CN110573180A - 癌症治疗用药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种癌症治疗用药物组合物，其含有针对CCR8的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及含有针对CCR8的抗体的癌症治疗用药物组合物。
背景技术
以肿瘤微环境中的调节性T细胞(Treg细胞)所介导的免疫抑制为代表的强的负调控机制，对于肿瘤的治疗而言为巨大的障碍(非专利文献1)。
例如，浸润到肿瘤的CD4阳性Treg细胞可能会强烈抑制抗肿瘤免疫应答，会成为有效的癌症治疗的巨大障碍。
CD4阳性FoxP3阳性Treg细胞所介导的肿瘤免疫抑制已经在动物肿瘤模型中得到充分证明，有报道指出：通过除去包括肿瘤内在内的全身性Treg细胞可得到抗肿瘤效果，另一方面，在除去50％左右的肿瘤内浸润性Treg细胞的情况下未观察到效果(非专利文献2)。
关于人类，有报道指出：在以肺、乳房和卵巢肿瘤为代表的各种癌症患者的肿瘤内检测到总CD4阳性T细胞群中的CD4阳性CD25阳性Treg细胞比例(包含Treg细胞的细胞群)增大，丰度比与患者存活率呈负相关(非专利文献3～8)。
通过利用抗CD25抗体从肿瘤内除去CD4阳性CD25阳性Treg细胞，确认到抗肿瘤效果。但是，由于CD25也在CD4阳性CD25阳性Treg细胞和新被活化的效应T细胞的细胞表面表达，因此不能说是特异性地除去Treg细胞。另外，在小鼠中，给药抗CD25抗体所带来的抗肿瘤效果有上限，已经通过各种肿瘤模型证明：仅在肿瘤移植前给药抗体的情况下显示治疗效果，而肿瘤在小鼠中定植后给药抗体的情况下几乎无治疗效果。在移植后第1天开始给药抗CD25抗体的情况下，抗肿瘤效果会减弱，在移植后第2天以后开始给药的情况下则几乎观察不到抗肿瘤效果(非专利文献9)。
到目前为止，虽然已经实施为了除去Treg细胞而对小鼠给药抗体的药效试验，但几乎没有显示抗肿瘤效果的报道，因此移植前给药抗体而除去Treg细胞、从而产生抗肿瘤治疗效果这一点非常难确认(非专利文献10)。
CCR8是也被称为CY6、CKR-L1或TER1的在胸腺、脾脏等中表达的G蛋白偶联型7次跨膜型CC趋化因子受体蛋白，在人染色体的情况下，其基因存在于3p21。人CCR8由355个氨基酸形成(非专利文献11)。作为对于CCR8的内源性配体，已知有CCL1(非专利文献12)。人CCR8cDNA由Genbank ACC No.M_005201.3所示的碱基序列构成，小鼠CCR8cDNA由GenbankACC No.NM_007720.2所示的碱基序列构成。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Nat.Rev.Immunol.、2006年、第6卷、第4号、p.295-307
非专利文献2:Eur.J.Immunol.、2010年、第40卷、p.3325-3335
非专利文献3:J.Clin.Oncol.、2006年、第24卷,p.5373-5380
非专利文献4:Nat.Med.、2004年、第10卷,p.942-949
非专利文献5:J.Clin.Oncol.、2007年、第25卷,p.2586-2593
非专利文献6:Cancer、2006年、第107卷,p.2866-2872
非专利文献7:Eur.J.Cancer、2008年、第44卷,p.1875-1882
非专利文献8:Cell.Mol.Immunol.2011年、第8卷,p.59-66
非专利文献9:Cancer Res.、1999年Jul 1；第59卷、第13号、p.3128-33
非专利文献10:Cancer Res.、2010年、第70卷、第7号、p.2665-74
非专利文献11:J.Immunol.、1996年、第157卷、第7号、p.2759-63
非专利文献12:J.Biol.Chem.、1997年、第272卷、第28号、p.17251-4
发明内容
发明要解决的课题
本发明所要解决的课题是通过抑制由Treg细胞等介导的免疫抑制而激活免疫，提供基于该机制的用于癌症治疗的药物组合物。
用于解决课题的手段
本发明人进行了深入研究，结果发现，肿瘤内浸润性Treg细胞和肿瘤内浸润性巨噬细胞特异性表达CCR8，通过给药针对CCR8的抗体，肿瘤内浸润性Treg细胞和肿瘤内浸润性巨噬细胞的细胞数减少、肿瘤的增殖得到抑制，从而完成了本发明。
即，本发明涉及：
(1)一种癌症治疗用药物组合物，其含有针对CCR8的抗体；
(2)根据(1)所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体具有ADCC活性的抗体；
(3)根据(1)或(2)中任一项所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体为CCR8的中和用抗体；
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性Treg细胞的作用；
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性巨噬细胞的作用；
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的药物组合物，其中，癌症为乳腺癌、结直肠癌、肾癌或肉瘤；
(7)一种用于癌症治疗的药物，其组合有针对CCR8的抗体和抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体；
(8)一种癌症的治疗方法，其特征在于，给药(1)～(5)中任一项所述的针对CCR8的抗体；
(8-1)一种癌症的治疗方法，其特征在于，给药针对CCR8的抗体；
(8-2)根据(8-1)所述的治疗方法，其中，针对CCR8的抗体具有ADCC活性的抗体；
(8-3)根据(8-1)或(8-2)所述的治疗方法，其中，针对CCR8的抗体为CCR8的中和抗体；
(8-4)根据(8-1)～(8-3)所述的治疗方法，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性Treg细胞的作用；
(8-5)根据(8-1)～(8-4)所述的治疗方法，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性巨噬细胞的作用；
(8-6)根据(8-1)～(8-5)所述的治疗方法，其中，癌症为乳腺癌、结直肠癌、肾癌或肉瘤；
(8-7)根据(8-1)～(8-6)所述的治疗方法，其特征在于，进一步给药抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体；
(9)根据(1)～(5)中任一项所述的针对CCR8的抗体，其用于治疗癌症；
(9-1)一种针对CCR8的抗体，其用于治疗癌症；
(9-2)根据(9-1)所述的针对CCR8的抗体，其中，针对CCR8的抗体为具有ADCC活性的抗体；
(9-3)根据(9-1)～(9-2)所述的针对CCR8的抗体，其中，针对CCR8的抗体为CCR8的中和抗体；
(9-4)根据(9-1)～(9-3)所述的针对CCR8的抗体，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性Treg细胞的作用；
(9-5)根据(9-1)～(9-4)所述的针对CCR8的抗体，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性巨噬细胞的作用；
(9-6)根据(9-1)～(9-5)所述的针对CCR8的抗体，其中，癌症为乳腺癌、结直肠癌、肾癌或肉瘤；
(9-7)一种(9-1)～(9-6)所述的针对CCR8的抗体与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的组合，其用于治疗癌症。
发明的效果
本发明的包含抗体的药物组合物作为用于治疗癌症的药物非常有用。
附图说明
图1：是肾癌肿瘤内浸润性CD3+CD4+T细胞的FACS分析。将CD25分子和FoxP3分子用抗体染色并评价表达率。表明CD25表达细胞也表达FoxP3。
图2：对同一患者的外周血单核细胞(以下记作PBMC。)中的CD45RA和CD25表达强度示出流式细胞术分析结果。关于CD3+CD4+T细胞，用CD45RA和CD25表达量如图示那样分为6级(Fr1～Fr6)，分别用分选仪回收细胞。数值为各级分的细胞存在比率(％)。此时的Treg级分为Fr1和Fr2。
图3：对肾癌肿瘤内浸润性细胞的CD45RA和CD25表达强度示出流式细胞术分析结果。将肿瘤内浸润性CD3+CD4+T细胞用CD45RA和CD25表达量如图示那样分为4级(Fr2～Fr5)，分别用分选仪回收细胞。数值为各级分的细胞存在比率(％)。
图4：示出进行图2、图3的各级分的细胞的RNA-Seq分析、通过作为Treg特异性表达基因的FoxP3和IKZF2的mRNA表达量来研究各级分中的任一者是否包含Treg细胞的结果。纵轴表示归一化后的相对mRNA表达量。在Fr2和Fr3中，观察到两基因均在在肿瘤内强表达。在效应细胞内表达的IL-2、IFNγ，则在Fr4和Fr5中观察到强表达。
图5：示出各级分中的FoxP3基因座的Treg特异性去甲基化区域(chrX,49118000-49118500,hg19)的分析结果。获知肿瘤内浸润性CD3+CD4+T细胞的Fr2和Fr3级分中大多是Treg细胞。
图6：与图4同样地示出各级分的CCR8的mRNA表达量的分析结果。在作为肿瘤内浸润性Treg细胞级分的Fr2和Fr3中显示强烈的CCR8表达，与此相对地，外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell；PBMC)中的Treg细胞中几乎观察不到表达。
图7：示出表达小鼠CCR8的HEK293细胞的流式细胞术分析结果。将整合有小鼠CCR8基因的pcDNA3.4表达载体导入HEK293细胞，用G418进行药剂选择。关于小鼠CCR8的表达程度，用PE标记抗小鼠CCR8抗体确认表达。将导入pcDNA3.4载体并且同样进行了药剂选择的HEK293细胞作为阴性对照。表明几乎所有细胞均表达小鼠CCR8。
图8：示出抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)具有活化抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)所需的信号转导通路的能力。
图9：示出抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)具有ADCC活性。
图10：示出抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)具有抑制由CCR8介导的细胞内钙流入的活性。使用同型对照抗体作为阴性对照。
图11：示出抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)不识别CT26细胞。使用同型对照抗体作为阴性对照。
图12：示出如下操作的结果：对3例移植了小鼠结直肠癌细胞株CT26细胞的BALB/c小鼠在移植后第3天(day3)给药对照抗体，在给药后第4天或第7天摘出肿瘤，用流式细胞仪分析其中存在的Treg细胞率。
图13：示出在与图12相同的实验中用流式细胞仪分析CCR8+Treg细胞率的结果。
图14：示出用流式细胞仪分析肿瘤内CD11b+Gr1+CD206+M2型巨噬细胞中的CCR8阳性细胞率的图。表明在任一情况下40-50％的细胞为CCR8阳性M2型巨噬细胞。
图15：示出下述实验的流程：对移植了结直肠癌细胞株CT26细胞的BALB/c小鼠，在移植后第3天(day3)给药抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体，在移植后第7天或第10天摘出肿瘤，检测其中存在的T淋巴细胞和巨噬细胞的存在率。
图16：示出移植后第7天(d7)或第10天(d10)的CD45+CD4+细胞中的CD25+FoxP3+细胞比率。
图17：示出移植后第7天(d7)的CD11b+F4/80+巨噬细胞的比率。
图18：示出移植后第7天(d7)的IA/IE阳性(IA/IE+)或IA/IE阴性细胞(IA/IE-)的存在比率。
图19：示出下述实验的流程：对移植了结直肠癌细胞株CT26细胞的BALB/c小鼠，在移植后第3天(d3)以400μg/小鼠单次给药抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体(大鼠抗KLH)，移植7天后(d7)每隔3-4天测定肿瘤直径，直至21天(d21)后。
图20：示出测定移植后的各个体的实体瘤直径并计算肿瘤体积的结果。
图21：是各组小鼠的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。同时示出标准偏差。显著水平＊＊＊表示p<0.001，显著水平＊＊表示p<0.01(t-test)。
图22：将2×105个结直肠癌细胞株Colon26细胞移植到BALB/c小鼠背部皮内，在移植后第3天(d3)以400μg/小鼠单次给药抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体。移植3天后(d3)每隔3-4天测定肿瘤体积，至18天(d18)后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。
图23：图中示出各个FACS分析的荧光强度的平均值(MFI)，中央横线表示14例的MFI值的平均值，竖线表示标准偏差。显著水平＊＊＊表示P<0.001。
图24：是对于14例人肾癌肿瘤内的CD3+CD4+FoxP3+T细胞或CD3+CD4+FoxP3-T细胞按照个体标绘显示出同型对照抗体的背景水平以上的CCR8阳性信号的细胞的比率(阳性率％)而成的图。中央横线表示14例的阳性率的平均值，竖线表示标准偏差。
图25：基于利用癌基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据的透明细胞肾细胞癌患者的肿瘤内细胞的CCR8的mRNA表达量平均分成高表达组(High)、低表达组(Low)两组、示出关于上述各组的存活率的卡普兰-迈耶曲线。纵轴表示存活率，横轴表示月数。数值为各组的个体数。P值表示对数秩检验值。
图26：为通过与图25相同的方法对前列腺癌患者进行分析的结果。
图27：为通过与图25相同的方法对膀胱癌患者进行分析的结果。
图28：与图11同样地示出抗小鼠CCR8抗体不识别MethA细胞和LM8细胞。使用同型对照抗体(Isotype)作为阴性对照。
图29：将3×105个骨肉瘤细胞株LM8细胞移植到C3H/He小鼠背部皮内，移植后第3天(d3)以400μg/小鼠单次给药抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体(对照抗体)。移植7天后起每隔3～4天测定肿瘤体积，至35天后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。同时示出标准偏差。显著水平＊＊＊表示p<0.001，显著水平＊＊表示p<0.01，显著水平＊表示p<0.05(t-test)。
图30：将1×105个MethA细胞移植到Balb/c小鼠背部皮内，在移植后第3天以400μg/小鼠单次给药抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体(对照抗体)。移植11天后起每隔3～4天测定肿瘤体积，至21天后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。显著水平＊表示p<0.05(t-test)。
图31：将1×105个乳腺癌细胞株EMT6细胞移植到Balb/c小鼠背部皮内，在移植后第3天和第10天以100μg/小鼠给药抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体。移植4天后起每隔3-4天测定肿瘤体积，至22天后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。显著水平＊＊＊表示p<0.001，显著水平＊＊表示p<0.01(t-test)。
图32：将2×105个结直肠癌细胞株Colon26细胞移植到BALB/c小鼠背部皮内，在移植后第3天和第10天以400μg/小鼠给药抗同型对照抗体(Isotpe抗体)、小鼠CCR8抗体(SA214G2)或抗PD-1抗体(RMP1-14)。移植3天后起每隔3～4天测定肿瘤体积，至24天后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。
图33：将4×105个小鼠肾癌来源细胞株RAG移植到BALB/c小鼠背部皮内，在肿瘤移植6天后，将同型对照抗体、抗小鼠CCR8抗体或抗小鼠PD-1抗体(抗PD-1抗体)静脉内给药100μg(100μL)，移植6天后起每隔3～4天测定肿瘤体积，至21天后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。
图34：将2×105个结直肠癌细胞株Colon26细胞移植到BALB/c小鼠背部皮内，在移植后第3天和第10天以400μg/小鼠给药抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体(对照抗体)。移植24天后，回收小鼠各脏器并测定其重量。示出各10例的平均值。
图35：将1×105个小鼠乳腺癌细胞株EMT6细胞移植到BALB/c小鼠背部皮内，对于抗小鼠CCR8抗体，在移植后第3天和第10天进行静脉内给药，对于抗小鼠PD-1抗体，在移植后第8天目和第13天进行静脉内给药。对照组在移植3天后和10天后静脉内给药同型对照抗体。移植6天后起每隔3～4天测定肿瘤体积，至27天后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。
图36：示出与图35相同的实验中的、各组的移植后各时点的肿瘤萎缩到50mm3以下的个体的比例。
图37：将4.5×105个小鼠肾癌来源细胞株RAG移植到BALB/c小鼠背部皮内，在肿瘤移植8天后和15天后静脉内给药100μL的生理盐水、抗小鼠CCR8抗体、抗小鼠PD-1抗体或抗小鼠CCR8抗体和抗小鼠PD-1抗体，移植8天后起每隔3～4天测定肿瘤体积，至33天后。示出各组的移植后各时点的肿瘤体积的中位值。
图38：在Balb/c品系的野生型小鼠和纯合型CCR8基因缺陷小鼠的背部皮内移植2×105个CT26细胞(N＝5)，移植后静脉内给药同型对照抗体或抗小鼠CCR8抗体。移植后每隔3～4天测定肿瘤体积。左图示出关于野生型小鼠的各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值，右图示出关于纯合型CCR8基因缺陷小鼠的各组的移植后各时点的肿瘤体积的平均值。
具体实施方式
本发明的药物组合物的特征在于，含有针对CCR8的抗体。
本发明的CCR8包括来源为小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、狗、猪、猴、包含人在内的灵长类的哺乳动物的CCR8。优选为人CCR8。
针对CCR8的抗体只要是与CCR8结合的抗体即可，可以是人来源抗体、小鼠来源抗体、大鼠来源抗体、兔来源抗体或山羊来源抗体中的任一者，进一步地可以是它们的多克隆抗体、单克隆，可以是完整抗体、抗体片段(例如F(ab’)2、Fab’、Fab或Fv片段)、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体中的任一者。优选为人来源抗体、人源化抗体或全人抗体。
本发明的抗体可以以CCR8的全长蛋白或部分蛋白为抗原按照公知的抗体或抗血清的制造方法制造。需要说明的是，由于期望本发明的抗体与在细胞表面上表达的CCR8结合，因此期望部分蛋白为CCR8的胞外区域。这些抗原可以通过公知的蛋白质表达以及纯化方法来制备。
除了上述以外，作为适合于制作针对CCR8的抗体的抗原，可列举例如：利用表达载体等强制表达CCR8的细胞、CCR8表达质粒载体、CCR8表达病毒载体等(腺病毒载体等)。
多克隆抗体可以利用公知的方法来制造。例如可以如下制造：用抗原蛋白或其与载体蛋白的混合物对合适的动物进行免疫，由该免疫动物采集含有针对抗原蛋白的抗体的成分，进行抗体的分离纯化，从而制造。作为所使用的动物，通常可列举小鼠、大鼠、绵羊、山羊、兔、天竺鼠。为了提高抗体产生能力，可以将弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂与抗原蛋白一起给药。一般情况下，通常约每2周给药1次，进行总计约3～10次左右。可以从用上述方法免疫后的动物的血液、腹水等中采集多克隆抗体。关于抗血清中的多克隆抗体效价的测定，可以利用ELISA法来测定。多克隆抗体的分离纯化可以通过例如下述免疫球蛋白的分离纯化方法进行：使用抗原结合固相或蛋白A或蛋白G等活性吸附剂的纯化方法；盐析法；醇沉淀法；等电点沉淀法；电泳法；利用离子交换体的吸附脱附法；超离心法；凝胶过滤法等。
单克隆抗体可以利用已知的常规制造方法来制备。具体而言，将本发明的抗原根据需要与弗氏佐剂一起向哺乳动物、优选为小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠或兔的皮下内、肌肉内、静脉内、足跖内或腹腔内注射1至数次而实施免疫致敏。通常，从首次免疫起，每隔约1～21天进行1～4次免疫，在最终免疫起约1～10天后，可以从免疫致敏后的哺乳动物中取得抗体产生细胞。免疫实施次数和时间间隔可根据所使用的免疫原的性质等适当变更。
分泌单克隆抗体的杂交瘤的制备可以按照Kohler和Milstein的方法(Nature、1975、vol.256、p495～497)和基于该方法的方法进行。即，通过使由如上述那样免疫致敏后的哺乳动物取得的脾脏、淋巴结、骨髓或扁桃体等、优选脾脏所含的抗体产生细胞与优选小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、兔或人等哺乳动物、更优选为小鼠、大鼠或人来源的无自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合，从而可以制备杂交瘤。
作为细胞融合中使用的骨髓瘤细胞，通常可以使用由小鼠得到的细胞系化细胞，例如P3-U1、NS-1、SP-2、653、X63、AP-1等。
产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选如下进行：将杂交瘤在例如微量滴定板中培养，利用RIA、ELISA、FACS等测定方法测定观察到增殖的孔的培养上清对用于上述小鼠免疫致敏的本发明的抗原的反应性，选择产生与该抗原或半抗原显示特异性结合的单克隆抗体的克隆。并且通常使用下述方法：将抗原固相化，对于与其结合的培养上清中的抗体，使用用放射性物质、荧光物质、酶等标记的二抗进行检测。另外，在使用抗原表达细胞时，可以向该细胞添加杂交瘤培养上清，然后使用荧光标记的二抗进行反应，然后用流式细胞仪等荧光检测装置测定该细胞的荧光强度，从而检测该细胞膜上的本发明的能与抗原结合的单克隆抗体。
关于由所选择的杂交瘤制造单克隆抗体，可以如下进行：离体培养杂交瘤或在小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠或兔等、优选为小鼠或大鼠、更优选为小鼠的腹水等中培养杂交瘤，从得到的培养上清或哺乳动物的腹水中分离。在离体培养的情况下，可以根据所培养的细胞种类的特性、试验研究的目的和培养方法等各种条件，使用用于进行杂交瘤的增殖、维持和保存且在培养上清中产生单克隆抗体的已知营养培养基或由已知的基本培养基诱导制备的所有营养培养基来实施。
作为基本培养基，可列举例如Ham’F12培养基、MCDB153培养基或低钙MEM培养基等低钙培养基以及MCDB104培养基、MEM培养基、D-MEM培养基、RPMI1640培养基、ASF104培养基或RD培养基等高钙培养基等，该基本培养基可以根据目的而含有例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。
单克隆抗体的分离、纯化可以通过将上述培养上清或腹水供于饱和硫酸铵、离子交换色谱(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱等亲和柱色谱等来进行。
作为本发明的抗体，可以使用重组型抗体，所述重组型抗体是从抗体产生细胞、例如杂交瘤克隆抗体基因并整合到合适的载体、将载体导入宿主而使用基因重组技术产生的(例如Carl等、THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES、1990年发行)。
具体而言，从对产生目标抗体的杂交瘤、产生抗体的免疫细胞、例如致敏淋巴细胞等通过癌基因进行等永生化的细胞中分离编码抗体的可变区(V区)的mRNA。关于mRNA的分离，可以利用公知的方法、例如胍超离心法(Chirgwin、J.M.等、Biochemistry(1979)18、5294-5299)等制备总RNA，使用mRNA Purification Kit(Pharmacia Inc.制)等制备mRNA。
由得到的mRNA，利用逆转录酶合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可以使用AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等进行。另外，在进行cDNA的合成和扩增时，可以使用利用5’-Ampli FINDER RACEKit(Clontech Laboratories,Inc制)和PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988年、第85卷、8998页等)。从得到的PCR产物中纯化目标DNA片段，与载体DNA连接。进一步由此制作重组载体，导入大肠杆菌等中，选择菌落而制备期望的重组载体。可以利用公知的方法、例如脱氧法(deoxy method)对目标DNA的碱基序列进行确认。
如果得到编码目标抗体的V区的DNA，则将其与编码期望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，将其整合到表达载体中。或者，可以将编码抗体的V区的DNA整合到包含抗体C区的DNA的表达载体中。为了制造本发明中使用的抗体，可以按照使抗体基因在表达控制区、例如增强子/启动子的控制下表达的方式整合到表达载体中。然后，利用该表达载体转化宿主细胞，可以使抗体表达。
关于抗体基因的表达，可以将抗体的重链(H链)或轻链(L链)分别整合到表达载体中并同时转化宿主，或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合到一个表达载体中并转化宿主(参照WO94/11523)。
作为上述以外的本发明抗体的制作方法，还可以使用所谓的噬菌体展示技术(Nature Biotechnology 23，1105(2005))。具体而言，例如可以使以人或动物(例如兔、小鼠、大鼠、仓鼠等)的B淋巴细胞为材料利用公知的方法制作的抗体基因文库、或者从人或动物的种系序列中筛选和改造后进行全合成的抗体基因文库展示在噬菌体、大肠杆菌、酵母、动物细胞等的细胞表面、脂质体上等。此时，作为展示在细胞表面的抗体的形态，可列举IgG分子、IgM分子、Fab片段、单链Fv(scFv)片段等。
将如此得到的抗体片段基因利用公知的方法与IgG抗体基因的对应区域进行替换，可以得到抗体基因。然后将如此得到的基因整合到合适的载体中，将其导入宿主，使用基因重组技术则可以产生抗体(例如Carl等、THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES、1990年发行)。
本发明的抗体包括出于降低对人的异种抗原性等目的而人工改造后的抗体，例如嵌合化抗体、人源化抗体、全人抗体等。
本发明的抗体可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素、糖链等各种分子结合而成的缀合抗体。这样的缀合抗体可以通过对得到的抗体实施化学修饰来得到。需要说明的是，本领域中，已经建立了抗体的修饰方法。本发明的抗体中也包含这些缀合抗体。
本发明的抗体中，还包括在抗体的Fc区连接有N-糖苷结合糖链、在该N-糖苷结合糖链的还原末端的N-乙酰基葡糖胺上未连接岩藻糖的抗体。作为在抗体的Fc区连接有N-糖苷结合糖链、在该N-糖苷结合糖链的还原末端的N-乙酰基葡糖胺未连接岩藻糖的抗体，可列举例如使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺损的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)制作的抗体。在抗体的Fc区连接有N-糖苷结合糖链、在该N-糖苷结合糖链的还原末端的N-乙酰基葡糖胺上未连接岩藻糖的本发明的抗体具有高ADCC活性。
另外，本发明的抗体的N末端或C末端可以融合有其它蛋白(Clinical CancerResearch，2004，10，1274-1281)。所融合的蛋白可以由本领域技术人员适当选择。
抗体片段是指：作为上述本发明的抗体的一部分的、与该抗体同样具有CCR8特异结合性的片段。抗体片段具体可列举Fab、F(ab')2、Fab'、单链抗体(scFv)、二硫键稳定型抗体(dsFv)、二聚体V区片段(Diabody)、包含CDR的肽等(Expert Opinion on TherapeuticPatents、第6卷、第5号、第441～456页、1996年)。
另外，本发明的抗体可以是具有2个不同的抗原决定簇、与不同的抗原结合的双特异性抗体(bispecific抗体)。
ADCC(Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性是指：在生物体内，结合于肿瘤细胞等的细胞表面抗原等的抗体通过抗体的Fc区与存在于效应细胞表面上的Fc受体的结合而活化效应细胞、杀伤肿瘤细胞等的活性。作为效应细胞，可列举天然杀伤细胞、活化的巨噬细胞等。
另外，从可以除去Treg细胞或巨噬细胞的角度出发，本发明的抗体优选对表达CCR8的细胞具有ADCC活性的抗体。关于本发明的抗体是否具有这样的ADCC活性这一点，例如可以利用后述的实施例中记载的方法来测定。
从抑制Treg细胞或巨噬细胞在肿瘤内聚集的观点出发，本发明的药物组合物中所含的针对CCR8的抗体优选为CCR8的中和抗体。CCR8的中和抗体是指具有针对CCR8的中和活性的抗体。关于是否具有针对CCR8的中和活性这一点，可以通过测定是否抑制CCL1对CCR8的生理作用来判定。作为例子，并不限定于这些，可列举测定CCL1与CCR8的结合、或者CCL1所致的CCR8表达细胞迁移或细胞内Ca++增加或对CCL1刺激具有感受性的基因的表达变动等。另外，也可以利用后述的实施例中记载的方法来测定。
本发明的针对CCR8的抗体优选具有除去肿瘤内浸润性Treg细胞的作用。关于本发明的抗体是否具有除去肿瘤内浸润性Treg细胞的作用这一点，可以利用例如后述的实施例中记载的方法来测定。
本发明的针对CCR8的抗体优选具有除去肿瘤内浸润性巨噬细胞的作用。关于本发明的抗体是否具有除去肿瘤内浸润性巨噬细胞的作用这一点，可以利用例如后述的实施例中记载的方法来测定。
本发明的抗体作为药物组合物是有用的。因此，可以将包含本发明的抗体的药物组合物经口或非经口地全身或局部给药。作为非经口给药，可选择例如点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内给药、吸入等。
本发明的“癌症治疗用药物组合物”中的“癌症”包括所有的实体癌和血液癌。具体而言，可列举乳腺癌、子宫体癌、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、肾癌、非霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、肉瘤、血细胞癌(白血病、淋巴瘤等)、胆管癌、胆囊癌、甲状腺癌、前列腺癌、睾丸癌、胸腺癌、肝脏癌等。优选为乳腺癌、子宫体癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、肾癌、肉瘤，更优选为乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肉瘤。
另外，本发明的“癌症治疗用药物组合物”中的“癌症”优选为表达肿瘤特异抗原的癌症。
需要说明的是，本说明书中记载的“癌症”不仅包含卵巢癌、胃癌等上皮性恶性肿瘤，还指包含慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤等造血系统癌症在内的非上皮性恶性肿瘤，在本说明书中，“癌症(cancer)”、“癌(carcinoma)”、“肿瘤(tumor)”、“新生物(neoplasm)”等术语彼此无差别，可相互替换。
出于下述的目的，本发明的针对CCR8的抗体可以与其它药剂组合以联用剂形式给药：
(1)补充和/或增强本发明的药物组合物的治疗效果、
(2)本发明的药物组合物的药代动力学、吸收的改善、给药量的降低和/或、
(3)减轻本发明的药物组合物的副作用。
本发明的针对CCR8的抗体与其它药剂的联用剂可以以在1个制剂中配合有两成分的配合剂的方式给药，也可以采取制成不同的制剂而给药的方式。在所述制成不同的制剂而给药的情况下，包括同时给药和不同时给药。另外，不同时给药可以是先给药本发明抗体、后给药其它药剂，也可以是先给药其它药剂、后给药本发明化合物，各自的给药方法可以相同或不同。
作为可以与本发明的针对CCR8的抗体组合使用的其它药剂，可列举例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体。优选抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体，更优选抗PD-1抗体。
在本发明中，作为抗PD-1抗体，可列举例如纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)。
在本发明中，作为抗PD-L1抗体，可列举例如阿特朱(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)。
本发明中，作为抗CTLA-4抗体，可列举例如伊只单抗(Ipilimumab)。
本发明的药物组合物的对象患者设定为癌症患者或疑似癌症患者。有效给药量可从每次每千克体重0.01mg至100mg的范围中选择。或者，可以选择每位患者5～5000mg、优选为10～500mg的给药量。但是，包含本发明的抗体或其抗体片段的药物组合物不限于这些给药量。另外，给药期可以根据患者的年龄、症状适当选择。本发明的药物组合物根据给药途径而可一起包含药物学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体和添加物的例子，可列举水、药物学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、酪蛋白、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、允许作为药物添加物的表面活性剂等。所使用的添加物根据剂型从上述中适当选择或组合选择，但不限于这些。
以下示出实施例来具体说明本发明，但本发明不受下述实施例限制。需要说明的是，作为基因操作的方法，只要没有特别声明则使用Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory)中记载的方法。
实施例1
肾癌肿瘤内浸润性细胞和PBMC的提取和分析
使用从术前未进行抗癌剂、放射线等的治疗的透明细胞肾细胞癌(clear cellrenal cell carcinoma；ccRCC)患者(3例)中通过手术摘出的原发肿瘤组织的一部分，进行以下的分析。测定肿瘤重量后，将肿瘤块用剪刀切割成2mm见方，使用Tumor DissociationKit,human(130-095-929,Miltenyi)和gentleMACS(TM)Dissociator(Miltenyi,130-093-235)按照试剂盒的附带规程制作肿瘤组织的匀浆。使匀浆通过70um的细胞过滤器，进行溶血处理后，用30％Percoll/PBS溶液除去碎片和死细胞，得到肿瘤组织单细胞。
从外周血中，利用使用Ficoll-paque PLUS(GE Healthcare公司)的密度梯度离心法分取同一患者的外周血单核细胞(PBMC)。对所分离的肿瘤内细胞和PBMC计测细胞数后，将Human TruStain FcX(TM)(BioLegend,422-301)和Zombie NIRTM Fixable Viabilitykit(BioLegend,423105)按照附带规程处理，在冰中染色30分钟。然后，用2％FCS/HEPES/HBSS清洗1次后，用以下的标记抗体按照标记抗体附带规程染色。
对于肿瘤内浸润性细胞，使用抗CD3抗体(BioLegend,Clone UCHT1)、抗CD4抗体(BioLegend,Clone OKT4)、抗CD25抗体(BioLegend,Clone BC96)在冰中反应30分钟而进行细胞表面的染色。用2％FCS/HEPES/HBSS清洗2次后，使用Foxp3/Transcription FactorStaining Buffer Set(eBioscience,00-5523-00)按照试剂盒附带规程将细胞固定，进行膜透明处置。进一步用PE标记抗FoxP3抗体(eBioscience,Clone PCH010)对FoxP3进行染色。用试剂盒附带的清洗液清洗1次后，通过流式细胞术(BD Biosciences,BDLSRFortessa)进行分析。确认在ccRCC肿瘤中CD4+CD25+T细胞几乎全部表达作为Treg细胞的标志物的FoxP3(图1)。
然后，将上述肿瘤内浸润性细胞和PBMC用抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD45RA抗体(BD Biosciences,Clone HI100)和抗CD25抗体染色，对于CD3+CD4+T细胞，以CD45RA和CD25表达量进行二维展开。PBMC的结果为图2，将肿瘤内浸润性细胞的结果示于图3。在肿瘤内浸润性细胞的情况下，使用细胞分选仪(FACSAriaII)，以CD3+CD4+CD45RA-和CD25表达强度为指标如图1的C所示那样分成强阳性细胞(Fr2)、弱阳性细胞(Fr3)、阴性细胞(Fr4和Fr5)4个级别，回收各级分中所含的细胞。PBMC也与肿瘤内浸润性细胞同样地进行二维展开，以CD45RA和CD25的表达强度为指标，如图2所示那样级分为Fr1～Fr6，回收各级分中所含的细胞。
实施例2
从分级后的细胞中分离RNA和cDNA序列分析
将分离回收的各细胞溶解于RLT缓冲液(Qiagen)，使用Agencourt RNAClean XP(Bechman Coulter)提取总RNA。对于回收的RNA，用SMART-Seq v4Ultra Low Input RNAkit for Sequencing(Clontech)进行cDNA化，使用KAPA Hyper Prep Kit for illumina(Kapa Biosystems)进行文库制备。在cDNA合成、文库制备时，随时使用Agilent2100Bioanalyzer(Agilet Technologies)进行质量控制，确认没有问题。完成的cDNA文库在使用KAPA library Quantification kit Illumina Platforms(KapaBiosystems)测定滴度后，使用Hiseq4000(illumina)通过双末端读取进行DNA测序，对每个样品取得2000万个以上的100碱基对的序列数据(fastq文件)。
利用FastQC来分析原始数据(fastq文件)，使用CutAdapt除去衔接序列和重复序列。各双末端读取使用cmpfastq_pe程序来对各对进行匹配。基因组作图中，以hg38为参照序列，利用具有Bowtie2的TOPHAT2程序在默认设置下对基因组进行作图。对于作图而得的读长，利用SAMtools程序进行序列分选，利用HTSEQ程序进行读长计数。使用Deseq2程序进行计数数据的归一化。对于得到的各级分，用以下方法来确认哪些级分中包含Treg细胞。
Treg细胞组成性表达作为标志基因的FoxP3和Ikzf2基因，另外获知即使受到刺激而活化也几乎不分泌IFNγ、IL2。通过调查这些基因的表达量，可以在某种程度上确认是否包含Treg细胞。基于上述RNA-Seq数据对肿瘤浸润细胞和PBMC的各级分调查这些基因的表达量，结果明确了肿瘤浸润细胞中的Fr2、Fr3、PBMC的Fr2中特异性表达Ikzf2和FoxP3，此外的级分中几乎不表达(图4)。另外明确了，肿瘤浸润细胞的Fr4、5和PBMC细胞中的Fr4、Fr5中特异性表达IFNγ(IFNgamma)和IL2，此外的级分中不表达。(图4)。由以上明确了肿瘤浸润细胞的Fr2、Fr3、PBMC中的Fr2包含Treg细胞，此外的级分中不含。
实施例3
FoxP3区域的去甲基化率的测定
FoxP3区域的去甲基化率是能够准确求出Treg细胞的比例的指标，因此对上述中得到的肾癌肿瘤浸润细胞的Fr2～Fr5的细胞研究了FoxP3区域的去甲基化率。在FoxP3基因的第一内含子内的规定的CpG区域中，存在Treg细胞特异性去甲基化的区域(chrX,49118000-49118500,hg19)。对于肿瘤内浸润性细胞的各级分中所含的细胞，通过分析该区域的去甲基化能够检测此次得到的级分是仅由Treg细胞构成还是混杂有其它细胞。
回收肿瘤内浸润性CD4+T细胞的各级分(Fr2、3、4、5)，用苯酚提取法回收基因组DNA。对于基因组DNA，使用MethylEasy Xceed试剂盒(Human Genetic Signatures)进行亚硫酸氢盐处理，对Treg细胞特异性去甲基化区域、即FOXP3intron1区域(chrX,49118000-49118500,hg19)进行扩增子PCR。准备甲基化DNA特异性FAM荧光探针和去甲基化特异性VIC荧光探针，利用QuantStudio 3D digital PCR系统(Applied Biosystems)来进行DNA甲基化的检测。扩增子PCR后，对FAM和VIC荧光探针的发光数进行计数，由两荧光数的比率计算DNA甲基化率，来作为各级分(Fr2～Fr5)的甲基化率。
其结果是，在肿瘤内浸润性细胞的Fr2和Fr3所含的细胞中，FOXP3intron1区域(chrX,49118000-49118500)内的CpG序列的95％以上去甲基化，Fr4和Fr5的去甲基化率为50％以下。由此明确了Fr2和Fr3中所含的细胞几乎全部为Treg细胞(图5)。
实施例4
CCR8的鉴定
为了鉴定在Treg细胞(肿瘤浸润细胞中的Fr2)中特异性表达的一组基因，对于肿瘤来源的各CD4+T细胞级分和同一患者的PBMC来源CD4+T细胞级分的基因表达数据进行分层聚类分析，作为在Treg细胞中的Fr2中表达且在肿瘤来源Fr5和PBMC的Fr4、Fr5中几乎不表达的基因鉴定CCR8(图6)。
实施例5
小鼠CCR8强制表达细胞的制作
将小鼠CCR8(以下有时记作mCCR8。)的ORF全长插入表达载体(pcDNA3.4)中，构建pcDNA3.4-mCCR8质粒。在不改变氨基酸的范围内，将碱基序列变更为在哺乳类中使用频度高的密码子。使用Lipofectamine3000将pcDNA3.4和pcDNA3.4-mCCR8表达质粒分别导入到HEK293细胞中，用浓度1mg/ml的遗传霉素(G418)进行2周的药剂选择。
将存活的细胞用胰蛋白酶剥离，用DMEM/10％FCS培养基清洗后，以1/200稀释的方式添加PE标记抗mCCR8抗体(克隆SA214G2)，在冰上使抗体反应30分钟，然后用DMEM/10％FCS清洗1次，对在细胞表面表达的mCCR8进行标记。通过利用细胞分选仪(FACSAriaII)分选而富集表达mCCR8的细胞群。将阳性细胞群在DMEM/10％FCS(1mg/ml的G418含有培养基)存在下在37℃CO2培养箱中培养2周。对于用pcDNA3.4转化的细胞仅进行药剂选择，不进行分选。为了确认表达，将两种细胞用市售抗PE标记抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2)染色，用流式细胞仪(FACSAriaII)分析。示出其结果(图7)。对与转化了pcDNA3.4的细胞相比、转化了pcDNA3.4-mCCR8的细胞而言，确认了99％以上的细胞表达mCCR8。
实施例6
抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)的FcγR刺激能力的研究
使用mFcγRIV ADCC Reporter Bioassays Core kit(Promega公司)评价抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2,购自BioLegend公司)的ADCC活性所必需的FcgR刺激能力。本试剂盒能够将效应细胞上的FcγR的活化以连接在该细胞的NFAT启动子下游的荧光素酶基因的表达量来示出、通过对其进行定量而能够对FcγR信号的活化进行定量。
以下简单进行说明。将用胰蛋白酶剥离的mCCR8表达HEK293靶细胞(靶细胞)1×105/孔和试剂盒附带的FcγR表达效应细胞以1：1.5的比率在96孔板中混合。细胞混合后立即添加mCCR8抗体。如图8所示，其浓度设为33ug/ml至0.033ug/ml(N＝2)。仅将效应细胞作为阴性对照。添加抗体起14小时后回收细胞，测定荧光素酶活性(图8)。示出N＝2的平均值。
结果，阴性对照中在所有抗体浓度下均未观察到荧光素酶活性，与此相对地，靶细胞添加组则观察到抗体浓度依赖性活性。纵轴表示发光量相对值。根据图8，最大活性值为约6000相对光单元(Relative LightUnit，R.L.U)，EC50值(约3500R.L.U)为约0.1μg/ml(图中的线)。由以上结果明确了抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)可以活化FcγRIV。
实施例7
ADCC活性的测定
使用实施例5中制作的mCCR8稳定表达HEK293细胞，评价抗mCCR8抗体(SA214G2)的细胞杀伤活性。
分离C57BL/6小鼠的脾脏，通过细胞过滤器回收脾脏细胞。清洗细胞后，使生物素化抗CD49b(clone DX5)抗体在4℃下反应30分钟，清洗后，使用链霉亲和素微珠(Miltenyi)纯化NK细胞，作为效应细胞。将小鼠CCR8表达HEK293细胞用Cell Trace Violet(CTV)(Thermo Fisher Scientific Inc.,、C34557)以终浓度2.5uM染色，作为靶细胞(targetcells)。在96孔板中，按照效应细胞:靶细胞＝5:1(效应细胞数为2.5×105)的比率混合成200μL，以终浓度1μg/ml添加抗小鼠CCR8抗体或同型对照抗体(大鼠IgG2b,cloneRTK4530)，在37℃的CO 2培养箱中培养一晚。然后，按照附带规程以1/100稀释的方式添加PE标记膜联蛋白V(Annexin V-PE,MBL公司、4696-100)，在37℃下染色30分钟后，清洗1次。用流式细胞仪分析经CTV染色的靶细胞中的膜联蛋白V阳性凋亡细胞率。以三联方式(N＝3)来实施，示出其平均值和标准偏差。示出进行了两次同样的实验的代表例。(图9)。与同型对照抗体相比，在添加抗小鼠CCR8抗体时，靶细胞中的膜联蛋白V阳性细胞率显著增加6倍左右。由以上明确了抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)具有ADCC活性。
实施例8
针对CCR8的中和活性的测定
使用小鼠CCR8稳定表达HEK293细胞，以作为小鼠CCR8的配体的小鼠CCL1介导的细胞内钙流入为指标，评价抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)的针对CCR8的中和活性。
在钙测定中，使用以下的试剂。
HEPES(WAKO CAS.NO7365-45-9)
HBSS(+)without Phenol Red(WAKO)
Fluo3-AM(cat F023同人化学)
丙磺舒(CAS-No:57-66-9,Nacalai Tesque)
Pluronic F127(P3000MP；Life Technology公司)
10mM HEPES/HBSS/0.1％BSA缓冲液(在HBSS中分别添加有终浓度10mM HEPES和终浓度0.1％BSA)
将Fluo3-AM以4μmol/L的终浓度、将Pluronic F127以0.04％的终浓度溶解于10mMHEPES/HBSS缓冲液。将细胞悬浮在该溶液中，在37℃下孵育1小时，从而使Fluo3-AM被摄入细胞内。然后，将细胞用10mM HEPES/HBSS/0.1％BSA溶液清洗3次，以2×105/ml的细胞浓度悬浮在包含1.25uM丙磺舒的10mM HEPES/HBSS/0.1％BSA溶液中。然后在37℃下在CO2培养箱中孵育10分钟。进一步以5μg/ml的浓度添加抗mCCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体(Clone LTF-2,Bio X Cell)。进一步在37℃下孵育20分钟。
对于细胞，将2mL溶液添加到石英玻璃制杯中，设置到预先将测定室温度设为35℃的分光光度计HITACHI F7000中。测定条件如下。
激发波长508.0nm；荧光(测定)波长527.0nm；激发侧狭缝5nm；荧光侧狭缝5nm；光电倍增管电压950V；响应0.5s
边用搅拌器搅拌边孵育约30秒，直至荧光波长达到稳定。在波长达到稳定后，以终浓度50nM(4μL)的方式添加小鼠CCL1，开始测定。由测定的结果明确了：通过预先添加抗mCCR8抗体，几乎完全抑制了mCCL1介导的细胞内钙流入(图10)。添加对照抗体的情况下，则未观察到抑制。需要说明的是，图中的空隙是为了将激动剂给药于细胞而开关设备的盖时形成的。由以上明确了抗mCCR8抗体(SA214G2)抗体具有针对小鼠CCR8的中和活性。
实施例9
CT26中的mCCR8的表达的确认
用6孔平皿培养CT26细胞，在达到约50％铺满状态的时点除去培养液，添加10mMEDTA/PBS 5ml，在37℃下孵育5分钟。其结果是，细胞几乎被完全剥离，通过用移液管吹打可以几乎分离为单细胞。用D-MEM/10％FCS清洗2次，在D-MEM/10％FCS中进行吹打，用LIVE/DEAD(注册商标)Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(ThermoFisher Scientific,L34975)和APC标记抗mCCR8(SA214G2)或APC标记同型对照抗体在冰中将细胞染色。1小时后用D-MEM/10％FCS清洗3次，用流式细胞仪(FACSCantoII)分析mCCR8表达率。用同型对照抗体设定背景，计算背景水平以上的阳性细胞率(P6)和APC荧光的中位值(Median)(图11)。其结果是，APC荧光强度的中位值观察不到差异，另外阳性细胞也为0.2％，几乎观察不到。由以上确认：CT26细胞不被抗mCCR8抗体识别，CT26细胞不表达mCCR8。
实施例10
使用大肠癌细胞株CT26细胞确认肿瘤内浸润性细胞的CCR8表达
向小鼠Balb/c小鼠(7w、雌性)的背部皮内移植3×105个(50μL)的CT26细胞(N＝3)，在移植第3天，腹腔内给药大鼠抗KLH(钥孔戚血蓝蛋白、Clone LTF-2)抗体(IgG2b)400μg。给药后第4天(4d)和第7天(7d)由3例的个体回收肿瘤(N＝3)。将CT26细胞的肿瘤块用剪刀切碎，使用市售试剂盒(Tumor Dissociation Kit,mouse,Miltenyi和the gentleMACS(TM)Dissociator,Miltenyi Biotech cat.130-095-929)按照附带试剂盒规程制备肿瘤浸润细胞。
使所制备的细胞通过70um的细胞过滤器后，用10mM HEPES/HBSS/2％FBS清洗2次。然后，用红细胞裂解液(Miltenyi公司)处理5分钟而除去红细胞，再用2％FCS(Fetal CalfSerum)/10mM HEPES/HBSS缓冲液清洗2次。将肿瘤浸润细胞分为2份，一份进行Treg细胞的鉴定，另一份进行髓系细胞(巨噬细胞)的鉴定。利用以下的方法和抗体对细胞进行染色。使用的抗体和染色试剂、测试缓冲液如下。
以下为所使用的抗体。
(Treg细胞确认用抗体组)
PE抗小鼠/大鼠FoxP3(clone FJK-16s)eBiosciences
抗小鼠CD4PerCP/Cy5.5(clone RM4-5)eBiosciences
抗小鼠CD8a FITC(clone 5H10-1)Biolegend
Bv421抗小鼠CD25(clone PC61)BioLegend
Bv510抗小鼠CD45(clone 30-F11)Biolegend
AF647抗小鼠CCR8(clone SA214G2)BioLegend
AF647同型对照(clone RTK4530)BioLegend(CCR8的阴性对照)
(髓系、巨噬细胞确认用抗体组)
AF647抗小鼠CCR8(clone SA214G2)BioLegend
AF647同型对照(clone RTK4530)BioLegend(CCR8的阴性对照)
Bv510抗小鼠CD45(clone 30-F11)Biolegend
FITC抗小鼠Gr-1(clone RB6-8C5)Biolegend
Bv421抗小鼠F4/80(clone BM8)BioLegend
PECy7抗小鼠CD11b(clone M1/70)BioLegend
PerCP/Cy5.5抗小鼠MHC classII IA/IE(clone M5/114.15.2)BioLegend
PE抗小鼠CD206(clone C068C2)BioLegend
(所使用的其它试剂)
Zombie NIR Fixable Viability Kit(cat no.423106)BioLegend
BD Pharmingen Transcription Factor buffer Set(cat no.562574)
BD Pharmingen Lysing Buffer(cat no.555899)
HBSS(-)Wako 084-08345
FCS(Hyclone cat no.SH30070.03)
染色的方法如下。将浸润细胞用Zombie NIR Fixable Viability Kit试剂在冰中染色30分钟。用2％FCS/10mM HEPES/HBSS清洗1次后，对于Treg和CCR8阳性细胞，用Bv510标记抗CD45、PerCP.Cy5.5标记抗小鼠CD4、FITC标记抗小鼠CD8，Bv421标记抗小鼠CD25、AF647标记抗小鼠CCR8抗体(或用AF647标记的同型对照抗体)染色。对于单核细胞系细胞，用Bv510标记抗CD45、FITC抗小鼠Gr-1、PECy7抗小鼠CD11b、Bv421抗小鼠F4/80、PerCP/Cy5.5标记MHC簇II(IA/IE)抗体、PE标记抗小鼠CD206抗体染色。
染色在冰中实施30分钟。用2％FCS/HEPES/HBSS清洗2次后，将细胞用市售试剂盒(FoxP3staining kit、eBioscience公司)按照附带规程固定，使用PE标记抗FoxP3抗体对细胞内FoxP3进行染色。用该试剂盒附带缓冲液清洗后，使用流式细胞仪对细胞进行分析。
分析CD45+CD4+T细胞。在CD45+CD4+T细胞中，利用同型对照用抗体的染色确定阴性细胞区域，将抗小鼠CD25和抗小鼠FoxP3用抗体均呈阳性的细胞作为Treg细胞，计算给药4天后(移植7天后)和给药7天后(移植10天后)的存在频度。其结果是，小鼠肿瘤内的CD45+CD4+T细胞中的约23％(4d)和约30％(7d)为CD25+FoxP3+细胞(图12)。
然后分析CD45+CD4+CD25+FoxP3+T细胞中的CCR8表达。将CD45+CD4+CD25+FoxP3+T细胞用同型对照抗体染色而确定阴性细胞区域，将由于抗小鼠CCR8抗体而呈阳性的细胞作为CCR8+Treg细胞，计算给药4天后(移植7天后)和给药7天后(移植10天后)的存在频度(图13)。其结果是，小鼠肿瘤内的CD45+CD4+CD25+FoxP3+T细胞中，约50％(4d)和约67％(7d)为CCR8+细胞(图13)。
关于髓系细胞，用流式细胞仪以CD45+细胞和FSC/SSC来对髓系群设门，分析其中的CD11b+Gr1+CD206+细胞中的CCR8+细胞率。结果明确了移植7天后(给药后4天后)和10天后(给药后7天后)均有40-50％的细胞为CCR8阳性(图14)。另外，作为与此不同的巨噬细胞群，同样测定了CD45+CD11b+F4/80+细胞(N＝3)中的CCR8表达率，结果确认，在移植第10天(7d)的时点，45.3％(标准偏差±8.2％)的该细胞进行表达。根据以上的结果明确了：肿瘤内浸润性细胞的至少CD4+CD25+FoxP3+T细胞和CD11b+Gr1+CD206+巨噬细胞(也称为M2型巨噬细胞)中表达了CCR8。
实施例11
抗mCCR8抗体给药所带来的肿瘤内浸润性Treg细胞或肿瘤内浸润性巨噬细胞的除
去效果的研究
向小鼠Balb/c小鼠(7w、雌性)的背部皮内移植3×105个CT26细胞(50uL)。在移植3天后，向尾静脉内给药400μg(液量400μL)大鼠抗小鼠CD198(CCR8)抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)或同型对照抗体(Clone LTF-2)(各组N＝3)。在肿瘤移植7天后(抗体给药后4天)和10天后(抗体给药后7天)回收肿瘤，制备肿瘤内浸润性细胞并分析(图15)。
通过与实施例10同样的方法回收肿瘤内浸润性Treg细胞。使用的抗体与实施例10相同。
首先，将浸润细胞使用Zombie NIR Fixable Viability Kit在冰中染色30分钟。用2％FCS/10mM HEPES/HBSS清洗1次后，用Bv510标记抗CD45、PerCP.Cy5.5标记抗小鼠CD4、FITC标记抗小鼠CD8抗体、Bv421标记抗小鼠CD25、AF647标记抗小鼠CCR8抗体(或AF647标记的同型对照抗体)染色。染色在冰中实施30分钟。用2％FCS/HEPES/HBSS清洗2次后，将细胞用市售试剂盒(FoxP3staining kit、eBioscience公司)按照附带规程固定，使用PE标记抗FoxP3抗体对细胞内FoxP3进行染色。用该试剂盒附带缓冲液清洗后，用流式细胞仪对细胞进行分析。
将CD45+CD4+FoxP3+CD25+细胞作为小鼠Treg细胞。在Treg细胞中，通过AF647标记同型对照用抗体的染色确定阴性细胞区域，将由于AF647标记抗小鼠CCR8抗体而与对照相比呈阳性的细胞作为CCR8阳性细胞，计算其频度。
结果如图16，将同种型抗体给药小鼠的肿瘤内CD45+CD4+CD25+FoxP3+T细胞(Treg细胞)比率设为100％时，(10天后)抗小鼠CCR8(SA214G2)抗体给药小鼠中的该细胞(Treg细胞)的阳性率在肿瘤移植7天后(抗体给药后4天)为约80％，10天后(抗体给药后7天)为约40％(图16)。显著水平＊＊为P<0.01(t检验)。以上表明：抗CCR8抗体给药7天后，肿瘤内浸润性Treg细胞中的约60％被抗CCR8抗体除去。
与上述同样地，从移植后第7天(d7)的肿瘤中分离肿瘤浸润细胞，在CD45+细胞中，用FSC/SSC对髓系群设门(记为FSC/SSC+)，分析该细胞中的CD11b+F4/80+细胞。F4/80(Ly719)为小鼠成熟巨噬细胞和单核细胞的标志物。如图17所示，与同型对照(N＝3)相比，在抗mCCR8抗体给药组(N＝3)中，CD11b+F4/80+细胞的存在比率减少(t检验；P＝0.062)。图表示出CD45+FSC/SSC+单核细胞群中的F4/80+细胞的存在比率。
图17中，对于F4/80+细胞，进一步示出MHC(肿瘤组织相容性抗原)簇II分子中的IA/IE阳性或簇II(IA/IE)阴性细胞的存在比率。如图18所示，抗mCCR8抗体给药组(N＝3)与同型对照(N＝3)相比，显示出IA/IE阴性组减少倾向，IA/IE阳性组则显著减少(t检验；显著水平＊；P<0.05)。由以上明确了：在小鼠CT26肿瘤内，单核细胞/巨噬细胞群或其部分群的肿瘤内细胞数减少。
实施例12
使用大肠癌来源CT26评价由给药抗mCCR8抗体带来的抗肿瘤效果
向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植3×105个大肠癌来源CT26细胞(50uL)。在肿瘤移植3天后，向静脉内给药400μg(400μL)大鼠抗小鼠CD198(CCR8)抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)(N＝10)。对于对照，给药同型对照抗体(N＝10)。肿瘤移植8天后(抗体给药后5天)起每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图19)。
其结果是，在移植第7天，与同型对照抗体给药组相比，抗mCCR8给药组未观察到差异显著性异，但在第11天、第14天、第17天、第21天，抗mCCR8抗体给药组的肿瘤体积显著减少(关于显著水平，第11天和第14天为＊＊＊；P<0.001、第17天和第21天为＊＊；P<0.01)。另外，抗小鼠CCR8抗体给药组中，在第14天以后肿瘤体积减少，在第17天几乎完全消失(将按个体示出的数据示于图20，将平均值数据示于图21。)。由以上的结果得到如下结论：通过给药抗mCCR8抗体，抑制在已被指出作为免疫抑制细胞的Treg和单核细胞/巨噬细胞中表达的mCCR8的功能，或者通过抗体的ADCC活性杀死(除去)这些表达细胞，从而肿瘤免疫亢进，实现肿瘤的萎缩、消灭。
虽然有多篇文献等进行了报道，但是报道了：将针对作为小鼠Treg细胞的标志物的小鼠CD25的特异性抗体(抗CD25)给药于小鼠来除去小鼠Treg细胞的情况下，在肿瘤移植前给药会显示弱抗肿瘤效果，在移植起第2天以后给药则完全不显示抗肿瘤效果。我们此次也用相同的CT26细胞系在移植后第3天实施抗CD25抗体的给药，但是完全观察不到抗肿瘤效果。由此得到如下结论：与抗CD25抗体相比，抗mCCR8抗体具有强药效。
实施例13
然后，使用CT26，进行作为针对小鼠PD-1的特异抗体的抗PD-1抗体(clone RMP1-14、Bio X Cell公司)的药效评价，并进行与抗mCCR8的比较研究。向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植2×105个大肠癌来源CT26细胞(50μL)。从移植后第7天起，每隔3～4天给药抗PD-1抗体(200μg/head,i.p.)，共实施3次。
其结果是，与给药同型对照抗体的组(N＝8)相比，给药抗PD-1抗体的组(N＝8)中观察到抗肿瘤效果。移植后第14、17、20天，同型对照的肿瘤体积的平均值和标准偏差分别为601.7±378.1mm3、956.3±467.7mm3和1528.4±774.1mm3，而抗PD-1抗体给药组分别为175.3±42.6mm3、174.7±55.8mg和209.6±99.8mm3。抗PD-1抗体在移植后第14、17、20天的任一时点与对照相比均显著抑制肿瘤体积的增加。其中，关于肿瘤完全消失的个体，在观察期间(到移植后第20天为止)内为8只中有1只。另一方面，给药抗mCCR8抗体的情况下，在同样的期间内，10只中均观察到肿瘤完全消失。由以上得到如下结论：与标准给药法之下的抗PD-1抗体相比，抗mCCR8抗体具有强药效。
实施例14
抗mCCR8抗体给药小鼠中是否引发自身免疫疾病的确认
然后，对实施例12中的、给药后第18天的小鼠的状态进行评价。在对照抗体给药组和抗CCR8抗体给药组间，该期间内的体重没有差异显著性异。另外，两组均为观察到竖毛。给药后第18天进行解剖。与对照相比，对抗CCR8抗体给药组研究了有无淋巴结和肠管的肥大，均没有差异，未观察到肥大。由以上所见得到下述结论：在抗CCR8抗体给药小鼠中，在发挥抗肿瘤效果期间内未观察到自身免疫疾病的征兆。有论文报道指出，通常在将小鼠的全身Treg除去到引起抗肿瘤效果的程度时，在除去后14天左右会引起严重的自身免疫疾病，这成为包括Treg抑制疗法在内的肿瘤免疫疗法的担忧之处。此次的结果是，在通过给药抗CCR8抗体而观察到强抗肿瘤免疫效果的小鼠中，在给药抗体后第18天也完全未引起自身免疫疾病。作为其的说明之一，有报道指出：与肿瘤组织相比，小鼠和人的CCR8在PBMC、脾脏、淋巴结中的表达少。但是，关于在这些末梢组织中除去CCR8表达Treg细胞或抑制其功能的情况下是否会引起自身免疫疾病这一点，迄今为止尚无报道。此次首次明确了不会引起自身免疫疾病，这一点由以往的认识是无法预测的。
实施例15
使用大肠癌来源Colon-26评价由给药抗mCCR8抗体带来的抗肿瘤效果
向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植2×105个大肠癌来源Colon-26细胞(50μL)。在肿瘤移植3天后，将大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)静脉内给药400μg(400μL)(N＝10)。对于对照，给药同型对照抗体(N＝10)。从肿瘤移植3天后(抗体给药后5天)起每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测。在其肿瘤达到终点体积(800mm3)的时点，作为各动物的终点。其结果是，在移植后第14天和18天，与同型对照抗体给药组相比，抗mCCR8给药组中肿瘤体积的增加得到抑制。关于第14天的肿瘤体积的平均，同型对照抗体给药组为451.3mm3(标准偏差为±177.5mm3)，抗CCR8抗体给药组为322.6mm3(标准偏差为±146.0mm3)，关于第14天肿瘤体积为350mm3以上的个体，同型对照组的10例中为9例，在抗mCCR8给药组的10例中为4例，关于该分离方式，在Pearson的卡方检验中在P＝0.019下具有差异显著性异。因此，在第14天观察肿瘤体积达到350mm3的个体数的差异。另外，关于移植后第18天的肿瘤体积的平均值，同型对照抗体给药组为874.7mm3(标准偏差为±269.2mm3)，抗CCR8抗体给药组为585.4mm3(标准偏差为±401.7mm3)(图22)。关于第18天的肿瘤体积为600mm3以上的个体，在同型对照组的10例中为9例，而在抗mCCR8给药组的10例中为4例，关于该分离方式，在Pearson的卡方检验中P＝0.019，具有差异显著性异。因此，在第18天在肿瘤体积达到600mm3的个体数中观察到差异。进一步，将肿瘤体积达到800mm3的时点预先设定为终点。关于肿瘤体积超过800mm3、视为死亡的个体，在第14天时两组均未观察到，在第18天时，同型对照组的10例中为7例，抗CCR8抗体组的10例中为3例。对第18天的存活率进行Pearson的卡方检验来研究存活率是否存在差异，结果，在P＝0.025下存活率具有差异显著性异。
另外，在使用相同细胞株的同样实验中，与给药同型对照抗体的组相比，抗PD-1抗体(clone RMP1-14、Bio X Cell公司)给药组未观察到抗肿瘤效果。以上表明：抗mCCR8抗体针对抗PD-1抗体耐受性的Colon26细胞显示出更高的抗肿瘤效果。
实施例16
人肾癌浸润细胞的CCR8的表达分析
进行14例人肾癌肿瘤内浸润性细胞中的CCR8的表达分析。14例肾癌患者的背景如下：性别，男性11名、女性3名；年龄中位值为68.5岁；分期，T1A为6名、T1B为2名、T3A为5名、T3b为1名。具体而言，与实施例1的图1同样地分离14名肾癌(Clear Cell RenalCellCarcinoma,ccRCC)患者的肾癌原发肿瘤内浸润性细胞，用抗CD4(BioLegend,CloneOKT4)、抗CD3(BioLegend,Clone UCHT1)、抗CD45RA(BD Biosciences,Clone HI100)、抗CD8(Biolegend,RPA-T8)、抗CCR8(BioLegend,Clone L263G8)、抗FoxP3(eBioscience,Clone236A/E7)、抗FoxP3的同型对照抗体染色，用流式细胞术(BDBiosciences,BD LSRFortessa)分析。对CD3+CD8+T细胞和CD3+CD4+T细胞进行分析。对于CD3+CD4+T细胞，进一步通过有无FoxP3表达分为2组而进行分析。通过同型对照抗体染色，作为FoxP3表达的阴性对照。CCR8的表达强度使用各患者样品的FACS分析值的平均值(MFI)。表1示出抗CCR8抗体和其同型对照抗体的染色的MFI值的平均和其标准偏差。
[表1]
明确了CD8+T细胞中几乎不表达CCR8(表1)。CD4+FoxP3-T细胞少量表达，CD4+FoxP3+T细胞的MFI值的平均为CD4+FoxP3-T细胞的8倍以上，明确了CD4+FoxP3+T细胞显著强表达CCR8(表1)。图23是示出表1的结果的图。图表的各标识表示由流式细胞仪得到的各患者样品的CCR8表达量的平均值(MFI)。图表的横线表示各样品的MFI值的平均值。线段表示标准偏差。显著水平＊＊＊表示P<0.001。由以上的结果明确了人肾癌(ccRCC)中在浸润到肿瘤内的CD3+CD4+FoxP3+T细胞表面特异性表达了CCR8蛋白。该结果与利用RNA-Seq分析的mRNA表达分析也一致。
对于上述ccRCC的14个样品，进行肿瘤浸润CD4+T细胞的FoxP3和CCR8的流式细胞术分析。对每个样品标绘FoxP3阳性细胞中的CCR8阳性细胞的比例、FoxP3阴性细胞中的CCR8阳性细胞的比例。(图24)。对于FoxP3和CCR8，均使用同型对照用抗体的染色作为阴性标准，将该阈值以上的细胞作为阳性细胞。其结果是，肿瘤内CD3+CD4+FoxP3+T细胞的CCR8表达率为约75％，CD3+CD4+FoxP3-T细胞的CCR8表达率为约10％。
由以上的结果明确了：人肾癌肿瘤内浸润性细胞中，表达FoxP3的Treg细胞几乎都表达CCR8，Treg细胞以外的CD4阳性T细胞中的约10％表达了CCR8。以上表明：人肿瘤内的FoxP3阳性Treg细胞中的CCR8表达率与小鼠肿瘤内的Treg细胞中的CCR8表达率类似，与小鼠同样地，通过抗人CCR8特异性抗体可以除去肿瘤内浸润性FoxP3阳性Treg细胞的大部分。
实施例17
各种癌症中的肿瘤内浸润性细胞中的CCR8表达率与存活率的相关性
作为在Treg细胞中特异性表达、在肿瘤细胞或人的大部分正常细胞中均不表达的基因，已经鉴定出FoxP3基因。作为这种仅在某种特异性细胞中表达的所谓的标志基因，例如，作为Treg细胞的标志基因，已知有FoxP3基因，作为T细胞和NK细胞的标志基因，已知有CD3G基因，作为CD8阳性T细胞的标志基因，已知有CD8A基因等。
还有报道指出，对于作为Treg细胞的标志基因的FoxP3基因，可以测定各肿瘤内的FoxP3基因的mRNA表达量作为Treg细胞在肿瘤内的存在比例的指标(Cell,2015年、第160卷、p.48-61)。
另外，如该论文所报道那样，利用TCGA之类的RNA-Seq数据库对标志基因的肿瘤内表达率(Treg存在比率)和患者存活率绘制存活概率生存曲线，能够分析Treg细胞在肿瘤内的存在率与存活率是否相关。肿瘤块的RNA-Seq数据为肿瘤细胞和其中存在的浸润细胞(淋巴细胞、血管细胞等)两方的细胞中表达的mRNA的混合数据，如果是表明在肿瘤细胞不表达的基因则可视为在肿瘤内浸润性细胞中表达的基因，对其进行利用，通过上述分析、即肿瘤块的RNA-Seq数据中的标志基因的表达分析，能够鉴定肿瘤内浸润性细胞。进一步地，肿瘤块内的标志基因的表达量可以设为其中浸润的对应于标志基因的规定细胞的表达细胞数与各表达细胞的表达量之积。
这里，假设各细胞的标志基因的表达量在个体间基本恒定，则其表达量与浸润细胞数成正比。因此，通过使用该表达量，能够对各个体计算肿瘤内的表达细胞数，能够进行个体间比较。
(细胞水平的CCR8表达分析)
在公共数据库CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)中登录有1037种人细胞株的RNA表达数据。使用这些数据库来分析CCR8、CD3G基因在T细胞以外的癌症细胞或正常细胞中是否表达。
对于肾癌、前列腺癌和膀胱癌来源细胞株，使用CCLE数据库分析CD3G和CCR8的mRNA表达。
所调查的细胞株中，肾癌来源细胞株为下述40种：
VMRCRCW、SKRC20、SNU34、SKRC31、UOK10、SLR20、OSRC2、TUHR14TKB、SLR24、HK2、A498、RCC4、KMRC1、RCC10RGB、ACHN、SLR25、SNU1272、UMRC6、SLR23、769P、SLR21、HEKTE、CAKI1、TUHR4TKB、KMRC2、VMRCRCZ、KMRC3、KMRC20、CAKI2、BFTC909、786O、A704、TUHR10TKB、SLR26、UMRC2、CAL54、FURPNT1、FURPNT2、HEK293、G402，
前列腺癌来源细胞株为下述8种：
VCAP、LNCAPCLONEFGC、DU145、PC3、22RV1、PRECLH、MDAPCA2B、NCIH660，
膀胱癌来源细胞株为下述2种：TCBC14TK、TCBC2TKB。在这些被调查的所有实体癌细胞株中，CCR8和CD3G的表达为与背景相同水平的值，完全观察不到mRNA表达(即使是显示最强的表达的值也是G3PDH的1/500以下。此外均为G3PDH的表达量的1/1000以下)。即，可以确认CCR8和CD3G在实体癌细胞中几乎不表达。对人各组织来源的原代正常细胞也进行同样分析，明确了CCR8和CD3G仅在血细胞系细胞的一部分中表达，在此外的原代的正常组织来源细胞中几乎不表达。
以上表明，这3种癌症细胞中不表达CCR8和CD3G。因此得到如下结论：对于肾癌、前列腺癌、膀胱癌的肿瘤块使用TCGA的RNA表达数据的情况下，CCR8和CD3G反映癌症细胞以外的、存在于肿瘤块中的浸润正常细胞中的mRNA表达。
(利用TCGA公共数据库的分析)
然后利用TCGA公共数据库，对于肾癌、前列腺癌、膀胱癌的肿瘤中表达的CD3G基因与CCR8基因之比(CCR8/CD3G)以及患者存活率进行分析。明确了：在这3种肿瘤内，与CCR8和CD3G基因的表达最相关(Pearson相关)的基因是在T细胞中特异性表达的各种基因(FoxP3、CD5、IL7R等之间的相关系数r为0.7以上)。该结果表明：CCR8、CD3G在肿瘤细胞本身中不表达，在浸润到肿瘤内的表达细胞(特别是T细胞)中特异性表达。其中，不否认CCR8在T细胞以外的浸润细胞中表达，因此这里记作表达CCR8的细胞群。已有论文等报道了CD3G在T细胞和NK细胞中特异性表达，另外T细胞是浸润到肿瘤中的主要细胞，因此CD3G表达量可以比较推定为已浸润的T细胞数。因此，CCR8/CD3G值可以定义为存在于肿瘤内的、每单位T细胞数的表达CCR8的细胞数。
用存活概率曲线对这3种癌肿分析CCR8/CD3G比和患者存活率。关于肾癌，使用TCGA数据中的肾透明细胞癌(TCGA,Provisional)的数据，使用RNA表达数据和患者存活率数据完整的523例。同样地，对于前列腺癌，使用TCGA数据中的前列腺腺癌(TCGA,Provisional)的数据，使用RNA表达数据和患者存活率数据完整的490例。
另外，关于膀胱癌，使用TCGA数据中的膀胱尿路上皮癌(TCGA,Provisional)的数据，使用RNA表达数据和患者存活率数据完整的392例。
关于CCR8/CD3G的表达值，等分为表达值高的组和低的组这2组(在肾癌的情况下，由于为奇数而为261:262)，用分析软件R(R-Studio)进行卡普兰-梅尔生存曲线分析。关于差异显著性检验，进行Log-rank检验。将肾癌的结果示于图25，将前列腺癌的结果示于图26，将膀胱癌的结果示于图27。关于图表中的竖线，由于患者存活但评价期到该时点截止，因此作为在该时点遗漏(相当于所谓的censors)来处理。另外，在全部图表，横轴的值表示月数。
其结果是，在全部3种癌肿中，CCR8/CD3G值高的组中，患者存活率显著低。明确了浸润到人肿瘤内的CCR8表达细胞在T细胞中的比率高的组的存活率下降，这暗示了在人类中CCR8表达细胞也对肿瘤免疫带来抑制作用。该结果显示：与小鼠中的抗mCCR8抗体给药时的抗肿瘤效果同样，在人类中也有可能通过用某些方法特异性除去或杀死肿瘤内CCR8表达细胞来提高肿瘤免疫、提高存活率。
实施例18
LM8细胞和MethA细胞中的小鼠CCR8的表达确认
将骨肉瘤来源LM8细胞和皮肤纤维肉瘤来源MethA细胞用6孔平皿培养，在达到约50％铺满状态的时点除去培养液，添加5ml的10mMEDTA/PBS，在37℃下孵育5分钟。其结果是，细胞几乎完全剥离，通过用移液管吹打可以几乎分离为单细胞。用D-MEM/10％FCS清洗2次，在D-MEM/10％FCS中吹打，用LIVE/DEAD(注册商标)FixableNear-IR Dead Cell StainKit(ThermoFisher Scientific,L34975)和抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)或同型对照抗体在冰中将细胞染色。1小时后，用D-MEM/10％FCS清洗3次，用流式细胞仪(FACSCantoII)分析小鼠CCR8表达率。使用同型对照抗体设定背景，计算背景水平以上的阳性细胞率和荧光的中位值(Median)(图28)。其结果，任一细胞的PE的荧光强度的中位值均未观察到差异，另外阳性细胞也完全未观察到。由以上确认：这些细胞不被抗小鼠CCR8抗体识别，其不表达小鼠CCR8或不具有与抗体发生反应的表位。
实施例19
使用骨肉瘤来源LM8评价由给药抗小鼠CCR8抗体带来的抗肿瘤效果
向小鼠C3H/He小鼠(7周龄、雄性)的背部皮内移植3×105个小鼠骨肉瘤来源LM8细胞(50uL)。在肿瘤移植3天后，腹腔内给药400μg(400μL)大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)(N＝11)。对于对照，给药同型对照抗体(N＝10)。肿瘤移植7天后(抗体给药后4天)起每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图29)。其结果是，在移植第18天以后的所有测定时点，与同型对照抗体给药组相比，抗mCCR8给药组的肿瘤体积的平均值显著减少(关于显著水平，第18天为＊；P<0.05，第21、24、27、31天为＊＊；P<0.01，第35天为＊＊＊；P<0.001)。另外，在给药抗体第31天的时点，抗小鼠CCR8抗体给药组11只中的6只、同型对照抗体给药组10只中的1只的肿瘤消失。对于该分离方式进行Pearson的卡方检验，结果具有差异显著性异(P＝0.031)。
实施例20
使用皮肤纤维肉瘤来源MethA评价由给药抗小鼠CCR8抗体带来的抗肿瘤效果
向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植1×105个皮肤纤维肉瘤来源MethA(50uL)。在肿瘤移植3天后，腹腔内给药400μg(400μL)大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)(N＝5)。关于对照，给药同型对照抗体(N＝5)。肿瘤移植11天后(抗体给药后8天)起每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图30)。
其结果是，在移植第11天以后的所有测定时点，与同型对照抗体给药组相比，抗小鼠CCR8抗体给药组的肿瘤体积的平均值显著减少(显著水平在所有时点均为＊；P<0.05)。另外，在抗体给药第21天的时点，抗小鼠CCR8抗体给药组5只中的5只、同型对照抗体给药组5只中的0只的肿瘤消失。对于该分离方式进行Pearson的卡方检验，结果具有差异显著性异(P＝0.0016)。
实施例21
使用乳腺癌来源EMT6评价由给药抗小鼠CCR8抗体带来的抗肿瘤效果
向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植1×105个乳腺癌来源EMT6(50uL)。在肿瘤移植3天后和10天后，向尾静脉内给药100μg(100μL)大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)(N＝20)。对于对照，给药等量的同型对照抗体(N＝20)。肿瘤移植4天后(抗体给药后1天)起每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图31)。
其结果是，在移植第10天以后的所有测定时点，与同型对照抗体给药组相比，抗小鼠CCR8抗体给药组的肿瘤体积的平均值显著减少(关于显著水平，第10天为＊＊；P<0.01，第14、17、第21天为＊＊＊；P<0.001)。另外，在抗体给药第21天的时点，抗小鼠CCR8抗体给药组20只中的19只、同型对照抗体给药组20只中的2只的肿瘤消失。对于该分离方式进行Pearson的卡方检验，结果具有差异显著性异(P＜0.0001)。
实施例22
抗小鼠CCR8抗体相对于抗PD-1抗体的优势性确认
向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植2×105个大肠癌来源Colon26细胞(50uL)。在肿瘤移植3天后和10天后，静脉内给药400μg(400μL)同型对照抗体、大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)或抗小鼠PD-1抗体(RMP1-14，Bioxcell公司)(N＝10)。肿瘤移植3天后起每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图32)。其结果是，与同种型抗体给药组相比，抗小鼠CCR8给药组在第17、20和24天肿瘤体积显著减少(Steel的非参数检验：显著水平为P＜0.05)。抗PD-1抗体给药组与同种型抗体给药组相比，在任一时点均未观察到差异显著性。
另外，关于抗体给药第24天的时点的具有1000mm3以上的体积的肿瘤的小鼠个体，同种型抗体给药组的10只中为7只、抗小鼠CCR8抗体给药组的10只中为2只、抗PD-1抗体给药组的10只中为7只，抗CCR8给药组相对于同种型抗体给药组和抗PD-1抗体给药组中的任一者的分离方式，在Pearson的卡方检验下均具有差异显著性异(均为P＝0.025)。根据以上，在大肠癌细胞株Colon26中，通过给药抗小鼠CCR8抗体而观察到抗肿瘤治疗效果。
进一步地，在移植第20天目、第24天，与抗小鼠PD-1抗体给药组相比，抗小鼠CCR8给药组的肿瘤体积显著减少(Steel-Dwass的非参数检验；显著水平为P＜0.05)。根据以上，在小鼠大肠细胞株中，抗小鼠CCR8抗体给药组与抗PD-1抗体给药组相比观察到更强的抗肿瘤治疗效果。
实施例23
使用肾癌来源细胞株RAG评价由给药抗小鼠CCR8抗体带来的抗肿瘤效果
使用小鼠肾癌来源细胞株RAG进行了同样的研究。向Balb/c小鼠(8周龄、雌性)的背部皮内移植4×105个肾癌来源RAG细胞(50uL)。需要说明的是，作为RAG细胞，使用了对小鼠皮下的定植效率提高的RAG细胞(细胞驯化株)，其是重复2次将预先移植而定植于Balb/c小鼠皮下的肿瘤再次移植到小鼠中的操作而得到的。在肿瘤移植6天后，静脉内给药100μg(100μL)同型对照抗体(N＝10、其中，仅第21天时N＝9)、大鼠抗小鼠CCR8抗体(N＝10)(克隆SA214G2、BioLegend公司)或抗小鼠PD-1抗体(N＝10)(RMP1-14，Bioxcell公司)。肿瘤移植6天后每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图33)。其结果是，与同种型抗体给药组相比，抗小鼠CCR8抗体给药组在给药后第14、17和21天时肿瘤体积显著减少(Steel的非参数检验：显著水平为P＜0.05)。与同种型抗体给药组相比，抗小鼠PD-1抗体给药组未观察到差异显著性。根据以上，在肾癌细胞株中，通过给药抗小鼠CCR8抗体而观察到抗肿瘤治疗效果。另外，在移植第14天时，与抗小鼠PD-1抗体给药组相比，抗小鼠CCR8抗体给药组的肿瘤体积显著减少(Steel-Dwass的非参数检验；显著水平为P＜0.05)。根据以上，在小鼠肾癌细胞株中，抗小鼠CCR8抗体给药组与抗小鼠PD-1抗体给药组相比观察到更强的抗肿瘤治疗效果。
实施例24
抗小鼠CCR8抗体给药小鼠中有无炎症反应的分析
向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植2×105个大肠癌来源Colon26细胞(50uL)。在肿瘤移植3天后和10天后静脉内给药400μg(400μL)大鼠抗小鼠CD198(CCR8)抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)或同型对照抗体(LTF-2,Bioxcell公司)(N＝10)。测定移植第24天时的体重和小鼠各脏器(肺、肝脏、脾脏、小肠、鼠径淋巴结)的重量(图34)。其结果是，如图34所示，在对照给药组(N＝10)和抗小鼠CCR8抗体给药组(N＝10)间，在体重和各脏器重量方面未观察到差异显著性。由以上得到下述结论：未引起由给药抗小鼠CCR8抗体导致的炎症反应和自身免疫疾病。
实施例25
各种临床肿瘤内浸润性细胞中的CCR8的表达分析
进行人肾癌、卵巢癌、子宫体癌、大肠癌和肺癌的肿瘤内浸润性细胞中的CCR8的表达分析。关于表达分析中使用的各种临床肿瘤的患者数，肾癌为12名，卵巢癌为14名，子宫体癌为21名，大肠癌为10名，肺癌为4名。与实施例1的图1同样分离各种临床肿瘤内浸润性细胞，用抗CD45(BioLegend,Clone H130)、抗CCR8(BioLegend,Clone L263G8)抗体染色，用流式细胞术(BD Biosciences,BD LSRFortessa)进行测定。分析每单位重量肿瘤的CCR8阳性细胞数和CD45阳性白细胞中的CCR8阳性细胞的比例。
表2示出每单位重量肿瘤的CCR8阳性细胞数的平均值和其标准偏差。表3示出CD45阳性白细胞中的CCR8阳性细胞的比例的平均值和其标准偏差。
[表2]
[表3]
各种临床肿瘤中，在以肾癌为基准时，关于每单位重量肿瘤的CCR8阳性细胞数，卵巢癌和大肠癌显示低于肾癌的平均值，子宫体癌和肺癌显示高于肾癌的平均值。关于CD45阳性白细胞中的CCR8阳性细胞的比例，卵巢癌显示与肾癌同程度的平均值，肺癌显示低于肾癌的平均值。另外，子宫体癌和大肠癌显示高于肾癌的平均值。除了人肾癌肿瘤内浸润性细胞以外，还在卵巢癌、子宫体癌、大肠癌和肺癌的肿瘤内浸润性细胞中确认到CCR8的表达。以上的结果表明：除了肾癌以外，在卵巢癌、子宫体癌、大肠癌和肺癌中，也有可能利用抗人CCR8特异性抗体来除去CCR8阳性肿瘤内浸润性细胞。
实施例26
使用乳腺癌来源EMT6评价抗小鼠CCR8抗体与抗PD-1抗体给药的并用所带来的抗
肿瘤效果
向小鼠Balb/c小鼠(7周龄、雌性)的背部皮内移植1×105个乳腺癌来源EMT6(50uL)。
对于抗小鼠CCR8抗体单独给药组，在肿瘤移植3天后和10天后静脉内给药大鼠抗小鼠CCR8抗体15μg(克隆SA214G2、BioLegend公司)(100μL)，在肿瘤移植第8天和第13天给药同型对照抗体200μg(100μL)(N＝10)。对于抗PD-1抗体单独给药组，在肿瘤移植3天后和10天后静脉内给药同型对照抗体15μg(100μL)，在肿瘤移植第8天和第13天静脉内给药抗小鼠PD-1抗体(RMP1-14、Bioxcell公司)200μg(100μL)(N＝10)。对于抗PD-1抗体和抗小鼠CCR8抗体并用给药组，在肿瘤移植第3天和第10天静脉内给药大鼠抗小鼠CCR8抗体15μg(100μL)，在肿瘤移植第8天和第13天静脉内给药抗PD-1抗体200μg(100μL)(N＝10)。对于对照组，在肿瘤移植3天后和10天后静脉内给药同型对照抗体15μg(100μL)，在肿瘤移植第8天和第13天静脉内给药PBS100μL(N＝10)。肿瘤移植3天后(抗体给药后1天)每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图35)。
在关于平均肿瘤体积的单独给药组彼此的比较中，与抗PD-1抗体给药组相比，在10、14、17、20、23和27天时抗小鼠CCR8抗体给药组的平均肿瘤体积显著小(基于Dunnett法的显著水平：P＜0.05)。另外，与各单独给药组相比，并用组的肿瘤小。
另外，也比较了移植后第17天和第27天时肿瘤的完全缓解率。移植第17天时，对照组和抗PD-1抗体给药组10只中的0只、抗小鼠CCR8抗体给药组10只中的1只显示了肿瘤完全缓解，抗PD-1抗体和抗小鼠CCR8抗体并用组10只中的6只完全缓解。在移植第27天时，对照组和抗PD-1抗体给药组10只中的2只和3只、抗小鼠CCR8抗体给药组10只中的7只显示肿瘤完全缓解，抗PD-1抗体与抗小鼠CCR8抗体的并用组10只中的9只完全缓解。
还计算了肿瘤萎缩到50mm3以下的个体的比例(图36)。抗PD-1抗体与抗小鼠CCR8抗体的并用组在移植第17天时所有个体的肿瘤萎缩到50mm3以下(100％)，此后到第27天时为50mm3以下，抗PD-1抗体给药组在第17天时为10％，第27天时为30％、此外抗小鼠CCR8抗体给药组在移植后第17天时为70％，在第27天时也同样为70％。
由以上的结果可知，与其它单独给药组相比，并用组实现肿瘤萎缩的时间短、另外萎缩效果强。
实施例27
使用小鼠肾癌来源细胞株RAG评价抗小鼠CCR8抗体与抗PD-1抗体给药的并用所带
来的抗肿瘤效果
向小鼠Balb/c小鼠(6周龄、雌性)的背部皮内移植4.5×105个肾癌来源RAG细胞(50uL)。需要说明的是，作为RAG细胞，使用对小鼠皮下的定植效率提高的RAG细胞(细胞驯化株)，其是重复2次将预先皮下移植并定植于Balb/c小鼠的肿瘤再次移植到小鼠中的操作而得的。
对于抗PD-1抗体单独给药组，在肿瘤移植8天后和15天后静脉内给药抗PD-1抗体(RMP1-14、Bioxcell公司)50μg(100μL)(N＝10)。对于抗小鼠CCR8抗体单独给药组，在肿瘤移植8天后和15天后静脉内给药大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)25μg(100μL)(N＝10)。对于抗PD-1抗体和抗小鼠CCR8抗体并用给药组，在肿瘤移植8天后和15天后将抗PD-1抗体(RMP1-14、Bioxcell公司)50μg和大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)25μg混合(100μL)，进行静脉内给药(N＝10)。对于对照组，在肿瘤移植8天后和15天后静脉内给药生理盐水100μL(N＝10)。
肿瘤移植8天后每隔3～4天测定肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)以长径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2来计测(图37)。
其结果是，获知抗PD-1抗体与抗小鼠CCR8抗体的并用组与抗PD-1抗体或抗小鼠CCR8抗体的单独给药组相比肿瘤变小。
实施例28
使用纯合型CCR8基因缺陷小鼠的抗小鼠CCR8抗体的特异性的分析
向Balb/c品系的野生型小鼠(N＝10)和纯合型CCR8基因缺陷小鼠(N＝5)的背部皮内移植3×105个大肠癌来源Colon26细胞(50uL)。对于野生型小鼠，在肿瘤移植3天后和10天后静脉内给药大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)或同型对照抗体(LTF-2,Bioxcell公司)100μg(100μL)(N＝5)。对于纯合型CCR8基因缺陷小鼠，也在肿瘤移植3天后和10天后静脉内给药大鼠抗小鼠CCR8抗体(克隆SA214G2、BioLegend公司)或同型对照抗体(LTF-2,Bioxcell公司)100μg(100μL)(N＝5)。给药后第7天起测定肿瘤的大小。
其结果是，在野生型小鼠中，与给药同型对照抗体的情况相比，通过给药抗小鼠CCR8抗体，全部例子中均观察到显著的肿瘤萎缩和最终的肿瘤完全萎缩。另一方面，在纯合型CCR8基因缺陷小鼠中，抗小鼠CCR8抗体给药组与同种型抗体相比，肿瘤的体积方面未观察到变化，另外也未观察到肿瘤萎缩(图38)。
在纯合型CCR8基因缺陷小鼠中，抗小鼠CCR8抗体的抗肿瘤效果完全消失，因此证明所使用的抗小鼠CCR8抗体(SA214G2)是介由CCR8而发挥抗肿瘤效果的。
产业上的可利用性
本发明的针对CCR8的抗体具有通过减少肿瘤内浸润性Treg细胞等来激活免疫的作用，作为用于治疗癌症的药物是有用的。
Claims (9)
1.一种癌症治疗用药物组合物，其含有针对CCR8的抗体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体为具有ADCC活性的抗体。
3.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体为CCR8的中和抗体。
4.根据权利要求1～权利要求3中任一项所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性Treg细胞的作用。
5.根据权利要求1～根据权利要求4中任一项所述的药物组合物，其中，针对CCR8的抗体具有除去肿瘤内浸润性巨噬细胞的作用。
6.根据权利要求1～根据权利要求5中任一项所述的药物组合物，其中，癌症为乳腺癌、大肠癌、肾癌或肉瘤。
7.一种用于癌症治疗的药物，其组合有针对CCR8的抗体、和抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
8.一种癌症的治疗方法，其特征在于，给药权利要求1～权利要求5中任一项所述的针对CCR8的抗体。
9.用于治疗癌症的权利要求1～权利要求5中任一项所述的针对CCR8的抗体。
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