la línea celular de cáncer colorrectal al lomo de cada ratón BALB/c.A los 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, se administró un anticuerpo de control anti-isotipo (anticuerpo de isotipo), el anticuerpo CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo anti-PD-1 (RMP1-14) en 400 pg/ratón.Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días desde 3 días hasta 24 días después de la inoculación del tumor.Se muestra el volumen tumoral medio de cada grupo en cada tiempo de medición después de inoculación.
[Figura 33] Se trasplantaron por vía intracutánea4 x 105 células RAG de la línea celular derivadas de cáncer de riñón de ratón al lomo de cada ratón BALB/c. 6 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intraperitoneal 100 pg (100 pl) de un anticuerpo de control de isotipo, el anticuerpo anti-CCR8 de ratón o un anticuerpo anti-PD-1 de ratón (anticuerpo anti-PD-1).Se midió el volumen del tumor cada 3 a 4 días desde 6 días hasta 21 días después de la inoculación del tumor.Se muestra el volumen tumoral medio de cada grupo en cada tiempo de medición después de inoculación.
[Figura 34] Se trasplantaron por vía intracutánea2 x 105 células Colon26 de la línea celular de cáncer colorrectal al lomo de cada ratón BALB/c.A los 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, se administró el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo (anticuerpo de control) en 400 pg/ratón. 24 días después de la inoculación del tumor, se recuperó cada órgano de los ratones y se midió su peso.Se muestra la media de 10 casos en cada grupo.
[Figura 35] Se trasplantaron por vía intracutánea1 x 105 células EMT6 de la línea celular de cáncer de mama de ratón al lomo de cada ratón BALB/c. Se les administró el anticuerpo anti-CCR8 de ratón por vía intravenosa a los 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, y se le administró por vía intravenosa un anticuerpo anti-PD-1 de ratón a los 8 y 13 días después de la inoculación del tumor.Se administró por vía intravenosa un anticuerpo de control de isotipo a un grupo de control a los 3 y 10 días después de la inoculación del tumor.Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días desde 6 días hasta 27 días después de la inoculación.Se muestra el volumen tumoral medio de cada grupo en cada tiempo de medición después de la inoculación.
[Figura 36] La Figura 36 muestra la proporción individuos que portan un tumor mayor de 50 mm3 o menor en cada tiempo de medición después de la inoculación en cada grupo en el mismo experimento que en la Figura 35.
[Figura 37] Se trasplantaron por vía intracutánea4,5 x 105 células RAG de la línea celular derivadas del cáncer de riñón de ratón al lomo de cada ratón BALB/c. 8 y 15 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intravenosa 100 pl de solución salina fisiológica, el anticuerpo anti-CCR8 de ratón o un anticuerpo anti-PD-1 de ratón, o el anticuerpo anti-CCR8 de ratón y el anticuerpo anti-PD-1 de ratón. Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días desde 8 días hasta 33 días después de la inoculación del tumor.Se muestra la mediana del volumen tumoral de cada grupo en cada tiempo de medición después de la inoculación.
[Figura 38] Se trasplantaron por vía intracutánea2 x 105 células CT26 al lomo de cada ratón no manipulado genéticamente o ratón homocigoto para deficiencia en el gen de CCR8 de linaje Balb/c (N = 5).Después de inoculación, se les administró por vía intravenosa un anticuerpo de control de isotipo o el anticuerpo anti-CCR8 de ratón.Se midió un volumen tumoral cada 3 a 4 días después de la inoculación del tumor.El diagrama de la izquierda muestra el volumen tumoral medio de los ratones no manipulados genéticamente en cada grupo en cada tiempo de medición después de la inoculación, y el diagrama de la derecha muestra el volumen tumoral medio de los ratones homocigotos para deficiencia en el gen de CCR8 en cada grupo en cada tiempo de medición después de inoculación.
[Descripción de realizaciones]
La presente invención se refiere a un anticuerpo contra CCR8 que tiene actividad ADCC para usar en un método de tratamiento de un cáncer, como se define en las reivindicaciones.
El CCR8 de la presente invención incluye aquellos derivados de mamíferos ratones, ratas, hámsteres, cobayas, perros, cerdos y primates, incluyendo monos y seres humanos.Se prefiere el CCR8 humano.
El anticuerpo contra CCR8 puede ser cualquiera de un anticuerpo derivado de ser humano, un anticuerpo derivado de ratón, un anticuerpo derivado de rata, un anticuerpo derivado de conejo y un anticuerpo derivado de cabra siempre que el anticuerpo se una a CCR8.El anticuerpo contra CCR8 puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal del mismo y puede ser cualquiera de un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo (p. ej., un fragmento F(ab')2, Fab', Fab o Fv), un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano completo.Se prefiere un anticuerpo derivado de ser humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano completo.
El anticuerpo de la presente invención se puede producir de acuerdo con un método de producción de anticuerpo o antisuero conocido en la técnica usando una proteína de longitud completa o una proteína parcial de CCR8 como antígeno.De forma conveniente, el anticuerpo de la presente invención se une a CCR8 expresado en la superficie celular.Por lo tanto, la proteína parcial es convenientemente una región extracelular de CCR8.Estos antígenos se pueden preparar por métodos de expresión y purificación de proteínas conocidos en la técnica.
Los ejemplos del antígeno, distintos de los descritos antes, adecuados para la preparación del anticuerpo contra CCR8 incluyen células obligadas a expresar CCR8 por un vector de expresión o similar, vectores plasmídicos de expresión de CCR8 y vectores víricos de expresión de CCR8 (vectores de adenovirus, etc.).
El anticuerpo policlonal se puede producir por un método conocido en la técnica.El anticuerpo policlonal se puede producir, por ejemplo, inmunizando un animal adecuado con una proteína antigénica o una mezcla de la misma con una proteína transportadora, y recogiendo un producto que contiene un anticuerpo contra la proteína antigénica del animal inmunizado, seguido de la separación y purificación del anticuerpo.Los ejemplos del animal usado generalmente incluyen ratones, ratas, ovejas, cabras, conejos y cobayas. Con el fin de mejorar la capacidad de producir anticuerpos, se puede administrar un adyuvante completo de Freund o un adyuvante incompleto de Freund junto con la proteína antigénica.En general, la administración se realiza un total de aproximadamente 3 a 10 veces, normalmente una vez cada aproximadamente 2 semanas. El anticuerpo policlonal se puede recoger de la sangre, líquido ascítico o similar del animal inmunizado por el método descrito anteriormente. Se puede medir el título de anticuerpos policlonales en el antisuero por ELISA. La separación y purificación del anticuerpo policlonal se puede llevar a cabo de acuerdo con un método de separación y purificación de inmunoglobulinas, por ejemplo, un método de purificación que usa una fase sólida de unión al antígeno o un adsorbente activo tal como la proteína A o proteína G, un método de precipitación salina, un método de precipitación con alcohol, un método de precipitación isoeléctrica, electroforesis, un método de adsorción y desorción que usa un intercambiador de iones, un método de ultracentrifugación o un método de filtración en gel.
El anticuerpo monoclonal se puede preparar por un método de producción general conocido. Específicamente, un mamífero, preferiblemente un ratón, una rata, un hámster, una cobaya o un conejo, seinmunosensibiliza con el antígeno de la presente invención, si es necesario, junto con un adyuvante de Freund, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intra-plantar o inyección intraperitoneal, de una a varias veces. Normalmente, la inmunización se llevó a cabo de una a cuatro veces cada aproximadamente 1 a 21 días desde la inmunización inicial, y las células productoras de anticuerpos se pueden obtener del mamífero inmunosensibilizado aproximadamente de 1 a 10 días después de la inmunización final.El número de inmunizaciones y el intervalo de tiempo se pueden cambiar de forma adecuada según las propiedades, etc. del inmunógeno usado.
Los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal se pueden preparar de acuerdo con el método de Kohler y Milstein (Nature, 1975, vol. 256, pág. 495-497) y un método equivalente al mismo.Específicamente, los hibridomas se pueden preparar por fusión celular de células productoras de anticuerpos contenidas en el bazo, el ganglio linfático, la médula ósea o las amígdalas, etc., preferiblemente el bazo, obtenidas de un mamífero inmunosensibilizado como se ha mencionado antes, preferiblemente con células de mieloma derivadas de ratón, rata, cobaya, hámster, conejo o mamífero (p. ej., ser humano), más preferiblemente derivadas de ratón, rata o ser humano, que carecen de la capacidad de producir anticuerpos autólogos.
En general, se puede usar una línea celular establecida obtenida de ratones, por ejemplo, P3-U1, NS-1, SP-2, 653, X63 o AP-1, como células de mieloma para usar en la fusión celular.
Se criba un clon de hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal, cultivando los hibridomas, por ejemplo, en una placa de microtitulación, midiendo la reactividad de un líquido sobrenadante del cultivo en un pocillo donde se observa crecimiento, con el antígeno de la presente invención usado en la inmunosensibilización del ratón mencionada antes por un método de medición tal como RIA, ELISA o FACS, y seleccionando un clon que produce el anticuerpo monoclonal que presenta unión específica al antígeno o hapteno.Normalmente, se usa además un método que implica inmovilizar el antígeno en una fase sólida y detectar un anticuerpo en un líquido sobrenadante de cultivo que se une al mismo usando un anticuerpo secundario marcado con un material radiactivo, un material fluorescente, una enzima o similar.En el caso de usar células que expresan antígenos, el líquido sobrenadante del cultivo de hibridoma se añade a las células, y después se puede hacer reaccionar en este un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, seguido de la medición de la intensidad de fluorescencia de las células usando un aparato de detección fluorescente tal como un citómetro de flujo para detectar un anticuerpo monoclonal capaz de unirse al antígeno de la presente invención en las membranas de las células.
El anticuerpo monoclonal se puede producir a partir del hibridoma seleccionado cultivando el hibridoma in vitro o cultivando el hibridoma en el líquido ascítico o similar de un ratón, una rata, una cobaya, un hámster o un conejo, etc., preferiblemente un ratón o una rata, más preferiblemente un ratón, y aislando el anticuerpo monoclonal del líquido sobrenadante del cultivo obtenido o del líquido ascítico del mamífero. Para el cultivo in vitro, el hibridoma se cultiva, se mantiene y se conserva de acuerdo con diversas condiciones, tal como las características del tipo de célula a cultivar, el propósito del ensayo e investigación y un método de cultivo, y se puede cultivar usando un medio nutritivo conocido como se usa para producir anticuerpos monoclonales en un líquido sobrenadante de cultivo, o cada medio nutritivo inducido y preparado a partir de un medio basal conocido.
Los ejemplos del medio basal incluyen medios con bajo contenido de calcio tales como el medio F12 de Ham, medio MCDB153 medio y medio MEM con bajo contenido de calcio y medios con alto contenido de calcio tales como el medio MCDB104, medio MEM, medio D-MEM, medio RPMI1640, medio ASF104 y medio RD. El medio basal puede contener, por ejemplo, suero, hormona, citoquina y/o diversas sustancias inorgánicas u orgánicas, según un propósito.
El anticuerpo monoclonal se puede aislar y purificar, por ejemplo, sometiendo el líquido sobrenadante del cultivo o el líquido ascítico mencionado antes a sulfato de amonio saturado, cromatografía de intercambio iónico (DEAE o DE52, etc.) o cromatografía en columna de afinidad usando una columna de anti-inmunoglobulina, una columna de proteína A, o similar.
Se puede usar un anticuerpo recombinante obtenido por clonación de un gen de anticuerpo de células productoras de anticuerpos, por ejemplo, hibridomas, integracióndel gen del anticuerpo en un vector adecuado y transfección de un hospedante con este vector, seguido de la producción mediante el uso de una técnica de recombinación de genes, como el anticuerpo de la presente invención (p. ej., Cari et al., Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en 1990).
Específicamente, el ARNm que codifica la región variable (región V) del anticuerpo se aísla de los hibridomas que producen el anticuerpo de interés o los inmunocitos que producen el anticuerpo, por ejemplo, células de linfocitos sensibilizadas inmortalizadas con un oncogén o similar.Para el aislamiento del ARNm, el ARN total se prepara por un método conocido en la técnica, por ejemplo, un método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), y el ARNm se prepara usando el Kit de purificación de ARNm (fabricado por Pharmacia Inc.) o similares.
El ADNc de la región V del anticuerpo se sintetiza a partir del ARNm obtenido usando transcriptasa inversa.La síntesis del ADNc se puede realizar usando el kit de síntesis de la primera cadena deADNccon transcriptasa inversa de AMV o similar. Se puede usar el kit 5'-Ampli FINDER RACE (fabricado por ClontechLaboratories, Inc) y 5'-RACE basado en PCR (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, Vol. 85, pág. 8998, etc.) para la síntesis y amplificación de ADNc.El fragmento de ADN de interés se purifica a partir del producto de PCR obtenido y se liga con el ADN del vector. Se prepara además un vector recombinante a partir del mismo. Se transfectaE. coli o similar con el vector recombinante y se selecciona una colonia para preparar el vector recombinante deseado.La secuencia de nucleótidos del ADN de interés se confirma por un método conocido en la técnica, por ejemplo, un método desoxi.
Siempre que se obtenga con éxito el ADN que codifica la región V del anticuerpo de interés, este ADN se une al ADN que codifica la región constante del anticuerpo deseado (región C) y el resultado se integra en un vector de expresión.Alternativamente, el ADN que codifica la región V del anticuerpo se puede integrar en un vector de expresión que contiene el ADN de la región C del anticuerpo. Con el fin de producir el anticuerpo usado en la presente invención, el gen del anticuerpo se integra en un vector de expresión de manera que el gen del anticuerpo se exprese bajo el control de una región de control de la expresión, por ejemplo, potenciador/promotor.A continuación, las células hospedantes se pueden transformar con este vector de expresión para expresar el anticuerpo.
Para la expresión del gen del anticuerpo, el ADN que codifica la cadena pesada (cadena H) y el ADN que codifica la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo se pueden integrar por separado en vectores de expresión, con los que se cotransforma un hospedante, o el a Dn que codifica la cadena H y el ADN que codifica la cadena L se pueden integrar en un único vector de expresión, con el que se transforma un hospedante (véase el documento WO94/11523).
También se puede usar una técnica denominada de presentación en fagos (NatureBiotechnology 23, 1105 (2005)) como método, distinto de los descritos antes, para preparar el anticuerpo de la presente invención.Específicamente, por ejemplo, una genoteca de anticuerpos preparada por un método conocido en la técnica que usa linfocitos B humanos o animales (p. ej., de conejo, ratón, rata o hámster) como material, o una genoteca de anticuerpos completamente sintetizada por selección y modificación de una secuencia de la línea germinal humana o animal se presenta, por ejemplo, en bacteriófagos, E. coli, levaduras o la superficie de células animales, o liposomas. En relación con esto, los ejemplos de la forma del anticuerpo que se presentará en la superficie celular incluyen moléculas de IgG, moléculas de IgM, fragmentos Fab y fragmentos Fvmonocatenarios (scFv).
El gen del fragmento de anticuerpo así obtenido se puede recombinar con una región correspondiente de un gen de anticuerpo IgG por un método conocido en la técnica para obtener un gen de anticuerpo. Después, el gen así obtenido se puede integrar en un vector apropiado, con el que se transfecta un hospedante, seguido de la producción del anticuerpo mediante el uso de una técnica de recombinación de genes (p. ej., Carl et al., Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en 1990).
El anticuerpo de la presente invención incluye anticuerpos modificados artificialmente con el propósito de, por ejemplo, reducir la xenoantigenicidad contra seres humanos, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos completos.
El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo conjugado en el que el anticuerpo se une con cualquiera de varias moléculas tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radiactivas, toxinas y cadenas de azúcar. Dicho anticuerpo conjugado se puede obtener modificando químicamente el anticuerpo obtenido. El método para modificar el anticuerpo ya se ha establecido en la técnica. El anticuerpo según la presente invención también abarca estos anticuerpos conjugados.
El anticuerpo de la presente invención abarca un anticuerpo que tiene una región Fc unida con cadenas de azúcar unidas por N-glucósido que carecen de una fucosa unida con N-acetilglucosamina en sus extremos reductores. Ejemplos del anticuerpo que tiene una región Fc unida con cadenas de azúcar unidas por N-glucósido que carecen de una fucosa unida con N-acetilglucosamina en sus extremos reductores, incluyen anticuerpos preparados usando células CHO deficientes en el gen de laa1,6 -fucosiltransferasa (Publicaciones Internacionales N° WO 2005/035586 y WO 02/31140). El anticuerpo de la presente invención que tiene una región Fc unida con cadenas de azúcar unidas por N-glucósido que carecen de una fucosa unida con N-acetilglucosamina en sus extremos reductores tiene una alta actividad ADCC.
El anticuerpo de la presente invención se puede fusionar en su extremo N o extremo C con una proteína adicional (ClinicalCancerResearch, 2004, 10, 1274-1281). Los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente la proteína que se va a fusionar.
El fragmento de anticuerpo es una parte del anticuerpo de la presente invención mencionado antes y significa un fragmento que tiene actividad de unión específica de CCR8 como en el anticuerpo. Los ejemplos del fragmento de anticuerpo pueden incluir específicamente Fab, F(ab')2, Fab', anticuerpo monocatenario (scFv), anticuerpo estabilizado con disulfuro (dsFv), fragmento de región V dimerizada (diacuerpo) y péptidos que contienen CDR (ExpertOpiniononTherapeutic Patents, Vol. 6, No. 5, pág. 441-456, 1996).
Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo biespecífico que tiene dos determinantes antigénicos diferentes y se une a diferentes antígenos.
La actividad ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) significa la actividad in vivo de dañar las células tumorales o similares activando las células efectoras por la unión de la región Fc del anticuerpo unido con un antígeno de superficie celular o similar en las células tumorales o similar a un receptor de Fc presente en la superficie de las células efectoras. Los ejemplos de células efectoras incluyen células citolíticas naturales y macrófagos activados.
El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo que tiene actividad ADCC contra células que expresan CCR8 porque este anticuerpo puede agotar las células Treg o las células macrófagos. Si un anticuerpo tiene o no dicha actividad ADCC se puede medir, por ejemplo, por un método descrito en los ejemplos mencionados más adelante.
El anticuerpo contra CCR8 de la presente invención es preferiblemente un anticuerpo neutralizante de CCR8 desde el punto de vista de suprimir la acumulación intratumoral de células Treg o células macrófagos. El anticuerpo neutralizante de CCR8 significa un anticuerpo que tiene actividad neutralizante contra CCR8. Si el anticuerpo de la presente invención tiene o no actividad neutralizante contra CCR8 se puede determinar midiendo la presencia o ausencia de supresión del efecto fisiológico de CCL1 en CCR8. Ejemplos de los mismos incluyen, pero no se limitan a la medición de la unión de CCL1 a CCR8, la migración de células que expresan CCR8 por CCL1, el aumento en el nivel de Ca++ intracelular por CCL1 y la variación en la expresión de un gen sensible a la estimulación de CCL1. Esto también se puede determinar por un método descrito en los ejemplos mencionados más adelante.
El anticuerpo contra CCR8 de la presente invención tiene preferiblemente un efecto de agotamiento de las células Treginfiltrantes de tumores. Si el anticuerpo de la presente invención tiene o no el efecto de agotamiento de células Treginfiltrantes de tumores, se puede determinar, por ejemplo, por un método descrito en los ejemplos mencionados más adelante.
El anticuerpo contra CCR8 de la presente invención tiene preferiblemente un efecto de agotamiento decélulas macrófagosinfiltrantes de tumores.Si el anticuerpo de la presente invención tiene o no el efecto de agotamiento decélulas macrófagosinfiltrantes de tumores se puede determinar, por ejemplo, por un método descrito en los ejemplos mencionados más adelante.
El anticuerpo de la presente invención es útil como una composición farmacéutica. Por lo tanto, la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral y sistémica o local.Por ejemplo, se puede seleccionar la inyección intravenosa tal como infusión, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, administración transnasal o inhalación, como administración parenteral.
El "cáncer" que se va a tratar de acuerdo con la presente invención incluye todo cáncer sólido y cáncer de la sangre.Específicamente, ejemplos de los mismos incluyen cáncer de mama, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de estómago (adenocarcinoma gástrico), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de bazo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, linfoma no Hodgkin, cáncer urotelial, sarcoma, carcinoma de células sanguíneas (leucemia, linfoma, etc.), carcinoma de vías biliares, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de tiroides, cáncer de próstata, carcinoma testicular, carcinoma tímico y hepatocarcinoma.Preferiblemente, sus ejemplos incluyen cáncer de mama, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de riñón y sarcoma, y más preferiblemente, sus ejemplos incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de riñón y sarcoma.
El "cáncer" es preferiblemente un cáncer que expresa un antígeno específico de tumor.
El "cáncer" descrito en la presente memoria descriptiva significa no sólo tumores malignos epiteliales tales como cáncer de ovario y cáncer de estómago, sino también tumores malignos no epiteliales que incluyen cánceres hematopoyéticos tales como leucemia linfocítica crónica y linfoma de Hodgkin.En la presente memoria descriptiva, términos tales como "cáncer", "carcinoma", "tumor" y "neoplasma" se pueden usar de manera intercambiable entre sí sin diferenciarse entre ellos.
El anticuerpo contra CCR8 de la presente invención se puede administrar como un fármaco concomitante en combinación con un fármaco adicional con el fin de
( 1) complementar y/o potenciar el efecto terapéutico de la composición farmacéutica de la presente invención, (2) mejorar la farmacocinética y la absorción de la composición farmacéutica de la presente invención y reducir la dosis de la misma, y/o
(3) reducir la reacción adversa de la composición farmacéutica de la presente invención.
El fármaco concomitante del anticuerpo contra CCR8 de la presente invención y un fármaco adicional se pueden administrar en forma de un fármaco combinado que contiene ambos ingredientes en una preparación o se pueden administrar en forma de preparaciones separadas. Esta administración como preparaciones separadas incluye la administración simultánea y la administración escalonada. Para la administración escalonada, se puede administrar primero el anticuerpo de la presente invención y se puede administrar más tarde el fármaco adicional, o se puede administrar primeroel fármaco adicional y se puede administrar más tarde el compuesto de la presente invención.Sus respectivos métodos de administración pueden ser iguales o diferentes.
Los ejemplos del fármaco adicional que se puede usar en combinación con el anticuerpo contra CCR8 de la presente invención incluyen anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-PD-L1 y anticuerpos anti-CTLA-4.Se prefiere un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1, y se prefiere más un anticuerpo anti-PD-1.
En la presente invención, los ejemplos del anticuerpo anti-PD-1 incluyen nivolumab y pembrolizumab.
En la presente invención, los ejemplos del anticuerpo anti-PD-L1 incluyen atezolizumab, avelumab y durvalumab. En la presente invención, los ejemplos del anticuerpo anti-CTLA-4 incluyen ipilimumab.
Se espera que el paciente que se pretende tratar mediante la presente invención sea un paciente con cáncer o un paciente que se sospecha que tiene cáncer.La dosis eficaz se selecciona del intervalo de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal por dosis.Alternativamente, la dosis se puede seleccionar de 5 a 5000 mg, preferiblemente de 10 a 500 mg, por paciente.Sin embargo, la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención o un fragmento de anticuerpo del mismo no está limitada por estas dosis.Además, el periodo de dosificación se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con la edad y los síntomas del paciente.La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención puede contener además un vehículo o aditivo farmacéuticamente aceptable dependiendo de la vía de administración.Los ejemplos de dicho vehículo y aditivo incluyen agua, disolventes orgánicos farmacéuticamente aceptables, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, caseína, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, albúmina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa y tensioactivos aceptables como aditivos farmacéuticos.El aditivo usado se selecciona de forma adecuada o en combinación entre los descritos antes según una forma de dosificación, aunque el aditivo no se limita a la misma. En lo sucesivo, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos.Sin embargo, la presente invención no está limitada por los ejemplos que se dan a continuación.Los métodos descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición (Cold Spring Harbor Laboratory) se usaron como procedimientos de manipulación genética a menos que se especifique lo contrario.
[Ejemplo 1]
Extracción y análisis de células infiltrantes de tumores de cáncer de riñón y PBMC
El siguiente análisis se llevó a cabo usando una porción de tejidos tumorales primarios extirpados por tratamiento quirúrgico de pacientes con carcinoma de células renales de células claras (ccRCC) (3 casos) que no recibieron tratamiento preoperatorio con un agente antineoplásico, radiación o similar. Después de la medición del peso del tumor, las masas tumorales se cortaron en cuadrados de 2 mm con tijeras y se prepararon homogeneizados de tejido tumoral usando el kit de disociación de tumores humanos (130-095-929, MiltenyiBiotec) y el disociador gentleMACS (TM) (MiltenyiBiotec, 130-093-235) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Los homogeneizados se pasaron a través de un filtro de células de 70 um y se sometieron a tratamiento de hemólisis, seguido de la eliminación de desechos y células muertas en una solución de Percoll al 30% en PBS para obtener células individuales de tejido tumoral.
Se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del mismo paciente de la sangre periférica por el método de centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque PLUS (GE HealthcareJapan Corp.). Después de la medición del recuento de células, las células intratumorales separadas y las PBMC se trataron con Human TruStainFcX(TM) (BioLegend, Inc., 422-301) y el kit de viabilidad fijableZombie NIR(TM) (BioLegend, Inc., 423105) de acuerdo con los protocolos adjuntos y se tiñeron 30 minutos en hielo. Después, las células se lavaron una vez con FCS/HEPES/HBSS al 2% y después se tiñeron con los siguientes anticuerpos marcadores de acuerdo con los protocolos adjuntos a los anticuerpos marcadores.
La superficie celular de las células infiltrantes de tumores se tiñó mediante reacción durante 30 minutos en hielo usando un anticuerpo anti-CD3 (BioLegend, Inc., Clone UCHT1), un anticuerpo anti-CD4 (BioLegend, Inc., Clone OKT4) y un anticuerpo anti-CD25 (BioLegend, Inc., Clon BC96).Las células se lavaron dos veces con FCS/HEPES/HBSS al 2% y después se fijaron y se permeabilizaron las membranas usando el conjunto de tampón de tinción de factor de transcripción/Foxp3 (eBioscience, Inc., 00-5523-00) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit.FoxP3 se tiñó adicionalmente usando un anticuerpo anti-FoxP3 marcado con PE (eBioscience, Inc., Clone PCH010).Las células se lavaron una vez con una solución de lavado unida al kit y después se analizaron por citometría de flujo (BD Biosciences, BD LSRFortessa).Se confirmó que casi todas las células T CD4+ CD25+ dentro de los tumores de ccRCC expresan FoxP3, un marcador de células Treg (Figura 1).
Posteriormente, las células infiltrantes de tumores y las PBMC descritas antes se tiñeron con un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD4, un anticuerpo anti-CD45RA (BD Biosciences, Clone HI100) y un anticuerpo anti-CD25.Las células T CD3+ CD4+ se desarrollaron bidimensionalmente según los niveles de expresión de CD45RA y CD25.Los resultados sobre las PBMC se muestran en la Figura 2, y los resultados sobre las células infiltrantes de tumores se muestran en la Figura 3.Las células infiltrantes de tumores se fraccionaron en 4 fracciones de células fuertemente positivas (Fr2), células débilmente positivas (Fr3) y células negativas (Fr4 y Fr5) como se muestra en la Figura 1C con la intensidad de expresión de CD3+ CD4+ CD45RA- y CD25 como índice usando un separador de células (FACSAria II), y se recuperaron las células contenidas en cada fracción.Las PBMC también se desarrollaron bidimensionalmente, como en las células infiltrantes de tumores, y se fraccionaron en Fr1 a Fr6 como se muestra en la Figura 2 con la intensidad de expresión de CD45RA y CD25 como índice, y se recuperaron las células contenidas en cada fracción.
[Ejemplo 2]
Separación de ARN de células fraccionadas y análisis de secuencia de ADNc
Las células separadas y recuperadas de cada fracción se lisaron en tampón RLT (Qiagen N.V.) y se extrajo el ARN total usando AgencourtRNAClean XP (BeckmanCoulter, Inc.).El ARN recuperado se preparó en ADNc usando el kit de ARN de entrada ultrabaja SMART-Seq v4 para secuenciación (ClontechLaboratories, Inc.), y se preparó una biblioteca usando el kit KAPA HyperPrep para illumina (KapaBiosystems, Inc.).Para la síntesis de ADNc y la preparación de la biblioteca, el control de calidad se realizó constantemente usando el bioanalizadorAgilent 2100 (Agilent Technologies, Inc.) para confirmar que estos procedimientos no presentaban problemas.La biblioteca de ADNc terminada se tituló usando un kit de cuantificación de bibliotecas KAPA deIlluminaPlatforms (KapaBiosystems, Inc.). Después, se llevó a cabo la secuenciación del ADN mediante lecturas de extremos emparejados usando Hiseq 4000 (Illumina, Inc.) para obtener 20.000.000 de lecturas o más de datos de secuencia de 100 pares de bases por muestra (archivo Fastq).
Los datos brutos (archivo Fastq) se analizaron por FastQC, y las secuencias de adaptador y las secuencias repetidas se eliminaron usando CutAdapt. Se emparejaron pares de cada lectura de extremos emparejados usando el programa cmpfastq_pe. Se usó hg38 como una secuencia de referencia en el mapeo del genoma, y las lecturas se mapearon en el genoma en la configuración predeterminada usando el programa TOPHAT2 que tiene Bowtie 2.Las lecturas mapeadas se clasificaronpor secuencia usando el programa SAMtools y se contaron usando el programa HTSEQ.Los datos de recuento se normalizaron usando el programa Deseq 2.Entre las fracciones obtenidas, se confirmó una fracción que contenía células Tregpor el siguiente método.
Se sabe que las células Treg expresan constitutivamente los genes de FoxP3 e Ikzf2 como genes marcadores y que rara vez secretan IFNy o IL2 incluso cuando se activan por estimulación.Se puede confirmar hasta cierto punto si contienen o no células Treg examinando los niveles de expresión de estos genes.Como resultado del examen de los niveles de expresión de estos genes en cada fracción de las células infiltrantes de tumores y las PBMC según los datos de RNA-Seq descritos antes, se encontró que Ikzf2 y FoxP3 se expresaban específicamente en la Fr2 y Fr3 de las células infiltrantes de tumores y la Fr2 de las PBMC y rara vez se expresaban en las otras fracciones (Figura 4).Además, se encontró que el IFNy (IFN-gamma) y la IL2 se expresaban específicamente en la Fr4 y Fr5 de las células infiltrantes de tumores y la Fr4 y Fr5 de las células PBMC y no se expresaban en las otras fracciones (Figura 4).En conclusión, se encontró que las células Treg estaban contenidas en la Fr2 y Fr3 de las células infiltrantes de tumores y la Fr2 de las PBMC y no estaban contenidas en las otras fracciones.
[Ejemplo 3]
Medición de la tasa de desmetilación de la región de FoxP3
La tasa de desmetilación de una región de FoxP3 sirve como índice para determinar con precisión la proporción de células Treg.Por lo tanto, se estudió en las células en la Fr2 a Fr5 de las células infiltrantes de tumores de cáncer de riñón obtenidas como se ha descrito antes, la tasa de desmetilación de la región de FoxP3.Una región desmetilada de una manera específica de células Treg reside (chrX, 49118000-49118500, hg19) en una región CpG particular dentro del primer intrón del gen de FoxP3. Se puede analizar en las células contenidas en cada fracción de las células infiltrantes de tumor la desmetilación de esta región para verificar si la fracción obtenida esta vez consiste solo en células Tregotambién coexisten otras células con ellas.
Se recuperó cada fracción (Fr2, Fr3, Fr4 y Fr5) de las células T CD4+ infiltrantes de tumores y se recuperó el ADN genómico mediante el uso del método de extracción con fenol.El ADN genómico se trató con bisulfito usando el kit MethylEasyXceed (Human GeneticSignatures) y la región del intrón 1 de FOXP3 (chrX, 49118000-49118500, hg19), una región de desmetilación específica de células Treg, se sometió a PCR de amplicón. La metilación del ADN se detectó usando una sonda fluorescente FAM específica de ADN metilado preparada y una sonda fluorescente VIC específica de desmetilación y el sistema de PCR digital QuantStudio 3D (AppliedBiosystems, Inc.).Después de la PCR del amplicón, se contó el número de emisiones de luz de las sondas fluorescentes FAM y VIC y se calculó la tasa de metilación del ADN a partir de la relación entre estos números de emisiones de fluorescencia y se usó como la tasa de metilación de cada fracción (Fr2 a Fr5).
Como resultado, el 95% o más de secuencias CpG dentro de la región del intrón 1 de FOXP3 (chrX, 49118000­ 49118500) estaban desmetiladas en las células contenidas en la Fr2 y Fr3 de las células infiltrantes de tumores, mientras que las tasas de desmetilación de la Fr4 y Fr5 eran 50% o menos. En conclusión, se encontró que casi todas las células contenidas en la Fr2 y Fr3 eran células Treg (Figura 5).
[Ejemplo 4]
Identificación de CCR8
Con el fin de identificar un gen de un grupo expresado específicamente en las células Treg (Fr2 de las células infiltrantes de tumores), se llevó a cabo un análisis de agrupamiento jerárquico en los datos de expresión génica en la fracción de células T CD4+ derivadas de PBMC del mismo paciente que en cada fracción de células T CD4+ derivadas de tumor.CCR8 se identificó como un gen que se expresaba en la Fr2 de las células Treg y rara vez se expresaba en la Fr5 y Fr4 derivadas del tumor y la Fr5 de las PBMC (Figura 6).
[Ejemplo 5]
Preparación de células obligadas a expresar CCR8 de ratón
Se insertó el ORF de longitud completa de CCR8 de ratón (en lo sucesivo, también denominado mCCR8) en un vector de expresión (pcDNA3.4) para construir el plásmido pcDNA3.4-mCCR8.La secuencia de nucleótidos se cambió para tener codones con alta frecuencia de uso en mamíferos sin cambiar los aminoácidos.Se transfectaron células HEK293 con pcDNA3.4 o el plásmido de expresión pcDNA3.4-mCCR8 usando Lipofectamina 3000 y se seleccionaron con fármaco con una concentración degeneticina (G418) de 1 mg/ml durante 2 semanas.
Las células supervivientes se disociaron con tripsina y se lavaron con medio DMEM/FCS al 10%. Después, se les añadió un anticuerpo anti-mCCR8 marcado con PE (clon SA214G2) diluido 1/200 y se hicieron reaccionar en hielo durante 30 minutos. Después, las células se lavaron una vez con DMEM/FCS al 10% para marcar mCCR8 expresado en la superficie celular.Se enriqueció una población de células que expresaba mCCR8 por separación usando un separador de células (FACSAria II).La población de células positivas se cultivó a 37°C durante 2 semanas en una incubadora con CO2 en presencia de DMEM/FCS al 10% (medio que contenía 1 mg/ml de G418).Para las células transformadas con pcDNA3.4, solo se llevó a cabo la selección con fármaco y no se llevó a cabo la separación. Con el fin de confirmar la expresión, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CCR8 de ratón marcado con anti-PE disponible en el mercado (clon SA214G2) y se analizaron usando un citómetro de flujo (FACSAria II).Se muestran los resultados (Figura 7). La expresión de mCCR8 se observó en 99% o más de las células transformadas con pcDNA3.4-mCCR8 en comparación con las células transformadas con pcDNA3.4.
[Ejemplo 6]
Estudio sobre la capacidad del anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) para estimular FcyR
Se evaluó la capacidad de un anticuerpo anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, adquirido de BioLegend, Inc.) para estimular FcgR, necesario para su actividad ADCC, usando el kit mFcYRIV ADCC ReporterBioassays Core (Promega Corp.).Este kit indica la activación de FcyR en células efectoras por el nivel de expresión del gen de luciferasa ligado corriente abajo del promotor NFAT en las células.La activación de las señales de FcyR se puede cuantificar cuantificando este nivel de expresión.
En lo sucesivo, se describirán brevemente los procedimientos. Se mezclaron 1 x 105 células/pocillo de células diana HEK293 que expresan mCCR8 (células diana) disociadas con tripsina con células efectoras que expresan FcyR unidas al kit en una relación de 1:1,5 en una placa de 96 pocillos.Inmediatamente después de la mezcla de células, se le añadió el anticuerpo contra mCCR8.La concentración se estableció en 33 ug/ml a 0,033 ug/ml como se muestra en la Figura 8 (N = 2).Solo las células efectoras se usaron como control negativo. 14 horas después de la adición del anticuerpo, se recuperaron las células y se midió la actividad de luciferasa (Figura 8).Se muestra una media de N = 2.
Como resultado, no se observó actividad de luciferasaen ninguna de las concentraciones de anticuerpo para el control negativo, mientras que se observó actividad dependiente de la concentración de anticuerpo en el grupo de adición de células diana.La ordenada representa un valor relativo de intensidad de luminiscencia.Como se ve en la Figura 8, el valor de actividad más grande era de aproximadamente 6000 unidades relativas de luz (URL), y el valor de la CE50 (aproximadamente 3500 URL) era de aproximadamente 0,1 pg/ml (líneas en el dibujo).Estos resultados demostraban que el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) puede activar FcyRIV.
[Ejemplo 7]
Medición de la actividad de ADCC
Se evaluó en el anticuerpo anti-mCCR8 (SA214G2) su actividad citotóxica usando las células HEK293 que expresan de manera estable mCCR8 preparadas en el ejemplo 5.
Se separó el bazo de un ratón C57BL/6 y se recuperaron las células del bazo a través de un filtro de células. Las células se lavaron y después se hicieron reaccionar con un anticuerpo anti-CD49b biotinilado (clon DX5) a 4°C durante 30 minutos. Después de lavar, las células NK se purificaron usando microperlas de estreptavidina (MiltenyiBiotec) y se usaron como células efectoras. Las células HEK293 que expresan CCR8 de ratón se tiñeron con Cell Trace Violet (CTV) (Thermo Fisher Scientific Inc., C34557) en una concentración final de 2,5 pM y se usaron como células diana. Estas células se mezclaron en una relación de células efectoras:células diana = 5:1 (recuento de células efectoras: 2,5 x 105 células) en una placa de 96 pocillos (2pKp ocillo). Se le aadió el anticuerpo anti-CCR8 de ratón o un anticuerpo de control de isotipo (IgG2b de rata, clon RTK4530) en una concentración final de 1 pg/ml, seguido de cultivo durante la noche en una incubadora de CO2 a 37°C. Después, se añadió anexina V marcada con PE (Annexin V-PE, Medical &BiologicalLaboratories Co., Ltd.(MBL), 4696-100) diluida 1/100 según el protocolo adjunto, y las células se tiñeron a 37°C durante 30 minutos y después se lavaron una vez. La proporción de células apoptóticas positivas para anexina V en las células diana teñidas con CTV se analizó usando un citómetro de flujo. El ensayo se llevó a cabo por triplicado (N = 3), y se muestran una media y una desviación estándar de la misma.Se muestra un ejemplo típico de dos experimentos similares (Figura 9).La adición del anticuerpo anti-CCR8 de ratón en comparación con el anticuerpo de control de isotipo aumentó significativamente la proporción de células positivas para anexina V en las células diana en aproximadamente 6 veces.En conclusión, se encontró que el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) tenía actividad ADCC.
[Ejemplo 8]
Medición de la actividad neutralizante contra CCR8
Se evaluó laactividad neutralizante del anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) contra CCR8 con entrada de flujo de calcio intracelular mediada por CCL1 de ratón (ligando de CCR8 de ratón) como índice usando células HEK293 que expresan de forma estable CCR8 de ratón.
Se usaron los siguientes reactivos en la medición de calcio.HEPES (WakoPureChemical Industries, Ltd., N° CAS.
7365-45-9) HBSS(+) sin Rojo fenol (WakoPureChemical Industries, Ltd.). Fluo 3-AM (cat F023, DojindoLaboratories) Probenecid (N° CAS: 57-66-9, NacalaiTesque, Inc.) Pluronic F127 (P3000MP; Life Technologies Corp.) HEPES 10 mM/HBSS/tampón de BSA al 0,1% (se añadieron HEPES (concentración final: 10 mM) y BSA (concentración final: 0.1%) a HBSS)
Se disolvieron Fluo 3-AM y Pluronic F127 a concentraciones finales de 4 pmol/l y 0,04%, respectivamente, en tampón HEPES/HBSS 10 mM.Las células se suspendieron en esta solución y se incubaron a 37°C durante 1 hora de modo que las células absorbieran Fluo 3-AM. Después, las células se lavaron tres veces con solución de HEPES 10 mM/HBSS/BSA al 0,1% y se suspendieron a una concentración celular de 2 x 105 células/ml en solución de HEPES 10 mM/HBSS/BSA al 0,1% que contenía probenecid 1,25 uM. Después, las células se incubaron a 37°C durante 10 minutos en una incubadora con CO2.Se les añadió además el anticuerpo anti-mCCR8 (SA214G2) o un anticuerpo de control de isotipo (Clon LTF-2, Bio X Cell) a una concentración de 5 pg/ml.Las células se incubaron adicionalmente a 37°C durante 20 minutos.
Se pusieron 2 ml de la solución de las células en una cubeta de vidrio de cuarzo y se cargó en un espectrofotómetro HITACHI F7000 con la temperatura de una sala de medición preestablecida a 35°C. Las condiciones de medición eran como se describen a continuación.
Longitud de onda de excitación: 508,0 nm, longitud de onda de fluorescencia (medición): 527,0 nm, rendija lateral de excitación: 5 nm, rendija lateral de fluorescencia: 5 nm, voltaje del fotomultiplicador: 950 V, respuesta: 0,5 s Las células se incubaron con agitación usando un agitador durante aproximadamente 30 segundos hasta que se estabilizó la longitud de onda de fluorescencia.Cuando se estabilizó la longitud de onda, se le añadió CCL1 de ratón en una concentración final de 50 nM (4 pl) para iniciar la medición.Como resultado de la medición, se descubrió que la administración del anticuerpo anti-mCCR8 con antelación suprime casi por completo la entrada de flujo de calcio intracelular mediado por mCCL1 (Figura 10). Dicha supresión no se observó por la adición del anticuerpo de control.Los huecos en los gráficos derivaban de la apertura y cierre de la tapa del instrumento con el fin de administrar el agonista a las células.En conclusión, se encontró que el anticuerpo anti-mCCR8 (SA214G2) tiene actividad neutralizante contra CCR8 de ratón.
[Ejemplo 9]
Confirmación de la expresión de mCCR8 en CT26
Se cultivaron células CT26 en una placa de 6 pocillos y la solución de cultivo se eliminó cuando las células se volvieron confluentes en aproximadamente 50%. Se les añadieron 5 ml de EDTA/PBS 10 mM y las células se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Como resultado, casi todas las células se disociaron, suspendieron usando una pipeta y así se pudieron separar en casi células individuales. Las células se lavaron dos veces con D-MEM/FCS al 10%, se suspendieron en D-MEM/FCS al 10% y se tiñeron en hielo con el kit de tinción de células muertas para IR cercano LIVE/DEAD(R) Fixable (Thermo Fisher Scientific Inc., L34975) y un anticuerpo anti-mCCR8 (SA214G2) marcado con APC o de control de isotipo marcado con APC. 1 hora más tarde, las células se lavaron tres veces con D-MEM/FCS al 10% y se analizó la tasa de expresión de mCCR8 usando un citómetro de flujo (FACSCanto II). Se estableció un nivel de fondo usando el anticuerpo de control de isotipo, y se calculó la proporción de células positivas (P6) igual o mayor que el nivel de fondo y la fluorescencia de APC mediana (Figura 11). Como resultado, no se observó ninguna diferencia en la intensidad de fluorescencia de APC mediana, y las células positivas rara vez se observaron (0,2%). En conclusión, las células CT26 no eran reconocidas por el anticuerpo anti-mCCR8, y se confirmó que las células CT26 no expresan mCCR8.
[Ejemplo 10]
Confirmación de la expresión de CCR8 en células infiltrantes de tumores usando células CT26 de línea celular de cáncer colorrectal
Se trasplantaron 3 x 105 células CT26 (50 pl) por vía intracutánea al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas, hembra) (N = 3).El día 3 posterior al trasplante, se les administraron 400 pg por vía intraperitoneal de un anticuerpo anti-KLH de rata (hemocianina de lapa californiana, clon LTF-2) (IgG2b). Los días 4 (4d) y 7 (7d) posteriores a la administración, se recuperaron los tumores de los 3 individuos (N = 3).Las masas tumorales de las células CT26 se picaron con tijeras y las células infiltrantes de tumores se prepararon usando kits disponibles en el mercado (kit de disociación de tumores, ratón, MiltenyiBiotec y disociador gentleMACS (TM), MiltenyiBiotec, cat. 130-095-929) según los protocolos adjuntos a los kits.
Las células preparadas se pasaron a través de un filtro de células de 70 pm y después se lavaron dos veces con HEPES 10 mM/HBSS/FBS al 2%. Después, las células se trataron con una solución de lisis de eritrocitos (MiltenyiBiotec) durante 5 minutos para la eliminación de eritrocitos y se lavaron dos veces más con tampón de FCS al 2% (suero de ternero fetal)/HEPES 10 mM/HBSS.Las células infiltrantes de tumores se dividieron en dos partes, una de las cuales se usó en la identificación de células Treg y la otra en la identificación de células mieloides (macrófagos).Las células se tiñeron usando el siguiente método y anticuerpos.Los anticuerpos, reactivos de tinción y tampones de ensayo usados eran como se describen a continuación.
Se usaron los siguientes anticuerpos.
(Conjunto de anticuerpos para confirmación de células Treg)
Anti- FoxP3 deratón/rata PE (clon FJK-16s), eBioscience, Inc.
Anti-CD4 de ratónPerCP/Cy5.5 (clon RM4-5), eBioscience, Inc.
Anti-CD8a de ratón FITC (clon 5H10-1), BioLegend, Inc.
Anti-CD25 de ratónBv421 (clon PC61), BioLegend, Inc.
Anti-CD45 de ratónBv510 (clon 30-F11), BioLegend, Inc.
Anti-CCR8 de ratónAF647 (clon SA214G2), BioLegend, Inc.
Control de isotipo AF647 (clon RTK4530), BioLegend, Inc. (control negativo de CCR8)
(Conjunto de anticuerpos para confirmación de células mieloides y de macrófagos)
Anti-CCR8 de ratónAF647 (clon SA214G2), BioLegend, Inc.
Control de isotipo AF647 (clon RTK4530), BioLegend, Inc. (control negativo de CCR8)
anti-CD45 de ratónBv510 (clon 30-F11), BioLegend, Inc.
anti-Gr-1 de ratónFITC (clon RB6-8C5), BioLegend, Inc.
anti-F4/80 de ratónBv421 (clon BM8), BioLegend, Inc.
anti-CD11b de ratónPECy7 (clon M1/70), BioLegend, Inc.
Anti-MHC clase II IA/IE de ratónPerCP/Cy5.5 (clon M5/114.15.2), BioLegend, Inc.
anti-CD206 de ratónPE (clon C068C2), BioLegend, Inc.
(Otros reactivos usados)
Kit de viabilidad Zombie NIR Fixable (n° cat 423106), BioLegend, Inc.
Conjunto de tampón de factor de transcripción BD Pharmingen (n° cat 562574)
Tampón de lisis BD Pharmingen (n° cat 555899)
HBSS(-), WakoPureChemical Industries, Ltd., 084-08345
FCS (HyClonLaboratories Inc., n° cat SH30070.03)
El método de tinción fue el siguiente: las células infiltrantes se tiñeron en hielo durante 30 minutos usando un reactivo del kit de viabilidad Zombie NIR Fixable. Las células se lavaron una vez con FCS al 2%/HEPES 10 mM/HBSS. Después, las células Treg y CCR8 positivas se tiñeron con anticuerpo anti-CD45 marcado con Bv510, anti-CD4 de ratón marcado con PerCP/Cy5.5, anti-CD8 de ratón marcado con FITC, anti-CD25 de ratón marcado con Bv421 y anti-CCR8 de ratón marcado con AF647 (o anticuerpo de control de isotipo marcado con AF647). Las células monocíticasse tiñeron con anticuerpo anti-CD45 marcado con Bv510, anti-Gr-1 de ratón FITC, anti-CD11b de ratón PECy7, anti-F4/80 de ratón Bv421, MHC clase 2 (IA/IE) marcado con PerCP/Cy5.5 y anti-CD206 de ratón marcado con PE.
La tinción se llevó a cabo en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con FCS al 2%/HEPES/HBSS y después se fijaron usando un kit disponible en el mercado (kit de tinción FoxP3, eBioscience, Inc.) de acuerdo con el protocolo adjunto, y se tiñó FoxP3 intracelular usando un anticuerpo anti-FoxP3 marcado con PE. Las células se lavaron con un tampón adjunto al kit y después se analizaron usando un citómetro de flujo.
Se analizaron las células T CD45+ CD4+. Se determinó una región de células negativas en las células T CD45+ CD4+ por tinción con un anticuerpo de control de isotipo, y se usaron células positivas tanto para anticuerpos anti-CD25 de ratón como para anti-FoxP3 de ratón como células Treg para calcular la frecuencia de presencia 4 días después de la administración. (7 días después de la inoculación) y 7 días después de la administración (10 días después de la inoculación). Como resultado, aproximadamente 23% (4d) y aproximadamente 30% (7d) de las células T CD45+ CD4+ dentro de los tumores de ratón eran células CD25+ FoxP3+ (Figura 12).
A continuación, se analizó la expresión de CCR8 en las células T CD45+ CD4+ CD25+ FoxP3+. Se determinó una región de células negativas en las células T CD45+ CD4+ CD25+ FoxP3+ por tinción con un anticuerpo de control de isotipo, y las células positivas para un anticuerpo anti-CCR8 de ratón se usaron como células Treg CCR8+ para calcular la frecuencia de presencia 4 días después de la administración (7 días después de la inoculación) y 7 días después de la administración (10 días después de la inoculación) (Figura 13). Como resultado, aproximadamente 50% (4d) y aproximadamente 67% (7d) de las células T CD45+ CD4+ CD25+ FoxP3+ dentro de los tumores de ratón eran células CCR8+ (Figura 13).
En cuanto a las células mieloides, la población mieloide se activó en células CD45+ y FSC/SSC usando un citómetro de flujo y se analizó la proporción de células CCR8+ en células CD11b+ Gr1+ CD206+. Como resultado, se encontró que de 40 a 50% de las células tanto 7 días después de la inoculación (4 días después de la administración) como 10 días después de la inoculación (7 días después de la administración) eran positivas para CCR8 (Figura 14). Además, se midió la tasa de expresión de CCR8 en células CD45+ CD11b+ F4/80+ (N = 3) como una población de células macrófagos diferente de estas de la misma forma que antes. Como resultado, se confirmó que 45,3% (desviación estándar: ± 8,2%) de las células expresaban CCR8 el día 10 posterior al trasplante (7 días). A partir de estos resultados, se encontró que al menos las células T CD4+ CD25+ FoxP3+ y los macrófagos CD11b+ Gr1 CD206+ (llamados macrófagos M2) como células infiltrantes de tumores expresan CCR8.
[Ejemplo 11]
Estudio sobre el efecto del agotamiento de células Treg infiltrantes de tumores o células macrófagos infiltrantes de tumores por la administración de anticuerpos anti-mCCR8
Se trasplantaron por vía intracutánea 3 x 105 células CT26 (50 ul) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas, hembra). 3 días después de la inoculación, se administraron 400 pg (volumen de líquido: 400 pl) de un anticuerpo de rata anti-CD198 (CCR8) de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) o un anticuerpo de control de isotipo (clon LTF-2) en la vena de la cola (cada grupo N = 3). 7 días después de la inoculación del tumor (4 días después de la administración del anticuerpo) y 10 días después de la inoculación del tumor (7 días después de la administración del anticuerpo), se recuperaron los tumores y se prepararon y analizaron las células infiltrantes de tumores (Figura 15).
Las células Treg infiltrantes de tumores se recuperaron de la misma forma que en el ejemplo 10. Los anticuerpos usados eran los mismos que en el ejemplo 10.
Primero, las células infiltrantes se tiñeron en hielo durante 30 minutos usando el kit de viabilidad Zombie NIR Fixable. Las células se lavaron una vez con FCS al 2%/HEPES 10 mM/HBSS y después se tiñeron con anticuerpo anti-CD45 marcado con Bv510, anti-CD4 de ratón marcado con PerCP/Cy5.5, anti-CD8 de ratón marcado con FITC, anticuerpo anti-CD25 de ratón marcado con Bv421 y anti-CCR8 de ratón marcado con AF647 (o anticuerpo de control de isotipo marcado con AF647). La tinción se llevó a cabo en hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con FCS al 2%/HEPES/HBSS y después se fijaron usando un kit disponible en el mercado (kit de tinción de FoxP3, eBioscience, Inc.) de acuerdo con el protocolo adjunto, y se tiñó FoxP3 intracelular usando un anticuerpo anti-FoxP3 marcado con PE. Las células se lavaron con un tampón adjunto al kit y después se analizaron usando un citómetro de flujo.
Se usaron células CD45+ CD4+ FoxP3+ CD25+ como células Treg de ratón.Se determinó una región de células negativas en las células Tregpor tinción con un anticuerpo de control de isotipo marcado con AF647, y las células positivas para un anticuerpo anti-CCR8 de ratón marcado con AF647 en comparación con el control se usaron como células CCR8 positivas para calcular su frecuencia.
Como resultado, como se muestra en la Figura 16, el porcentaje de positividad de células T CD45+ CD4+ CD25+ (células Treg) en los ratones que recibieron el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) era de aproximadamente 80% 7 días después de la inoculación del tumor (4 días después de laadministración de anticuerpos) y aproximadamente 40% 10 días después de la inoculación del tumor (7 días después de la administración de anticuerpos 7) (Figura 16) cuando la proporción de células T CD45+ CD4+ CD25+ FoxP3+ FoxP3+ (células Treg) intratumorales en los ratones que recibieron el anticuerpo de isotipo se definía como 100% (10 días después de la inoculación del tumor).El nivel de significancia ** era P <0,01 (prueba t).Estos resultados mostraban que aproximadamente 60% de las células Treginfiltrantes de tumores eran agotadas por el anticuerpo anti-CCR87 días después de la administración del anticuerpo anti-CCR8.
De la misma manera que antes, las células infiltrantes de tumores se separaron de los tumores el día 7 (d7) posterior al trasplante y, entre las células CD45+, se activó una población mieloide en FSC/SSC (denominada FSC/SSC+), seguida del análisis de células CD11b+ F4/80+ en las células.F4/80 (Ly719) es un marcador de macrófagos y monocitos maduros de ratón.Como se muestra en la Figura 17, la relación de abundancia de células CD11b+ F4/80+ disminuía en el grupo de administración de anticuerpos anti-mCCR8 (N = 3) en comparación con el control de isotipo (N = 3) (prueba t; P = 0,062).El gráfico muestra la relación de abundancia de células F4/80+ en una población de células mononucleares CD45+ FSC/SSC+.
La relación de abundancia de células IA/IE positivas o de clase 2 (IA/IE) negativas en las células F4/80+ mostradas en la Figura 17 se muestra además con respecto a moléculas de MHC (antígeno de histocompatibilidad tumoral) de clase 2.Como se muestra en la Figura 18, en el grupo de administración de anticuerpo anti-mCCR8 (N = 3) comparado con el control de isotipo (N = 3), el grupo IA/IE negativo presentaba una tendencia decreciente, y el grupo IA/IE positivo se redujo significativamente (prueba t; nivel de significancia *; P <0,05).En conclusión, se encontró que la población de monocitos/macrófagos intratumorales CT26 de ratón o una parte de la población tenía un recuento menor de células intratumorales.
[Ejemplo 12]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración de anticuerpos anti-mCCR8 usando CT26 derivadas de cáncer colorrectal
Se trasplantaron por vía intracutánea3 x 105 células CT26 derivadas de cáncer colorrectal (50 ul) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra). 3 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intravenosa 400 pg (400 pl) de un anticuerpo de rata anti-CD198 de ratón (CCR8) (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) (N = 10).Se administró un anticuerpo de control de isotipo a un control (N = 10).Los volúmenes de los tumores se midieron cada 3 a 4 días a partir de los 8 días después de la inoculación del tumor (5 días después de la administración del anticuerpo).El volumen del tumor (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 19).
Como resultado, no se observaron diferencias significativas en el grupo de administración de anti-mCCR8 en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo el día 7 posterior al trasplante, mientras que el volumen tumoral del grupo de administración de anticuerpo anti-mCCR8 disminuyó significativamente los 11, 14, 17 y 21 días después de la inoculación del tumor (nivel de significación: ***; P <0,001 los días 11 y 14, **; P <0,01 los días 17 y 21).Además, en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón, el volumen tumoral disminuyó el día 14 posterior al trasplante o más tarde, y los tumores desaparecieron casi por completo el día 17 (los datos individuales se muestran en la Figura 20, y los datos medios se muestran en la Figura 21).A partir de estos resultados, se concluyó que la administración del anticuerpo anti-mCCR8 suprimía las funciones de mCCR8 expresado en Treg y monocitos/macrófagos señalados como células inmunosupresoras, o mataba (agotaba) estas células de expresión a través de la actividad ADCC del anticuerpo de modo que mejoraba la inmunidad tumoral, conduciendo a la regresión y desaparición de los tumores.
Como ya se ha descrito en muchas publicaciones, etc., en el caso de administrar un anticuerpo específico para CD25 de ratón (anti-CD25), un marcador de células Treg de ratón, a ratones y, por lo tanto, agotar las células Treg de ratón, la administración antes de la inoculación del tumor presenta una efecto antitumoral débil y la administración el día 2 posterior al trasplante o más tarde no presenta efecto antitumoral.También se llevó a cabo la administración de anticuerpo anti-CD25 el día 3 posterior al trasplante usando el mismo sistema de células CT26 que se usó esta vez, pero no se observó ningún efecto antitumoral.A partir de estos resultados, se concluyó que el anticuerpo antimCCR8 tiene una eficacia farmacológica más fuerte que la del anticuerpo anti-CD25.
[Ejemplo 13]
A continuación, se evaluó la eficacia farmacológica de un anticuerpo anti-PD-1 (clon RMP1-14, Bio X Cell) específico para PD-1 de ratón, usando CT26 y se estudió comparativamente con el anti-mCCR8. Se trasplantaron por vía intracutánea 2 x 105 células CT26 derivadas de cáncer colorrectal (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra). El anticuerpo anti-PD-1 (200 pg/cabeza, i.p.) se administró un total de tres veces cada 3 a 4 días a partir del día 7 posterior al trasplante.
Como resultado, se observó un efecto antitumoral en el grupo que recibió el anticuerpo anti-PD-1 (N = 8) en comparación con un grupo que recibió un anticuerpo de control de isotipo (N = 8). El volumen tumoral medio y la desviación estándar del control de isotipo eran 601,7 ± 378,1 mm3, 956,3 ± 467,7 mm3 y 1528,4 ± 774,1 mm3 a los 14, 17 y 20 días después de la inoculación del tumor, respectivamente, mientras que el volumen tumoral medio y la desviación estándar del grupo de administración del anticuerpo anti-PD-1 eran 175,3 ± 42,6 mm3, 174,7 ± 55,8 mg y 209,6 ± 99,8 mm3 a los 14, 17 y 20 días después de la inoculación del tumor, respectivamente. El anticuerpo anti-PD-1 suprimía significativamente el aumento del volumen tumoral en comparación con el control en todos los 14, 17 y 20 días después de la inoculación del tumor. Sin embargo, los individuos cuyo tumor desapareció por completo eran 1 de 8 ratones en el periodo de observación (hasta el día 20 posterior al trasplante). Por otro lado, se observó la desaparición completa de los tumores en los 10 casos en el mismo periodo anterior por la administración de anticuerpos anti-mCCR8. A partir de estos resultados, se concluyó que el anticuerpo anti-mCCR8 tiene una eficacia farmacológica más fuerte que la del anticuerpo anti-PD-1 en el método de administración convencional.
[Ejemplo 14]
Confirmación de la presencia o ausencia de inducción de enfermedad autoinmunitaria en ratones que recibieron anticuerpos anti-mCCR8
A continuación, se evaluó el estado de los ratones del ejemplo 12 hasta el día 18 posterior a la administración. No se encontraron diferencias significativas en el peso corporal en este periodo entre el grupo de administración de anticuerpo de control y el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8. No se observó piloerección en ninguno de los grupos. Estos ratones se diseccionaron el día 18 posterior a la administración. Aunque se estudió la presencia o ausencia de agrandamiento del ganglio linfático y del tracto intestinal en el grupo de administración de anti-CCR8 en comparación con el control, no se observó agrandamiento, sin diferencias entre los grupos. A partir de estos hallazgos, se concluyó que no se observaba ningún signo de enfermedad autoinmunitaria en el periodo en el que se ejercía un efecto antitumoral en los ratones que recibían el anticuerpo anti-CCR8. Se ha descrito en artículos que, en general, si se agotan las Treg en todo el cuerpo de un ratón hasta el punto en que se induce un efecto antitumoral, se induce una enfermedad autoinmunitaria grave alrededor de 14 días después del agotamiento. Este es un motivo de preocupación para la inmunoterapia tumoral que incluye la terapia de supresión de Treg. Los resultados obtenidos esta vez mostraron que no se inducía ninguna enfermedad autoinmunitaria incluso el día 18 posterior a la administración del anticuerpo en los ratones en los que se observaba un fuerte efecto de inmunidad antitumoral por la administración de anticuerpos anti-CCR8.Una de las explicaciones para ello es la baja expresión de CCR8 de ratón y humano en PBMC, el bazo y el ganglio linfático en comparación con los tejidos tumorales según los informes.Sin embargo, ninguno de los informes anteriores indica si se induce o no una enfermedad autoinmunitaria agotando o inhibiendo funcionalmente las células Treg que expresan CCR8 en estos tejidos periféricos. Aquí, se encontró por primera vez que estos procedimientos no inducen ninguna enfermedad autoinmunitaria. Este efecto puede ser inesperado a partir de los hallazgos anteriores.
[Ejemplo 15]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración de anticuerpos anti-mCCR8 usando Colon-26 derivadas de cáncer colorrectal
Se trasplantaron por vía intracutánea2 x 105 células Colon-26 derivadas de cáncer colorrectal (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra). 3 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intravenosa 400 pg (400 pl) de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) (N = 10).Se administró un anticuerpo de control de isotipo a un control (N = 10).Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de los 3 días después de la inoculación del tumor (5 días después de la administración del anticuerpo).El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2.El momento en el que el tumor alcanzaba un volumen de punto final (800 mm3) se usó como criterio de valoración de cada animal.Como resultado, se suprimió el aumento del volumen del tumor en el grupo de administración de anti-mCCR8 en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo a los 14 y 18 días después de la inoculación del tumor.El volumen tumoral medio el día 14 era de 451,3 mm3 (desviación estándar: ± 177,5 mm3) en el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo y 322,6 mm3 (desviación estándar: ± 146,0 mm3) en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8. Los individuos que tenían un volumen tumoral de 350 mm3 o mayor el día 14 eran 9 de 10 casos en el grupo de control de isotipo y 4 de 10 casos en el grupo de administración de anti-mCCR8. Había una diferencia significativa con P = 0,019 en la prueba de chi-cuadrado de Pearson en cuanto a esta forma segregada. Por lo tanto, la diferencia se observó en el número de individuos cuyo volumen tumoral alcanzó 350 mm3 el día 14.Además, el volumen tumoral medio el día 18 posterior al trasplanteera 874,7 mm3 (desviación estándar: ± 269,2 mm3) en el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo y 585,4 mm3 (desviación estándar: ± 401,7 mm3) en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 (Figura 22). Los individuos que tenían un volumen tumoral de 600 mm3 o mayor el día 18 eran 9 de 10 casos en el grupo de control de isotipo y, por otro lado, 4 de 10 casos en el grupo de administración de anti-mCCR8. Había una diferencia significativa con P = 0,019 en la prueba de chi-cuadrado de Pearson en cuanto a esta forma segregada.Por lo tanto, la diferencia se observó en el número de individuos cuyo volumen tumoral alcanzó los 600 mm3 el día 18. Además, el momento en que el volumen tumoral alcanzaba 800 mm3 se preestableció como un criterio de valoración. No se observó ningún individuo considerado muerto con el volumen tumoral superior a 800 mm3 en ninguno de los grupos hasta el día 14 y fueron 7 de 10 casos en el grupo de control de isotipo y 3 de 10 casos en el grupo de anticuerpos anti-CCR8 el día 18.Como resultado de estudiar una diferencia en la probabilidad de supervivencia el día 18 por la prueba de chi-cuadrado de Pearson, había una diferencia significativa en la probabilidad de supervivencia con P = 0,025.No se observó ningún efecto antitumoral en un grupo de administración de anti-PD-1 (clon RMP1-14, Bio X Cell) en comparación con un grupo que recibió un anticuerpo de control de isotipo en un experimento similar usando la misma línea celular que antes.En conclusión, el anticuerpo anti-mCCR8 presentaba un mayor efecto antitumoral en las células Colon26 resistentes al anticuerpo anti-PD-1.
[Ejemplo 16]
Análisis de la expresión de CCR8 en células infiltrantes de cáncer de riñón humano
Se analizó la expresión de CCR8 en células infiltrantes de tumores de cáncer de riñón humano de 14 casos.Los antecedentes de los 14 pacientes con cáncer de riñón eran 11 hombres y 3 mujeres por sexo, una mediana de edad de 68,5 años y estadios patológicos de T1A para 6 pacientes, T1B para 2 pacientes, T3A para 5 pacientes y T3b para 1 paciente.Específicamente, se aislaron células infiltrantes de tumores primarios de cáncer de riñón de los 14 pacientes con cáncer de riñón (carcinoma de células renales de células claras, ccRCC) de la misma manera que en la Figura 1 del ejemplo 1, se tiñeron con anticuerpo anti-CD4 (BioLegend, Inc., Clon OKT4), anti-CD3 (BioLegend, Inc., Clon UCHT1), anti-CD45RA (BD Biosciences, Clon HI100), anti-CD8 (BioLegend, Inc., RPA-T8), anti-CCR8 (BioLegend, Inc., Clon L263G8) y anti-FoxP3 (eBioscience, Inc., Clon 236A/E7) o un control de isotipo anti-FoxP3, y se analizaron por citometría de flujo (BD Biosciences, BD LSRFortessa).Se analizaron células T CD3+ CD8+ y células T CD3+ CD4+.Las células T CD3+ CD4+ se dividieron además en 2 grupos según la presencia o ausencia de expresión de FoxP3 y se analizaron.Se preparó un control negativo de expresión de FoxP3 por tinción con el anticuerpo de control de isotipo.El valor medio del análisis de FACS (MFI) de cada muestra de paciente se usó como intensidad de expresión de CCR8.La Tabla 1 muestra la MFI media de la tinción con el anticuerpo anti-CCR8 o el anticuerpo de control de isotipo del mismo, y una desviación estándar de la misma.
T l 1
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Se encontró que las células T CD8+ rara vez expresan CCR8 (Tabla 1). Las células T CD4+ FoxP3- expresaban ligeramente CCR8, mientras que las células T c D4+ FoxP3+ tenían 8 veces o más la MFI media de las células T CD4+ FoxP3-, poniendo de manifiesto que las células T CD4+ FoxP3+ expresan CCR8 de manera significativa y fuerte (Tabla 1). La Figura 23 muestra los resultados de la Tabla 1 en forma de gráfico. Cada representación del gráfico muestra el nivel medio de expresión de CCR8 (MFI) de cada muestra de paciente en un citómetro de flujo. Las líneas horizontales del gráfico representan la MFI media de las muestras. Las barras representan desviaciones estándar. El nivel de significancia *** indica P <0,001. A partir de estos resultados, se encontró que la proteína CCR8 se expresaba específicamente en la superficie de las células T CD3+ CD4+ FoxP3+ infiltrantes de tumores en el cáncer de riñón humano (ccRCC). Estos resultados también son consistentes con los resultados del análisis de expresión del ARNm por el análisis de ARN-Seq.
Las células T CD4+ infiltrantes de tumores en las 14 muestras de ccRCC descritas antes se sometieron a análisis de citometría de flujo usando FoxP3 y CCR8. La relación de células CCR8 positivas a células FoxP3 positivas y la relación de células CCR8 positivas a células FoxP3 negativas se representaron gráficamente basado en una muestra (Figura 24).La tinción con un anticuerpo de control de isotipo se usó como referencias negativas tanto para FoxP3 como para CCR8, y las células que tenían un valor igual o superior a este umbral se usaron como células positivas.Como resultado, la tasa de expresión de CCR8 de las células T CD3+ CD4+ FoxP3+ intratumoralesera aproximadamente de 75%, y la tasa de expresión de CCR8 de las células T CD3+ CD4+ FoxP3- era de aproximadamente 10%.
A partir de estos resultados, se encontró que CCR8 se expresaba en la mayoría de las células Treg que expresan FoxP3 entre las células infiltrantes de tumores de cáncer de riñón humano y se expresaba en aproximadamente 10% de las células T CD4 positivas distintas de las células Treg.A partir de estos resultados, la tasa de expresión de CCR8 de las células Treg FoxP3 positivas intratumorales humanas era similar a la de las células Tregintratumorales de ratón, lo que indica la posibilidad de que el anticuerpo específico de anti-CCR8 humano pueda agotar la mayoría de las células Treg FoxP3 positivas infiltrantes de tumores, como en ratones.
[Ejemplo 17]
Correlación de la tasa de expresión de CCR8 de células infiltrantes de tumores en diversos cánceres con la probabilidad de supervivencia
El gen FoxP3 se ha identificado como un gen que se expresa específicamente en células Treg y no se expresa en células tumorales ni en la mayoría de las células humanas normales. Por ejemplo, el gen FoxP3 como un gen marcador de células Treg, el gen CD3G como un gen marcador de células T y células NK, y el gen CD8A como un gen marcador de células T CD8 positivas se conocen como los llamados genes marcadores, que se expresan solo en ciertas células específicas como se ha mencionado antes.
También se ha descritoen relación con el gen FoxP3, un gen marcador de células Treg, que se puede medir el nivel de expresión del ARNm del gen FoxP3 dentro de cada tumor y, así usarlo como índice para la relación de abundancia de células Treg dentro del tumor (Cell, 2015, vol. 160, pág. 48-61).
Como también se describió en este artículo, se puede analizar si la relación de abundancia intratumoral de células Treg está relacionada con una probabilidad de supervivencia representando una curva de supervivencia de Kaplan-Meier en relación con la tasa de expresión intratumoral (relación de abundancia de Treg) del gen marcador y de las probabilidades de supervivencia de los pacientes mediante el uso de una base de datos RNA-Seqtal como TCGA. Los datos de RNA-Seq sobre masas tumorales son datos mixtos sobre ARNm expresados tanto en células tumorales como en células infiltrantes presentes en las mismas (linfocitos, células vasculares, etc.).Sin embargo, un gen que se ha demostrado que no se expresa en células tumorales se puede considerar como un gen expresado en células infiltrantes de tumores.Mediante su uso, se pueden identificar las células infiltrantes de tumores mediante el análisis como se ha descrito antes, es decir, análisis de la expresión del gen marcador usando los datos de RNA-Seq en masas tumorales.Además, el nivel de expresión de un gen marcador en una masa tumoral se puede considerar como el producto del recuento de las células que expresan de células particulares, que corresponden al gen marcador, que infiltran la masa tumoral, y el nivel de expresión del gen marcador en cada célula que expresa. En este contexto, si el nivel de expresión del gen marcador en cada célula es casi constante entre individuos, el nivel de expresión es directamente proporcional al recuento de células infiltrantes.Por tanto, se puede calcular un recuento de células intratumoralesque expresan de forma individual usando este nivel de expresión y se puede comparar entre individuos.
(Análisis de expresión de CCR8 a nivel celular)
Los datos de expresión de ARN de 1037 tipos diferentes de líneas celulares humanas están registrados en una base de datos pública CCLE (Enciclopedia de líneas celulares de cáncer).Se analizó si el gen CCR8 o CD3G se expresaría en células cancerosas distintas de las células T o células normales usando la base de datos.
Se analizó la expresión del ARNm de CD3G y CCR8 en relación con líneas celulares derivadas de cáncer de riñón, cáncer de próstata y cáncer de vejiga usando la base de datos CCLE.
Las líneas celulares examinadas fueron 40 líneas celulares derivadas de cáncer de riñón: VMRCRCW, SKRC20, SNU34, SKRC31, UOK10, SLR20, OSRC2, TUHR14TKB, SLR24, HK2, A498, RCC4, KMRC1, RCC10RGB, ACHN, SLR25, SNU1272, UMRC6, SLR23, 769P, SLR21, HEKTE, CAKI1, TUHR4TKB, KMRC2, VMRCRCZ, KMRC3, KMRC20, CAKI2, BFTC909, 786O, A704, TUHR10TKB, SLR26, UMRC2, CAL54, FURPNT1, FURPNT2, HEK293, y G402;
8 líneas celulares derivadas de cáncer de próstata:
VCAP, LNCAPCLONEFGC, DU145, PC3, 22RV1, PRECLH, MDAPCA2B y NCIH660; y
2 líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga:
TCBC14TK y TCBC2TKB. En todas estas líneas celulares de cáncer sólidas examinadas, la expresión de CCR8 y CD3G estaba al mismo nivel que el nivel de fondo, y no se observó expresión de ARNm (incluso el valor más grande que indica que la expresión era 1/500 o menos del nivel de expresión de G3PDH, y todos los demás valores eran 1/1000 o menos del nivel de expresión de G3PDH).En resumen, se podía confirmar que CCR8 y CD3G rara vez se expresan en células de cáncer sólido.Las células primarias normales derivadas de cada tejido humano también se analizaron de la misma forma que antes.Se encontró que CCR8 y CD3G se expresaban sólo en algunas células hematopoyéticas y raramente se expresaban en las células normales primarias derivadas de otros tejidos.
Estos resultados mostraban que las células de estos 3 cánceres no expresan ni CCR8 ni CD3G. Por lo tanto, se concluyó que los datos de expresión del ARN de TCGA usados para masas tumorales de cáncer de riñón, cáncer de próstata y cáncer de vejiga reflejan la expresión del ARNm de CCR8 y CD3G en células normales infiltrantes, distintas de las células cancerosas, presentes en las masas tumorales.
(Análisis usando la base de datos pública TCGA)
A continuación, se analizó la relación entre el gen CCR8 y el gen CD3G (CCR8/CD3G) expresados en el tumor de cáncer de riñón, cáncer de próstata o cáncer de vejiga, y las probabilidades de supervivencia de los pacientes mediante el uso de la base de datos pública TCGA.Se encontró que los genes que tenían la correlación más alta (correlación de Pearson) en términos de expresión con los genes CCR8 y CD3G dentro de estos 3 tumores eran varios genes expresados específicamente en células T (FoxP3, CD5, IL7R, etc.con coeficiente de correlación r de 0,7 o más).Estos resultados indican que CCR8 o CD3G no se expresan en las propias células tumorales y se expresan específicamente en células de expresión infiltrantes de tumores (particularmente, células T).Sin embargo, aquí se usó una población de células que expresaban CCR8 porque esto no niega que CCR8 se expresa en células infiltrantes distintas de las células T.CD3G, como ya se comunicó en artículos, etc., se expresa específicamente en células T y células NK.Además, las células T son las principales células infiltrantes de tumores.Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de un recuento de células T infiltrantes a partir de un nivel de expresión de CD3G.Por tanto, el valor de CCR8/CD3G se puede definir como un recuento de células que expresan CCR8 por recuento de células T presentes dentro de un tumor.
La relación CCR8/CD3G y las probabilidades de supervivencia de los pacientes se analizaron en relación con estos 3 carcinomas usando una curva de Kaplan-Meier.Para el cáncer de riñón, se usaron los datos de carcinoma renal de células claras de riñón (TCGA, Provisional) delos datos del TCGA, y se usaron 523 casos que tenían datos completos de expresión de ARN y datos de probabilidad de supervivencia de los pacientes.Asimismo, para el cáncer de próstata, se usaron los datos del adenocarcinoma de próstata (TCGA, Provisional) de los datos del TCGA, y se usaron 490 casos que tenían datos completos de expresión de ARN y datos de probabilidad de supervivencia de los pacientes.
Además, para el cáncer de vejiga, se usaron los datos de carcinoma urotelial de vejiga (TCGA, provisional) de los datos del TCGA, y se usaron 392 casos que tenían datos completos de expresión de ARN y datos de probabilidad de supervivencia de los pacientes.
Los pacientes de cada cáncer se dividieron por igual en 2 grupos (los pacientes con cáncer de riñón eran impares y, por lo tanto, se dividieron en 261:262) con valores de expresión de CCR8/CD3G altos y valores de expresión de CCR8/CD3G bajos, seguidos por análisis de la curva de supervivencia de Kaplan-Meier usando el software analítico R (R-Studio).La prueba de rango logarítmico se realizó como una prueba de diferencia significativa.Los resultados sobre el cáncer de riñón se muestran en la Figura 25, los resultados sobre el cáncer de próstata se muestran en la Figura 26 y los resultados sobre el cáncer de vejiga se muestran en la Figura 27.Las líneas verticales en los gráficos muestran que los pacientes sobrevivieron pero se trataron como abandonos (correspondientes a los llamados censores) en ese tiempo de medición porque el periodo de evaluación terminó en ese tiempo de medición.Los valores de la abscisa representan el número de meses en todos los gráficos.
Como resultado, en los 3 carcinomas, los grupos con valores altos de CCR8/CD3G tenían probabilidades de supervivencia de los pacientes significativamente bajas.Se encontró que los grupos con una alta relación de células que expresan CCR8 infiltrantes de tumores humanos a células T tenían una probabilidad de supervivencia reducida.Esto sugiere que también en seres humanos, las células que expresan c CR8 tienen un efecto supresor sobre la inmunidad tumoral.Esto sugiere la posibilidad de que, como en el efecto antitumoral del anticuerpo antimCCR8 administrado a ratones, las células que expresan CCR8 intratumorales en seres humanos se agoten o destruyan específicamente por algún método para mejorar así la inmunidad tumoral y elevar la probabilidad de supervivencia.
[Ejemplo 18]
Confirmación de la expresión de CCR8 de ratón en células LM8 y células MethA
Se cultivaron células LM8 derivadas de osteosarcoma o células MethA derivadas de fibrosarcoma cutáneo en una placa de 6 pocillos, y la solución de cultivo se eliminó cuando las células llegaron a ser aproximadamente 50% confluentes. Se añadieron 5 ml de EDTA/PBS 10 mMa las mismas y las células se incubaron a 37°C durante 5 minutos.Como resultado, casi todas las células se disociaron, se suspendieron usando una pipeta y, por lo tanto, se pudieron separar en casi células individuales.Las células se lavaron dos veces con D-MEM/FCS al 10%, se suspendieron en D-MEM/FCS al 10% y se tiñeron en hielo con el kit de tinción de células muertas para IR cercano LIVE/DEAD (R) Fixable (Thermo Fisher Scientific Inc., L34975) y un anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) ode control de isotipo. 1 hora más tarde, las células se lavaron tres veces con D-MEM/FCS al 10% y se analizó la tasa de expresión de CCR8 de ratón usando un citómetro de flujo (FACSCanto II).Se estableció un nivel de fondo usando el anticuerpo de control de isotipo, y se calculó la proporción de células positivas igual o mayor que el nivel de fondo y la fluorescencia mediana (Figura 28).Como resultado, no se observó diferencia en la mediana de la intensidad de fluorescencia de PE en ambas células y no se observaron las células positivas.En conclusión, estas células no eran reconocidas por el anticuerpo anti-CCR8 de ratón y se confirmó que no expresaban CCR8 de ratón ni retenían un epítopo reactivo con el anticuerpo.
[Ejemplo 19]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración de anticuerpos anti-CCR8 de ratón usando LM8 derivado de osteosarcoma
Se trasplantaron por vía intracutánea 3 x 105 células LM8 derivadas de osteosarcoma de ratón (50 pl) al lomo de cada ratón C3H/He (7 semanas de edad, macho). 3 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intraperitoneal 400 pg (400 pl) de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) (N = 11). Se administró un anticuerpo de control de isotipo a un control (N = 10). Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de 7 días después de la inoculación del tumor (4 días después de la administración del anticuerpo). El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 29). Como resultado, el volumen tumoral medio del grupo de administración de anti-mCCR8 en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo disminuyó significativamente en todos los tiempos de medición el día 18 posterior al trasplante o más tarde (nivel de significancia: *; P < 0,05 al día 18, **; P <0,01 los días 21, 24, 27 y 31, ***; P <0,001 el día 35). Además, los tumores desaparecieron en 6 de 11 ratones en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón y 1 de 10 ratones en el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo el día 31 posterior a la administración del anticuerpo. Había una diferencia significativa (P = 0,031) en la prueba de chi-cuadrado de Pearson realizada en relación con esta forma segregada.
[Ejemplo 20]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración de anticuerpos anti-CCR8 de ratón usando MethA derivado de fibrosarcoma cutáneo
Se trasplantaron por vía intracutánea 1 x 105 células MethA derivadas de fibrosarcoma cutáneo (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra). 3 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intraperitoneal 400 pg (400 pl) de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) (N = 5). Se administró un anticuerpo de control de isotipo a un control (N = 5). Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de 11 días después de la inoculación del tumor (8 días después de la administración del anticuerpo). El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 30).
Como resultado, el volumen tumoral medio del grupo de administración de anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpos de control de isotipo disminuyó significativamente en todos los tiempos de medición el día 11 posterior al trasplante o más tarde (nivel de significancia: *; P <0,05 en todos los tiempos de medición).Además, los tumores desaparecieron en 5 de 5 ratones en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón y en 0 de 5 ratones en el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo el día 21 posterior a la administración del anticuerpo. Había una diferencia significativa (P = 0,0016) en la prueba de chicuadrado de Pearson realizada en relación con esta forma segregada.
[Ejemplo 21]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración de anticuerpos anti-CCR8 de ratón usando EMT6 derivado del cáncer de mama
Se trasplantaron por vía intracutánea1 x 105 células EMT6 derivadas de cáncer de mama (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra). 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intraperitoneal 100 pg (100 pl) de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) (N = 20).Se administró un anticuerpo de control de isotipo a un control (N = 20).Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de los 4 días después de la inoculación del tumor (1 día después de la administración del anticuerpo).El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 31).
Como resultado, el volumen tumoral medio del grupo de administración de anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo disminuyó significativamente en todos los tiempos de medición el día 10 posterior al trasplante o más tarde (nivel de significancia: **; P <0,01 el día 10, ***; P <0,001 los días 14, 17 y 21).Además, los tumores desaparecieron en 19 de 20 ratones en el grupo de administración de anticuerpos anti-CCR8 de ratón y en 2 de 20 ratones en el grupo de administración de anticuerpo de control de isotipo el día 21 posterior a la administración del anticuerpo. Había una diferencia significativa (P <0,0001) en la prueba de chi-cuadrado de Pearson realizada en relación con esta forma segregada.
[Ejemplo 22]
Confirmación de la superioridad del anticuerpo anti-CCR8 de ratón sobre el anticuerpo anti-PD-1
Se trasplantaron por vía intracutánea2 x 105 células Colon26 derivadas de cáncer colorrectal (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra). 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, se les administró por vía intravenosa 400 pg (400 pl) de un anticuerpo de control de isotipo, un anticuerpo de rata anti-CCR8 ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) o un anticuerpo anti-PD-1 de ratón (RMP1-14, Bio X Cell) (N = 10).Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de los 3 días después de la inoculación del tumor.El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 32).Como resultado, el volumen tumoral del grupo de administración de anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de isotipo disminuyó significativamente los días 17, 20 y 24 (prueba no paramétrica de Steel: nivel de significancia P <0,05).No se observó diferencia significativa en el grupo de administración de anticuerpos anti-PD-1 en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de isotipo en cualquier tiempo de medición.
Los individuos ratones que portaban un tumor con un volumen de 1000 mm3 o mayor el día 24 posterior a la administración del anticuerpo eran 7 de 10 ratones en el grupo de administración de anticuerpo de isotipo, 2 de 10 ratones en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón, y 7 de 10 ratones en el grupo de administración de anti-PD-1.El grupo de administración de anti-CCR8 tenía una diferencia significativa tanto respecto al grupo de administración de anticuerpo de isotipo como al grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 en la prueba de chi-cuadrado de Pearson en relación con la forma segregada (P = 0,025 para ambos).En conclusión, se confirmó que la administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón produce un efecto terapéutico antitumoral en la línea celular de cáncer colorrectal Colon26.
Además, el volumen tumoral del grupo de administración de anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 de ratón disminuyó significativamentelos 20 y 24 días después de la inoculación del tumor (prueba no paramétrica de Steel-Dwass; nivel de significación P <0,05).En conclusión, se observó un efecto terapéutico antitumoral más fuerte en la línea celular colorrectal de ratón en el grupo de administración del anticuerpo anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración del anticuerpo anti-PD-1.
[Ejemplo 23]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración de anticuerpos anti-CCR8 de ratón usando la línea celular RAG derivada del cáncer de riñón
Se llevó a cabo un estudio similar usando una línea celular RAG derivada de cáncer de riñón de ratón. Se trasplantaron por vía intracutánea 4 x 105 células RAG derivadas de cáncer de riñón (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (8 semanas de edad, hembra). 6 días después de la inoculación del tumor, se les administraron por vía intraperitoneal 100 pg (100 pl) de un anticuerpo de control de isotipo (N = 10 excepto para N = 9 el día 21), un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (N = 10) (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) o un anticuerpo anti-PD-1 de ratón (N = 10) (RMP1-14, Bio X Cell). Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de los 6 días después de la inoculación del tumor. El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 33). Como resultado, el volumen tumoral del grupo de administración de anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de isotipo disminuyó significativamente a los 14, 17 y 21 días después de la inoculación del tumor (prueba no paramétrica de Steel: nivel de significancia P <0,05). No se observó diferencia significativa en el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de isotipo. En conclusión, se confirmó que la administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón produce un efecto terapéutico antitumoral en la línea celular de cáncer de riñón. Además, el volumen tumoral del grupo de administración de anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 de ratón disminuyó significativamente el día 14 posterior al trasplante (prueba no paramétrica de Steel-Dwass; nivel de significación P <0,05). En conclusión, se observó un efecto terapéutico antitumoral más fuerte en la línea celular de cáncer de riñón de ratón en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 de ratón.
[Ejemplo 24]
Análisis de la presencia o ausencia de respuesta inflamatoria en ratones que recibieron anti-CCR8 de ratón Se trasplantaron por vía intracutánea 2 x 105 células Colon26 derivadas de cáncer colorrectal (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra). 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, se les administraron por vía intravenosa 400 pg (400 pl) de un anticuerpo de rata anti-CD198 de ratón (CCR8) (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) o un anticuerpo de control de isotipo (LTF-2, Bio X Cell) (N = 10). El peso corporal y el peso de cada órgano de ratón (pulmón, hígado, bazo, intestino delgado y nódulo inguinal) se midieron el día 24 posterior al trasplante (Figura 34). Como resultado, como se muestra en la Figura 34, no se observó ninguna diferencia significativa en el peso corporal y el peso de cada órgano entre el grupo de administración de control (N = 10) y el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón (N = 10). A partir de estos resultados, se concluyó que la administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón no inducía ni una respuesta inflamatoria ni una enfermedad autoinmunitaria.
[Ejemplo 25]
Análisis de la expresión de CCR8 en diversas células infiltrantes de tumores clínicos
La expresión de CCR8 se analizó en células infiltrantes de tumores de cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer de cuerpo uterino, cáncer colorrectal y cáncer de pulmón humanos.El número de pacientes con los diversos tumores clínicos usados en el análisis de expresión era 12 pacientes con cáncer de riñón, 14 pacientes con cáncer de ovario, 21 pacientes con cáncer de cuerpo uterino, 10 pacientes con cáncer colorrectal y 4 pacientes con cáncer de pulmón.Se aislaron diversas células infiltrantes de tumores clínicos de la misma manera que en la Figura 1 del ejemplo 1 y se tiñeron con anticuerpos anti-CD45 (BioLegend, Inc., Clon H130) y anti-CCR8 (BioLegend, Inc., Clon L263G8), seguidos de medición por citometría de flujo (BD Biosciences, BD LSRFortessa).Se analizaron el recuento de células CCR8 positivas por peso tumoral y la relación de células CCR8 positivas a leucocitos CD45 positivos. La Tabla 2 muestra un recuento medio de células CCR8 positivas por peso tumoral y una desviación estándar del mismo.La Tabla 3 muestra una relación media de células CCR8 positivas a leucocitos CD45 positivos y una desviación estándar de las mismas.
[Tabla 2]
Figure imgf000023_0001
[Tabla 3]
Figure imgf000023_0002
En los diferentes tumores clínicos con el cáncer de riñón como referencia, en relación con el recuento de células CCR8 positivas por peso tumoral, el cáncer de ovario y el cáncer colorrectal presentaban una media más baja que el cáncer de riñón, y el cáncer de cuerpo uterino y el cáncer de pulmón presentaban una media más alta que la del cáncer de riñón. En cuanto a la relación de células CCR8 positivas a leucocitos CD45 positivos, el cáncer de ovario presentaba una media equivalente a la del cáncer de riñón, y el cáncer de pulmón presentaba una media más baja que la del cáncer de riñón. Además, el cáncer de cuerpo uterino y el cáncer colorrectal presentaban una media más alta que la del cáncer de riñón. La expresión de CCR8 se confirmó en las células infiltrantes de tumores de cáncer de ovario, cáncer de cuerpo uterino, cáncer colorrectal y cáncer de pulmón, además de las células infiltrantes de tumores de cáncer de riñón humano. Estos resultados indicaban la posibilidad de que en el cáncer de riñón, así como en el cáncer de ovario, cáncer de cuerpo uterino, cáncer colorrectal y cáncer de pulmón, las células infiltrantes de tumores CCR8 positivas puedan agotarse usando el anticuerpo específico anti-CCR8 humano.
[Ejemplo 26]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración combinada de anticuerpo anti-CCR8 de ratón y anticuerpo anti-PD-1 usando EMT6 derivadas de cáncer de mama
Se trasplantaron por vía intracutánea 1 x 105 células EMT6 derivadas de cáncer de mama (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (7 semanas de edad, hembra).
A un grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón solo, se le administraron por vía intravenosa 15 pg de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) se le administraron por vía intravenosa (100 pl) por 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, y se administraron 200 pg (100 pl) de un anticuerpo de control de isotipo a los 8 y 13 días después de la inoculación del tumor (N = 10). A un grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 solo, se le administraron por vía intravenosa 15 pg (100 pl) de un anticuerpo de control de isotipo 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, y se administraron por vía intravenosa 200 pg (100 pl) de un anticuerpo anti-PD-1 de ratón (RMP1-14, Bio X Cell) a los 8 y 13 días después de la inoculación del tumor (N = 10). A un grupo de administración combinada de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CCR8 de ratón, se le administraron por vía intravenosa 15 pg (100 pl) del anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, y se administraron por vía intravenosa 200 pg (100 pl) del anticuerpo anti-PD-1 a los 8 y 13 días después de la inoculación del tumor (N = 10). A un grupo de control, se le administraron por vía intravenosa 15 pg (100 pl) de un anticuerpo de control de isotipo 3 y 10 días después de la inoculación del tumor, y se administraron por vía intravenosa 100 pl de PBS a los 8 y 13 días después de la inoculación del tumor (N = 10). Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de los 3 días después de la inoculación del tumor (1 día después de la administración del anticuerpo). El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 35).
En la comparación del volumen tumoral medio entre los grupos de administración sola, el volumen tumoral medio era significativamente pequeño en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1, los días 10, 14, 17, 20, 23 y 27 (método de Dunnett, nivel de significación: P <0,05). Además, los tumores eran pequeños en el grupo de administración combinada en comparación con cada grupo de administración sola.
También se comparó una tasa de remisión completa de los tumores a los 17 y 27 días después de la inoculación del tumor.El día 17 posterior al trasplante, la remisión completa de los tumores se mostró en 0 de 10 ratones en el grupo de control y en el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 y en 1 de 10 ratones en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón, mientras que los tumores remitieron completamente en 6 de 10 ratones en el grupo de administración combinada de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CCR8 de ratón.El día 27 posterior al trasplante, la remisión completa de los tumores se mostró en 2 y 3 de 10 ratones en el grupo de control y en el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1, respectivamente, y en 7 de 10 ratones en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón, mientras que los tumores remitieron completamente en 9 de 10 ratones en el grupo de administración combinada de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CCR8 de ratón.
Se calculó además la proporción de individuos portadores de tumor mayor de 50 mm3 o menor (Figura 36). Los tumores mayores de 50 mm3 o menores en todos los individuos en el grupo de administración combinada de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CCR8 de ratón (100%) el día 17 posterior al trasplante y despuésera de 50 mm3 o menores hasta el día 27, mientras que la proporción era de 10% y 30% en el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 los días 17 y 27, respectivamente, y de 70% en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón los días tanto 17 como 27 después de la inoculación del tumor.
Estos resultados demostraban que el grupo de administración combinada requiere un tiempo corto para la regresión del tumor y tiene un fuerte efecto de regresión, en comparación con otros grupos de administración sola.
[Ejemplo 27]
Evaluación del efecto antitumoral de la administración combinada de anticuerpo anti-CCR8 de ratón y anticuerpo anti-PD-1 usando la línea celular RAG derivada del cáncer de riñón de ratón
Se trasplantaron por vía intracutánea 4,5 x 105 células RAG derivadas de cáncer de riñón (50 pl) al lomo de cada ratón Balb/c (6 semanas de edad, hembra). Las células RAG usadas eran células RAG (línea celular aclimatada) con eficiencia de injerto subcutáneo en ratón elevada por trasplante, de nuevo a un ratón, de un tumor injertado con éxito previamente por inoculación subcutánea a un ratón Balb/c y repitiendo esta operación dos veces.
A un grupo de administración de solo anticuerpos anti-PD-1, se le administraron por vía intravenosa 5C|jg (100 pl) de un anticuerpo anti-PD-1 (RMP1-14, Bio X Cell) 8 y 15 días después de la inoculación del tumor (N = 10). A un grupo de administración de solo anticuerpo anti-CCR8 de ratón, se le administraron por vía intravenosa 25 pg (100 pl) de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) 8 y 15 días después de la inoculación del tumor (N = 10). En un grupo de administración combinada de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CCR8 de ratón, se mezclaron (100 pl) 50 pg de un anticuerpo anti-PD-1 (RMP1-14, Bio X Cell) y 25 pg de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) y se administraron por vía intravenosa 8 y 15 días después de la inoculación del tumor (N = 10).A un grupo de control, se le administraron por vía intravenosa 100 pl de solución salina fisiológica 8 y 15 días después de la inoculación del tumor (N = 10).
Los volúmenes tumorales se midieron cada 3 a 4 días a partir de los 8 días después de la inoculación del tumor.El volumen tumoral (mm3) se calculó de acuerdo con eje mayor (mm) x eje menor (mm) x eje menor (mm)/2 (Figura 37).
Como resultado, se encontró que los tumores tenían un tamaño reducido en el grupo de administración combinada de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo anti-PD-1 o anticuerpo anti-CCR8 de ratón solos.
[Ejemplo 28]
Análisis de la especificidad del anticuerpo anti-CCR8 de ratón usando un ratón homocigoto para deficiencia del gen CCR8
Se trasplantaron por vía intracutánea 3 x 105 células Colon26 derivadas de cáncer colorrectal (50 pl) al lomo de cada ratón genéticamente intacto (N = 10) o de ratón homocigoto para deficiencia del gen CCR8 (N = 5) de linaje Balb/c.Al ratón genéticamente intacto, se le administraron por vía intravenosa 100 pg (100 pl) de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) o un anticuerpo de control de isotipo (LTF-2, Bio X Cell) 3 y 10 días después de la inoculación del tumor (N = 5).Al ratón homocigoto para deficiencia del gen CCR8, también se le administraron por vía intravenosa 100 pg (100 pl) de un anticuerpo de rata anti-CCR8 de ratón (clon SA214G2, BioLegend, Inc.) o un anticuerpo de control de isotipo (LTF-2, Bio X Cell) 3 y 10 días después de la inoculación del tumor (N = 5).Los tamaños de los tumores se midieron a partirdel día 7 posterior a la administración.
Como resultado, se observó una regresión tumoral significativa y una regresión tumoral completa final en todos los ratones genéticamente intactos por la administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón en comparación con la administración de anticuerpo de control de isotipo.Por otro lado, no se observaron cambios en el volumen tumoral ni en la regresión tumoral en los ratones homocigotos para deficiencia del gen CCR8 en el grupo de administración de anticuerpo anti-CCR8 de ratón en comparación con el grupo de administración de anticuerpo de isotipo (Figura 38). El efecto antitumoral del anticuerpo anti-CCR8 de ratón desapareció completamente en los ratones homocigotos para deficiencia del gen CCR8, demostrando que el anticuerpo anti-CCR8 de ratón (SA214G2) usado ejerce un efecto antitumoral a través de CCR8.
[Aplicabilidad industrial]
El anticuerpo contra CCR8 de la presente invención tiene el efecto de activar la inmunidad al disminuir el número de células Treg infiltrantes de tumores o similares y, por lo tanto, es farmacéuticamente útil para el tratamiento de cánceres.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo contra CCR8 que tiene actividad ADCC, para usar en un método de tratamiento de un cáncer, en donde el anticuerpo contra CCR8 es opcionalmente un anticuerpo neutralizante de CCR8.
2. El anticuerpo para usar según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo contra CCR8 tiene un efecto de agotamiento de las células Treg infiltrantes de tumores.
3. El anticuerpo para usar según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo contra CCR8 tiene un efecto de agotamiento de las células macrófagos infiltrantes de tumores.
4. El anticuerpo para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es para usar en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1.
5. Un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1 para usar en combinación con un anticuerpo contra CCR8 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un método de tratamiento de un cáncer.
6. Una combinación de un anticuerpo contra CCR8 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-L1, para usar en un método de tratamiento de un cáncer.
7. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 4, o el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 5, o la combinación para usar según la reivindicación 6, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab o pembrolizumab o el anticuerpo anti-PD-L1 es atezolizumab, avelumab o durvalumab.
8. El anticuerpo contra CCR8 para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y 7, o el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 5 o reivindicación 7, o la combinación para usar según la reivindicación 6 o 7, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de bazo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de riñón, linfoma no Hodgkin, cáncer urotelial, sarcoma, cáncer de células sanguíneas tal como leucemia o linfoma, carcinoma de vías biliares, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de tiroides, carcinoma testicular, carcinoma tímico o hepatocarcinoma.
9. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de riñón y sarcoma.
10. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de riñón y sarcoma.
11. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de mama.
12. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de cuerpo uterino.
13. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de ovario.
14. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de pulmón.
15. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer colorrectal.
16. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es cáncer de riñón.
17. El anticuerpo contra CCR8 para usar según la reivindicación 8, el anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1 para usar según la reivindicación 8 o la combinación para usar según la reivindicación 8, en donde el cáncer es sarcoma.
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