JP6501171B2 - 癌治療用医薬組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、ＣＣＲ８に対する抗体を含有する癌治療用医薬組成物に関する。
腫瘍微小環境内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が媒介する免疫抑制をはじめとする強力な負の調節機構は、腫瘍の治療にとって大きな障害である（非特許文献１）。
例えば、腫瘍に浸潤するＣＤ４陽性Ｔｒｅｇ細胞は、抗腫瘍免疫応答を強力に阻害している可能性があり、効果的な癌治療の大きな障害となりうる。
ＣＤ４陽性ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞が媒介する腫瘍免疫抑制は、動物腫瘍モデルで十分に立証されており、腫瘍内も含めた全身性のＴｒｅｇ細胞除去により抗腫瘍効果が得られるが、一方で５０％程度の腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去では効果が認められないことが報告されている（非特許文献２）。
ヒトにおいて全ＣＤ４陽性Ｔ細胞集団中のＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇ細胞比（Ｔｒｅｇ細胞を含む細胞集団）の増大が、肺、乳房、および卵巣腫瘍をはじめとする、種々の癌患者の腫瘍内で検出され、存在比と患者生存率に負の相関があることが報告されている（非特許文献３〜８）。
抗ＣＤ２５抗体によってＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇ細胞を腫瘍内より除去することで、抗腫瘍効果を確認している。しかしＣＤ２５は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇ細胞および新たに活性化されたエフェクターＴ細胞の細胞表面にも発現するため、Ｔｒｅｇ細胞を特異的に除去しているとは言えない。またマウスにおいて抗ＣＤ２５抗体投与による抗腫瘍効果は限定的であり、腫瘍移植前の抗体投与でのみ治療効果を示し、腫瘍をマウスに生着させた後に抗体を投与する場合は治療効果がほとんどないことが種々の腫瘍モデルで証明されている。移植後１日目に抗ＣＤ２５抗体投与開始の場合、抗腫瘍効果は減弱し、移植後２日目以降の投与開始の場合、ほとんど抗腫瘍効果は認められていない（非特許文献９）。
現在までＴｒｅｇ細胞除去を目的として抗体をマウスに投与する薬効試験が実施されているが、抗腫瘍効果を示す報告はほとんどなく、移植前の抗体投与によるＴｒｅｇ細胞除去による抗腫瘍治療効果の確認は非常に困難である（非特許文献１０）。
ＣＣＲ８はＣＹ６、ＣＫＲ―Ｌ１またはＴＥＲ１とも呼ばれていた胸腺や脾臓等で発現しているＧ蛋白共役型７回膜貫通型のＣＣケモカイン受容体タンパク質であり、その遺伝子はヒトクロモゾームでは３ｐ２１に遺伝子が存在する。ヒトＣＣＲ８は３５５アミノ酸からなる（非特許文献１１）。ＣＣＲ８に対する内因性リガンドとしてはＣＣＬ１が知られている（非特許文献１２）。ヒトＣＣＲ８ ｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ ＡＣＣ Ｎｏ. Ｍ_００５２０１.３に示される塩基配列で構成され、マウスＣＣＲ８ ｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ ＡＣＣ Ｎｏ.ＮＭ_００７７２０.２に示される塩基配列で構成される。
Ｎａｔ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００６年、第６巻、第４号、ｐ．２９５-３０７ Ｅｕｒ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２０１０年、第４０巻、ｐ.３３２５-３３３５ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｏｎｃｏｌ.、２００６年、第２４巻, ｐ．５３７３-５３８０ Ｎａｔ. Ｍｅｄ.、２００４年、第１０巻, ｐ．９４２-９４９ Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｏｎｃｏｌ. 、２００７年、第２５巻, ｐ．２５８６-２５９３ Ｃａｎｃｅｒ、２００６年、第１０７巻, ｐ．２８６６-２８７２ Ｅｕｒ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ、２００８年、第４４巻, ｐ．１８７５-１８８２ Ｃｅｌｌ. Ｍｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２０１１年、第８巻, ｐ．５９-６６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、 １９９９年 Ｊｕｌ １; 第５９巻、第１３号、ｐ．３１２８-３３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.、 ２０１０年、第７０巻、第７号、ｐ．２６６５-７４ Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. 、 １９９６年、第１５７巻、第７号、ｐ．２７５９-６３ Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ.、１９９７年、第２７２巻、第２８号、ｐ．１７２５１-４
本発明が解決しようとする課題は、Ｔｒｅｇ細胞等による免疫抑制を阻害することにより、免疫を賦活させ、この機構を介した癌治療のための医薬組成物を提供することである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞及び腫瘍内浸潤マクロファージ細胞がＣＣＲ８を特異的に発現しており、ＣＣＲ８に対する抗体を投与することにより、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞及び腫瘍内浸潤マクロファージ細胞の細胞数が減少し、腫瘍の増殖が阻害されることを見出すことにより、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）ＣＣＲ８に対する抗体を含有する、癌治療用医薬組成物、
（２）ＣＣＲ８に対する抗体がＡＤＣＣ活性を有する抗体である、（１）記載の医薬組成物、
（３）ＣＣＲ８に対する抗体が、ＣＣＲ８の中和抗体である、（１）又は（２）のいずれかに記載の医薬組成物、
（４）ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有する、（１）〜（３）のいずれかに記載の医薬組成物、
（５）ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の医薬組成物、
（６）癌が乳癌、大腸癌、腎癌または肉腫である、（１）〜（５）のいずれかに記載の医薬組成物、
（７）ＣＣＲ８に対する抗体、及び抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を組み合わせてなる癌治療用の医薬、
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載のＣＣＲ８に対する抗体を投与することを特徴とする、癌の治療方法、
（８−１）ＣＣＲ８に対する抗体を投与することを特徴とする、癌の治療方法、
（８−２）ＣＣＲ８に対する抗体がＡＤＣＣ活性を有する抗体である、（８−１）記載の治療方法、
（８−３）ＣＣＲ８に対する抗体がＣＣＲ８の中和抗体である、（８−１）又は（８−２）記載の治療方法、
（８−４）ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有する、（８−１）〜（８−３）記載の治療方法、
（８−５）ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有する、（８−１）〜（８−４）記載の治療方法、
（８−６）癌が乳癌、大腸癌、腎癌または肉腫である、（８−１）〜（８−５）記載の治療方法、
（８−７）さらに、抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを特徴とする、（８−１）〜（８−６）記載の治療方法、
（９）癌を治療するための、（１）〜（５）のいずれかに記載のＣＣＲ８に対する抗体、
（９−１）癌を治療するための、ＣＣＲ８に対する抗体、
（９−２）ＣＣＲ８に対する抗体がＡＤＣＣ活性を有する抗体である、（９−１）記載のＣＣＲ８に対する抗体、
（９−３）ＣＣＲ８に対する抗体がＣＣＲ８の中和抗体である、（９−１）〜（９−２）記載のＣＣＲ８に対する抗体、
（９−４）ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有する、（９−１）〜（９−３）記載のＣＣＲ８に対する抗体、
（９−５）ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有する、（９−１）〜（９−４）記載のＣＣＲ８に対する抗体、
（９−６）癌が乳癌、大腸癌、腎癌または肉腫である、（９−１）〜（９−５）記載のＣＣＲ８に対する抗体、
（９−７）癌を治療するため使用される、（９−１）〜（９−６）記載のＣＣＲ８に対する抗体と抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組合せ、
に関する。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、癌の治療のための医薬として非常に有用である。
腎癌腫瘍内浸潤ＣＤ３+ ＣＤ４+ Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析である。ＣＤ２５分子及びＦｏｘＰ３分子を抗体で染色し、発現率を評価した。ＣＤ２５発現細胞はＦｏｘＰ３も発現していることを示す。 同一患者の末梢血単核細胞（以下、ＰＢＭＣとする。）中のＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５発現強度についてフローサイトメトリー解析結果を示す。ＣＤ３+ ＣＤ４+ Ｔ細胞について、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５発現量で図のように６つ（Ｆｒ１〜Ｆｒ６）に分画し、それぞれソーターで細胞を回収した。数値は各分画の細胞存在比率（％）である。この場合のＴｒｅｇ分画はＦｒ１とＦｒ２である。 腎癌腫瘍内浸潤細胞のＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５発現強度についてフローサイトメトリー解析結果を示す。腫瘍内浸潤ＣＤ３+ ＣＤ４+ Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５発現量で図のように４つ(Ｆｒ２〜Ｆｒ５)に分画し、それぞれソーターで細胞を回収した。数値は各分画の細胞存在比率（％）である。 図２、図３の各分画の細胞のＲＮＡ-Ｓｅｑ解析を行い、各分画のいずれがＴｒｅｇ細胞を含んでいるかをＴｒｅｇ特異的発現遺伝子であるＦｏｘＰ３及びＩＫＺＦ２のｍＲＮＡ発現量で検討した結果を示す。縦軸は正規化後の相対的ｍＲＮＡ発現量を示す。腫瘍内では両遺伝子ともＦｒ２とＦｒ３に強い発現が認められた。エフェクター細胞で発現するＩＬ-２やＩＦＮγはＦｒ４とＦｒ５で強い発現が認められた。 各分画におけるＦｏｘＰ３遺伝子座位のＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域(ｃｈｒＸ, ４９１１８０００-４９１１８５００, ｈｇ１９)の解析結果を示す。腫瘍内浸潤ＣＤ３+ ＣＤ４+ Ｔ細胞のＦｒ２及びＦｒ３分画のほとんどがＴｒｅｇ細胞であることが分かった。 図４と同様に各分画のＣＣＲ８のｍＲＮＡ発現量を解析した結果を示す。腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞分画であるＦｒ２とＦｒ３で強いＣＣＲ８の発現を示すのに対し、末梢血単核球(Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ; ＰＢＭＣ)中のＴｒｅｇ細胞ではほとんど発現は認められなかった。 マウスＣＣＲ８を発現するＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。マウスＣＣＲ８遺伝子を組込んだｐｃＤＮＡ３.４発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、Ｇ４１８で薬剤選択した。マウスＣＣＲ８の発現程度はＰＥ標識抗マウスＣＣＲ８抗体で発現を確認した。ｐｃＤＮＡ３.４ベクターを導入し、同様に薬剤選択をしたＨＥＫ２９３細胞を陰性対象とした。ほぼ全ての細胞がマウスＣＣＲ８を発現していることが示された。 抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)が、Ａｎｔｉｂｏｄｙ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ (ＡＤＣＣ)に必要なシグナル伝達経路の活性化能を有することを示す。 抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)がＡＤＣＣ活性を有することを示す。 抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)が、ＣＣＲ８を介した細胞内カルシウム流入を阻害する活性を有することを示す。アイソタイプコントロール抗体を陰性対象として用いた。 抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)がＣＴ２６細胞を認識しないことを示す。アイソタイプコントロール抗体を陰性対象として用いた。 ３例のマウス大腸癌細胞株ＣＴ２６細胞を移植したＢＡＬＢ/ｃマウスに、移植後３日目(ｄａｙ３)にコントロール抗体を投与し、投与後４日目又は７日目に腫瘍を摘出し、そこに存在するＴｒｅｇ細胞率をフローサイトメーターで解析した結果を示す。 図１２と同じ実験において、ＣＣＲ８+Ｔｒｅｇ細胞率をフローサイトメーターで解析した結果を示す。 腫瘍内ＣＤ１１ｂ+ Ｇｒ１+ ＣＤ２０６+ Ｍ２型マクロファージ細胞中のＣＣＲ８陽性細胞率をフローサイトメーターで解析した図である。どちらも４０−５０％の細胞がＣＣＲ８陽性Ｍ２型マクロファージ細胞であることを示す。 大腸癌細胞株ＣＴ２６細胞を移植したＢＡＬＢ/ｃマウスに、移植後３日目(ｄａｙ３)に抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いはアイソタイプコントロール抗体を投与し、移植後７日目又は１０日目に腫瘍を摘出、そこに存在するＴリンパ球及びマクロファージ細胞存在率を検証した実験の流れを示す。 移植後７日目(ｄ７)又は１０日目(ｄ１０)のＣＤ４５+ ＣＤ４+細胞中のＣＤ２５+ ＦｏｘＰ３+ 細胞比率を示す。 移植後７日目(ｄ７)のＣＤ１１ｂ+ Ｆ４/８０+マクロファージ細胞の比率を示す。 移植後７日目(ｄ７)のＩＡ/ＩＥ陽性（ＩＡ/ＩＥ＋）或いはＩＡ/ＩＥ陰性細胞（ＩＡ/ＩＥ−）の存在比率を示す。 大腸癌細胞株ＣＴ２６細胞を移植したＢＡＬＢ/ｃマウスに対し、移植後３日目(ｄ３)に抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いはアイソタイプコントロール抗体（ラット抗ＫＬＨ）を４００μｇ/マウスで単回投与し、移植後７日後(ｄ７)より３−４日おきに２１日(ｄ２１)後まで腫瘍径を測定した実験の流れを示す。 移植後の各個体の固形腫瘍径を測定、腫瘍体積を計算した結果である。 マウス各群の、移植後各時点での腫瘍体積の平均値である。標準偏差を同時に示している。有意水準***はｐ<０.００１、有意水準**はｐ<０.０１ (ｔ-ｔｅｓｔ)を示す。 ２ｘ１０５個の大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６細胞をＢＡＬＢ/ｃマウス背部皮内に移植し、移植後３日目(ｄ３)に抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いはアイソタイプコントロール抗体を４００μｇ/マウスで単回投与した。移植後３日後(ｄ３)より３−４日おきに１８日(ｄ１８)後まで腫瘍体積を測定した。各群の、移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。 プロットは個々のＦＡＣＳ解析の蛍光強度の平均値(ＭＦＩ)、中央横線はＭＦＩ値の１４例の平均値、縦線は標準偏差を示す。有意水準 ***は、Ｐ<０.００１を示す。 １４例のヒト腎癌腫瘍内のＣＤ３+ ＣＤ４+ ＦｏｘＰ３+ Ｔ細胞又はＣＤ３+ ＣＤ４+ ＦｏｘＰ３- Ｔ細胞について、アイソタイプコントロール抗体でのバックグラウンドレベル以上のＣＣＲ８陽性シグナルを示す細胞の比率（陽性率％）を、個体ごとにプロットしたものである。中央横線は１４例の陽性率の平均値、縦線は標準偏差を示す。 Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ (ＴＣＧＡ)データベースを利用した淡明細胞型腎細胞癌患者の腫瘍内細胞のＣＣＲ８のｍＲＮＡ発現量に基づき、発現高い群（Ｈｉｇｈ）, 低い群（Ｌｏｗ）で均等に２群に分け、それら各群の生存率についてのカプランマイヤー曲線を示す。縦軸は生存率、横軸は月数を示す。数値は各群の個体数である。Ｐ値はログランク検定値を示す。 図２５と同様の方法で、前立腺癌患者について解析した結果である。 図２５と同様の方法で、膀胱癌患者について解析した結果である。 図１１と同様に抗マウスＣＣＲ８抗体がＭｅｔｈＡ細胞及びＬＭ８細胞を認識しないことを示す。アイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏｔｙｐｅ）を陰性対象として用いた。 ３ｘ１０５個の骨肉種細胞株ＬＭ８細胞をＣ３Ｈ／Ｈｅマウス背部皮内に移植し、移植後３日目(ｄ３)に抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いはアイソタイプコントロール抗体（コントロール抗体）を４００μｇ/マウスで単回投与した。移植後７日後より３〜４日おきに３５日後まで腫瘍体積を測定した。各群の、移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。標準偏差を同時に示している。有意水準***はｐ<０.００１、有意水準**はｐ<０.０１、有意水準*はｐ<０.０５ (ｔ-ｔｅｓｔ)を示す。 １ｘ１０５個のＭｅｔｈＡ細胞をＢａｌｂ／ｃマウス背部皮内に移植し、移植後３日目に抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いはアイソタイプコントロール抗体（コントロール抗体）を４００μｇ/マウスで単回投与した。移植後１１日後より３〜４日おきに２１日後まで腫瘍体積を測定した。各群の移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。有意水準*はｐ<０.０５ (ｔ-ｔｅｓｔ)を示す。 １ｘ１０５個の乳癌細胞株ＥＭＴ６細胞をＢａｌｂ／ｃマウス背部皮内に移植し、移植後３日目及び１０日目に抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いはアイソタイプコントロール抗体を１００μｇ/マウスで投与した。移植後４日後より３−４日おきに２２日後まで腫瘍体積を測定した。各群の、移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。有意水準***はｐ<０.００１、有意水準**はｐ<０.０１(ｔ-ｔｅｓｔ)を示す。 ２ｘ１０５個の大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６細胞をＢＡＬＢ/ｃマウス背部皮内に移植し、移植後３日目及び１０日目に抗アイソタイプコントロール抗体（Ｉｓｏｔｐｅ抗体）、マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いは抗ＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４）を４００μｇ/マウスで投与した。移植後３日後より３〜４日おきに２４日後まで腫瘍体積を測定した。各群の移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。 ４ｘ１０５個のマウス腎癌由来細胞株ＲＡＧをＢＡＬＢ/ｃマウス背部皮内に移植し、腫瘍移植６日後にアイソタイプコントロール抗体、抗マウスＣＣＲ８抗体または抗マウスＰＤ−１抗体（抗ＰＤ―1抗体）を静脈内に１００μｇ（１００μＬ）投与し、移植後６日後より３〜４日おきに２１日後まで腫瘍体積を測定した。各群の移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。 ２ｘ１０５個の大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６細胞をＢＡＬＢ/ｃマウス背部皮内に移植し、移植後３日目及び１０日目に抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)或いはアイソタイプコントロール抗体（コントロール抗体）を４００μｇ/マウスで投与した。移植２４日後にマウス各臓器を回収し、その重量を測定した。各１０例の平均値を示す。 １ｘ１０５個のマウス乳癌細胞株ＥＭＴ６細胞をＢＡＬＢ/ｃマウス背部皮内に移植し、抗マウスＣＣＲ８抗体については移植後３日目及び１０日目、抗マウスＰＤ−１抗体については移植後８日目及び１３日目に静脈内投与した。コントロール群は移植後３日後及び１０日後にアイソタイプコントロール抗体を静脈内に投与した。移植後６日後より３〜４日おきに２７日後まで腫瘍体積を測定した。各群の移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。 図３５と同じ実験における、各群の移植後各時点での５０ｍｍ３以下にまで腫瘍が退縮した個体の割合を示す。 ４．５ｘ１０５個のマウス腎癌由来細胞株ＲＡＧをＢＡＬＢ/ｃマウス背部皮内に移植し、腫瘍移植８日後及び１５日後に生理食塩水、抗マウスＣＣＲ８抗体、抗マウスＰＤ−１抗体または抗マウスＣＣＲ８抗体及び抗マウスＰＤ−１抗体を静脈内に１００μＬ投与し、移植後８日後より３〜４日おきに３３日後まで腫瘍体積を測定した。各群の移植後各時点での腫瘍体積の中央値を示す。 Ｂａｌｂ／ｃ系統の野生型マウス及びＣＣＲ８遺伝子ホモ欠損マウスの背部皮内に２ｘ１０５個のＣＴ２６細胞を移植し（Ｎ＝５）、移植後にアイソタイプコントロール抗体又は抗マウスＣＣＲ８抗体を静脈内に投与した。移植後３〜４日おきに腫瘍体積を測定した。左図は野生型マウスについての各群の移植後各時点での腫瘍体積の平均値を、右図はＣＣＲ８遺伝子ホモ欠損マウスについての各群の移植後各時点での腫瘍体積の平均値を示す。
本発明の医薬組成物は、ＣＣＲ８に対する抗体を含有することを特徴とする、
本発明のＣＣＲ８はマウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ブタ、サル、ヒトを含む霊長類の哺乳動物を由来とするものを含む。好ましくはヒトＣＣＲ８である。
ＣＣＲ８に対する抗体は、ＣＣＲ８に結合する抗体であれば、ヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体またはヤギ由来抗体のいずれの抗体でもよく、さらにそれらのポリクローナル抗体、モノクローナル抗体でもよく、完全型抗体、抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖ断片）、キメラ化抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体のいずれのものでもよい。好ましくは、ヒト由来抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体である。
本発明の抗体は、ＣＣＲ８の全長タンパク質または部分タンパク質を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。なお、本発明の抗体は細胞表面上に発現するＣＣＲ８に結合することが望ましいため、部分タンパク質は、ＣＣＲ８の細胞外領域が望ましい。これらの抗原は、公知のタンパク質発現ならびに精製法によって調製することができる。
上記以外に、ＣＣＲ８に対する抗体の作成に適した抗原としては、例えば発現ベクターなどによりＣＣＲ８を強制発現させた細胞、ＣＣＲ８発現プラスミドベクター、ＣＣＲ８発現ウイルスベクター等（アデノウイルスベクターなど）があげられる。
ポリクローナル抗体は、公知の方法によって製造することができる。例えば、抗原タンパク質あるいはそれとキャリアー蛋白質との混合物で、適当な動物に免疫を行ない、その免疫動物から抗原タンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。用いられる動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモットが一般的に挙げられる。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを抗原タンパク質と共に投与することができる。投与は、通常約２週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうのが一般的である。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水などから採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、例えば、抗原結合固相あるいはプロテインＡ あるいはプロテインＧなどの活性吸着剤を用いた精製法、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法などの免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
モノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって調製することができる。具体的には、本発明の抗原を、必要に応じてフロイントアジュバントとともに、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜２１日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜１０日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生細胞を取得することができる。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、ｖｏｌ．２５６、ｐ４９５〜４９７）及びそれに準じた方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞を細胞融合させることによってハイブリドーマを調製することができる。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えばＰ３−Ｕ１、ＮＳ−１、ＳＰ−２、６５３、Ｘ６３、ＡＰ−１などを使用することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述のマウス免疫感作で用いた本発明の抗原に対する反応性を、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ等の測定法によって測定し、当該抗原あるいはハプテンに対して特異的結合を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって行う。そして、通常は抗原を固相化しそこに結合する培養上清中の抗体を、放射性物質、蛍光物質、酵素などで標識した二次抗体で検出する方法が用いられる。また、抗原の発現細胞を用いる場合には、該細胞にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に蛍光で標識した二次抗体を反応させた後、フローサイトメーター等の蛍光検出装置で該細胞の蛍光強度を測定することにより、該細胞膜上の本発明の抗原に結合できるモノクローナル抗体を検出することができる。
選択したハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養するか、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等で培養し、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。インビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
基本培地としては、例えば、Ｈａｍ’Ｆ１２培地、ＭＣＤＢ１５３培地あるいは低カルシウムＭＥＭ培地等の低カルシウム培地及びＭＣＤＢ１０４培地、ＭＥＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＡＳＦ１０４培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
本発明の抗体として、抗体遺伝子を抗体産生細胞、例えばハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌら、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１９９０年発行）。
具体的には、目的とする抗体を産生するハイブリドーマや抗体を産生する免疫細胞、例えば感作リンパ球等を癌遺伝子等により不死化させた細胞から、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えばグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ(１９７９) １８、５２９４-５２９９)等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ファルマシア製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥＫｉｔ (クローンテック製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８年、第８５巻、 ８９９８ページなど)を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３参照）。
上記以外の本発明の抗体の作製方法には、いわゆるファージディスプレイ技術（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１１０５（２００５））も用いることができる。具体的には、例えばヒトや動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターなど）のＢリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリー、もしくはヒトや動物のＧｅｒｍ Ｌｉｎｅ配列から選別、および改変して完全合成した抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させる。このとき、細胞表面に提示させる抗体の形態としてはＩｇＧ分子、ＩｇＭ分子、Ｆａｂフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント等が挙げられる。
こうして得た抗体フラグメント遺伝子は公知の方法によりＩｇＧ抗体遺伝子の対応領域と組替えることにより、抗体遺伝子を得ることができる。そして、このようにして得られた遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて抗体を産生することができる（例えば、Ｃａｒｌら、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１９９０年発行）。
本発明の抗体には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した抗体、例えば、キメラ化抗体、ヒト化抗体や、完全ヒト型抗体等が含まれる。
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン、糖鎖等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における抗体にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
本発明の抗体には抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が包含される。抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体としては、例えばα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を用いて作製される抗体が挙げられる。抗体のＦｃ領域にＮ−グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ−グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない本発明の抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有する。
また本発明の抗体は、そのＮ末端あるいはＣ末端に他のタンパク質を融合してもよい（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， １０， １２７４−１２８１）。融合するタンパク質は当業者が適宜選択することができる。
抗体断片とは、前述する本発明の抗体の一部であって、当該抗体と同様にＣＣＲ８に特異的な結合性を有する断片を意味する。抗体断片とは、具体的には、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、一本鎖抗体 （ｓｃＦｖ)、ジスルフィド安定化抗体(ｄｓＦｖ)、２量化体Ｖ領域断片 (Ｄｉａｂｏｄｙ)、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。
また、本発明の抗体は、２個の異なる抗原決定部位を有し、異なる抗原に結合する二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）でもよい。
ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；抗体依存性細胞介在性細胞傷害）活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を傷害する活性を意味する。エフェクター細胞としては、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
また、本発明の抗体は、Ｔｒｅｇ細胞又はマクロファージ細胞を除去させることが出来る点から、ＣＣＲ８を発現する細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する抗体が好ましい。本発明の抗体がこのようなＡＤＣＣ活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に記載の方法にて測定することができる。
本発明の医薬組成物に含まれるＣＣＲ８に対する抗体は、Ｔｒｅｇ細胞又はマクロファージ細胞の腫瘍内への集積を抑制する観点から、ＣＣＲ８の中和抗体が好ましい。ＣＣＲ８の中和抗体とは、ＣＣＲ８に対する中和活性を有する抗体を意味する。ＣＣＲ８に対する中和活性を有するか否かは、ＣＣＬ１のＣＣＲ８に対する生理作用を抑制するか否かを測定することにより判別できる。例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＣＬ１のＣＣＲ８への結合、あるいはＣＣＬ１によるＣＣＲ８発現細胞の遊走または細胞内Ｃａ＋＋増加またはＣＣＬ１刺激に感受性のある遺伝子の発現変動などを測定することが挙げられる。また、後述の実施例に記載の方法にて測定することもできる。
本発明のＣＣＲ８に対する抗体は、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有するものが好ましい。本発明の抗体が腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有しているか否かは、例えば、後述の実施例に記載の方法にて測定することができる。
本発明のＣＣＲ８に対する抗体は、腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有するものが好ましい。本発明の抗体が腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有しているか否かは、例えば、後述の実施例に記載の方法にて測定することができる。
本発明の抗体は、医薬組成物として有用である。したがって本発明の抗体を含む医薬組成物は、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、鼻腔内投与、吸入などを選択することができる。
本発明の「癌治療用医薬組成物」における「癌」には、すべての固形癌及び血液癌が含まれる。具体的には、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎癌、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、肉腫、血球癌（白血病、リンパ腫等）、胆管癌、胆のう癌、甲状腺癌、前立腺癌、精巣癌、胸腺癌、肝臓癌等が挙げられる。好ましくは乳癌、子宮体癌、卵巣癌、、肺癌、大腸癌、腎癌、肉腫が挙げられ、より好ましくは乳癌、大腸癌、腎癌、肉腫が挙げられる。
また、本発明の「癌治療用医薬組成物」における「癌」は、腫瘍特異抗原を発現する癌が好ましい。
なお、本明細書に記載の「癌」は、卵巣癌、胃癌等の上皮性の悪性腫瘍のみならず、慢性リンパ性白血病やホジキンリンパ腫等の造血器がんを含む非上皮性の悪性腫瘍も意味するものとし、本明細書において、「がん（ｃａｎｃｅｒ）」、「癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」、「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）」等の用語は互いに区別されず、相互に交換可能である。
本発明のＣＣＲ８に対する抗体は、
（１）本発明の医薬組成物の治療効果の補完及び／又は増強、
（２）本発明の医薬組成物の動態、吸収改善、投与量の低減及び／又は、
（３）本発明の医薬組成物の副作用の軽減、
のために他の薬剤と組み合わせて、併用剤として投与してもよい。
本発明のＣＣＲ８に対する抗体と他の薬剤の併用剤は、１つの製剤中に両成分を配合した配合剤の形態で投与してもよく、また別々の製剤にして投与する形態をとってもよい。この別々の製剤にして投与する場合には、同時投与および時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、本発明抗体を先に投与し、他の薬剤を後に投与してもよいし、他の薬剤を先に投与し、本発明化合物を後に投与してもかまわず、それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。
本発明のＣＣＲ８に対する抗体と併用してもよい他の薬剤としては、例えば抗ＰＤ―１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＣＴＬＡ−4抗体が挙げらる。抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が好ましく、抗ＰＤ―１抗体がより好ましい。
本発明において、抗ＰＤ―１抗体としては、例えば、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）が挙げられる。
本発明において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）が挙げられる。
本発明において、抗ＣＴＬＡ−4抗体としては、例えば、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）が挙げられる。
本発明の医薬組成物の対象患者は癌患者であるか又はその疑いがあることが想定される。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから１００ｍｇの範囲から選ばれる。あるいは、患者あたり５〜５０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇの投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗体又はその抗体断片を含む医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。また、投与期間は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。
腎癌腫瘍内浸潤細胞及びＰＢＭＣの抽出と解析
術前に抗癌剤や放射線等の治療を行っていない淡明細胞型腎細胞癌（ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ; ｃｃＲＣＣ）の患者（３例）から外科的治療により摘出された原発腫瘍組織の一部を用いて以下の解析を行った．腫瘍重量を測定後、腫瘍塊をハサミで２ｍｍ角に切断し、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ, ｈｕｍａｎ (１３０-０９５-９２９, Ｍｉｌｔｅｎｙｉ)及び ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（ＴＭ）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ (Ｍｉｌｔｅｎｙｉ, １３０-０９３-２３５)を用いてキットの添付プロトコルにしたがい腫瘍組織のホモジネートを作製した。ホモジネートを７０ｕｍのセルストレイナーに通し、溶血処理を行った後，３０%パーコール/ＰＢＳ溶液でデブリスおよび死細胞を除去し、腫瘍組織単細胞を得た。
同一患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は末梢血からＦｉｃｏｌｌ-ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ (ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社)を用いた密度勾配遠心法により分取した． 分離した腫瘍内細胞及びＰＢＭＣは細胞数を計測後、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＴＭ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, ４２２-３０１）及びＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲＴＭ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, ４２３１０５)を添付プロトコルにしたがい処理し、氷中で３０分間染色した。その後２%ＦＣＳ/ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳで１回洗浄後、以下の標識抗体、標識抗体添付プロトコルにしたがい染色した。
腫瘍内浸潤細胞については、抗ＣＤ３抗体 (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ ＵＣＨＴ１)、抗ＣＤ４抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ ＯＫＴ４), 抗ＣＤ２５抗体(ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ ＢＣ９６)、を用い氷中で３０分間反応させ，細胞表面の染色を行った．２%ＦＣＳ/ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳで２回洗浄後，Ｆｏｘｐ３ / Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ (ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, ００-５５２３-００) を使用し、キット添付プロトコル通りに細胞を固定、膜透過処置をした。さらにＰＥ標識抗ＦｏｘＰ３抗体 (ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ｃｌｏｎｅ ＰＣＨ０１０)を用いてＦｏｘＰ３を染色した。キット付属の洗浄液で１回洗浄後、フローサイトメトリー (ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ) により解析した。ｃｃＲＣＣ腫瘍内ＣＤ４+ ＣＤ２５+ Ｔ細胞はほぼすべてＴｒｅｇ細胞のマーカーであるＦｏｘＰ３を発現していることを確認した (図１)。
次いで，上記腫瘍内浸潤細胞及びＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体, 抗ＣＤ４抗体, 抗ＣＤ４５ＲＡ抗体(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｃｌｏｎｅ ＨＩ１００)及び抗ＣＤ２５抗体で染色し、ＣＤ３+ ＣＤ４+ Ｔ細胞について、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５発現量で二次元展開した。ＰＢＭＣの結果は図２であり、腫瘍内浸潤細胞の結果を図３に示す。腫瘍内浸潤細胞の場合は、セルソーター(ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ)を用いてＣＤ３+ ＣＤ４+ ＣＤ４５ＲＡ- でかつＣＤ２５発現強度を指標に図１Ｃに示すとおり強陽性細胞（Ｆｒ２）, 弱陽性細胞（Ｆｒ３）、陰性細胞（Ｆｒ４とＦｒ５）の４つに分画して、それぞれのフラクションに含まれる細胞を回収した。ＰＢＭＣも腫瘍内浸潤細胞と同様に二次元展開し、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ２５の発現強度を指標に図２に示すとおりＦｒ１〜Ｆｒ６に分画し、それぞれのフラクションに含まれる細胞を回収した。
分画した細胞からのＲＮＡの分離とｃＤＮＡ配列解析
分離回収された各細胞は、ＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒ (Ｑｉａｇｅｎ)に溶解し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ (Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ) を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。回収したＲＮＡは、ＳＭＡＲＴ-Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ (Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)を用いてｃＤＮＡ化し、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｉｌｌｕｍｉｎａ (Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を用いてライブラリー調整をおこなった。ｃＤＮＡ合成、ライブラリー調整は、常時Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ (Ａｇｉｌｅｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を用いてクオリティーコントロールをおこない、問題ないことを確認した。完成したｃＤＮＡライブラリーはＫＡＰＡ ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ (Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)を用いてタイトレーション後、Ｈｉｓｅｑ４０００ (ｉｌｌｕｍｉｎａ)を用いてペアエンドリードでＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇをおこない、各サンプルあたり１００塩基対の配列データを２０００万リード以上取得した(ｆａｓｔｑファイル)。
生データ(ｆａｓｔｑ ファイル)はＦａｓｔＱＣにより解析し、アダプター配列及びリピート配列はＣｕｔＡｄａｐｔを用いて除去した。各ペアエンドリードはｃｍｐｆａｓｔｑ_ｐｅプログラムを使用して各ペアを揃えた。ゲノムマッピングはｈｇ３８を参照配列として、Ｂｏｗｔｉｅ２を持つＴＯＰＨＡＴ２プログラムによりデフォルトセッティングでゲノムにマッピングした。マッピングされたリードはＳＡＭｔｏｏｌｓプログラムにより配列ソートされ、ＨＴＳＥＱプログラムによりリードカウントした。カウントデータの正規化はＤｅｓｅｑ２プログラムを使用した。得られた各分画について、どの分画がＴｒｅｇ細胞を含んでいるかを以下の方法で確認した。
Ｔｒｅｇ細胞はマーカー遺伝子としてＦｏｘＰ３及びＩｋｚｆ２遺伝子を恒常的に発現しており、また刺激により活性化していても、ＩＦＮγやＩＬ２はほとんど分泌しないことが判っている。Ｔｒｅｇ細胞が含まれているか否か、これら遺伝子の発現量を調べることで、ある程度確認することは可能である。上記ＲＮＡ-Ｓｅｑデータをもとに腫瘍浸潤細胞とＰＢＭＣの各分画について、これら遺伝子の発現量を調べた結果、腫瘍浸潤細胞中のＦｒ２、Ｆｒ３、 ＰＢＭＣのＦｒ２にＩｋｚｆ２とＦｏｘＰ３が特異的に発現し、それ以外の分画にはほとんど発現していないことが判明した（図４）。また腫瘍浸潤細胞のＦｒ４,５及びＰＢＭＣ細胞中のＦｒ４,Ｆｒ５にはＩＦＮγ（ＩＦＮｇａｍｍａ）及びＩＬ２が特異的に発現し、それ以外の分画には発現していないことが判明した。（図４）。以上より、腫瘍浸潤細胞中のＦｒ２、Ｆｒ３、ＰＢＭＣのＦｒ２にＴｒｅｇ細胞が含まれ、それ以外の分画には含まれていないことが判明した。
ＦｏｘＰ３領域の脱メチル化率の測定
ＦｏｘＰ３領域の脱メチル化率はＴｒｅｇ細胞の割合を正確に求める指標であるため、上記で得た腎癌腫瘍浸潤細胞のＦｒ２〜Ｆｒ５の細胞についてＦｏｘＰ３領域の脱メチル化率を検討した。ＦｏｘＰ３遺伝子の第一イントロン内の特定のＣｐＧ領域にはＴｒｅｇ細胞特異的に脱メチル化されている領域が存在する(ｃｈｒＸ, ４９１１８０００-４９１１８５００, ｈｇ１９)。腫瘍内浸潤細胞の各分画に含まれる細胞について、この領域の脱メチル化を解析することで、今回得られた分画がＴｒｅｇ細胞のみからなっているのか、それとも他の細胞も混在しているのかを検証可能である。
腫瘍内浸潤ＣＤ４+ Ｔ細胞の各分画(Ｆｒ２,３,４,５)を回収し、フェノール抽出法を用いてｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡを回収した。Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡに対し、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ Ｘｃｅｅｄ キット (Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ) を用いてＢｉｓｕｌｆｉｔｅ処理をおこない、Ｔｒｅｇ細胞特異的脱メチル化領域であるＦＯＸＰ３ ｉｎｔｒｏｎ１ 領域(ｃｈｒＸ, ４９１１８０００-４９１１８５００, ｈｇ１９)に対しアンプリコンＰＣＲをおこなった。ＤＮＡメチル化の検出は、メチル化ＤＮＡ特異的ＦＡＭ蛍光プローブと脱メチル化特異的ＶＩＣ蛍光プローブを用意し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステム (Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)によりおこなった。アンプリコンＰＣＲ後、ＦＡＭおよびＶＩＣ蛍光プローブの発光数をカウントし、両蛍光数の比率からＤＮＡメチル化率を算出し、各分画(Ｆｒ２〜Ｆｒ５)のメチル化率とした。
その結果腫瘍内浸潤細胞中のＦｒ２及びＦｒ３に含まれる細胞では、ＦＯＸＰ３ ｉｎｔｒｏｎ１ 領域（ｃｈｒＸ, ４９１１８０００-４９１１８５００）内のＣｐＧ配列の９５%以上が脱メチル化されており、Ｆｒ４及びＦｒ５の脱メチル化率は５０％以下であった。このことから、Ｆｒ２及びＦｒ３に含まれる細胞のほぼすべてがＴｒｅｇ細胞であると判明した（図５）。
ＣＣＲ８の同定
Ｔｒｅｇ細胞(腫瘍浸潤細胞中のＦｒ２)に特異的に発現する一群の遺伝子を同定するために腫瘍由来の各ＣＤ４+ Ｔ細胞分画と同一患者ＰＢＭＣ由来ＣＤ４+ Ｔ細胞分画の遺伝子発現データについて階層的クラスター解析を行い、Ｔｒｅｇ細胞中のＦｒ２に発現し、腫瘍由来Ｆｒ５及び、ＰＢＭＣのＦｒ４, Ｆｒ５にはほとんど発現していない遺伝子としてＣＣＲ８を同定した（図６）。
マウスＣＣＲ８強制発現細胞の作製
マウスＣＣＲ８(以下、ｍＣＣＲ８と記載する場合がある。)のＯＲＦ全長を発現ベクター(ｐｃＤＮＡ３.４)に挿入し、ｐｃＤＮＡ３.４- ｍＣＣＲ８プラスミドを構築した。塩基配列はアミノ酸を変更しない範囲で、哺乳類で使用頻度の高いコドンに変更した。ＨＥＫ２９３細胞にリポフェクタミン３０００を用いてｐｃＤＮＡ３.４及びｐｃＤＮＡ３.４- ｍＣＣＲ８発現プラスミドをそれぞれ導入し、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ(Ｇ４１８)濃度１ｍｇ/ｍｌで２週間薬剤選択を行った。
生き残った細胞をトリプシンで剥離し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ培地で洗浄後、ＰＥ標識抗ｍＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２）を１/２００希釈で添加、３０分間氷上で抗体を反応させ、その後ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで１回洗浄し、細胞表面に発現するｍＣＣＲ８を標識した。セルソーター（ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ）によりｍＣＣＲ８発現している細胞集団をソーティングにより濃縮した。陽性細胞集団をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（１ｍｇ/ｍｌのＧ４１８含有培地）存在下で３７℃ ＣＯ２インキュベーターで２週間培養した。ｐｃＤＮＡ３．４ を形質転換した細胞は薬剤選択のみを行い、ソーティングはしなかった。発現確認のため両細胞を市販抗ＰＥ標識抗マウスＣＣＲ８抗体(クローンＳＡ２１４Ｇ２）で染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ）で解析した。その結果を示す（図７）。ｐｃＤＮＡ３．４を形質転換した細胞と比較して、ｐｃＤＮＡ３．４−ｍＣＣＲ８を形質転換した細胞は、９９％以上の細胞でｍＣＣＲ８の発現を認めた。
抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)のＦｃγＲ刺激能の検討
抗マウスＣＣＲ８抗体(クローンＳＡ２１４Ｇ２, ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社より購入)のＡＤＣＣ活性に必要なＦｃｇＲ刺激能をｍＦｃγＲＩＶ ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ Ｃｏｒｅ ｋｉｔ (Ｐｒｏｍｅｇａ社)を用いて評価した。本キットではエフェクター細胞上のＦｃγＲの活性化が当該細胞のＮＦＡＴプロモーター下流につないだルシフェラーゼ遺伝子の発現量で示され、これを定量することでＦｃγＲシグナルの活性化を定量可能となる。
以下、簡単に記述する。トリプシンで剥離したｍＣＣＲ８発現ＨＥＫ２９３ターゲット細胞（ターゲット細胞）１ｘ１０５/ｗｅｌｌとキット添付ＦｃγＲ発現エフェクター細胞を１：１．５の比率で、９６ｗｅｌｌプレート中で混合した。細胞混合後すぐにｍＣＣＲ８抗体を添加した。その濃度は図８に示すように３３ｕｇ/ｍｌから０.０３３ｕｇ/ｍｌでとした（Ｎ＝２）。エフェクター細胞のみを陰性対象とした。抗体添加後１４時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した（図８）。Ｎ＝２の平均値を表示する。
結果、陰性対象ではいかなる抗体濃度でもルシフェラーゼ活性は認められなかったのに対し、ターゲット細胞添加群では抗体濃度依存的な活性が認められた。縦軸は発光量相対値を示す。図８より最大活性値は約６０００Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ (Ｒ.Ｌ.Ｕ)であり、ＥＣ５０値（約３５００Ｒ.Ｌ.Ｕ)は約０.１μｇ/ｍｌであった(図中のライン）。以上の結果より抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)がＦｃγＲＩＶを活性化できることを明らかにした。
ＡＤＣＣ活性の測定
実施例５で作製したｍＣＣＲ８安定発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて、抗ｍＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)の細胞傷害活性を評価した。
Ｃ５７ＢＬ/６マウスの脾臓を分離し、脾臓細胞をセルストレイナーに通して回収した。細胞を洗浄後、ビオチン化抗ＣＤ４９ｂ (ｃｌｏｎｅ ＤＸ５) 抗体を４℃で３０分反応させ、洗浄後にストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてＮＫ細胞を精製し、エフェクター細胞とした。マウスＣＣＲ８発現ＨＥＫ２９３細胞は、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ (ＣＴＶ) （サーモフィッシャー社、Ｃ３４５５７）を用いて終濃度２.５ｕＭで染色し、標的細胞（ターゲット細胞）とした。９６ｗｅｌｌ プレート中でエフェクター細胞 : 標的細胞 = ５ : １(エフェクター細胞数は２.５ｘ１０５)の比率で２００μＬに混合し、抗マウスＣＣＲ８抗体またはアイソタイプコントロール抗体 (ラットＩｇＧ２ｂ, ｃｌｏｎｅ ＲＴＫ４５３０) を終濃度１μｇ/ｍｌで添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で一晩培養した。その後， ＰＥ標識Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ (ＡｎｎｅｘｉｎＶ-ＰＥ, ＭＢＬ社、４６９６-１００)を添付プロトコルに従い１/１００希釈で添加し、３７℃で３０分染色後、１回洗浄した。フローサイトメーターでＣＴＶ染色された標的細胞中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ陽性アポトーシス細胞率を解析した。トリプリケート(Ｎ＝３)で実施し、その平均値と標準偏差を示す。２回同様の実験を行った代表例を示す。(図９)。アイソタイプコントロール抗体と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体を添加すると、標的細胞中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ 陽性細胞率が６倍程度有意に増加した。以上より抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)はＡＤＣＣ活性を有することが判明した。
ＣＣＲ８に対する中和活性の測定
マウスＣＣＲ８安定発現ＨＥＫ２９３細胞を用いてマウスＣＣＲ８のリガンドであるマウスＣＣＬ１による細胞内カルシウム流入を指標として抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)のＣＣＲ８に対する中和活性を評価した。
カルシウム測定には以下の試薬を使用した。
ＨＥＰＥＳ (ＷＡＫＯ ＣＡＳ.ＮＯ７３６５-４５-９)
ＨＢＳＳ(+) ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ (ＷＡＫＯ)
Ｆｌｕｏ３-ＡＭ (ｃａｔ Ｆ０２３ 同人化学）
プロベネシド (ＣＡＳ-Ｎｏ:５７-６６-９, ナカライテスク)
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７ (Ｐ３０００ＭＰ; Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社)
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳ/０.１% ＢＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ (ＨＢＳＳに終濃度１０ｍＭ ＨＥＰＥＳと終濃度０.１% ＢＳＡになるようにそれぞれ添加）
Ｆｌｕｏ３-ＡＭを４μｍｏｌ/Ｌ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７を０.０４%の終濃度で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳ Ｂｕｆｆｅｒに溶解した。この溶液に細胞を懸濁し、３７℃で１時間インキュベートすることで、Ｆｌｕｏ３-ＡＭを細胞に取り込ませた。その後細胞を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳ/０.１%ＢＳＡ溶液で３回洗浄し、１.２５ｕＭ プロベネシドを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳ/０.１%ＢＳＡ 溶液に ２ｘ１０５/ｍｌの細胞濃度になるように懸濁した。そして、１０分間３７℃、ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。さらに抗ｍＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)あるいはＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体(Ｃｌｏｎｅ ＬＴＦ-２, Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ)を５μｇ/ｍｌの濃度で添加した。さらに２０分間３７℃でインキュベートした。
細胞は２ｍＬ溶液を水晶ガラス製キュベットに入れ、予め測定室を３５℃に温度設定しておいた分光光度計ＨＩＴＡＣＨＩ Ｆ７０００にセットした。測定条件は下記のとおりである。
励起波長 ５０８.０ｎｍ、蛍光（測定）波長 ５２７.０ｎｍ、励起側スリット５ｎｍ、蛍光側スリット ５ｎｍ、ホトマル電圧 ９５０Ｖ、レスポンス ０.５ｓ
蛍光波長が安定するまで約３０秒間スターラーで撹拌しながらインキュベートした。波長が安定したら、マウスＣＣＬ１を終濃度５０ｎＭ(４μＬ)になるように添加し、測定を開始した。測定の結果、抗ｍＣＣＲ８抗体を予め添加することより、ｍＣＣＬ１による細胞内カルシウム流入がほぼ完全に抑制されることが判明した（図１０）。コントロール抗体添加では抑制は認められなかった。なお、グラフ中のギャップはアゴニストを細胞に投与するために機器の蓋の開閉をした際のものである。以上より抗ｍＣＣＲ８抗体（ＳＡ２１４Ｇ２）抗体はマウスＣＣＲ８に対する中和活性を有することが判明した。
ＣＴ２６におけるｍＣＣＲ８の発現の確認
ＣＴ２６細胞を６ウェルディッシュで培養し、約５０%のコンフルエント状態になった時点で培養液を除去し、１０ｍＭ ＥＤＴＡ/ＰＢＳを５ｍｌ添加し、３７℃で５分間インキュベートした。その結果細胞はほぼすべて剥離され、ピペットでサスペンドすることで、ほぼ単一細胞にまで分離できた。２回Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＣＳで洗浄し、Ｄ-ＭＥＭ/１０%ＦＣＳにサスペンドし、ＬＩＶＥ/ＤＥＡＤ（登録商標） Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ-ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ (ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, Ｌ３４９７５)とＡＰＣ標識抗ｍＣＣＲ８(ＳＡ２１４Ｇ２)又はＡＰＣ標識Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体で、氷中で細胞を染色した。１時間後に３回Ｄ-ＭＥＭ/１０%ＦＣＳで洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ）でｍＣＣＲ８発現率を解析した。Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体を用いてバックグラウンドを設定し、バックグラウンドレベル以上の陽性細胞率（Ｐ６）とＡＰＣ蛍光の中央値(Ｍｅｄｉａｎ)を算出した（図１１）。その結果ＡＰＣ蛍光強度の中央値に差は認められず、また陽性細胞も０.２%とほとんど認められなかった。以上より、ＣＴ２６細胞は抗ｍＣＣＲ８抗体には認識されず、ＣＴ２６細胞はｍＣＣＲ８を発現しないことが確認された。
大腸癌細胞株のＣＴ２６細胞を用いて腫瘍内浸潤細胞のＣＣＲ８発現確認
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７ｗ、メス）の背部皮内に３ｘ１０５個(５０μＬ)のＣＴ２６細胞(Ｎ=３)を移植し、移植３日目にラット抗ＫＬＨ(キーホールリンペットヘモシアニン、Ｃｌｏｎｅ ＬＴＦ-２)抗体(ＩｇＧ２ｂ)４００μｇを腹腔内に投与した。投与後４日目(４ｄ)と７日(７ｄ)目に、３例の個体より腫瘍を回収した(Ｎ=３)。ＣＴ２６細胞の腫瘍塊を、ハサミで細かく切断し、市販キット（Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ, ｍｏｕｓｅ, Ｍｉｌｔｅｎｙｉ と ｔｈｅ ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（ＴＭ） Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ, Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｃａｔ. １３０-０９５-９２９)を用いて添付キットプロトコルに従い、腫瘍浸潤細胞を調製した。
調製された細胞は７０ｕｍのセルストレイナーに通した後、２回１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳ/２%ＦＢＳで洗浄した。その後、赤血球溶解液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）で５分間処理し、赤血球を除去し、さらに２%ＦＣＳ(Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ)/１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳバッファーで２回洗浄した。腫瘍浸潤細胞を２つに分け、一つはＴｒｅｇ細胞の同定、もう一方はミエロイド系（マクロファージ）細胞の同定を行った。以下の方法及び抗体により細胞を染色した。使用した抗体及び染色試薬、アッセイバッファーは下記の通りである。
以下が使用した抗体である。
（Ｔｒｅｇ細胞確認用抗体セット）
ＰＥ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ/ｒａｔ ＦｏｘＰ３ (ｃｌｏｎｅ ＦＪＫ-１６ｓ) ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ/Ｃｙ５.５ (ｃｌｏｎｅ ＲＭ４-５)ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ａ ＦＩＴＣ (ｃｌｏｎｅ ５Ｈ１０-１)Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
Ｂｖ４２１ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ２５ (ｃｌｏｎｅ ＰＣ６１) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
Ｂｖ５１０ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５ (ｃｌｏｎｅ ３０-Ｆ１１) Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
ＡＦ６４７ Ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＣＲ８ (ｃｌｏｎｅ ＳＡ２１４Ｇ２) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
ＡＦ６４７ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ (ｃｌｏｎｅ ＲＴＫ４５３０) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ(ＣＣＲ８の陰性コントロール)
（ミエロイド、マクロファージ細胞確認用抗体セット）
ＡＦ６４７ Ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＣＲ８ (ｃｌｏｎｅ ＳＡ２１４Ｇ２) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
ＡＦ６４７ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ (ｃｌｏｎｅ ＲＴＫ４５３０) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ(ＣＣＲ８の陰性コントロール)
Ｂｖ５１０ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５ (ｃｌｏｎｅ ３０-Ｆ１１) Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
ＦＩＴＣ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ Ｇｒ-１(ｃｌｏｎｅ ＲＢ６-８Ｃ５) Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ
Ｂｖ４２１ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ Ｆ４/８０ (ｃｌｏｎｅ ＢＭ８) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
ＰＥＣｙ７ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｂ (ｃｌｏｎｅ Ｍ１/７０) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
ＰｅｒＣＰ/Ｃｙ５.５ Ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ ＩＡ/ＩＥ (ｃｌｏｎｅ Ｍ５/１１４.１５.２)ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
ＰＥ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ２０６ (ｃｌｏｎｅ Ｃ０６８Ｃ２) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
（その他、使用した試薬）
Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ (ｃａｔ ｎｏ.４２３１０６) ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ
ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ (ｃａｔ ｎｏ.５６２５７４)
ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ (ｃａｔ ｎｏ.５５５８９９)
ＨＢＳＳ(-) Ｗａｋｏ ０８４-０８３４５
ＦＣＳ(Ｈｙｃｌｏｎｅ ｃａｔ ｎｏ.ＳＨ３００７０.０３)
染色の方法は以下の通りである。浸潤細胞をＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ試薬を用いて、３０分間氷中で染色した。２%ＦＣＳ/１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳで１回洗浄後、Ｔｒｅｇ及びＣＣＲ８陽性細胞については、Ｂｖ５１０標識抗ＣＤ４５、 ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５標識抗マウスＣＤ４、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８，Ｂｖ４２１標識抗マウスＣＤ２５、ＡＦ６４７標識抗マウスＣＣＲ８抗体（又はＡＦ６４７標識されたアイソタイプコントロール抗体）で染色した。単球系細胞についてはＢｖ５１０標識抗ＣＤ４５、ＦＩＴＣ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ Ｇｒ-１、ＰＥＣｙ７ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｂ、Ｂｖ４２１ ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ Ｆ４/８０、ＰｅｒＣＰ/Ｃｙ５.５標識 ＭＨＣクラス２(ＩＡ/ＩＥ)抗体，ＰＥ標識 ａｎｔｉ-ｍｏｕｓｅ ＣＤ２０６抗体で染色した。
染色は３０分間氷中で実施した。２%ＦＣＳ/ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳで２回洗浄後、細胞を市販キット（ＦｏｘＰ３ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社)を用いて添付プロトコルにしたがい固定し、ＰＥ標識抗ＦｏｘＰ３抗体を用いて細胞内ＦｏｘＰ３を染色した。当該キット添付バッファーで洗浄後、フローサイトメーターを用いて細胞を解析した。
ＣＤ４５+ＣＤ４+Ｔ細胞を解析した。ＣＤ４５+ＣＤ４+Ｔ細胞中でアイソタイプコントロール抗体での染色により陰性細胞領域を決定し、抗マウスＣＤ２５及び抗マウスＦｏｘＰ３抗体でどちらも陽性となる細胞をＴｒｅｇ細胞として、投与４日後（移植７日後）と投与７日後（移植１０日後）の存在頻度を算出した。その結果、マウス腫瘍内のＣＤ４５+ＣＤ４+Ｔ細胞中の約２３％（４ｄ）と約３０%（７ｄ）がＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞であった（図１２）。
次にＣＤ４５+ＣＤ４+ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３+Ｔ細胞中のＣＣＲ８発現を解析した。ＣＤ４５+ＣＤ４+ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３+Ｔ細胞をアイソタイプコントロール抗体で染色することより陰性細胞領域を決定し、抗マウスＣＣＲ８抗体で陽性となる細胞をＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇ細胞として、投与４日後（移植７日後）と投与７日後（移植１０日後）の存在頻度を算出した（図１３）。その結果マウス腫瘍内のＣＤ４５+ＣＤ４+ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３+Ｔ細胞中の約５０％（４ｄ）と約６７%（７ｄ）がＣＣＲ８＋細胞であった（図１３）。
ミエロイド系細胞については、フローサイトメーターでＣＤ４５+細胞とＦＳＣ/ＳＳＣでミエロイド系集団にゲートし、そのうち ＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１+ＣＤ２０６＋細胞中のＣＣＲ８+細胞率を解析した。その結果移植７日後（投与後４日後）と１０日後（投与後７日後）のどちらも４０−５０％の細胞でＣＣＲ８陽性であることが判明した（図１４）。またこれとは異なるマクロファージ細胞集団として、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋細胞(Ｎ=３)でのＣＣＲ８発現率を同様に測定した所、移植１０日目（７ｄ）の時点で４５．３％（表準偏差±８．２％）の当該細胞で発現していることを確認した。以上の結果から腫瘍内浸潤細胞の少なくともＣＤ４+ＣＤ２５+ＦｏｘＰ３+Ｔ細胞とＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＣＤ２０６+マクロファージ（Ｍ２型マクロファージといわれている）でＣＣＲ８が発現していることが判明した。
抗ｍＣＣＲ８抗体投与による腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞或いは腫瘍内浸潤マクロファージ細胞の除去効果の検討
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７ｗ、メス）の背部皮内に３ｘ１０５個のＣＴ２６細胞（５０ｕＬ)を移植した。移植３日後にラット抗マウスＣＤ１９８（ＣＣＲ８）抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）或いはアイソタイプコントロール抗体（Ｃｌｏｎｅ ＬＴＦ-２）を尾静脈内に４００μｇ（液量４００μＬ）投与した（各群Ｎ＝３）。腫瘍移植７日後（抗体投与後４日）と１０日後（抗体投与後７日）に腫瘍を回収し、腫瘍内浸潤細胞を調製し、解析した（図１５）。
腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞は実施例１０と同様の方法で回収した。用いた抗体は実施例１０と同じである。
まず最初に、浸潤細胞をＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔを用いて、３０分間氷中で染色した。２%ＦＣＳ/１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳで１回洗浄後、Ｂｖ５１０標識抗ＣＤ４５、ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５標識抗マウスＣＤ４、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８抗体，Ｂｖ４２１標識抗マウスＣＤ２５、ＡＦ６４７標識抗マウスＣＣＲ８抗体（又はＡＦ６４７標識されたアイソタイプコントロール抗体）で染色した。染色は３０分間氷中で実施した。２%ＦＣＳ/ＨＥＰＥＳ/ＨＢＳＳで２回洗浄後、細胞を市販キット（ＦｏｘＰ３ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社)を用いて添付プロトコルにしたがい固定し、ＰＥ標識抗ＦｏｘＰ３抗体を用いて細胞内ＦｏｘＰ３を染色した。当該キット添付バッファーで洗浄後、フローサイトメーターを用いて細胞を解析した。
ＣＤ４５＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞をマウスＴｒｅｇ細胞とした。Ｔｒｅｇ細胞中でＡＦ６４７標識されたアイソタイプコントロール抗体での染色により陰性細胞領域を決定し、ＡＦ６４７標識された抗マウスＣＣＲ８抗体でコントロールと比較して陽性となる細胞をＣＣＲ８陽性細胞としてその頻度を算出した。
その結果、図１６のようにアイソタイプ抗体投与マウスの腫瘍内ＣＤ４５+ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）比率を１００％とした場合の（１０日後）抗マウスＣＣＲ８(ＳＡ２１４Ｇ２)抗体投与マウスでの同細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の陽性率は、腫瘍移植７日後（抗体投与後４日）で約８０％、１０日後（抗体投与後７日）で約４０％であった（図１６）。有意水準**はＰ<０.０１(ｔ検定)であった。以上より抗ＣＣＲ８抗体投与７日後で腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞の約６０％が抗ＣＣＲ８抗体により除去されていることが示された。
上記と同様に移植後７日目(ｄ７)の腫瘍より腫瘍浸潤細胞を分離し、ＣＤ４５+細胞のうち、ＦＳＣ/ＳＳＣでミエロイド集団にゲートし(ＦＳＣ/ＳＳＣ+と表記する)、その細胞中のＣＤ１１ｂ+ Ｆ４/８０+ 細胞について解析した。Ｆ４/８０(Ｌｙ７１９)はマウス成熟マクロファージと単球のマーカーである。図１７に示すとおり、アイソタイプコントロール(Ｎ=３)と比較して抗ｍＣＣＲ８抗体投与群(Ｎ=３)で、ＣＤ１１ｂ+ Ｆ４/８０+ 細胞の存在比率が減少した（ｔ検定; Ｐ=０.０６２）。グラフはＣＤ４５+ ＦＳＣ/ＳＳＣ+ 単核球細胞集団中のＦ４/８０+細胞の存在比率を示す。
図１７でＦ４/８０+細胞をさらにＭＨＣ(腫瘍組織適合抗原)クラス２分子のうち、ＩＡ/ＩＥ陽性或いはクラス２(ＩＡ/ＩＥ)陰性細胞の存在比率を示す。図１８に示すとおり、アイソタイプコントロール(Ｎ=３)と比較して、抗ｍＣＣＲ８抗体投与群(Ｎ=３)で、ＩＡ/ＩＥ陰性群で減少傾向を示し、ＩＡ/ＩＥ陽性群では有意に減少した（ｔ検定;有意水準*; Ｐ<０.０５）。以上よりマウスＣＴ２６腫瘍内単球/マクロファージ集団或いはその一部の集団の腫瘍内細胞数が減少していることが判明した。
大腸癌由来ＣＴ２６を用いた抗ｍＣＣＲ８抗体投与による抗腫瘍効果の評価
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に３ｘ１０５個の大腸癌由来ＣＴ２６細胞(５０ｕＬ)を移植した。腫瘍移植３日後にラット抗マウスＣＤ１９８（ＣＣＲ８）抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を静脈内に４００μｇ（４００μＬ）投与した（Ｎ＝１０）。コントロールはアイソタイプコントロール抗体を投与した（Ｎ＝１０）。腫瘍移植８日後（抗体投与後５日）より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図１９）。
その結果移植７日目にはアイソタイプコントロール抗体投与群と比較して、抗ｍＣＣＲ８投与群で有意差は認められなかったが、１１日目、１４日目、１７日目、２１日目において有意に抗ｍＣＣＲ８抗体投与群の腫瘍体積が減少した（有意水準は１１日目と１４日目が、***；Ｐ<０.００１、１７日目と２１日目が**; Ｐ<０.０１）。また抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では１４日目以降腫瘍体積が減少し、１７日目にはほぼ完全に消失した（個体別データは図２０、平均値データは図２１に示す。）。以上の結果より、抗ｍＣＣＲ８抗体投与により、免疫抑制細胞として指摘されているＴｒｅｇ及び単球/マクロファージに発現するｍＣＣＲ８の機能を抑制し、あるいはそれら発現細胞を抗体のＡＤＣＣ活性により死滅（除去）することで、腫瘍免疫が亢進し、腫瘍の退縮、消滅につながったと結論した。
多くの文献等ですでに報告されているが、マウスＴｒｅｇ細胞のマーカーであるマウスＣＤ２５に対する特異的抗体（抗ＣＤ２５）をマウスに投与し、マウスＴｒｅｇ細胞を除去した場合、腫瘍移植前の投与では弱い抗腫瘍効果を示し、移植後２日目以降での投与では、まったく抗腫瘍効果を示さないことが報告されている。我々も今回と同じＣＴ２６細胞系で抗ＣＤ２５抗体の移植後３日目での投与を実施したが、まったく抗腫瘍効果は認められなかった。以上より、抗ＣＤ２５抗体と比較して、抗ｍＣＣＲ８抗体の方が強い薬効を有していると結論した。
次にＣＴ２６を用いて、マウスＰＤ−１に対する特異抗体である抗ＰＤ-１抗体(ｃｌｏｎｅ ＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ 社)の薬効評価を行い、抗ｍＣＣＲ８と比較検討した。マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に２ｘ１０５個の大腸癌由来ＣＴ２６細胞(５０μＬ)を移植した。移植後７日目より抗ＰＤ-１抗体(２００μｇ/ｈｅａｄ, ｉ.ｐ.)を３〜４日おきに計３回実施した。
その結果アイソタイプコントロール抗体を投与した群(Ｎ=８)と比較して抗ＰＤ-１抗体を投与した群(Ｎ=８)で抗腫瘍効果が認められた。移植後１４、１７、２０日目でのアイソタイプコントロールの腫瘍体積の平均と標準偏差は、それぞれ６０１.７±３７８.１ｍｍ３、９５６.３±４６７.７ｍｍ３及び１５２８.４±７７４.１ｍｍ３であり、一方抗ＰＤ-１抗体投与群ではそれぞれ１７５.３±４２.６ｍｍ３、１７４.７±５５.８ｍｇ及び２０９.６±９９.８ｍｍ３であった。抗ＰＤ-１抗体は移植後１４、１７、２０日目のいずれの時点においてもコントロールと比較して腫瘍体積の増加が有意に抑制されていた。しかし腫瘍が完全に消失した個体は、観察期間（移植後２０日目まで）では８匹中１匹であった。一方抗ｍＣＣＲ８抗体投与では同期間中に、１０匹全例で、腫瘍の完全消失が認められた。以上より、標準的な投与法での抗ＰＤ-１抗体と比較して、抗ｍＣＣＲ８抗体の方が強い薬効を有していると結論した。
抗ｍＣＣＲ８抗体投与マウスにおける自己免疫疾患の惹起の有無の確認
次に実施例１２での、投与後１８日目までのマウスの状態について評価した。コントロール抗体投与群と抗ＣＣＲ８抗体投与群間で、当該期間中の体重に有意差は無かった。またどちらの群も立毛は認められなかった。投与後１８日目に解剖した。コントロールと比較して抗ＣＣＲ８抗体投与群で、リンパ節及び腸管の肥大があるか検討したが、どちらも違いはなく、肥大は認められなかった。以上の所見より、抗ＣＣＲ８抗体投与マウスにおいて、抗腫瘍効果を発揮した期間中に、自己免疫疾患の兆候は認められないと結論した。一般的には、抗腫瘍効果が惹起される程度まで、マウスの全身のＴｒｅｇを除去すると、除去後１４日程度で重篤な自己免疫疾患が惹起されることが論文で報告されており、Ｔｒｅｇ抑制療法をふくむ腫瘍免疫療法の懸念材料となっている。今回の結果は、抗ＣＣＲ８抗体投与により強い抗腫瘍免疫効果が認められたマウスにおいて、抗体投与後１８日目においても自己免疫疾患はまったく惹起されていなかった。その一つの説明として、マウスおよびヒトＣＣＲ８は腫瘍組織と比較して、ＰＢＭＣ、脾臓、リンパ節での発現が低いことが報告されている。しかしこれら末梢組織でＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇ細胞を除去あるいは機能阻害した場合に、自己免疫疾患が惹起されるか否かは今まで報告がなかった。今回初めて、自己免疫疾患を惹起しないことが判明し、従来の知見からは予測できない効果と考えられる。
大腸癌由来Ｃｏｌｏｎ−２６を用いた抗ｍＣＣＲ８抗体投与による抗腫瘍効果の評価
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に２ｘ１０５個の大腸癌由来Ｃｏｌｏｎ−２６細胞(５０μＬ)を移植した。腫瘍移植３日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を静脈内に４００μｇ（４００μＬ）投与した（Ｎ＝１０）。コントロールはアイソタイプコントロール抗体を投与した（Ｎ＝１０）。腫瘍移植３日後（抗体投与後５日）より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した。その腫瘍がエンドポイント体積(８００ｍｍ３)に達した時点で、各動物のエンドポイントとした。その結果移植後１４日目及び１８日目にアイソタイプコントロール抗体投与群と比較して、抗ｍＣＣＲ８投与群で腫瘍体積増加が抑制された。１４日目での腫瘍体積の平均はアイソタイプコントロール抗体投与群で４５１.３ｍｍ３（標準偏差は±１７７.５ｍｍ３）、抗ＣＣＲ８抗体投与群で３２２.６ｍｍ３（標準偏差は±１４６.０ｍｍ３）であり、１４日目の腫瘍体積が３５０ｍｍ３以上の個体はアイソタイプコントロール群で１０例中９例、抗ｍＣＣＲ８投与群で１０例中４例であり、この分離態様に関して、ピアソンのカイ２乗検定ではＰ=０.０１９で有意差があった。したがって１４日目に３５０ｍｍ３の腫瘍体積に達した個体数に差が認められた。また移植後１８日目での腫瘍体積の平均は、アイソタイプコントロール抗体投与群で８７４.７ｍｍ３（標準偏差は±２６９.２ｍｍ３）、抗ＣＣＲ８抗体投与群で５８５.４ｍｍ３（標準偏差は±４０１.７ｍｍ３）であった（図２２）。１８日目の腫瘍体積が６００ｍｍ３以上の個体はアイソタイプコントロール群で１０例中９例であり、一方抗ｍＣＣＲ８投与群では１０例中４例であり、この分離態様に関して、ピアソンのカイ２乗検定ではＰ=０.０１９であり有意差があった。したがって１８日目で６００ｍｍ３の腫瘍体積に達した個体数に差が認められた。さらに腫瘍体積が８００ｍｍ３になった時点をエンドポイントとして予め設定した。腫瘍体積が８００ｍｍ３を超え、死亡したとみなした個体は、１４日まではどちらも認められず、１８日目でアイソタイプコントロール群が、１０例中７例、抗ＣＣＲ８抗体群が１０例中３例であった。１８日目での生存率について、ピアソンのカイ２乗検定を行い、生存率に差があるか検討した結果、Ｐ=０.０２５で生存率に有意差があった。
また同じ細胞株を用いた同様の実験で、アイソタイプコントロール抗体を投与した群と比較して抗ＰＤ-１抗体(ｃｌｏｎｅ ＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ 社)の投与群で、抗腫瘍効果は認められなかった。以上より抗ｍＣＣＲ８抗体は抗ＰＤ-１抗体耐性のＣｏｌｏｎ２６細胞に対してより高い抗腫瘍効果を示した。
ヒト腎癌浸潤細胞のＣＣＲ８の発現解析
１４例のヒト腎癌腫瘍内浸潤細胞でのＣＣＲ８の発現解析を行った。１４例の腎癌患者の背景は、性別は男性１１名と女性３名であり、年齢中央値は６８．５歳、病理病期はＴ１Ａが６名、Ｔ１Ｂが２名、Ｔ３Ａが５名、Ｔ３ｂが１名であった。具体的には、腎癌（Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ, ｃｃＲＣＣ）患者１４名の腎癌原発腫瘍内浸潤細胞を実施例１の図１と同様に単離し、Ａｎｔｉ-ＣＤ４ (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ ＯＫＴ４)、 ａｎｔｉ-ＣＤ３ (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ ＵＣＨＴ１), ａｎｔｉ-ＣＤ４５ＲＡ (ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｃｌｏｎｅ ＨＩ１００), ａｎｔｉ-ＣＤ８ (Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ, ＲＰＡ-Ｔ８), ａｎｔｉ-ＣＣＲ８ (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ Ｌ２６３Ｇ８), ａｎｔｉ-ＦｏｘＰ３ (ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ｃｌｏｎｅ ２３６Ａ/Ｅ７)、ａｎｔｉ-ＦｏｘＰ３のアイソタイプコントロール抗体で染色し、フローサイトメトリー (ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ) で解析した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞について解析した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞については、さらにＦｏｘＰ３発現の有無で２群にわけて解析した。アイソタイプコントロール抗体の染色により、ＦｏｘＰ３発現の陰性対照とした。ＣＣＲ８の発現強度は各患者サンプルのＦＡＣＳ解析値の平均値(ＭＦＩ)を使用した。表１に抗ＣＣＲ８抗体及びそのアイソタイプコントロール抗体での染色のＭＦＩ値の平均及びその標準偏差を示す。
Figure 0006501171
ＣＤ８+ Ｔ細胞にはほとんどＣＣＲ８は発現していないことが判明した（表１）。ＣＤ４+ ＦｏｘＰ３- Ｔ細胞は少し発現しているが、ＣＤ４+ ＦｏｘＰ３+ Ｔ細胞ではＭＦＩ値の平均がＣＤ４+ ＦｏｘＰ３- Ｔ細胞の８倍以上であり、ＣＤ４+ ＦｏｘＰ３+ Ｔ細胞にＣＣＲ８が有意に強く発現していることが判明した（表１）。図２３は表１の結果をグラフで示したものである。グラフの各プロットはフローサイトメーターによる各患者サンプルのＣＣＲ８発現量の平均値(ＭＦＩ)を示す。グラフの横線は各サンプルのＭＦＩ値の平均値を示す。バーは標準偏差を示す。有意水準 ***は、 Ｐ<０.００１を示す。以上の結果から、ヒト腎癌(ｃｃＲＣＣ)において、腫瘍内に浸潤しているＣＤ３+ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞表面に特異的に、ＣＣＲ８タンパク質が発現していることが判明した。この結果はＲＮＡ-Ｓｅｑ解析によるｍＲＮＡ発現解析とも一致する。
上記ｃｃＲＣＣの１４サンプルについて、腫瘍浸潤ＣＤ４+ Ｔ細胞について、ＦｏｘＰ３とＣＣＲ８のフローサイトメトリー解析を行った。ＦｏｘＰ３陽性細胞中のＣＣＲ８陽性細胞の割合、ＦｏｘＰ３陰性細胞でＣＣＲ８陽性細胞の割合をサンプルごとにプロットした。（図２４）。ＦｏｘＰ３及びＣＣＲ８共にアイソタイプコントロール抗体での染色を陰性標準として使用し、この閾値以上の細胞を陽性細胞とした。その結果、腫瘍内ＣＤ３+ＣＤ４+ＦｏｘＰ３+Ｔ細胞のＣＣＲ８発現率は約７５%であり、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞のＣＣＲ８発現率は、約１０%であった。
以上の結果よりヒト腎癌腫瘍内浸潤細胞のうちＦｏｘＰ３を発現するＴｒｅｇ細胞のほとんどでＣＣＲ８が発現し、Ｔｒｅｇ細胞以外のＣＤ４陽性Ｔ細胞では約１０％にＣＣＲ８が発現していることが判明した。以上よりヒト腫瘍内のＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞中のＣＣＲ８発現率は、マウス腫瘍内のＴｒｅｇ細胞でのＣＣＲ８発現率と類似しており、マウスと同様に抗ヒトＣＣＲ８特異的抗体により、腫瘍内浸潤ＦｏｘＰ３陽性Ｔｒｅｇ細胞のほとんどを除去できる可能性が示された。
各種癌における腫瘍内浸潤細胞中のＣＣＲ８発現率と生存率の相関
Ｔｒｅｇ細胞に特異的に発現し、腫瘍細胞あるいはヒトのほとんどの正常細胞でも発現していない遺伝子としてＦｏｘＰ３遺伝子が同定されている。このようにある特異的な細胞でのみ発現するいわゆるマーカー遺伝子として、例えばＴｒｅｇ細胞のマーカー遺伝子としてＦｏｘＰ３遺伝子、Ｔ細胞及びＮＫ細胞のマーカー遺伝子としてＣＤ３Ｇ遺伝子、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のマーカー遺伝子としてＣＤ８Ａ遺伝子などが知られている。
Ｔｒｅｇ細胞のマーカー遺伝子であるＦｏｘＰ３遺伝子に関しては、各腫瘍内でのＦｏｘＰ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することによりＴｒｅｇ細胞の腫瘍内での存在割合の指標とすることが可能であることも報告されている（Ｃｅｌｌ,２０１５年、第１６０巻、ｐ.４８-６１）。
また同じ論文で報告されているように、ＴＣＧＡのようなＲＮＡ-Ｓｅｑデータベースを利用してマーカー遺伝子の腫瘍内発現率（Ｔｒｅｇ存在比率）と患者生存率について、カプランマイヤー生存曲線を描くことで、Ｔｒｅｇ細胞の腫瘍内での存在率が、生存率と関連するか解析可能である。腫瘍塊のＲＮＡ-Ｓｅｑデータは、腫瘍細胞及びそこに存在する浸潤細胞（リンパ球や血管細胞など）の両方の細胞で発現するｍＲＮＡが混在したデータであるが、腫瘍細胞に発現していないことが示された遺伝子であれば、腫瘍内浸潤細胞で発現する遺伝子とみなすことが可能であり、それを利用して上記のような解析、すなわち腫瘍塊のＲＮＡ-Ｓｅｑデータにおけるマーカー遺伝子の発現解析により腫瘍内浸潤細胞の同定が可能である。さらに腫瘍塊でのマーカー遺伝子の発現量は、そこに浸潤するマーカー遺伝子に対応する特定細胞の発現細胞数と各発現細胞の発現量の積と捉えることができる。
ここで各細胞のマーカー遺伝子の発現量は個体間でほぼ一定と仮定すると、その発現量は浸潤細胞数と正比例する。したがってこの発現量を用いることで、腫瘍内の発現細胞数が個体ごとに算定可能となり、個体間比較が可能となる。
（細胞レベルでのＣＣＲ８発現解析）
公共データベースであるＣＣＬＥ(Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ)にヒト各種細胞株１０３７種類のＲＮＡ発現データが登録されている。これらのデータベースを用いてＣＣＲ８やＣＤ３Ｇ遺伝子がＴ細胞以外の癌細胞又は正常細胞で発現しているかを解析した。
腎癌、前立腺癌および膀胱癌由来細胞株について、ＣＣＬＥデータベースを用いてＣＤ３ＧとＣＣＲ８のｍＲＮＡ発現を解析した。
調べた細胞株は、腎癌由来細胞株では、
ＶＭＲＣＲＣＷ、 ＳＫＲＣ２０、 ＳＮＵ３４、 ＳＫＲＣ３１、 ＵＯＫ１０、 ＳＬＲ２０、 ＯＳＲＣ２、ＴＵＨＲ１４ＴＫＢ、 ＳＬＲ２４、 ＨＫ２、 Ａ４９８、 ＲＣＣ４、 ＫＭＲＣ１、 ＲＣＣ１０ＲＧＢ、 ＡＣＨＮ、 ＳＬＲ２５、 ＳＮＵ１２７２、 ＵＭＲＣ６、 ＳＬＲ２３、 ７６９Ｐ、 ＳＬＲ２１、 ＨＥＫＴＥ、 ＣＡＫＩ１、 ＴＵＨＲ４ＴＫＢ、 ＫＭＲＣ２、 ＶＭＲＣＲＣＺ、 ＫＭＲＣ３、 ＫＭＲＣ２０、 ＣＡＫＩ２、 ＢＦＴＣ９０９、 ７８６Ｏ、 Ａ７０４、 ＴＵＨＲ１０ＴＫＢ、 ＳＬＲ２６、 ＵＭＲＣ２、 ＣＡＬ５４、ＦＵＲＰＮＴ１、ＦＵＲＰＮＴ２、ＨＥＫ２９３、Ｇ４０２の４０種であり、
前立腺癌由来細胞株では、
ＶＣＡＰ、 ＬＮＣＡＰＣＬＯＮＥＦＧＣ、 ＤＵ１４５、 ＰＣ３、 ２２ＲＶ１、 ＰＲＥＣＬＨ、 ＭＤＡＰＣＡ２Ｂ、 ＮＣＩＨ６６０ の８種であり、
膀胱癌由来細胞株では、
ＴＣＢＣ１４ＴＫ、ＴＣＢＣ２ＴＫＢの２種であった。これら調べた全ての固形癌細胞株でＣＣＲ８及びＣＤ３Ｇの発現はバックグラウンドと同レベルの値であり、ｍＲＮＡ発現はまったく認められなかった（最大の発現を示す値でもＧ３ＰＤＨの１/５００以下。それ以外はすべてＧ３ＰＤＨの発現量の１/１０００以下）。 すなわち、ＣＣＲ８及びＣＤ３Ｇは固形癌細胞にはほとんど発現していないことが確認できた。ヒト各組織由来のプライマリーな正常細胞についても同様に解析し、ＣＣＲ８及びＣＤ３Ｇは血球系細胞の一部にのみ発現し、それ以外のプライマリーな正常組織由来細胞では、ほとんど発現していないことが判明した。
以上よりこれら３種の癌細胞では、ＣＣＲ８とＣＤ３Ｇは発現していないことが示された。したがって腎癌、前立腺癌、膀胱癌の腫瘍塊について、ＴＣＧＡのＲＮＡ発現データを用いた場合に、ＣＣＲ８とＣＤ３Ｇは癌細胞以外の、腫瘍塊に存在する浸潤正常細胞でのｍＲＮＡ発現を反映すると結論した。
（ＴＣＧＡ公共データベースを利用した解析）
次にＴＣＧＡ公共データベースを利用して、腎癌、前立腺癌、膀胱癌の腫瘍中で発現するＣＤ３Ｇ遺伝子とＣＣＲ８遺伝子の比(ＣＣＲ８/ＣＤ３Ｇ)と、患者生存率について解析を行った。これら３種の腫瘍内について、ＣＣＲ８及びＣＤ３Ｇ遺伝子ともっともよく発現が相関（ピアソン相関）する遺伝子は、Ｔ細胞で特異的に発現する種々の遺伝子であることが判明した（ＦｏｘＰ３, ＣＤ５, ＩＬ７Ｒ,等で相関係数ｒは０.７以上）。この結果はＣＣＲ８やＣＤ３Ｇが腫瘍細胞自体には発現せず、腫瘍内に浸潤している発現細胞（特にＴ細胞）に特異的に発現することを示している。ただしＣＣＲ８がＴ細胞以外の浸潤細胞で発現していることを否定するものではないので、ここではＣＣＲ８を発現する細胞集団とする。ＣＤ３ＧについてはＴ細胞及びＮＫ細胞に特異的に発現することがすでに論文等で報告されており、またＴ細胞は腫瘍に浸潤する主要な細胞であるので、ＣＤ３Ｇ発現量は浸潤しているＴ細胞数と比定できる。したがってＣＣＲ８/ＣＤ３Ｇ値は腫瘍内に存在する、Ｔ細胞数あたりのＣＣＲ８を発現する細胞数と定義できる。
これら３種の癌腫についてＣＣＲ８/ＣＤ３Ｇ比と患者生存率をカプランマイヤー曲線で解析した。腎癌はＴＣＧＡデータのうちＫｉｄｎｅｙ Ｒｅｎａｌ Ｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (ＴＣＧＡ, Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ)のデータを使用し、ＲＮＡ発現データおよび患者生存率データの揃っている５２３例を使用した。同様に前立腺癌はＴＣＧＡデータのうちでＰｒｏｓｔａｔｅ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ (ＴＣＧＡ, Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ)のデータでＲＮＡ発現データおよび患者生存率データの揃っている４９０例を使用した。
また膀胱癌は ＴＣＧＡデータのうちでＢｌａｄｄｅｒ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (ＴＣＧＡ, Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ)のデータを使用し、ＲＮＡ発現データおよび患者生存率データの揃っている３９２例を使用した。
ＣＣＲ８/ＣＤ３Ｇの発現値について、高い群と低い群の２群に等分し（腎癌の場合は奇数なので２６１:２６２)、カプランマイヤー生存曲線解析を、解析ソフトＲ (Ｒ-Ｓｔｕｄｉｏ)を用いて行った。有意差検定はＬｏｇ-ｒａｎｋ検定を行った。腎癌の結果は図２５、前立腺癌の結果は図２６、膀胱癌の結果を図２７に示す。グラフ中の縦線は、患者は生存しているが、評価期間がこの時点までしか無いために、この時点で脱落したもの（いわゆるセンサーに該当）として扱っている。また横軸の値はすべてのグラフで月数を表す。
その結果、３種すべての癌腫においてＣＣＲ８/ＣＤ３Ｇ値の高い群で有意に患者生存率が低かった。ヒト腫瘍内に浸潤しているＣＣＲ８発現細胞のＴ細胞中での比率が高い群で生存率が低下することが判明し、このことは人においてもＣＣＲ８発現細胞が腫瘍免疫に対して抑制作用をおよぼしていることが示唆される。このことから、マウスでの抗ｍＣＣＲ８抗体投与での抗腫瘍効果と同様に、ヒトにおいても腫瘍内ＣＣＲ８発現細胞を何らかの方法で特異的に除去或いは死滅することで、腫瘍免疫を高め、生存率を上昇させる可能性があることが示唆される。
ＬＭ８細胞及びＭｅｔｈＡ細胞におけるマウスＣＣＲ８の発現の確認
骨肉種由来ＬＭ８細胞及び皮膚線維肉腫由来ＭｅｔｈＡ細胞を６ウェルディッシュで培養し、約５０%のコンフルエント状態になった時点で培養液を除去し、１０ｍＭ ＥＤＴＡ/ＰＢＳを５ｍｌ添加し、３７℃で５分間インキュベートした。その結果細胞はほぼすべて剥離され、ピペットでサスペンドすることで、ほぼ単一細胞にまで分離できた。２回Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＣＳで洗浄し、Ｄ-ＭＥＭ/１０%ＦＣＳにサスペンドし、ＬＩＶＥ/ＤＥＡＤ（登録商標） Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ-ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ (ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, Ｌ３４９７５)と抗マウスＣＣＲ８抗体(ＳＡ２１４Ｇ２)又はＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体で、氷中で細胞を染色した。１時間後に３回Ｄ-ＭＥＭ/１０%ＦＣＳで洗浄し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ）でマウスＣＣＲ８発現率を解析した。Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体を用いてバックグラウンドを設定し、バックグラウンドレベル以上の陽性細胞率と蛍光の中央値(Ｍｅｄｉａｎ)を算出した（図２８）。その結果いずれの細胞においてもＰＥの蛍光強度の中央値に差は認められず、また陽性細胞もまったく認められなかった。以上より、これら細胞は抗マウスＣＣＲ８抗体には認識されず、マウスＣＣＲ８を発現しないあるいは抗体が反応するエピトープを保持しないことが確認された。
骨肉種由来ＬＭ８を用いた抗マウスＣＣＲ８抗体投与による抗腫瘍効果の評価
マウスＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（７週齢、オス）の背部皮内に３ｘ１０５個のマウス骨肉種由来ＬＭ８細胞(５０ｕＬ)を移植した。腫瘍移植３日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を腹腔内に４００μｇ（４００μＬ）投与した（Ｎ＝１１）。コントロールはアイソタイプコントロール抗体を投与した（Ｎ＝１０）。腫瘍移植７日後（抗体投与後４日）より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図２９）。その結果移植１８日目以降全測定時点において、アイソタイプコントロール抗体投与群と比較して、抗ｍＣＣＲ８投与群で有意に腫瘍体積の平均値が減少した（有意水準は１８日目が*；Ｐ<０.０５、２１、２４、２７、３１日目が**; Ｐ<０.０１、３５日目が***; Ｐ<０.００１）。また抗体投与３１日目時点で、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では１１匹中６匹、アイソタイプコントロール抗体投与群では１０匹中１匹の腫瘍が消失した。この分離態様に関してピアソンのカイ２乗検定を行ったところ、有意差があった(Ｐ＝０．０３１)。
皮膚線維肉腫由来ＭｅｔｈＡを用いた抗マウスＣＣＲ８抗体投与による抗腫瘍効果の評価
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に１ｘ１０５個の皮膚線維肉腫由来ＭｅｔｈＡ(５０ｕＬ)を移植した。腫瘍移植３日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を腹腔内に４００μｇ（４００μＬ）投与した（Ｎ＝５）。コントロールはアイソタイプコントロール抗体を投与した（Ｎ＝５）。腫瘍移植１１日後（抗体投与後８日）より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図３０）。
その結果移植１１日目以降全測定時点において、アイソタイプコントロール抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群で有意に腫瘍体積の平均値が減少した（有意水準はすべての時点で、*；Ｐ<０.０５）。また抗体投与２１日目時点で、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では５匹中５匹、アイソタイプコントロール抗体投与群では５匹中０匹の腫瘍が消失した。この分離態様に関してピアソンのカイ２乗検定を行ったところ、有意差があった(Ｐ＝０．００１６)。
乳癌由来ＥＭＴ６を用いた抗マウスＣＣＲ８抗体投与による抗腫瘍効果の評価
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に１ｘ１０５個の乳癌由来ＥＭＴ６(５０ｕＬ)を移植した。腫瘍移植３日後及び１０日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を尾静脈内に１００μｇ（１００μＬ）投与した（Ｎ＝２０）。コントロールはアイソタイプコントロール抗体を同量投与した（Ｎ＝２０）。腫瘍移植４日後（抗体投与後１日）より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図３１）。
その結果移植１０日目以降全測定時点において、アイソタイプコントロール抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群で有意に腫瘍体積の平均値が減少した（有意水準は１０日目が**；Ｐ<０.０１、１４、１７、２１日目が***; Ｐ<０.００１）。また抗体投与２１日目時点で、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では２０匹中１９匹、アイソタイプコントロール抗体投与群では２０匹中２匹の腫瘍が消失した。この分離態様に関してピアソンのカイ２乗検定を行ったところ、有意差があった(Ｐ＜０．０００１)。
抗マウスＣＣＲ８抗体の抗ＰＤ−１抗体に対する優位性確認
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に２ｘ１０５個の大腸癌由来Ｃｏｌｏｎ２６細胞(５０ｕＬ)を移植した。腫瘍移植３日後及び１０日後にアイソタイプコントロール抗体、ラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）または抗マウスＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４，Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）を静脈内に４００μｇ（４００μＬ）投与した（Ｎ＝１０）。腫瘍移植３日後より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図３２）。その結果アイソタイプ抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８投与群で、１７、２０、及び２４日目において、有意に腫瘍体積が減少した（Ｓｔｅｅｌのノンパラメトリック検定：有意水準はＰ＜０．０５）。抗ＰＤ−１抗体投与群ではアイソタイプ抗体投与群と比較して、どの時点においても有意差は認められなかった。
また抗体投与２４日目時点で、１０００ｍｍ３以上の体積の腫瘍を保持するマウス個体はアイソタイプ抗体投与群では１０匹中７匹、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では１０匹中２匹、抗ＰＤ−１抗体投与群では１０匹中７匹であり、抗ＣＣＲ８投与群はアイソタイプ抗体投与群及び抗ＰＤ−１抗体投与群のどちらに対しても、分離態様において、ピアソンのカイ２乗検定で有意差があった（どちらもＰ＝０．０２５）。以上より大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６において、抗マウスＣＣＲ８抗体投与により抗腫瘍治療効果が認められた。
さらに移植２０日目、２４日目において、抗マウスＰＤ−１抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８投与群で有意に腫瘍体積が減少した（Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓのノンパラメトリック検定；有意水準はＰ＜０．０５）。以上よりマウス大腸細胞株において、抗ＰＤ−１抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群において、より強い抗腫瘍治療効果が認められた。
腎癌由来細胞株ＲＡＧを用いた抗マウスＣＣＲ８抗体投与による抗腫瘍効果の評価
マウス腎癌由来細胞株ＲＡＧを用いて同様の検討をした。Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、メス）の背部皮内に４ｘ１０５個の腎癌由来ＲＡＧ細胞(５０ｕＬ)を移植した。なお、ＲＡＧ細胞は予めＢａｌｂ／ｃマウスに皮下移植して生着した腫瘍を再度マウスに移植し、この操作を２回繰り返し、マウス皮下への生着効率を上昇させたＲＡＧ細胞（細胞馴化株）を使用した。腫瘍移植６日後にアイソタイプコントロール抗体（Ｎ＝１０、ただし２１日目のみＮ＝９）、ラット抗マウスＣＣＲ８抗体（Ｎ＝１０）（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）または抗マウスＰＤ−１抗体（Ｎ＝１０）（ＲＭＰ１−１４，Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）を静脈内に１００μｇ（１００μＬ）投与した。腫瘍移植６日後より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図３３）。その結果アイソタイプ抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群で、投与後１４、１７、及び２１日目において有意に腫瘍体積が減少した（Ｓｔｅｅｌのノンパラメトリック検定：有意水準はＰ＜０．０５）。アイソタイプ抗体投与群と比較して、抗マウスＰＤ−１抗体投与群では有意差は認められなかった。以上より腎癌細胞株において抗マウスＣＣＲ８抗体投与により抗腫瘍治療効果が認められた。また移植１４日目において、抗マウスＰＤ−１抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群で有意に腫瘍体積が減少した（Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓのノンパラメトリック検定；有意水準はＰ＜０．０５）。以上よりマウス腎癌細胞株において、抗マウスＰＤ−１抗体投与群と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群において、より強い抗腫瘍治療効果が認められた。
抗マウスＣＣＲ８抗体投与マウスにおける炎症反応の有無の解析
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に２ｘ１０５個の大腸癌由来Ｃｏｌｏｎ２６細胞(５０ｕＬ)を移植した。腫瘍移植３日後及び１０日後にラット抗マウスＣＤ１９８（ＣＣＲ８）抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）またはアイソタイプコントロール抗体（ＬＴＦ−２，Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）を静脈内に４００μｇ（４００μＬ）投与した（Ｎ＝１０）。移植２４日目での体重及びマウス各臓器（肺、肝臓、脾臓、小腸、鼠径リンパ節）の重量を測定した（図３４）。その結果、図３４に示すように、コントロール投与群（Ｎ＝１０）と抗マウスＣＣＲ８抗体投与群（Ｎ＝１０）で体重及び各臓器重量に有意差は認められなかった。以上より抗マウスＣＣＲ８抗体投与による炎症反応及び自己免疫疾患は惹起されていないと結論した。
各種臨床腫瘍内浸潤細胞中のＣＣＲ８の発現解析
ヒト腎癌、卵巣癌、子宮体癌、大腸癌、及び肺癌の腫瘍内浸潤細胞におけるＣＣＲ８の発現解析を行った。発現解析に用いた各種臨床腫瘍の患者数は、腎癌が１２名、卵巣癌が１４名、子宮体癌が２１名、大腸癌が１０名、及び肺癌が４名である。各種臨床腫瘍内浸潤細胞を実施例１の図１と同様に単離し、Ａｎｔｉ-ＣＤ４５ (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ Ｈ１３０)、ａｎｔｉ-ＣＣＲ８ (ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ, Ｃｌｏｎｅ Ｌ２６３Ｇ８) 抗体で染色し、フローサイトメトリー (ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ, ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ) で測定した。腫瘍重量あたりのＣＣＲ８陽性細胞数及びＣＤ４５陽性白血球中のＣＣＲ８陽性細胞の割合について解析した。
表２に腫瘍重量あたりのＣＣＲ８陽性細胞数の平均値及びその標準偏差を示す。表３にＣＤ４５陽性白血球中のＣＣＲ８陽性細胞の割合の平均値及びその標準偏差を示す。
Figure 0006501171
Figure 0006501171
各種臨床腫瘍において腎癌を基準とした場合、腫瘍重量あたりのＣＣＲ８陽性細胞数については、卵巣癌及び大腸癌では腎癌より低い平均値を示し、子宮体癌及び肺癌では腎癌より高い平均値を示した。ＣＤ４５陽性白血球中のＣＣＲ８陽性細胞の割合については、卵巣癌では、腎癌と同程度の平均値を示し、肺癌では、腎癌より低い平均値を示した。また、子宮体癌及び大腸癌では腎癌より高い平均値を示した。ヒト腎癌腫瘍内浸潤細胞以外にも、卵巣癌、子宮体癌、大腸癌及び肺癌の腫瘍内浸潤細胞において、ＣＣＲ８の発現が確認された．以上の結果より、腎癌に加えて、卵巣癌、子宮体癌、大腸癌及び肺癌において、抗ヒトＣＣＲ８特異的抗体により、ＣＣＲ８陽性腫瘍内浸潤細胞を除去できる可能性が示された。
乳癌由来ＥＭＴ６を用いた抗マウスＣＣＲ８抗体と抗ＰＤ−１抗体投与の併用による抗腫瘍効果の評価
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（７週齢、メス）の背部皮内に１ｘ１０５個の乳癌由来ＥＭＴ６(５０ｕＬ)を移植した。
抗マウスＣＣＲ８抗体単独投与群は、腫瘍移植３日後及び１０日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体１５μｇ（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を静脈内に投与し(１００μＬ)、腫瘍移植８日目及び１３日目にアイソタイプコントロール抗体を２００μｇ（１００μＬ) 投与した（Ｎ＝１０）。抗ＰＤ−１抗体単独投与群は、腫瘍移植３日後及び１０日後にアイソタイプコントロール抗体１５μｇ（１００μＬ)を、腫瘍移植８日目及び１３日目に抗マウスＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）２００μｇ(１００μＬ)を静脈内に投与した（Ｎ＝１０）。抗ＰＤ−１抗体及び抗マウスＣＣＲ８抗体併用投与群は、腫瘍移植３日目及び１０日目にラット抗マウスＣＣＲ８抗体１５μｇ（１００μＬ)を静脈内に投与し、腫瘍移植８日目及び１３日目に抗ＰＤ−１抗体２００μｇ（１００μＬ)を静脈内に投与した（Ｎ＝１０）。コントロール群は腫瘍移植３日後及び１０日後にアイソタイプコントロール抗体１５μｇ（１００μＬ)を静脈内に投与し、腫瘍移植８日目及び１３日目にＰＢＳ１００μＬを静脈内に投与した（Ｎ＝１０）。腫瘍移植３日後（抗体投与後１日）より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図３５）。
平均腫瘍体積についての単独投与群同士の比較では、抗ＰＤ−１抗体投与群と比較して１０、１４、１７、２０、２３及び２７日目において、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群で平均腫瘍体積が有意に小さかった（Ｄｕｎｎｅｔｔ法による有意水準：Ｐ＜０．０５）。また、各単独投与群と比較して併用群で腫瘍が小さかった。
また、移植後１７日及び２７日目における腫瘍の完全寛解率についても比較した。移植１７日目でコントロール群及び抗ＰＤ−１抗体投与群では１０匹中０匹、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では１０匹中１匹が腫瘍の完全寛解を示したが、抗ＰＤ−１抗体と抗マウスＣＣＲ８抗体併用群では１０匹中６匹が完全寛解した。移植２７日目では、コントロール群及び抗ＰＤ−１抗体投与群ではそれぞれ１０匹中２匹と３匹、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では１０匹中７匹が腫瘍の完全寛解を示したが、抗ＰＤ−１抗体と抗マウスＣＣＲ８抗体の併用群では１０匹中９匹が完全寛解した。
さらに、５０ｍｍ３以下にまで腫瘍が退縮した個体の割合を算出した（図３６）。抗ＰＤ−１抗体と抗マウスＣＣＲ８抗体の併用群では移植１７日目ですべての個体で腫瘍が５０ｍｍ３以下に退縮し（１００％）、その後２７日目まで５０ｍｍ３以下であったが、抗ＰＤ−１抗体投与群では１７日目で１０％、２７日目で３０％、また抗マウスＣＣＲ８抗体投与群では移植後１７日目で７０％、２７日目でも同じ７０％であった。
以上の結果より，他の単独投与群と比較して併用群では腫瘍退縮までの時間が早く、また退縮効果が強いことが分かった。
マウス腎癌由来細胞株ＲＡＧを用いた抗マウスＣＣＲ８抗体と抗ＰＤ−１抗体投与の併用よる抗腫瘍効果の評価
マウスＢａｌｂ／ｃマウス（６週齢、メス）の背部皮内に４．５ｘ１０５個の腎癌由来ＲＡＧ細胞(５０ｕＬ)を移植した。なお、ＲＡＧ細胞は予めＢａｌｂ／ｃマウスに皮下移植して生着した腫瘍を再度マウスに移植し、この操作を２回繰り返し、マウス皮下への生着効率を上昇させたＲＡＧ細胞（細胞馴化株）を使用した。
抗ＰＤ−１抗体単独投与群は腫瘍移植８日後及び１５日後に抗ＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）を静脈内に５０μｇ（１００μＬ）投与した（Ｎ＝１０）。抗マウスＣＣＲ８抗体単独投与群は腫瘍移植８日後及び１５日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を静脈内に２５μｇ（１００μＬ）投与した（Ｎ＝１０）。抗ＰＤ−１抗体及び抗マウスＣＣＲ８抗体併用投与群は、腫瘍移植８日後及び１５日後に抗ＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）５０μｇとラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）２５μｇを混合し（１００μＬ）、静脈内に投与した（Ｎ＝１０）。コントロール群は腫瘍移植８日後及び１５日後に生理食塩水を静脈内に１００μＬ投与した（Ｎ＝１０）。
腫瘍移植８日後より３〜４日ごとに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積(ｍｍ３)は長径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)ｘ短径(ｍｍ)/２で計量した（図３７）。
その結果抗ＰＤ−１抗体と抗マウスＣＣＲ８抗体の併用群が、抗ＰＤ−１抗体あるいは抗マウスＣＣＲ８抗体の単独投与群と比較して、腫瘍が小さくなることが分かった。
ＣＣＲ８遺伝子ホモ欠損マウスを用いた抗マウスＣＣＲ８抗体の特異性の解析
Ｂａｌｂ／ｃ系統の野生型マウス（Ｎ＝１０）及びＣＣＲ８遺伝子ホモ欠損マウス（Ｎ＝５）の背部皮内に３ｘ１０５個の大腸癌由来Ｃｏｌｏｎ２６細胞(５０ｕＬ)を移植した。野生型マウスには腫瘍移植３日後及び１０日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）またはアイソタイプコントロール抗体（ＬＴＦ−２，Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）を静脈内に１００μｇ（１００μＬ）投与した（Ｎ＝５）。ＣＣＲ８遺伝子ホモ欠損マウスについても腫瘍移植３日後及び１０日後にラット抗マウスＣＣＲ８抗体（クローンＳＡ２１４Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）またはアイソタイプコントロール抗体（ＬＴＦ−２，Ｂｉｏｘｃｅｌｌ社）を静脈内に１００μｇ（１００μＬ）投与した（Ｎ＝５）。投与後７日目より腫瘍の大きさを測定した。
その結果、野生型マウスでは、アイソタイプコントロール抗体投与と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与により、全例で有意な腫瘍の退縮と、最終的な腫瘍の完全退縮が認められた。一方、ＣＣＲ８遺伝子ホモ欠損マウスではアイソタイプ抗体と比較して、抗マウスＣＣＲ８抗体投与群で腫瘍の体積に変化は認められず、また腫瘍退縮も認められなかった（図３８）。
ＣＣＲ８遺伝子ホモ欠損マウスにおいて抗マウスＣＣＲ８抗体の抗腫瘍効果が完全に消失したことから、使用している抗マウスＣＣＲ８抗体（ＳＡ２１４Ｇ２）はＣＣＲ８を介して抗腫瘍効果を発揮していることが証明された。
本発明のＣＣＲ８に対する抗体は、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞等を減少させることにより、免疫を賦活させる作用を有しており、癌の治療のための医薬として有用である。

Claims (15)

  1. ＣＣＲ８に対する抗体、及び抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を組み合わせてなり、該ＣＣＲ８に対する抗体がＡＤＣＣ活性を有する抗体である、癌治療用の医薬。
  2. 抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と併用するための、ＣＣＲ８に対する抗体を含有し、該ＣＣＲ８に対する抗体がＡＤＣＣ活性を有する抗体である、癌治療用の医薬。
  3. ＣＣＲ８に対する抗体と併用するための、抗ＰＤ―１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含有し、該ＣＣＲ８に対する抗体がＡＤＣＣ活性を有する抗体である、癌治療用の医薬。
  4. ＣＣＲ８に対する抗体が、ＣＣＲ８の中和抗体である、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の医薬。
  5. ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤Ｔｒｅｇ細胞除去作用を有する、請求項１〜請求項４のいずれかに記載の医薬。
  6. ＣＣＲ８に対する抗体が、腫瘍内浸潤マクロファージ細胞除去作用を有する、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の医薬。
  7. 癌が乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎癌、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮癌、肉腫、血球癌、胆管癌、胆のう癌、甲状腺癌、前立腺癌、精巣癌、胸腺癌または肝臓癌である、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の医薬。
  8. 癌が乳癌、子宮体癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、腎癌または肉腫である、請求項７記載の医薬。
  9. 癌が乳癌である、請求項８記載の医薬。
  10. 癌が子宮体癌である、請求項８記載の医薬。
  11. 癌が卵巣癌である、請求項８記載の医薬。
  12. 癌が肺癌である、請求項８記載の医薬。
  13. 癌が大腸癌である、請求項８記載の医薬。
  14. 癌が腎癌である、請求項８記載の医薬。
  15. 癌が肉腫である、請求項８記載の医薬。
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