BR112018073414A2 - molécula, composição farmacêutica, e, métodos in vitro para prognosticar e/ou diagnosticar e/ou avaliar o risco de desenvolver e/ou para monitorar a progressão e/ou para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico e/ou para a triagem de um tratamento terapêutico de um tumor, para tratar e/ou prevenir tumor e para identificar uma molécula. - Google Patents

molécula, composição farmacêutica, e, métodos in vitro para prognosticar e/ou diagnosticar e/ou avaliar o risco de desenvolver e/ou para monitorar a progressão e/ou para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico e/ou para a triagem de um tratamento terapêutico de um tumor, para tratar e/ou prevenir tumor e para identificar uma molécula. Download PDF

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Abstract

a presente invenção se refere a uma molécula capaz de modular a expressão e/ou função de pelo menos um marcador que é seletivamente desregulado na célula t reguladora da infiltração em tumor ou a uma molécula capaz de especificamente ligar a pelo menos um marcador que é seletivamente desregulado na célula t reguladora da infiltração em tumor e induzir a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (adcc) para o uso na prevenção e/ou tratamento de câncer ou para o uso em um método para esgotar célula t reguladora da infiltração em tumor in vivo em um sujeito ou para o uso em um método para realçar a imunidade tumoral em um sujeito e composição farmacêutica relativa.

Description

MOLÉCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS IN VITRO PARA PROGNOSTICAR E/OU DIAGNOSTICAR E/OU AVALIAR O RISCO DE DESENVOLVER E/OU PARA MONITORAR A PROGRESSÃO E/OU PARA MONITORAR A EFICÁCIA DE UM TRATAMENTO TERAPÊUTICO E/OU PARA A TRIAGEM DE UM TRATAMENTO TERAPÊUTICO DE UM TUMOR, PARA TRATAR E/OU PREVENIR TUMOR E PARA IDENTIFICAR UMA MOLÉCULA
Campo da Invenção [001] A presente invenção se refere a uma molécula capaz de modular a expressão e/ou função de pelo menos um marcador que é seletivamente desregulado na célula T reguladora da infiltração em tumor ou a uma molécula capaz de especificamente ligar a pelo menos um marcador que seja seletivamente desregulado na célula T reguladora da infiltração em tumor e induzir citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) para o uso na prevenção e/ou tratamento de câncer ou para o uso em um método para esgotar in vivo célula T reguladora da infiltração em tumor em um sujeito ou para o uso em um método para realçar a imunidade tumoral em um sujeito e composição farmacêutica relativa.
Fundamentos da Invenção [002] A combinação de mutações genéticas e modificações epigenéticas que são peculiares a todos os tumores geram antígenos que os linfócitos T e B podem usar para especificamente reconhecer células tumorais (Jamal-Hanjani et al., 2013). Está crescentemente evidente que os linfócitos T que reconhecem peptídeos derivados de tumor apresentados pelas moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) desempenham um papel central na imunoterapia e em quimio-radioterapia convencional de câncer (Galluzzi et al., 2015). De fato, respostas de célula T antitumor surgem em pacientes com câncer mas são neutralizadas na progressão de tumor pelos mecanismos supressivos deflagrados pela interação entre células malignas e o
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2/113 microambiente tumoral (Munn e Bronte, 2015). Os mecanismos imunossupressivos dependentes de tumor dependem da ação integrada de leucócitos e linfócitos infiltrantes que suprarregulam uma faixa de moléculas moduladoras, coletivamente chamadas de pontos de checagem imunes, cuja função é apenas parcialmente caracterizada (Pardoll, 2012). Portanto, a pesquisa quanto a agonistas de complexos ou antagonistas coestimuladores de moléculas inibidores para potenciar respostas de célula T específicas de antígeno é uma meta primária da pesquisa antitumoral corrente (Sharma e Allison, 2015; Zitvogel et al., 2013). De fato, os testes clínicos têm inequivocadamente mostrado que o bloqueio de pontos de checagem imunes desatrelam as respostas imunes antitumor espontâneas em um tal modo poderoso que tem criado um mudança paradigmática na terapia de câncer (Sledzinska et al., 2015; Topalian et al., 2015).
[003] Entre os pontos de checagem imunes alvejados pelas estratégias de bloqueio, CTLA-4 tem sido um dos primeiros a serem traduzidos em aplicações terapêuticas.
[004] Os anticorpos monoclonais (mAb) anti-CTLA-4 mostraram sucesso notável em melanoma metastático, e mais recentemente em câncer pulmonar de célula não pequena, câncer prostático, carcinoma de célula renal, carcinoma urotelial e câncer ovariano (Carthon et al., 2010; Hodi et al., 2010; van den Eertwegh et al., 2012; Yang et al., 2007). Entretanto, a fração de pacientes que não respondem permanece alta, sugerindo uma investigação mais profunda dos mecanismos que servem de base para a modulação de respostas imunes pelos tumores. Evidência experimental recente mostrou que a eficácia de mAb anti-CTLA-4 depende da depleção mediada por FcyR de células T reguladoras de CD4+ (células Treg) dentro do microambiente tumoral (Peggs et al., 2009; Selby et al., 2013; Simpson et al., 2013; Twyman-Saint Victor et al., 2015).
[005] As células Treg, que são fisiologicamente engajadas na
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3/113 manutenção de autotolerância imunológica e homeóstase imune (Josefowicz et al., 2012; Sakaguchi et al., 2008), são supressores potentes de células efetoras e são encontradas em altas frequências em vários tipos de cânceres (Fridman et al., 2012; Nishikawa e Sakaguchi, 2010). Interessantemente, as células Treg adaptam o seu programa transcricional para as várias citocinas às quais elas são expostas no meio inflamatório (Campbell e Koch, 2011). esta versatilidade é controlada pelos fatores transcricionais geralmente associadas com a diferenciação de outro subconjuntos de célula T CD4+, resultando em várias populações de célula Treg com trações e funções imunomoduladoras únicas (Duhen et al., 2012; Geginat et al., 2014). Além disso, as células Treg que infiltram tecidos não linfoides são relatadas exibir fenótipos e assinaturas transcricionais únicos, visto que elas podem demonstrar funções além dos seus papéis supressivos bem estabelecidos, tais como a modulação metabólica em tecido adiposo (Cipolletta et al., 2012) ou regulagem de reparo tecidual no músculo esqueletal (Burzyn et al., 2013) e em tecido pulmonar (Arpaia et al., 2015).
[006] A depleção de células Treg foi relatada para aumentar respostas imunes antitumor específicas e reduzir a carga tumoral (Marabelle et al., 2013; Teng et al., 2010; Walter et al., 2012). Embora resultados clínicos promissores tenham sido obtidos com estratégias de depleção de célula Treg, alguns problemas relevantes devem ser tratados, para uma aplicação clínica mais segura, mais eficaz e mais ampla destas terapias. Primeiro, várias autoimunidades podem ocorrer a seguir da depleção sistêmica de células Treg (Nishikawa e Sakaguchi, 2010), o que seria evitado se depleção seletiva de células Treg que infiltram tumor fosse praticável. Um segundo problema diz respeito à especificidade de alvejamento, de fato compartilhar as células Treg com linfócitos efetores com a maioria das moléculas alvejadas para terapia, o que pode possivelmente esgotar também as células efetoras específicas de tumor. Portanto, a caracterização molecular
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4/113 de células Treg em sítios de tumor diferentes deve ajudar a definir melhor alvos terapêuticos através de uma melhor descrição de suas moléculas de assinatura e da rede que regula as funções de célula Treg no microambiente tumoral.
[007] O câncer pulmonar de célula não pequena (NSCLC) e câncer colorretal (CRC) são os dois cânceres mais frequentes em ambos os gêneros (Torre et al., 2015). NSCLC tem o pior disgnóstico devido à sua alta taxa de mortalidade mesmo nos estágios iniciais. Embora a taxa de sobrevivência do CRC seja altamente dependente dos estágios do tumor no diagnóstico, cerca de 50% dos pacientes progredirão para câncer metastático (Gonzalez-Pons e Cruz-Correa, 2015). Ambos os tumores foram alvejados com terapias com base nos anticorpos monoclonais aos inibidores do ponto de checagem, mas os resultados foram diferentes. Embora sucesso clínico notável tenha sido obtido no NSCLC, evidência de resposta durável no CRC é escassa com a exceção das lesões no CRC deficientes em reparo desemparelhadas (Jacobs et al., 2015; Kroemer et al., 2015; Le et al., 2015).
[008] Então existe ainda necessidade quanto a agentes que alvejem células Treg que infiltram tumor para o tratamento e/ou prevenção de câncer. Sumário da Invenção [009] Os linfócitos T reguladores da infiltração em tumor (Treg) podem suprimir as células T efetoras específicas para antígenos de tumor. Visto que novas imunoterapias anticâncer visam as células T efetoras desatreladas pelo alvejamento de pontos de checagem imunes, definições moleculares mais profundas de linfócitos que infiltram tumor ofereceriam novas oportunidades terapêuticas. Os transcriptomas de células T auxiliares l(Thl), Th 17 e células Treg que infiltram cânceres colorretais ou pulmonares de célula não pequena foram comparados com transcriptomas dos mesmos subconjuntos a partir de tecidos normais, e validados ao nível de célula única. Os inventores descobriram que as células Treg que infiltram tumor são
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5/113 altamente supressivas, suprarregulam vários pontos de checagem imunes, e expressam nas moléculas de assinatura específicas de superfície celular tais como receptor 2 da interleucina-1 (IL1R2), morte programada (PD)-l Ligantel, PD-1 Ligante2, e quimiocina CCR8 que não foram anteriormente descritos nas células Treg. Notavelmente, a alta expressão em amostras de tumor inteiras de genes de assinatura Treg, tais como LAYN, MAGEH1 ou CCR8, correlacionaram com prognóstico pobre. A invenção fornece novos discernimentos na identidade molecular e funções de células Treg que infiltram tumor humanas, e definem novos alvos potenciais para a imunoterapia de tumor.
[0010] Na presente invenção, os inventores proveem uma análise de transcriptoma compreensiva de células Treg CD4+ humanas e células efetoras (Thl e Thl7) infiltrando NSCLC ou CRC e seus tecidos normais combinados. [0011] Os inventores definiram assinaturas moleculares de células Treg que infiltram tumor nestes dois tipos de câncer e confirmaram a relevância destas assinaturas pelas análises de célula única. Estes dados ajudariam a um melhor entendimento do papel funcional de Treg nos sítios de tumor e preparam o terreno para a identificação de alvos terapêuticos para modulação mais específica e mais segura de células Treg na terapia de câncer. [0012] As descobertas dos inventores proveem novos discernimentos sobre os mecanismos inibidores das células Treg e oferecem alvos precisos para a imunoterapia contra o câncer.
[0013] Então a presente invenção provê uma molécula capaz de modular a expressão e/ou função de pelo menos um marcador que é seletivamente desregulado na célula T reguladora da infiltração em tumores para o uso na prevenção e/ou tratamento do dito tumor.
[0014] Preferivelmente, a molécula de acordo com a invenção é capaz de especificamente se ligar ao dito pelo menos um marcador e induzir a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
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6/113 [0015] A dita molécula é preferivelmente capaz de esgotar seletivamente célula T reguladora da infiltração em tumores.
[0016] A dita molécula é preferivelmente selecionada do grupo consistindo em:
a) um anticorpo ou um fragmento do mesmo;
b) um polipeptídeo;
c) uma molécula pequena;
d) um polinucleotídeo codificando o dito anticorpo ou polipeptídeo ou um derivado funcional dos mesmos;
e) um polinucleotídeo, tal como construção de antissentido, oligonucleotídeo de antissentido, construção de interferência de RNA ou siRNA,
e) um vetor compreendendo ou expressando o polinucleotídeo como definido em d) ou e);
f) uma célula hospedeira geneticamente engenheirada expressando o dito polipeptídeo ou anticorpo ou compreendendo o polinucleotídeo como definido em d) ou e).
[0017] Preferivelmente, o marcador é selecionado do grupo consistindo em pelo menos um marcador divulgado na seguinte Tabela VIII.
Tabela VII]
NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108 NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108
FUCA2 ENSG00000001036 2519 HADHB ENSG00000138029 3032
ICA1 ENSG00000003147 3382 CEP55 ENSG00000138180 55165
TTC22 ENSG00000006555 55001 ENTPD1 ENSG00000138185 953
COXIO ENSG00000006695 1352 NAB1 ENSG00000138386 4664
IL32 ENSG00000008517 9235 HECW2 ENSG00000138411 57520
ETV7 ENSG00000010030 51513 CD27 ENSG00000139193 939
ATP2C1 ENSG00000017260 27032 CDH24 ENSG00000139880 64403
FAS ENSG00000026103 355 RAB15 ENSG00000139998 376267
ARNTL2 ENSG00000029153 56938 ETFA ENSG00000140374 2108
IKZF2 ENSG00000030419 22807 KSR1 ENSG00000141068 8844
PEX3 ENSG00000034693 8504 PCTP ENSG00000141179 58488
MAT2B ENSG00000038274 27430 SECTM1 ENSG00000141574 6398
TSPAN17 ENSG00000048140 26262 EVA1B ENSG00000142694 55194
COL9A2 ENSG00000049089 1298 WDTC1 ENSG00000142784 23038
TNFRSF9 ENSG00000049249 3604 CTTNBP2NL ENSG00000143079 55917
FOXP3 ENSG00000049768 50943 CASQ1 ENSG00000143318 844
NFE2L3 ENSG00000050344 9603 SNAP47 ENSG00000143740 116841
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NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108
LIMAI ENSG00000050405 51474
TNIP3 ENSG00000050730 79931
LY75 ENSG00000054219 4065
ZNF280C ENSG00000056277 55609
YIPF1 ENSG00000058799 54432
NFYC ENSG00000066136 4802
ISOC1 ENSG00000066583 51015
PHKA1 ENSG00000067177 5255
ACSL4 ENSG00000068366 2182
MAST4 ENSG00000069020 375449
LMCD1 ENSG00000071282 29995
TFRC ENSG00000072274 7037
PANX2 ENSG00000073150 56666
FNDC3B ENSG00000075420 64778
REXO2 ENSG00000076043 25996
TP73 ENSG00000078900 7161
LXN ENSG00000079257 56925
CE AC AM 1 ENSG00000079385 634
IL12RB2 ENSG00000081985 3595
GSK3B ENSG00000082701 2932
TDRD3 ENSG00000083544 81550
RRAGB ENSG00000083750 10325
STARD7 ENSG00000084090 56910
SSH1 ENSG00000084112 54434
NCOA1 ENSG00000084676 8648
MGST2 ENSG00000085871 4258
ACOX3 ENSG00000087008 8310
AURKA ENSG00000087586 6790
TPX2 ENSG00000088325 22974
ANKRD10 ENSG00000088448 55608
FKBP1A ENSG00000088832 2280
SIRPG ENSG00000089012 55423
BIRC5 ENSG00000089685 332
RGS1 ENSG00000090104 5996
DPYSL2 ENSG00000092964 1808
WHRN ENSG00000095397 25861
CENPM ENSG00000100162 79019
SEPT3 ENSG00000100167 55964
NCF4 ENSG00000100365 4689
CSF2RB ENSG00000100368 1439
IL2RB ENSG00000100385 3560
CNIH1 ENSG00000100528 10175
ZMYND8 ENSG00000101040 23613
MAP1LC3A ENSG00000101460 84557
PIGU ENSG00000101464 128869
NXT2 ENSG00000101888 55916
SMS ENSG00000102172 6611
NDFIP2 ENSG00000102471 54602
ACP5 ENSG00000102575 54
NFAT5 ENSG00000102908 10725
CYB5B ENSG00000103018 80777
IL21R ENSG00000103522 50615
LAPTM4B ENSG00000104341 55353
IL7 ENSG00000104432 3574
NCALD ENSG00000104490 83988
ERI1 ENSG00000104626 90459
NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108
STAG ENSG00000144681 6769
ARL6IP5 ENSG00000144746 10550
ADPRH ENSG00000144843 141
PAM ENSG00000145730 5066
RNF145 ENSG00000145860 153830
TTBK1 ENSG00000146216 84630
TMEM140 ENSG00000146859 55281
CHST7 ENSG00000147119 56548
CHRNA6 ENSG00000147434 8973
MKI67 ENSG00000148773 4288
PTPRJ ENSG00000149177 5795
ZC3H12C ENSG00000149289 85463
NCAM1 ENSG00000149294 4684
INPP1 ENSG00000151689 3628
IAKMIP1 ENSG00000152969 152789
GTF3C6 ENSG00000155115 112495
RHOC ENSG00000155366 389
SLC16A1 ENSG00000155380 6566
BATF ENSG00000156127 10538
CXCL13 ENSG00000156234 10563
SH3RF2 ENSG00000156463 153769
NPTN ENSG00000156642 27020
CCNB2 ENSG00000157456 9133
RNF207 ENSG00000158286 388591
AHCYL2 ENSG00000158467 23382
PTGIR ENSG00000160013 5739
CALM3 ENSG00000160014 808
TMPRSS3 ENSG00000160183 64699
FCRL3 ENSG00000160856 115352
PAQR4 ENSG00000162073 124222
ZG16B ENSG00000162078 124220
IAK1 ENSG00000162434 3716
DIRAS3 ENSG00000162595 9077
ACTG2 ENSG00000163017 72
SGPP2 ENSG00000163082 130367
NEURL3 ENSG00000163121 93082
CTLA4 ENSG00000163599 1493
ICOS ENSG00000163600 29851
RYBP ENSG00000163602 23429
KIF15 ENSG00000163808 56992
TMEM184C ENSG00000164168 55751
C5orf63 ENSG00000164241 401207
PTTG1 ENSG00000164611 9232
MELK ENSG00000165304 9833
FAAH2 ENSG00000165591 158584
PRDX3 ENSG00000165672 10935
HPRT1 ENSG00000165704 3251
CACNB2 ENSG00000165995 783
TPP1 ENSG00000166340 1200
AKIP1 ENSG00000166452 56672
ACAA2 ENSG00000167315 10449
GNG8 ENSG00000167414 94235
GNG4 ENSG00000168243 2786
CX3CR1 ENSG00000168329 1524
AHCYL1 ENSG00000168710 10768
TSPAN5 ENSG00000168785 10098
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NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108
EBI3 ENSG00000105246 10148
PLA2G4C ENSG00000105499 8605
CDK6 ENSG00000105810 1021
HOXA1 ENSG00000105991 3198
GLCCI1 ENSG00000106415 113263
MINPP1 ENSG00000107789 9562
ACTA2 ENSG00000107796 59
WSB1 ENSG00000109046 26118
CLNK ENSG00000109684 116449
HTATIP2 ENSG00000109854 10553
CTSC ENSG00000109861 1075
VWA5A ENSG00000110002 4013
DCPS ENSG00000110063 28960
SLC35F2 ENSG00000110660 54733
FOXM1 ENSG00000111206 2305
RAD51AP1 ENSG00000111247 10635
RASAL1 ENSG00000111344 8437
VDR ENSG00000111424 7421
FAM184A ENSG00000111879 79632
DNPH1 ENSG00000112667 10591
KIF20A ENSG00000112984 10112
SEC24A ENSG00000113615 10802
KAT2B ENSG00000114166 8850
PPM1G ENSG00000115241 5496
IL1R2 ENSG00000115590 7850
IL1R1 ENSG00000115594 3554
IL1RL2 ENSG00000115598 8808
IL1RL1 ENSG00000115602 9173
UXS1 ENSG00000115652 80146
SLC25A12 ENSG00000115840 8604
THADA ENSG00000115970 63892
PARK7 ENSG00000116288 11315
LEPR ENSG00000116678 3953
GADD45A ENSG00000116717 1647
KIF14 ENSG00000118193 9928
MREG ENSG00000118242 55686
HSDL2 ENSG00000119471 84263
FLVCR2 ENSG00000119686 55640
CD274 ENSG00000120217 29126
SOCS2 ENSG00000120833 8835
TNFRSF8 ENSG00000120949 943
RDH10 ENSG00000121039 157506
LAX1 ENSG00000122188 54900
TWIST 1 ENSG00000122691 7291
ZWINT ENSG00000122952 11130
CIT ENSG00000122966 11113
ACOT9 ENSG00000123130 23597
IKZF4 ENSG00000123411 64375
HJURP ENSG00000123485 55355
METTL8 ENSG00000123600 79828
TOX2 ENSG00000124191 84969
GTSF1L ENSG00000124196 149699
SOX4 ENSG00000124766 6659
TM9SF2 ENSG00000125304 9375
HS3ST3B1 ENSG00000125430 9953
EML2 ENSG00000125746 24139
NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108
PGM2 ENSG00000169299 55276
CRADD ENSG00000169372 8738
UGP2 ENSG00000169764 7360
ZNF282 ENSG00000170265 8427
GLB1 ENSG00000170266 2720
SM ADI ENSG00000170365 4086
SPATA24 ENSG00000170469 202051
PRKCDBP ENSG00000170955 112464
TADA3 ENSG00000171148 10474
RBKS ENSG00000171174 64080
NETO2 ENSG00000171208 81831
LRG1 ENSG00000171236 116844
FAM98B ENSG00000171262 283742
CHST11 ENSG00000171310 50515
ECEL1 ENSG00000171551 9427
BCL2L1 ENSG00000171552 598
MALT1 ENSG00000172175 10892
ZMAT3 ENSG00000172667 64393
CORO1B ENSG00000172725 57175
CYP7B1 ENSG00000172817 9420
HPSE ENSG00000173083 10855
VANGL1 ENSG00000173218 81839
GLRX ENSG00000173221 2745
TRIB1 ENSG00000173334 10221
CD7 ENSG00000173762 924
HAP1 ENSG00000173805 9001
FBXO45 ENSG00000174013 200933
CHST2 ENSG00000175040 9435
RMI2 ENSG00000175643 116028
SLC35E3 ENSG00000175782 55508
ZBTB38 ENSG00000177311 253461
ZBED2 ENSG00000177494 79413
PARD6G ENSG00000178184 84552
GLDC ENSG00000178445 2731
AKAP5 ENSG00000179841 9495
CCR8 ENSG00000179934 1237
PAK2 ENSG00000180370 5062
YIPF6 ENSG00000181704 286451
TIGIT ENSG00000181847 201633
CREB3L2 ENSG00000182158 64764
XKRX ENSG00000182489 402415
CADM1 ENSG00000182985 23705
LHFP ENSG00000183722 10186
CSF1 ENSG00000184371 1435
PTP4A3 ENSG00000184489 11156
CDCA2 ENSG00000184661 157313
0SBP2 ENSG00000184792 23762
METTL7A ENSG00000185432 25840
SPATC1 ENSG00000186583 375686
TNFRSF4 ENSG00000186827 7293
TNFRSF18 ENSG00000186891 8784
TMPRSS6 ENSG00000187045 164656
GCNT1 ENSG00000187210 2650
MAGEH1 ENSG00000187601 28986
NHS ENSG00000188158 4810
IL17REL ENSG00000188263 400935
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NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108
MGME1 ENSG00000125871 92667
IGFLR1 ENSG00000126246 79713
DLGAP5 ENSG00000126787 9787
HIVEP3 ENSG00000127124 59269
LRRC61 ENSG00000127399 65999
TST ENSG00000128311 7263
STRIP2 ENSG00000128578 57464
MYO5C ENSG00000128833 55930
FOXA1 ENSG00000129514 3169
ITFG1 ENSG00000129636 81533
KLHDC7B ENSG00000130487 113730
TRAF3 ENSG00000131323 7187
MCCC2 ENSG00000131844 64087
GRSF1 ENSG00000132463 2926
SYT11 ENSG00000132718 23208
SLC41A1 ENSG00000133065 254428
ATP13A3 ENSG00000133657 79572
MICAL2 ENSG00000133816 9645
IL2RA ENSG00000134460 3559
CABLES 1 ENSG00000134508 91768
RFK ENSG00000135002 55312
HAVCR2 ENSG00000135077 84868
CGA ENSG00000135346 1081
FAIM2 ENSG00000135472 23017
EGLN1 ENSG00000135766 54583
ARHGEF4 ENSG00000136002 50649
SLC41A2 ENSG00000136052 84102
FLNB ENSG00000136068 2317
RCBTB1 ENSG00000136144 55213
TMOD1 ENSG00000136842 7111
TPMT ENSG00000137364 7172
CASP1 ENSG00000137752 834
NUSAP1 ENSG00000137804 51203
ADAM 10 ENSG00000137845 102
ZNF280D ENSG00000137871 54816
NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 ENTREZJD release 108
ADAT2 ENSG00000189007 134637
NEMP2 ENSG00000189362 100131211
SPATS2L ENSG00000196141 26010
NTNG2 ENSG00000196358 84628
MYL6B ENSG00000196465 140465
ARHGEF12 ENSG00000196914 23365
MAP3K5 ENSG00000197442 4217
PDGFA ENSG00000197461 5154
PDCD1LG2 ENSG00000197646 80380
TOR4A ENSG00000198113 54863
HIBCH ENSG00000198130 26275
ZNF334 ENSG00000198185 55713
NTRK1 ENSG00000198400 4914
TMA16 ENSG00000198498 55319
WDHD1 ENSG00000198554 11169
FAM19A2 ENSG00000198673 338811
F5 ENSG00000198734 2153
GK ENSG00000198814 2710
INPP5F ENSG00000198825 22876
LAYN ENSG00000204381 143903
CARD 16 ENSG00000204397 114769
TBC1D8 ENSG00000204634 11138
CD 177 ENSG00000204936 57126
LEPROT ENSG00000213625 54741
SEC14L6 ENSG00000214491 730005
TRIM 16 ENSG00000221926 10626
LTA ENSG00000226979 4049
PROB1 ENSG00000228672 389333
AF165138,7 ENSG00000243440 NA
USP51 ENSG00000247746 158880
CARD 17 ENSG00000255221 440068
DOC2B ENSG00000272636 8447
C17orí96 ENSG00000273604 100170841
SSTR3 ENSG00000278195 6753
AC019206,1 ENSG00000279229 NA
[0018] em que cada um do dito nome do marcador é caracterizado por “Ensembl gene id” e inclui todas das sequências de proteína da isoforma aí divulgada.
[0019] Cada gene da tabela VIII é caracterizada pelo seu número de acesso Ensembl Gene (ENSG), recuperável nas bases de dados públicas EnsEMBL (http://www.ensembl.org) e pelo seu Entrez Gene ID, recuperável na base de dados pública NCBI (https ://www.ncbi.nlm.nih. gov/), se presente.
[0020] Preferivelmente o marcador é selecionado do grupo consistindo em: uma proteína de transmembrana, uma citocina, um fator epigenético, uma cinase fosfatase ou um fator de transcrição.
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10/113 [0021] Mais preferivelmente, o marcador é uma proteína de transmembrana selecionada do grupo da SEQ ID NO: 1 a 661, ainda mais preferivelmente, o marcador é selecionado do grupo consistindo em:
LAYN (SEQ ID NOs: 1-9), CCR8 (SEQ ID NOs: 10-11), IL21R (SEQ ID NOs: 12-14), IL1R2 (SEQ ID NOs: 206-209), LY75 (SEQ ID NO: 78), SIRPG (SEQ ID NOs: 122-126), CD177 (SEQ ID NOs: 651-653), CD7 (SEQ ID NOs: 549-554), FCRL3 (SEQ ID NOs: 452-457), CADM1 (SEQ ID NOs: 570-583), NTNG2 (SEQ ID NOs: 621-622), CSF2RB (SEQ ID NOs: 134137), SECTM1 (SEQ ID NOs: 349-356), TSPAN5 (SEQ ID NOs: 497-503), TMPRSS3 (SEQ ID NOs: 448-451), TMPRSS6 (SEQ ID NOs: 605-611), METTL7A (SEQ ID NOs: 600-604), THADA (SEQ ID NOs: 237), NDFIP2 (SEQ ID NOs: 148-151), CHRNA6 (SEQ ID NOs: 392-394), ou do grupo consistindo de: LAYN (SEQ ID NOs: 1-9 [ >ENSG00000204381_ENST00000375614_ENSP00000364764_LAYN MRPGTALQAVLLAVLLVGLRAATGRLLSGQPVCRGGTQRPCYKVIYF HDTSRRLNFEEAKEACRRDGGQLVSIESEDEQKLIEKFIENLLPSDGDF WIGLRRREEKQSNSTACQDLYAWTDGSISQFRNWYVDEPSCGSEVCV VMYHQPSAPAGIGGPYMFQWNDDRCNMKNNFICKYSDEKPAVPSRE AEGEETELTTPVLPEETQEEDAKKTFKESREAALNLAYILIPSIPLLLLL VVTTVVCWVWICRKRKREQPDPSTKKQHTIWPSPHQGNSPDLEVYN VIRKQSEADLAETRPDLKNISFRVCSGEATPDDMSCDYDNMAVNPSE SGFVTLVSVESGFVTNDIYEFSPDQMGRSKESGWVENEIYGY* (SEQ ID NO:1) >ENSG00000204381_ENST00000375615_ENSP00000364765_LAYN MRPGTALQAVLLAVLLVGLRAATGRLLSASDLDLRGGQPVCRGGTQ RPCYKVIYFHDTSRRLNFEEAKEACRRDGGQLVSIESEDEQKLIEKFIE NLLPSDGDFWIGLRRREEKQSNSTACQDLYAWTDGSISQFRNWYVDE PSCGSEVCVVMYHQPSAPAGIGGPYMFQWNDDRCNMKNNFICKYSD EKPAVPSREAEGEETELTTPVLPEETQEEDAKKTFKESREAALNLAYIL
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11/113
IPSIPLLLLLVVTTVVCWVWICRKRKREQPDPSTKKQHTIWPSPHQGN SPDLEVYNVIRKQSEADLAETRPDLKNISFRVCSGEATPDDMSCDYDN MAVNPSESGFVTLVSVESGFVTNDIYEFSPDQMGRSKESGWVENEIY GY* (SEQ ID N0:2) >ENSG00000204381_ENST00000436913_ENSP00000392942_LAYN MVTSGLGSGGVRRNKAIAQPARTFMLGLMAAYHNLEKPAVPSREAE GEETELTTPVLPEETQEEDAKKTFKESREAALNLAYILIPSIPLLLLLVV TTVVCWVWICRKRKREQPDPSTKKQHTIWPSPHQGNSPDLEVYNVIR KQSEADLAETRPDLKNISFRVCSGEATPDDMSCDYDNMAVNPSESGF VTLVSVESGFVTNDIYEFSPDQMGRSKESGWVENEIYGY* (SEQ ID N0:3) >ENSG00000204381_ENST00000525126_ENSP00000434328_LAYN MRPGTALQAVLLAVLLVGLRAATGRLLSASDLDLRGGQPVCRGGTQ RPCYKVIYFHDTSRRLNFEEAKEACRRDGGQLVSIESEDEQKLIEKFIE NLLPSDGDFWIGLRRREEKQSNSTACQDLYAWTDGSISQFRNWYVDE PSCGSEVCVVMYHQPSAPAGIGGPYMFQWNDDRCNMKNNFICKYSD EKPAVPSREAEGEETELTTPVLPEETQEEDAKKTFKESREAALNLAYIL IPSIPLLLLLVVTTVVCWVWICRKRQKTGAARP* (SEQ ID N0:4) >ENSG00000204381_ENST00000525866_ENSP00000434300_LAYN MRPGTALQAVLLAVLLVGLRAATGRLLSGQPVCRGGTQRPCYKVIYF HDTSRRLNFEEAKEACRRDGGQLVSIESEDEQKLIEKFIENLLPSDGDF WIGLRRREEKQSNSTACQDLYAWTDGSISQFRETSSSF* (SEQ ID N0:5) >ENSG00000204381_ENST00000528924_ENSP00000486561_LAYN MVTSGLGSGGVRRNKAIAQPARTFMLGLMAAYHNLEKPAVPSREAE GEETELTTPVLPEETQEEDAKKTFKESREAALNLAYILIPSIPLLLLLVV TTVVCWVWICRK (SEQ ID N0:6) >ENSG00000204381_ENST00000530962_ENSP00000431627_LAYN MYHQPSAPAGIGGPYMFQWNDDRCNMKNNFICKYSDEKPAVPSREA
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EGEETELTTPVLPEETQEEDAKKTFKESREAALNLAYILIPSIPLLLLLV
VTTVVCWVWICRK (SEQ ID N0:7) >ENSG00000204381_ENST00000533265_ENSP00000434972_LAYN
MRPGTALQAVLLAVLLVGLRAATGRLLSGQPVCRGGTQRPCYKVIYF HDTSRRLNFEEAKEACRRDGGQLVSIESEDEQKLIEKFIENLLPSDGDF WIGLRRREEKQSNSTACQDLYAWTDGSISQFRNWYVDEPSCGSEVCV VMYHQPSAPAGIGGPYMFQWNDDRCNMKNNFICKYSDEKPAVPSRE AEGEETELTTPVLPEETQEEDAKKTFKESREAALNLAYILIPSIPLLLLL VVTTVVCWVWICRKRQKTGAARP* (SEQ ID NO:8) >ENSG00000204381_ENST00000533999_ENSP00000432434_LAYN MYHQPSAPAGIGGPYMFQWNDDRCNMKNNFICKYSDEKPAVPSREA EGE (SEQ ID NO:9)]),
CCR8 (SEQ ID NOs: 10-11 [ >ENSG00000179934_ENST00000326306_ENSP00000326432_CCR8
MDYTLDLSVTTVTDYYYPDIFSSPCDAELIQTNGKLLLAVFYCLLFVF SLLGNSLVILVLVVCKKLRSITDVYLLNLALSDLLFVFSFPFQTYYLLD QWVFGTVMCKVVSGFYYIGFYSSMFFITLMSVDRYLAVVHAVYALK VRTIRMGTTLCLAVWLTAIMATIPLLVFYQVASEDGVLQCYSFYNQQ TLKWKIFTNFKMNILGLLIPFTIFMFCYIKILHQLKRCQNHNKTKAIRL VLIVVIASLLFWVPFNVVLFLTSLHSMHILDGCSISQQLTYATHVTEIIS FTHCCVNPVIYAFVGEKFKKHLSEIFQKSCSQIFNYLGRQMPRESCEKS SSCQQHSSRSSSVDYIL* (SEQ ID NO: 10) >ENSG00000179934_ENST00000414803_ENSP00000390104_CCR8 MDYTLDLSVTTVTDYYYPDIFSSPCDAELIQTNDLLSAGPVGVWDCN VQSGVWLLLHWLLQQHVFHHPHECGQVPGCCPCRVCPKGEDDQDG HNAVPGSMANRHYGYHPIASVLPSGL* (SEQ ID NO: 11)]), IL21R (SEQ ID NOs: 12-14 [ >ENSG00000103522_ENST00000337929_ENSP00000338010_IL21R MPRGWAAPLLLLLLQGGWGCPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPST
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LTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADD
IFSVNITDQSGNYSQECGSFLLAESIKPAPPFNVTVTFSGQYNISWRSD
YEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPL
EFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQSEELKEGWN
PHLLLLLLLVIVFIPAFWSLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKG
CSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQL
TELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTV
TVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVL
SCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGG
VSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYL
RQWVVIPPPLSSPGPQAS* (SEQ ID NO: 12) >ENSG00000103522_ENST00000395754_ENSP00000379103_IL21R
MPRGWAAPLLLLLLQGGWGCPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPST
LTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADD
IFSVNITDQSGNYSQECGSFLLAESIKPAPPFNVTVTFSGQYNISWRSD
YEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPL
EFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQSEELKEGWN
PHLLLLLLLVIVFIPAFWSLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKG
CSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQL
TELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTV
TVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVL
SCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGG
VSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYL
RQWVVIPPPLSSPGPQAS* (SEQ ID NO: 13) >ENSG00000103522_ENST00000564089_ENSP00000456707_IL21R
MPRGWAAPLLLLLLQGGWGCPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPST
LTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADD
IFSVNITDQSGNYSQECGSFLLAESIKPAPPFNVTVTFSGQYNISWRSD
YEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPL
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EFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQSEELKEGWN PHLLLLLLLVIVFIPAFWSLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKG CSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQL TELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTV TVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVL SCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGG VSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYL
RQWVVIPPPLSSPGPQAS* (SEQ ID NO: 14)]).
[0022] A dita citocina é preferivelmente selecionada do grupo consistindo em: IL32 (SEQ ID NOs: 19-30), IL7 (SEQ ID NOs: 168-174), EBI3 (SEQ ID NO: 175), SECTM1 (SEQ ID NOs: 349-356), CSF1 (SEQ ID NOs: 585-592) e LTA (SEQ ID NOs: 657-658).
[0023] O dito fator epigenético é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em: TDRD3 (SEQ ID NO: 712-718), KAT2B (SEQ ID NO:719), FOXA1 (SEQ ID NOs: 720-721) e RCBTB1 (SEQ ID NOs: 722723).
a dita cinase fosfatase é preferivelmente selecionada do grupo consistindo em: GSK3B (SEQ ID NOs: 724-725), SSH1 (SEQ ID NOS: 111112), CDK6 (SEQ ID NOs: 726-727), MINPP1 (SEQ ID NOs: 181-183), PTPRJ (SEQ ID NOs: 395-400), CALM3 (SEQ ID NOs: 728-734) e PTP4A3 (SEQ ID NOs: 593-598).
o dito fator de transcrição é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em:
VDR (SEQ ID NO:204), ZNF334 (SEQ ID NOs: 736-741), CREB3L2 (SEQ ID NOs: 565-567), ETV7 (SEQ ID NO:31 ou 32), SOX4 (SEQ ID NO:735), TWIST1 (SEQ ID NOs: 743-745), TP73 (SEQ ID NOs: 746-756), FOXP3, NFE2L3 (SEQ ID NO:76), ARNTL2 (SEQ ID NOs: 757764), BATE (SEQ ID NOs: 765-766), PTTG1 (SEQ ID NOs: 767-770), HIVEP3 (SEQ ID NOs: 771-772), FOXA1 (SEQ ID NOs: 720-721), ZBTB38
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15/113 (SEQ ID NO:561), F0XM1 (SEQ ID NOs: 773-778), TADA3 (SEQ ID NOs: 779-782), NFAT5 (SEQ ID NO:160, 783-791, 742).
[0024] Em uma modalidade preferida, o marcador é MAGEH1 (SEQ ID NO: 708 ou 709) [MAGEHl_Entrez:28986_ENSG00000187601_ENST0 0000342972_ENSP00000343706 ATGCCTCGGGGACGAAAGAGTCGGCGCCGCCGTAATGCGAGAGCC
GCAGAAGAGAACCGCAACAATCGCAAAATCCAGGCCTCAGAGGC CTCCGAGACCCCTATGGCCGCCTCTGTGGTAGCGAGCACCCCCGA AGACGACCTGAGCGGCCCCGAGGAAGACCCGAGCACTCCAGAGG AGGCCTCTACCACCCCTGAAGAAGCCTCGAGCACTGCCCAAGCAC AAAAGCCTTCAGTGCCCCGGAGCAATTTTCAGGGCACCAAGAAAA GTCTCCTGATGTCTATATTAGCGCTCATCTTCATCATGGGCAACAG CGCCAAGGAAGCTCTGGTCTGGAAAGTGCTGGGGAAGTTAGGAAT GCAGCCTGGACGTCAGCACAGCATCTTTGGAGATCCGAAGAAGAT CGTCACAGAAGAGTTTGTGCGCAGAGGGTACCTGATTTATAAACC GGTGCCCCGTAGCAGTCCGGTGGAGTATGAGTTCTTCTGGGGGCCC CGAGCACACGTGGAATCGAGCAAACTGAAAGTCATGCATTTTGTG GCAAGGGTTCGTAACCGATGCTCTAAAGACTGGCCTTGTAATTATG ACTGGGATTCGGACGATGATGCAGAGGTTGAGGCTATCCTCAATT CAGGTGCTAGGGGTTATTCCGCCCCTTAA (SEQ ID NO:708) MPRGRKSRRRRNARAAEENRNNRKIQASEASETPMAASVVASTPEDD LSGPEEDPSTPEEASTTPEEASSTAQAQKPSVPRSNFQGTKKSLLMSIL ALIFIMGNSAKEALVWKVLGKLGMQPGRQHSIFGDPKKIVTEEFVRR GYLIYKPVPRSSPVEYEFFWGPRAHVESSKLKVMHFVARVRNRCSKD WPCNYDWDSDDDAEVEAILNSGARGYSAP* (SEQ ID NO:709)].
[0025] Na presente invenção, o tumor é preferivelmente um sólido ou tumor líquido. Preferivelmente, o tumor sólido é selecionado do grupo consistindo em: câncer pulmonar de célula não pequena, câncer colorretal, câncer mamário, câncer gástrico.
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16/113 [0026] Em uma modalidade preferida da invenção, o tumor é uma metástase, preferivelmente uma metástase óssea, uma cerebral ou uma hepática.
[0027] Preferivelmente, a metástase deriva de câncer colorretal ou câncer pulmonar de célula não pequena.
[0028] Um outro objetivo da invenção é a molécula definida acima para o uso em um método para esgotar células T reguladoras da infiltração em tumor in vivo em um sujeito ou para o uso em um método para realçar a imunidade tumoral em um sujeito.
[0029] Um outro objetivo da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo a molécula como definida acima e pelo menos um carregador farmaceuticamente aceitável.
[0030] Um outro objetivo da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo a molécula como acima definida, para o uso na prevenção e/ou tratamento de tumor ou para o uso em um método para esgotar célula T reguladora da infiltração em tumor in vivo em um sujeito ou para o uso em um método para realçar imunidade tumoral em um sujeito.
[0031] A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode compreender ainda um agente terapêutico, preferivelmente o agente terapêutico em um agente antitumoral.
[0032] Um outro objetivo da invenção é um método in vitro para diagnosticar e/ou avaliar o risco de desenvolver e/ou prognosticar e/ou para monitorar a progressão e/ou para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico e/ou para a triagem de um tratamento terapêutico de um tumor em um sujeito compreendendo a etapa de:
a) detectar pelo menos um do marcador como acima definido em uma amostra biológica isolada obtida do sujeito e
b) comparar com respeito a um controle apropriado.
[0033] Um outro objetivo da invenção é um método in vitro ou ex
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17/113 vivo para diagnosticar e/ou avaliar o risco de desenvolver e/ou prognosticar e/ou para monitorar a progressão e/ou para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico e/ou para a triagem de um tratamento terapêutico de um tumor em um sujeito como acima definido, em que o marcador a ser detectado é pelo menos um do marcador selecionado do grupo consistindo em: LAYN, MAGEH1 e CCR8.
[0034] Preferivelmente o método acima é para o prognostico de câncer colorretal ou câncer pulmonar de célula não pequena em um sujeito e compreende a etapa de:
a) detectar pelo menos um do marcador selecionado do grupo consistindo em:
LAYN, MAGEH1 e CCR8 em uma amostra biológica isolada obtida do sujeito e
b) comparar com respeito a um controle apropriado, em que uma quantidade do dito pelo menos um marcador na amostra biológica isolada obtida do sujeito mais alta do que a quantidade de controle indica que o sujeito tem um prognóstico pobre.
[0035] No método acima, preferivelmente a etapa a) compreende medir a quantidade do marcador ou de fragmentos do mesmo ou do polinucleotídeo codificando a dita proteína (DNA ou mRNA) ou de fragmentos do mesmo na dita amostra biológica isolada obtida do sujeito e a etapa b) compreende comparar a quantidade medida da etapa a) com uma quantidade de controle apropriada.
[0036] Preferivelmente, o método in vitro para monitorar a progressão e/ou para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico de um tumor, como acima definido, compreende a etapa de:
a) medir a alteração da quantidade ou a alteração da atividade dos marcadores acima ou de fragmentos do mesmo ou do polinucleotídeo codificando a dita proteína ou fragmentos da mesma na dita amostra biológica
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18/113 isolada obtida do sujeito e
b) comparar a alteração medida da etapa a) com uma alteração de controle apropriada.
[0037] Um outro objetivo da invenção é um método para o tratamento e/ou prevenção de tumor compreendendo administrar a um sujeito a molécula como acima definida.
[0038] Um outro objetivo é um método para identificar uma molécula que atue como um antitumoral, compreendendo a etapa de:
- ensaiar moléculas candidatas quanto à sua especificidade de ligação ao pelo menos um marcador como acima definido;
- selecionar moléculas tendo uma atividade de ligação específica ao pelo menos um marcador como acima definido;
- testar tais moléculas de ligação específica quanto à sua capacidade de inibir a proliferação e/ou induzir uma resposta apoptótica em um sistema de célula, preferivelmente pela depleção seletiva de célula T reguladora da infiltração em tumor, mais preferivelmente pela indução da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
[0039] Preferivelmente, a amostra biológica é um fluido, uma célula ou uma amostra de tecido, mais preferivelmente a dita amostra é plasma ou soro.
[0040] O termo “amostra biológica” abrange uma amostra clínica, e também inclui tecido obtido pela resseção cirúrgica, tecido obtido por biópsia, células em cultura, sobrenadantes celulares, lisados celulares, amostras de tecido, órgãos, medula óssea, sangue, plasma, soro, e afins.
[0041] Uma “amostra” no contexto das presentes divulgações se refere a qualquer amostra biológica que é isolada de um sujeito. Uma amostra pode incluir, sem limitação uma alíquota de fluido corporal, sangue integral, soro, plasma, amostras sólidas de tecido tais como biópsias de tecido, ou
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19/113 culturas de tecido ou células daí derivadas e a progênie das mesmas, fluido sinovial, fluido linfático, fluido de ascite, e fluido intersticial ou extracelular. O termo “amostra” também abrange o fluido nos espaços entre as células, incluindo fluido crevicular gengival, medula óssea, fluido cerebroespinhal (CSF), saliva, muco, catarro, sêmen, suor, urina, ou quaisquer outros fluidos corporais. “Amostra de sangue” pode se referir ao sangue integral ou qualquer fração do mesmo, incluindo soro e plasma. As amostras podem ser obtidas de um sujeito por meios incluindo mas não limitados à venopunção, excreção, ejaculação, massagem, biópsia, aspirado de agulha, lavagem, raspagem, incisão cirúrgica, ou intervenção ou outros meios conhecidos na técnica. A definição também inclui amostras que foram manipuladas de qualquer modo depois da sua aquisição, tal como pelo tratamento com reagentes; lavagem; ou enriquecimento para certas populações celulares, tais como células cancerosas ou amostras em que as células T reguladoras, são isoladas e depois analisadas. A definição também inclui amostra que foi enriquecida quanto a tipos particulares de moléculas, por exemplo, ácidos nucleicos, polipeptídeos, etc.
[0042] Um outro objetivo da invenção é um kit para realizar os métodos acima, compreendendo
- meios para medir a quantidade ou a atividade dos marcadores acima ou de fragmentos dos mesmos e/ou meios para medir a quantidade do polinucleotídeo codificando a dita proteína ou de fragmentos do mesmo e opcionalmente,
- meios de controle.
[0043] Qualquer combinação dos marcadores acima é compreendida dentro da presente invenção. As combinações preferidas de marcadores são LAYN e MAGEH1; LAYN e CCR8; CCR8 e MAGEH1; LAYN, MAGEH1 e CCR8.
[0044] Preferivelmente, o polinucleotídeo acima é um inibidor de RNAi, preferivelmente selecionado do grupo consistindo em: siRNA,
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20/113 miRNA, shRNA, stRNA, snRNA, e ácido nucleico de antissentido, ou um derivado funcional do mesmo.
[0045] Uma análise comparativa de arranjos de expressão de gene de células T CD4+ infiltrando NSCLC e CRC revelou a expressão específica de Treg de 328 marcadores como listados na Tabela IV Manipulação de células Treg via estes marcadores pode portanto ser usada para realçar a imunoterapia de câncer.
[0046] As expressões “molécula capaz de modular” e “modulador” são aqui intercambiáveis. Pelo termo “modulador” é intencionada uma molécula que efetua uma mudança na expressão e/ou função de pelo menos um marcador como acima definido.
[0047] A mudança é relativa ao nível normal ou de referência da expressão e/ou função na ausência do modulador, mas de outro modo sob condições similares, e a mesma pode representar um aumento (por exemplo usando-se um indutor ou ativador) ou uma diminuição (por exemplo usandose um supressor ou inibidor) na expressão e/ou função normal/de referência. No contexto da presente invenção, um “modulador” é uma molécula que pode suprimir ou inibir a expressão e/ou função de pelo menos um marcador que é seletivamente desregulado na célula T reguladora da infiltração em tumor para o uso na prevenção e/ou tratamento de câncer.
[0048] Pelos termos “supressor ou inibidor” ou uma “molécula que (seletivamente) suprime ou inibe” é intencionada uma molécula que efetue uma mudança na expressão e/ou função do alvo.
[0049] No contexto da presente invenção, um “modulador” é uma molécula que pode induzir ou ativar a expressão e/ou função de pelo menos um marcador que é seletivamente desregulado na célula T reguladora da infiltração em tumor para o uso na prevenção e/ou tratamento de câncer.
[0050] A mudança é relativa ao nível normal ou de referência da expressão e/ou função na ausência do modulador, mas de outro modo sob
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21/113 condições similares, e a mesma pode representar um aumento (por exemplo usando-se um indutor ou ativador) ou uma diminuição (por exemplo usandose um supressor ou inibidor) na expressão e/ou função normal/de referência.
[0051] A supressão ou inibição da expressão e/ou função do alvo podem ser avaliadas por quaisquer meios conhecidos pela pessoa versada na técnica. A avaliação do nível de expressão ou da presença do alvo é preferivelmente realizada usando técnicas da biologia molecular clássica tais como (Reação da Cadeia da Polimerase em tempo real) qPCR, microarranjos, arranjos de grânulos, análise de proteção de RNAse ou análise de Northern blot ou clonagem e sequenciamento.
[0052] A avaliação da função alvo é preferivelmente realizada pelo ensaio de supressão in vitro, análise de transcriptoma integral, análise de espectrometria de massa para identificar proteínas que interagem com o alvo.
[0053] No contexto da presente invenção, o alvo (ou o marcador) pode ser o gene, o mRNA, o cDNA, ou a proteína codificada do mesmo, incluindo fragmentos, derivados, variantes, isoformas, etc. Preferivelmente, o marcador é caracterizado pelos seus Números de Acesso (isto é, NCBI Entrez ID; número de acesso na Ensembl Gene (ENSG), número de acesso no Ensembl transcript (ENST) e número de acesso no Ensembl protein (ENSP), recuperável na base de dados pública EnsEMBL (http://www.ensembl.org)) e/ou sequências de aminoácido e nucleotídeo, aqui divulgadas.
[0054] No contexto da presente invenção, o termo “tratar” (ou “tratado”, ’’tratamento”, etc.) quando da alusão à célula T CD4+, significa por exemplo a exposição da célula a um modulador exógeno como acima definido. A superexpressão pode ser obtida por exemplo infectando-se as células com um vetor viral expressando a molécula da invenção. A inibição da expressão de marcador pode por exemplo ser obtida pela transfecção com polinucleotídeo, como por exemplo com siRNAs. O termo “tratar” pode também significar que as células são manipuladas de modo a superexpressar
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22/113 ou silenciar o marcador. A superexpressão ou o silenciamento pode ser obtido por exemplo modificando-se geneticamente as células.
[0055] Meios de controle podem ser usados para comparar a quantidade ou o aumento da quantidade do marcador definido e relação a um controle apropriado. O controle apropriado pode ser obtido por exemplo, com referência ao padrão conhecido, de um sujeito normal ou de população normal, ou de células T diferentes das células T reguladoras da infiltração em tumor ou células T reguladoras.
[0056] Os meios para medir a quantidade de pelo menos um marcador como acima definido são preferivelmente pelo menos um anticorpo, análogo funcional ou derivados do mesmo. O dito anticorpo, análogo funcional ou derivados do mesmo são específicos para o dito marcador.
[0057] No contexto da presente invenção, o anticorpo é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em uma imunoglobulina intacta, um Fv, um scFv (fragmento Fv de cadeia única), um Fab, um F(ab’)2, um domínio “semelhante a anticorpo”, um “domínio mimético de anticorpo”, um domínio de anticorpo único (domínio VH ou domínios VL), um anticorpo multimérico, fragmentos de ligação de antígeno recombinante ou sintético, um peptídeo ou um fragmento proteolítico contendo a região de ligação de epítopo. Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” podem ser usados intercambiavelmente e são aqui usados no sentido mais amplo e abrangem vários anticorpos e estruturas miméticas de anticorpo, incluindo mas não limitados a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos quiméricos, nanocorpos, derivados de anticorpo, fragmentos de anticorpo, anticalinas, DARPins, aficorpos, afilinas, afímeros, afitinas, alfacorpos, avímeros, finômeros, monocorpos e outros domínios de ligação, contanto que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.
[0058] O termo imunoglobulina também inclui “conjugado” do
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23/113 mesmo. No contexto da presente invenção “conjugado” em relação ao anticorpo da invenção inclui anticorpos (ou fragmentos dos mesmos) conjugados com uma substância (um composto, etc.) tendo uma atividade terapêutica, por exemplo atividade antitumoral e/ou atividade de matança de célula ou um dos agentes citotóxicos tais como várias toxinas de cadeia A, proteínas que inativam ribossomas, e ribonucleases; anticorpos biespecíficos planejados para induzir mecanismos celulares para matar tumores (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.676.980 e 4.954.617). O conjugado pode ser formado preparando-se previamente cada uma da molécula de anticorpo anteriormente mencionada e da substância tendo atividade antitumoral e/ou atividade de matança de célula anteriormente mencionada, separadamente, e depois combinando-se as mesmas (imunoconjugado) ou ligando-se uma toxina de proteína usada como uma tal substância tendo atividade antitumoral e/ou atividade de matança de célula com um gene de anticorpo em um gene de acordo com uma técnica de recombinação genética, de modo a permitir que a mesma se expresse como uma proteína única (uma proteína de fusão) (imunotoxina).
[0059] Um “fragmento de anticorpo” se refere a uma molécula outra que não um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga.
[0060] Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo scFv); e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Fvs VH ou VL são também chamadas de “Nanocorpos”.
[0061] O termo “miméticos de anticorpo” se refere àqueles compostos orgânicos ou domínios de ligação que não são derivados de anticorpo mas que podem ligar especificamente um antígeno como os anticorpos o fazem. Eles incluem anticalinas, DARPinas, aficorpos, afilinas, afímeros, afitinas,
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24/113 alfacorpos, avímeros, finômeros, monocorpos e outros.
[0062] O termo anticorpo “quimérico” se refere a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particulares, enquanto que o resto da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie diferente.
[0063] Os termos “anticorpo de tamanho natural,” “anticorpo intacto,” e “anticorpo inteiro” são aqui usados intercambiavelmente para se referir a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativa ou tendo cadeias pesadas que contenham uma região Fc como aqui definido.
[0064] Em uma modalidade preferida, o kit da invenção compreende:
- um anticorpo específico aderido à fase sólida para o dito composto;
- meios de detecção do complexo marcador específico de ligante.
[0065] Altemativamente, os reagentes podem ser providos como um kit compreendendo reagentes em uma suspensão ou forma suspensa, por exemplo reagentes ligados a grânulos adequados para a citometria de fluxo, preferivelmente grânulos magnéticos revestidos com captura de anticorpo. As instruções podem compreender instruções para conduzir um ensaio de citometria de fluxo com base em anticorpo.
[0066] Os meios de detecção são preferivelmente meios capazes de detectar e/ou medir a quantidade dos marcadores descritos, por exemplo meios capazes de detectar o complexo antígeno-anticorpo, como anticorpos secundários conjugados a enzima, substratos luminescentes, grânulos magnéticos revestidos com captura de anticorpo, coquetéis de anticorpo seco customizados e/ou colunas com cartuchos com filtro de tamanho e/ou combinados com filtros de anticorpo específicos (SAF).
[0067] Em uma modalidade, o método compreende ainda selecionar
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25/113 um regime terapêutico com base na análise. Em uma modalidade, o método compreende ainda determinar um curso de tratamento para o sujeito com base na análise. Outros meios podem ser por exemplo iniciadores e sondas específicos para a RT PCR. Os kits de acordo com a invenção podem compreender ainda auxiliares habituais, tais como tampões, carreadores, marcadores, etc. e/ou instruções para o uso.
[0068] No contexto da presente invenção o termo “detectar” pode ser intencionado também como “medir a quantidade” ou “medir a alteração”. No caso de um método ou um kit para avaliação de risco e/ou diagnostico e/ou prognostico de um tumor, o controle apropriado pode ser uma amostra tirada de um paciente saudável ou de um paciente afetado por um outro distúrbio ou patologia, e a quantidade ou atividade apropriadas de controle podem ser a quantidade ou atividade da mesma proteína ou polinucleotídeo medidas em uma amostra tirada de um paciente saudável ou de um paciente afetado por um outro distúrbio ou patologia.
[0069] No caso de um método ou um kit para monitorar a progressão de um tumor, o progresso do câncer é monitorado e o controle apropriado pode ser uma amostra tirada do mesmo sujeito em vários tempos ou de um outro paciente, e a quantidade ou atividade apropriadas de controle podem ser a quantidade ou atividade da mesma proteína ou polinucleotídeo medidas em uma amostra tirada do mesmo sujeito em vários tempos ou de um outro paciente.
[0070] No caso de um método ou um kit para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico, o controle apropriado pode ser uma amostra tirada do mesmo sujeito antes do início da terapia ou tirada em vários tempos durante o curso da terapia e a quantidade ou atividade apropriadas de controle podem ser a quantidade ou atividade da mesma proteína ou polinucleotídeo medidos em uma amostra tirada do mesmo sujeito antes do início da terapia ou tirada em vários tempos durante o curso da terapia.
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26/113 [0071] No caso de um método ou um kit para a triagem de um tratamento terapêutico, o controle apropriado pode ser uma amostra tirada de sujeitos sem tratamento e de sujeitos tratados com uma substância que deva ser ensaiada ou de sujeitos tratados com um tratamento de referência e a quantidade ou atividade apropriadas de controle podem ser a média das quantidades ou atividade da mesma proteína ou polinucleotídeo medidas em amostras tiradas de sujeitos sem tratamento e de sujeitos tratados com uma substância que deva ser ensaiada ou de sujeitos tratados com um tratamento de referência. Neste caso, se a quantidade ou atividade de MAGEH1 e/ou LAYN e/ou CCR8 ou polinucleotídeos dos mesmos na amostra biológica isolada obtida do sujeito forem mais baixas ou iguais à quantidade ou atividade de controle, as mesmas podem indicar que a substância testada é eficaz para o tratamento do tumor.
[0072] Na presente invenção, a expressão “medir a quantidade” pode ser intencionada como medir a quantidade (ou a atividade) ou concentração ou nível da respectiva proteína e/ou mRNA da mesma e/ou DNA da mesma, preferivelmente semiquantitativa ou quantitativa. A medição de uma proteína pode ser realizada direta ou indiretamente. A medição direta se refere à medida da quantidade ou concentração do marcador, com base em um sinal obtido diretamente da proteína, e que esteja diretamente correlacionado com o número de moléculas de proteína presentes na amostra, este sinal - que também pode ser aludido como sinal de intensidade - pode ser obtido, por exemplo, medindo-se um valor de intensidade de uma propriedades química ou física do marcador. As medições indiretas incluem a medição obtida de um componente secundário (por exemplo, um componente diferente do produto de expressão de gene) e um sistema de medição biológico (por exemplo a medição de respostas celulares, ligantes, “rótulos” ou produtos da reação enzimática).
[0073] O termo “quantidade”, como usado na descrição se refere mas
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27/113 não é limitado à quantidade absoluta ou relativa de proteínas e/ou mRNA do mesmo e/ou DNA do mesmo, e qualquer outro valor ou parâmetro associado com a mesma ou que pode resultar destas. Tais valores ou parâmetros compreendem valores de intensidade de sinal obtidos das propriedades físicas ou químicas da proteína, obtidos pela medição direta, por exemplo, valores de intensidade em um imunoensaio, espectroscopia de massa ou uma ressonância magnética nuclear. Adicionalmente, estes valores ou parâmetros incluem aqueles obtidos pela medição indireta, por exemplo, qualquer um dos sistemas de medição aqui descritos. Os métodos de medir mRNA e DNA em amostras são conhecidos na técnica. Para medir os níveis de ácido nucleico, as células em uma amostra de teste podem ser lisadas, e os níveis de mRNA nos lisados ou em RNA purificado ou semipurificado de lisados podem ser medidas por qualquer variedade de métodos familiares para aqueles na técnica. Tais métodos incluem ensaios de hibridização usando sondas de DNA ou RNA detectavelmente rotulados (isto é, Northern blotting) ou as metodologias de RT-PCR quantitativas ou semiquantitativas usando iniciadores de oligonucleotídeo apropriado. Altemativamente, ensaios de hibridização in situ quantitativos ou semiquantitativos podem ser realizados usando, por exemplo, seções de tecido, ou suspensões de célula não lisadas, e sondas de DNA ou RNA detectavelmente rotuladas (por exemplo, fluorescentes, ou rotuladas com enzima). Os métodos adicionais para quantificar mRNA incluem ensaio de proteção de RNA (RPA), cDNA e microarranjos de oligonucleotídeo, análise de diferença de representação (RDA), demonstrações diferenciais, análise de sequência de EST, e análise serial de expressão de gene (SAGE).
[0074] Se ao comparar a quantidade ou atividade medidas dos marcadores acima ou do polinucleotídeo codificando a dita proteína com a quantidade ou atividade obtida de uma amostra de controle, a quantidade ou a atividade do dito marcador na amostra isolada do sujeito corresponde a um
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28/113 valor mais alto, o sujeito pode apresentar câncer ou ir para um agravamento da dita doença.
[0075] Se ao comparar a quantidade ou atividade medidas dos marcadores acima ou do polinucleotídeo codificando a dita proteína com a quantidade ou a atividade obtida de uma amostra de controle, a quantidade ou a atividade do dito marcador na amostra isolada do sujeito corresponde a um valor similar ou mais baixo, o sujeito pode não ser afetado pelo câncer ou ir para uma melhora do câncer, respectivamente.
[0076] Altemativamente, a expressão “detectar” ou “medir a quantidade” é intencionado como medir a alteração da molécula. A dita alteração pode refletir um aumento ou uma diminuição na quantidade ou atividade das moléculas como acima definido. Um aumento da proteína ou da atividade do marcador ou do polinucleotídeo codificando o dito marcador pode estar correlacionado com um agravamento do câncer. Uma diminuição da proteína ou da atividade do dito marcador ou do polinucleotídeo codificando a dita proteína pode estar correlacionada com uma melhora do câncer ou com a recuperação do sujeito.
[0077] A expressão “marcador” é intencionada a incluir também a proteína correspondente codificada a partir dos ditos genes marcadores hortólogos ou homólogos, mutantes funcionais, derivados funcionais, fragmentos funcionais ou análogos, isoformas, variantes de junção dos mesmos.
[0078] Quando a expressão “marcador” é aludida aos genes, é intencionada incluir também os genes ortólogos ou homólogos correspondentes, mutantes funcionais, derivados funcionais, fragmentos funcionais ou análogos, isoformas dos mesmos.
[0079] Como aqui usado “fragmentos” se refere aos polinucleotídeos tendo preferivelmente um comprimento de pelo menos 1000 nucleotídeos, 1100 nucleotídeos, 1200 nucleotídeos, 1300 nucleotídeos, 1400 nucleotídeos,
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1500 nucleotídeos.
[0080] Como aqui usado “fragmentos” se refere aos polipeptídeos tendo preferivelmente um comprimento de pelo menos 10 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 15, pelo menos 17 aminoácidos ou pelo menos 20 aminoácidos, ainda mais preferivelmente pelo menos 25 aminoácidos ou pelo menos 37 ou 40 aminoácidos, e mais preferivelmente de pelo menos 50, ou 100, ou 150 ou 200 ou 250 ou 300 ou 350 ou 400 ou 450 ou 500 aminoácidos.
[0081] O termo “polinucleotídeo” também se refere aos polinucleotídeos modificados.
[0082] Como aqui usado, o termo “vetor” se refere a um vetor de expressão, e pode estar por exemplo na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, um fago, etc. Tais vetores podem incluir plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tal como vírus da varíola, adenovirus, lentivírus, vírus do epitelioma contagioso dos galináceos, e pseudo-raiva. Números grandes de vetores adequados são conhecidos por aqueles de habilidade na técnica e são comercialmente disponíveis.
[0083] A sequência de polinucleotídeo, preferivelmente a sequência de DNA no vetor é operativamente ligada a uma sequência(s) de controle de expressão apropriada (promotor) para direcionar a síntese de mRNA. Como exemplos representativos de tais promotores, pode-se mencionar promotores procarióticos ou eucarióticos tais como CMV imediato precoce, timidina cinase do HSV, SV40 precoce e tardio, LTRs de retrovirus, e metalotioneína I de camundongo. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação de ribossoma para o início de tradução e um vetor de transcrição. O vetor pode também incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão. Além disso, os vetores preferivelmente contêm um ou mais genes
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30/113 marcadores selecionáveis para prover um traço fenotípico para a seleção de células hospedeiras transformadas tais como a di-hidro foliato redutase ou resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina na E. coli.
[0084] Como aqui usado, o termo “célula hospedeira geneticamente engenheirada” se refere às células hospedeiras que foram transduzidas, transformadas ou transfectadas com o polinucleotídeo ou com o vetor previamente descrito. Como exemplos representativos de células hospedeiras apropriadas, pode-se citar células bacterianas, tais como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, células fúngicas tais como de levedura, células de inseto tais como Sf9, células animais tais como CHO ou COS, células vegetais, etc. A seleção de um hospedeiro apropriado é julgada estar dentro do escopo daqueles versados na técnica a partir das divulgações aqui. Preferivelmente, a dita célula hospedeira é uma célula animal, e o mais preferivelmente uma célula humana.
[0085] A introdução do polinucleotídeo ou do vetor anteriormente descrito na célula hospedeira pode ser efetuada por método bem conhecido de uma pessoa de habilidade na técnica tal como transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrano, eletroporação, lipofecção, microinjeção, infecção viral, choque térmico, transformação depois da permeabilização química da membrana ou fusão de células.
[0086] O polinucleotídeo pode ser um vetor tal como por exemplo um vetor viral.
[0087] Os polinucleotídeos como acima definidos podem ser introduzidos dentro do corpo do sujeito a ser tratado como um ácido nucleico dentro de um vetor que duplica dentro das células hospedeiras e produz os polinucleotídeos ou as proteínas.
[0088] As vias de administração adequadas da composição farmacêutica da invenção incluem, mas não são limitadas à, oral, retal,
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31/113 transmucósica, intestinal, enteral, tópica, supositório, através da inalação, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, intraocular e parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular, intramedular, e subcutânea). Uma via de administração adicional adequada inclui a quimioembolização. Outros métodos de administração adequados incluem injeção, transferência viral, uso de lipossomas, por exemplo lipossomas catiônicos, ingestão oral e/ou aplicação dérmica.
[0089] Em certas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada na forma de uma unidade de dosagem (por exemplo, tablete, cápsula, bolo, etc.).
[0090] Para aplicações farmacêuticas, a composição pode estar na forma de uma solução, por exemplo uma solução, emulsão, suspensão injetáveis ou afins. O carreador pode ser qualquer carreador farmacêutico adequado. Preferivelmente, um carreador é usado que é capaz de aumentar a eficácia das moléculas de RNA para entrar nas células alvos. Os exemplos adequados de tais carreadores são lipossomas.
[0091] O modulador como acima definido é administrado em uma dosagem farmaceuticamente eficaz, que no caso de polinucleotídeos pode estar na faixa de 0,001 pg/kg de peso corporal a 10 mg/kg de peso corporal dependendo da via de administração e do tipo ou severidade da doença.
[0092] O termo “composição farmacêutica” se refere a uma preparação que esteja em tal forma como para permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nele seja eficaz, e que não contenha nenhum componente adicional que seja inaceitavelmente tóxico para um sujeito ao qual a formulação seria administrada. Na presente invenção o termo “quantidade eficaz” deve significar uma quantidade que alcance um efeito ou efeito terapêutico desejados como tal efeito é entendido por aqueles de habilidade comum na técnica. Na presente invenção, o anticorpo pode ser administrados simultânea ou sequencialmente com um outro tratamento
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32/113 terapêutico, que pode ser uma quimioterapia ou radioterapia. A invenção provê formulações compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo como aqui divulgado, um tampão mantendo o pH na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 8,5, e, opcionalmente, um tensoativo. As formulações são tipicamente para um anticorpo como aqui divulgado, fragmentos de ligação de antígeno recombinantes ou sintéticos do mesmo da invenção como concentração de princípio ativo de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml. Em certas modalidades, a concentração do anticorpo, fragmentos de ligação de antígeno recombinantes ou sintéticos do mesmo é de cerca de 0,1 mg/ml a 1 mg/ml; preferivelmente de 1 mg/ml a 10 mg/ml, preferivelmente de 10 a 100 mg/ml.
[0093] As formulações terapêuticas do anticorpo/anticorpos podem ser preparadas misturando-se o anticorpo tendo o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed., 1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas.
[0094] As composições farmacêuticas contendo o anticorpo da presente invenção podem ser fabricadas pelos processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando uma variedade de processos de mistura, dissolução, granulação, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização bem conhecidos. A formulação apropriada é dependente da via de administração escolhida. As vias parenterais são preferidas em muitos aspectos da invenção.
[0095] Para injeção, incluindo, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular e subcutânea, os compostos da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como tampão salino fisiológico ou solventes polares incluindo, sem limitação, uma pirrolidona ou sulfóxido de dimetila. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem
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33/113 unitária, por exemplo em ampolas ou em recipientes de dose múltipla. As composições úteis incluem, sem limitação, suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter adjuntos tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. As composições farmacêuticas para a administração parenteral incluem soluções aquosas de uma forma solúvel em água, tal como, sem limitação, um sal do composto ativo. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas em um veículo lipofílico. Os veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de gergelim, ésteres de ácido graxo sintéticos tais como oleato de etila e triglicerídeos, ou materiais tais como lipossomas. As suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose sódica, sorbitol, ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes e/ou agentes adequados que aumentam a solubilidade do compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril, livre de pirogênio, antes do uso. Para a administração pela inalação, o anticorpo da presente invenção pode ser convenientemente distribuído na forma de uma pulverização aerossol usando uma embalagem pressurizada ou um nebulizador e um propelente adequado. O anticorpo também pode ser formulado em composições retais tais como supositórios ou enemas de retenção, usando, por exemplo, bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos. Além das formulações anteriormente descritas, o anticorpo também pode ser formulado como preparações de depósito. Tais formulações de longa ação podem ser administradas pela implantação (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou pela injeção intramuscular. Os compostos desta invenção podem ser formulados para esta via de administração com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, em uma emulsão com
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34/113 um óleo farmacologicamente aceitável), com resinas de troca iônica, ou como um derivado escassamente solúvel tal como, sem limitação, um sal escassamente solúvel. Adicionalmente, o anticorpo pode ser distribuído usando um sistema de liberação prolongada, tal como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o agente terapêutico. Outros sistemas de distribuição tais como lipossomas e emulsões também podem ser usados.
[0096] Uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma quantidade de composto eficaz para prevenir, aliviar ou melhorar o câncer ou sintomas de retomo de câncer. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica, especialmente considerando-se a divulgação aqui. Para qualquer anticorpo usado na invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro. Depois, a dosagem pode ser formulada para o uso em modelos animais de modo a se obter uma faixa de concentração circulante que inclua a dosagem eficaz. Tal informação pode ser depois usada para determinar mais acuradamente dosagens úteis nos pacientes. A quantidade da composição que é administrada dependerá da molécula precursora nela incluída. Geralmente, a quantidade usada nos métodos de tratamento é aquela quantidade que eficazmente alcança o resultado terapêutico desejado em mamíferos. Naturalmente, as dosagens dos vários compostos podem variar um pouco dependendo do composto, taxa de hidrólise in vivo, etc. Além disso, a dosagem, naturalmente, pode variar dependendo da forma de dosagem e via de administração. A faixa apresentada acima é ilustrativa e aqueles versados na técnica determinarão a dosagem ideal do composto selecionado com base na experiência clínica e na indicação de tratamento. Além disso, a formulação, via de administração e dosagem exatas podem ser selecionadas pelo médico individual em vista da condição do paciente e da via mais eficaz de administração (por exemplo, intravenosa,
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35/113 subcutânea, intradérmica). Adicionalmente, a toxicidade e eficácia terapêutica do anticorpo e outro agente terapêutico aqui descrito podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais usando métodos bem conhecidos na técnica. E considerado que o tratamento será dado durante um ou mais ciclos até que os resultados clínico e biológico desejados sejam obtidos. A quantidade, frequência e período exatos de administração do composto da presente invenção variarão, naturalmente, dependendo do sexo, idade e condição médica do paciente assim como da severidade e tipo da doença como determinado pelo médico atendente.
[0097] O modulador da presente invenção pode compreender um único tipo de modulador ou uma pluralidade de moduladores diferentes.
[0098] A função de uma célula T reguladora pode ser inibida pela inibição da atividade e/ou expressão de marcadores ou pela diminuição do número de células positivas para tais marcadores em uma população de célula T (por exemplo pela ligação de pelo menos um dos marcadores acima e induzindo a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC)). Inibir a função de células T reguladoras em um organismo pode ser usado para realçar a resposta de célula T imune nestas circunstâncias onde uma tal resposta é desejável, tal como em um paciente que sofre de câncer.
[0099] Quando do tratamento de um paciente com câncer com um agente inibidor que se liga à proteína marcadora ou mRNA, pode-se opcionalmente coadministrar uma vacina ou terapia antitumor. Tais vacinas podem ser direcionadas para antígenos isolados ou para grupos de antígenos ou para células tumorais integrais. Pode ser desejável administrar o agente inibidor com agentes quimioterapêuticos ou junto com radioterapia.
[00100] O tratamento com agentes múltiplos não precisa ser feita usando uma mistura de agentes mas pode ser feita usando preparações farmacêuticas separadas. As preparações não precisam ser distribuídas no
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36/113 mesmo tempo exato, mas podem ser coordenadas para serem distribuídas a um paciente durante o mesmo período de tratamento, isto é, dentro de uma semana ou um mês ou entre si.
[00101] Assim uma composição compreendendo dois ingredientes ativos pode ser constituída no corpo do paciente. Qualquer tratamento antitumor adequado pode ser coordenado com os tratamentos da presente invenção alvejadas para os marcadores. Similarmente, se o tratamento de pacientes com infecções, outros agentes anti-infecção podem ser coordenados com o tratamento da presente invenção alvejada para os marcadores. Tais agentes podem ser fármacos, vacinas, anticorpos, de molécula pequena etc.
[00102] O número de células marcadoras+ em uma população de célula T pode ser modificado usando-se um anticorpo ou outro agente que seletivamente se ligue ao marcador. As células marcadoras+ representam uma população enriquecida de células T reguladoras que podem ser introduzidas de volta dentro da fonte original das células T ou dentro de um outro hospedeiro compatível para realçar a função reguladora de célula T. Altemativamente, as células marcadoras representam uma população de células T deficientes na atividade de célula T reguladora que podem ser reintroduzidas dentro da fonte original das células T ou um outro hospedeiro compatível para inibir ou reduzir a função da célula T reguladora enquanto retêm a atividade de célula T geral.
[00103] Quaisquer meios desejados para aumentar ou diminuir (modular) a atividade marcadora podem ser usados nos métodos da invenção. Isto inclui modular diretamente a função de proteína marcadora, modular a transdução do sinal marcador, e modular a expressão de marcador nas células T modulando-se a transcrição ou a tradução ou ambas. Estes meios que seletivamente modulam a atividade marcadora são preferidos em relação aos moduladores não seletivos. Também, aqueles meios inibidores que criam uma deficiência de marcador transitória em uma população de células T que depois
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37/113 retornam aos níveis normais de atividade marcadora podem ser preferidos para tratar uma deficiência de célula T temporária. As células T transitoriamente deficientes podem ser usadas para reconstituir uma população de célula T diminuída com células T que serão geneticamente normais com respeito ao marcador. A modulação da atividade de marcador pode ser realizada nas células in vitro ou em animais inteiros, in vivo. As células que são tratadas in vitro podem ser administradas a um paciente, à fonte original das células ou a um indivíduo não relacionado.
[00104] Para inibir a função do marcador (antagonista), anticorpos marcadores ou inibidores de molécula pequena podem ser usados. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo que são úteis para este propósito serão aqueles que podem se ligar ao marcador e bloquear a sua capacidade para funcionar. Tais anticorpos podem ser anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única, moléculas MHC classe II solúveis, fragmentos de anticorpo, etc. [00105] Os anticorpos gerados contra polipeptídeos marcadores podem ser obtidos pela injeção direta dos polipeptídeos marcadores em um animal ou administrando-se polipeptídeos marcadores a um animal, preferivelmente um não humano. O anticorpo assim obtido depois ligar-se-á aos próprios polipeptídeos marcadores. Desta maneira, mesmo uma sequência codificando apenas um fragmento do polipeptídeo marcador pode ser usado para gerar anticorpos para ligar o polipeptídeo marcador nativo integral.
[00106] Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que proveja anticorpos produzidos pelas culturas contínuas de linhagem celular pode ser usada. Os exemplos incluem a técnica de hibridoma (Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), a técnica de trioma, a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72), e a técnica do hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole, et al., 1985, em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
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Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
[00107] As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Pat. U.S. No. 4.946.778) podem ser facilmente usadas para produzir anticorpos de cadeia única para polipeptídeos marcadores. Também, camundongos transgênicos podem ser usados para expressar anticorpos humanizados para polipeptídeos marcadores imunogênicos. Para realçar ou ativar a função do marcador, qualquer agente que aumente o nível do marcador ou a atividade de marcador existente na célula T pode ser usado. Tais agentes podem ser identificados usando os ensaios de triagem descritos abaixo. Os vetores de expressão codificando o marcador também podem ser administrados para aumentar a dosagem de gene. Os vetores de expressão podem ser vetores plasmídicos ou vetores virais, como são conhecidos na técnica. Qualquer vetor pode ser escolhido pelos versados na técnica quanto às propriedades particularmente desejáveis. No contexto da presente invenção, o termo “polinucleotídeo” inclui moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA, siRNA, shRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo. O polinucleotídeo pode ser de filamento único ou de filamento duplo. O polinucleotídeo pode ser sintetizado usando análogos ou derivados de oligonucleotídeo (por exemplo, inosina ou nucleotídeos de fosforotioato).
[00108] Os inibidores de RNAi como acima definidos são preferivelmente capazes de hibridizar a toda ou parte da sequência alvo específica. Portanto, os inibidores de RNAi podem ser total ou parcialmente complementares a toda ou parte da sequência alvo [00109] Os inibidores de RNAi podem hibridizar com a sequência alvo especificada sob condições de severidade média a alta.
[00110] Um dos inibidores de RNAi pode ser definido com referência a uma identidade de sequência específica para o complemento reverso da sequência à qual é intencionado alvejar. As sequências de antissentido
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39/113 tipicamente terão pelo menos cerca de 75%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com os complementos reversos das suas sequências alvo.
[00111] Os termos polinucleotídeo e polipeptídeo também incluem derivados e fragmentos funcionais dos mesmos.
[00112] No contexto da presente invenção, o pelo menos um gene ou marcador como acima definidos são preferivelmente caracterizados por pelo menos uma das sequências identificadas pelo seu Ensembl Gene ID ou Números de Acesso NCBI, como divulgados nas Tabelas VIII ou VI, ou por pelo menos uma das SEQ ID No. 1 a 709.
[00113] O termo gene aqui também inclui genes ortólogos ou homólogos, isoformas, variantes, variantes alélicas, derivados funcionais, fragmentos funcionais correspondentes do mesmo.
[00114] A expressão “proteína” é intencionada a incluir também a proteína correspondente codificada a partir de um dos genes ortólogos ou homólogos, mutantes funcionais, derivados funcionais, fragmentos funcionais ou análogos, isoformas correspondentes da mesma.
[00115] O termo “análogo” como aqui usado com referência a uma proteína significa um peptídeo modificado em que um ou mais resíduos de aminoácido do peptídeo foram substituídos por outros resíduos de aminoácido e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram deletados do peptídeo e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram deletados do peptídeo e ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados ao peptídeo. Tal adição ou deleção de resíduos de aminoácido podem ocorrer no terminal N do peptídeo e/ou no terminal C do peptídeo.
[00116] Um “derivado” pode ser uma molécula de ácido nucleico, como uma molécula de DNA, codificando o polinucleotídeo como acima definido, ou uma molécula de ácido nucleico compreendendo o
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40/113 polinucleotídeo como acima definido, ou um polinucleotídeo de sequência complementar. No contexto da presente invenção o termo “derivados” também se refere a polinucleotídeos mais longos ou mais curtos e/ou polipeptídeos tendo por exemplo uma porcentagem de identidade de pelo menos 41%, 50%, 60%, 65%, 70% ou 75%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, como um exemplo de pelo menos 90%, e ainda mais preferivelmente de pelo menos 95% ou 100% com as sequências aqui mencionadas ou com a sua sequência complementar ou com a sua sequência de DNA ou RNA correspondente. O termo “derivados” e o termo “polinucleotídeo” também incluem oligonucleotídeos sintéticos modificados. Os oligonucleotídeos sintéticos modificados são preferivelmente LNA (Ácido Nucleico Trancado), oligos fosforotiolados ou oligos metilados, morfolinos, oligonucleotídeos de 2’-O-metila, 2’-O-metoxietila e oligonucleotídeos modificados com 2’-O-metila conjugado a colesterol (antagomirs).
[00117] O termo “derivado” também pode incluir análogos de nucleotídeo, isto é, um ribonucleotídeo ou desoxirribonucleotídeo que ocorrem naturalmente substituídos por um nucleotídeo que não ocorre naturalmente.
[00118] O termo “derivados” também inclui ácidos nucleicos ou polipeptídeos que podem ser gerados pela mutação de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos na sua sequência, equivalentes ou sequências precursoras. O termo “derivados” também inclui pelo menos um fragmento funcional do polinucleotídeo.
[00119] No contexto da presente invenção “funcional” é intencionado por exemplo como “mantendo a sua atividade”.
[00120] No contexto da presente invenção, o vetor como acima definido é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em: plasmideos, vetores virais e fagos, mais preferivelmente o vetor viral é um vetor lentiviral. [00121] No contexto da presente invenção, a célula hospedeira como
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41/113 acima definida é preferivelmente selecionada do grupo consistindo em:
células bacterianas, células fúngicas, células de inseto, células animais, células vegetais, preferivelmente sendo uma célula animal.
[00122] As composições compreendendo uma mistura de anticorpos que especificamente se ligam ao(s) marcador(es); e uma vacina anticâncer pode ser fabricada in vitro. Preferivelmente a composição é fabricada sob condições que a tornam adequada para o uso como uma composição farmacêutica.
As composições farmacêuticas podem ser estéreis e livres de pirogênio. Os componentes da composição também podem ser administrados separadamente a um paciente dentro de um período de tempo tal que eles estejam ambos dentro do corpo do paciente ao mesmo tempo. Uma tal administração separada no tempo leva à formação da mistura de anticorpos e vacina dentro do corpo do paciente. Se o anticorpo e a vacina devam ser administradas em uma maneira separada no tempo, eles podem ser fornecidos juntos em um kit. Dentro do kit os componentes podem ser separadamente embalados ou contidos. Outros componentes tais como excipientes, carreadores, outros moduladores imunes ou adjuvantes, instruções para a administração do anticorpo e da vacina, e dispositivos de injeção também podem ser fornecidos no kit. Instruções podem estar em uma forma escrita, em vídeo, ou áudio, pode estar contida em papel, um meio eletrônico, ou ainda como uma referência para outra fonte, tal como um sítio da web ou manual de referência.
[00123] Os anticorpos antimarcadores da invenção podem ser usados para aumentar a magnitude da resposta anticâncer do paciente com câncer à vacina anticâncer ou terapia anticâncer. Os mesmos também podem ser usados para aumentar o número de respondedores em uma população de pacientes com câncer. Assim os anticorpos podem ser usados para superar a supressão imune encontrada em pacientes refratários às vacinas ou tratamento
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42/113 anticâncer. As vacinas anticâncer podem ser qualquer uma que seja conhecida na técnica, incluindo, mas não limitada às vacinas contra célula de tumor integrais, antígenos de tumor isolados ou polipeptídeos compreendendo um ou mais epítopos de antígenos de tumor.
[00124] A expressão de marcador em células T pode ser modulada ao nível transcricional ou traducional. Os agentes que são capazes de tal modulação podem ser identificados usando os ensaios de triagem descritos abaixo.
[00125] A tradução de mRNA marcador pode ser inibida usando-se ribozimas, moléculas de antissentido, RNA de interferência pequeno (siRNA; Ver Elbashir, S. M. et al., “Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells”, Nature 411: 494-498 (2001)) ou inibidores de molécula pequena deste processo que alveja mRNA marcador. A tecnologia de antissentido pode ser usada para controlar a expressão de gene através da formação de hélice tripla ou DNA ou RNA de antissentido, ambos destes métodos são fundamentados na ligação de um polinucleotídeo ao DNA ou RNA. Por exemplo, a porção codificando 5’ da sequência de polinucleotídeo, que codifica os polipeptídeos maduros da presente invenção, é usada para planejar um oligonucleotídeo de RNA de antissentido de cerca de 10 a 40 pares de base no comprimento. Um oligonucleotídeo de DNA é planejado ser complementar para uma região do gene envolvido na transcrição (hélice tripla — ver Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al, Science, 241: 456 (1988); e Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), prevenindo deste modo a transcrição e a produção do marcador. O oligonucleotídeo de RNA de antissentido hibridiza ao mRNA in vivo e bloqueia a tradução da molécula de mRNA no polipeptídeo marcador (Antissentido — Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)). Os oligonucleotídeos descritos acima
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43/113 também podem ser distribuídos às células pelas construções de expressão antissentido tal que o RNA ou DNA antissentido possam ser expressos in vivo para inibir a produção do marcador. Tais construções são bem conhecidas na técnica. As construções de antissentido, oligonucleotídeos antissentido, construções de interferência de RNA ou moléculas de RNA duplex siRNA podem ser usados para interferir com a expressão do marcador. Tipicamente, pelo menos 15, 17, 19, ou 21 nucleotídeos do complemento da sequência de mRNA marcador são suficientes para uma molécula de antissentido. Tipicamente pelo menos 19, 21, 22, ou 23 nucleotídeos de marcador são suficientes para uma molécula de interferência de RNA. Preferivelmente, uma molécula de interferência de RNA terá uma projeção 3’ de 2 nucleotídeos. Se a molécula de interferência de RNA é expressa em uma célula de uma construção, por exemplo de uma molécula de grampo de cabelo ou de uma repetição invertida da sequência marcadora desejada, então o mecanismo celular endógeno criará as projeções. As moléculas de siRNA podem ser preparadas pela síntese química, transcrição in vitro, ou digestão de dsRNA longos pela Rnase III ou Dicer. Estas podem ser introduzidas dentro de células pela transfecção, eletroporação, ou outros métodos conhecidos na técnica. (Ver Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418:244-251; Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7:1509-1521; Hutvagner G et aL9 RNAi : Nature harbors a double-strand. Curr. Opin. Genetics & Development 12 : 225-232, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296 : 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, and Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20: 500-505; Miyagishi M, and Taira K. (2002). U6- promoter-driven siRNAs with four uridine 3’overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20: 497-500 ; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ,
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44/113 and Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequencespecific silencing in mammalian cells. Genes & Dev. 16: 948-958 ; Paul CP, Good PD, Winer I, and Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20: 505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forester WC, and Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (6): 5515-5520; Yu J-Y, DeRuiter SL, and Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (9): 6047-6052).
[00126] Além dos moduladores conhecidos, moduladores adicionais da atividade de marcadores que são úteis nos métodos da invenção podem ser identificados usando triagem de dois híbridos, métodos de bioquímica convencionais, e técnicas de triagem com base em célula, tais como triar moléculas candidatas para uma capacidade para ligar ao marcador ou triagem quanto aos compostos que inibem a atividade de marcador na cultura celular. [00127] Isto provê um sistema de ensaio in vitro simples para triar quanto aos moduladores da atividade de marcador. O método pode identificar agentes que diretamente interagem com e modulam o marcador, assim como agentes que indiretamente modulam a atividade de marcador afetando-se uma etapa no caminho de transdução de sinal do marcador.
[00128] Ensaios com base em célula utilizando células que expressam o marcador podem utilizar células que são isoladas de mamíferos e que naturalmente expressam o marcador. Alternativamente, células que foram geneticamente engenheiradas para expressar o marcador podem ser usadas. Preferivelmente as células geneticamente engenheiradas são células T.
[00129] Agentes que modulam a atividade do marcador pela modulagem da expressão do gene marcador pode ser identificado nos ensaios de triagem com base em célula medindo-se as quantidades da proteína
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45/113 marcadora nas células na presença e ausência de agentes candidatos. A proteína marcadora pode ser detectada e medida, por exemplo, pela citometria de fluxo usando anticorpos monoclonais antimarcador específicos. O mRNA marcador também pode ser detectado e medido usando técnicas conhecidas na técnica, incluindo mas não limitadas a Northern blot, RT-PCR, e hibridização de arranjo.
[00130] De acordo com as divulgações da invenção, os inibidores de marcador podem ser administrados a um organismo para aumentar o número de células T no organismo. Este método pode ser útil para tratar organismos que sofrem de condições resultantes em uma população baixa de célula T. Tais condições incluem distúrbios envolvendo invasão ou crescimento celulares indesejados, tais como crescimento de tumor ou câncer. Os inibidores de marcador também podem ser úteis quando administrados em combinação com produtos terapêuticos convencionais para tratar distúrbios sensíveis à proliferação de célula T. Por exemplo, um tumor, que é um distúrbio sensível à proliferação de célula T, é convencionalmente tratado com um agente quimioterapêutico que funcione matando rapidamente as células que se dividem. Os inibidores de marcador da invenção quando administrados em conjunção com um agente quimioterapêutico realçam o efeito tumoricida do agente quimioterapêutico pela estimulação da proliferação de célula T para realçar a rejeição imunológica das células tumorais.
[00131] De acordo com as divulgações da invenção, ativadores de marcador (agonistas) ou realçadores de expressão podem ser administrados a um organismo para diminuir o número de células T, em particular célula T reguladora da infiltração em tumores, no organismo e deste modo diminuir a atividade de célula T nociva. Os métodos da invenção podem ser aplicados a qualquer organismo que contenha células T que expressem o marcador. Isto inclui, mas não é limitado a, qualquer mamífero e particularmente inclui seres
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46/113 humanos e camundongos.
[00132] Quando os métodos da invenção são realizados in vivo, a quantidade eficaz do modulador de marcador usado variará com o modulador particular que é usado, a condição particular que é tratada, a idade e condição física do sujeito que é tratado, a severidade da condição, a duração do tratamento, a natureza da terapia concorrente (se alguma), a via específica de administração e fatores similares dentro do conhecimento e perícia do profissional de saúde. Por exemplo, uma quantidade eficaz pode depender do grau no qual um indivíduo tem níveis anormalmente diminuídos de células T. [00133] Quando administradas, as preparações farmacêuticas da invenção são aplicadas em quantidades farmaceuticamente aceitáveis e em composições farmaceuticamente aceitáveis. Tais preparações podem rotineiramente conter sal, agentes de tamponização, preservantes, carreadores compatíveis, e opcionalmente outros agentes terapêuticos. Quando usados em medicina, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamente aceitáveis podem ser convenientemente usados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo e não são excluídos do escopo da invenção. Tais sais farmacológica e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados àqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico, e afins. Também, os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados como sais de metal alcalino ou alcalino terroso, tais como os sais de sódio, potássio ou cálcio. Os moduladores de marcador podem ser combinados, opcionalmente, com um carreador farmaceuticamente aceitável. O termo “carreador farmaceuticamente aceitável” como aqui usado significa um ou mais enchedores, diluentes ou substâncias de encapsulação sólidos ou líquidos compatíveis que sejam adequados para a administração em um ser humano. O termo “carreador” denota um ingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou
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47/113 sintético, com o qual ο ingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes das composições farmacêuticas também são capazes de serem co-misturados com as moléculas da presente invenção, e entre si, em uma maneira tal que não haja nenhuma interação que substancialmente prejudicaria a eficácia farmacêutica desejada.
[00134] As composições farmacêuticas podem conter agentes de tamponização adequados, incluindo: ácido acético em um sal; ácido cítrico em um sal; ácido bórico em um sal; e ácido fosfórico em um sal. As composições farmacêuticas também podem conter, opcionalmente, preservantes adequados, tais como: cloreto de benzalcônio; clorobutanol; parabenos e timerosal.
[00135] As composições adequadas para a administração parenteral convenientemente compreende uma preparação aquosa estéril do agente antiinflamatório, que é preferivelmente isotônico com o sangue do receptor. Esta preparação aquosa pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos usando agentes de dispersão ou umectação e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em butano diol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados são água, solução de Ringer, e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos estéril, fixos são convencionalmente utilizado como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixo brando pode ser utilizado incluindo monoou di-glicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos tais como ácido oleico podem ser usados na preparação de injetáveis. Formulação de carreador adequada para as administrações orais, subcutâneas, intravenosas, intramusculares, etc. podem ser encontradas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.
[00136] Uma variedade de vias de administração estão disponíveis. Ο
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48/113 modo particular selecionado dependerá, naturalmente, do fármaco particular selecionado, da severidade da condição que é tratada e da dosagem requerida para a eficácia terapêutica. Os métodos da invenção, geralmente falando, podem ser praticados usando qualquer modo de administração que seja medicamente aceitável, significando qualquer modo que produza níveis eficazes dos compostos ativos sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. Tais modos de administração incluem as vias oral, retal, tópica, nasal, intradérmica, ou parenteral. O termo “parenteral” inclui as vias subcutânea, intravenosa, intramuscular, ou infusão. As vias intravenosa ou intramuscular não são particularmente adequadas para a terapia e profilaxia de longa duração. Elas, entretanto, seriam preferidas em situações de emergência. A administração oral será preferida por causa da conveniência para o paciente assim como o programa de dosagem. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica da farmácia. Todos os métodos incluem a etapa de levar o agente ativo em associação com um carreador que constitui um ou mais ingredientes suplementares. No geral, as composições são preparadas levando-se uniforme e intimamente o agente ativo em associação com um carreador líquido, um carreador sólido finamente dividido, ou ambos, e depois, se necessário, formar o produto. As composições adequadas para a administração oral podem ser apresentadas como unidades separadas, tais como cápsulas, tabletes, pastilhas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do agente ativo. Outras composições incluem suspensões em líquidos aquosos ou líquidos não aquosos tais como um xarope, elixir ou uma emulsão.
[00137] Outros sistemas de distribuição podem incluir sistemas de distribuição de liberação com o tempo, liberação retardada ou liberação prolongada. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas do agente
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49/113 ativo, aumentando a conveniência para o sujeito e o médico. Muitos tipos de sistemas de distribuição de liberação são disponíveis e conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Eles incluem sistemas com base em polímero tais como poli (lactídeo-glicolídeo), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico, e polianidridos. Microcápsulas dos polímeros precedentes contendo fármacos que são descritos, por exemplo, na Pat. U.S. No. 5.075.109. Os sistemas de distribuição também incluem sistemas não poliméricos que são: lipídeos incluindo esteróis tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras neutras tais como mono- di- e tri-glicerídeos; sistemas de liberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas com base em peptídeo; revestimentos de cera; tabletes comprimidos usando aglutinantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos; e afins. Os exemplos específicos incluem, mas não são limitados a: (a) sistemas erosionais em que o agente anti-inflamatório está contido em uma forma dentro de uma matriz tal como aquelas descritas nas Pat. U.S. Nos. 4.452.775, 4.667.014, 4.748.034 e 5.239.660 e (b) sistemas difusionais em que um componente ativo permeia em uma taxa controlada de um polímero tal como descrito nas Pat. U.S. Nos. 3.832.253, e 3.854.480. Além disso, sistemas de distribuição de hardware com base em bomba podem ser usados, alguns dos quais são adaptados para implantação. O uso de um implante de liberação prolongada de longa duração pode ser particularmente adequado para o tratamento de condições crônicas. A liberação de longa duração, é aqui usada, significa que o implante é construído e disposto para distribuir níveis terapêuticos do ingrediente ativo durante pelo menos 30 dias, e preferivelmente 60 dias. Os implantes de liberação prolongada de longa duração são bem conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica e incluem alguns dos sistemas de liberação descritos acima. Embora a invenção tenha sido descrita com respeito aos exemplos específicos incluindo os modos
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50/113 presentemente preferidos de realizar a invenção, aqueles versados na técnica avaliarão que existem numerosas variações e permutas dos sistemas e técnicas descritos acima que caem dentro do espírito e escopo da invenção como apresentadas mas reivindicações anexas.
[00138] A invenção será ilustrada por meio de exemplos não limitantes em referência às seguintes figuras.
[00139] Figura 1. Purificação, caracterização funcional e expressão de pontos de checagem imunes em células infiltrantes em tumor.
(A) Representação da estratégia de classificação de células Treg infiltrantes em tumor ou tecido normal.
(B) Plotagens de citometria de fluxo representativa mostrando atividade supressiva de células Treg isoladas de tumor (NSCLC ou CRC), pulmão e sangue normais do mesmo paciente. 4 x 105 células T ingênuas em CD4+ rotuladas com éster carboxifluoresceína diacetato succinimidílico (CFSE) de doadores saudáveis foram cocultivadas com um número igual de células Treg durante 4 dias com um mAb específico de CD3 e células dendríticas CDlc+CDllc+. A porcentagem de células proliferantes é indicada. Os dados são representativos destes experimentos independentes.
(C) valores da expressão de RNA-seq normalizada para a contagem Z de genes dos pontos de imunochecagem são representados como um mapa de calor. As populações de célula são relatadas na parte superior do gráfico, enquanto que os nomes dos genes foram designados nas fileiras do mapa de calor. Os resultados de agrupamento hierárquico são mostrados como um dendrograma desenhado no lado esquerdo da matriz. Tecidos colônicos são indicados como C, tecidos pulmonares como L e sangue periférico como B. Ver também a Figura 6.
[00140] Figura 2. A análise da expressão diferencial identifica genes co-regulados em células Treg que infiltram tumor
Valores de expressão normalizada de contagem Z de genes
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51/113 que são preferencialmente expressos em Tregs infiltrantes em tumor (teste de
Wilcoxon Mann Whitney p < 2,2 x IO16) nos subconjuntos de célula listados são representados como plotagens de caixa. Os tecidos colônicos são indicados como C, tecidos pulmonares como L e sangue periférico como B.
[00141] Figura 3. Análise de célula única de células Treg que infiltram tumor (A) Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. Os experimentos foram realizados nas células Treg infiltrantes CRC, NSCLC, ou isoladas de sangue periférico de doadores saudáveis (PB); cinco amostras foram coletadas para cada tecido.
(B) A porcentagem de coexpressão de genes de assinatura com FOXP3 e IL2RA é representada.
(C) Os níveis de expressão dos genes de assinatura classificadas pela porcentagem de coexpressão são representados como plotagem de caixa.
(D) Distribuição de expressão (plotagens violino) em células Treg infiltrantes CRC, NSCLC ou PB. As plotagens representando as classes de ontologia de receptores, sinalização e atividade enzimática, atividade de citocina e fatores transcricionais são mostrados (teste de Wilcoxon Mann Whitney p < 0,05). O gradiente na escala cinza indica a porcentagem de células expressando cada gene nas células Treg isoladas dos três compartimentos.
(E) Análise da expressão de gene de genes de assinatura Treg de tumor em tipos de tumor diferentes. Os valores de expressão são expressos como log2 (2A-DCt).
[00142] Figura 4. Expressão de assinaturas de proteína de células Treg que infiltram tumor em amostras de CRC e NSCLC.
(A e B) Plotagens de citometria de fluxo representativa para células Treg infiltrantes em tecido normal de tumor e células Treg de sangue
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52/113 periférico analisadas quanto à expressão das proteínas indicadas.
[00143] Figura 5. Valor de prognóstico de transcritos de assinatura de células Treg que infiltram tumor.
(A) curva de sobrevivência de Kaplan-Meier comparando os transcritos de assinatura Treg na expressão de tumor alta e baixa (CCR8, MAGEH1, LAYN) normalizados ao CD3G para os estudos de CRC (n = 177) e NSCLC (n = 263). A análise univariada confirmou uma diferença significante na curva de sobrevivência global comparando pacientes com expressão alta e baixa. A significância estatística foi determinada pelo teste de log-rank. (CRC: p = 0,05 para CCR8, p = 1,48 x 10-3 para MAGEH1, p = 2,1 x 10’4 para LAYN; NSCLC: p = 0,0125 para CCR8, p = 0,035 para MAGEH1, p = 0,0131 para LAYN) Cada tabela representa as estimativas de Kaplan Meier nos pontos de tempo especificados. (B) Distribuições de expressão de CCR8, MAGEH1 e LAYN de acordo com o estagiamento de tumor no momento da cirurgia no grupo de pacientes CRC. Ver também a Figura 9.
[00144] A Figura 6 se refere à Figura 1. Análise de transcriptoma de linfócitos infiltrantes em tumor.
(A) Representação da estratégia de classificação de células Treg infiltrantes em tumor colorretal ou tecido normal.
(B) Valores de expressão de RNA-seq (contagens normalizadas) de FOXP3, TBX21 e RORC em células CD4+ Thl, Th 17 e Treg de CRC (C), NSCLC (L) ou sangue periférico (PB) de doadores saudáveis.
(C) dados de contagens normalizadas RNA-seq para pontos de checagem imunes selecionados e seus ligantes são mostrados como plotagem de histograma. Os nomes da população de célula são relatados na parte inferior de cada gráfico, enquanto os nomes de gene são mostrados na parte superior.
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53/113 [00145] Figura 7 relacionada com a Figura 3. Análise de célula única de células Treg que infiltram tumor.
[00146] Avaliação de células T CD4+ Treg, Thl, Thl7, Th2, CD8+ e expressão de marcadores de célula B (porcentagem de expressão em células) em células Treg únicas purificadas de NSCLC e CRC.
[00147] Figura 8 relacionada com a Figura 4. Comparação da expressão de BATF em células Treg CD4+ vs Thl7.
[00148] Os níveis de expressão de BATF (dados de contagens normalizadas de RNA-seq) em subconjuntos CD4+ Treg e Thl7 isolados de tecido de tumor ou sangue periférico.
[00149] A Figura 9 se refere à Figura 5. Os níveis de expressão de genes de assinatura Treg infiltrantes de tumor.
[00150] Dados de contagens normalizadas de RNA-seq de três genes de assinatura Treg infiltrantes em tumor (MAGEH1 (painel A), LAYN (painel B) e CCR8 (painel C)) através das populações de célula listada.
[00151] Figura 10. Resultados da análise de RT-PCR feita no cDNA de células Treg infiltrantes em tumor (L = NSCLC, C = CRC, - = ntc) com iniciadores específicos capazes de discriminar as isoformas de transcrito diferentes anotadas para SIRPG.
Descrição Detalhada da Invenção
Procedimentos Experimentais
Tecidos primários humanos [00152] Os tumores pulmonar e colorretal humanos primários e as contrapartes não neoplásticas foram obtidas respectivamente de quinze e catorze pacientes que passaram por cirurgia para propósitos terapêuticos em Fondazione IRCCS Ca’ Granda, Policlinico ou San Gerardo Hospitals (Itália). Os registros foram disponíveis para todos os casos e incluíram a idade dos pacientes no diagnóstico, gênero, hábito de fumar (para pacientes com câncer pulmonar), estagiamento clinicopatológico (Sobin et al., 2009), histotipo e
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54/113 grau de tumor (Tabela II). Nenhum paciente recebeu cirurgia paliativa ou quimio- e/ou radioterapia neoadjuvante. Consentimento informado foi obtido de todos os pacientes, e o estudo foi aprovado pelo Institutional Review
Board of the Fondazione IRCCS Ca’ Granda (aprovação n. 30/2014).
[00153] Câncer pulmonar de célula não pequena (NSCLC) foi cortado em pedaços e suspensões de célula única foram preparadas usando-se o Kit de Dissociação de Tumor, humano e o gentleMACS® Dissociator (Miltenyi Biotech cat. 130-095-929) de acordo com o protocolo padrão acompanhante. As suspensões de célula foram than isoladas pela centrifugação de gradiente de densidade ficoll-hypaque (Amersham Bioscience). Os espécimes de câncer colorretal (CRC) foram cortados em pedaços e incubados em DTT 0,1 mM (Sigma-Aldrich) durante 10 min, depois extensivamente lavado em HBSS (Thermo Scientific) e incubados em 1 mM de EDTA (Sigma-Aldrich) durante 50 min a 37 °C na presença de 5% de CO2. Eles foram depois lavados e incubados em solução de colagenase tipo D 0,5 mg/mL (Roche Diagnostic) durante 4 h a 37°C. Os sobrenadantes contendo linfócitos infiltrantes de tumor foram filtrados através de peneira de célula de 100 pm, centrifugados e fracionados 1800X g durante 30 min a 4°C em um gradiente de quatro etapas consistindo em soluções em Percoll a 100%, 60%, e 40% e 30% (Pharmacia). A fração de célula T foi recuperada da interface entre as camadas de Percoll a 60% e 40%.
[00154] Os subconjuntos de célula T CD4 foram purificados pela classificação de FACS usando os seguintes anticorpos conjugados com fluorocromo: anti-CD4 APC/Cy7 (Biolegend clone OKT4), anti-CD27 Pacific Blue (Biolegend, clone M-T271), anti-IL7R PE (Milteniy, clone MB15-18C9), anti-CD25 PE/Cy7 (eBioscience, clone BC96), anti-CXCR3 PE/Cy5 (BD, clone 1C6/CXCR3), anti-CCR6 APC (Biolegend, clone G034E3) e anti-CCR5 FITC (Biolegend, clone j418F1) usando um FACSAria II (BD).
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Citometria de Fluxo [00155] Para validar células de expressão de marcador de superfície foram diretamente tingidos com os seguintes anticorpos conjugados com fluorocromo e analisados pela citometria de fluxo: anti-CD4 (Biolegend, clone OKT4); anti-PD-L2 (Biolegend, Clone CL24F,10C12); anti-CD127 (eBioscience, clone RDR5); anti-BATF (eBioscience, clone MBM7C7), antiGITR (eBioscience, clone eBIOAITR), anti-CD25 (Miltenyi, clone 4E3) e anti 4-1BB (eBioscience clone 4B4) anti CCR8 (Biolegend clone L263G8) anti CD30 (eBioscience, clone Ber-H2) anti PD-L1 (Biolegend clone 29E,2A3) anti TIGIT (eBioscience, clone MBSA43) anti IL1R2 (R e D clone 34141) IL21R (Biolegend clone 2G1-K12) anti 0X40 (Biolegend clone BerACT35). O tingimento intracelular foi realizada usando kit de tingimento eBioscience Foxp3 de acordo com o protocolo do fabricante (eBioscience cat 00-5523-00). Em resumo as células foram colhidas e fixadas durante 30 min em tampão de fixação/permeabilização a 4 °C, e than tingida com anticorpo anti-FOXP3 (eBioscience, clone 236A/E7) e anti-BATF (eBioscience clone MBM7C7) em tampão de permeabilização durante 30 min a 4 °C. As células foram depois lavadas duas vezes, recolocadas em suspensão em tampão de lavagem FACS e analisadas pela citometria de fluxo.
Ensaio de supressão.
[00156] 4 x 104 células T Ingênuas4 respondedoras rotuladas com éster de carboxifluoresceína diacetato succinimidílico (CFSE) (1 μΜ) de doadores saudáveis foram cocultivados com razão E/T diferentes com células T CD127“CD25baixaCD4+ não rotulada classificadas de TILs ou PBMCs de pacientes com CRC ou NSCLC, usando FACS Aria II (BD Biosciences), na presença de células dendríticas CDllc+CDlc+ como células que apresentam antígeno e 0,5 mg/ml de mAb anti-CD3 (OKT3). A proliferação de células rotuladas com CFSE foi avaliada pela citometria de fluxo depois de cultura de 96 horas.
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Isolação de RNA e sequenciamento de RNA [00157] RNA de linfócitos infiltrantes em tumor foi isolado usando Kit de Isolação mirVana. O DNA genômico contaminante residual foi removido da fração de RNA total usando Turbo DNA-livre (Thermo Fisher). Os rendimentos de RNA foram quantificados usando o QuantiFluor RNA System (Promega) e a qualidade de RNA foi avaliada pelo Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliotecas para sequenciamento Illumina foram construídos a partir de 50 ng de RNA total com o Kit de Preparação de Amostra Illumina TruSeq RNA v2 (Conjunto A). As bibliotecas geradas foram carregadas no cBot (Illumina) para agrupamento em um HiSeq Flow Cell v3. A célula de fluxo foi depois sequenciado usando um HiSeq 2500 no modo de Alto Rendimento (Illumina). Uma rodada final emparelhada (2x125) foi realizada. Análise de dados RNA-seq [00158] Arquivos .fastq brutos foram analisados usando FastQC vO.11.3, e a remoção de adaptador foi realizada usando cutadapt 1.8. O cutadapt é conduzido tanto para as sequências reversas quanto avançadas com parâmetros default [—anywhere <adapterl> —anywhere <adapter2> —overlap 10 —times 2 -mask-adapter]. As sequências adaptadoras usadas para preparação de bibliotecas são
Adapterl:
AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTC GTATGCCGTCTTCTGCTTG (SEQ ID NO:710)
Adapter2:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGG TCGCCGTATCATT (SEQ ID NO:711) [00159] O corte foi realizado nas leituras brutas usando Trimmomatic (Bolger et al., 2014): os parâmetros padrão para codificação phred33 foram usados: ILLUMINACLIP (LEADINGS TRAILING:3
SLIDINGWINDOW:4:15), o parâmetro MINLEN foi ajustado para 50.
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Mapeamento e quantificação: O mapeamento de leituras para o genoma de referência (GRC1138) foi realizado nas leituras checadas na qualidade e cortadas usando STAR 2.4.1c: [STAR —genomeDir <index_star> — runThreadN <cpu_number> —readFilesIn <trimmed>_Rl.fastq.gz <trimmed>_R2_P.fastq.gz —readFilesCommand zcat]. A anotação de referência é Ensembl v80. A sobreposição de leituras com traços de anotação encontrados no .gtf de referência foi calculado usando HT-seq vO.6.1. O produto computado para cada amostra (contagens de leitura brutas) foi depois usado como entrada para a análise DESeq2. As contagens brutas foram normalizadas usando a função ‘rlog’ da DESeq2, e as contagens normalizadas foram usadas para realizar e visualiza resultados da Análise de Componente Principal (PCA) (usando a função ‘plotPCA’ da DESeq2).
Análise de expressão diferencial: As análises de expressão diferencial de subconjuntos CD4+ Treg/Thl/Thl7 infiltrantes de tumor vs. CD4+ Treg/Thl/Thl7 de PBMC foram realizadas usando DESeq2. Os genes suprarregulados/infrarregulados foram selecionados para as análises subsequentes se seus valores de expressão foram descobertos exceder o limiar de 0,05 FDR (correção de Benjamini-Hochberg).
Captura de células únicas, preparação de cDNA e PCR de célula única [00160] Células Treg de 5 espécimes CRC e 5 NSCLC foram isoladas como anteriormente descrito (Ver também Tabela II). As células únicas foram capturadas em um chip microfluídico no sistema Cl (Fluidigm) e o transcriptoma integrado amplificado. O cDNA foi preparado no chip usando o kit de RNA SMARTer Ultra Baixo (Clontech). As células foram carregadas no chip a uma concentração de 3-5E5 células/ml, tingidas quanto à viabilidade (ensaio de viabilidade celular LIVE/DEAD; Thermo Fisher) e imageadas pela microscopia de contraste de fase e fluorescência para avaliar o número e a viabilidade de células por sítio de captura. Apenas células únicas, vivas foram incluídas na análise. Para os experimentos de qPCR, o cDNA
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58/113 colhido foi pré-amplificado usando uma reunião 0,2X de iniciadores preparados do mesmo ensaio de expressão de gene a ser usado para qPCR. A pré-amplificação permite a amplificação específica de sequência multiplex de 78 alvos. Em detalhes, uma alíquota de 1,25 μΐ de cDNA de célula única foi pré-amplificada em um volume final de 5 μΐ usando 1 μΐ de PreAmp Master Mix (Fluidigm) e 1,25 μΐ de mistura de ensaio TaqMan (0,2x) reunidos. Ο cDNA passou pela amplificação pela desnaturação a 95°C durante 15 s, e recozimento e amplificação a 60°C durante 4 min durante 20 ciclos. Depois da ciclagem, o cDNA pré-amplificado foi diluído 1:5 adicionando-se 20 μΐ de Tampão TE até o volume de reação final de 5 μΐ para um volume total de 25 μΐ.
[00161] Os experimentos de expressão de gene de célula única foram realizados usando os chips microfluídicos DynamicArray 96x96 para PCR quantitativa (qPCR) (Fluidigm). Uma alíquota de 2,25 μΐ de cDNA amplificado foi misturada com 2,5 μΐ de TaqMan Fast Adavanced Master Mix (Thermo Fisher) e 0,25 μΐ de “agente de carregamento de amostra” da Fluidigm, depois inserido dentro de uma das entradas de “amostra” do chip. Uma alíquota de 2,5 μΐ de cada ensaio 20X TaqMan foi misturada com 2,5 μΐ de “agente de carregamento de ensaio” da Fluidigm e individualmente inserido dentro de uma das entradas “ensaio” do chip. As amostras e sondas foram carregadas em chips 96x96 usando um IFC Controller HX (Fluidigm), depois transferidos para uma leitora de PCR em tempo real BioMark (Fluidigm) seguindo as instruções do fabricante. Uma lista dos 78 ensaios TaqMan usados neste estudo é provida abaixo.
Tabela V Relacionada com a Figura 3.
Eista de Sondas TaqMan e número de ensaio usado nos experimentos de célula única RT-qPCR
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Números dos Eíjsíúos Taqman
Nome do {lent Número do Ensaio Nome do Gene Número do Ensaio
ECX2L1 A x ACP5
~ S . B.4TF H«Z33W_ssI
AHÚYLL - s S SLC3SF2 W8Ô233WJÍSÍ
KF3SL3 LAXI .Hsís5SI4W.ssI
HsSS 174764jssl
CS177 HsC03SWR_asl AZWH Wm53Wjsü
O3E4S 7174^1 EÍZ72 Es8S2mSljsa
METTL'A RtsXíXW42._ s»J. CSF2SE M8WM4_ssil
MW®55«_S33 ΪΕ3ΗΡ2 M6S34®5I_s31
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FOXF3 ' -5831 5.vm
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Análise de dados de célula única: O Limiar de Qualidade no software BioMark® Analysis é uma ferramenta qualitativa projetada para medir a “qualidade” de cada curva de amplificação. Basicamente, cada curva de amplificação é comparada com uma curva exponencial ideal e conforme a
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60/113 contagem de qualidade se aproxima de 1 mais próxima está do ideal. Quanto mais distante a curva do ideal, a sua contagem de qualidade se aproxima de 0. O corte de default de 0,65 é um valor arbitrário ajustado pela Fluidigm. Qualquer curva acima de 0,65 passa. Qualquer curva abaixo, falha. A correção de linha de base foi ajustada no Linear (Derivado)[default]. O Método do Limiar Ct foi ajustado em Auto (Detectors). Este método independentemente calcula um limiar para cada detector em um chip. Para agrupamento e análise a jusante, Cts brutos foram convertidos para Log2Exp usando-se um Limite de Detecção (LOD) de 35, que corresponde ao último ciclo de PCR. A análise de coexpressão foi realizada considerando-se tanto as amostras CRC quanto NSCLC nestes genes para os quais tanto FOXP3 quanto IL2RA foram coexpressos pelo menos a 2%. Os níveis de gene acima do fundo foram representados como plotagens violino depois da transformação na escala log2 por ggplot2 (v. 2.1.10). O gradiente de cor do violino é a porcentagem de células que estão expressando o gene de interesse e o limite superior da escala de cor é a porcentagem máxima de células que expressam um gene do conjunto de gene inteiro.
[00162] Procedimento para a remoção de transcritos cujos valores de expressão são afetados pelo efeito ‘dropouf. Os dados de qPCR de célula única são inerentemente ruidosos, e devido às limitações das tecnologias correntes os padrões de expressão de um certo número de genes podem ser afetados pelo ‘efeito dropout’. Os inventores realizaram um procedimento de seleção de gene de modo a levar em conta este efeito ‘dropout’ e descartaram aqueles genes cujos valores de expressão não puderam ser confiavelmente usados em uma comparação binária (tumor-periférico vs sangue). Os inventores adaptaram um número de distribuições paramétricas para as razões de genes detectados no número total de células tumorais (tanto NSCLC quanto CRC) e selecionaram a variável aleatória contínua Gaussiana inversa recíproca como melhor ajuste.
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61/113 [00163] Os inventores depois calcularam o valor médio da distribuição ajustada e descartaram aqueles genes cuja razão de detecção foi menor do que este valor de limiar (pelo menos 8,4% de detecção). Os inventores concluíram que estes genes são mais prováveis de serem afetados pelo efeito ‘dropout’. Com este limiar, os inventores selecionaram 45 genes para os quais um teste T não paramétrico (teste de Wilcoxon Mann Whitney p<0,05) foi realizado (comparando-se amostras de tumor vs. sangue periférico).
Meta análise de Kaplan-Meier e correlação de estágio [00164] A análise estatística foi realizada usando-se o pacote de sobrevivência R (Therneau T. 2013). Os tempos de sobrevivência foram calculados como o número de dias do diagnóstico patológico inicial até a morte, ou o número de dias do disgnóstico patológico inicial até o último momento que o paciente foi relatado estar vivo. A Kaplan-Meier (KM) foi usada para comparar os níveis de expressão altos e baixos dos transcritos de assinatura Treg da célula de tumor em pacientes com CRC (GSE17536) e NSCLC (GSE41271). Para ambos estudos a anotação foi normalizada para quatro estágios de tumor (1, 2, 3, 4). Para o estudo GSE41271 cinco pacientes foram excluídos devido à anotação incompleta ou imprecisa (GSM1012883, GSM1012884, GSM1012885, GSM1013100, GSM1012888), retendo um total de duzentos e sessenta e três pacientes. Os pacientes de ambos estudos foram rotulados como ‘Alto’ ‘Baixo’ se os seus valores de expressão relativa excederam ou não um limite de decisão (média das amostras). Os inventores definiram xy para indicar a expressão relativa do gene i para as n amostras do estudo normalizadas ao nível CD3:
.ú , = ——— ; ti - MW) j ~ 1,2,amostras :
V;
[00165] Para classificar um paciente, um limiar na ” é requerido e definido como . «AAA
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62/113 [00166] onde T(SuPerior, inferior) representa os extremos superior e inferior do limite de decisão:
( t Sitperíof Altí) '
Superior — Xj.y — Ί Inferior VXCluíãO [00167] Os inventores examinaram a significância de prognóstico de transcritos Treg de células de tumor usando-se estatísticas de classificação log; um valor p de menos do que 0,05 foi considerado estatisticamente significante.
[00168] Visto que o teste de classificação log resultou em um valor p de menos do que 0,05, uma comparação após estágio por meio da representação de plotagem de caixa foi realizada de modo a avaliar o grau de correlação entre o nível de expressão dos transcritos e os estágios de tumor no grupo de pacientes com CRC. A anotação foi normalizada para quatro estágios de tumor (1, 2, 3, 4).
NÚMEROS DE ACESSO [00169] Os números de acesso para os presentes dados são como segue: ENA: PRJEB11844 para linfócitos infiltrantes de tumor e tecido RNAseq; ArrayExpress: E-MTAB-2319 para conjuntos de dados de linfócitos humanos RNA-seq; ArrayExpress: E-MTAB-513 para o projeto Illumina Human BodyMap 2.0; GEO: GSE50760 para os conjuntos de dados RNA-seq CRC; GEO: GSE40419 para os conjuntos de dados RNA-seq NSCLC; GEO: GSE17536 para traçar o perfil de expressão de CRC pelo arranjo; e GEO: GSE41271 para traçar o perfil de expressão de NSCLC pelo arranjo.
Prognóstico de proteínas expostas na superfície e associadas com membrana [00170] A probabilidade de exposição na superfície das proteínas codificadas pelos genes de interesse foi determinada por uma combinação de quatro algoritmos de prognóstico de localização de célula diferente: Yloc (Briesemeister et al, 2010), TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/
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TMHMMZ), SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) e Phobius (Kall et Em particular Yloc é um sistema interpretável que oferece modelos preditivos múltiplos na versão animal; os inventores usaram tanto a predição YLoc-LowRes em 4 locais (núcleo, citoplasma, mitocôndria, caminho secretor) quanto a predição Yloc-HighRes em 9 locais (espaço extracelular, membrana plasmática, núcleo, citoplasma, mitocôndria, retículo endoplasmático, peroxissoma, aparelho de Golgi, e lisossoma).
[00171] TMHMM e SignalP foram desenvolvidos pela unidade de bioinformática da Technical University of Denmark para o prognóstico de hélices de transmembrana e a presença e localização de sítios de clivagem de peptídeo de sinal nas sequências de aminoácido, respectivamente. Phobius é uma topologia de transmembrana e prognosticador de peptídeo de sinal combinados.
Análise de RT-PCR de isoformas de transcrito expressas pelas células T reguladoras da infiltração em tumor (células Treg) [00172] O RNA total foi extraído das células de tumor Treg (NSCLC ou CRC) usando o kit de isolação de RNA miRCURY (Exiqon) e 1 pg foi transcrito reverso com iScript reverse transcription supermix (BIORAD). Subsequentemente, 25 pg de cDNA foram amplificados com DreamTaq Green PCR Master Mix (ThermoScientific) usando iniciadores específicos de gene múltiplo capazes de discriminar as isoformas diferentes. Os produtos de PCR foram conduzidos em gel de agarose. A expressão de transcritos específicos foi avaliada com base no tamanho de faixa esperado.
Resultados
Células Tregs Infiltrantes de Tumor Suprarregulam Pontos de Checagem Imunes e São Altamente Supressivas [00173] Para avaliar o cenário da expressão de gene de células T CD4+ infiltrantes de tumor, os inventores isolaram subconjuntos de linfócitos CD4+ diferentes de dois tumores diferentes, NSCLC e CRC, dos tecidos normais
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64/113 adjacentes, e de amostras de sangue periférico. De todos estes tecidos, os inventores purificaram pela citometria de fluxo (Figs. IA e 6A e 6B) células
Treg CD4+ (36 amostras de 18 indivíduos), Thl (30 amostras de 21 indivíduos) e Thl7 (22 amostras de 14 indivíduos) (Tabela I e Tabela II).
Tabela 1. Purificação e Sequei Primário Humano adanteato de RNA de Subconjuntos de Ltnfódto
Fenódpo Número de Leitoras Tecido Subconjimto de classificação A mostras Mapeadas · Μ)
NSCLC ”cm* Trsg cm* cmar· CD2Õ*
cm* III cm* CXCR3* CCR6 8 403
cm* ill cm* CCR6* CXCR3 8 308
CRC cm* cm* 03127 CD25* 488
cm* ill cm* CXCR3* CCR 6 s 2£8
cm* ill cm* CCR6* CXCR3 308
Pslnsno llllliiiiiiiiii normal) cm* M|il Cm* 03127 CD2S* 1 irenms.o i Í||®B 73
cm* ill cm* CXCR3* ccRr i iremòào ; 7δ
: tecido normal) cm* Bill! CD4* CD 12.7 GD2S* ·ιι· 404
cm* III cm* cxcrs* CCR3 8 352
cm* ill Cm*CCR6+ GXCR3 β .234
PR fdoador saudável: cm* ill Cm*CD127 CD25* 8 233
cm* 1111 cm* CXCR3* CCR8 3 70
cm* III cm* CCR6* CXCR3 8 F7
Para cada m dos subconjuntos de célula perfdadas pelo tecido de* sequenciamento de RNA de origem, combinações de marcador de superfície usadas para a classificação, número de amostras perfiladas, assim como o.„ número de leituras de sequenciamento mapeadas são indicados. M, milhão;* CRC, câncer colorretal; NSCLC, câncer pulmonar de célula não pequena; PB, sangue periférico
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Tabela II relacionada com a Tabela I. Informação de pacientes e análise histológica.
[00174] Para cada subconjunto de célula perfilado pelo sequenciamento de RNA, os registros de paciente são mostrados incluindo: idade no diagnóstico, gênero, hábito de fumar (para pacientes com câncer de pulmão), histotipo e graduação de tumor no estagiamento clinicopatológico (classificação TNM).
[00175] Para célula Treg isolada para o experimento de qPCR a mesma informação está disponível, incluindo também o número de células vivas capturadas de cada tumor e disponível para a análise de célula única.
[00176] CRC: câncer colorretal; NSCLC: câncer pulmonar de célula não pequena; (T): Amostra de Tumor; (H): Tecido Saudável; ADC: Adenocarcinoma; SCC: Carcinoma de Célula Escamosa; MUC ADC: Adenocarcinoma com Muco.
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Lista de Pacientes com NSCLC (sequenciamento de RNA) (T)Thl (T)Thl7 (T)Treg (H)Thl (H)Thl7 (H)Treg Hábito de Fumar Situação Gênero Idade (anos) Histotipo Principal Subtipo ADCA (predominante) Grau pTNM: T pTNM: N pTNM: M Estágio
PACIENTEI SQ 0342 Fumante anterior >15a Vivo M 84 SCC G3 2b 0 0 IA
PACIENTE2 SQ 0339 Fumante anterior <15a Vivo M 83 SCC G3 2a 0 0 18
PACIENTE3 SQ 0365 SQ 0375 Fumante anterior <15a Vivo M 72 SCC G3 2 2 0 MA
PACIENTE4 SQ 0366 SQ 0374 SQ 0341 Fumante anterior >15a Vivo M 79 SCC G3 2a 0 0 18
PACIENTE5 SQ 0364 SQ 0373 SQ 0350 SQ 0351 Fumante Morto M 66 SCC G3 3 2 0 MA
PACIENTE6 SQ 0358 SQ 0336 SQ 0350 SQ 0351 Fumante anterior <15a Vivo M 71 SCC G3 4 1 0 MA
PACIENTE7 SQ 0363 SQ 0376 SQ 0334 SQ 0350 SQ 0351 Fumante anterior <15a Vivo M 78 SCC G3 2b 1 0 118
PACIENTE8 SQ 0357 SQ 0337 SQ 0350 SQ_0351 Fumante anterior <15a Vivo Com Recaída M 77 ADCA SÓLIDO G3 2 2 0 MA
PACIENTE9 SQ 0404 SQ 0408 SQ 0398 SQ 0350 SQ 0351 Fumante Vivo F 69 ADCA SÓLIDO G3 Ia 0 0 A
PACIENTE 10 SQ 0403 SQ 0407 SQ 0396 SQ 0350 SQ_0351 Fumante anterior >15a Vivo F 77 ADCA ACINAR G3 Ia 0 0 A
NSCLC = câncer pulmonar de célula não pequena ADC = Adenocarcinoma
SCC = Carcinoma de Célula Escamosa (T) = Amostra de Tumor (H) = Tecido Saudável
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Treg que infiltra tumor de NSCLC (qPCR de célula única) Hábito de Fumar Situação Gênero Idade (anos) Histotipo Principal subtipo ADCA (predominante) Grau pTNM: T pTNM: N pTNM:M Estágio Células únicas capturadas
PACIENTEI Nunca Fumou Vivo F 65 ADCA Acilar e Papilar G2 2a 0 0 IB 71
PACIENTE2 Fumante anterior >15a Vivo M 62 ADCA SOLID G2 lb 0 0 IA 61
pPACIENTE3 Nunca Fumou Vivo F 63 ADCA ACINAR G1 la 0 0 IA 44
PACIENTE4 Fumante Vivo M 66 SCC G2 2a 0 0 IB 55
PACIENTE5 Fumante Vivo M 68 SCC G3 lb 0 0 IA 55
NSCLC = câncer pulmonar de célula não pequena ADC = Adenocarcinoma
SCC = Carcinoma de Célula Escamosa (T) = Amostra de Tumor (H) = Tecido Saudável
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Lista de Pacientes com CRC (sequenciamento de RNA) (T) Thl (T) Th 17 (T) Treg (H) Thl (H) Th 17 (H) Treg Gênero Idade (anos) Histotipo Principal Grau pTNM: T pTNM: N pTNM:M Estágio
PACIENTEI SQ 0389 SQ 0386 SQ 0387 SQ 0388 M 76 ADC G2 3 IA 0 IIIB
PACIENTE2 SQ 0427 SQ 0434 SQ 0418 F 68 ADC G2 3 0 0 IA
PACIENTE3 SQ 0423 SQ 0436 SQ 0411 M 80 ADC G2 4B 1B 0 IIIB
PACIENTE4 SQ 0426 SQ 0437 SQ 0413 SQ 0428 SQ 0439 SQ 0417 M 79 ADC G2 3 IA 0 IIIB
PACIENTE5 SQ 0425 SQ 0412 SQ 0429 SQ 0441 SQ 0422 M 78 ADC G2 3 0 0 IA
PACIENTE6 SQ 0424 SQ 0415 SQ 0431 SQ 0442 SQ 0421 M 69 MUC ADC 3 1B 0 IIIB
PACIENTE7 SQ 0435 SQ 0416 SQ 0432 SQ 0438 SQ 0420 F 84 ADC G2 4B 0 0 IIC
PACIENTE8 SQ 0414 F 75 MUC ADC 3 1C 0 IIIB
PACIENTE9 SQ 0433 SQ 0430 SQ 0440 SQ 0419 M 54 ADC G2 2 0 0 I
ADC = Adenocarcinoma
MUC ADC = Adenocarcinoma com Muco
CRIB ADC = Adenocarcinoma Criboso (T) = Subconjuntos Purificados de Amostra de Tumor (H) = Subconjuntos Purificados de Tecido Saudável
Treg que infiltra tumor de CRC (qPCR de célula única) Gênero Idade (anos) Histotipo Principal Grau pTNM: T pTNM: N pTNM: M Estágio Células únicas capturadas
PACIENTEI M 64 ADC 2 3 0 0 IIA 62
PACIENTE2 M 59 CRIB ADC 3 0 0 IIA 66
PACIENTE3 F 75 MUC ADC 4A 2B 0 IIIC 65
PACIENTE4 M 71 ADC 1 3 0 0 IIA 63
PACIENTE5 M 64 ADC 2 3 0 0 IIA 64
ADC = Adenocarcinoma
MUC ADC = Adenocarcinoma com Muco
CRIB ADC = Adenocarcinoma Criboso (T) = Subconjuntos Purificados de Amostra de Tumor (H) = Subconjuntos Purificados de Tecido Saudável
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68/113 [00177] Para avaliar a função da célula Treg, os inventores testaram a sua atividade supressora e mostraram que as células Treg infiltrantes de cada tipo de tecidos tumor têm uma atividade supressiva notavelmente mais forte in vitro comparado com as células Treg isoladas do tecido normal adjacente e sangue periférico dos mesmos pacientes (Figura 1B).
[00178] A fração de RNA poliadenilada extraída das células Treg CD4+, Thl, e Thl7 classificadas foi depois analisada pelo sequenciamento de RNA de extremidade emparelhada obtendo cerca de 4 bilhões de “leituras” mapeadas (Tabela I). Primeiro, os inventores examinaram dados de sequenciamento de RNA de células T CD4+ infiltrantes tanto de CRC quanto de NSCLC e seus tecidos normais emparelhados, para quantificar a expressão de mRNA de pontos de checagem imunes conhecidos e seus ligantes. Em segundo lugar, os inventores analisaram dados de RNA-seq de CRC e NSCLC, assim como de amostras de cólon e pulmão normais. Os inventores descobriram que vários pontos de checagem imunes e seus transcritos ligantes foram surpreendentemente suprarregulados em células Treg que infiltram tumor comparadas com células Treg derivadas tanto de tecido normal quanto de sangue periférico, assim como com subconjuntos de linfócitos T e B purificados de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) (Figuras 1C e 6C e Tabela III).
[00179] A Tabela III se refere à Figura 1. Os níveis de expressão de genes dos pontos de checagem imunes em todos os subconjuntos analisados.
Treg_Tumor_I nfiltrante Treg_Tumor_I nfiltrante Treg_Tecido_I nflitratante Treg_Tecido_I nflitrante Treg saudável
NOME GENE CRC NSCLC Cólon Pulmão Sangue Periférico
ADORA2A 14,69 24,06 17,97 44,84 18,52
BTLA 554,04 742,11 389,51 208,76 108,2
BTNL2 (BTLN2) 0 0,14 0,29 0 0,75
C10orf54 (VISTA) 779,38 872,36 555,47 1405,63 1111,37
CD 160 58,39 38,24 51,87 34,54 36,55
CD200 268,39 283,21 282,05 104,64 99,59
CD200R1 95,89 136,08 81,36 349,99 59,03
CD244 34,46 31,21 29,59 128,35 47,8
CD27 710,13 1068,55 583,58 496,38 468,93
CD274 (PD-L1) 1050,94 645,66 576,59 390,71 120,19
CD276 16,85 72,3 10,44 65,98 3,61
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CD28 4770,41 4585,17 5446,29 3687,01 5179,32
CD40 112,04 161,29 80,64 93,3 34,71
CD40LG 135,51 143,07 360,09 418,55 104,22
CD44 13049,36 8518,98 13513,69 19851 16013,71
CD48 346,61 489,78 494,58 594,83 1523,63
CD70 426,35 269,38 318,97 249,48 101,67
CD80 632,12 483,34 318,48 269,06 114,41
CD86 29,52 78,86 52,72 278,86 3,87
CTLA4 6798,82 10378,3 4810,74 5340,06 4806,23
HAVCR2 (TIM-3) 577,57 633,27 265,84 487,62 49,81
HHLA2 3,41 3,66 4,47 9,28 12,7
ICOS 6830,94 7339,08 4119,2 5211,71 3398,28
ICOSLG (B7RP1) 58,02 8,86 59,13 33,5 76,5
IDO1 3,86 83,81 9,51 5,15 2,36
IDO2 0,22 2,25 1,41 5,15 1,58
KIR3DL1 (KIR) 0,38 0,43 0,28 4,64 0,9
LAG3 705,14 1956,22 2181,52 1505,63 127,02
LAIR1 277,06 194,09 551,94 874,72 346,22
LGALS9 (Galectin-9) 1175,81 1530,47 1160,89 1593,26 592,56
NRP1 7,38 36,24 8,89 106,7 8,59
PDCD1LG2 (PD-L2) 214,51 223,04 61,89 25,77 12,12
PDCD1 (PD1) 467,22 496,56 405,01 676,27 111,26
TIGIT 14821,45 14747,79 10986,74 4901,41 4611,14
TMIGD2 28,38 16,64 78,3 75,77 71,27
TNFRSF14 (HVEM) 2230,85 2677,32 2297,43 2675,7 2274,82
TNFRSF18 (GITR) 4038,86 4078,14 2871,78 3071,57 333,36
TNFRSF25 5236,86 4188,61 4986,56 5111,71 3587,58
TNFRSF4 (0X40) 4222,16 4642,56 2873,16 2992,18 400,56
TNFRSF8 (CD30) 155,59 430,23 115,57 208,24 30,89
TNFRSF9 (4-1 BB) 2921,72 3128,82 898,69 1739,13 502,86
TNFSF14 (LIGHT) 148,57 183,77 223,49 421,12 105,12
TNFSF15 1,58 3,75 0,89 25,77 1,23
TNFSF18 0,4 1,11 0,53 0 0,45
TNFSF4 (OX40LG) 110,82 136,82 100,95 98,97 16,33
TNFSF9 (CD137L) 26,79 19,48 19,72 29,9 7,41
VTCN1 (B7-H4) 1,12 4,49 1,48 1,55 2,65
[00180] Os dados de contagens normalizados para RNA-seq para genes de pontos de checagem imunes selecionados e seus ligantes em todos os subconjuntos analisados.
[00181] Estas descobertas salientam os padrões de expressão específicos de pontos de checagem imunes e seus ligantes em células Treg e efetoras infiltrantes de tumor e sugerem que a sua relevância funcional deve ser investigada diretamente nos sítios de tumor.
As Células Treg Infiltrantes de Tumor Expressam uma Assinatura de Gene Específica [00182] Os inventores depois indagaram se as células Treg que infiltram tumor seriam definidas pelos padrões de expressão de gene
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[00183] Para identificar transcritos de assinatura de células Treg que infiltram tumor, os inventores incluíram nas análises do padrão de expressão o conjunto de dados de transcriptoma que eles anteriormente obtiveram de subconjuntos de linfócitos T e B diferentes purificados a partir das PBMCs (Ranzani et al., 2015). Ao fazer isso, os inventores obtiveram uma assinatura de 328 transcritos cuja expressão é mais alta nas células Treg que infiltram tumor (teste de Wilcoxon Mann Whitney p < 2,2 x IO16) (Figura 2, e Tabela IV comparados com os outros subconjuntos de linfócito purificados de tecidos não tumorais e de PBMCs de pacientes saudáveis ou neoplásticos.
Tabela IV se refere à Figura 2. Os níveis de expressão de assinaturas de gene Treg infiltrante de tumor em todos os subconjuntos analisados.
[00184] Os valores de expressão normalizados de genes da assinatura
de Treg infi trantes de tumor através das populações de célula listadas.
Treg_Tumor_Infi Freg_Tumor_Infi rreg_Tecido_Infi Γ reg_T ecido_Infi
Nome do Gene Itrantes Itrantes Itrantes Itrantes Treg saudável
CRC NSCLC Cólon Pulmão Sangue Periférico
AC019206,1 15,41 8,72 12,89 12,04 29,46
ACAA2 305,76 499,02 497,41 526,58 614,28
ACOT9 918,3 803,71 1361,82 2180,66 1272,07
ACOX3 183,48 384,73 469,06 506,97 439,27
ACP5 267,7 837,72 859,77 1872,29 1483,27
ACSL4 1154,87 1384,88 1903,56 2170,94 2043,91
ACTA2 86,65 270,74 108,76 234,86 232,15
ACTG2 10,69 6,16 22,68 21,11 36,14
ADAM 10 2378,26 3051,7 2545,29 3600,38 3167,56
ADAT2 927,45 1272,17 1214,4 2094,25 3103,21
ADPRH 136,34 460,61 352,57 836,7 718,74
AHCYL1 914,19 1271,5 1269,55 1835,94 1711,94
AHCYL2 305,15 570,67 525,24 790,1 856,25
AKAP5 174,24 264 358,75 709,28 535,97
AKIP1 261,47 273,85 225,25 436,84 360,48
ANKRD10 2251,92 3433,73 2805,08 4192,8 4672,81
ARHGEF12 1371,05 2064,05 1536,04 3069,77 2637,79
ARHGEF4 19,42 71,47 28,87 195,02 252,84
ARL6IP5 3008,69 4385,74 4051,43 4983,16 4712,48
ARNTL2 20,4 201,3 281,95 560,77 445,13
ATP13A3 3776,14 4020,7 4688,02 6688,94 6967,94
ATP2C1 1491,87 1399,81 1553,57 2029,41 1819,78
AURKA 24,56 50,12 79,89 66,37 87,07
BATF 820,97 3325,93 1698,92 5052,64 2727,65
BCL2L1 212,64 478,8 537,61 554,11 892,28
BIRC5 14,74 20,27 20,62 25,03 44,99
C17orí96 19 174,31 159,79 239,88 377,03
C5orf63 146,45 201,44 112,88 228,2 357,09
CABLES 1 59,04 196,68 125,77 473,94 386,73
Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 78/157
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CACNB2 67,43 50,49 40,21 169,83 105,62
CADM1 113,76 602,72 115,46 1766,12 901,32
CALM3 2474,48 2829,3 2675,18 2954,03 4107,03
CARD 16 370,31 696,36 493,29 1220,7 823,89
CARD 17 41,87 96,94 54,12 101,19 132,95
CASP1 925,29 1453,84 1521,09 2028,95 1980,45
CASQ1 52,11 31,21 24,74 135,08 174,95
CCNB2 18,28 27,62 34,02 51,57 58,08
CCR8 255,66 578,27 1355,63 3127,33 2069,11
CD 177 2,36 204,74 299,99 718,58 470,27
CD27 468,93 583,58 496,38 710,13 1068,55
CD274 120,19 576,59 390,71 1050,94 645,66
CD7 1622,12 6900,01 2829,82 9053,96 6919,59
CDCA2 19,24 35,09 49,48 68,21 49,95
CDH24 57,67 57,11 89,69 148,93 105,02
CDK6 602,97 2175,36 2463,85 3580,4 3238,58
CE AC AM 1 360,01 340,84 326,28 381,79 732,86
CENPM 43,72 39,12 61,85 72,94 61,32
CEP55 56,18 88,17 223,71 220,17 273,64
CGA 1,08 13,59 22,68 334,28 9,73
CHRNA6 14,46 218,49 67,52 336,38 504,28
CHST11 1822,7 2085,92 2806,11 2790,19 2535,23
CHST2 75,46 218,75 156,7 458,24 604,97
CHST7 141,3 341,87 426,79 1087,21 333,3
CIT 89,25 105,13 155,15 150,2 262,67
CLNK 153,06 288,36 248,96 340,12 528,54
CNIH1 1028,31 1005,46 935,03 2336,95 1101,87
COL9A2 149,87 278,77 357,72 889,47 805,72
CORO1B 481,34 667,37 861,83 774,65 1040,47
COXIO 305,31 399,33 397,93 447,17 612,29
CRADD 77,04 155,66 277,31 394,31 306,61
CREB3L2 739,04 1289,66 1415,94 2984,54 2590,37
CSF1 313,09 1629,13 1609,75 2204,79 3288,67
CSF2RB 1069,75 1275,49 1290,69 2036,76 2531,99
CTLA4 4806,23 4810,74 5340,06 6798,82 10378,3
CTSC 1026,76 2196,93 2514,88 3030,74 2767,27
CTTNBP2NL 85 200,53 248,45 500,75 267,16
CX3CR1 9,57 63,99 123,71 341,79 293,28
CXCL13 1,07 255,23 1145,33 1270,98 11433,26
CYB5B 714,26 1129,39 947,4 1156,4 1221,22
CYP7B1 9,83 210,33 29,38 186,99 161,17
DCPS 153,25 210,26 210,82 191,31 271,71
DFNB31 561,87 1636,56 1727,79 4251,83 2526,15
DIRAS3 1,9 4,59 3,61 26,01 35,64
DLGAP5 7,89 14,46 20,62 27,41 49,7
DNPH1 160,15 650,05 321,13 683,55 576,77
DOC2B 10,47 3,42 5,15 14,23 238,86
DPYSL2 208,98 189,08 580,4 591,32 618,42
EBI3 7,47 103,59 56,7 148,96 200,74
ECEL1 3,7 150,7 34,02 199,17 794,51
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EML2 861,51 1601,25 1643,25 2156,04 1957,43
ENTPD1 752,88 2078,17 1447,38 4321,79 4162,57
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FAM19A2 311,38 204,56 302,57 264,46 748,09
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FAM98B 314,26 664,69 491,22 698,92 657,42
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GRSF1 1277,4 1725,67 1397,9 2899,76 2343,4
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HTATIP2 567,61 1439,29 997,4 3285,86 1576,24
ICA1 94,65 371,57 113,91 487,68 411,64
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IL1RL2 8,65 76,53 28,35 74,81 59,47
IL21R 708,61 1355,83 1715,93 3092,3 3514,36
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IL32 4332,08 13202,73 9755,92 11766,98 13883,45
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KIF14 20,18 25,43 31,96 36,73 59,61
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KIF15 20,64 29,67 51,03 41,9 68,63
KIF20A 9,84 14,93 7,22 20,97 32,72
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LHFP 1,58 10,38 9,79 18,09 63,16
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LOC388813 7,42 45,99 28,87 86,3 60,63
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MAST4 1053,08 2239,36 2198,39 3373,36 1855,42
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MICAL2 354,6 1601,79 1813,35 1910,22 3188,92
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NAB1 508,21 973,74 1261,31 1831,77 1227,51
NCALD 111,73 163,32 272,67 283,43 370,26
NCAM1 7,88 58,27 39,69 207,45 213,23
NCF4 509,63 630,55 880,39 894,67 1176,84
NCOA1 2088,38 2062,57 1941,7 2367,54 2618,11
NDFIP2 77,99 529,73 618,54 829,53 987,25
NEMP2 382,56 478,4 475,76 565,18 634,41
NETO2 145,84 559,95 773,69 1490,82 1137,73
NEURL3 4,04 29,74 12,37 24,02 35,49
NFAT5 2075,17 3880,92 3923,6 4786,04 5295,06
NFE2L3 279,28 590,19 560,29 743,24 1114,26
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NHS 7,27 18,73 55,15 60,16 159,44
NPTN 525,86 838,02 897,91 1007,87 969,1
NTNG2 117,04 296,81 534,52 669,43 1001,58
NTRK1 20,85 27,9 155,15 88,29 161,78
NUSAP1 199,28 266,11 445,86 635,51 365,17
NXT2 221,6 263,39 226,8 285,15 302,01
OSBP2 111,03 89,82 127,83 195,47 244,93
PAK2 4621,62 6173,86 5024,6 7194,78 6376,28
PAM 582,52 904,05 1069,56 1365,03 1631,64
PANX2 3,7 76,02 15,46 97,12 71,72
PAQR4 16,99 46,54 62,37 92,6 65,27
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PCTP 49,2 173,47 163,4 253,27 270,62
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PRDX3 466,56 854,12 745,34 890,58 1052,67
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RASAL1 18,87 53,37 50 87,38 238,78
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RDH10 194,04 311,58 467,51 658,5 1448,57
REXO2 487,9 832,35 648,44 852,58 987,43
RFK 378,31 396,91 292,26 460,78 452,8
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SECTM1 69,01 1347,35 725,75 2354,1 1511,04
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SH3RF2 20,9 18,3 65,98 98,4 196,34
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SLC35F2 378,22 795,55 688,64 1130,81 880,5
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SM ADI 15,34 53,93 30,41 63,54 87,46
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SOCS2 245,77 405,76 463,39 605,25 611,78
SOX4 128,76 244,57 218,04 1205,78 715,01
SPATA24 38,86 77,02 36,6 66,43 94,41
SPATC1 7,97 10,96 19,59 61,51 55,84
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TADA3 677,14 893,74 852,04 880,43 1189,01
TBC1D8 53,89 374,1 265,97 817,36 1087,39
TDRD3 461,34 383,25 520,09 584,64 643,84
TFRC 3608,04 4612,18 5640,05 8107,35 10082,21
THADA 1102,51 1505,13 1467,48 3472,21 3171,99
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TIGIT 4611,14 10986,74 4901,41 14821,45 14747,79
TM9SF2 2048,03 2689,14 2665,91 2935,98 3358,4
TMA16 172,88 180,92 137,11 304,24 192,53
TMEM140 273,98 640,28 574,73 917,16 691
TMEM184C 520,19 508,83 599,98 1170,37 519,43
TMOD1 14,75 72,22 32,47 150,93 89,62
TMPRSS3 70,84 352,78 321,64 540,8 1106,85
TMPRSS6 113,53 548,87 265,97 698,41 985,34
TNFRSF18 333,36 2871,78 3071,57 4038,86 4078,14
TNFRSF4 400,56 2873,16 2992,18 4222,16 4642,56
TNFRSF8 30,89 115,57 208,24 155,59 430,23
TNFRSF9 502,86 898,69 1739,13 2921,72 3128,82
TNIP3 28,73 485,83 213,91 324,53 419,8
TOR4A 141,27 291,3 346,9 358,98 326,51
TOX2 237,46 860,48 490,71 861,08 1264,13
TP73 7,86 31,27 39,69 78,27 93,99
TPMT 357,13 354,93 305,66 480,15 519,82
TPP1 2589,92 6024,92 4380,81 7164,96 6236,83
TPX2 106,25 89,08 184,02 150,35 202,77
TRAF3 1140,85 3231,25 2706,11 4078,84 3554,01
TRIB1 927,27 1820,64 1482,95 2402,58 1469,85
TRIM 16 160,05 115,2 121,13 240,55 210,13
TSPAN17 709,59 1721,26 1322,64 1685,38 1865,69
TSPAN5 372,4 1167,46 723,69 1230,67 1398,7
TST 3,8 26,32 26,8 39,78 41,65
TTBK1 13,41 164,27 99,48 380,69 460,64
TTC22 237,9 386,91 323,19 483,96 451,61
TWIST1 4,21 94,46 21,65 95,32 195,78
UGP2 1950,41 3283,79 2562,82 3399,18 2864,71
USP51 48,1 133,95 28,87 233,48 291,46
UXS1 1661,1 2156,16 1600,47 2614,66 1914,74
VANGL1 97,19 192,58 248,96 263,46 289,05
VDR 123 992,41 1771,6 2616,68 3656,18
VWA5A 426,29 550,67 373,7 604,53 739,57
WDHD1 101,74 126,37 140,2 136,76 193,58
WDTC1 1220,3 3855,35 2029,33 4398,54 3774,61
WSB1 2837,49 3876,77 4697,29 5090,18 5383,33
XKRX 16,06 71,84 90,2 115,05 101,81
YIPF1 310,29 351,68 285,04 354,44 456,27
YIPF6 342,01 687,07 705,14 1078,09 793,2
ZBED2 87,53 94,86 522,15 230,51 1238,63
ΖΒΤΒ38 1986,89 5405,41 3134,97 6174,05 4680,43
ZC3H12C 123,76 159,39 518,54 1191,95 985,54
ZG16B 3,42 17,03 15,46 32,31 32,59
ZMAT3 529,91 925,46 822,66 1077,17 1234,3
ZMYND8 585,94 675,31 711,84 850,29 1131,01
ZNF280C 181,86 444,81 326,28 635,21 467,78
ZNF280D 698,54 973,93 616,48 1061,55 1290,04
ZNF282 374,36 1273,4 2253,55 2562,43 3165,99
ZNF334 6,95 26,52 17,53 40,03 100,33
ZWINT 60,55 73,28 101,03 87,1 105,4
[00185] No geral, os dados mostram que as células Treg demonstram as diferenças mais pronunciadas na expressão de transcritos entre subconjunto de células infiltrantes T CD4+ de tecidos normal e de tumor. Os inventores definiram um subconjunto de genes de assinatura que descreve o perfil de expressão de gene específico de células Treg que infiltram tumor.
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A assinatura de Gene de Células Treg Infiltrantes de Tumor Está Presente em Tumores Humanos Primários e Metastáticos [00186] Os inventores depois observaram ao nível de célula única quanto ao perfil de expressão diferencial de genes de assinatura de células Treg que infiltram tumor. Os inventores isolaram células T CD4+ de 5 amostras de tumor CRC e 5 NSCLC assim como de 5 PBMCs de indivíduos saudáveis (Tabela II), células Treg purificadas, e usando um sistema microfluídico automatizado (Cl Fluidigm) capturaram células únicas (um total de 858 células Treg: 320 de CRC e 286 de NSCLC; 252 de PBMCs de indivíduos saudáveis). Os inventores depois avaliaram pela RT-qPCR de alto rendimento (Biomark HD, Fluidigm) a expressão de 79 genes selecionados dentre os genes de assinatura de célula Treg de tumor altamente expressados (>10 FKPM) (Figura 3A, 3C e 7).
[00187] Notavelmente, foi descoberto que a vasta maioria (75 em 79; 95%) das assinaturas Treg de célula infiltrante de tumor foi coexpressa com marcadores de célula Treg genuínos (isto é, FOXP3+ e 1L2RA) (Figura 3B). A porcentagem de coexpressão entre estes marcadores de célula Treg e os 79 genes selecionados dentre os genes de assinatura de célula Treg infiltrantes de tumor variaram entre 81% de T1G1T e 0,59% de CGA (Figura 3B). A expressão de genes de assinatura Treg no RNA-seq da população de célula Treg integral correlacionou-se com a porcentagem de células únicas expressando os genes diferentes (Figura 3C). De modo a reduzir o efeito “drop-out” dos dados de célula única (isto é, eventos em que um transcrito é detectado em uma célula mas não em uma outra porque o transcrito é ‘perdido’ durante a etapa de transcrição reversa) (Kharchenko et al., 2014), um limiar (valor médio t = 8,4%) foi definido com base na distribuição de expressão para cada um dos genes transcritos e descartados abaixo deste limiar. Os quarenta e cinco transcritos de assinatura de células Treg que infiltram tumor detectados acima deste limiar foram na maioria dos casos
Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 84/157 /113 significantemente super-expressos em células Treg de ambos os tumores (39 em 45, 87%; teste de Wilcoxon Mann Whitney p<0,05) ou em um tipo de tumor (43 em 45, 96%; Figura 3D). A homogeneidade das células Treg infiltrantes de tecido purificadas pode ser afetada pelo transporte de células de outros subconjuntos de linfócito. Para quantificar esta contaminação possível, as análises de RT-qPCR de célula única das células Treg foram realizadas incluindo marcadores específicos para outros subconjuntos de linfócitos (isto é, Thl, Th2, Thl7, Tfh, células T CD8, células B) (Figura 7). Nossos dados mostraram que apenas uma fração muito baixa das células únicas purificadas demonstraram marcadores de subconjuntos de linfócitos diferentes das células Treg (Figura 7).
[00188] A sobreposição entre os genes de assinatura nas células Treg infiltrantes de CRC e NSCLC (Figura 2) nos estimulou a avaliar se esta assinatura também foi enriquecida em células Treg infiltrantes de outros tumores. O RNA foi assim extraído de células Treg infiltrantes de câncer mamário, câncer gástrico, metástase cerebral de NSCLC, e metástase hepática de CRC. Foi descoberto pela RT-qPCR que os genes de assinatura Treg infiltrantes de tumor foram na maioria das vezes acima regulados também nestes tumores (Figura 3E).
[00189] Por toda a parte estes dados mostraram que os genes de assinatura de célula Treg infiltrantes de tumor são coexpressas ao nível de célula única com FOXP3 e IL2RA e que diversos tumores humanos primários e metastáticos expressam a assinatura de célula Treg infiltrante de tumor.
A Assinatura de Gene de Células Treg Infiltrantes de Tumor E Traduzida em uma Assinatura de Proteína.
[00190] Os inventores depois avaliaram ao nível de célula única pela citometria de fluxo a expressão de proteína de dez genes de assinatura representativos presentes em células Treg infiltrantes de CRC e NSCLC, tecidos normais adjacentes, e PBMCs de pacientes. Das dez proteínas, duas
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78/113 são proteínas (0X40 e TIGIT) cuja relevância para a biologia das células Treg foi demonstrada (Joller et al., 2014; Voo et al., 2013), sete são proteínas (BATF, CCR8, CD30, IL-1R2, IL-21R, PDL-1 e PDL-2) cuja expressão nunca foi descrita em células Treg que infiltram tumor, e uma proteína, a 4-1BB, é um receptor coestimulador expresso em diversas células hematopoiéticas, cuja expressão nas células Treg foi mostrada marcar as células ativadas por antígeno (Schoenbrunn et al., 2012). Foi verificado que todas estas proteínas foram supra-reguladas (Figs 4A e 4B), em graus diferentes, nas células Treg que infiltram tumor comparadas com as células Treg residentes em tecidos normais.
[00191] No todo, nossos dados mostram haver uma assinatura molecular de células Treg que infiltram tumor, que podem ser detectadas tanto ao nível do mRNA quanto ao nível da proteína.
A Expressão de Genes de Assinatura Treg de Tumor está negativamente correlacionada com a sobrevivência dos pacientes [00192] Em uma tentativa para correlacionar as nossas descobertas com os resultados clínicos, os inventores indagaram se a expressão dos transcritos de assinatura Treg de tumor se correlacionam com o prognóstico de doença em pacientes com CRC e NSCLC. Os inventores portanto examinaram quanto aos conjuntos de dados transcriptômicos da expressão de genes de assinatura Treg obtidos de tecidos de tumor ressecados de um grupo de 177 pacientes com CRC (GSE17536 (Smith et al., 2010) e de um grupo de 263 pacientes com NSCLC (GSE41271 - (Sato et al., 2013), e correlacionaram os níveis de expressão de gene alto e baixo com os dados de sobrevivência de 5 anos. Entre aqueles genes cuja expressão é altamente enriquecida nas células Treg que infiltram tumor, LAYN, MAGEH1 e CCR8 foram selecionados visto que eles são os três genes mais seletivamente expressos (Figura 9A-C). Para normalizar quanto às diferenças nas densidades de célula T dentro dos tecidos de tumor ressecados, os inventores
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79/113 usaram a razão entre a expressão dos genes de assinatura selecionados e
CD3G. Notavelmente, foi descoberto que a expressão alta dos três genes de assinatura está em todos os casos correlacionada com uma sobrevivência significantemente reduzida (Figura 5A). Interessantemente, também foi observado que as expressões dos três genes de assinatura aumentaram com o estagiamento do tumor de pacientes com CRC (Figura 5B).
[00193] Em conclusão, a expressão alta nas amostras de tumor integral de três genes (LAYN, MAGEH1 e CCR8) que são específica e altamente expressos em células Treg que infiltram tumor, se correlaciona com um prognóstico pobre tanto nos pacientes com NSCLC quanto nos com CRC.
Seleção de alvos potenciais especificamente super-expressos na superfície de Treg Infiltrante de Tumor [00194] Todas as isoformas de proteína anotadas codificadas pelos 328 genes e recuperáveis na base de dados pública EnsEMBL (http://www.ensembl.org) foram simultaneamente analisadas com os quatro algoritmos de prognóstico e os genes codificando pelo menos uma isoforma prognosticada ser exposta na superfície foram consideradas como alvos potenciais.
[00195] Dos 328 genes, 193 codificam pelo menos uma isoforma de proteína de superfície celular potencial na base de pelo menos um dos quatro prognosticadores. A lista de isoformas de proteína prognosticadas estar associadas com membrana está relatada na Tabela VI.
[00196] seq id No da Sequência aa da isoforma proteína
Tabela VI
Nome do gene Descrição ENSG ID release87 ENST ID ENSP ID SEQ ID No da Sequência aa da isoforma proteína
LAYN Layilina ENSG00000204381 ENST00000375614 ENSP00000364764 1
ENST00000375615 ENSP00000364765 2
ENST00000436913 ENSP00000392942 3
ENST00000525126 ENSP00000434328 4
ENST00000525866 ENSP00000434300 5
ENST00000528924 ENSP00000486561 6
ENST00000530962 ENSP00000431627 7
ENST00000533265 ENSP00000434972 8
ENST00000533999 ENSP00000432434 9
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CCR8
IL21R
Receptor quimiocina CC tipo 8
Receptor
Interleucina-21 de|ENSG00000179934 ENST00000326306
ENST00000414803
ENSP00000326432
ENSP00000390104
FUCA2
ICA1
COX 10
IL32
ETV7
ATP2C1
FAS
PEX3
TSPAN17 deENSG00000103522 ENST00000337929
ENST00000395754 __ENST00000564089
ENSGOOOOOOO1O36 ENST00000002165
ENST00000451668
Alfa-Lfucosidase plasmática ' Autoantígeno 1IENSG00000003147 da célula da ilhota
ENST00000407906
Protoheme IX ENSG00000006695 ENST00000261643 farnesiltransfer ase, mit.
Interleucina-32 ENSG00000008517 ENST00000008180
ENST00000396890
ENST00000525228
ENST00000525377
ENST00000530890
ENST00000534507
ENST00000548246
ENST00000548476
ENST00000548807
ENST00000551513
ENST00000552356 __ENST00000552936 deENSG00000010030 ENST00000339796
ENST00000627426
Fator transcrição ETV7
ATPase transportadora de cálcio tipo 2C membro 1
Ácido sintase
Fator biogênese peroxissômica 3
ENSG00000017260 ENST00000328560
ENST00000359644
ENST00000422190
ENST00000428331
ENST00000504381
ENST00000504571
ENST00000504612
ENST00000504948
ENST00000505072
ENSTOOOOO5O533O
ENST00000507194
ENST00000507488
ENST00000508297
ENST00000508532
ENST00000508660
ENST00000509662
ENST00000510168
ENST00000513801
ENST00000515854
ENST00000533801 graxo ENSG00000026103 ENST00000352159
ENST00000355279
ENST00000355740
ENST00000357339
ENST00000479522
ENST00000484444
ENST00000488877
ENST00000492756
ENST00000494410 __ENST00000612663 deENSG00000034693 ENST00000367591
- ENST00000367592
Tetraspanina- |ENSG00000048140 [ENST00000298564
ENSPOOOOO338O1O
ENSP00000379103
ENSP00000456707 'ENSP00000002165
ENSP00000398119
ENSP00000386021
ENSP00000261643
ENSP00000008180 'ENSP00000380099
ENSP00000431740
ENSP00000433866
ENSP00000433747
ENSP00000431775
ENSP00000447979
ENSP00000449483
ENSP00000448354
ENSP00000449147
ENSP00000446978
ENSP00000447033
ENSP00000342260
ENSP00000486712
ENSP00000329664
ENSP00000352665
ENSP00000402677
ENSP00000395809
ENSP00000425320
ENSP00000422489
ENSP00000425228
ENSP00000423330
ENSP00000427625
ENSP00000423774
ENSP00000427087
ENSP00000421326
ENSP00000421261
ENSP00000424783
ENSP00000424930
ENSP00000426849
ENSP00000427461
ENSP00000422872
ENSP00000422890
ENSP00000432956
ENSP00000345601
ENSP00000347426
ENSP00000347979
ENSP00000349896
ENSP00000424113
ENSP00000420975
ENSP00000425159
ENSP00000422453
ENSP00000423755
ENSP00000477997
ENSP00000356563 'ENSP00000356564
ENSP00000298564
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17 ENST00000310032 ENSP00000309036 66
ENSTOOOOO5O3O3O ENSP00000425975 67
ENST00000503045 ENSP00000425212 68
ENST00000504168 ENSP00000423957 69
ENST00000507471 ENSP00000423610 70
ENST00000508164 ENSP00000422053 71
ENST00000515708 ENSP00000426650 72
COL9A2 Colâgeno da cadeia alfa2(IX) ENSG00000049089 ENST00000372736 ENSP00000361821 73
ENST00000372748 ENSP00000361834 74
ENST00000417105 ENSP00000388493 75
NFE2L3 Fator 3 relacionado com o fator nuclear eritroide 2 ENSG00000050344 ENST00000056233 ENSP00000056233 76
TNIP3 Prot.3 que interage com TNFAIP3 ENSG00000050730 ENST00000515036 ENSP00000424284 77
LY75 Linfócito antígeno 75 ENSG00000054219 ENST00000263636 ENSP00000263636 78
YIPF1 Proteína YIPF1 ENSG00000058799 ENST00000072644 ENSP00000072644 79
ENST00000371399 ENSP00000360452 80
ENST00000412288 ENSP00000416507 81
ENST00000464950 ENSP00000432266 82
ISOC1 proteína 1 contendo o domínio da isocorismatase ENSG00000066583 ENST00000173527 ENSP00000173527 83
ENST00000514194 ENSP00000421273 84
ACSL4 Ácido graxo de cadeia longa CoA ligase 4 ENSG00000068366 ENST00000340800 ENSP00000339787 85
ENST00000469796 ENSP00000419171 86
ENST00000469857 ENSP00000423077 87
ENST00000502391 ENSP00000425408 88
ENST00000504980 ENSP00000421425 89
ENST00000508092 ENSP00000425378 90
MAST4 serina/ treonina- proteína cinase 4 assoc. Com microtúbulo ENSG00000069020 ENST00000434115 ENSP00000396765 91
LMCD1 Proteína 1 de domínios ricos em LIM e cisteína ENSG00000071282 ENST00000456506 ENSP00000405049 92
TFRC Proteína 1 receptora de transferrina ENSG00000072274 ENSTOOOOO36O11O ENSP00000353224 93
ENST00000392396 ENSP00000376197 94
ENST00000421258 ENSP00000402839 95
ENST00000426789 ENSP00000414015 96
PANX2 Panexina-2 ENSG00000073150 ENST00000159647 ENSP00000159647 97
ENST00000395842 ENSP00000379183 98
ENST00000402472 ENSP00000384148 99
FNDC3B Proteína 3B contendo o domínio tipo III de fibronectina ENSG00000075420 ENST00000336824 ENSP00000338523 100
ENST00000415807 ENSP00000411242 101
ENST00000416957 ENSP00000389094 102
ENST00000421757 ENSP00000408496 103
ENST00000423424 ENSP00000392471 104
IL12RB2 Subunidade beta-2 do receptor de interleucina-12 ENSG00000081985 ENST00000262345 ENSP00000262345 105
ENST00000371000 ENSP00000360039 106
ENST00000441640 ENSP00000400959 107
ENST00000541374 ENSP00000445276 108
ENST00000544434 ENSP00000442443 109
Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 89/157
82/113
STARD7 Proteína 7 de transferência de lipídeo relacionado com StAR, mitocondrial ENSG00000084090 ENST00000337288 ENSPOOOOO338O3O 110
SSH1 Homólogo 1 da fosfatase Slingshot de proteína ENSG00000084112 ENST00000546697 ENSP00000446652 111
ENST00000548522 ENSP00000448586 112
MGST2 Glutationa Stransferase 2 Microssômica ENSG00000085871 ENST00000265498 ENSP00000265498 113
ENST00000503816 ENSP00000423008 114
ENST00000506797 ENSP00000424278 115
ENST00000616265 ENSP00000482639 116
ACOX3 acil-coenzima A oxidase 3 peroxissômica ENSG00000087008 ENST00000514423 ENSP00000427321 117
ANKRD10 proteína 10 contendo domínio de repetição de Anquirina ENSG00000088448 ENST00000603993 ENSP00000474638 118
FKBP1A Peptidil-prolil cis-trans isomerase FKBP1A ENSG00000088832 ENST00000612074 ENSP00000480846 119
ENST00000614856 ENSP00000482758 120
ENST00000618612 ENSP00000478093 121
SIRPG Proteína gama reguladora de sinal ENSG00000089012 ENST00000216927 ENSP00000216927 122
ENST00000303415 ENSP00000305529 123
ENST00000344103 ENSP00000342759 124
ENST00000381580 ENSP00000370992 125
ENST00000381583 ENSP00000370995 126
WHRN Whirlin ENSG00000095397 ENST00000374059 ENSP00000363172 127
CENPM Proteína M centromérica ENSG00000100162 ENST00000215980 ENSP00000215980 128
ENST00000402338 ENSP00000384731 129
ENST00000402420 ENSP00000384132 130
ENST00000404067 ENSP00000384814 131
ENST00000407253 ENSP00000384743 132
NCF4 fator 4 de citosol neutro fíli co ENSG00000100365 ENST00000447071 ENSP00000414958 133
CSF2RB Subunidade beta do receptor comum de citocina ENSG00000100368 ENST00000262825 ENSP00000262825 134
ENST00000403662 ENSP00000384053 135
ENST00000406230 ENSP00000385271 136
ENST00000421539 ENSP00000393585 137
CNIH1 Homólogo 1 da proteína cornichon ENSG00000100528 ENST00000216416 ENSP00000216416 138
ENST00000395573 ENSP00000378940 139
ENST00000553660 ENSP00000452457 140
ENST00000554683 ENSP00000452466 141
ENST00000556113 ENSP00000451142 142
ENST00000557659 ENSP00000451640 143
ENST00000557690 ENSP00000451852 144
PIGU Proteína de classe M de biossíntese de âncora do fosfatidilinosit ol glicano ENSG00000101464 ENST00000217446 ENSP00000217446 145
ENST00000374820 ENSP00000363953 146
ENST00000438215 ENSP00000395755 147
NDFIP2 proteína 2 que interage com a família NEDD4 ENSG00000102471 ENST00000218652 ENSP00000218652 148
ENST00000487865 ENSP00000419200 149
ENST00000612570 ENSP00000480798 150
ENST00000620924 ENSP00000480881 151
ACP5 fosfatase ácida tipo 5 ENSG00000102575 ENST00000218758 ENSP00000218758 152
ENST00000412435 ENSP00000392374 153
Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 90/157
83/113 resistente ao tartarato
ENST00000433365
ENST00000589792
ENST00000590420
ENST00000590832
ENST00000591319
ENST00000592828
NFAT5 Fator nuclear ENSG00000102908 ENST00000567990
ENSP00000413456
ENSP00000468685 'ENSP00000468509
ENSP00000465127 ENSP00000464831 ENSP00000468767 ENSP00000455115
154
155
156
157
158
159
160
CYB5B de células T 5 ativadas
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175 tipo B
LAPTM4B
Proteína transmembrana 4B associada a lisossoma
EB 13
Citocromo b5ENSG00000103018 ENST00000307892
ENST00000512062 __ENST00000568237 de|ENSG00000104341 ENST00000445593
ENST00000517924
ENST00000521545
ENST00000619747
Interleucina-7 IENSG00000104432 'ENST00000263851
ENST00000379113
ENST00000518982
ENST00000520215
ENST00000520269
ENST00000520317 __ENST00000541183
Interleucina-27 ENSG00000105246 ENST00000221847
ENSP00000308430
ENSP00000423679
ENSPOOOOCH 64102 'ENSP00000402301
ENSP00000429868 'ENSP00000428409
ENSP00000482533
ENSP00000263851 'ENSP00000368408 'ENSP00000430272
ENSP00000428364 'ENSP00000427750 'ENSP00000427800
ENSP00000438922
ENSP00000221847 subunidade beta
PLA2G4C Fosfolipase A2ENSG00000105499 gama citossólica
ENST00000595161
ENST00000595487
ENST00000596352
ENST00000598488
ENSP00000469528 'ENSP00000471328 'ENSP00000471759
ENSP00000468972
GLCCI1
Proteína transcrito induzida deENSG00000106415
ENST00000430798 ENSP00000396171
176
177
178
179
180
MINPP1
WSB1
HTATIP2
CTSC por
Glicocorticoide
Fosfatase 1 deENSG00000107789 polifosfato de inositol múltiplo__ ' Proteína 1ENSG00000109046 contendo repetição WD e caixa SOCS ' Oxidorredutase ENSG00000109854 HTATIP2
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192 peptidase 1
VWA5A Proteína 5AENSG00000110002 contendo o domínio do fator A de von __________Willebrand__
SEC35F2 Membro F2 da ENSG00000110660 família 35 de carreador de soluto
193
194
195
196
197
198
199
VDR
Receptor da ENSG00000111424
ENST00000525071
ENST00000525815
ENST00000532513
ENST00000547065
ENSP00000434307
ENSP00000436785
ENSP00000433783
ENSP00000449074
200
201
202
203
204
Vitamina D3
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SEC24A proteína Sec24A do transporte de proteína ENSG00000113615 ENST00000398844 ENSP00000381823 205
IL1R2 Receptor tipo 2 de Interleucina-1 ENSG00000115590 ENST00000332549 ENSP00000330959 206
ENST00000393414 ENSP00000377066 207
ENST00000441002 ENSP00000414611 208
ENST00000457817 ENSP00000408415 209
IL1R1 Receptor tipo 1 de Interleucina-1 ENSG00000115594 ENST00000409288 ENSP00000386478 210
ENST00000409329 ENSP00000387131 211
ENST00000409589 ENSP00000386555 212
ENST00000409929 ENSP00000386776 213
ENST00000410023 ENSP00000386380 214
ENST00000413623 ENSP00000407017 215
ENST00000422532 ENSP00000390349 216
ENST00000424272 ENSP00000415366 217
ENST00000428279 ENSP00000410461 218
ENST00000430171 ENSP00000408101 219
ENST00000442590 ENSP00000393296 220
ENST00000450319 ENSP00000411627 221
ENST00000452403 ENSP00000401646 222
IL1RL2 Receptor tipo 2 de Interleucina 1 ENSG00000115598 ENST00000264257 ENSP00000264257 223
ENST00000421464 ENSP00000387611 224
ENST00000441515 ENSP00000413348 225
IL1RL1 Receptor tipo 1 da Interleucina-1 ENSG00000115602 ENST00000233954 ENSP00000233954 226
ENST00000311734 ENSP00000310371 227
ENST00000404917 ENSP00000384822 228
ENST00000409584 ENSP00000386618 229
ENST00000427077 ENSP00000391120 230
ENST00000447231 ENSP00000409437 231
UXS1 UDP-ácido glicurônico descarboxilase 1 ENSG00000115652 ENST00000283148 ENSP00000283148 232
ENST00000409501 ENSP00000387019 233
ENST00000441952 ENSP00000416656 234
ENST00000457835 ENSP00000399316 235
SLC25A12 proteína Arai arldo carreador mitocondrial da ligação de cálcio ENSG00000115840 ENST00000426896 ENSP00000413968 236
THADA Proteína associada ao adenoma da tireoide ENSG00000115970 ENST00000403856 ENSP00000385469 237
LEPR Receptor de Leptina ENSG00000116678 ENST00000344610 ENSP00000340884 238
ENST00000349533 ENSPOOOOO33O393 239
ENST00000371058 ENSP00000360097 240
ENST00000371059 ENSP00000360098 241
ENST00000371060 ENSP00000360099 242
ENST00000406510 ENSP00000384025 243
ENST00000616738 ENSP00000483390 244
MREG Melanorregulin a ENSG00000118242 ENST00000263268 ENSP00000263268 245
ENST00000620139 ENSP00000484331 246
FLVCR2 Proteína 2 relacionada com o receptoi do subgrupo C do vírus da leucemia felina ENSG00000119686 ENST00000238667 ENSP00000238667 247
ENST00000539311 ENSP00000443439 248
ENST00000553341 ENSP00000452584 249
ENST00000553587 ENSP00000451603 250
ENST00000554580 ENSP00000451781 251
ENST00000555027 ENSP00000452453 252
ENST00000555058 ENSP00000451104 253
ENST00000556856 ENSP00000452468 254
SOCS2 Supressor da sinalização de citocina 2 ENSG00000120833 ENST00000548537 ENSP00000448709 255
ENST00000549510 ENSP00000474888 256
Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 92/157
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RDH10
Retinol desidrogenase 10
ENSG00000121039 ENST00000240285
ENSP00000240285
257
LAX1
ENST00000519380 __ENST00000521928
Adaptador 1 da|ENSG00000122188 ENST00000367217
ENST00000442561
ZWINT transmembrana de linfócito Interador ZW10
ENSG00000122952 ENST00000489649
Acil-coenzima |ENSG00000123130 ENST00000336430
ENST00000379303
ENST00000494361
TM9SF2 iMembro 2 da|ENSG00000125304 'ENST00000376387
ACOT9
A tioesterase 9, mitocondrial
HS3ST3B1 superfamilia de transmembrana 9________
Sulfato heparana glicosamina 3deENSG00000125430 ENST00000360954
ENST00000466596 sulfotransferas e3Bl
EML2
Proteína tipo 2ENSG00000125746 |ENST00000245925 associada com o microtubule de equinoderma
ENST00000586195
ENST00000586405
ENST00000586770
ENST00000587152
ENST00000587484
ENST00000588272
ENST00000588308
ENST00000589876
ENST00000590018
ENST00000590043
ENST00000590819
ENST00000591721
ENST00000592853
ENST00000593255
MGME1 exonuclease l|ENSG00000125871 ENST00000377704
ENST00000377709
ENST00000377710 de manutenção do genoma mitocondrial
IGFLR1
MYO5C receptor 1 daENSG00000126246 ENST00000246532 > ENST00000588018
ENST00000588992
ENST00000591277
ENST00000591748
ENST00000592537
ENST00000592693 __ENST00000592889
ENSG00000128833 ENST00000261839 familia tipo
IGF
ITFG1 miosina-Vc não convencional célula imunomodulad ora de proteína
SYT11
T|ENSG00000129636 ENST00000320640
ENST00000544001
ENST00000563730
ENST00000565262
ENST00000565940
Sinaptotagmin IENSG00000132718 'ENST00000368324 a-11
SLC41A1 Membro 1 família 41 carreador soluto da ENSG00000133065 ENST00000367137 de de
ATP13A3
ATPase 13A3 ENSG00000133657 ENST00000256031
ENSP00000428132 'ENSP00000429727 'ENSP00000356186
ENSP00000406970
ENSPOOOOO47333O
ENSP00000336580 'ENSP00000368605 'ENSP00000420238
ENSP00000365567
ENSP00000354213
ENSP00000436078
ENSP00000245925 'ENSP00000465339 'ENSP00000465885 'ENSP00000465786 'ENSP00000468312 'ENSP00000465994 'ENSP00000466100 'ENSP00000468329 'ENSP00000464789 'ENSP00000468373 'ENSP00000464804 'ENSP00000464950 'ENSP00000468470 'ENSP00000468383 'ENSP00000467941 'ENSPOOOOO366933 'ENSP00000366938
ENSP00000366939
ENSP00000246532 'ENSP00000468545 'ENSP00000465962 'ENSP00000468644 'ENSP00000476009 'ENSP00000466181 'ENSP00000474913 'ENSP00000467750
ENSP00000261839
ENSP00000319918 'ENSP00000441062 'ENSP00000455630 'ENSP00000457665 'ENSP00000459192
ENSP00000357307
ENSPOOOOO3561O5
ENSP00000256031
258
259
260
261
262
263
264
265
266
267
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300
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86/113
transportador de câtion provável ENST00000429136 ENSP00000402550 304
ENST00000439040 ENSP00000416508 305
ENST00000446356 ENSP00000410767 306
ENST00000457986 ENSP00000406234 307
ENST00000619199 ENSP00000482200 308
MICAL2 Proteínametionina sulfóxido oxidase MICAL2 ENSGOOOOO133816 ENST00000379612 ENSP00000368932 309
CABLES 1 Substrato 1 de enzima CDK5 e ABL1 ENSG00000134508 ENST00000256925 ENSP00000256925 310
ENST00000579963 ENSP00000464435 311
HAVCR2 Receptor celular 2 do vírus A da hepatite ENSG00000135077 ENST00000307851 ENSP00000312002 312
ENST00000522593 ENSP00000430873 313
CGA CromograninaA ENSG00000135346 ENST00000369582 ENSP00000358595 314
ENSTOOOOO61O31O ENSP00000482232 315
ENST00000625577 ENSP00000486666 316
ENST00000627148 ENSP00000486024 317
ENSTOOOOO63O63O ENSP00000487300 318
FAIM2 Proteína salvavidas 2 ENSG00000135472 ENST00000320634 ENSP00000321951 319
ENST00000547871 ENSP00000449360 320
ENST00000550195 ENSP00000447715 321
ENST00000550635 ENSP00000449711 322
ENST00000550890 ENSP00000450132 323
ENST00000552669 ENSP00000446771 324
ENST00000552863 ENSP00000449957 325
ARHGEF4 fator de troca 4de núcleo tídeo Rho guanina ENSG00000136002 ENST00000392953 ENSP00000376680 326
SLC41A2 Membro 2 da família 41 de carreador de soluto ENSG00000136052 ENST00000258538 ENSP00000258538 327
ENST00000437220 ENSP00000391377 328
NUS API Proteína 1 nucleolar e associada a fuso ENSG00000137804 ENST00000557840 ENSP00000453428 329
ENST00000559046 ENSP00000452725 330
ADAM 10 proteína 10 contendo o domínio da desintegrina e metaloproteina se ENSG00000137845 ENST00000260408 ENSP00000260408 331
ENST00000396136 ENSP00000456542 332
ENST00000402627 ENSP00000386056 333
ENST00000439637 ENSP00000391930 334
ENST00000461408 ENSP00000481779 335
ENST00000558004 ENSP00000452704 336
ENST00000559053 ENSP00000453952 337
ENST00000561288 ENSP00000452639 338
HADHB Subunidade beta de enzima trifuncional, mitocondrial ENSG00000138029 ENST00000545822 ENSP00000442665 339
CD27 Antígeno CD27 ENSG00000139193 ENST00000266557 ENSP00000266557 340
CDH24 Caderina-24 ENSG00000139880 ENST00000267383 ENSP00000267383 341
ENST00000397359 ENSP00000380517 342
ENST00000487137 ENSP00000434821 343
ENST00000554034 ENSP00000452493 344
ENST00000610348 ENSP00000478078 345
ETFA Subunidade ENSG00000140374 ENST00000560044 ENSP00000452942 346
Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 94/157
87/113 alfa, mitocondrial da flavoproteína de transferência ___________de elétron__
KSR1 Cinase ENSG00000141068 supres sora de __________Ras 1__
SECTM1 Proteína 1ENSG00000141574 secretada e de transmembrana
ENST00000560309 ENSP00000453753 347
ENST00000580163 ENSP00000463204 348
EVA1B homólogo B daENSG00000142694 ___________proteína eva-1__
CTTNBP2 proteína
NL
ENST00000269389
ENST00000580437
ENST00000581691
ENST00000581864
ENST00000581954
ENST00000582290
ENST00000582563
ENST00000583093
ENST00000270824
ENSP00000269389
ENSP00000463904
ENSP00000463114
ENSP00000464111
ENSP00000464385
ENSP00000462294
ENSP00000463120
ENSP00000462563
ENSP00000270824
349
350
351
352
353
354
355
356
357 terminal tipoENSG00000143079
N
ENST00000271277
ENSP00000271277
358 _______CTTNBP2__
CASQ1 Calsequestrina-ENSG00000143318 _______________1__
ARL6IP5 Proteína 3 daENSG00000144746 família PR Al
ENST00000441739
ENST00000368078
ENSP00000390976
ENSP00000357057
359
360
ENST00000273258
ENSP00000273258
361
ADPRH [Proteína ENSG00000144843
ADPribosilarginina] hidrolase
PAM Peptidil-glicina ENSG00000145730 alfa-amidante monooxigenas e
RNF145 proteína 145 deENSG00000145860 dedo RING
TMEM140 proteína deENSG00000146859
Transmembran a 140__
Carboidrato ENSG00000147119 sulfotransferas e7__
Subunidade ENSG00000147434 alfa-6 do
ENST00000478935
ENST00000484921
ENST00000485444
ENST00000357003
ENST00000465513
ENST00000478399
ENST00000478927
ENST00000481816
ENST00000304400
ENST00000345721
ENST00000346918
ENST00000348126
ENST00000438793
ENST00000455264
ENST00000504691
ENST00000505654
ENST00000506006
ENST00000509832
ENST00000511477
ENST00000511839
ENST00000512073
ENST00000274542
ENST00000424310
ENST00000518802
ENST00000519865
ENST00000520638
ENST00000521606
ENST00000611185
ENST00000275767
ENSP00000420138 ENSP00000419374 ENSP00000419021 ENSP00000349496 ENSP00000417430 'ENSP00000420200 ENSP00000417528 ENSP00000419703 'ENSPOOOOO3O61OO ENSP00000302544 ENSP00000282992 ENSP00000314638 ENSP00000396493 ENSP00000403461 ENSP00000424203 ENSP00000421569 ENSP00000423611 ENSP00000423763 ENSP00000421823 ENSP00000426448 ENSP00000420851 ENSP00000274542 'ENSP00000409064 ENSP00000430955 ENSP00000430397 ENSP00000429071 ENSP00000430753 ENSP00000482720 ENSP00000275767
362
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383
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385
386
387
388
389
390
CHST7
CHRNA6
ENST00000276055 ENSP00000276055 391
ENST00000276410 ENSP00000276410__392
ENST00000533810 ENSP00000434659 393
Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 95/157
88/113 receptor de acetilcolina __________neuronal__
PTPRJ Tirosina- ENSG00000149177 proteína fosfatase eta tipo receptor
ENST00000534622 ENSP00000433871 394
NCAM1 Molécula 1 ENS G00000149294 adesão de célula neural
INPPI
Inositol ENSG00000151689 polifosfato 1fosfatase
JAKMIP1 Janus cinase eENSG00000152969 proteína 1 que interage com microtúbulo
ENST00000418331
ENST00000440289
ENST00000527952
ENST00000534219
ENST00000613246
ENST00000615445
ENST00000316851
ENST00000401611
ENST00000524916
ENST00000526322
ENST00000528158
ENST00000528590
ENST00000529356
ENST00000531044
ENST00000531817
ENST00000533073
ENST00000613217
ENST00000615112
ENST00000615285
ENST00000618266
ENST00000619839
ENST00000620046
ENST00000621128
ENST00000621518
ENST00000621850
ENST00000413239
ENST00000444194
ENST00000451089
ENST00000458193
ENST00000409021
ENST00000409371
ENSP00000400010
ENSP00000409733
ENSP00000435618
ENSP00000432686
ENSP00000477933
ENSP00000479342
ENSP00000318472
ENSP00000384055
ENSP00000478072
ENSP00000479687
ENSP00000486241
ENSP00000480269
ENSP00000482205
ENSP00000484943
ENSP00000475074
ENSP00000486406
ENSP00000479353
ENSP00000480797
ENSP00000479241
ENSP00000477835
ENSP00000480132
ENSP00000482852
ENSP00000481083
ENSP00000477808
ENSP00000480774
ENSP00000391415
ENSP00000404732
ENSP00000410662
ENSP00000412119
ENSP00000386711
ENSP00000387042
395
396
397
398
399
400
401
402
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417
418
419
420
421
422
423
424
425
RHOC
Proteína RhoCENSG00000155366 que liga GTP relacionado com Rho
ENST00000468093
ENST00000484280
ENST00000528831
ENSP00000431392
ENSP00000434310
ENSP00000432209
426
427
428
SLC16A1
Transportador ENSG00000155380 de monocarboxila to 1
CXCL13 quimiocina 13ENSG00000156234 motivo C-X-C
ENST00000369626
ENST00000429288
ENST00000443580
ENST00000458229
ENST00000538576
ENST00000286758
ENSP00000358640
ENSP00000397106
ENSP00000399104
ENSP00000416167
ENSP00000441065
ENSP00000286758
429
430
431
432
433
434
SH3RF2 ubiquitina- ENSG00000156463 proteína ligase SH3RF2 E3
ENST00000359120
ENST00000511217
ENSP00000352028
ENSP00000424497
435
436 ___________putativa__
NPTN Neuroplastina ENSG00000156642
AHCYL2
PTGIR
Adenosilhomo ENSG00000158467 cisteinase 3__ 'Receptor deENSGOOOOO16OO13 prostaciclina
ENST00000345330
ENST00000351217
ENST00000562924
ENST00000563691
ENST00000565325
ENST00000466924
ENSP00000290401
ENSP00000342958
ENSP00000456349
ENSP00000457028
ENSP00000457470
ENSP00000419346
437
438
439
440
441
442
TMPRSS3
Serina protease ENSG00000160183 de
ENST00000291294
ENST00000594275
ENST00000596260
ENST00000597185
ENST00000598865
ENST00000291532
ENST00000398397
ENSP00000291294
ENSP00000469408
ENSP00000468970
ENSP00000470566
ENSP00000470799
ENSP00000291532
ENSP00000381434
443
444
445
446
447
448
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89/113
FCRL3
PAQR4
ZG16B
SGPP2 transmembrana
450
451
452
453
454
455
456
457
458
459
460
461
462
463
464
465
466
467
ENST00000398405
ENST00000433957
ENST00000368184
ENST00000368186
ENST00000477837
ENST00000485028
ENST00000492769
ENST00000496769 e|ENSG00000162073 ' ENST00000293978 da| ENST00000318782
ENST00000572687
ENST00000574988
ENST00000576565
B|ENSG00000162078 ' ENST00000382280
ENST00000570670
ENST00000571723
ENST00000572863
Esfingosina-1- IENSG00000163082 'ENST00000321276
Proteína 3 tipoENSG00000160856 receptor de Fc
Progestina membro família receptor adipoQ do de
Homólogo da proteína de grânulo Zimogênio de
ENSP00000381442 'ENSP00000411013
ENSP00000357167
ENSP00000357169 'ENSP00000433430
ENSP00000434331
ENSP00000435487 'ENSP00000473680
ENSP00000293978 'ENSP00000321804
ENSP00000459418
ENSP00000458683 'ENSP00000460326
ENSP00000371715 'ENSP00000460793
ENSP00000458847 'ENSP00000461740
ENSP00000315137 fosfato fosfatase 2
NEURL3 |E3 ubiquitina-|ENSG00000163121 ENST00000310865
ENST00000435380 proteína ligase NEURL1B
ENSP00000479456
ENSP00000480933
468
469
KIF15
Proteína KIF15ENSG00000163808 ENST00000438321
ENSP00000406939
470
TMEM184 tipo quinesina
Proteína 184CENSG00000164168 ENST00000296582
ENSP00000296582
471
C5ORF63
MELK
FAAH2 de transmembrana i ENST00000505999 __ENST00000508208
ENSG00000164241 ENST00000296662 > ENST00000508527
ENST00000509733
ENST00000535381
ENST00000606042
ENST00000606937 _________________ENST00000607731 deENSG00000165304 ENST00000495529 leucina cinase| ENST00000536329
ENST00000536987
ENST00000543751
ENST00000626154 graxolENSGOOOOOl 65591 ' ENST00000374900
Proteína
C5orf63 tipo
Glutarredoxina ziper embrionário materno
Ácido amida hidrolase 2 de|ENSG00000166340 ENST00000299427
ENST00000436873
ENST00000528571
ENST00000528657
CX3CR1 |receptor 1 de|ENSG00000168329 ' ENST00000358309
ENST00000399220
ENST00000412814
ENST00000435290
ENST00000541347
ENST00000542107
Tetraspanin-5 IENSG00000168785 ' ENST00000305798
ENST00000505184
ENST00000508798
ENST00000511651
ENST00000511800
ENST00000515287 __ENST00000515440
UTP—glicose- |ENSG00000169764 ENST00000467999
ENST00000496334
TPP1
TSPAN5
UGP2
Proteína transferência de alfatocoferol quimiocina
CX3C
1-fosfato uridililtransfera se
ENSP00000421159 'eNSP00000425940 'ENSP00000453964 'ENSP00000475157 'ENSP00000475415 'ENSP00000454153 'ENSP00000475733 'ENSP00000475810 'ENSP00000476160 'ENSP00000487536 'ENSP00000443550 'ENSP00000439184 'ENSP00000441596 'ENSP00000486558
ENSP00000364035
ENSP00000299427
ENSP00000398136
ENSP00000434647 'ENSP00000435001 'ENSP00000351059
ENSP00000382166 'ENSP00000408835 'ENSP00000394960 'ENSP00000439140
ENSP00000444928 'ENSP00000307701
ENSP00000423916 'ENSP00000421808
ENSP00000426248
ENSP00000422548 'ENSP00000423504
ENSP00000422351
ENSP00000418642
ENSP00000420760
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GLB1
Betagalactosidase
SPATA24 proteína associada com espermatogêne se_________
Ribocinase
RBKS
NETO2
LRG1
ENSG00000170266 ENSTOOOOO3O7363
ENST00000307377
ENST00000399402
ENST00000415454
ENST00000436768
ENST00000438227
ENST00000440656
ENST00000446732 __ENST00000450835
24ENSG00000170469 ENST00000514983
ENSP00000306920 'ENSP00000305920
ENSP00000382333
ENSP00000411813
ENSP00000387989 'ENSP00000401250
ENSP00000411769
ENSP00000407365
ENSP00000403264
ENSP00000423424
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515
ENSG00000171174 ENST00000449378
Proteína 2 tipoENSG00000171208 ENSTOOOOO3O3155 e ENST00000562435
ENST00000562559
ENST00000563078 __ENST00000564667
ENSG00000171236 ENST00000306390 neuropilina toloide
Alfa-2glicoproteína rica em leucina
Proteína
FAM98B
IFAM98B
CHST11
Carboidrato sulfotransferas e 11
ENSG00000171262 ENST00000491535 __ENST00000559431
ENSG00000171310 ENST00000303694
ENST00000546689
ENST00000547956 __ENST00000549260
Enzima tipo í ENSG00000171551 ENST00000304546
ECEL1 que converte endotelina
BCL2L1
MALT1 __ENST00000409941
Proteína 1 tipo|ENSG00000171552 ENST00000307677
ENST00000376055
ENST00000376062
Proteína 1 de|ENSG00000172175 'ENST00000345724 translocação de
Bcl-2 linfoma de tecido linfoide associado com mucosa
ENST00000348428
ENST00000591792
CYP7B1
25hidroxicolester ol 7-alfahidroxilase
ENSG00000172817 ENSTOOOOO31O193
HPSE
Heparanase
VANGL1
ENSG00000173083 ENST00000311412
ENST00000405413
ENST00000507150
ENST00000508891
ENST00000509906
ENST00000512196 __ENST00000513463
Proteína 1 tipoENSG00000173218 ENST00000310260
Vang
CD7
ENST00000355485
ENST00000369509 __ENST00000369510 antígeno CD7ENSG00000173762 ENST00000312648 de célula T
ENST00000578509
ENST00000581434
ENST00000582480
ENST00000583376
ENSP00000413789
ENSP00000306726
ENSP00000455169
ENSP00000454213
ENSP00000456818
ENSP00000457133
ENSP00000302621
ENSP00000453166 'ENSP00000453926
ENSP00000305725
ENSP00000448678
ENSP00000449093 'ENSP00000450004
ENSP00000302051
ENSPOOOOO386333
ENSP00000302564
ENSP00000365223
ENSP00000365230
ENSP00000304161
ENSP00000319279
ENSP00000467222
ENSP00000310721
ENSP00000308107
ENSP00000384262
ENSP00000426139
ENSP00000421827
ENSP00000421038
ENSP00000423265
ENSP00000421365
ENSP00000310800
ENSP00000347672
ENSP00000358522
ENSP00000358523
ENSP00000312027
ENSP00000464565
ENSP00000464546
ENSP00000464182
ENSP00000463489
516
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HAPl
Proteína 1ENSG00000173805 associada com
FBXO45
CHST2 huntingtina__
Proteína 1ENSG00000174013 contendo o domínio Fbox/SPRY__
Carboidrato ENSG00000175040 sulfo transferas
RMI2 Proteína 2 daENSG00000175643 instabilidade de genoma mediada por ________RecQ__
SLC35E3 Membro E3 daENSG00000175782 família 35 do carreador de ___________soluto__
ZBTB38 Proteína 38ENSG00000177311 contendo o domínio dedo de zinco e
YIPF6
BTB
Proteína
YIPF6
ENSG00000181704
CREB3L2 proteína 2 tipoENSG00000182158 proteína 3 que liga elemento responsive ao _________AMP cíclico__
XKRX Proteína 2ENSG00000182489 relacionada com XK
CADM1 molécula 1 deENSG00000182985 adesão celular
LHFP Parceiro deENSG00000183722 fusão de Lipoma _______HMGIC__
CSF1 Fator 1ENSG00000184371 estimulador de colônia de macrófago
PTP4A3
Proteína tirosina
ENSG00000184489
ENST00000584284 ENSP00000463612 554
ENST00000455021 ENSP00000397242 555
ENST00000440469 ENSP00000389868 556
ENST00000309575 ENSP00000307911 557
ENST00000572173 ENSP00000461206 558
ENST00000398004 ENSP00000381089 559
ENST00000431174 ENSP00000403769 560
ENST00000503809 ENSP00000422051 561
ENST00000374622 ENSP00000363751 562
ENST00000451537 ENSP00000401799 563
ENST00000462683 ENSP00000417573 564
ENST00000330387 ENSP00000329140 565
ENST00000420629 ENSP00000402889 566
ENST00000456390 ENSP00000403550 567
ENST00000372956 ENSP00000362047 568
ENST00000468904 ENSP00000419884 569
ENST00000331581 ENSP00000329797 570
ENST00000452722 ENSP00000395359 571
ENST00000536727 ENSP00000440322 572
ENST00000537058 ENSP00000439817 573
ENST00000540951 ENSP00000445375 574
ENST00000542447 ENSP00000439176 575
ENST00000542450 ENSP00000442001 576
ENST00000543540 ENSP00000439847 577
ENST00000545380 ENSP00000442387 578
ENST00000612235 ENSP00000483648 579
ENST00000612471 ENSP00000483793 580
ENST00000616271 ENSP00000484516 581
ENST00000621043 ENSP00000482840 582
ENST00000621709 ENSP00000482924 583
ENST00000379589 ENSP00000368908 584
ENST00000329608 ENSP00000327513 585
ENST00000357302 ENSP00000349854 586
ENST00000369801 ENSP00000358816 587
ENST00000369802 ENSP00000358817 588
ENST00000420111 ENSP00000407317 589
ENST00000488198 ENSP00000433837 590
ENST00000525659 ENSP00000431547 591
ENST00000527192 ENSP00000434527 592
ENST00000329397 ENSP00000332274 593
ENST00000349124 ENSPOOOOO33173O 594
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OSBP2
ENST00000520105
ENST00000521578
ENST00000523147
ENST00000524028
Proteína 2 de|ENSG00000184792 'ENST00000445781 de fosfatase tipo IVA 3
ENSP00000428758
ENSP00000428976
ENSP00000428725 'ENSP00000430332
ENSP00000411497
595
596
597
598
599
METTL7A ligação oxisterol
Proteína tipo metiltransferas e
TMPRSS6 senna protease transmembrana
GCNT1
Beta-1,3galactosil-Oglicosilglicoproteina beta-l,6-Nacetilglicosami niltransferase
7A|ENSG00000185432 ENST00000332160
ENST00000547104
ENST00000548553
ENST00000550097
ENST00000550502
6IENSG00000187045 ' ENST00000346753 de ENST00000381792
I ENST00000406725
ENST00000406856
ENST00000423761
ENST00000429068 __ENST00000442782
ENSG00000187210 ENST00000376730
ENST00000442371
ENST00000444201
ENSP00000331787
ENSP00000447542
ENSP00000448785
ENSP00000448286 'ENSP00000450239
ENSP00000334962
ENSP00000371211
ENSP00000385453
ENSP00000384964 'ENSP00000400317
ENSP00000392433
ENSP00000397691 'ENSP00000365920
ENSP00000415454
ENSP00000390703
600
601
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MAGEH1
Antígeno Hl ENSG00000187601 ENST00000342972 associado com
ENSP00000343706
615 melanoma
NEMP2 proteína membrana integral envelope nuclear
NTNG2 Netrina-G2
PDGFA
2da|ENSG00000189362 ENST00000343105
ENST00000409150
ENST00000414176
ENST00000421038
ENST00000444545
ENSG00000196358 ' ENST00000372179 __ENST00000393229
AENSG00000197461 ENST00000354513 de| ENST00000400761
ENST00000402802
ENST00000405692 de
PDCD1LG 2
TOR4A
HIBCH
NTRK1
Subunidade do fator crescimento derivado plaqueta Tigante 2 da|ENSG00000197646 morte de célula programada 1 Torsina-4A 3-hidróxiisobutiril-CoA hidrolase, mitocondrial Receptor fator de
ENST00000397747
ENSG00000198113 ENST00000357503
ENSG00000198130 ENST00000392333
ENST00000414928
ENSP00000340087
ENSP00000386292 'ENSP00000404283 'ENSP00000410306 'ENSP00000403867
ENSP00000361252
ENSP00000376921 'ENSP00000346508
ENSP00000383572
ENSP00000383889
ENSP00000384673
ENSPOOOOO38O855
ENSP00000350102
ENSP00000376145
ENSP00000414820
616
617
618
619
620
621
622
623
624
625
626
627
628
629
630
631
632
633
634
635
636
ENSP00000351486
ENSP00000357179 'ENSP00000376120 'ENSP00000436804
ENSP00000431418
ENSP00000393987 doENSG00000198400 ENST00000358660 de ENST00000368196 crescimento de ENST00000392302 nervo de alta ENST00000497019 _________________ENST00000524377
ENSG00000198673 ENST00000416284 afinidade
Proteína
FAM19A2
IFAM19A2
F5
Fator coagulação V
ENST00000548780
ENST00000549379
ENST00000549958
ENST00000550003
ENST00000551449
ENST00000551619 __ENST00000552075 deENSG00000198734 ENST00000367796
ENSP00000449310
ENSP00000447584 'ENSP00000447280
ENSP00000449457
ENSP00000449632 'ENSP00000447305
ENSP00000449516
ENSP00000356770
637
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ENST00000367797 ENSP00000356771 645
GK Glicerol cinase ENSG00000198814 ENST00000378943 ENSP00000368226 646
ENST00000427190 ENSP00000401720 647
ENST00000488296 ENSP00000419771 648
INPP5F Fosfatidilinosit ideo fosfatase SAC2 ENSG00000198825 ENST00000490818 ENSP00000487706 649
ENST00000631572 ENSP00000488726 650
CD 177 Antígeno CD 177 ENSG00000204936 ENST00000378012 ENSP00000367251 651
ENST00000607855 ENSP00000483817 652
ENST00000618265 ENSP00000479536 653
LEPROT Transcrito de Sobreposição do Receptor de Leptina ENSG00000213625 ENST00000371065 ENSP00000360104 654
ENST00000613538 ENSP00000483521 655
TRIM 16 proteína 16 contendo o motivo tripartido ENSG00000221926 ENST00000579219 ENSP00000463639 656
LTA Linfotoxinaalfa ENSG00000226979 ENST00000418386 ENSP00000413450 657
ENST00000454783 ENSP00000403495 658
PROB1 Proteína 1 básica rica em prolina ENSG00000228672 ENST00000434752 ENSP00000416033 659
SSTR3 Receptor tipo 3 de somatostatina ENSG00000278195 ENST00000610913 ENSP00000480971 660
ENST00000617123 ENSP000004813 25 661
CEACAM 1 Molécula 1 de adesão celulat relacionada com antígeno carcinoembrio nário ENSG00000079385 ENST00000161559 ENSP00000161559 662
ENST00000352591 ENSP00000244291 663
ENST00000358394 ENSP00000351165 664
ENST00000403444 ENSP00000384709 665
ENST00000403461 ENSP00000384083 666
ENST00000471298 ENSP00000472633 667
ENST00000599389 ENSP00000471918 668
ENST00000600172 ENSP00000471566 669
CTLA4 Proteína 4 de linfócito I citotóxico ENSG00000163599 ENST00000295854 ENSP00000295854 670
ENST00000302823 ENSP00000303939 671
ENST00000427473 ENSP00000409707 672
ENST00000472206 ENSP00000417779 673
TIGIT Imunorreceptoi de célula I com domínios Ig e ITIM ENSG00000181847 ENST00000383671 ENSP00000373167 674
ENST00000461158 ENSP00000418917 675
ENST00000481065 ENSP00000420552 676
ENST00000484319 ENSP00000419706 677
ENST00000486257 ENSP00000419085 678
IL2RA Subunidade alfa do receptor de Interleucina-2 ENSG00000134460 ENST00000256876 ENSP00000256876 679
ENST00000379954 ENSP00000369287 680
ENST00000379959 ENSP00000369293 681
ENTPD1 Trifosfato difosfohidrolas e 1 Ectonucleosíco ENSG00000138185 ENST00000371205 ENSP00000360248 682
ENST00000371207 ENSP00000360250 683
ENST00000453258 ENSP00000390955 684
ENST00000483213 ENSP00000489333 685
ENST00000543964 ENSP00000442968 686
ENST00000635076 ENSP00000489250 687
ICOS Coestimulador de célula I indutível ENSGOOOOO1636OO ENSTOOOOO316386 ENSP00000319476 688
ENST00000435193 ENSP00000415951 689
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TNFRSF4 Membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose de tumor ENSG00000186827 ENST00000379236 ENSP00000368538 690
TNFRSF1 8 Membro 18 da superfamília do receptor do fator de necrose de tumor ENSG00000186891 ENST00000328596 ENSP00000328207 691
ENST00000379265 ENSP00000368567 692
ENST00000379268 ENSP00000368570 693
ENST00000486728 ENSP00000462735 694
TNFRSF8 Membro 8 da superfamília do receptor do fator de necrose de tumor ENSG00000120949 ENST00000263932 ENSP00000263932 695
ENST00000417814 ENSP00000390650 696
ENST00000514649 ENSP00000421938 697
CD274 Ligante 1 da morte celular programada 1 ENSG00000120217 ENST00000381573 ENSP00000370985 698
ENST00000381577 ENSP00000370989 699
IL2RB Subunidade beta do receptor de Interleucina-2 ENSG00000100385 ENST00000216223 ENSP00000216223 700
ENST00000429622 ENSP00000402685 701
ENST00000445595 ENSP00000401020 702
ENST00000453962 ENSP00000403731 703
TNFRSF9 Membro 9 da superfamília do receptor do fator de necrose de tumor ENSG00000049249 ENST00000377507 ENSP00000366729 704
ENST00000474475 ENSP00000465272 705
ENST00000615230 ENSP00000478699 706
IKZF2 Proteína Helios de dedo de zinco ENSG00000030419 ENST00000442445 ENSP00000390045 707
[00197] Os genes da Tabela VI são caracterizados pelo seu número de acesso no Ensembl Gene (ENSG), recuperável na base de dados pública EnsEMBL (http://www.ensembl.org). Cada isoforma de proteína relacionada é caracterizada por um número de acesso de transcrito Ensembl (ENST) e um número de acesso de proteína Ensembl (ENSP).
Identificação de isoformas de transcrito expressas pelas células Treg de tumor [00198] Um aspecto importante a ser verificado na seleção de alvos potenciais de Treg de tumor é se as isoformas de proteína prognosticadas a para serem expostas na superfície/associadas com membrana pelos algoritmos de localização de célula são de fato expressas em células Treg de tumor. Assim, o RNA total foi extraído das células Treg de tumor isoladas de amostras de NSCLC ou CRC e submetidas à RT-PCR usando pares de iniciador específicos capazes de discriminar as isoformas diferentes anotadas
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95/113 para cada gene. Os resultados exemplificativos de isoformas de proteína prognosticadas a serem expostas na superfície e detectadas em células Treg de tumor são relatados na Tabela VII. Além disso, um exemplo de análise de
RT-PCR realizada para SIRPG é relatado na Figura 10.
Tabela VII. Exemplos representativos de transcritos detectados nas células
Treg que infiltram tumor
SÍMBOLO DO GENE Isoforma prognosticada na superfície detectada em células Treg de tumor
CCR8 ENST00000326306
LAYN ENST00000375614 e/ou ENST00000533265 e/ou ENST00000375615 e/ou ENST00000525126
CD7 ENST00000312648 e/ou ENST00000584284
CXCL13 ENST00000286758
FCRL3 ENST00000492769 e/ou ENST00000368184 e/ou ENST00000368186 e/ou ENST00000485028
IL1R2 ENST00000332549 e/ou ENST00000393414
IL21R ENST00000337929 e/ou ENST00000395754 e/ou ENST00000564089
NTNG2 ENST00000393229
TSPAN5 ENST00000305798 e/ou ENST00000505184
TMPRSS3 ENST00000291532
TMPRSS6 ENST00000406725 e/ou ENST00000406856
NDFIP2 ENST00000218652
Debate [00199] A diversidade de células Treg que infiltram tumor deve ser totalmente elucidada para entender a sua relevância funcional e significância de prognóstico em tipos diferentes de câncer, e para possivelmente melhorar a eficácia terapêutica da modulação da célula Treg através da depleção seletiva de células Treg que infiltram tumor. A análise de transcriptoma realizada nas células T infiltrantes de CRC e NSCLC mostraram que as células Treg que infiltram tumor são diferentes das Tregs infiltrantes tanto circulantes quanto de tecido normal, sugerindo que o microambiente tumoral influencia a expressão de gene específica em células Treg. Nossas descobertas sustentam ainda a visão de que as células Treg de tecidos diferentes são instruídas pelos fatores ambientais para demonstrar perfis de expressão de gene diferentes (Panduro et al., 2016). De fato a lista de genes de assinatura inclui várias moléculas que são consistentemente suprarreguladas em células Treg que infiltram tumor isoladas de tipos de tumor diferentes, e estes genes de
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96/113 assinatura não seriam identificados se os inventores não tivessem perfilado especificamente células Treg que infiltram tumor. Foi descoberto que os genes de assinatura Treg infiltrantes de tumor não são apenas amplamente compartilhados entre células infiltrantes em CRC e NSCLC, mas são também conservados em cânceres mamários e gástricos assim como em tumores metastáticos de CRC e NSCLC (no fígado e cérebro respectivamente) sugerindo que a expressão destes genes é um traço comum das células Treg que infiltram tumor que podem se correlacionar com função específica de células Treg dentro do microambiente tumoral. Embora nosso conhecimento sobre a função dos pontos de checagem imunes nos linfócitos seja ainda incompleto, os pontos de checagem de anticorpos monoclonais agonistas ou antagonistas estão em desenvolvimento clínico. Interessantemente, foi descoberto que alguns destes pontos de checagem (tais como G1TR, 0X40, T1G1T, LAG-3 e ΊΊΜ-3) e alguns de seus ligantes (tais como OX40LG, Galectina-9, CD70) são suprarregulados também em células Treg que infiltram tumor, e este fato deve ser levado em conta na interpretação dos resultados clínicos com inibidores de checagem. De fato, é provável que a avaliação da expressão de pontos de checagem e de seus ligantes nos vários subconjuntos de linfócitos infiltrantes de tumor ajudem a elucidar resultados conflitantes e provejam a lógica para as terapias de combinação. Portanto, o padrão de expressão dos pontos de checagem devem ser avaliados tanto nos linfócitos infiltrantes de tumor quanto nas células tumorais. A análise de célula única nos genes de assinatura Treg de tumor selecionados confirmou os dados transcriptômicos integrais e proveram informação sobre a frequência de expressão destes genes. As células Treg infiltrantes de tumor expressam com genes de alta frequência que estão associados com atividade supressora aumentada, tais como os 0X40, CTLA4 e GITR bem caracterizados. Além disso, existem vários genes interessantes e menos prováveis a expressão específica dos quais foi validada também ao nível de proteína. Por exemplo, a
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97/113 suprarregulagem de IL-1R2 seria um outro mecanismo que as células Treg residentes no tumor utilizariam para moderar as respostas imunes antitumor através da neutralização da função de IL-Ιβ nas células efetoras. A expressão de PD-L1 e PD-L2 foi recentemente relatada nas células T ativadas ou APCs (Boussiotis et al., 2014; Lesterhuis et al., 2011; Messal et al., 2011) mas, segundo nossos melhores conhecimentos, nem a expressão de PD-L2 nem a de PD-L1 foram ainda relatadas nas células Treg, e nossa descoberta de que são supraexpressos nas células Treg que infiltram tumor acrescenta um nível adicional de complexidade ao eixo imunomodulatório de PDl/PD-Ls dentro do microambiente tumoral. BATF é um fator de transcrição que foi principalmente associado ao desenvolvimento de Thl7 e diferenciação de células T CD8+ (Murphy et al., 2013). Nossas descobertas mostram que o transcrito BATF é suprarregulado nas células Treg que infiltram tumor mais do que nas células Th 17 infiltrantes de tumor (Figura 8). Interessantemente, a expressão de BATF nas células T CD8+ é induzida pela IL-21 (Xin et al., 2015), e foi descoberto que IL21R é altamente expressa em células Treg que infiltram tumor (Figura 4).
[00200] Foi mostrado que as células Treg que infiltram tumor expressam altas quantidades de 4-1 BB (CD137) um marcador de ativação mediado por TcR (Schoenbrunn et al., 2012) e foi mostrado que elas demonstram função supressora muito alta na proliferação de célula T efetora. Poderia estar esta expressão dos genes de assinatura correlacionada com a capacidade supressiva realçada e assim contribuiría para o estabelecimento de um ambiente imunossupressivo forte nos sítios de tumor. Uma conclusão para as nossas descobertas seria que este número aumentado de células Treg no ambiente de tumor deve associar-se com um pior resultado clínico. De fato, quando LAYN, MAGEH1 e CCR8 (que representam três dos genes mais enriquecidos nas células Treg que infiltram tumor) são altamente detectados nas amostras de tumor integral há uma piora significante da sobrevivência de
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98/113 anos dos pacientes tanto com CRC quanto com NSCLC. Embora, os papéis funcionais nas células Treg de LAYN, uma proteína de transmembrana com homologia para lectina tipo c (Borowsky e Hynes, 1998), e de MAGEH1, um membro da família de Gene de Antígeno de Melanoma (Weon e Potts, 2015) sejam desconhecidos, a alta expressão do receptor de quimiocina CCR8 é ao invés intrigante. De fato CCL18, o ligante de CCR8 (Islam et al., 2013), é altamente expresso em tumores diferentes incluindo NSCLC (Chen et al., 2011; Schutyser et al., 2005). A alta especificidade da expressão de CCR8 nas células Treg que infiltram tumor sugere que o mesmo podería ser um novo alvo terapêutico interessante para inibir as células Treg de trafegar para os sítios de tumor, sem perturbar o recrutamento de outras células T efetoras que não expressam CCR8. Esforços consideráveis foram recentemente colocados no desenvolvimento de métodos de bioinformática sofisticados que exploram os dados de expressão de gene de linfócito para entender as redes imunomodulatórias no sítio de tumor, para prognosticar respostas clínicas para as terapias imunes, e para definir novos alvos terapêuticos (Bindea et al., 2013a; Bindea et al., 2013b; Gentles et al., 2015). Os dados aqui apresentados representam a primeira análise de sequenciamento de RNA compreensiva realizada sobre as células Treg CD4+, Thl e Th 17 humanas infiltrantes de tumor. Nossas descobertas salientam a relevância de avaliar os padrões de expressão de gene de linfócito nos sítios de tumor e sugere que a geração de mais dados transcriptômicos de subconjuntos de linfócito infiltrante de tumor purificado de diferentes tipos de câncer podem contribuir para um melhor entendimento das dinâmicas subjacentes à modulação imune no microambiente tumoral. Além disso, nossos dados representam um recurso para gerar e validar novas hipóteses que aumentarão nosso conhecimento sobre a biologia da célula Treg infiltrante de tumor e deve levar à identificação de novos alvos terapêuticos.
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Claims (26)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Molécula, caracterizada pelo fato de ser capaz de modular a expressão e/ou função de pelo menos um marcador que é seletivamente desregulado na célula T reguladora da infiltração em tumores para o uso na prevenção e/ou tratamento do dito tumor.
  2. 2. Molécula para o uso como definido na reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é capaz de especificamente ligar ao dito pelo menos um marcador e induzir citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
  3. 3. Molécula para o uso como definido nas reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser capaz de esgotar seletivamente a dita célula T reguladora da infiltração em tumores.
  4. 4. Molécula para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo consistindo em:
    a) um anticorpo ou um fragmento do mesmo;
    b) um polipeptídeo;
    c) uma molécula pequena;
    d) um polinucleotídeo codificando o dito anticorpo ou polipeptídeo ou um derivado funcional do mesmo;
    e) um polinucleotídeo, tal como construção de antissentido, oligonucleotídeo de antissentido, construção de interferência de RNA ou siRNA,
    e) um vetor compreendendo ou expressando o polinucleotídeo como definido em d) ou e);
    f) uma célula hospedeira geneticamente engenheirada expressando o dito polipeptídeo ou anticorpo ou compreendendo o polinucleotídeo como definido em d) ou e).
  5. 5. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações
    Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 122/157
    2/11 anteriores, caracterizada pelo fato de que o marcador é selecionado do grupo consistindo em:
    NOME DO MARCADOR ENSEMBL_release87 LAYN ENSG00000204381 CCR8 ENSG00000179934 IL21R ENSG00000103522 FUCA2 ENSG00000001036 ICA1 ENSG00000003147 TTC22 ENSG00000006555 COXIO ENSG00000006695 IL32 ENSG00000008517 ETV7 ENSG00000010030 ATP2C1 ENSG00000017260 FAS ENSG00000026103 ARNTL2 ENSG00000029153 PEX3 ENSG00000034693 MAT2B ENSG00000038274 TSPAN17 ENSG00000048140 COL9A2 ENSG00000049089 FOXP3 ENSG00000049768 NFE2L3 ENSG00000050344 LIMAI ENSG00000050405 TNIP3 ENSG00000050730 LY75 ENSG00000054219 ZNF280C ENSG00000056277 YIPF1 ENSG00000058799 NFYC ENSG00000066136 ISOC1 ENSG00000066583 PHKA1 ENSG00000067177 ACSL4 ENSG00000068366 MAST4 ENSG00000069020 LMCD1 ENSG00000071282 TFRC ENSG00000072274 PANX2 ENSG00000073150 FNDC3B ENSG00000075420 REXO2 ENSG00000076043 TP73 ENSG00000078900 LXN ENSG00000079257 IL12RB2 ENSG00000081985 GSK3B ENSG00000082701 TDRD3 ENSG00000083544 RRAGB ENSG00000083750 STARD7 ENSG00000084090 SSH1 ENSG00000084112 NCOA1 ENSG00000084676 MGST2 ENSG00000085871 ACOX3 ENSG00000087008 AURKA ENSG00000087586 TPX2 ENSG00000088325 ANKRD10 ENSG00000088448 FKBP1A ENSG00000088832 SIRPG ENSG00000089012 BIRC5 ENSG00000089685 RGS1 ENSG00000090104 DPYSL2 ENSG00000092964
    Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 123/157
    3/11
    WHRN ENSG00000095397 CENPM ENSG00000100162 SEPT3 ENSG00000100167 NCF4 ENSG00000100365 CSF2RB ENSG00000100368 CNIH1 ENSG00000100528 ZMYND8 ENSG00000101040 MAP1LC3A ENSG00000101460 PIGU ENSG00000101464 NXT2 ENSG00000101888 SMS ENSG00000102172 NDFIP2 ENSG00000102471 ACP5 ENSG00000102575 NFAT5 ENSG00000102908 CYB5B ENSG00000103018 LAPTM4B ENSG00000104341 IL7 ENSG00000104432 NCALD ENSG00000104490 ERI1 ENSG00000104626 EBI3 ENSG00000105246 PLA2G4C ENSG00000105499 CDK6 ENSG00000105810 HOXA1 ENSG00000105991 GLCCI1 ENSG00000106415 MINPP1 ENSG00000107789 ACTA2 ENSG00000107796 WSB1 ENSG00000109046 CLNK ENSG00000109684 HTATIP2 ENSG00000109854 CTSC ENSG00000109861 VWA5A ENSG00000110002 DCPS ENSG00000110063 SLC35F2 ENSG00000110660 FOXM1 ENSG00000111206 RAD51AP1 ENSG00000111247 RASAL1 ENSG00000111344 VDR ENSG00000111424 FAM184A ENSG00000111879 DNPH1 ENSG00000112667 KIF20A ENSG00000112984 SEC24A ENSG00000113615 KAT2B ENSG00000114166 PPM1G ENSG00000115241 IL1R2 ENSG00000115590 IL1R1 ENSG00000115594 IL1RL2 ENSG00000115598 IL1RL1 ENSG00000115602 UXS1 ENSG00000115652 SLC25A12 ENSG00000115840 THADA ENSG00000115970 PARK7 ENSG00000116288 LEPR ENSG00000116678 GADD45A ENSG00000116717 KIF14 ENSG00000118193 MREG ENSG00000118242 HSDL2 ENSG00000119471 FLVCR2 ENSG00000119686 SOCS2 ENSG00000120833
    Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 124/157
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    RDH10 ENSG00000121039 LAX1 ENSG00000122188 TWIST1 ENSG00000122691 ZWINT ENSG00000122952 CIT ENSG00000122966 ACOT9 ENSG00000123130 HJURP ENSG00000123485 METTL8 ENSG00000123600 TOX2 ENSG00000124191 GTSF1L ENSG00000124196 SOX4 ENSG00000124766 TM9SF2 ENSG00000125304 HS3ST3B1 ENSG00000125430 EMF2 ENSG00000125746 MGME1 ENSG00000125871 IGFER1 ENSG00000126246 DLGAP5 ENSG00000126787 HIVEP3 ENSG00000127124 ERRC61 ENSG00000127399 TST ENSG00000128311 STRIP2 ENSG00000128578 MYO5C ENSG00000128833 FOX Al ENSG00000129514 ITFG1 ENSG00000129636 KEHDC7B ENSG00000130487 TRAF3 ENSG00000131323 MCCC2 ENSG00000131844 GRSF1 ENSG00000132463 SYT11 ENSG00000132718 SEC41A1 ENSG00000133065 ATP13A3 ENSG00000133657 MICAE2 ENSG00000133816 CABEES1 ENSG00000134508 RFK ENSG00000135002 HAVCR2 ENSG00000135077 CGA ENSG00000135346 FAIM2 ENSG00000135472 EGEN1 ENSG00000135766 ARHGEF4 ENSG00000136002 SEC41A2 ENSG00000136052 FENB ENSG00000136068 RCBTB1 ENSG00000136144 TMOD1 ENSG00000136842 TPMT ENSG00000137364 CASP1 ENSG00000137752 NUSAP1 ENSG00000137804 ADAM 10 ENSG00000137845 ZNF280D ENSG00000137871 HADHB ENSG00000138029 CEP55 ENSG00000138180 NAB1 ENSG00000138386 HECW2 ENSG00000138411 CD27 ENSG00000139193 CDH24 ENSG00000139880 RAB15 ENSG00000139998 ETFA ENSG00000140374 KSR1 ENSG00000141068 PCTP ENSG00000141179
    Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 125/157
    5/11
    SECTM1 ENSG00000141574 EVA IB ENSG00000142694 WDTC1 ENSG00000142784 CTTNBP2NL ENSG00000143079 CASQ1 ENSG00000143318 SNAP47 ENSG00000143740 STAC ENSG00000144681 ARL6IP5 ENSG00000144746 ADPRH ENSG00000144843 PAM ENSG00000145730 RNF145 ENSG00000145860 TTBK1 ENSG00000146216 TMEM140 ENSG00000146859 CHST7 ENSG00000147119 CHRNA6 ENSG00000147434 MKI67 ENSG00000148773 PTPRJ ENSG00000149177 ZC3H12C ENSG00000149289 NCAM1 ENSG00000149294 INPPI ENS G00000151689 JAKMIP1 ENSG00000152969 GTF3C6 ENSG00000155115 RHOC ENSG00000155366 SLC16A1 ENSG00000155380 BATE ENSG00000156127 CXCL13 ENSG00000156234 SH3RF2 ENSG00000156463 NPTN ENSG00000156642 CCNB2 ENSG00000157456 RNF207 ENSG00000158286 AHCYL2 ENSG00000158467 PTGIR ENSG00000160013 CALM3 ENSG00000160014 TMPRSS3 ENSG00000160183 FCRL3 ENSG00000160856 PAQR4 ENSG00000162073 ZG16B ENSG00000162078 JAK1 ENSG00000162434 DIRAS3 ENSG00000162595 ACTG2 ENSG00000163017 SGPP2 ENSG00000163082 NEURL3 ENSG00000163121 RYBP ENSG00000163602 KIF15 ENSG00000163808 TMEM184C ENSG00000164168 C5orf63 ENSG00000164241 PTTG1 ENSG00000164611 MELK ENSG00000165304 FAAH2 ENSG00000165591 PRDX3 ENSG00000165672 HPRT1 ENSG00000165704 CACNB2 ENSG00000165995 TPP1 ENSG00000166340 AKIP1 ENSG00000166452 ACAA2 ENSG00000167315 GNG8 ENSG00000167414 GNG4 ENSG00000168243 CX3CR1 ENSG00000168329
    Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 126/157
  6. 6/11
    AHCYL1 ENSG00000168710 TSPAN5 ENSG00000168785 PGM2 ENSG00000169299 CRADD ENSG00000169372 UGP2 ENSG00000169764 ZNF282 ENSG00000170265 GLB1 ENSG00000170266 SM ADI ENSG00000170365 SPATA24 ENSG00000170469 PRKCDBP ENSG00000170955 TADA3 ENSG00000171148 RBKS ENSG00000171174 NETO2 ENSG00000171208 LRG1 ENSG00000171236 FAM98B ENSG00000171262 CHST11 ENSG00000171310 ECEL1 ENSG00000171551 BCL2L1 ENSG00000171552 MALT1 ENSG00000172175 ZMAT3 ENSG00000172667 CORO1B ENSG00000172725 CYP7B1 ENSG00000172817 HPSE ENSG00000173083 VANGL1 ENSG00000173218 GLRX ENSG00000173221 TRIB1 ENSG00000173334 CD7 ENSG00000173762 HAP1 ENSG00000173805 FBXO45 ENSG00000174013 CHST2 ENSG00000175040 RMI2 ENSG00000175643 SLC35E3 ENSG00000175782 ZBTB38 ENSG00000177311 ZBED2 ENSG00000177494 PARD6G ENSG00000178184 GLDC ENSG00000178445 AKAP5 ENSG00000179841 PAK2 ENSG00000180370 YIPF6 ENSG00000181704 CREB3L2 ENSG00000182158 XKRX ENSG00000182489 CADM1 ENSG00000182985 LHFP ENSG00000183722 CSF1 ENSG00000184371 PTP4A3 ENSG00000184489 CDCA2 ENSG00000184661 OSBP2 ENSG00000184792 METTL7A ENSG00000185432 SPATC1 ENSG00000186583 TMPRSS6 ENSG00000187045 GCNT1 ENSG00000187210 MAGEH1 ENSG00000187601 NHS ENSG00000188158 IL17REL ENSG00000188263 ADAT2 ENSG00000189007 NEMP2 ENSG00000189362 SPATS2L ENSG00000196141 NTNG2 ENSG00000196358
    Petição 870180151270, de 13/11/2018, pág. 127/157
  7. 7/11
    MYL6B ENSG00000196465 ARHGEF12 ENSG00000196914 MAP3K5 ENSG00000197442 PDGFA ENSG00000197461 PDCD1LG2 ENSG00000197646 TOR4A ENSG00000198113 HIBCH ENSG00000198130 ZNF334 ENSG00000198185 NTRK1 ENSG00000198400 TMA16 ENSG00000198498 WDHD1 ENSG00000198554 FAM19A2 ENSG00000198673 F5 ENSG00000198734 GK ENSG00000198814 INPP5F ENSG00000198825 CARD 16 ENSG00000204397 TBC1D8 ENSG00000204634 CD 177 ENSG00000204936 LEPROT ENSG00000213625 SEC14L6 ENSG00000214491 TRIM 16 ENSG00000221926 LTA ENSG00000226979 PROB1 ENSG00000228672 AF165138.7 ENSG00000243440 USP51 ENSG00000247746 CARD 17 ENSG00000255221 DOC2B ENSG00000272636 C17orf96 ENSG00000273604 SSTR3 ENSG00000278195 AC019206.1 ENSG00000279229
    em que cada um do dito nome do marcador é caracterizado pelo “Ensembl gene id” e inclui todas das isoformas aqui divulgadas em sequências de proteína.
    6. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o marcador é selecionado do grupo consistindo em: uma proteína de transmembrana, uma citocina, um fator epigenético, uma cinase fosfatase ou um fator de transcrição.
    7. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o marcador é uma proteína de transmembrana selecionada do grupo das SEQ ID NOs: 1 a 661.
  8. 8. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o marcador é selecionado do grupo consistindo em: LAYN (SEQ ID NOs: 1-9), CCR8 (SEQ ID NOs: 10-11), IL21R (SEQ ID NOs: 12-14), IL1R2 (SEQ ID NOs: 206-209), LY75 (SEQ ID NO: 78),
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    8/11
    SIRPG (SEQ ID NOs: 122-126), CD177 (SEQ ID NOs: 651-653), CD7 (SEQ ID NOs: 549-554), FCRL3 (SEQ ID NOs: 452-457), CADM1 (SEQ ID NOs: 570-583), NTNG2 (SEQ ID NOs: 621-622), CSF2RB (SEQ ID NOs: 134137), SECTM1 (SEQ ID NOs: 349-356), TSPAN5 (SEQ ID NOs: 497-503), TMPRSS3 (SEQ ID NOs: 448-451), TMPRSS6 (SEQ ID NOs: 605-611), METTL7A (SEQ ID NOs: 600-604), THADA (SEQ ID NOs: 237), NDFIP2 (SEQ ID NOs: 148-151), CHRNA6 (SEQ ID NOs: 392-394).
  9. 9. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o marcador é selecionado do grupo consistindo em: LAYN (SEQ ID NOs: 1-9), CCR8 (SEQ ID NOs: 10-11), IL21R (SEQ ID NOs: 12-14).
  10. 10. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a citocina é selecionada do grupo consistindo em: IL32 (SEQ ID NOs: 19-30), IL7 (SEQ ID NOs: 168-174), EBI3 (SEQ ID NO: 175), SECTM1 (SEQ ID NOs: 349-356), CSF1 (SEQ ID NOs: 585-592) e LTA (SEQ ID NOs: 657-658).
  11. 11. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o fator epigenético é selecionado do grupo consistindo em: TDRD3 (SEQ ID NO: 712-718), KAT2B (SEQ ID NO:719), FOXA1 (SEQ ID NOs: 720-721) e RCBTB1 (SEQ ID NOs: 722-723).
  12. 12. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a cinase fosfatase é selecionada do grupo consistindo em: GSK3B (SEQ ID NOs: 724-725), SSH1 (SEQ ID NOS: 111112), CDK6 (SEQ ID NOs: 726-727), MINPP1 (SEQ ID NOs: 181-183), PTPRJ (SEQ ID NOs: 395-400), CALM3 (SEQ ID NOs: 728-735) e PTP4A3 (SEQ ID NOs: 593-598).
  13. 13. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o fator de transcrição é selecionado do grupo consistindo em: VDR (SEQ ID NO:204), ZNF334 (SEQ ID NOs: 736-741),
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    CREB3L2 (SEQ ID NOs: 565-567), ETV7 (SEQ ID NO:31 ou 32), SOX4 (SEQ ID NO:735), TWIST1 (SEQ ID NOs: 743-745), TP73 (SEQ ID NOs: 746-756), FOXP3, NFE2L3 (SEQ ID NO:76), ARNTL2 (SEQ ID NOs: 757764), BATE (SEQ ID NOs: 765-766), PTTG1 (SEQ ID NOs: 767-770), HIVEP3 (SEQ ID NOs: 771-772), FOXA1 (SEQ ID NOs: 720-721), ZBTB38 (SEQ ID NO:561), FOXM1 (SEQ ID NOs: 773-778), TADA3 (SEQ ID NOs: 779-782), NFAT5 (SEQ ID NO:160, 783-791, 742).
  14. 14. Molécula para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o marcador é MAGEH1 (SEQ ID NO: 708 ou 709).
  15. 15. Molécula para o uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizada pelo fato de que o tumor é um tumor sólido ou líquido.
  16. 16. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o tumor sólido é selecionado do grupo consistindo em: câncer pulmonar de célula não pequena, câncer colorretal, câncer mamário, câncer gástrico ou em que o tumor é uma metástase, preferivelmente uma metástase óssea, uma cerebral ou uma hepática.
  17. 17. Molécula para o uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a metástase deriva de câncer colorretal ou câncer pulmonar de célula não pequena.
  18. 18. Molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizada pelo fato de ser para o uso em um método para esgotar células T reguladoras da infiltração em tumor in vivo em um sujeito ou para o uso em um método para realçar a imunidade tumoral em um sujeito.
  19. 19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14 e pelo menos um carregador farmaceuticamente aceitável.
  20. 20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação
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    19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente terapêutico, preferivelmente o agente terapêutico em um agente antitumoral.
  21. 21. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 19 ou 20, caracterizada pelo fato de ser para o uso na prevenção e/ou tratamento de tumor, ou para o uso em um método para esgotar células T reguladoras da infiltração em tumor in vivo em um sujeito, ou para o uso em um método para realçar a imunidade tumoral em um sujeito.
  22. 22. Método in vitro para prognosticar e/ou diagnosticar e/ou avaliar o risco de desenvolver e/ou para monitorar a progressão e/ou para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico e/ou para a triagem de um tratamento terapêutico de um tumor em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de:
    a) detectar pelo menos um dos marcadores como definidos em com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14;
    em uma amostra biológica isolada obtida do sujeito e
    b) comparar com respeito a um controle apropriado.
  23. 23. Método in vitro para prognosticar e/ou diagnosticar e/ou avaliar o risco de desenvolver e/ou para monitorar a progressão e/ou para monitorar a eficácia de um tratamento terapêutico e/ou para a triagem de um tratamento terapêutico de um tumor em um sujeito de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o marcador a ser detectado é pelo menos um dos marcadores selecionados do grupo consistindo em: LAYN, MAGEH1 e CCR8.
  24. 24. Método in vitro de acordo com a reivindicação 23 para ο prognostico de câncer colorretal ou câncer pulmonar de célula não pequena em um sujeito caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de:
    a) detectar pelo menos um dos marcadores selecionados do
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    11/11 grupo consistindo em:
    LAYN, MAGEH1 e CCR8, em um amostra biológica isolada obtida do sujeito e b) comparar com respeito a um controle apropriado, em que uma quantidade do dito pelo menos um marcador na amostra biológica isolada obtida do sujeito mais alta do que a quantidade de controle indica que o sujeito tem um prognóstico pobre.
  25. 25. Método para tratar e/ou prevenir tumor, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um sujeito a molécula como definida nas reivindicações de 1 a 14.
  26. 26. Método para identificar uma molécula que atua como um antitumoral, caracterizado pelo fato de que compreendendo as etapas de:
    - ensaiar moléculas candidatas quanto à sua especificidade de ligação ao pelo menos um marcador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14;
    - selecionar moléculas tendo uma atividade de ligação específica ao pelo menos um marcador como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 14;
    - testar tais moléculas de ligação específica quanto à sua capacidade de inibir a proliferação e/ou induzir uma resposta apoptótica em um sistema de célula, preferivelmente esgotando-se seletivamente as células T reguladoras da infiltração em tumor, mais preferivelmente induzindo-se a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
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