ES2922525T3 - Marcadores desregulados selectivamente en células T reguladoras que infiltran tumores - Google Patents

Abstract

La presente invención describe una serie de marcadores desregulados selectivamente en células T reguladoras infiltrantes de tumores. La invención se refiere a moléculas capaces de modular la expresión y/o función de al menos uno de dichos marcadores para uso en la prevención y/o tratamiento del tumor. Preferiblemente, la molécula se une específicamente al marcador e induce citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). La invención se refiere además a una molécula capaz de modular la expresión y/o función de al menos uno de tales marcadores para usar en un método para reducir in vivo las células T reguladoras infiltrantes de tumores en un sujeto, o para usar en un método para mejorar inmunidad en un sujeto. También se contemplan las composiciones farmacéuticas correspondientes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Marcadores desregulados selectivamente en células T reguladoras que infiltran tumores

Campo técnico

La invención se encuentra en el campo de la investigación del cáncer y las consiguientes aplicaciones en medicina.

Antecedentes

La combinación de mutaciones genéticas y modificaciones epigenéticas que son que son peculiares a todos los tumores genera antígenos que los linfocitos T y B pueden utilizar para reconocer específicamente las células tumorales (Jamal-Hanjani et al., 2013). Cada vez está más claro que los linfocitos T que reconocen los péptidos derivados del tumor presentados por las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) desempeñan una función central en la inmunoterapia y en la quimiorradioterapia convencional del cáncer (Galluzzi et al., 2015). De hecho, las respuestas de células T antitumorales surgen en pacientes con cáncer, pero se desactivan con la progresión del tumor mediante mecanismos de supresión desencadenados por la interacción entre las células malignas y el microambiente tumoral (Munn and Bronte, 2015). Los mecanismos inmunosupresores dependientes de tumores dependen de la acción integrada de leucocitos y linfocitos infiltrantes que regulan al alza un rango de moléculas moduladoras, denominadas colectivamente puntos de control inmunitarios, cuya función solo se caracteriza parcialmente (Pardoll, 2012). Por lo tanto, la búsqueda de agonistas de complejos coestimuladores o antagonistas de moléculas inhibidoras para potenciar las respuestas de células T específicas de antígeno es un objetivo principal de la investigación antitumoral actual (Sharma and Allison, 2015; Zitvogel et al., 2013). De hecho, los ensayos clínicos han mostrado inequívocamente que el bloqueo de los puntos de control inmunitarios desencadena las respuestas inmunitarias antitumorales espontáneas de una manera tan potente que ha creado un cambio de paradigma en la terapia contra el cáncer (Sledzinska et al., 2015; Topalian et al., 2015).

Entre los puntos de control inmunitarios a los que se dirigen las estrategias de bloqueo, CTLA-4 ha sido uno de los primeros en traducirse en aplicaciones terapéuticas.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CTLA-4 mostraron un éxito notable en el melanoma metastásico y, más recientemente, en el cáncer de pulmón de células no microcíticas, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, carcinoma urotelial y cáncer de ovario (Carthon et al., 2010; Hodi et al., 2010; van den Eertwegh et al., 2012; Yang et al., 2007). Sin embargo, la fracción de pacientes que no responden sigue siendo alta, lo que lleva a una investigación más profunda de los mecanismos que sustentan la modulación de las respuestas inmunitarias por los tumores. La evidencia experimental reciente mostró que la eficacia de mAb anti-CTLA-4 depende del agotamiento mediado por FcyR de células T reguladoras (células Treg) CD4+ dentro del microambiente tumoral (Peggs et al., 2009; Selby et al., 2013; Simpson et al., 2013; Twyman-Saint Victor et al., 2015).

Las células Treg, que están fisiológicamente involucradas en el mantenimiento de la autotolerancia inmunológica y la homeostasis inmunológica (Josefowicz et al., 2012; Sakaguchi et al., 2008), son potentes supresores de las células efectoras y se encuentran en altas frecuencias en varios tipos de cánceres (Fridman et al., 2012; Nishikawa and Sakaguchi, 2010). Curiosamente, las células Treg adaptan su programa transcripcional a las diversas citocinas a las que están expuestas en el medio inflamatorio (Campbell and Koch, 2011). Esta versatilidad está controlada por factores de transcripción generalmente asociados con la diferenciación de otros subconjuntos de células T CD4+ efectoras, lo que da como resultado varias poblaciones de células Treg con características y funciones inmunomoduladoras únicas (Duhen et al., 2012; Geginat et al., 2014). Más aún, se informa que las células Treg que infiltran tejidos no linfoides exhiben fenotipos y distintivos transcripcionales únicas, ya que pueden mostrar funciones más allá de sus funciones supresoras bien establecidas, tal como la modulación metabólica en el tejido adiposo (Cipolletta et al., 2012) o la regulación de reparación de tejido músculo esquelético (Burzyn et al., 2013) y en tejido pulmonar (Arpaia et al., 2015).

Se ha informado que el agotamiento de las células Treg aumenta las respuestas inmunitarias específicas antitumorales y reduce la carga tumoral (Marabelle et al., 2013; Teng et al., 2010; Walter et al., 2012). Aunque se han logrado resultados clínicos prometedores con las estrategias de agotamiento de células Treg, se deben abordar algunas cuestiones relevantes para una aplicación clínica más segura, más efectiva y más amplia de estas terapias. En primer lugar, puede producirse una autoinmunidad grave después del agotamiento de las células Treg sistémicas (Nishikawa and Sakaguchi, 2010), lo que podría evitarse si fuera factible el agotamiento selectivo de las células Treg que infiltran tumores. Un segundo problema se refiere a la especificidad de la dirección, de hecho, las células Treg comparten con los linfocitos efectores la mayoría de las moléculas diana de la terapia, lo que posiblemente también puede agotar las células efectoras específicas del tumor. Por lo tanto, la caracterización molecular de las células Treg en diferentes sitios tumorales debería ayudar a definir mejor las dianas terapéuticas a través de una mejor descripción de sus moléculas características y de la red que regula las funciones de las células Treg en el microambiente tumoral.

El cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC) y el cáncer colorrectal (CRC) son los dos cánceres más frecuentes en ambos géneros (Torre et al., 2015). El NSCLC tiene el peor pronóstico debido a su alta tasa de mortalidad incluso en etapas tempranas. Aunque la tasa de supervivencia del CRC depende en gran medida del estadio del tumor en el momento del diagnóstico, aproximadamente el 50% de los pacientes progresarán a cáncer metastásico (GonzalezPons and Cruz-Correa, 2015). Ambos tumores han sido dirigidos con terapias basadas en anticuerpos monoclonales contra los inhibidores de puntos de control, pero los resultados fueron diferentes. Si bien se ha obtenido un éxito clínico notable en el NSCLC, la evidencia de una respuesta duradera en el CRC es escasa, con la excepción de las lesiones de CRC deficientes en la reparación de errores de emparejamiento (Jacobs et al., 2015; Kroemer et al., 2015; Le et al., 2015).

La técnica anterior citada incluye:

Ravikiran (2015) Human Immunol. 77(2):201-213;

Plitas (2016) Cancer Res. 76(4, suup) p4-04-11;

Tosolini (2011) Cancer Res. 71(4) 1263-1271;

Marabelle (2013) J.C.I. 123(6) 2447-2463;

Takeuchi (2016) IntI. Immunol 28(8) 401-419;

Selby (2013) Cancer Immunol 1(1) 32-42; y

De Simone (2016) Immunity 45(5) 1135-1147 (publicada posteriormente).

De estos solo Ravikiran hace referencia a LAYN

Entonces todavía subsiste la necesidad de agentes que se dirijan a las células Treg que infiltran tumores para el tratamiento y/o prevención del cáncer y herramientas y métodos de diagnóstico y pronóstico.

Resumen

En el presente documento se divulgan marcadores que se desregulan selectivamente en células T reguladoras que infiltran tumores.

En base a estos marcadores, se presentan métodos para determinar el pronóstico de ciertos cánceres, o para controlar la eficacia de los tratamientos terapéuticos de los mismos. También se presentan métodos para identificar moléculas adecuadas para el tratamiento del cáncer.

La invención se refiere a dichos métodos con respecto al marcador LAYN, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La divulgación explora adicionalmente vías adicionales de desarrollo, tales como moléculas capaces de modular la expresión y/o función de al menos uno de dichos marcadores; o tales como moléculas capaces de unirse a dichos marcadores para uso en el diagnóstico y pronóstico del cáncer.

Enseñanzas técnicas generales

La información técnica establecidas a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no es parte de la invención.

Los linfocitos T reguladores que infiltran tumores (Treg) pueden suprimir las células T efectoras específicas para antígenos tumorales. Dado que las nuevas inmunoterapias contra el cáncer tienen como objetivo liberar las células T efectoras al dirigirse a los puntos de control inmunitarios, las definiciones moleculares más profundas de los linfocitos que infiltran tumores podrían ofrecer nuevas oportunidades terapéuticas. Los transcriptomas de células T cooperadoras 1 (Th1), Th17 y Treg que infiltran cánceres colorrectales o de pulmón de células no microcíticas se compararon con transcriptomas de los mismos subconjuntos de tejidos normales y se validaron a nivel de células individuales. Los inventores encontraron que las células Treg que infiltran tumores son altamente supresoras, regulan al alza varios puntos de control inmunitarios y expresan en la superficie celular moléculas distintivas específicas tales como el receptor 2 de interleucina-1 (IL1R2), muerte programada (PD)-1 Ligando 1, PD-1 Ligando 2 y quimiocina CCR8 que no se describieron previamente en las células Treg. Notablemente, la alta expresión en muestras de tumores completos de genes distintivos de Treg, tales como LAYN, MAGEH1 o CCR8, correlacionado con mal pronóstico. El hallazgo proporciona nuevos conocimientos sobre la identidad molecular y las funciones de las células Treg que infiltran tumores humanos y define nuevas dianas potenciales para la inmunoterapia tumoral. Como se describe en este documento, los inventores proporcionan un análisis completo del transcriptoma de células Treg CD4+ y células efectoras (Th1 y Th17) humano que infiltran NSCLC o CRC y sus tejidos normales emparejados.

Los inventores definieron los distintivos moleculares de células Treg que infiltran tumores en estos dos tipos de cáncer y confirmaron la relevancia de estos distintivos mediante análisis de células individuales. Estos datos podrían ayudar a comprender mejor el papel funcional de las células Treg en los sitios tumorales y allanar el camino para la identificación de dianas terapéuticas para una modulación más específica y segura de las células Treg en la terapia contra el cáncer.

Los hallazgos de los inventores proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos inhibidores de las células Treg y ofrecen dianas precisas para la inmunoterapia contra el cáncer.

Proporcionan moléculas capaces de modular la expresión y/o función de al menos un marcador que se desregula selectivamente en células T reguladoras que infiltran tumores para uso en la prevención y/o tratamiento de dicho tumor.

Preferiblemente, la molécula es capaz de unirse específicamente a dicho al menos un marcador e inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC).

Preferiblemente, dicha molécula es capaz de agotar selectivamente las células T reguladoras que infiltran tumores. Dicha molécula se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en:

a) un anticuerpo o un fragmento del mismo;

b) un polipéptido;

c) una molécula pequeña;

d) un polinucleótido que codifica dicho anticuerpo o polipéptido o un derivado funcional del mismo;

e) un polinucleótido, tal como una construcción antisentido, un oligonucleótido antisentido, una construcción de interferencia de ARN o ARNip,

e) un vector que comprende o expresa el polinucleótido como se define en d) o e);

f) una célula anfitriona manipulada genéticamente que expresa dicho polipéptido o anticuerpo o que comprende el polinucleótido como se define en d) o e).

El marcador es LAYN, mostrado en la Tabla VIII.

Tabla VIII

en el que cada uno de dichos nombres de marcadores se caracteriza por "id de Ensembl Gene” e incluye todas las secuencias de proteína de isoforma divulgadas en el mismo.

Cada gen de la tabla VIII se caracteriza por su número de acceso Ensembl Gene (ENSG), recuperable en la base de datos pública EnsEMBL (http://www.ensembl.org) y por su ID de Entrez Gene, recuperable en la base de datos pública NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), si está presente.

El marcador de la invención es una proteína de transmembrana seleccionada del grupo de la SEQ ID NO:1-9.

LAYN (SEQ ID NO: 1-9),

>ENSG00000204381_ENST00000375614_ENSP00000364764_LAYN

M R PG T A L Q A V L L A V L L V G L R A A T G R L L SG Q PV C R G G T Q R PC Y K V IY FH D T SR R L N FE E A K E A C R R D G G Q L V SIE SE D E Q K L IE K FIE N L L PSD G D FW IG L R R R E E K Q SN ST A C Q D L Y A W T D G SISQ FR N W Y V D E PSC G SE V C V V M Y H Q P S A P A G IG G P Y M F Q W N D D R C N M K N N F IC K Y S D E K P A V P S R E A E G E E T E L T T PV L PE E T Q E E D A K K T FK E SR E A A L N L A Y IL IPSIPL L L L L V V T T V V C W V W IC R K R K R E Q P D P S T K K Q H T IW PSPH Q G N SPD L E V Y N V IR K Q SE A D L A E T R PD L K N ISFR V C SG E A T PD D M SC D Y D N M A V N P S E S G FV T L V SV E SG FV T N D IY E FSPD Q M G R SK E SG W V E N E IY G Y * (SE Q ID N O :l)

>ENSG00000204381_ENST00000375615_ENSP00000364765_LAYN

M R P G T A L Q A V L L A V L L V G L R A A T G R L L S A S D L D L R G G Q P V C R G G T Q R P C Y K V IY F H D T S R R L N F E E A K E A C R R D G G Q L V SIE SE D E Q K L IE K FIE N L L PSD G D FW IG L R R R E E K Q SN ST A C Q D L Y A W T D G SISQ FR N W Y V D E P S C G S E V C V V M Y H Q P S A P A G IG G P Y M F Q W N D D R C N M K N N F IC K Y S D E K P A V PSR E A E G E E T E L T T PV L PE E T Q E E D A K K T FK E SR E A A L N L A Y IL IPSIPL L L L L V V T T V V C W V W IC R K R K R E Q P D P S T K K Q H T IW P S P H Q G N S P D L E V Y N V IR K Q S E A D L A E T R P D L K N IS F R V C S G E A T P D D M S C D Y D N M A V N P S E SG FV T L V SV E SG FV T N D IY E FSPD Q M G R SK E SG W V E N E IY G Y * (SEQ

ID N O :2)

>ENSG00000204381 ENST00000436913 ENSP00000392942 LAYN

M V T SG L G SG G V R R N K A IA Q P A R T F M L G L M A A Y H N L E K P A V P S R E A E G E E T E L T T P V L P E E T Q E E

D A K K T FK E SR E A A L N L A Y IL IP S IP L L L L L V V T T V V C W V W IC R K R K R E Q P D P S T K K Q H T IW P S P H Q G N S P D L E V Y N V IR K Q SE A D L A E T R PD L K N ISFR V C SG E A T PD D M SC D Y D N M A V N PSE SG FV T L V S V E SG FV T N D IY E FSPD Q M G R SK E SG W V E N E IY G Y * (SEQ ID N 0 :3 ) >ENSG00000204381_ENST00000525126_ENSP00000434328_LAYN

M R P G T A L Q A V L L A V L L V G L R A A T G R L L S A S D L D L R G G Q P V C R G G T Q R P C Y K V IY F H D T S R R L N F E E A K E A C R R D G G Q L V SIE SE D E Q K L IE K FIE N L L PSD G D FW IG L R R R E E K Q SN ST A C Q D L Y A W T D G SISQ FR N W Y V D E P S C G S E V C V V M Y H Q P S A P A G IG G P Y M F Q W N D D R C N M K N N F IC K Y S D E K P A V PSR E A E G E E T E L T T PV L PE E T Q E E D A K K T FK E SR E A A L N L A Y IL IPSIPL L L L L V V T T V V C W V W IC R K R Q K T G A A R P* (SEQ ID N 0 :4 )

>ENSG00000204381_ENST00000525866_ENSP00000434300_LAYN

M R PG T A L Q A V L L A V L L Y G L R A A T G R L L S G Q P V C R G G T Q R P C Y K V IY F H D T S R R L N F E E A K E A C R R D G G Q L V SIE SE D E Q K L IE K FIE N L L PSD G D FW IG L R R R E E K Q SN ST A C Q D L Y A W T D G SISQ FR E T SSSF* (SE Q ID N 0 :5 )

>ENSG00000204381_ENST00000528924_ENSP00000486561_LAYN

M V T SG L G S G G V R R N K A IA Q P A R T F M L G L M A A Y H N L E K P A V P S R E A E G E E T E L T T P V L P E E T Q E E D A K K T F K E S R E A A L N L A Y IL IP S IP L L L L L V V T T V V C W V W IC R K (SE Q ID N 0 :6 ) >ENSG00000204381_ENST00000530962_ENSP00000431627_LAYN

M Y H Q P S A P A G IG G P Y M F Q W N D D R C N M K N N F IC K Y S D E K P A V P S R E A E G E E T E L T T P V L P E E T Q E E D A K K T F K E S R E A A L N L A Y IL IP S IP L L L L L V V T T V V C W V W IC R K (SE Q ID N 0 :7 ) >ENSG00000204381_ENST00000533265_ENSP00000434972_LAYN

M R PG T A L Q A V L L A V L L V G L R A A T G R L L SG Q PV C R G G T Q R PC Y K V IY FH D T SR R L N FE E A K E A C R R D G G Q L V SIE SE D E Q K L IE K FIE N L L PSD G D FW IG L R R R E E K Q SN ST A C Q D L Y A W T D G SISQ FR N W Y V D E PSC G SE V C V V M Y H Q P S A P A G IG G P Y M F Q W N D D R C N M K N N F IC K Y S D E K P A V P S R E A E G E E T E L T T PV L PE E T Q E E D A K K T FK E SR E A A L N L A Y IL IPSIPL L L L L V V T T V V C W V W IC R K R Q K T G A A R P* (SE Q ID N 0 :8 )

>ENSG00000204381_ENST00000533999_ENSP00000432434_LAYN MYHQPSAPAGIGGPYMFQWNDDRCNMKNNFICKYSDEKPAVPSREAEGE (SEQ ID NO:9)]),

El tumor diana es un tumor sólido. El tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón de células no microcíticas, cáncer colorrectal, cáncer de mama y cáncer gástrico o metástasis, preferiblemente una metástasis ósea, cerebral o hepática.

Preferiblemente, la metástasis se deriva de cáncer rectal de colon o cáncer de pulmón de células no microcíticas.

Un objeto de la invención es un método in vitro para el pronóstico y/o para monitorizar la progresión y/o para monitorizar la eficacia de un tratamiento terapéutico y/o para el cribado de un tratamiento terapéutico de un tumor en un sujeto que comprende las etapas de:

a) detectar LAYN en una muestra biológica aislada obtenida del sujeto y

b) comparar con respecto a un control adecuado.

Otro objeto de la invención es un método in vitro o ex-vivo para monitorizar la progresión y/o para monitorizar la eficacia de un tratamiento terapéutico y/o para el cribado de un tratamiento terapéutico de un tumor en un sujeto como se definió anteriormente, donde el marcador que se va detectar es LAYN.

Preferiblemente, el método anterior es para el pronóstico de cáncer colorrectal o cáncer de pulmón de células no microcíticas en un sujeto y comprende las etapas de:

a) detectar LAYN en una muestra biológica aislada obtenida del sujeto y

b) comparar con respecto a un control adecuado,

en el que una cantidad de dicho LAYN en la muestra biológica aislada obtenida del sujeto mayor que la cantidad de control indica que el sujeto tiene un mal pronóstico.

En el método anterior, preferiblemente la etapa a) comprende medir la cantidad del marcador o de fragmentos del mismo o del polinucleótido que codifica dicha proteína (Ad N o ARNm) o de fragmentos de la misma en dicha muestra biológica aislada obtenida del sujeto y la etapa b) comprende comparar la cantidad medida de la etapa a) con una cantidad de control adecuada.

Preferiblemente, el método in vitro para monitorizar la progresión y/o para monitorizar la eficacia de un tratamiento terapéutico de un tumor, como se definió anteriormente, comprende las etapas de:

a) medir la alteración de la cantidad o la alteración de la actividad de los marcadores anteriores o de fragmentos de los mismos o del polinucleótido que codifica dicha proteína o fragmentos de la misma en dicha muestra biológica aislada obtenida del sujeto y

b) comparar la alteración medida de la etapa a) con una alteración de control adecuada.

Un objeto adicional es un método para identificar una molécula que actúa como antitumoral, que comprende las etapas de:

- ensayar moléculas candidatas para determinar su especificidad de unión a al menos un marcador como se definió anteriormente;

- seleccionar moléculas que tienen una actividad de unión específica a al menos un marcador como se definió anteriormente;

- probar dichas moléculas de unión específicas para determinar su capacidad de inhibir la proliferación y/o inducir una respuesta apoptótica en un sistema celular,

preferiblemente al agotar selectivamente las células T reguladoras que infiltran tumores, más preferiblemente al inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).

Preferiblemente, la muestra biológica es una muestra de fluido, célula o tejido, más preferiblemente dicha muestra es plasma o suero.

El término “muestra biológica” abarca una muestra clínica y también incluye tejido obtenido por resección quirúrgica, tejido obtenido por biopsia, células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, muestras de tejido, órganos, médula ósea, sangre, plasma, suero y similares.

Una “muestra” en el contexto de las presentes enseñanzas se refiere a cualquier muestra biológica que se aísla de un sujeto. Una muestra puede incluir, sin limitación, una alícuota de fluido corporal, sangre entera, suero, plasma, muestras de tejido sólido tales como biopsias de tejido o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos y progenie de las mismas, fluido sinovial, fluido linfático, fluido de ascitis y fluido intersticial o extracelular. El término “muestra” también abarca el fluido en los espacios entre las células, que incluyen el fluido crevicular gingival, médula ósea, fluido cefalorraquídeo (CSF), saliva, mucosa, esputo, semen, sudor, orina o cualquier otro fluido corporal. “Muestra de sangre” se puede referir a sangre completa o cualquier fracción de la misma, que incluye suero y plasma. Las muestras se pueden obtener de un sujeto por medios que incluyen, pero no se limitan a, venopunción, excreción, eyaculación, masaje, biopsia, aspiración con aguja, lavado, raspado, incisión o intervención quirúrgica u otros medios conocidos en la técnica. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos; lavado; o enriquecimiento para ciertas poblaciones de células, tales como células cancerosas o muestras en las que se aíslan y luego se analizan células T reguladoras. La definición también incluye muestras que han sido enriquecidas para tipos particulares de moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, etc.

Se puede proporcionar un kit para llevar a cabo los métodos anteriores, y comprende

- medios para medir la cantidad o la actividad de los marcadores anteriores o de fragmentos de los mismos y/o medios para medir la cantidad del polinucleótido que codifica dicha proteína o de fragmentos de la misma y opcionalmente, - medios de control.

El marcador de la presente invención es LAYN.

Preferiblemente, el polinucleótido anterior es un inhibidor de ARNi, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en: ARNip, ARNmi, ARNhp, ARNtp, ARNnp y ácido nucleico antisentido, o un derivado funcional de los mismos.

Un análisis comparativo de matrices de expresión génica de células T CD4+ que infiltran NSCLC y CRC reveló la expresión específica de Treg de 328 marcadores como se enumeran en la Tabla IV

Las expresiones “molécula capaz de modular” y “modulador” son en el presente documento intercambiables. Por el término “modulador” se entiende una molécula que efectúa un cambio en la expresión y/o función de al menos un marcador como se definió anteriormente.

El cambio es relativo al nivel normal o de valor inicial de expresión y/o función en ausencia del modulador, pero por lo demás bajo condiciones similares, y puede representar un aumento (por ejemplo, al utilizar un inductor o activador) o una disminución (por ejemplo, al utilizar un supresor o inhibidor) en la expresión y/o función normal/inicial. En el contexto de la presente invención, un “modulador” es una molécula que puede suprimir o inhibir la expresión y/o función de al menos un marcador que se desregula selectivamente en células T reguladoras que infiltran tumores para uso en la prevención y/o tratamiento contra el cáncer.

Por el término “supresor o inhibidor” o una “molécula que (selectivamente) suprime o inhibe” se entiende una molécula que efectúa un cambio en la expresión y/o función de la diana.

En el contexto de la presente invención, un “modulador” es una molécula que puede inducir o activar la expresión y/o función de al menos un marcador que se desregula selectivamente en células T reguladoras que infiltran tumores para uso en la prevención y/o tratamiento contra el cáncer.

El cambio es relativo al nivel normal o de valor inicial de la expresión y/o función en ausencia del modulador, pero por lo demás bajo condiciones similares, y puede representar un aumento (por ejemplo, al utilizar un inductor o activador) o una disminución (por ejemplo, al utilizar un supresor o inhibidor) en la expresión y/o función normal/inicial.

La supresión o inhibición de la expresión y/o función de la diana se pueden evaluar por cualquier medio conocido por el experto en la técnica. La evaluación del nivel de expresión o de la presencia de la diana se realiza preferiblemente utilizando técnicas clásicas de biología molecular tales como (Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real) qPCR, micromatrices, matrices de microesferas, análisis de protección de RNAsa o análisis de transferencia Northern o clonación y secuenciación.

La evaluación de la función de la diana se realiza preferiblemente mediante ensayo de supresión in vitro, análisis de transcriptoma completo, análisis de espectrometría de masas para identificar proteínas que interactúan con la diana.

La diana (o el marcador) puede ser el gen, el ARNm, el ADNc o la proteína codificada del mismo, que incluye fragmentos, derivados, variantes, isoformas, etc. Preferiblemente, el marcador se caracteriza por sus números de Acceso (es decir, ID NCBI Entrez; Número de acceso de Ensembl Gene (ENSG), número de acceso de la transcripción Ensembl (ENST) y número de acceso de proteína Ensembl (ENSP), recuperable en la base de datos pública EnsEMBL (http://www.ensembl.org)) y/o secuencias de aminoácidos y nucleótidos, divulgadas en el presente documento.

El término “tratar” (o “tratado”, “tratamiento”, etc.) cuando se refiere a células T CD4+, significa, por ejemplo, la exposición de la célula a un modulador exógeno como se definió anteriormente. La sobreexpresión se puede obtener, por ejemplo, al infectar las células con un vector viral que expresa la molécula de la invención. La inhibición de la expresión del marcador se puede, por ejemplo, obtener mediante transfección con polinucleótido, como, por ejemplo con ARNip. El término “tratar” también puede significar que las células se manipulan para sobreexpresar o silenciar el marcador. La sobreexpresión o el silenciamiento se pueden obtener, por ejemplo, al modificar genéticamente las células. Se pueden utilizar medios de control para comparar la cantidad o el aumento de la cantidad del marcador definido con un control adecuado. El control adecuado se puede obtener, por ejemplo, con referencia a un estándar conocido, ya sea de un sujeto normal o de una población normal, o de células T diferentes de las células T reguladoras que infiltran tumores o células T reguladoras.

Los medios para medir la cantidad de al menos un marcador como se definió anteriormente son preferiblemente al menos un anticuerpo, análogo funcional o derivados del mismo. Dicho anticuerpo, análogo funcional o derivados del mismo son específicos para dicho marcador.

El anticuerpo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en una inmunoglobulina intacta, un Fv, un scFv (fragmento Fv de cadena sencilla), un Fab, un F(ab')2, un dominio “similar a anticuerpo”, un “anticuerpo- dominio mimético”, un dominio de anticuerpo único (dominio VH o dominios VL), un anticuerpo multimérico, fragmentos de unión a antígeno recombinantes o sintéticos, un péptido o un fragmento proteolítico que contiene la región de unión al epítopo. Los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se pueden utilizar indistintamente y se utilizan en el presente documento en el sentido más amplio y abarcan varios anticuerpos y estructuras miméticas de anticuerpos, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, nanocuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticalinas, DARPinas, aficuerpos, afilinas, afímeros, afitinas, alfacuerpos, avímeros, finómeros, monocuerpos y otros dominios de unión, siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.

El término inmunoglobulina también incluye “conjugados” de la misma. En el contexto de la presente invención, “conjugado” en relación con el anticuerpo de la invención incluye anticuerpos (o fragmentos de los mismos) conjugados con una sustancia (un compuesto, etc.) que tiene una actividad terapéutica, por ejemplo, actividad antitumoral y/o actividad de destrucción de células o agentes citotóxicos tales como diversas toxinas de cadena A, proteínas que inactivan ribosomas y ribonucleasas; anticuerpos biespecíficos diseñados para inducir mecanismos celulares para destruir tumores (véase, por ejemplo, Patentes de EE. UU. Nos. 4,676,980 y 4,954,617). El conjugado se puede formar al preparar previamente cada una de las moléculas de anticuerpo mencionadas anteriormente y la sustancia mencionada anteriormente que tiene actividad antitumoral y/o actividad de destrucción de células, por separado, y luego combinándolos (inmunoconjugado) o al ligar una toxina proteica utilizada como dicha sustancia que tiene actividad antitumoral y/o actividad de destrucción de células para un gen de anticuerpo en un gen de acuerdo con una técnica de recombinación genética, para permitirle expresarse como una única proteína (una proteína de fusión) (inmunotoxina).

Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto.

Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, entre otros, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los Fv VH o VL también se denominan “nanocuerpos”.

El término “miméticos de anticuerpos” se refiere a aquellos compuestos orgánicos o dominios de unión que no son derivados de anticuerpos pero que se pueden unir específicamente a un antígeno como lo hacen los anticuerpos. Incluyen anticalinas, DARPinas, aficuerpos, afilinas, afímeros, afitinas, alfacuerpos, avímeros, finómeros, monocuerpos y otros.

El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o liviana se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o liviana se deriva de una fuente o especie diferente.

Los términos “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto” y “anticuerpo completo” se utilizan en el presente documento indistintamente para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento. El kit incluye:

- un anticuerpo adherido en fase sólida específico para dicho compuesto;

- medios de detección del complejo marcador específico de ligando.

Alternativamente, los reactivos se pueden proporcionar como un kit que comprende reactivos en una suspensión o en forma de suspensión, por ejemplo, reactivos unidos a microesferas adecuadas para citometría de flujo, preferiblemente microesferas magnéticas recubiertas con anticuerpos de captura. Las instrucciones pueden comprender instrucciones para realizar un ensayo de citometría de flujo basado en anticuerpos.

Los medios de detección son preferiblemente medios capaces de detectar y/o medir la cantidad de los marcadores descritos, por ejemplo, medios capaces de detectar el complejo antígeno-anticuerpo, como anticuerpos secundarios conjugados con enzimas, sustratos luminiscentes, microesferas magnéticas recubiertas con captura de anticuerpos, cócteles personalizados de anticuerpos secos y/o columnas con cartuchos de filtro de tamaño y/o combinadas con filtro de anticuerpos específicos (SAF).

En una realización, el método comprende adicionalmente seleccionar un régimen terapéutico basado en el análisis. En una realización, el método comprende adicionalmente determinar un curso de tratamiento para el sujeto en base al análisis. Otros medios pueden ser, por ejemplo, cebadores y sondas específicos para RT PCR. Los kits pueden comprender además auxiliares habituales, tales como tampones, portadores, marcadores, etc. y/o instrucciones de uso.

En el contexto de la presente invención, el término “detectar” también puede significar “medir la cantidad” o “medir la alteración”. En el caso de un método o kit para evaluar el pronóstico de un tumor, el control adecuado puede ser una muestra tomada de un paciente sano o de un paciente afectado por otro trastorno o patología, y la cantidad o actividad del control adecuado puede ser la cantidad o actividad de la misma proteína o polinucleótido medida en una muestra tomada de un paciente sano o de un paciente afectado por otro trastorno o patología.

En el caso de un método o un kit para monitorizar la progresión de un tumor, se monitoriza el progreso del cáncer y el control adecuado puede ser una muestra tomada del mismo sujeto en varios momentos o de otro paciente, y la cantidad o actividad de control adecuada puede ser la cantidad o actividad de la misma proteína o polinucleótido medida en una muestra tomada del mismo sujeto en varios momentos o de otro paciente.

En el caso de un método o un kit para monitorizar la eficacia de un tratamiento terapéutico, el control adecuado puede ser una muestra tomada del mismo sujeto antes del inicio de la terapia o tomada en varios momentos durante el curso de la terapia y la cantidad o actividad de control adecuada puede ser la cantidad o actividad de la misma proteína o polinucleótido medida en una muestra tomada del mismo sujeto antes del inicio de la terapia o tomada en varios momentos durante el curso de la terapia.

En el caso de un método o kit para el cribado de un tratamiento terapéutico, el control adecuado puede ser una muestra tomada de sujetos sin tratamiento y de sujetos tratados con una sustancia que se va a ensayar o de sujetos tratados con un tratamiento de referencia y la cantidad o actividad de control adecuado puede ser el promedio de las cantidades o actividades de la misma proteína o polinucleótido medida en muestras tomadas de sujetos sin tratamiento y de sujetos tratados con una sustancia que se va a ensayar o de sujetos tratados con un tratamiento de referencia. En este caso, si la cantidad o actividad de los polinucleótidos ^lA^y N del mismo en la muestra biológica aislada obtenida del sujeto es menor o igual que la cantidad o actividad de control, puede indicar que la sustancia probada es efectiva para el tratamiento del tumor.

En la presente invención, la expresión “medir la cantidad” puede pretender medir la cantidad (o la actividad) o la concentración o el nivel de la respectiva proteína y/o ARNm de la misma y/o ADN de la misma, preferiblemente semicuantitativa o cuantitativa. La medición de una proteína se puede realizar directa o indirectamente. La medición directa se refiere a la medida de la cantidad o concentración del marcador, basada en una señal obtenida directamente de la proteína, y que está directamente correlacionada con el número de moléculas de proteína presentes en la muestra. Esta señal, que también puede denominarse señal de intensidad, se puede obtener, por ejemplo, al medir un valor de intensidad de una propiedad química o física del marcador. Las mediciones indirectas incluyen la medición obtenida a partir de un componente secundario (por ejemplo, un componente diferente del producto de expresión génica) y un sistema de medición biológica (por ejemplo, la medición de respuestas celulares, ligandos, “etiquetas” o productos de reacción enzimática).

El término “cantidad”, como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita a la cantidad absoluta o relativa de proteínas y/o ARNm de las mismas y/o ADN de las mismas, y cualquier otro valor o parámetro asociado con las mismas o que pueda resultar de estas. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de propiedades físicas o químicas de la proteína, obtenidas por medición directa, por ejemplo, valores de intensidad en un inmunoensayo, espectroscopia de masas o resonancia magnética nuclear. Adicionalmente, estos valores o parámetros incluyen aquellos obtenidos por medición indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medición descritos en el presente documento. Los métodos para medir ARNm y ADN en muestras son conocidos en la técnica. Para medir los niveles de ácido nucleico, se pueden lisar las células en una muestra de prueba, y los niveles de ARNm en los lisados o en el ARN purificado o semipurificado a partir de lisados se pueden medir mediante cualquier variedad de métodos familiares para aquellos expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen ensayos de hibridación que utilizan sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable (es decir, transferencia Northern) o metodologías de RT-PCR cuantitativas o semicuantitativas que utilizan cebadores de oligonucleótidos adecuados. Alternativamente, pueden llevarse a cabo ensayos de hibridación in situ cuantitativos o semicuantitativos utilizando, por ejemplo, secciones de tejido o suspensiones de células no lisadas y sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable (por ejemplo, fluorescentes o marcadas con enzimas). Los métodos adicionales para cuantificar el ARNm incluyen el ensayo de protección de ARN (RPA), micromatrices de ADNc y oligonucleótidos, análisis de diferencia de representación (RDA), visualización diferencial, análisis de secuencia EST y análisis en serie de la expresión génica (SAGE).

Si al comparar la cantidad o actividad medida de los marcadores anteriores o del polinucleótido que codifica dicha proteína con la cantidad o actividad obtenida de una muestra de control, la cantidad o la actividad de dicho marcador en la muestra aislada del sujeto corresponde a un mayor valor, el sujeto puede presentar cáncer o ir hacia un agravamiento de dicha enfermedad.

Si al comparar la cantidad o la actividad medida de los marcadores anteriores o del polinucleótido que codifica dicha proteína con la cantidad o la actividad obtenida de una muestra de control, la cantidad o la actividad de dicho marcador en la muestra aislada del sujeto corresponde a un valor similar o inferior, el sujeto puede no verse afectado por el cáncer o avanzar hacia una mejora del cáncer, respectivamente.

Alternativamente, la expresión “detectar” o “medir la cantidad” pretende medir la alteración de la molécula. Dicha alteración puede reflejar un aumento o una disminución en la cantidad o actividad de las moléculas como se definió anteriormente. Un aumento de la proteína o de la actividad del marcador o del polinucleótido que codifica dicho marcador se puede correlacionar con un agravamiento del cáncer. Una disminución de la proteína o de la actividad de dicho marcador o del polinucleótido que codifica dicha proteína se puede correlacionar con una mejora del cáncer o con la recuperación del sujeto.

La expresión “marcador” pretende incluir también la proteína correspondiente codificada a partir de dicho marcador genes ortólogos u homólogos, mutantes funcionales, derivados funcionales, fragmentos funcionales o análogos, isoformas, variantes de corte y empalme de los mismos.

Cuando la expresión “marcador” se refiere a genes, se pretende que incluya también los correspondientes genes ortólogos u homólogos, mutantes funcionales, derivados funcionales, fragmentos funcionales o análogos, isoformas de los mismos.

Como se utiliza en el presente documento, “fragmentos” se refiere a polinucleótidos que tienen preferiblemente una longitud de al menos 1000 nucleótidos, 1100 nucleótidos, 1200 nucleótidos, 1300 nucleótidos, 1400 nucleótidos, 1500 nucleótidos.

Como se utiliza en el presente documento, “fragmentos” se refiere a polipéptidos que tienen preferiblemente una longitud de al menos 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 15, al menos 17 aminoácidos o al menos 20 aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 25 aminoácidos o al menos 37 o 40 aminoácidos, y más preferiblemente de al menos 50, o 100, o 150 o 200 o 250 o 300 o 350 o 400 o 450 o 500 aminoácidos.

El término “polinucleótido” también se refiere a polinucleótidos modificados.

Como se utiliza en el presente documento, el término “vector” se refiere a un vector de expresión y puede tener, por ejemplo, la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Dichos vectores pueden incluir plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, lentivirus, virus de la viruela aviar y pseudorrabia. Aquellos expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.

La secuencia de polinucleótidos, preferiblemente la secuencia de ADN en el vector, se liga operativamente a una secuencia o secuencias de control de expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de dichos promotores, se pueden mencionar promotores procarióticos o eucarióticos tales como CMV inmediato temprano, timidina quinasa HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un vector de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células anfitrionas transformadas, tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Como se utiliza en el presente documento, el término “célula anfitriona manipulada genéticamente” se refiere a células anfitrionas que se han transducido, transformado o transfectado con el polinucleótido o con el vector descrito anteriormente. Como ejemplos representativos de células anfitrionas apropiadas, se pueden citar células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, células fúngicas tales como levadura, células de insectos tales como Sf9, células animales tales como CHO o COS, células vegetales, etc. Se considera que la selección de un anfitrión adecuado está dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas del presente documento. Preferiblemente, dicha célula anfitriona es una célula animal, y más preferiblemente una célula humana.

Los anticuerpos generados contra los polipéptidos marcadores se pueden obtener mediante inyección directa de los polipéptidos marcadores en un animal o al administrar polipéptidos marcadores a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los propios polipéptidos marcadores. De esta manera, incluso una secuencia que codifica sólo un fragmento del polipéptido marcador se puede utilizar para generar anticuerpos que se unen al polipéptido marcador nativo completo.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de estirpes celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72), y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de EE.UU. N° 4,946,778) se puede utilizar fácilmente para producir anticuerpos de cadena sencilla para polipéptidos marcadores. Además, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para polipéptidos marcadores inmunogénicos. Para mejorar o activar la función del marcador, se puede utilizar cualquier agente que aumente el nivel del marcador o la actividad del marcador existente en la célula T. Dichos agentes se pueden identificar utilizando los ensayos de cribado que se describen a continuación. Los vectores de expresión que codifican el marcador también se pueden administrar para aumentar la dosis génica. Los vectores de expresión pueden ser vectores plasmídicos o vectores víricos, como se conoce en la técnica. Cualquier vector puede ser elegido por aquellos expertos en la técnica por sus propiedades particularmente deseables. El término “polinucleótido” incluye moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm, ARNip, ARNhp) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. El polinucleótido puede ser de cadena sencilla o de cadena doble. El polinucleótido se puede sintetizar utilizando análogos o derivados de oligonucleótidos (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato).

Los inhibidores de ARNi como se definió anteriormente son preferiblemente capaces de hibridarse con la totalidad o parte de la secuencia diana específica. Por lo tanto, los inhibidores de ARNi pueden ser total o parcialmente complementarios a toda o parte de la secuencia diana.

Los inhibidores de ARNi se pueden hibridar con la secuencia diana especificada bajo condiciones de rigurosidad media a alta.

Un inhibidor de ARNi se puede definir con referencia a una identidad de secuencia específica con el complemento inverso de la secuencia a la que pretende dirigirse. Las secuencias antisentido tendrán normalmente al menos aproximadamente 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con los complementos inversos de sus secuencias objetivo.

El término polinucleótido y polipéptido también incluye derivados y fragmentos funcionales de los mismos.

En el contexto de la presente invención, el al menos un gen o marcador como se definió anteriormente se caracteriza preferiblemente por al menos una de las SEQ ID No. 1-9.

El término gen en el presente documento también incluye genes ortólogos u homólogos correspondientes, isoformas, variantes, variantes alélicas, derivados funcionales, fragmentos funcionales de los mismos. La expresión “proteína” p re te n d e in c lu ir ta m b ié n la p ro te ín a c o r re s p o n d ie n te c o d if ic a d a a p a rt ir d e g e n e s o r tó lo g o s u h o m ó lo g o s c o r re s p o n d ie n te s , m u ta n te s fu n c io n a le s , d e r iv a d o s fu n c io n a le s , f ra g m e n to s fu n c io n a le s o a n á lo g o s , is o fo rm a s d e lo s m is m o s .

El término “análogo” como se utiliza en el presente documento para referirse a una proteína significa un péptido modificado en el que uno o más residuos de aminoácidos del péptido se han sustituido por otros residuos de aminoácidos y/o en el que uno o más residuos de aminoácidos se han suprimido del péptido y/o en el que uno o más residuos de aminoácidos se han suprimido del péptido y/o en el que se han agregado uno o más residuos de aminoácidos al péptido. Dicha adición o supresión de residuos de aminoácidos puede tener lugar en el terminal N del péptido y/o en el terminal C del péptido.

Un “derivado” puede ser una molécula de ácido nucleico, como una molécula de ADN, que codifica el polinucleótido como se definió anteriormente, o una molécula de ácido nucleico que comprende el polinucleótido como se definió anteriormente, o un polinucleótido de secuencia complementaria. El término “derivados” también se refiere a polinucleótidos y/o polipéptidos más largos o más cortos que tienen, por ejemplo, un porcentaje de identidad de al menos 41%, 50%, 60%, 65%, 70% o 75%, más preferiblemente de al menos 85%, como ejemplo de al menos 90%, y aún más preferiblemente de al menos 95% o 100% con las secuencias en el presente documento mencionadas o con su secuencia complementaria o con su correspondiente secuencia de ADN o ARN. El término “derivados” y el término “polinucleótido” también incluyen oligonucleótidos sintéticos modificados. Los oligonucleótidos sintéticos modificados son preferiblemente LNA (Ácido Nucleico Bloqueado), oligos fosforo-tiolados o oligos metilados, morfolinos, oligonucleótidos de 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo y oligonucleótidos modificados con 2'-O-metilo conjugado con colesterol (antagomires).

El término “derivado” también puede incluir análogos de nucleótidos, es decir, un ribonucleótido o desoxirribonucleótido de origen natural sustituido por un nucleótido de origen no natural. El término “derivados” también incluye ácidos nucleicos o polipéptidos que se pueden generar mediante la mutación de uno o más nucleótidos o aminoácidos en sus secuencias, equivalentes o secuencias precursoras. El término “derivados” también incluye al menos un fragmento funcional del polinucleótido.

El término “funcional” se entiende, por ejemplo, como “mantener su actividad”.

La expresión del marcador en las células T se puede modular a nivel transcripcional o traduccional. Los agentes que son capaces de dicha modulación se pueden identificar utilizando los ensayos de cribado descritos a continuación.

La traducción del ARNm marcador se puede inhibir al utilizar ribozimas, moléculas antisentido, ARN de interferencia pequeña (ARNip; Véase Elbashir, S. M. et al., “Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells”, Nature 411: 494-498 (2001)) o inhibidores de molécula pequeña de este proceso que se dirigen al ARNm marcador. Se puede utilizar la tecnología antisentido para controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos métodos se basan en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica los polipéptidos maduros, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Un oligonucleótido de ADN está diseñado para ser complementario a una región del gen involucrada en la transcripción (triple hélice, véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al, Science, 241: 456 (1988); h Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), impidiendo de esta manera la transcripción y la producción del marcador. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido marcador (Antisentido--Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también se pueden suministrar a las células mediante construcciones de expresión antisentido, de tal manera que el ARN o ADN antisentido se puede expresar in vivo para inhibir la producción dicho marcador. Dichas construcciones son bien conocidas en la técnica. Se pueden utilizar construcciones antisentido, oligonucleótidos antisentido, construcciones de interferencia de ARN o moléculas de ARN dúplex de ARNip para interferir con la expresión del marcador. Normalmente, al menos 15, 17, 19 o 21 nucleótidos del complemento de la secuencia de ARNm marcador son suficientes para una molécula antisentido. Normalmente, al menos 19, 21, 22 o 23 nucleótidos de marcador son suficientes para una molécula de interferencia de ARN. Preferiblemente, una molécula de interferencia de ARN tendrá un saliente 3' de 2 nucleótidos. Si la molécula de interferencia de ARN se expresa en una célula a partir de una construcción, por ejemplo, de una molécula de horquilla o de una repetición invertida de la secuencia marcadora deseada, entonces la maquinaria celular endógena creará los salientes. Las moléculas de ARNip se pueden preparar mediante síntesis química, transcripción in vitro o digestión de ARNcs largo por Rnasa III o Dicer. Estos se pueden introducir en las células mediante transfección, electroporación u otros métodos conocidos en la técnica. (Véase Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418:244-251; Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7:1509-1521; Hutvagner G et aL9 RNAi: Nature harbors a double-strand. Curr. Opin. Genetics & Development 12: 225-232, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, and Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20: 500-505; Miyagishi M, and Taira K. (2002). U6- promoter-driven siRNAs with four uridine 3'overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20: 497-500; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, and Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Dev.

16: 948-958; Paul CP, Good PD, Winer I, and Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20: 505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forester WC, and Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (6): 5515­ 5520; Yu J-Y, DeRuiter SL, and Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (9): 6047-6052).

Además de los moduladores conocidos, los moduladores adicionales de la actividad de los marcadores que son útiles en los métodos de la invención se pueden identificar utilizando cribado de dos híbridos, enfoques bioquímicos convencionales y técnicas de cribado basadas en células, tales como el cribado de moléculas candidatas para determinar su capacidad de unión al marcador o cribado de compuestos que inhiben la actividad del marcador en cultivo celular.

Esto proporciona un sistema de ensayo in vitro simple para cribar moduladores de actividad de marcadores. El método puede identificar agentes que interactúan directamente con el marcador y lo modulan, así como agentes que modulan indirectamente la actividad del marcador al afectar una etapa en la ruta de transducción de la señal del marcador.

Los ensayos basados en células que emplean células que expresan el marcador pueden emplear células que se aíslan de mamíferos y que expresan el marcador de forma natural. Alternativamente, se pueden utilizar células que han sido manipuladas genéticamente para expresar el marcador. Preferiblemente, las células manipuladas genéticamente son células T.

Los agentes que modulan la actividad del marcador al modular la expresión del gen marcador se pueden identificar en ensayos de cribado basados en células al medir las cantidades de la proteína marcadora en las células en presencia y ausencia de agentes candidatos. La proteína marcadora se puede detectar y medir, por ejemplo, mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales específicos antimarcadores. El ARNm marcador también se puede detectar y medir utilizando 23 técnicas conocidas en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, transferencia Northern, RT-PCR e hibridación en matriz.

Figuras

Figura 1. Purificación, caracterización funcional y expresión de puntos de control inmunitarios en células que infiltran tumores.

(A) Representación de la estrategia de clasificación de las células Treg que infiltran tumores o tejido normal.

(B) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la actividad supresora de células Treg aisladas de tumor (NSCLC o CRC), de pulmón normal y de sangre del mismo paciente. Se cocultivaron 4*105 células T vírgenes CD4+ de donantes sanos marcados con diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) con un número igual de células Treg durante 4 días con un mAb específico de CD3 y células dendríticas CD1c+CD11c+. Se indica el porcentaje de células en proliferación. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.

(C) Los valores de expresión de ARN-seq normalizados con puntaje Z de los genes de los puntos de control inmunitarios se representan como un mapa de calor. Las poblaciones de células se fijan en la parte superior del gráfico, mientras que los nombres de los genes se han asignado a las filas del mapa de calor. Los resultados del agrupamiento jerárquico se muestran como un dendrograma dibujado en el lado izquierdo de la matriz. Los tejidos del colon se indican como C, los tejidos de pulmón como L y la sangre periférica como B. Véase también la Figura 6.

Figura 2. El análisis de expresión diferencial identifica genes regulados en conjunto en células Treg que infiltran tumores

Los valores de expresión normalizados de puntaje Z de genes que se expresan preferiblemente en células Treg que infiltran tumores (prueba de Wilcoxon Mann Whitney p<2.2x10-16) sobre los subconjuntos de células enumerados se representan como gráficos en caja. Los tejidos de colon se indican como C, los tejidos de pulmón como L y la sangre periférica como B.

Figura 3. Análisis de células individuales de células Treg que infiltran tumores

(A) Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. Los experimentos se realizaron en células Treg que infiltran CRC, NSCLC o aisladas de sangre periférica de donantes sanos (PB); Se recolectaron cinco muestras para cada tejido.

(B) Se representa el porcentaje de coexpresión de genes distintivos con FOXP3 e IL2RA.

(C) Los niveles de expresión de los genes distintivos clasificados por el porcentaje de coexpresión se representan como gráfico de caja.

(D) Distribución de la expresión (gráficos de violín) en células Treg que infiltran CRC, NSCLC o PB. Se muestran gráficos que representan las clases de ontología de receptores, señalización y actividad enzimática, actividad de citocinas y factores de transcripción (prueba de Wilcoxon Mann Whitney p<0.05). El gradiente de escala de grises indica el porcentaje de células que expresan cada gen en las células Treg aisladas de los tres compartimentos.

(E) Análisis de la expresión génica de genes distintivos de Treg tumorales en diferentes tipos de tumores. Los valores de expresión se expresan como log2 (2A-DCt).

Figura 4. Expresión de distintivos de proteínas de células Treg que infiltran tumores en muestras de CRC y NSCLC. (A y B) Gráficos representativos de citometría de flujo para células Treg que infiltran tejido tumoral normal y células Treg de sangre periférica analizadas para determinar la expresión de las proteínas indicadas.

Figura 5. Valor pronóstico de las transcripciones distintivas de las células Treg que infiltran tumores.

(A) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que compara la expresión alta y baja de las transcripciones distintivas de Treg tumorales (CCR8, MAGEH1, LAYN) normalizados a CD3G para los estudios CRC (n=177) y NSCLC (n=263). El análisis univariado confirmó una diferencia significativa en la curva de supervivencia global que compara pacientes con expresión alta y baja. La significación estadística se determinó mediante la prueba de rango logarítmico. (CRC: p=0.05 para CCR8, p=1.48*10-3 para MAGEH1, p=2.1*10-4 para LAYN; NSCLC: p=0.0125 para CCR8, p=0.035 para MAGEH1, p=0.0131 para LAYN). Cada tabla muestra las estimaciones de Kaplan Meier en los puntos de tiempo especificados. (B) Distribuciones de expresión de CCR8, MAGEH1 y LAYN de acuerdo con la estadificación del tumor en el momento de la cirugía en la cohorte de pacientes con CRC. Véase también la Figura 9.

Figura 6 relacionada con Figura 1. Análisis transcriptómico de linfocitos que infiltran tumores.

(A) Representación de la estrategia de clasificación de las células Treg que infiltran tumores colorrectales o tejido normal. (B) Valores de expresión de ARN-seq (recuentos normalizados) de FOXP3, TBX21 y RORC en células Th1, Th17 y Treg c D4+ de CRC (C), NSCLC (L) o sangre periférica (PB) de donantes sanos.

(C) Los datos de recuentos normalizados de ARN-seq para puntos de control inmunitarios seleccionados y sus ligandos se muestran como gráfico de histograma. Los nombres de las poblaciones de células se informan en la parte inferior de cada gráfico, mientras que los nombres de los genes se muestran en la parte superior.

Figura 7 relacionada con Figura 3. Análisis de células Treg individuales que infiltran tumores.

Evaluación de la expresión de marcadores de células B y células T Treg CD4+, Th1, Th17, Th2, CD8+ (porcentaje de células que se expresan) en células Treg individuales purificadas de NSCLC y CRC.

Figura 8 relacionada con Figura 4. Comparación de la expresión de BATF en células Treg CD4+ versus Th17.

Niveles de expresión de BATF (datos de recuentos normalizados de ARN-seq) en subconjuntos de Treg CD4+ y Th17 aislados de tejido tumoral o sangre periférica

Figura 9 relacionada con Figura 5. Niveles de expresión de genes distintivos de Treg que infiltran tumores.

ARN-seq normalizó los datos de recuentos de tres genes distintivos de Treg que infiltran tumores (MAGEH1 (panel A), LAYN (panel B) y CCR8 (panel C)) a través de las poblaciones de células enumeradas.

Figura 10. Resultados del análisis de RT-PCR realizado en ADNc de células Treg que infiltran tumores (L=NSCLC, C=CRC, -=ntc) con cebadores específicos capaces de discriminar las diferentes isoformas de transcripción anotadas para SIRPG.

Detalles técnicos

La información técnica que se establece a continuación puede divulgar aspectos fuera del alcance de la invención que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para ubicar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no es parte de la invención. Procedimientos experimentales

Tejidos primarios humanos

Se obtuvieron tumores humanos primarios de pulmón o colorrectales y homólogos no neoplásicos, respectivamente, de quince y catorce pacientes que se sometieron a cirugía con fines terapéuticos en los hospitales Fondazione IRCCS Ca' Granda, Policlínico o San Gerardo (Italia). Los registros estaban disponibles para todos los casos e incluían la edad de los pacientes en el momento del diagnóstico, género, tabaquismo (para pacientes con cáncer de pulmón), estadificación clínico-patológica (Sobin et al., 2009), histotipo y grado del tumor (Tabla II). Ningún paciente recibió cirugía paliativa ni quimioterapia y/o radioterapia neoadyuvante. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Fondazione IRCCS Ca’ Granda (aprobación n. 30/2014).

El cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC) se cortó en pedazos y se prepararon suspensiones de células individuales al utilizar el Kit de Disociación de Tumores, humano y el Disociador GentleMACS™ (Miltenyi Biotech cat. 130­ 095-929) de acuerdo con el protocolo estándar acompañante. Las suspensiones celulares se aislaron luego mediante centrifugación en gradiente de densidad ficoll-hypaque (Amersham Bioscience). Las muestras de cáncer colorrectal (CRC) se cortaron en pedazos y se incubaron en DTT 0.1 mM (Sigma-Aldrich) durante 10 min, luego se lavaron exhaustivamente en HBSS (Thermo Scientific) y se incubaron en EDTA 1 mM (Sigma-Aldrich) durante 50 min a 37 °C en presencia de 5% de CO2. Luego se lavaron e incubaron en solución de colagenasa tipo D 0.5 mg/mL (Roche Diagnostic) durante 4 h a 37 °C. Los sobrenadantes que contenían linfocitos que infiltran tumores se filtraron a través de un tamiz de células de 100 pm, se centrifugaron y se fraccionaron 1800 x g durante 30 min a 4 °C en un gradiente de cuatro etapas que consistía en soluciones de Percoll al 100%, 60% y 40% y 30% (Pharmacia). La fracción de células T se recuperó de la interfaz entre las capas de Percoll al 60% y al 40%.

Los subconjuntos de células T CD4+ se purificaron mediante clasificación FACS utilizando los siguientes anticuerpos conjugados con fluorocromo: anti-CD4+ ApC/Cy7 (Biolegend clon OKT4), anti-CD27 Pacific Blue (Biolegend clon OKT4), anti-CD27 Pacific Blue (Biolegend, clon M-T271), anti-IL7R PE (Milteniy, clon MB15-18C9), anti-CD25 PE/Cy7 (eBioscience, clon BC96), anti-CXCR3 PE/Cy5 (BD, clon 1C6/CXCR3), anti-CCR6 APC (Biolegend, clon G034E3) y anti-Cc R5 FITC (Biolegend, clon j418F1) utilizando un FACSAria II (BD).

Citometría de flujo

Para validar la expresión del marcador de superficie, las células se tiñeron directamente con los siguientes anticuerpos conjugados con fluorocromo y se analizaron mediante citometría de flujo: anti-CD4 (Biolegend, clon OKT4); anti-PD-L2 (Biolegend, Clon CL24F.10C12); anti-CD127 (eBioscience, clon RDR5); anti-BATF (eBioscience, clon MBM7C7), anti-GlTR (eBioscience, clon eBlOAITR), anti-CD25 (Miltenyi, clon 4e3) y anti 4-1BB (eBioscience clon 4b4) anti CCR8(Biolegend clon L263G8) anti CD30 (eBioscience, clon Ber-H2) anti PD-L1 (Biolegend clon 29E.2A3) anti TIGIT (eBioscience, clon MBSA43) anti IL1R2 (clon R y D 34141) IL21R (Biolegend clon 2G1-K12) anti OX40 (Biolegend clon Ber- ACT35). La tinción intracelular se realizó utilizando el kit de tinción eBioscience Foxp3 de acuerdo con el protocolo del fabricante (eBioscience cat 00-5523-00). Brevemente, las células se recolectaron y fijaron durante 30 min en tampón de fijación/permeabilización a 4 °C, y luego se tiñeron con anticuerpo anti-FOXP3 (eBioscience, clon 236A/E7) y anti-BATF (eBioscience clon MBM7C7) en tampón de permeabilización durante 30 min a 4 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en tampón de lavado FACS y se analizaron mediante citometría de flujo.

Ensayo de supresión.

Se cocultivaron 4 x 104 células T vírgenes+ de respondedores marcados con éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) (1 pM) de donantes sanos con diferentes relaciones E/T con células T CD127-CD25bajoCD4+ sin marcar clasificadas de TIL o PBMC de pacientes con CRC o NSCLC, utilizando FACS Aria II (BD Biosciences), en presencia de células dendríticas CD11c+CD1c+ como células presentadoras de antígeno y 0.5 mg/ml de mAb anti-CD3 (OKT3). La proliferación de células marcadas con CFSE se evaluó mediante citometría de flujo después de 96 h de cultivo.

Aislamiento de ARN y secuenciación de ARN

El ARN de los linfocitos que infiltran tumores se aisló utilizando el Kit de Aislamiento mirVana. El ADN genómico contaminante residual se eliminó de la fracción de ARN total utilizando ADN Turbo-libre (Thermo Fisher). Los rendimientos de ARN se cuantificaron con el Sistema de ARN QuantiFluor (Promega) y la calidad del ARN se evaluó con el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent). Las bibliotecas para la secuenciación de Illumina se construyeron a partir de 50 ng de ARN total con el kit de preparación de muestras de ARN Illumina TruSeq v2 (Conjunto A). Las bibliotecas generadas se cargaron en el cBot (Illumina) para agruparlas en una Celda de Flujo HiSeq v3. A continuación, la celda de flujo se secuenció utilizando un HiSeq 2500 en modo de Alto Rendimiento (Illumina). Se realizó una serie de extremo emparejado (2x125).

Análisis de datos de ARN-seq

Los archivos.fastq sin procesar se analizaron con FastQC v0.11.3 y la eliminación del adaptador se realizó utilizando cutadapt 1.8. Cutadapt se realiza para secuencias inversas y directas con parámetros predeterminados [--anywhere <adapter1> --anywhere <adapter2> --overlap 10times 2 --mask-adapter]. Las secuencias adaptadoras utilizadas para la preparación de bibliotecas son

Adaptadorl:

AG A TC G G AAG A G C A C A C G TC TG A A C T C C A G T C A C N N N N N N A T C T C G T A T G C C G T C

T T C T G C T T G (SEQ ID N O :710)

Adaptador2:

AG AT C G G AAG A G C G T C G T G T AG G G AAAG A G T G TA G AT C T C G G T G G T C G C C G T AT C

A TT (SEQ ID N 0 :711)

El recorte se realizó en lecturas sin procesar utilizando Trimmomatic (Bolger et al., 2014): se utilizaron parámetros estándar para la codificación phred33: ILLUMINACLIP (LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15), el parámetro MINLEN se estableció en 50.

Mapeo y cuantificación: El mapeo de lecturas al genoma de referencia (GRCh38) se realizó en lecturas recortadas y con control de calidad utilizando STAR 2.4.1c: [STAR-genomeDir <index_star> --runThreadN <cpu_number> -read-FilesIn <trimmed>_R1.fastq.gz <trimmed>_R2_P.fastq.gz --readFilesCommand zcat]. La anotación de referencia es Ensembl v80. La superposición de lecturas con características de anotación encontradas en el.gtf de referencia se calculó utilizando HT-seq v0.6.1. La salida calculada para cada muestra (recuentos de lectura sin procesar) luego se utilizó como entrada para el análisis DESeq2. Los recuentos sin procesar se normalizaron utilizando la función ‘rlog’ de DESeq2, y los recuentos normalizados se utilizaron para realizar y visualizar los resultados del análisis de componentes principales (PCA) (utilizando la función ‘plotPCA’ de DESeq2).

Análisis de expresión diferencial: Se realizaron análisis de expresión diferencial de los subconjuntos Treg CD4+/Th1/Th17 que infiltran el tumor frente a Treg CD4+/Th1/Th17 de PBMC utilizando DESeq2. Los genes regulados al alza/regulados a la baja se seleccionaron para análisis posteriores si se encontraba que sus valores de expresión excedían el umbral de 0.05 FDR (corrección de Benjamin-Hochberg).

Captura de células individuales, preparación de ADNc y PCR de células individuales

Las células Treg de 5 muestras de CRC y 5 de NSCLC se aislaron como se describió anteriormente (Véase también la Tabla II). Se capturaron células individuales en un chip de microfluidos en el sistema C1 (Fluidigm) y se amplificó el transcriptoma completo. El ADNc se preparó en el chip utilizando el kit ARN Ultra Bajo (Clontech). Las células se cargaron en el chip a una concentración de 3-5E5 células/ml, se tiñeron para viabilidad (ensayo de viabilidad de células VIVAS/^m U^e RTAS; Thermo Fisher) y se tomaron imágenes mediante microscopía de fluorescencia y contraste de fase para evaluar el número y la viabilidad de las células por sitio de captura. Solo se incluyeron células vivas individuales en el análisis. Para los experimentos de qPCR, el ADNc recolectado se preamplificó utilizando un agrupamiento de cebadores 0.2X preparados a partir de los mismos ensayos de expresión génica que se utilizarán para qPCR. La preamplificación permite la amplificación múltiplex específica de secuencias de 78 dianas. En detalle, se preamplificó una alícuota de 1.25 j l de ADNc de célula individual en un volumen final de 5 j l utilizando 1 j l de Mezcla Maestra PreAmp (Fluidigm) y 1.25 j l de mezcla de ensayo TaqMan agrupada (0.2x). El ADNc pasó a través de amplificación mediante desnaturalización a 95 °C durante 15 s, hibridación y amplificación a 60 °C durante 4 min durante 20 ciclos. Después del ciclo, el ADNc preamplificado se diluyó 1:5 al agregar 20 j l de tampón TE al volumen de reacción de 5 j l final para un volumen total de 25 |jl.

Los experimentos de expresión génica de célula individual se realizaron utilizando los chips microfluídicos DynamicArray de PCR cuantitativa (qPCR) 96x96 (Fluidigm). Se mezcló una alícuota de 2.25 j l de ADNc amplificado con 2.5 j l de Mezcla Maestra TaqMan Fast Adavanced (Thermo Fisher) y 0.25 j l del "agente de carga de muestra” de Fluidigm, luego se insertó en una de las entradas de "muestra” del chip. Se mezcló una alícuota de 2.5 j l de cada ensayo 20X TaqMan con 2.5 j l del "agente de carga de ensayo” de Fluidigm y se insertó individualmente en una de las entradas del "ensayo” del chip. Las muestras y las sondas se cargaron en chips 96 x96 utilizando un Controlador IFC HX (Fluidigm), luego se transfirieron a un lector de PCR en tiempo real BioMark (Fluidigm) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación se proporciona una lista de los 78 ensayos TaqMan utilizados en este estudio.

Tabla V Relacionada con la Figura 3.

Lista de sondas TaqMan y número de ensayo utilizados en experimentos de célula individual de RT-qPCR

Análisis de datos de célula individual: El Umbral de Calidad en el software de Análisis BioMark™ es una herramienta cualitativa diseñada para medir la “calidad” de cada curva de amplificación. Básicamente, cada curva de amplificación se compara con una curva exponencial ideal y, a medida que el puntaje de calidad se acerca a 1, más se acerca al ideal. Cuanto más se aleja la curva del ideal, su puntaje de calidad se aproxima a 0. El límite predeterminado de 0.65 es un valor arbitrario establecido por Fluidigm. Cualquier curva por encima de 0.65 pasa. Cualquier curva por debajo, falla. La corrección del valor inicial se estableció en Lineal (Derivada) [predeterminado]. El Método de Umbral Ct se configuró en Auto (Detectores). Este método calcula de forma independiente un umbral para cada detector en un chip. Para el análisis de agrupamiento y de dirección descendente, los Ct sin procesar se han convertido a Log2Exp utilizando un Límite de Detección (LOD) de 35, que corresponde al último ciclo de PCR. El análisis de coexpresión se ha realizado al considerar muestras de CRC y NSCLC en aquellos genes para los que tanto FOXP3 como IL2RA se coexpresaron al menos en un 2 %. Los niveles de Gene por encima del fondo se representaron como gráficos de violín después de la transformación a escala log2 por ggplot2 (v. 2.1.10). El gradiente de color del violín es el porcentaje de células que expresan el gen de interés y el límite superior de la escala de colores es el porcentaje máximo de células que expresan un gen de todo el conjunto de genes.

Procedimiento para la eliminación de transcripciones cuyos valores de expresión se ven afectados por el efecto 'abandono'. Los datos de qPCR de célula individual son inherentemente ruidosos y, debido a las limitaciones de las tecnologías actuales, los patrones de expresión de una cierta cantidad de genes se pueden ver afectados por el “efecto de abandono”. Los inventores realizaron un procedimiento de selección de genes para tener en cuenta este efecto de 'abandono' y descartar aquellos genes cuyos valores de expresión no se pueden utilizar de forma fiable en una comparación binaria (periférica del tumor frente a sangre). Los inventores ajustaron una serie de distribuciones paramétricas a las relaciones de genes detectados en el número total de células tumorales (tanto NSCLC como CRC) y seleccionaron la variable aleatoria continua Gaussiana inversa recíproca como la que mejor se ajustaba.

Luego, los inventores calcularon el valor de la mediana de la distribución ajustada y descartaron aquellos genes cuya relación de detección es menor que este valor umbral (al menos 8.4% de detección). Los inventores razonaron que es más probable que estos genes se vean afectados por el efecto de “abandono”. Con este umbral, los inventores seleccionaron 45 genes para los que se realizó una prueba T no paramétrica (prueba de Wilcoxon Mann Whitney p<0.05) (al comparar muestras de tumor frente a muestras de sangre periférica).

Meta análisis Kaplan-Meier y correlación de estadios

El análisis estadístico se realizó al utilizar el paquete de supervivencia R (Therneau T.2013). Los tiempos de supervivencia se calcularon como el número de días desde el diagnóstico patológico inicial hasta la muerte, o el número de días desde el diagnóstico patológico inicial hasta la última vez que se informó que el paciente estaba vivo. El Kaplan-Meier (KM) se utilizó para comparar los niveles de expresión altos y bajos de las transcripciones distintivas de células Treg tumorales en pacientes con CRC (GSE17536) y NSCLC (GSE41271). Para ambos estudios, la anotación se normalizó a cuatro estadios tumorales (1, 2, 3, 4). Para el estudio GSE41271 se excluyeron cinco pacientes debido a una anotación incompleta o imprecisa (GSM1012883, GSM1012884, GSM1012885, GSM1013100, GSM1012888), conservando un total de doscientos sesenta y tres pacientes. Los pacientes de ambos estudios fueron etiquetados como 'Alto' 'Bajo' independientemente de que sus valores de expresión relativa excedieran o no un límite de decisión (media de las muestras). Los inventores definen

para denotar la expresión relativa del gen i Para las n muestras del estudio normalizadas al nivel de CD3:

í g —----------; I = (CCRS, MAGEH1, LAYN) ^J = 1,2,..... n muestras ‘ x CD3C.j

Para clasificar a un paciente, un umbral en el X H _y se requiere y se define como

donde T(Superior inferior) representan el extremo superior e inferior del límite de decisión:

Los inventores examinaron la importancia pronóstica de las transcripciones de células Treg tumorales al utilizar estadísticas de rango logarítmico; un valor de p de menos de 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Dado que la prueba de rango logarítmico resultó en un valor de p menor de 0.05, se realizó una comparación posterior el estadio mediante representación de diagrama de caja para evaluar el grado de correlación entre el nivel de expresión de las transcripciones y los estadios del tumor en la cohorte de pacientes con CRC. La anotación se normalizó a cuatro estadios tumorales (1,2,3,4).

Números de accesión

Los números de acceso para los presentes datos son los siguientes: ES: PRJEB11844 para linfocitos que infiltran tejido y tumor ARN-seq; ArrayExpress: E-MTAB-2319 para conjuntos de datos de linfocitos humanos ARN-seq; ArrayExpress: E-MTAB-513 para el proyecto Illumina Human BodyMap 2.0; GEO: GSE50760 para conjuntos de datos ARN-seq CRC; GEO: GSE40419 para conjuntos de datos de ARN-seq NSCLC; GEO: GSE17536 para perfiles de expresión ^c R^c por matriz; y GEO: GSE41271 para perfiles de expresión de NSCLC por matriz.

Predicción de proteínas expuestas a superficie y asociadas a la membrana

La probabilidad de exposición superficial de las proteínas codificadas por los genes de interés se determinó mediante una combinación de cuatro algoritmos de predicción de localización celular diferentes: Yloc (Briesemeister et al, 2010), TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/) y Phobius (Kall et. al,. 2007). En particular Yloc es un sistema interpretable que ofrece múltiples modelos predictivos en versión animal; los inventores utilizaron YLoc-LowRes para predecir en 4 ubicaciones (núcleo, citoplasma, mitocondria, vía secretora) y Yloc-HighRes para predecir en 9 ubicaciones (espacio extracelular, membrana plasmática, núcleo, citoplasma, mitocondria, retículo endoplásmico, peroxisoma, aparato de Golgi y lisosoma).

Se desarrollaron TMHMM y SignalP por la unidad de bioinformática de la Universidad técnica de Dinamarca para la predicción de hélices transmembrana y la presencia y ubicación de sitios de escisión de péptido señal en secuencias de aminoácidos, respectivamente. Phobius es una topología transmembrana combinada y un predictor de péptido señal.

Análisis de RT-PCR de isoformas de transcripción expresadas por células T reguladoras que infiltran tumores (células Treg)

El ARN total se extrajo de las células Treg tumorales (NSCLC o CRC) utilizando el kit de aislamiento de ARN miRCURY (Exiqon) y 1 |jg se transcribió inversamente con la supermezcla de transcripción inversa iScript (BIORAD). Posteriormente, se amplificaron 25 ng de ADNc con Mezcla Maestra DreamTaq Green PCR (ThermoScientific) utilizando múltiples cebadores específicos de genes capaces de discriminar las diferentes isoformas. Los productos de PCR se realizaron sobre gel de agarosa. La expresión de transcripciones específicos se evaluó en función del tamaño de banda esperado.

Resultados

Las células Treg que infiltran tumores regulan al alza los puntos de control inmunitarios y son altamente supresoras

Evaluar el panorama de la expresión génica de las células T CD4+ que infiltran tumores, los inventores aislaron diferentes subconjuntos de linfocitos CD4+ de dos tumores diferentes, NSCL^c y CRC, de los tejidos normales adyacentes y de muestras de sangre periférica. De todos estos tejidos, los inventores purificaron mediante citometría de flujo (Fig. 1A y 6A y 6B) células Treg CD4+ (36 muestras de 18 individuos), Th1 (30 muestras de 21 individuos) y Th17 (22 muestras de 14 individuos) (Tabla I y Tabla II).

Tabla 1. Purificación y secuenciación de ARN de subconjuntos de linfocitos primarios humanos Fenotipo de Número de lecturas

Tejido Subconjunto Clasificación Muestras Mapeadas M NSCLC Treg CD4* C O T C D 127 8 587

CD25*

^{T h l CD4*} C O T CXCR3* 8 409

C CR6

Th l7 CD4' CD4* CCR6* 6 206

CXCR3

CRC Treg CD4* C O T C D 127 7 488

CD25*

T h l CD4* C O T CXCR3* 5 266

C CR6

T h l7 CD4* CD4* C C R 6f 5 308

CXCR3

Pulmón Treg CD4* C O T C D 127 1 (agolpa­ 73

(tejido CD25* miento de 6)

normal)

T h l CD4* C O T CXCR3* 1 (agolpa­ 76

C CR6 miento de 6)

Colon Treg CD4* C O T C D 127 7 404

(tejido C D 25+

normal)

_{T h l CD4*} C O T CXCR3* 6 352

CCR6

_{T h l7 CD4*} C O T C C R 6+ 6 284

CXCR3

PB(donante _{Treg CD4*} c o r C D 127 - 8 259

sano) CD25*

T h l CD4' C O T CXCR3* 5 70

CCR6

_{T h l7 CD4*} CD4* CCR6* 5 77

CXCR3

Para cada uno de los subconjuntos de células perfilados por tejido con secuenciación de ARN de origen, se indicaron las combinaciones de marcador de superficie, número de muestras perfiladas, así como los números de las lecturas de secuenciación mapeadas. M, millón; CRC: cáncer

colorrectal; NSCLC: cáncer de pulmón de células no microcíticas; PB, sangre periférica.

Tabla II relacionada con Tabla I. Información de los pacientes y análisis histológico.

Para cada subconjunto de células perfilado mediante secuenciación de ARN, se muestran registros de pacientes que incluyen: edad en el momento del diagnóstico, género, hábito de fumar (para pacientes con cáncer de pulmón), estadificación clinicopatológica (clasificación TNM), histotipo y grado del tumor.

Para las células Treg aisladas para el experimento de qPCR, la misma información está disponible, que también incluyen el número de células vivas capturadas de cada tumor y disponibles para el análisis de célula individual.

CRC: cáncer colorrectal; NSCLC: cáncer de pulmón de células no microcíticas; (T): muestra tumoral; (H): tejido sano; CDA: adenocarcinoma; SCC: carcinoma de células epidermoides; ADC MUC: Adenocarcinoma mucinoso.

Para evaluar la función de las células Treg, los inventores probaron su actividad supresora y mostraron que las células Treg que infiltran cualquier tipo de tejido tumoral tienen una actividad supresora in vitro notablemente más fuerte en comparación con las células Treg aisladas del tejido normal adyacente y la sangre periférica de los mismos pacientes (Figura 1B).

La fracción de ARN poliadenilado extraída de las células Treg CD4+, Th1 y Th17 clasificadas luego se analizó mediante secuenciación de ARN de extremo emparejado obteniendo aproximadamente 4 mil millones de “lecturas” mapeadas (Tabla I). En primer lugar, los inventores interrogaron los datos de secuenciación de ARN de las células T CD4+ que infiltraban tanto CRC como n NSCLC y sus tejidos normales correspondientes, para cuantificar la expresión de ARNm de puntos de control inmunitarios conocidos y sus ligandos. En segundo lugar, los inventores analizaron los datos de ARN-seq de CRC y NSCLC, así como de muestras de pulmón y colon normales. Los inventores encontraron que varios puntos de control inmunitarios y sus transcripciones de ligandos estaban notablemente regulados al alza en las células Treg que infiltran tumores en comparación con las células Treg derivadas de tejido normal y de sangre periférica, así como con los subconjuntos de linfocitos T y B purificados a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) (Figuras 1C y 6C y Tabla III).

Tabla III relacionada con la Figura 1. Niveles de expresión de genes de puntos de control inmunitarios en todos los subconjuntos analizados.

_______

Datos de recuentos normalizados de ARN-seq para genes de puntos de control inmunitarios seleccionados y sus ligandos en todos los subconjuntos analizados.

Estos hallazgos resaltan los patrones de expresión específicos de los puntos de control inmunitarios y sus ligandos en las células efectoras y Treg que infiltran tumores y sugieren que su relevancia funcional se debe investigar directamente en los sitios del tumor.

Las células Treg que infiltran tumores expresan un distintivo genético específico

Los inventores luego preguntaron si las células Treg que infiltran tumores se podrían definir mediante patrones de expresión génica específicos.

Para identificar las transcripciones distintivas de las células Treg que infiltran tumores, los inventores incluyeron en el patrón de expresión analizan el conjunto de datos del transcriptoma que obtuvieron previamente de diferentes subconjuntos de linfocitos T y B purificados de PBMC (Ranzani et al., 2015). Al hacerlo, los inventores obtuvieron un distintivo de 328 transcripciones cuya expresión es mayor en las células Treg que infiltran tumores (prueba de Wilcoxon Mann Whitney p<2.2x10-16) (Figura 2 y Tabla IV en comparación con los otros subconjuntos de linfocitos purificados de tejidos no tumorales y de PBMC de pacientes sanos o neoplásicos.

Tabla IV relacionada con la Figura 2. Niveles de expresión de distintivos de genes Treg que infiltran tumores en todos los subconjuntos analizados.

En conjunto, los datos muestran que las células Treg visualizan las diferencias más pronunciadas en la expresión de transcripciones entre subconjuntos de células T CD4+ que infiltran tejidos normales y tumorales. Los inventores definieron un subconjunto de genes distintivos que describen el perfil de expresión génica específica de las células Treg que infiltran tumores.

El distintivo genético de las células Treg que infiltran tumores está presente en tumores humanos primarios y metastásicos A continuación, los inventores buscaron a nivel de células individuales, el perfil de expresión diferencial de los genes distintivos de las células Treg que infiltran tumores. Los inventores aislaron células T CD4+ de 5 muestras de tumores CRC y 5 NSCLC, así como de 5 PBMC de individuos sanos (Tabla II), células Treg purificadas y utilizando un sistema de microfluidos automatizado (C1 Fluidigm) capturaron células individuales (un total de 858 células Treg: 320 de CRC y 286 de NSCLC; 252 de PBMC de individuos sanos). Luego, los inventores evaluaron mediante RT-qPCR de alto rendimiento (Biomark HD, Fluidigm) la expresión de 79 genes seleccionados entre los genes distintivos de células Treg tumorales altamente expresados (>10 FKPM) (Figura 3A, 3C y 7).

En concreto, se encontró que la gran mayoría (75 sobre 79; 95%) de los distintivos de células Treg que infiltran tumores se coexpresaron con marcadores de células Treg de buena fe (es decir, FOXP3+ y IL2RA) (Figura 3B). El porcentaje de coexpresión entre estos marcadores de células Treg y los 79 genes seleccionados entre los genes distintivos de células Treg que infiltran tumores varió entre el 81% de TIGITy 0.59% de CGA (Figura 3B). La expresión de los genes distintivos de Treg en el ARN-seq de la población de células Treg completa se correlacionó con el porcentaje de células individuales que expresan los diferentes genes (Figura 3C). Para reducir el efecto de “abandono” de los datos de una célula individual (es decir, eventos en los que se detecta una transcripción en una célula pero no en otra porque la transcripción se “pierde” durante la etapa de transcripción inversa) (Kharchenko et al., 2014), un umbral (valor de mediana t=8.4%) se definió en base a la distribución de la expresión de cada transcripción y los genes descartados por debajo de este umbral. Las cuarenta y cinco transcripciones distintivas de las células Treg que infiltran tumores detectadas por encima de este umbral se sobreexpresaron en la mayoría de los casos significativamente en las células Treg de ambos tumores (39 sobre 45, 87%; prueba de Wilcoxon Mann Whitney p<0,05) o en un tipo de tumor (43 sobre 45, 96%; Figura 3D). La homogeneidad del tejido purificado que infiltra las células Treg puede verse afectada por el arrastre de células de otros subconjuntos de linfocitos. Para cuantificar esta posible contaminación, se realizaron análisis de RT-qPCR de células individuales de células Treg que incluyeron marcadores específicos para otros subconjuntos de linfocitos (es decir, células T Th1, Th2, Th17, Tfh, c D8, células B) (Figura 7). Nuestros datos mostraron que solo una fracción muy pequeña de las células individuales purificadas mostraba marcadores de subconjuntos de linfocitos diferentes de las células Treg (Figura 7).

La superposición entre los genes distintivos en el CRC y el NSCLC que infiltran las células Treg (Figura 2) nos llevó a evaluar si este distintivo también se enriqueció en las células Treg que infiltran otros tumores. Por lo tanto, se extrajo el ARN de las células Treg que infiltran cáncer de mama, cáncer gástrico, metástasis cerebral de NSCLC y metástasis hepática de CRC. Se encontró por RT-qPCR que los genes distintivos de Treg que infiltran tumores también estaban mayormente regulados al alza en estos tumores (Figura 3E).

En general, estos datos muestran que los genes distintivos de las células Treg que infiltran el tumor se expresan conjuntamente a nivel de célula individual con FOXP3 e IL2RA y que varios tumores humanos primarios y metastásicos expresan el distintivo de células Treg que infiltran tumores.

El distintivo genético de las células Treg que infiltran tumores se traduce en un distintivo de proteína

A continuación, los inventores evaluaron a nivel de células individuales mediante citometría de flujo la expresión de proteínas de diez genes distintivos representativos presentes en células Treg que infiltran CRC y NSCLC, tejidos normales adyacentes y PBMC de pacientes. De las diez proteínas, dos son proteínas (OX40 y TIGIT) cuya relevancia para la biología de las células Treg se ha demostrado (Joller et al., 2014; Voo et al., 2013), siete son proteínas (BATF, CCR8, CD30, IL -1 R2, IL-21 R, PDL-1 y PDL-2) cuya expresión nunca ha sido descrita en células Treg que infiltran tumores, y una proteína, 4-1BB, es un receptor coestimulador expresado en varias células hematopoyéticas, cuya expresión sobre las células Treg se ha demostrado para marcar las células activadas por antígeno (Schoenbrunn et al., 2012). Nuestros hallazgos mostraron que todas estas proteínas estaban reguladas al alza (Fig. 4A y 4B), en diferente medida, en células Treg que infiltran tumores en comparación con las células Treg residentes en tejidos normales.

En conjunto, nuestros datos muestran que existe un distintivo molecular de células Treg que infiltran tumores, que se puede detectar tanto en el ARNm como en los niveles de proteína.

La expresión de los genes distintivos de Treg de tumor se correlaciona negativamente con la supervivencia de los pacientes

En un intento de correlacionar nuestros hallazgos con el resultado clínico, los inventores preguntaron si la expresión de las transcripciones distintivas de Treg de tumor se correlacionaba con el pronóstico de la enfermedad en pacientes con CRC y NSCLC. Por lo tanto, los inventores interrogaron sobre la expresión de los conjuntos de datos transcriptómicos de genes distintivos de Treg obtenidos de tejidos tumorales extirpados de una cohorte de 177 pacientes con CRC (GSE17536 (Smith et al., 2010) y de una cohorte de 263 pacientes con NSCLC (GSE41271 -(Sato et al., 2013), y correlacionó los niveles de expresión génica altos y bajos con los datos de supervivencia a 5 años. Entre aquellos genes cuya expresión está altamente enriquecida en células Treg que infiltran tumores, se seleccionaron LAYN, MAGEH1 y CCR8 ya que son los tres genes expresados más selectivamente (Figura 9A-C). Para normalizar las diferencias en las densidades de células T dentro de los tejidos tumorales resecados, los inventores utilizaron la relación entre la expresión de los genes distintivos seleccionados y CD3G. En concreto, se encontró que la alta expresión de los tres genes distintivos se correlaciona en todos los casos con una supervivencia significativamente reducida (Figura 5A). Curiosamente, también se observó que las expresiones de los tres genes distintivos aumentaron con la estadificación tumoral de pacientes con CRC (Figura 5B).

En conclusión, la alta expresión en las muestras de tumor completo de tres genes (LAYN, MAGEH1 y CCR8) que se expresan específica y altamente en las células Treg que infiltran tumores, se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con NSCLC y CRC.

Selección de dianas potenciales específicamente sobreexpresadas sobre la superficie de Treg que infiltran tumores

Todas las isoformas de proteínas anotadas codificadas por los 328 genes y recuperables en la base de datos pública EnsEMBL (http://www.ensembl.org) se analizaron simultáneamente con los cuatro algoritmos de predicción y los genes que codifican al menos una isoterma predicha para estar expuesta en la superficie se consideraron como dianas potenciales.

De 328 genes, 193 codifican al menos una posible isoterma de proteína de la superficie celular sobre la base de al menos uno de los cuatro predictores. La lista de isotermas de proteínas que se prevé que están asociadas a la membrana se presenta en la Tabla VI.

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Los genes de la tabla VI se caracterizan por su número de acceso Ensembl Gene (ENSG), recuperable en la base de datos pública EnsEMBL (http://www.ensembl.org). Cada isoforma de proteína relacionada se caracteriza por un número de acceso de transcripción Ensembl (ENST) y un número de acceso de proteína Ensembl (ENSP).

Identificación de isoformas de transcripción expresadas por células Treg tumorales

Un aspecto importante a verificar en la selección de dianas potenciales de Treg tumoral es que las isoformas de proteína predichas para estar expuestas a la superficie/asociadas a la membrana por los algoritmos de localización celular se expresan de hecho en las células Treg tumorales. Por lo tanto, el ARN total se extrajo de células Treg tumorales aisladas de muestras de NSCLC o CRC y se sometió a RT-PCR utilizando pares de cebadores específicos capaces de discriminar las diferentes isoformas anotadas para cada gen. Los resultados de ejemplo de las isoformas de proteína que se predijo que estarían expuestas en la superficie y detectadas en las células Treg tumorales se informan en la Tabla VII. Más aún, en la Figura 10 se muestra un ejemplo de análisis de RT-PCR llevado a cabo para SIRPG.

Tabla VII. Ejemplos representativos de transcripciones detectadas en células Treg que infiltran tumores

Discusión

La diversidad de las células Treg que infiltran tumores se debe dilucidar por completo para comprender su relevancia funcional y su importancia pronóstica en diferentes tipos de cáncer, y para mejorar posiblemente la eficacia terapéutica de la modulación de las células Treg a través del agotamiento selectivo de las células Treg que infiltran tumores. El análisis del transcriptoma realizado sobre células T que infiltran CRC y NSCLC mostró que las células Treg que infiltran tumores son diferentes tanto de las circulantes como de las que infiltran tejidos normales, lo que sugiere que el microambiente tumoral influye en la expresión génica específica en las células Treg. Nuestros hallazgos respaldan aún más la opinión de que los factores ambientales instruyen a las células Treg de diferentes tejidos para que exhiban diferentes perfiles de expresión génica (Panduro et al., 2016). De hecho, la lista de genes distintivos incluye una serie de moléculas que se regulan al alza de manera constante en células Treg que infiltran tumores aisladas de diferentes tipos de tumores, y estos genes distintivos no se habrían identificado si los inventores no hubieran perfilado específicamente las células Treg que infiltran tumores. Se encontró que los genes distintivos de Treg que infiltran tumores no solo se comparten en gran medida entre las células infiltrantes de CRC y NSCLC, sino que también se conservan en los cánceres de mama y gástrico, así como en los tumores metastásicos de CRC y NSCLC (en el hígado y el cerebro respectivamente), lo que sugiere que la expresión de estos genes es una característica común de las células Treg que infiltran tumores que se puede correlacionar con la función específica de las células Treg dentro del microambiente tumoral. Aunque nuestro conocimiento sobre la función de los puntos de control inmunitarios en los linfocitos aún es incompleto, los anticuerpos monoclonales agonistas o antagonistas que se dirigen a los puntos de control están en desarrollo clínico. Curiosamente, se ha encontrado que algunos de estos puntos de control (tales como GITR, OX40, TIGIT, LAG-3 y TIM-3) y algunos de sus ligandos (tales como OX40LG, Galectina-9, CD70) también se regulan al alza en las células Treg que infiltran tumores, y este hecho se debe tener en cuenta al interpretar los resultados clínicos con inhibidores de puntos de control. De hecho, es probable que la evaluación de la expresión de los puntos de control y de sus ligandos sobre los diversos subconjuntos de linfocitos que infiltran tumores ayude a dilucidar los resultados contradictorios y proporcione la justificación para las terapias combinadas. Por lo tanto, el patrón de expresión de los puntos de control se debe evaluar tanto en los linfocitos que infiltran tumores como en las células tumorales. El análisis de célula individual en genes distintivos de Treg tumorales seleccionados confirmó todos los datos transcriptómicos y proporcionó información sobre la frecuencia de expresión de estos genes. Las células Treg que infiltran tumores expresan con alta frecuencia genes que están asociados con una mayor actividad supresora, tales como los bien caracterizados OX40, CTLA4 y GITR. Más aún, hay una serie de genes interesantes y menos esperados cuya expresión específica también se validó a nivel de proteína. Por ejemplo, la regulación positiva de IL-1R2 podría ser otro mecanismo que emplean las células Treg residentes del tumor para amortiguar las respuestas inmunitarias antitumorales a través de la neutralización de la función de IL-1p en las células efectoras. Recientemente se informó la expresión de PD-L1 y PD-L2 sobre células T activadas o APC (Boussiotis et al., 2014; Lesterhuis et al., 2011; Messal et al., 2011) pero, a nuestro leal saber y entender, ni La expresión de PD-L2 o PD-L1 nunca se ha informado en las células Treg, y nuestro hallazgo de que se sobreexpresan en las células Treg que infiltran tumores agrega un nivel adicional de complejidad al eje inmunomodulador PD1/PD-Ls dentro del microambiente tumoral. BATF es un factor de transcripción que se ha asociado principalmente al desarrollo de Th17 y diferenciación de células T CD8+ (Murphy et al., 2013). Nuestros hallazgos muestran que la transcripción BATF está regulada al alza en las células Treg que infiltran tumores más que en las células Th17 que infiltran tumores (Figura 8). Curiosamente, la expresión de BATF en las células T CD8+ son inducidas por IL-21 (Xin et al., 2015), y se encontró que IL21R se expresa altamente en las células Treg que infiltran tumores (Figura 4).

Se mostró que las células Treg que infiltran tumores expresan grandes cantidades de 4-1 BB (CD137), un marcador de activación mediada por TcR (Schoenbrunn et al., 2012) y han mostrado que exhiben una función supresora muy alta en la proliferación de células T efectoras. Podría ser que la expresión de los genes distintivos se correlacionara con la capacidad supresora mejorada y, por lo tanto, contribuyera al establecimiento de un entorno inmunosupresor fuerte en los sitios tumorales. Un corolario de nuestros hallazgos sería que un mayor número de células Treg en el entorno del tumor debería asociarse con un peor resultado clínico. De hecho, cuando LAYN, MAGEH1 y CCR8(que representan tres de los genes más enriquecidos en las células Treg que infiltran tumores) se detectan mucho en muestras de tumor completo, hay un empeoramiento significativo de la supervivencia a 5 años de los pacientes con CRC y NSCLC. Aunque se desconocen los roles funcionales en las células Treg de LAYN, una proteína de transmembrana con homología con la lectina de tipo c (Borowsky and Hynes, 1998), y de MAGEH1, un miembro de la familia de Melanoma De Gen de Antígenos (Weon and Potts, 2015), la alta expresión del receptor de quimioquinas CCR8 es en cambio intrigante. De hecho, CCL18, el ligando de CCR8 (Islam et al., 2013), se expresa mucho en diferentes tumores, que incluyen el NSCLC (Chen et al., 2011; Schutyser et al., 2005). La alta especificidad de la expresión de CCR8 en las células Treg que infiltran tumores sugiere que podría ser una nueva diana terapéutica interesante para inhibir el tráfico de células Treg a los sitios del tumor, sin alterar el reclutamiento de otras células T efectoras que no expresan CCR8. Recientemente se han realizado esfuerzos considerables en el desarrollo de enfoques bioinformáticos sofisticados que explotan los datos de expresión génica de los linfocitos para comprender las redes inmunomoduladoras en los sitios del tumor, para predecir las respuestas clínicas a las inmunoterapias y para definir nuevas dianas terapéuticas (Bindea et al., 2013a; Bindea et al., 2013b; Gentles et al., 2015). Los datos en el presente documento presentados representan el primer análisis de secuenciación de ARN completo realizado sobre células Treg CD4+, Th1 y Th17 humanas que infiltran tumores. Nuestros hallazgos resaltan la relevancia de evaluar los patrones de expresión génica de los linfocitos en los sitios del tumor y sugieren que la generación de más datos transcriptómicos de subconjuntos de linfocitos que infiltran tumores purificados de diferentes tipos de cáncer puede contribuir a una mejor comprensión de la dinámica subyacente a la modulación inmunitaria en el microambiente tumoral. Más aún, nuestros datos representan un recurso para generar y validar nuevas hipótesis que aumentarán nuestro conocimiento sobre la biología de las células Treg que infiltran tumores y deberían conducir a la identificación de nuevas dianas terapéuticas.

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Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para determinar el pronóstico de un sujeto que tiene un tumor sólido seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de pulmón de células no microcíticas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer gástrico o una metástasis derivada de los mismos, dicho método comprende las etapas de:

a) obtener una muestra biológica aislada que contiene células Treg que infiltran tumores del sujeto;

b) detectar LAYN en dicha muestra;

c) comparar el LAYN detectado con un control seleccionado de

i) un estándar conocido de un sujeto normal o de una población normal, o

ii) de células T diferentes de células T reguladoras que infiltran tumores o células T reguladoras; y

d) en base a la comparación que determina un pronóstico, un LAYN superior en la muestra de sujetos indica un peor pronóstico.

2. Un método para identificar una molécula que actúa como una molécula antitumoral contra un tumor sólido seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de pulmón de células no microcíticas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer gástrico o una metástasis derivada de los mismos, dicho método comprende las etapas de:

a) ensayar moléculas candidatas para determinar su especificidad de unión a LAYN;

b) seleccionar moléculas que tienen una actividad de unión específica a LAYN y que sean capaces de modular la expresión y/o función de LAYN; y

c) probar dichas moléculas de unión específicas en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación y/o inducir una respuesta apoptótica en un sistema celular que contiene células T reguladoras que infiltran tumores, preferiblemente agotándolas selectivamente.

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, en el que la etapa c) comprende la prueba para agotar selectivamente las células T reguladoras que infiltran tumores al inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).

4. Un método como se reivindica en la reivindicación 2 o 3, en el que la molécula es un anticuerpo.

5. Un método in vitro para monitorizar la eficacia de un tratamiento terapéutico de un tumor sólido seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de pulmón de células no microcíticas, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer gástrico o una metástasis derivada de los mismos, en un sujeto, dicho método que comprende las etapas de:

a) obtener una muestra biológica aislada que contiene células Treg que infiltran tumores del sujeto;

b) detectar LAYN en dicha muestra;

c) comparar el LAYN detectado con un control seleccionado del mismo sujeto antes del inicio de la terapia o con una muestra tomada en varios momentos durante el curso de la terapia, en el que una menor cantidad de LAYN puede indicar un tratamiento eficaz del tumor.