KR20230004458A - Apc-결핍 암의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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루미 리
로날드 에이. 데핀호
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더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

본 개시내용은 APC-결핍 암과 같은 비정상적인 WNT 신호전달을 갖는 암이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 TDO2 또는 TDO2에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 투여함을 포함하는 APC-결핍 암의 치료 방법에 관한 것이다. 추가 측면은 APC 유전자의 결핍을 검출하고/하거나 TDO2의 발현 수준을 측정함을 포함하는, 암을 TDO2 억제에 민감한 것으로서 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

APC-결핍 암의 치료를 위한 방법 및 조성물
상호 참조
본원은 2020년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/982,561호의 우선권을 주장하며, 이 출원은 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본원에는 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록이 포함되어 있으며 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다. 2021년 2월 23일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 UTSCP1205WO - SeqListing.txt이며 크기는 3,899바이트이다.
발명의 배경
본 발명은 국립 보건원에서 수여한 R01CA231360 및 5T32CA186892-04 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 가지고 있다.
I. 발명의 분야
본 발명의 측면은 적어도 분자 생물학, 면역학 및 종양학 분야에 관한 것이다.
II. 발명의 배경
결장직장암(Colorectal cancer; CRC)은 선진국에서 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이며 매년 전 세계적으로 600,000명 이상의 사망을 초래한다. 선종에서 선암종으로, 및 궁극적으로 침습성 및 전이성 질환으로의 CRC의 진화는 특징적인 유전적 변화의 획득, 가장 두드러지게는 대장선종용종(adenomatous polyposis coli; APC) 및 p53 종양 억제인자(suppressor)의 불활성화 및 KRAS 종양유전자의 활성화에 의해 좌우된다(Orchard et al., 2013). APC 손실은 다른 많은 암 유형에서도 자주 발생한다(Fang et al., 2002; Furuuchi et al., 2000; Horii et al., 1992; Ohgaki et al., 2004). APC 경로와 관련하여, 돌연변이된 APC 단백질은 글리코겐 신타제 키나제 3β(GSK3β)를 활성화하는 능력을 상실하며, 이는 차례로 β-카테닌의 N-말단 세린/트레오닌 잔기를 인산화하여 유비퀴틴화를 통한 β-카테닌 분해를 매개한다. 따라서 APC 결핍은 β-카테닌의 축적을 초래하고, 이어서 상기 카테닌은 핵으로 이동하여 T-세포 인자/림프 강화인자-결합 인자(TCF/LEF) 전사 인자 복합체에 결합하고 억제를 해제(de-repressing)하여, 표준 WNT 신호전달(signaling) 네트워크의 활성화를 가능하게 한다.
암에서의 중요성에도 불구하고, 이 APC 신호전달 캐스케이드의 치료 표적화(targeting)는 암 치료에 있어 여전히 애매한 목표로 남아 있다. 현재 WNT 경로를 표적으로 하는 작용제에는 WNT 리간드, b-카테닌 분해 복합체, TCF/LEF, 및 WNT와 연통하는 Notch 및 Sonic Hedgehog 신호전달의 억제제가 포함된다. 현재까지 이러한 WNT 표적화 프로그램은 아직 의미 있는 임상 결과를 생성하지 못하였다. APC-결핍 결장직장암(CRC) 및 기타 APC-결핍 종양 유형을 표적으로 하는 직교 전략이 필요하다.
본 개시내용은 APC-결핍 암(APC-deficient cancer)을 갖는 대상체(subject)를 치료하는데 적합한 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 측면은 대상체에게 TDO2 또는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 제공하는 것을 포함하는, APC-결핍 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 추가의 측면은 암이 APC 결핍이 있음을 확인하고 TDO2의 억제제 또는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인을 대상체에게 제공하는 것을 포함하는, 대상체를 암에 대해 치료하는 방법에 관한 것이다. 추가적인 측면은 암에서 APC 유전자의 결핍 및/또는 TDO2의 발현 증가를 검출하는 것을 포함하는, 암이 TDO2 억제에 민감한 것으로서 확인하는 방법을 포함한다. 더욱 또 다른 측면은 대상체에게 TDO2 또는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 제공하는 것을 포함하는, 구성적으로 활성인 WNT 신호전달을 갖는 암에 대해 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 다양한 구현예는 APC-결핍 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법, APC 돌연변이를 갖는 것으로 결정된 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법, APC-결핍 CRC를 갖는 대상체를 치료하는 방법, 암을 TDO2 억제에 민감한 것으로서 확인하는 방법, 암을 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제에 민감한 것으로 확인하는 방법, 환자를 진단하는 방법, 환자를 예측하는 방법, 암 세포를 검출하는 방법, APC-결핍 암을 치료하기 위한 조성물, 및 구성적으로 활성인 WNT 신호전달을 갖는 암에 걸린 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
본 개시내용의 방법은 하기 단계 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상을 포함할 수 있다: TDO2 억제제 제공, 사이토카인의 억제제 제공, 암을 APC 결핍이 있는 것으로서 확인, 대상체에게 약제학적 조성물 제공, 암 세포의 핵산 서열분석, 암 세포의 핵산 돌연변이 확인, 핵산 발현 수준을 대조 또는 참조 값과 비교, 암 세포의 핵산의 메틸화 상태 분석, 생물학적 샘플 획득, 대상체로부터 암 세포 단리, 암 요법으로 대상체 치료, 면역요법으로 대상체 치료, 유전자의 증가된 발현 검출, 치료 결과 측정, 암을 TDO2 억제에 민감한 것으로서 확인, 암을 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제에 민감한 것으로서 확인, TDO2 억제, CXCL5 억제 및 CXCL1/2 억제. 일부 구현예에서, 임의의 하나 이상의 단계가 상기 개시된 방법에서 제외됨이 고려된다.
일부 구현예에서, 본원은 대장선종용종(APC) 돌연변이를 갖는 것으로 결정된 암이 있는 대상체의 치료 방법을 개시하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 (a) 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO2) 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공함을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원은 대상체를 APC-결핍 암에 대해 치료하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 (a) TDO2 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공함을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원은 대상체를 암에 대해 치료하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 (a) 암을 APC 결핍이 있는 것으로서 확인하고, (b) 상기 대상체에게 유효량의 (i) TDO2 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공함을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 상기 암이 APC 돌연변이가 있는 지의 여부를 결정하고 (a) 상기 암이 APC 돌연변이를 갖는 경우, 상기 대상체에게 유효량의 (i) TDO2 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 제공하고, (b) 상기 암이 APC 돌연변이를 갖지 않는 경우, 상기 대상체에게 유효량의 대체 요법을 제공함을 포함한다. 대체 요법은 예를 들어 방사선 요법, 화학 요법 또는 수술일 수 있다.
일부 구현예에서, 억제제는 TDO2의 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 암에서 TDO2의 발현을 억제한다. 일부 구현예에서, 억제제는 암에서 TDO2의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 억제제는 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 억제제, 항체, 또는 항체-유사 분자이다. 일부 구현예에서, 억제제는 TDO2를 표적화하는 siRNA, shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 억제제는 PF06845102/EOS200809, 680C91, LM10, HTI-1090, DN1406131, RG70099, EPL-1410, CB548, CMG017, 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 억제제는 PF06845102/EOS200809이다. 일부 구현예에서, 억제제는 680C91이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소, 흡입을 통해, 또는 둘 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여된다.
일부 구현예에서, 억제제는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 CXCL5, CXCL7, CSF3, CXCR2, CXCL2, CXCL10, CCL2, 또는 CXCL1이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 CXCL5, CXCL7 또는 CSF3이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 CXCL5이다. 일부 구현예에서, 억제제는 CXCL1/2 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 CXCL5 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 CXCR5를 표적화하는 항체 또는 항체-유사 분자이다. 일부 구현예에서, 억제제는 CXCL5를 표적화하는 siRNA, shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본원은, 일부 측면에서, 암을 TDO2 억제에 민감한 것으로 확인하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 (a) 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 암 세포를 수득하는 단계; (b) 암 세포에서 APC 유전자의 결핍을 검출하는 단계; 및 (c) (b)에 기반하여 암을 TDO2 억제에 민감한 것으로 확인하는 단계를 포함한다. 또한, 일부 구현예에서, 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함하는지 여부를 결정하는 방법을 개시하며, 상기 방법은 (a) 생물학적 샘플에서 APC 결핍의 존재 또는 부재를 측정하는 단계; (b) 생물학적 샘플이 APC 결핍을 포함하는 경우 상기 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함함을 결정하는 단계; 및 (c) 생물학적 샘플이 APC 결핍을 포함하지 않는 경우 상기 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함하지 않음을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 비-암성 생물학적 샘플(non-cancerous biological sample)로부터의 세포에 비해 암 세포에서 TDO2의 증가된 발현 또는 활성을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플에서 TDO2의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플에서의 TDO2 발현 또는 활성 수준이 비-암성 생물학적 샘플에서의 발현 또는 활성 수준과 유의하게 다르지 않은 경우, 상기 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함하지 않음을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, APC 결핍은 APC 돌연변이이다. 일부 구현예에서, APC 결핍은 APC 발현의 억제(repression)이다. 일부 구현예에서, 억제는 후성적 억제(epigenetic repression)이다.
일부 구현예에서, 암은 건강한 대상체로부터의 생물학적 샘플일 수 있는 대조 또는 참조 샘플에 비해 TDO2의 증가된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 암은 구성적으로 활성인 WNT 신호전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 결장직장암, 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 폐암(lung cancer), 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinoma), 또는 육종(sarcoma)이다. 일부 구현예에서, 암은 결장직장암이다. 일부 구현예에서, 암은 주어진 진단 단계의 암이다. 일부 구현예에서, 암은 I기(stage I), IIa기, IIb기, IIc기, IIIa기, IIIb기, IIIc기, IVa기 또는 IVb기 암이다. 일부 구현예에서, 암은 재발성 암이다. 일부 구현예에서, 대상체는 이전에 암 치료를 받았다. 일부 구현예에서, 대상체는 이전에 암 치료를 받지 않았다. 일부 구현예에서, 암은 선행 치료에 내성인 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 개시된 방법은 대상체에게 암 면역요법을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 암 면역요법은 예를 들어 항체 요법 또는 세포 요법일 수 있다. 일부 구현예에서, 암 면역요법은 관문 억제제 요법(checkpoint inhibitor therapy)이다. 일부 구현예에서, 방법은 추가 요법을 대상체에게 제공하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 추가 요법은 화학요법, 방사선 요법, 수술, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 화학요법, 방사선 요법, 또는 수술을 제공하는 임의의 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에서 종양 관련 대식세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플이다. 일부 구현예에서, 암 세포는 결장직장암 세포이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 결장직장암 환자의 수술 부위에 인접한 조직 샘플이다. 일부 구현예에서, 비암성 생물학적 샘플은 정상 점막 조직이다.
일부 구현예에서, 개시된 방법은 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1(IDO1) 또는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 2(IDO2)의 억제제를 대상체에게 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 IDO1 또는 IDO2의 억제제를 대상체에게 제공하는 것을 포함하지 않는다.
본 개시내용의 측면은 구성적으로 활성인 WNT 신호전달을 갖는 것으로 결정된 암에 대해 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의 (a) TDO2 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적으로 활성인 WNT 신호전달은 APC-결핍을 포함한다. 일부 구현예에서, 구성적으로 활성인 WNT 신호전달은 APC-결핍을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 암은 구성적으로 활성인 β-카테닌 단백질을 포함한다.
추가의 측면은 대상체의 APC-돌연변이 암의 치료에서, 또는 대상체의 APC-돌연변이 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 (a) (i) TDO2 또는 (ii) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체의 용도에 관한 것이다.
본 출원 전체에서 용어 "약"은 값이 측정 또는 정량화 방법에 대한 본래의 오차 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
"a" 또는 "an"이라는 단어의 사용은 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와 일치한다.
"및/또는"이라는 문구는 "및" 또는 "또는"을 의미한다. 예를 들어, A, B 및/또는 C에는 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B의 조합, A와 C의 조합, B와 C의 조합, 또는 A, B, 및 C의 조합이 포함된다. 즉, "및/또는"은 포괄적인 또는 으로서 작동한다. A, B 또는 C는 구현예에서 구체적으로 제외될 수 있음이 구체적으로 고려된다.
"포함하는"(및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 임의의 형태의 포함), "가지는"(및 "갖다" 및 "갖는"과 같은 임의의 형태의 가짐), "내포하는"(및 "내포하다" 및 "내포하는"과 같은 임의의 형태의 내포) 또는 "함유하는"(및 "함유하다" 및 "함유하는"과 같은 임의의 형태의 함유)는 포괄적이거나 개방형이며 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
이들의 사용을 위한 조성물 및 방법은 명세서 전체에 걸쳐 개시된 임의의 성분 또는 단계를 "포함하거나", 이들로 "이루어지거나" 또는 "필수적으로 이루어질" 수 있다. 개시된 임의의 성분 또는 단계로 "필수적으로 이루어진" 조성물 및 방법은 청구의 범위를, 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 명시된 물질 또는 단계로 제한한다.
본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 바와 같이, "포함하는"(및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 임의의 형태의 포함), "가지는"(및 "갖다" 및 "갖는"과 같은 임의의 형태의 가짐), "내포하는"(및 "내포하다" 및 "내포하는"과 같은 임의의 형태의 내포) 또는 "함유하는"(및 "함유하다" 및 "함유하는"과 같은 임의의 형태의 함유)는 포괄적이거나 개방형이며 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다. "포함하는"이라는 용어의 맥락에서 본원에 기재된 구현예는 또한 "이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지는"이라는 용어의 맥락에서 구현될 수 있음이 고려된다.
치료, 진단 또는 생리학적 목적 또는 효과의 맥락에서 임의의 방법은 또한 기재된 치료, 진단, 또는 생리학적 목적 또는 효과를 달성하거나 구현하기 위해 본원에 논의된 임의의 화합물, 조성물 또는 작용제의 "용도"와 같은 "용도"항의 용어로 기재될 수 있다.
다양한 구현예가 본원 전반에 걸쳐 논의된다. 하나의 측면과 관련하여 논의된 임의의 구현예는 다른 측면에도 적용될 뿐만 아니라 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본원에 기재된 각각의 구현예는 모든 측면에 적용 가능한 구현예인 것으로 이해된다. 본원에 논의된 임의의 구현예는 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있으며 그 반대도 마찬가지이다. 더욱 또한, 조성물 및 키트를 사용하여 본원에 개시된 방법을 달성할 수 있다. 실시예에 제시된 구현예의 측면은 또한 상이한 실시예의 다른 어딘 가에 또는 본원의 다른 어딘 가에, 예를 들어 요약, 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면의 간단한 설명에 논의된 구현예의 맥락에서 실행될 수 있는 구현예이다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 특정 구현예를 나타내지만, 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 본 발명의 진의 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형은 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명해질 것이다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1A-1F는 CRC에서 돌연변이 APC 유전자에 대한 합성 필수 유전자로서 TDO를 밝히는 연구의 결과를 나타낸다. 도 1A는 다수의 암 유형의 TCGA 데이터베이스에서 TDO2 및 APC/CTNNB1의 상호 배타적인 패턴을 도시한다. 각 유전자의 변경 백분율이 표시된다. 도 1B는 3개의 잠재적 SE 유전자를 식별한 2개의 상이한 데이터세트를 사용하는 벤 다이어그램 분석을 도시한다. 도 1C는 TDO2 mRNA 발현이 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 환자(n=433)에서 WNT 경로 특징 유전자의 발현과 유의하게 상관됨을 도시한다. ***P <0.001. 도 1D는 음성(n=34) 및 양성 핵 β-카테닌(n=47)을 갖는 인간 CRC 종양에서 TDO2에 대한 면역조직화학(IHC) 염색의 표현을 도시한다. 스케일 바, X10(200 ㎛) 및 X40(50 ㎛). 도 1E는 핵 β-카테닌을 갖는 CRC 종양이 더 높은 TDO2 발현을 나타내었음을 도시한다(TDO2 염색 점수 0-3). 피어슨 상관 계수 = 42.342, ****P <0.0001. 카이제곱 검정. 도 1F는 APCmin 마우스의 폴립 및 iKAP 마우스 모델의 종양에 대한 IHC 분석을 도시하며, 이는 정상 결장 조직과 비교하여 증가된 핵 β-카테닌, Ki67 및 TDO2를 나타낸다. 3회 중복 연구의 전형적인 상을 도시한다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 2A-2J는 CRC에서 TDO2 발현과 WNT 활성화 사이의 상관관계를 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 2A 및 2B는 CCD-841-CoN 및 동질유전자 RKO 세포주에서 PPAT 및 AP3D1의 mRNA 발현을 도시한다. 도 2C는 WNT 시그니처(signature) 유전자의 발현에 기초한 TCGA COAD 및 READ 데이터세트의 클러스터링을 나타낸다(Van der Flier et al., 2007). APC 돌연변이 상태가 도시된다. 도 2D는 특징(hallmark) WNT 유전자 세트(HALLMARK_WNT_BETA_CATENIN_SIGNALING)의 발현을 기반으로 하는 TCGA COAD 및 READ 데이터세트의 클러스터링을 나타낸다. 도 2E는 특징 WNT 유전자의 발현이 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 환자 샘플(n=433)에서 TDO2 발현과 상관됨을 도시한다. ****P <0.0001. 도 2F는 PPAT mRNA 발현이 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 환자(n=433)에서 WNT 시그니처 유전자의 발현과 역으로 상관됨을 도시한다. **P <0.01. 도 2G는 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 데이터세트(n=220)에서 APC 및 CTNNB1에 대한 IDO1/2의 상호 배타적인 패턴을 도시한다. 도 2H는 IDO1 mRNA 발현이 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 환자(n=433)에서 WNT 시그니처 유전자의 발현과 상관 없음을 도시한다. n.s. P >0.05, **P <0.01. 도 2I는 IDO2 mRNA 발현이 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 환자(n=433)에서 WNT 시그니처 유전자의 발현과 상관됨을 나타낸다는 것을 도시한다. 도 2J는 CRC에서 APC 돌연변이에 대한 SE 유전자를 확인하기 위한 분석을 나타내는 벤 다이어그램을 도시한다. 상이한 컷오프를 사용하는 2개의 별도 분석을 나타낸다. *좌측 P값 - β-카테닌 활성 암 세포주에 필수적인 유전자에 대한 P값.
도 3A-3I는 TCF4/TCF7L2가 APC-돌연변이된 CRC 세포에서 TDO2의 상향조절을 매개한다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 3A는 CRC 세포주 RKO(인간) 및 MC38(마우스)에서 TDO2 및 β-카테닌에 대한 면역블롯을 이들의 동질유전자 APC-KO 대응물과 함께 도시한다. 도 3B는 APC 결실된 RKO 및 MC38 세포주가 증가된 TDO2 mRNA 발현을 나타낸다는 것을 입증하는 RT-qPCR 결과를 도시한다. ****P <0.0001. 도 3C는 전사 인자 TCF4/TCF7L2에 대한 DNA 서열 결합 모티프(motif)를 도시한다. 도 3D는 인간 및 마우스 TDO2 유전자의 프로모터 영역이 전사 개시 부위 근처에 TCF4 결합 모티프를 보유함을 도시한다. 모티프 서열은 인간 및 마우스 유전자에서 보존된다. 도 3E는 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포에서 ChIP-seq가 TDO2 유전자의 프로모터에서 TCF4에 대한 결합 피크를 나타냄을 도시한다. 도 3F는 TCF4 항체를 사용한 CHIP-PCR이 DLD-1 세포에서 TDO2 유전자의 프로모터 영역에 대한 풍부한 결합을 나타냄을 도시한다. GAPDH를 음성 대조군으로, MYC 및 AXIN2 를 양성 대조군으로 사용한다. 도 3G는 우성 음성(DN) TCF4로 공동-형질감염될 때 β-카테닌(Δ90)의 구성적 활성 형태를 갖는 HEK 293T 세포에서 hTDO2 프로모터의 루시페라제 활성으로부터의 결과를 도시한다. n=3 생물학적 복제물. n.s. P >0.05, *P ≤0.05, **P <0.01. 도 3H는 β-카테닌(Δ90) 및 우성 음성(DN) TCF4의 구성적 활성 형태를 갖는 HEK 293T 세포에서 hTDO2 프로모터 및 TCF4 결합 모티프-돌연변이된 hTDO2 프로모터의 루시페라제 활성을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. n.s. P >0.05, **P <0.01. 도 3I는 클로닝되지 않은 MC38 세포, APC-양성 클론 및 APC-결실된 클론에서 APC 및 TDO2의 면역블롯팅을 도시한다. 도 3J는 36시간 동안 0, 50 및 100 ng의 재조합 마우스 WNT3a 단백질이 보충된 MC38 세포에서 TDO2의 면역블롯팅을 도시한다. 도 3K-3M은 용량-의존적인 방식으로 XAV-939로 처리된 DLD-1 세포(도 3K), Caco-2 세포(도 3L), 및 HCT-15 세포(도 3M)에서 TDO2 및 β-카테닌에 대한 면역블롯을 나타낸다.
도 4A-4P는 TDO2가 APC-돌연변이 CRC 세포에서 생존에 필수적임을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 4A는 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주에서 TDO2 shRNA 녹다운 효율을 나타내는 RT-qPCR을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 4B는 shTDO2를 발현하는 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주의 콜로니 형성 분석의 전형적인 상을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 4C는 680C91을 48시간 동안 용량 의존적인 방식으로 처리한 후 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주의 크리스탈 바이올렛 염색의 전형적인 상을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 4D는 dox 처리 96시간 후 ishTDO2로 감염된 APCmin 콜로노이드에서 RFP-카스파제-3의 면역형광 염색을 도시한다. shTDO2의 유도는 GFP에 의해 표시된다(화살표로 강조 표시됨). X63 배율. 도 4E는 48시간 동안 Dox 처리 후 APCmin ishTDO2 오가노이드 세포 용해물에서 TDO2 및 절단된 카스파제-3에 대한 면역블롯을 도시한다. 도 4F는 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주에서 TDO2 유도성 shRNA 녹다운 효율을 나타내는 RT-qPCR을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 4G는 독시사이클린(Dox) 처리 후 ishTDO2를 사용한 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주에서 절단된 카스파제-3의 면역블롯을 도시한다. 도 4H는 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주(2×105 세포)의 동소 주사 후 21일째에 C57BL/6J 마우스의 전형적인 생체내 생물발광 기반 상을 도시한다. Dox 음식이 주사 후 5일째에 생체 내에서 유도된 TDO2 녹다운을 위해 제공되었다(그룹당 n=5). 도 4I는 H.에서 종양으로부터의 종양의 전체 플럭스 측정을 도시한다. n.s. P>0.05, *P<0.05. 도 4J는 도 4H의 마우스로부터 수확된 종양의 중량을 도시한다(그룹당 n=6) n.s. P >0.05, ****P <0.0001. 도 4K는 도 4H의 샘플로부터 생성된 CRC 동소 종양 조직에서 KI67 및 카스파제-3의 IHC를 도시한다. 스케일 바, 100 ㎛. 도 4L은 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주(5×105 세포)가 동소 이식된 C57BL/6J 마우스의 생존 곡선을 도시한다. Dox 음식이 생체 내 TDO2 녹다운을 유도하기 위해 동소 주사 후 5일째에 적용되었다(ishTDO2 APC-WT MC38, n = 5, ishTDO2 APC-WT + Dox MC38 및 ishTDO2 APC-KO MC38, n = 6, ishTDO2 APC-KO MC38 + Dox, n = 7). n.s. P >0.05, **P <0.01, ***P <0.001. 양측 t-검정. 도 4M은 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주(5x105 세포)가 동소 이식된 NSG 마우스의 생존 곡선을 도시한다. Dox 음식이 생체내 TDO2 녹다운을 유도하기 위해 동소 주사 후 5일째에 적용되었다(그룹당 n=8). n.s. P >0.05, **P <0.01, ***P <0.001. 양측 t-검정. 도 4N 및 4O는 TDO2 억제제(도 4N) 또는 에파카도스탯(Epacadostat)(도 4O)으로 처리된 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주(5×105 세포)가 동소 이식된 C57BL/6J 마우스의 생존 곡선을 도시한다. TDO2 억제제 및 에파카도스탯 처리(100 ㎎/㎏)는 경구 위관영양법으로 하루에 두 번 주사 후 5일째에 시작되었다. n.s. P>0.05, *P<0.05, ***P<0.001. 로그 순위(만텔-콕스) 검정. 도 4P는 TDO2 억제제(100 ㎎/㎏) 또는 에파카도스탯(100 ㎎/㎏)으로 처리하고 종점에서 수확한 APC-WT 및 APC-KO MC38 종양에서 절단된 카스파제-3, F4/80, CD163 및 Ki67의 면역조직화학 염색을 도시한다. 스케일 바, ×10(200 ㎛).
도 5A-5I는 APC-돌연변이/WNT-활성 인간 CRC 세포주에서 TDO2 필수성을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 5A는 연구에 사용된 인간 정상 및 CRC 세포주에서 APC 및 CTNNB1의 돌연변이 상태를 도시한다. 도 5B는 동질유전자 APC-WT 및 APC-KO RKO 뿐만 아니라 DLD-1, LS180 및 HT-28 세포주에서 TDO2 shRNA 녹다운 효율을 나타내는 RT-qPCR을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 5C는 shTDO2를 발현하는 인간 CRC 세포주의 콜로니 형성 분석의 전형적인 상을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 5D는 680C91을 48시간 동안 용량 의존적인 방식으로 처리한 후 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주의 크리스탈 바이올렛 염색의 전형적인 상을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 5E는 shTDO2를 발현하는 APC-WT 및 APC-KO RKO 세포주(주사당 5×105 세포)가 주사된 NSG 마우스의 종양 중량을 도시한다. 종양은 피하 주사 후 25일째에 수확되었다(그룹당 n=7) n.s. P >0.05, ****P <0.0001. 양측 t-검정. 도 5F는 누드 마우스에서 DLD-1 세포주를 발현하는 TDO2 녹다운 및 헤어핀-내성(HR) TDO2-ORF의 피하 종양 성장의 측정을 도시한다(주사당 5×105 세포). n = 5/그룹. 종양의 전체 플럭스 측정이 표시된다. *P <0.05, 양측 t-검정. 도 5G 및 5H는 도 S2E 및 S2F의 샘플로부터 생성된 종양 조직에서 Ki67 및 카스파제-3의 IHC를 도시한다. 스케일 바, 100 ㎛. 도 5I는 96h 동안 Dox 처리 후 유도성 TDO2를 갖는 APCmin 오가노이드의 명시야 상을 나타낸다. 스케일 바, 50 ㎛.
도 6A-6D는 WNT-의존성 BRCA 종양에서 TDO2 고갈에 의한 종양 성장 감소를 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 6A는 ishTDO2 4T1 세포주에서 TDO2 shRNA 녹다운 효율을 나타내는 RT-qPCR을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 6B 및 6C는 dox 처리 유무에 관계없이 유방 지방 패드에 ishTDO2 4T1 세포(주사당 2×104 세포)를 동소 주사하여 생성된 유방 종양의 전형적인 상 및 측정된 중량을 도시한다. n = 6/그룹. ***P <0.001. 양측 t-검정. 도 6D는 도 S3B의 샘플로부터 생성된 종양 조직에서 Ki67 및 카스파제-3의 IHC를 도시한다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 7A-7J는 TDO2에 의해 상향조절된 키누레닌 경로가 APC-돌연변이 CRC 세포에서 AhR 신호전달을 활성화한다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 7A는 TDO2 고갈된 APC-KO MC38 세포에서 대안적으로 발현된 유전자와 트립토판 대사 및 생체이물 대사와의 GSEA 상관관계를 도시한다. 정규화 농축 점수(NES) 및 명목 P 값이 표시된다. 도 7B는 TCGA COAD 데이터베이스(n=286)에서 AhR 및 CYP1B1 발현에 대한 TDO2 발현의 양의 상관관계를 도시한다. P 값과 R-제곱 값이 표시된다. 도 7C는 APCmin 마우스의 폴립 및 iKAP 마우스 모델의 종양에 대한 IHC 분석이 정상 결장 조직에 비해 증가된 AhR을 나타내었음을 도시한다. 3회 중복 연구의 전형적인 상이 도시된다. 스케일 바, 100 ㎛. 도 7D는 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주와 함께 배양된 배양 배지에 존재하는 키누레닌(kyn)에 대한 ELISA 분석 결과를 도시한다. n=4 생물학적 복제물. **P <0.01. 도 7E는 TDO2 녹다운이 APC-KO MC38 세포주에서 AhR 하류 표적 유전자의 발현을 감소시켰음을 입증하는 RT-qPCR을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 7F는 Dox 단독, Dox/Kyn 동시 처리 및 shAhR 발현 후 ishTDO2 APC-KO MC38 세포주의 콜로니 형성 분석의 전형적인 상을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 7G는 680C91 단독 및 680C91/Kyn 공동-처리 후 APC-KO MC38 세포주의 콜로니 형성 분석으로부터의 전형적인 상을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 7I는 680C91 단독 및 680C91/Kyn으로 처리된 APC- WT 및 APC-KO MC38 세포 용해물에서 절단된 카스파제-3에 대한 면역블롯을 도시한다. 도 7H는 680C91 단독 및 680C91/Kyn으로 처리된 iKAP 세포 용해물에서 절단된 카스파제-3에 대한 면역블롯을 도시한다. 도 7J는 sh대조용 APC-KO MC38 세포주(2×105 세포) 및 2개의 shAhR(#1 및 #2) APC-KO MC38 세포주(2×105 세포)가 동소 이식된 C57BL/6J 마우스의 생존 곡선을 도시한다. Dox 음식이 생체 내 TDO2 녹다운을 유도하기 위해 동소 주사 후 5일째에 적용되었다(sh대조군, n = 7, Dox, n = 8, shAhR #1, #2, n = 7). ***P <0.001. 양측 t-검정.
도 8A 및 8B는 TDO2가 APC-돌연변이 CRC 세포에서 AhR 신호전달을 통해 세포 생존 및 성장을 조절한다는 것을 입증하는 연구로부터의 결과를 도시한다. 도 8A는 shTDO2 DLD-1 세포에서 AhR, CYP1B1 및 CYP1A1의 감소된 발현을 나타내는 RT-qPCR을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. ****P <0.0001. 도 8B는 도 4J의 샘플로부터 생성된 종양 조직에서 Ki67 및 카스파제-3의 IHC를 도시한다. 스케일 바, 100 ㎛.
도 9A-9J는 TDO2-AhR이 대식세포 침윤을 조절함으로써 종양 성장을 매개한다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 9A는 ishTDO2 APC-KO MC38 세포주의 RNA-seq 데이터세트(dox 부재 대 48hr dox, n=3)와 ishTDO2 APC-KO MC38 세포주(dox 부재 대 dox 처리됨, n=3)로 확립된 이종이식 종양의 마이크로어레이 데이터세트 간에 중첩되는 유전자에 대한 GSEA 분석(특징 유전자 세트)을 도시한다. APC-KO 세포에서 상향조절되는 유전자만을 분석하였다. 청색 막대는 면역 반응 관련 경로를 나타낸다. 도 9B는 TDO2 고갈된 APC-KO MC38 세포에서 대안적으로 발현된 유전자와 TNFA 신호전달 및 염증 반응의 GSEA 상관관계를 도시한다. 정규화 농축 점수(NES) 및 명목 P 값이 표시된다. 도 9C는 CRC 동소 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 종양으로부터 CyTOF에 의해 평가된 F4/80 및 CD206 양성 면역 세포의 viSNE 분석을 도시한다. 도 9D는 도 9C에 도시된 종양에서 대식세포(F4/80+) 및 M2 대식세포(CD206+)의 정량분석(quantification)을 도시한다. FlowJo에 의해 분석된 CyTOF 데이터. 데이터는 평균 ± s.d.을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01. 양측 t-검정. 도 9E는 CRC 동소 ishTDO2 CT26 종양으로부터 CyTOF에 의해 평가된 F4/80 및 CD206 양성 면역 세포의 viSNE 분석을 도시한다. 도 9F는 ishTDO2 CT26 세포주로 확립된 종양에서 대식세포(F4/80+) 및 M2 대식세포(CD206+)의 정량분석을 도시한다. CyTOF 데이터는 FlowJo에 의해 분석되었다. 데이터는 평균 ± s.d.을 나타낸다. **P <0.01. 양측 t-검정. 도 9G는 ishTDO2 CT26 세포주(2×105 세포)가 동소 이식된 Balb/C 마우스의 생존 곡선을 도시한다. 클론드로네이트 리포솜 또는 대조용 인캡솜 리포솜은 동소 주사 후 2일째에 복강 내(100 ㎕) 및 주 3회 제공되었다(인캡솜, n = 6, 클로드로네이트, n = 9). ***P <0.001 양측 t-검정. 도 9H는 TDO2 mRNA 발현이 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 환자(n=433)에서 전체 대식세포 마커 및 M2 대식세포 마커의 발현과 유의하게 상관관계가 있음을 도시한다. ****P <0.0001. 도 9I는 음성(n=42) 및 양성 핵 β-카테닌(n=50)을 갖는 인간 CRC 종양에서 CD163에 대한 IHC 염색의 표현을 도시한다. 스케일 바, X10(200 ㎛) 및 X40(50 ㎛). 도 9J는 핵 β-카테닌을 갖는 CRC 종양이 더 높은 CD163 발현을 나타내었음을 도시한다. 피어슨 상관 계수 = 5.074, P = 0.0243. 카이제곱 검정.
도 10A-10G는 TDO2-AhR 축이 APC-돌연변이 CRC 세포에서 해당작용을 매개한다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 10A는 TDO2 고갈된 APC-KO MC38 세포에서 변경된 유전자 발현과 해당작용의 GSEA 상관관계를 도시한다. 정규화 농축 점수(NES) 및 명목 P 값이 표시된다. 도 10B는 용량 의존적인 방식으로 STF-31을 24시간 처리한 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포의 세포 생육력 분석 결과를 도시한다. 그룹당 6개의 복제물. ***P <0.001, 양측 t-검정. 도 10C는 dox 처리가 있거나 없는 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주를 사용한 2-DG 흡수 분석의 결과를 도시한다. n=3 생물학적 복제물. **P <0.01, ***P <0.001, 양측 t-검정. 도 10D는 dox 처리가 있거나 없는 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주로부터의 순화 배지를 사용한 분비된 락테이트의 측정을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. *P <0.05, **P <0.01, 양측 t-검정. 도 10E는 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주에서 해당 경로 유전자의 RT-qPCR 분석을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. **P <0.01, ***P<0.001, ****P <0.0001, 양측 t-검정. 도 10F는 sh대조군 또는 shAhR을 발현하는 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주에서 해당 경로 유전자의 RT-qPCR 분석을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. *P <0.05, ***P <0.001, ****P <0.0001, 양측 t-검정. 도 10G는 ishTDO2 APC-KO MC38 세포주 용해물의 주요 해당 대사산물의 농도 변화를 도시한다. 적색 막대는 dox 처리되지 않은 세포를 나타내고 녹색 막대는 dox 처리된 세포를 나타낸다. n = 5/생물학적 복제물.
도 11A-11D는 CRC 및 BRCA 동소 모델에서 TDO2 녹다운에 의한 감소된 대식세포 침윤을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 11A는 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주로 확립된 CRC 동소 종양 조직에서 F4/80 및 CD163에 대한 IHC 염색을 나타낸다. 스케일 바, 100 ㎛. 도 11B는 ishTDO2 CT26 세포로 확립된 CRC 동소 종양 조직에서 F4/80 및 CD163에 대한 IHC 염색을 나타낸다. 스케일 바, 100 ㎛. 도 11C는 ishTDO2 4T1 세포로 확립된 CRC 동소 종양 조직에서 F4/80 및 CD163에 대한 IHC 염색을 나타낸다. 스케일 바, 100 ㎛. 도 11D는 TDO2 mRNA 발현이 TCGA CRC(COAD + READ, 잠정적) 환자(n=433)에서 조절 T 세포 마커 및 MDSC 마커의 발현과 유의하게 상관됨을 도시한다. ****P <0.0001.
도 12A-12G는 TDO2-AhR-CXCL5 축이 APC-돌연변이된 CRC 종양에서 대식세포 모집을 조절한다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 12A는 RNA-seq 분석에서 확인된 사이토카인 유전자의 발현과 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주를 사용한 RT-qPCR에 의해 검증된 TDO2의 발현을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. *P <0.05, ***P <0.001, ****P <0.0001. 이원 ANOVA 분석. 도 12B는 블랭크, CXCL5, CXCL7 및 CSF3을 발현하는 ishTDO2 APC-KO MC38 세포주로 확립된 종양의 부피를 도시한다. Dox 음식이 생체내 TDO2 녹다운을 유도하기 위해 동소 주사 후 5일째에 적용되었다. n = 4/그룹. n.s. P>0.05, *P<0.05, ****P<0.001, ****P<0.0001. 양측 t-검정. 도 12C는 CRC 동소 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 종양 및 TDO2 고갈과 함께 APC-KO MC38을 발현하는 CXCL5-ORF로부터 CyTOF에 의해 평가된 F4/80 및 CD206 양성 면역 세포의 viSNE 분석을 도시한다. 도 12D 및 12E는 도 12C에 도시된 종양에서 대식세포(F4/80+; 도 12D) 및 M2 대식세포(CD206+; 도 12E)의 정량분석을 도시한다. FlowJo에 의해 분석된 CyTOF 데이터. 데이터는 평균 ± s.d.를 나타내고, n = 3/그룹이다. *P<0.05, **P<0.01. 양측 t-검정. 도 12F는 트랜스웰 분석에서 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 순화 배지와 함께 배양된 이동된 Raw264.7의 전형적인 상을 도시한다. 재조합 CXCL5 단백질(50 ng) 및 SX-682(1 μM)를 36시간 동안 수확된 순화 배지에 첨가하였다. 스케일 바, 100 ㎛. n=3 생물학적 복제물. 정량분석은 하단 패널에 표시된다. n.s. P>0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 t-검정. 도 12G는 ishTDO2 및 ishTDO2/CXCL5-ORF APC-KO MC38 세포주(5 x 105 세포)가 동소 이식된 C57Bl/6J 마우스의 생존 곡선을 도시한다. 클론드로네이트 리포솜 또는 대조용 인캡솜 리포솜은 동소 주사 후 2일째 및 주 3회 복강 내(100 ㎕) 제공되었다. (인캡솜 및 클로드로네이트 그룹, n = 6, Dox 및 Dox + 클로드로네이트 그룹, n = 7, Dox + CXCL5-ORF + 인캡솜, n = 5, Dox + CXCL5-ORF + 클로드로네이트, n = 6). n.s. P>0.05, **P<0.01, ***P<0.001. 양측 t-검정.
도 13A-13I는 CXCL5가 TDO2-AhR 경로에 의해 조절되고 APC-돌연변이 CRC에서 대식세포 모집을 담당한다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 13A는 dox 처리가 있거나 없는 ishTDO2 APC-KO MC38 세포로부터의 순화 배지의 사이토카인 어레이를 도시한다. 적색 상자(1-6으로 표시됨)는 TDO2 녹다운 후 크게 감소한 사이토카인을 나타낸다. 도 13B는 sh대조군 또는 shTDO2를 발현하는 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주로부터의 순화 배지에서 배양된 이동된 BMDM을 나타낸다. n=3 생물학적 복제물. 스케일 바, 50 ㎛. 도 13C는 CXCL5 유전자의 프로모터 상의 AhR에 대한 결합 피크를 나타내는 APC-KO MC38 세포에서의 ChIP-seq를 도시한다. 도 13D는 APC-KO MC38 세포주에서 AhR 녹다운 후 사이토카인의 발현에 대한 RT-qPCR 분석을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 13E는 30h 동안 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포로부터의 순화 배지와 함께 배양된 Raw264.7 세포에서 M2 대식세포 시그니처 유전자의 RT-qPCR 분석을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 13F는 CSF1(50 ng), CXCL5(50 ng) 및 Kyn(1 mM)을 24시간 동안 처리한 BMDM에서 M2 대식세포 시그니처 유전자 Arg1 및 YM1 및 M1 대식세포 시그니처 유전자 iNOS의 RT-qPCR 분석을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. n.s. P>0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001. 양측 t-검정 . 도 13G는 ishTDO2 및 ishTDO2/CXCL5-ORF APC-KO MC38 세포주로 확립된 CRC 동소 종양 조직에서 F4/80 및 CD163에 대한 IHC 염색을 나타낸다. 스케일 바, 100 ㎛. 도 13H는 shCXCL5를 발현하는 ishTDO2 APC-KO MC38 세포주(5 x 105 세포)가 동소 이식된 C57Bl/6J 마우스의 생존 곡선을 도시한다. (isTDO2 및 isTDO2/shCXCL5 #2 그룹, n = 7, isTDO2/shCXCL5 #3, n = 8). ****P<0.0001. 양측 t-검정. 도 13I는 ishTDO2 APC-KO MC38 세포주(5 x 105 세포)가 동소 이식된 C57Bl/6J 마우스의 생존 곡선을 도시한다. (sh대조군 및 shCXCL5 #2 그룹, n = 7, shCXCL5 #3, n = 8). ****P<0.0001. 양측 t-검정.
도 14A-14G는 CXCL5 발현이 CRC 및 BRCA에서 대식세포 집단 및 트립토판 대사와 상관됨을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 14A 및 14B는 TCGA CRC 및 BRCA 데이터베이스에서 대식세포 집단과 CXCL5-높은 종양의 GSEA 상관관계를 도시한다. NES 및 명목 P 값이 표시된다. 도 14C 및 14D는 TCGA CRC(n = 254) 및 BRCA(n = 730) 종양에서 CXCL5 발현과 양의 상관관계가 있는 면역 집단의 목록을 도시한다. 강조 표시된 막대는 대식세포를 나타낸다. NES 값이 표시된다. 도 14E는 CXCL5-높은 TCGA CRC 종양과 트립토판 대사 및 생체이물 대사의 GSEA 상관관계를 도시한다. 정규화 농축 점수(NES) 및 명목 P 값이 표시된다. 도 14F는 CXCL5 발현 및 상관성 상위 6개 트립토판 대사 관련 유전자(TDO2, KYNU, KMO, IDO1, IL4I1, 및 AOX1)의 발현을 기반으로 하는 클러스터링된 TCGA CRC 환자 샘플의 전형적인 상을 평가된 순서로 도시한다(CXCL5 고, n = 127, CXCL5 저, n = 127). 도 14G는 트립토판 대사 및 생체이물 대사와 CXCL5-고 TCGA BRCA 종양의 GSEA 상관관계를 도시한다. 정규화 농축 점수(NES) 및 명목 P 값이 표시된다.
도 15A-15K는 대식세포에 의해 분비된 Gas6이 종양 세포상의 Axl에 결합하고 종양 성장을 촉진한다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. 도 15A는 dox 처리 전후의 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주로부터의 용해물의 마우스 RTK 포스포-어레이를 도시한다. 적색 상자는 Axl을 나타낸다. 도 15B는 R428 처리(0.2 μM, 24h) 후 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포에서 Ax1 및 포스포-Axl에 대한 면역블롯을 도시한다. 도 15C는 24h 동안 재조합 마우스 Gas6 단백질(rmGAS6)을 보충한 후 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포에서 Ax1 및 포스포-Axl에 대한 면역블롯을 도시한다. 도 15D는 36시간 동안 Gas6(25 ng)만 처리하고 R428(1 μM)로 처리한 LS180 및 HT-29 세포주의 콜로니 형성 분석의 표현을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 15E는 용량 의존적인 방식으로 48h 동안 0.5 μM R428로 처리된 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포의 세포 생육력 분석 결과를 도시한다. 그룹당 6개의 복제물. 양측 t-검정. *P<0.05. 도 15F는 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포를 C57BL/6J 마우스에 주사함으로써 확립된 CRC 동소 종양에서 인산화된 Axl(RFP)의 면역형광 염색을 도시한다. 상피 세포는 EpCam으로 염색되고 GFP로 표시된다. X63 배율. 도 15G는 ishTDO2 APC-WT 및 APC-KO MC38 세포주로부터의 순화 배지에서 배양된 BMDM에서 Gas6 발현의 RT-qPCR 분석을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. n.s. P>0.05, ****P<0.0001. 양측 t-검정. 도 15H는 24시간 동안 CSF1(50 ng), Kyn(1 mM), CXCL5(50 ng) 및 Gas6(25 ng)으로 처리된 BMDM에서 Gas6 발현의 RT-qPCR 분석을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. ****P<0.0001. 양측 t-검정. 도 15I는 RT-qPCR이 Raw264.7에서 GAS6 shRNA 녹다운 효율을 나타냄을 도시한다. n=3 생물학적 복제물. 도 15J는 CT26 세포(1×105 세포) 및 대식세포 세포주 Raw264.7(1×105 세포)을 sh대조군 또는 shGAS6과 함께 동소 동시 주사 후 20일째에 BalB/CJ 마우스의 전형적인 생체내 생물발광 기반 상을 도시한다. 종점에서의 전체 플럭스 측정. **P<0.01. 양측 t-검정. 도 15K는 주사 전 48h 동안 100 ng의 CXCL5로 전-처리된 CT26 세포(1×105 세포) 및 대식세포 세포주 Raw264.7(1×105 세포)의 동소 동시 주사 후 20일째에 BalB/CJ 마우스의 전형적인 생체내 생물발광 기반 상을 도시한다. 종점에서 종양의 전체 플럭스 측정을 수행하였다. **P<0.01. 양측 t-검정.
도 16은 APC-결핍 CRC 세포에서 TDO2-Kyn-AhR-CXCL5 축의 활성화 및 TAM의 모집을 위한 연구 모델의 개략도를 도시한다.
종양 억제인자 대장선종용종(APC)의 불활성화는 산발성 결장직장암(CRC)의 대다수(~90%) 발병의 중요한 시작 사건이다. APC 손실은 다른 많은 암 유형에서도 자주 발생한다. APC 신호 전달 캐스케이드는 암 치료를 위한 애매한 표적으로 남아 있었다. 합성 필수성의 개념을 사용하여, 트립토판 2,3-디옥시게나제 2(TDO2)는 본원에서 APC-결핍 암에 대한 합성 필수(SE) 유전자로서 식별된다. 기계적으로, TDO2-Kyn-AhR 축의 활성화는 해당 작용을 유도하고 APC-결핍 CRC 세포에서 세포 증식 및 성장을 촉진할 뿐만 아니라 종양 관련 대식세포(TAM)를 모집하는 CXCL5를 상향 조절한다. 이러한 TAM은 면역억제성 종양 미세환경(TME)을 촉진할 뿐만 아니라 암 세포에서 AXL을 활성화하는 GAS6의 분비를 통해 암 세포 생존을 지원한다. 따라서 APC-결핍은 CRC TME에서 암 세포와 침윤성 TAM 사이의 공생 관계를 설정하는 TDO2 구동 회로를 생성한다. 일부 구현예에서, APC-결핍 종양의 치료를 위해 TDO2 및 하류 효과기(예를 들어, 사이토카인)를 표적화하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시되어 있다.
I. TDO2 핵산 및 폴리펩티드
트립토판 2,3-디옥시게나제 2(TDO2)는 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재된 하기 DNA, mRNA 및 단백질 서열에 의해 예시된다. 일부 구현예에서, TDO2는 효소 위원회(EC) 분류 번호 1.13.11.11을 갖는 효소이다.
예를 들어, TDO2 유전자는 호모 사피엔스 트립토판 2,3-디옥시게나제(NCBI 참조 서열: NC_000004.12)에 의해 예시될 수 있다.
다른 예에서, TDO2 mRNA는 호모 사피엔스 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO2), mRNA(NCBI 참조 서열: NM_005651.4)에 의해 예시된다.
다른 예에서, TDO2 단백질은 호모 사피엔스 트립토판 2,3-디옥시게나제(NCBI 참조 서열: NP_005642.1)에 의해 예시된다:
MSGCPFLGNNFGYTFKKLPVEGSEEDKSQTGVNRASKGGLIYGNYLHLEKVLNAQELQSETKGNKIHDEHLFIITHQAYELWFKQILWELDSVREIFQNGHVRDERNMLKVVSRMHRVSVILKLLVQQFSILETMTALDFNDFREYLSPASGFQSLQFRLLENKIGVLQNMRVPYNRRHYRDNFKGEENELLLKSEQEKTLLELVEAWLERTPGLEPHGFNFWGKLEKNITRGLEEEFIRIQAKEESEEKEEQVAEFQKQKEVLLSLFDEKRHEHLLSKGERRLSYRALQGALMIYFYREEPRFQVPFQLLTSLMDIDSLMTKWRYNHVCMVHRMLGSKAGTGGSSGYHYLRSTVSDRYKVFVDLFNLSTYLIPRHWIPKMNPTIHKFLYTAEYCDSSYFSSDESD (서열번호 1).
일부 구현예에서, TDO2 폴리펩티드 또는 핵산은 인간 TDO2 폴리펩티드 또는 인간 TDO2 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, TDO2 폴리펩티드 또는 TDO2 핵산은 비-인간이다. 일부 구현예에서, TDO2 폴리펩티드 또는 TDO2 핵산은 마우스, 말, 개, 토끼 또는 염소로부터 유래한다.
II. 억제제
본 개시내용의 측면은 TDO2의 억제제 및/또는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 TDO2의 억제제를 포함한다. TDO2의 억제제는 TDO2의 발현 및/또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 분자를 기재할 수 있다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 TDO2의 효소 활성을 억제하는 역할을 할 수 있는 소분자 억제제이다. 소분자 TDO2 억제제의 예는 PF06845102/EOS200809, 680C91, LM10, HTI-1090, DN1406131, RG70099, EPL-1410, CB548, CMG017 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 이중 TDO2/IDO1 억제제이다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 이중 TDO2/IDO2 억제제이다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 선택적 TDO2 억제제이다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 세포에서 TDO2 발현을 억제할 수 있는 핵산이다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 TDO2 mRNA의 번역을 표적화하고 억제하도록 설계된 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 또는 유사한 핵산이다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 TDO2 단백질(서열번호 1)을 암호화하는 TDO2 메신저 RNA의 전부 또는 일부에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, TDO2 억제제는 항체, 항체-유사 분자, 또는 다른 TDO2 결합 단백질이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함한다. TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인은 TDO2의 효소 활성의 결과로 발현이 증가된 사이토카인을 기재할 수 있다. TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인에는 CXCL5, CXCL7, CSF3, CXCR2, CXCL2, CXCL10, CCL2 및 CXCL1이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 개시된 방법은 CXCL5의 억제제를 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제는 세포에서 사이토카인의 발현을 억제할 수 있는 핵산이다. 일부 구현예에서, 이러한 억제제는 사이토카인 mRNA의 번역을 표적화하고 억제하도록 설계된 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 유사한 핵산이다. 일부 구현예에서, TDO 억제제는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인(예를 들어, CXCL5, CXCL7, CSF3, CXCR2, CXCL2, CXCL10, CCL2, 또는 CXCL1)을 암호화하는 메신저 RNA의 전부 또는 일부에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 항체-유사 분자, 또는 다른 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 개시된 방법은 CXCL5, CXCL1 또는 CXCL2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 개시된 방법은 CXCL5에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공하는 것을 포함한다.
A. 억제성 올리고뉴클레오티드
일부 측면에서, 본 개시내용은 TDO2의 유전자 발현을 억제하는 억제성 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 억제성 올리고뉴클레오티드의 예는 siRNA(작은 간섭 RNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 이중 가닥 RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 억제성 올리고뉴클레오티드는 유전자의 전사를 억제하거나 세포에서 유전자 전사물의 번역을 방지할 수 있다. 억제성 올리고뉴클레오티드 산은 16 내지 1000개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 특정 구현예에서는 18 내지 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 기껏해야 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90개(또는 이 중에서 유도 가능한 임의의 범위)의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 억제성 RNA를 암호화하는 DNA, RNA, 또는 cDNA일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된"은 인간 개입을 통해 자연 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 siRNA는 "단리"되지 않지만, 합성 siRNA, 또는 자연 상태의 공존 물질에서 부분적으로 또는 완전히 분리된 siRNA는 "단리"된다. 단리된 siRNA는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 siRNA가 전달된 세포와 같은 비-고유 환경에 존재할 수 있다.
억제성 올리고뉴클레오티드는 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, siRNA 및 이중 가닥 RNA는 미국특허 제6,506,559호 및 제6,573,099호뿐만 아니라 미국 특허 공개 2003/0051263, 2003/0055020, 2004/0265839, 2002/0168707, 2003/0159161, 및 2004/0064842에 기재되어 있으며, 이들 모두는 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특히, 억제성 올리고뉴클레오티드는 TDO2의 발현을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 또는 전술한 것 사이의 임의의 범위 또는 값까지 감소시킬 수 있다.
추가의 구현예에서, TDO2 억제제인 합성 올리고뉴클레오티드가 개시된다. 억제제는 길이가 17 내지 25개의 뉴클레오티드일 수 있으며, 성숙한 TDO2 mRNA의 5'에서 3' 서열에 대해 적어도 90% 상보적인 5'에서 3' 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 억제제 분자는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이 중에서 유도 가능한 임의의 범위이다. 더욱이, 억제제 분자는 성숙한 TDO2 mRNA, 특히 성숙한 천연 mRNA의 5'에서 3' 서열에 대해 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 또는 100% 상보적이거나 또는 적어도 상보적이거나, 또는 이 중에서 유도 가능한 임의의 범위로 상보적인 서열(5'에서 3'으로)을 갖는다.
일부 구현예에서, 억제성 올리고뉴클레오티드는 유사체이며, 변형, 특히 뉴클레아제 내성을 증가시키고, 결합 친화성을 개선시키고/시키거나, 결합 특이성을 개선시키는 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 당 부분이 카보사이클릭 부분에 의해 대체되면 이는 더 이상 당이 아니다. 더욱이, 다른 치환, 예를 들어 당-간 포스포디에스테르 결합에 대한 이와 같은 치환이 이루어질 때, 생성된 물질은 더 이상 진정한 종이 아니다. 이러한 모든 화합물이 유사체로 간주된다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 핵산 종의 당 부분에 대한 언급은 진정한 당 또는 야생형 핵산의 당의 구조적 지위를 차지하는 종을 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 당-간 연결에 대한 언급은 야생형 핵산의 방식으로 당 또는 당 유사체 부분을 연결하는 역할을 하는 모이어티를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
III. 치료 방법
본 개시내용의 조성물은 생체내, 시험관내 또는 생체외 투여에 사용될 수 있다. 조성물의 투여 경로는 예를 들어, 피내, 피하, 정맥내, 국소, 국소 및 복강내 투여일 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 방법은 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 암은 고형 종양, 전이성 암, 또는 비-전이성 암일 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 비뇨기, 자궁경부, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 기원할 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 결장에서 기원한다. 일부 구현예에서, 암은 직장에서 기원한다.
암은 구체적으로 하기 조직학적 유형 중 하나 이상의 것일 수 있지만 이에 제한되지 않는다: 미분화 암종, 방광, 혈액, 뼈, 뇌, 유방, 비뇨기, 식도, 흉선종, 십이지장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 연조직, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀, 자궁, 흉선, 피부 편평 세포, 비결장직장 위장관, 결장직장, 흑색종, 메르켈 세포, 신장-세포, 자궁경부, 간세포, 요로상피, 비소세포 폐, 두경부, 자궁내막, 식도위, 소세포 폐 중피종, 난소, 식도위, 교모세포종, 부신, 눈, 췌장, 생식 세포, 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종(small cell carcinoma); 유두 암종(papillary carcinoma); 편평세포 암종(squamous cell carcinoma); 림프상피 암종(lymphoepithelial carcinoma); 기저세포 암종(basal cell carcinoma); 필로매트릭스 암종(pilomatrix carcinoma); 이행세포 암종(transitional cell carcinoma); 유도 이행세포 암종(papillary transitional cell carcinoma); 선암종(adenocarcinoma); 담관암종(cholangiocarcinoma); 간세포 암종(hepatocellular carcinoma); 복합 간세포 암종 및 담관암종(combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma); 섬유주 선암종(trabecular adenocarcinoma); 선양 낭성 암종(adenoid cystic carcinoma); 선종성 폴립의 선암종(adenocarcinoma in adenomatous polyp); 가족성 대장선종용종(adenocarcinoma, familial polyposis coli); 고형 암종(solid carcinoma); 기관지-폐포 선암종(branchiolo-alveolar adenocarcinoma); 유두 선암종(papillary adenocarcinoma); 혐색소세포 암종(chromophobe carcinoma); 호산구 암종(acidophil carcinoma); 호산성 선암종(oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종(basophil carcinoma); 투명세포 선암종(clear cell adenocarcinoma); 과립 세포 암종(granular cell carcinoma); 여포 선암종(follicular adenocarcinoma); 유두 및 여포 선암종(papillary and follicular adenocarcinoma); 비외막 경화성 암종(nonencapsulating sclerosing carcinoma); 부신 피질 암종(adrenal cortical carcinoma); 자궁내막암종(endometroid carcinoma); 피부 부속기 암종(skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(apocrine adenocarcinoma); 피지 선암종(sebaceous adenocarcinoma); 귀지 선암종(ceruminous adenocarcinoma); 점막표피양 암종(mucoepidermoid carcinoma); 낭선암종(cystadenocarcinoma); 유두 낭선암종(papillary cystadenocarcinoma); 유두 장액성 낭선암종(papillary serous cystadenocarcinoma); 점액성 낭선암종(mucinous cystadenocarcinoma); 점액성 선암종(mucinous adenocarcinoma); 반지세포 암종(signet ring cell carcinoma); 침윤성 관암종(infiltrating duct carcinoma); 수질암종(medullary carcinoma); 소엽 암종(lobular carcinoma); 염증성 암종(inflammatory carcinoma); 파제트병, 유방(Paget's disease, mammary); 포상세포 암종(acinar cell carcinoma); 선편평 암종(adenosquamous carcinoma); 흉선종(thymoma); 협막세포종(thecoma); 남성모세포종(androblastoma); 세르톨리세포 암종(sertoli cell carcinoma); 악성 흑색종(malignant melanoma); 흑색성 흑색종(amelanotic melanoma); 표재성 확산 흑색종(superficial spreading melanoma); 상피세포 흑색종(epithelioid cell melanoma); 육종(sarcoma); 중간엽(mesenchymal)(예를 들어, 섬유육종(fibrosarcoma); 섬유성 조직구증(fibrous histiocytoma); 점액육종(myxosarcoma); 지방육종(liposarcoma); 평활근육종(leiomyosarcoma); 횡문근육종(rhabdomyosarcoma); 배아 횡문근육종(embryonal rhabdomyosarcoma); 폐포 횡문근육종(alveolar rhabdomyosarcoma); 기질 육종(stromal sarcoma); 뮬러 혼합 종양(mullerian mixed tumor); 신모세포종(nephroblastoma); 간모세포종(hepatoblastoma); 암육종(carcinosarcoma); 이상 생식세포종(dysgerminoma); 배아 암종(embryonal carcinoma); 융모막암종(choriocarcinoma); 중신종(mesonephroma); 혈관육종(hemangiosarcoma); 카포시 육종(Kaposi's sarcoma); 림프관육종(lymphangiosarcoma); 골육종(osteosarcoma); 피질옆 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종(chondrosarcoma); 중간엽 연골육종(mesenchymal chondrosarcoma); 벼의 거대세포 종양(giant cell tumor of bone); 유잉 육종(Ewing's sarcoma); 변색성 상아육종(ameloblastic odontosarcoma); 변색성 섬유육종(ameloblastic fibrosarcoma); 척색종(chordoma); 뇌실막종(ependymoma); 성상세포종(astrocytoma); 원형질 성상세포종(protoplasmic astrocytoma); 원섬유성 성상세포종(fibrillary astrocytoma); 성상모세포종(astroblastoma); 희소돌기아교종(oligodendroglioma); 희소돌기모세포종(oligodendroblastoma); 원시 신경외배엽(primitive neuroectodermal); 소뇌 육종(cerebellar sarcoma); 신경절신경모세포종(ganglioneuroblastoma); 신경모세포종(neuroblastoma); 망막모세포종(retinoblastoma); 후각신경성 종양(olfactory neurogenic tumor); 신경섬유육종(neurofibrosarcoma); 부육아종(paragranuloma)); 또는 조혈성(예를 들어, 다발성 골수종(multiple myeloma); 비만세포 육종(mast cell sarcoma); 면역증식성 소장 질환(immunoproliferative small intestinal disease); 백혈병(leukemia); 림프성 백혈병(lymphoid leukemia); 형질세포 백혈병(plasma cell leukemia); 적혈구 백혈병(erythroleukemia); 림프육종 세포 백혈병(lymphosarcoma cell leukemia); 골수성 백혈병(myeloid leukemia); 호염기성 백혈병(basophilic leukemia); 호산구성 백혈병(eosinophilic leukemia); 단핵구성 백혈병(monocytic leukemia); 비만세포 백혈병(mast cell leukemia); 거핵모세포성 백혈병(megakaryoblastic leukemia); 골수 육종(myeloid sarcoma); 모세포 백혈병(hairy cell leukemia)).
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 암을 치료하는 것을 포함하며, 여기서 암은 결장직장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 두경부 편평 세포 암종, 또는 육종이다. 일부 구현예에서, 암은 결장직장암(CRC)이다. 일부 구현예에서, 암은 구성적으로 활성인 WNT 신호전달을 갖는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 APC-결핍 암이다. 일부 구현예에서, 암은 APC-결핍 CRC이다.
본원에 사용된 "APC-결핍 암"은 정상 또는 비-암성 세포에 비해 대장선종용종(APC) 유전자 또는 단백질의 발현 및/또는 활성이 감소된 암을 기재한다. 일례에서, APC-결핍 암은 APC 유전자 또는 APC 유전자의 조절 영역에 돌연변이가 있는 암이며, 여기서 돌연변이는 APC의 발현을 방지한다. 또 다른 예에서, APC-결핍 암은 APC 유전자에 돌연변이가 있는 암이며, 여기서 돌연변이는 APC 단백질이 정상적으로 기능하는 것을 방지한다(예를 들어, 단백질의 미스폴딩을 유발한다). 또 다른 예에서, APC-결핍 암은 APC 유전자 발현의 후성적 억제를 갖는 암이다.
본 개시내용의 특정 측면은 APC-결핍 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 개시된 방법은 예를 들어 DNA 서열분석, 폴리머라제 연쇄 반응, 또는 다른 적합한 분자 기법을 통해 치료 전에 대상체로부터 암 세포에서 APC 결핍(예를 들어, 돌연변이, 후성유전적 억제 등)을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 결핍이 있는 암에 걸린 것으로 알려진 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 결핍이 있는 암을 갖는 것으로 추정되는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결장직장암이 APC 결핍을 갖는 것으로 추정되는, 상기 결장직장암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 개시된 방법은 대상체로부터의 암 세포에서 APC 결핍을 검출하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 대상체로부터의 건강한(예를 들어, 비암성) 세포에서 APC 결핍을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 APC 결핍이 있는 것으로 공지된 대상체를 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 방법은 가족성 선종성 용종증(FAP)이 있는 대상체를 진단하고/하거나 FAP가 있는 것으로 알려진 대상체를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 방법은 대상체의 건강한 세포에서 APC 결핍을 검출하는 단계를 포함하지 않는다.
IV. 면역 요법
일부 구현예에서, 개시된 방법은 암 면역요법의 투여를 포함한다. 암 면역 요법(때때로 면역-종양학, 약칭 IO라고도 함)은 암을 치료하기 위해 면역계를 사용하는 것이다. 면역 요법은 능동, 수동 또는 혼성(능동 및 수동)으로 분류될 수 있다. 이러한 접근 방식은 암 세포가 표면에 종양 관련 항원(TAA)으로 알려진 면역계에 의해 감지될 수 있는 분자를 가지고 있다는 사실을 이용하며; 이들 분자는 종종 단백질 또는 기타 거대분자(예를 들어, 탄수화물)이다. 능동 면역 요법은 TAA를 표적으로 하여 면역계가 종양 세포를 공격하도록 지시한다. 수동 면역 요법은 기존의 항종양 반응을 강화하며, 단클론 항체, 림프구 및 사이토카인의 사용을 포함한다. 특정 면역 요법이 당업계에 공지되어 있으며, 일부를 하기에 기재한다.
1. 공동-자극 분자의 활성화
일부 구현예에서, 면역 요법은 공동-자극 분자의 작용제를 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 B7-1(CD80), B7-2(CD86), CD28, ICOS, OX40(TNFRSF4), 4-1BB(CD137; TNFRSF9), CD40L(CD40LG), GITR(TNFRSF18)의 작용제, 및 이들의 조합을 포함한다. 작용제는 작용 항체, 폴리펩티드, 화합물 및 핵산을 포함한다.
A. 관문 억제제 및 병용 치료
본 개시내용의 구현예는 면역 관문 억제제의 투여를 포함할 수 있으며, 이는 하기에 추가로 설명된다.
1. PD-1, PDL1 및 PDL2 억제제
PD-1은 T 세포가 감염 또는 종양과 만나는 종양 미세 환경에서 작용할 수 있다. 활성화된 T 세포는 PD-1을 상향조절하고 말초 조직에서 계속해서 PD-1을 발현한다. IFN-감마와 같은 사이토카인은 상피 세포 및 종양 세포에서 PDL1의 발현을 유도한다. PDL2는 대식세포 및 수지상 세포에서 발현된다. PD-1의 주요 역할은 말초에서 효과기 T 세포의 활성을 제한하고 면역 반응 동안 조직에 대한 과도한 손상을 방지하는 것이다. 본 개시내용의 억제제는 PD-1 및/또는 PDL1 활성의 하나 이상의 기능을 차단할 수 있다.
"PD-1"의 대체명에는 CD279 및 SLEB2가 포함된다. "PDL1"의 대체명에는 B7-H1, B7-4, CD274 및 B7-H가 포함된다. "PDL2"의 대체명에는 B7-DC, Btdc 및 CD273이 포함된다. 일부 구현예에서, PD-1, PDL1, 및 PDL2는 인간 PD-1, PDL1 및 PDL2이다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 PD-1의 이의 리간드 결합 상대에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 측면에서, PD-1 리간드 결합 상대는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 억제제는 PDL1의 이의 결합 상대에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 측면에서, PDL1 결합 상대는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 억제제는 PDL2의 이의 결합 상대에 대한 결합을 억제하는 분자이다. 특정 측면에서, PDL2 결합 상대는 PD-1이다. 억제제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드일 수 있다. 예시적인 항체는 미국특허 제8,735,553호, 제8,354,509호 및 제8,008,449호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다. 본원에 제공된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 다른 PD-1 억제제는 미국특허 출원 번호 US2014/0294898, US2014/022021, 및 US2011/0008369(모두 본원에 참고로 포함된다)에 기재된 것과 같이 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, PD-1 억제제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 피딜리주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 억제제는 면역부착소(예를 들어, 불변 영역(예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역부착소)이다. 일부 구현예에서, PDL1 억제제는 AMP-224를 포함한다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO®로서 또한 공지된 니볼루맙은 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA® 및 SCH-900475로서 또한 공지된 펨브롤리주맙은 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. CT-011, hBAT, 또는 hBAT-1으로서 또한 공지된 피딜리주맙은 WO2009/101611에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로서 또한 공지된 AMP-224는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다. 추가적인 PD-1 억제제는 MEDI0680(또한 AMP-514라고도 함) 및 REGN2810을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PDL1 억제제, 예를 들어 MEDI4736으로서 또한 공지된 더발루맙, MPDL3280A로서 또한 공지된 아테졸리주맙, MSB00010118C로서 또한 공지된 아벨루맙, MDX-1105, BMS-936559, 또는 이들의 조합이다. 특정 측면에서, 면역 관문 억제제는 rHIgM12B7과 같은 PDL2 억제제이다.
일부 구현예에서, 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 피딜리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 억제제는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 피딜리주맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 피딜리주맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 동일한 PD-1, PDL1 또는 PDL2 상의 에피토프와 결합에 대해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 또는 99%(또는 이 중의 임의의 유도 가능한 범위)의 가변 영역 아미노산 서열 일치성을 갖는다.
2. CTLA-4, B7-1, 및 B7-2
본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 CD152로서 또한 공지된 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁 번호 L15006을 가지고 있다. CTLA-4는 T 세포 표면에서 발견되며, 항원 제시 세포 표면의 B7-1(CD80) 또는 B7-2(CD86)에 결합될 때 "오프" 스위치로 작용한다. CTLA4는, 헬퍼 T 세포의 표면에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전달하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CTLA4는 T 세포 공동 자극 단백질인 CD28과 유사하며 두 분자 모두 항원 제시 세포상의 B7-1 및 B7-2에 결합한다. CTLA-4는 억제 신호를 T 세포에 전달하는 반면, CD28은 자극 신호를 전달한다. 세포내 CTLA-4는 또한 조절 T 세포에서도 발견되며 그 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인 CTLA-4의 발현을 증가시킨다. 본 개시내용의 억제제는 CTLA-4, B7-1 및/또는 B7-2 활성의 하나 이상의 기능을 차단할 수 있다. 일부 구현예에서, 억제제는 CTLA-4 및 B7-1 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 억제제는 CTLA-4 및 B7-2 상호작용을 차단한다.
일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드이다.
본 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당업계에서 인정된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제8,119,129호, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504(CP675,206, 트레멜리무맙으로서 또한 공지됨; 이전에는 티실리무맙), 미국특허 제6,207,156호; 문헌[Hurwitz et al., 1998]에 개시된 항-CTLA-4 항체가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 상기 언급된 각각의 간행물의 교시 내용은 본원에 참고로 포함된다. CTLA-4에 대한 결합에 대해 이러한 기술분야에서 인정된 항체와 경쟁하는 항체도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간화 CTLA-4 항체가 국제특허출원 번호 WO2001/014424, WO2000/037504 및 미국특허 제8,017,114호(모두 본원에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에서 관문 억제제로서 유용한 추가의 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(10D1, MDX-010, MDX-101 및 Yervoy®로서 또한 공지됨) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다(예를 들어, WO0 1/14424를 참조하시오).
일부 구현예에서, 억제제는 트레멜리무맙 또는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 억제제는 트레멜리무맙 또는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 트레멜리무맙 또는 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 동일한 PD-1, B7-1 또는 B7-2 상의 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 또는 99%(또는 이 중의 임의의 유도 가능한 범위)의 가변 영역 아미노산 서열 일치성을 갖는다.
B. 수지상 세포 요법
수지상 세포 요법은 수지상 세포가 종양 항원을 림프구에 제시하도록 하여 항종양 반응을 유발하고, 이는 림프구를 활성화시켜 항원을 제시하는 다른 세포를 살해하도록 자극한다. 수지상 세포는 포유동물 면역계의 항원 제시 세포(APC)이다. 암 치료에서 상기 세포는 암 항원 표적화를 돕는다. 수지상 세포를 기반으로 한 세포 암 요법의 일례는 시풀류셀-T이다.
수지상 세포가 종양 항원을 제시하도록 유도하는 한 가지 방법은 자가 종양 용해물 또는 짧은 펩티드(암 세포의 단백질 항원에 해당하는 단백질의 작은 부분)로 백신접종하는 것이다. 이러한 펩티드는 면역 및 항종양 반응을 증가시키기 위해 종종 항원보강제(고도의 면역원성 물질)와 함께 제공된다. 다른 항원보강제는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 수지상 세포를 유인 및/또는 활성화하는 단백질 또는 기타 화학 물질을 포함한다.
수지상 세포는 또한 종양 세포가 GM-CSF를 발현하도록 함으로써 생체내에서 활성화될 수 있다. 이것은 GM-CSF를 생성하도록 종양 세포를 유전적으로 조작하거나 GM-CSF를 발현하는 종양 용해성 바이러스로 종양 세포를 감염시킴으로써 달성될 수 있다.
또 다른 전략은 환자의 혈액에서 수지상 세포를 제거하고 신체 외부에서 활성화시키는 것이다. 수지상 세포는 단일 종양 특이적 펩티드/단백질 또는 종양 세포 용해물(분해된 종양 세포의 용액)일 수 있는 종양 항원의 존재 하에서 활성화된다. 이 세포(임의의 항원보강제 포함)를 주입하여 면역 반응을 유발시킨다.
수지상 세포 요법에는 수지상 세포 표면의 수용체에 결합하는 항체의 사용이 포함된다. 항원을 항체에 가할 수 있으며 상기 항원은 수지상 세포가 성숙하도록 유도하고 종양에 대한 면역성을 제공할 수 있다. TLR3, TLR7, TLR8 또는 CD40과 같은 수지상 세포 수용체가 항체 표적으로 사용되었다.
C. CAR-T 세포 요법
키메라 항원 수용체(CAR, 키메라 면역수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 인공 T 세포 수용체로서 또한 공지됨)는 암 세포를 표적화하기 위해 면역 세포와 새로운 특이성을 겸비하는 조작된 수용체이다. 일반적으로 이러한 수용체는 단클론 항체의 특이성을 T 세포에 접목시킨다. 수용체는, 다른 공급원의 부분이 융합되어 있기 때문에 키메라라고 한다. CAR-T 세포 요법은 이러한 형질전환된 세포를 암 요법에 활용하는 치료를 지칭한다.
CAR-T 세포 설계의 기본 원리는 항원 결합 기능과 T 세포 활성화 기능을 겸비하는 재조합 수용체를 수반한다. CAR-T 세포의 일반적인 전제는 암 세포에서 발견되는 마커를 표적으로 하는 T 세포를 인공적으로 생성시키는 것이다. 과학자들은 사람에게서 T 세포를 제거하고 유전적으로 변형시킨 다음, 암 세포를 공격하도록 이를 환자에게 다시 주입할 수 있다. T 세포가 CAR-T 세포가 되도록 조작되면 "살아 있는 약물"로 작용한다. CAR-T 세포는 세포외 리간드 인식 도메인과 세포내 신호전달 분자 사이에 연결을 생성하고 차례로 T 세포를 활성화한다. 세포외 리간드 인식 도메인은 일반적으로 단쇄 가변 단편(scFv)이다. CAR-T 세포 요법의 안전성의 중요한 측면은 정상 세포가 아닌 암 세포만 표적화하는 방법이다. CAR-T 세포의 특이성은 표적 분자의 선택에 의해 결정된다.
CAR-T 요법의 예로는 Tisagenlecleucel(Kymriah) 및 Axicabtagene ciloleucel(Yescarta)이 있다. 일부 구현예에서, CAR-T 요법은 CD19를 표적으로 한다.
D. 사이토카인 요법
사이토카인은 종양 내에 존재하는 여러 유형의 세포에 의해 생성되는 단백질이다. 상기는 면역 반응을 조절할 수 있다. 종양은 종종, 종양이 성장할 수 있게 하고 면역 반응을 감소시키기 위해 상기 단백질을 사용한다. 이러한 면역 조절 효과로 인해 상기는 면역 반응을 유발하는 약물로 사용될 수 있다. 일반적으로 사용되는 두 가지 사이토카인은 인터페론 및 인터류킨이다.
인터페론은 면역계에 의해 생성된다. 상기는 일반적으로 항-바이러스 반응에 관여하지만 암에도 사용된다. 상기는 유형 I(IFNα 및 IFNβ), 유형 II(IFNγ) 및 유형 III(IFNλ)의 3개 그룹으로 나뉜다.
인터류킨은 다양한 면역계 효과를 갖는다. IL-2는 예시적인 인터류킨 사이토카인 요법이다.
E. 입양 T-세포 요법
입양 T 세포 요법은 T 세포의 이입(transfusion)(입양 세포 이식)에 의한 수동 면역의 한 형태이다. 이는 혈액과 조직에서 발견되며, 대개는 외부 병원체를 발견하면 활성화된다. 특히 T 세포의 표면 수용체가 표면 항원상에 외부 단백질의 일부를 내보이는 세포를 만날 때 활성화된다. 상기는 감염된 세포 또는 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 상기는 정상 조직과 종양 조직에서 발견되며, 여기서 상기는 종양 침윤 림프구(TIL)로서 알려져 있다. 상기는 종양 항원을 제시하는 수지상 세포와 같은 APC의 존재에 의해 활성화된다. 상기 세포는 종양을 공격할 수 있지만, 종양 내 환경은 고도로 면역억제성이어서, 면역-매개된 종양 사멸을 방지한다.
종양 표적화된 T-세포를 생산하고 획득하는 다수의 방법이 개발되었다. 종양 항원에 특이적인 T-세포를 종양 샘플(TIL)로부터 제거하거나 혈액에서 여과할 수 있다. 후속 활성화 및 배양을 생체 외에서 수행하고, 결과적으로 재주입한다. 활성화가 유전자 요법을 통해 또는 T 세포를 종양 항원에 노출시킴으로써 일어날 수 있다.
암 치료가 본원에 기재된 암 치료 중 임의의 것을 배제할 수 있음이 고려된다. 또한, 본 개시내용의 구현예는 본원에 기재된 요법에 대해 이전에 치료를 받았거나, 현재 본원에 기재된 요법에 대해 치료를 받고 있거나, 본원에 기재된 요법에 대해 치료를 받지 않은 환자를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 본원에 기재된 요법에 내성이 있는 것으로 밝혀진 환자이다. 일부 구현예에서, 환자는 본원에 기재된 요법에 민감한 것으로 밝혀진 환자이다.
V. 샘플 제조
특정 측면에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 것을 포함한다. 본원에 제공된 수득 방법은 미세 바늘 흡인, 코어 바늘 생검, 진공 보조 생검, 절개 생검, 절제 생검, 펀치 생검, 면도 생검 또는 피부 생검과 같은 생검 방법을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 이전에 언급된 임의의 생검 방법에 의해 식도 조직의 생검으로부터 수득된다. 다른 구현예에서 샘플은 혈청, 담낭, 점막, 피부, 심장, 폐, 유방, 췌장, 혈액, 간, 근육, 신장, 평활근, 방광, 결장, 장, 뇌, 전립선, 식도 또는 갑상선 조직으로부터의 비-암성 또는 암성 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 제공된 조직 중 임의의 조직으로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 샘플을 혈액, 땀, 모낭, 협측 조직, 눈물, 생리혈, 대변 또는 타액을 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 다른 공급원으부터 수득할 수 있다. 현행 방법의 특정 측면에서 의사, 간호사 또는 의료 기술자와 같은 의료 전문가는 시험을 위해 생물학적 샘플을 획득할 수 있다. 또한, 의료 전문가의 도움 없이 생물학적 샘플을 얻을 수 있다.
샘플은 대상체의 세포로부터, 또는 상기 세포로부터 유래된 조직, 세포, 또는 생물학적 물질이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직의 이종 또는 동종 집단일 수 있다. 생물학적 샘플은 본원에 기재된 분석 방법에 적합한 샘플을 제공할 수 있는 당업계에 알려진 모든 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 샘플을, 피부 또는 자궁 경부의 긁기, 뺨의 면봉채취, 타액 수집, 소변 수집, 대변 수집, 생리혈, 눈물 또는 정액 수집을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비침습적 방법으로 수득할 수 있다.
샘플을 당업계에 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 특정 구현예에서 샘플을 생검에 의해 수득한다. 다른 구현예에서, 샘플을 면봉 채취, 내시경검사, 긁어내기, 정맥 절개술, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수득한다. 일부 경우에, 본 방법의 키트의 구성요소를 사용하여 샘플을 수득하거나, 저장하거나, 수송할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 방법에 의한 진단을 위해 다중 식도 샘플과 같은 다중 샘플을 수득할 수 있다. 다른 경우에, 상기 방법에 의한 진단을 위해, 하나의 조직 유형(예를 들어 식도)으로부터의 하나 이상의 샘플 및 또 다른 시편(예를 들어 혈청)으로부터의 하나 이상의 샘플과 같은 다중 샘플을 수득할 수 있다. 일부 경우에, 하나의 조직 유형(예를 들어 식도)의 하나 이상의 샘플 및 또 다른 시편(예를 들어 혈청)으로부터의 하나 이상의 샘플과 같은 다중 샘플을 동일하거나 상이한 시간에 수득할 수 있다. 상이한 시간에 샘플을 수득할 수 있으며 상이한 방법으로 저장 및/또는 분석할 수 있다. 예를 들어, 샘플을 일상적인 염색 방법 또는 기타 세포학적 분석 방법에 의해 수득하고 분석할 수 있다.
일부 구현예에서 생물학적 샘플을 의사, 간호사, 또는 의료 기술자, 내분비학자, 세포학자, 사혈학자, 방사선과 의사 또는 호흡기학자와 같은 기타 의료 전문가에 의해 수득할 수 있다. 의료 전문가는 샘플에 대해 수행할 적절한 시험 또는 분석을 지시할 수 있다. 특정 측면에서 분자 프로파일링 사업은 어떤 분석 또는 시험을 가장 적절하게 지시할 지 자문할 수 있다. 현행 방법의 추가 측면에서, 환자 또는 대상체는 전혈 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 협측 샘플 또는 타액 샘플을 수득하는 것과 같이 의료 전문가의 도움 없이 시험을 위한 생물학적 샘플을 수득할 수 있다.
다른 경우에, 샘플을, 생검, 바늘 흡인, 내시경 또는 정맥 절개를 포함하지만 이에 제한되지 않는 침습적 절차에 의해 수득한다. 바늘 흡인 방법은 미세 바늘 흡인, 코어 바늘 생검, 진공 보조 생검, 또는 대형 코어 생검을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 충분한 양의 생물학적 물질을 보장하기 위해 본원의 방법에 의해 다중 샘플을 수득할 수 있다.
생물학적 샘플을 얻기 위한 일반적인 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 문헌[Ramzy, Ibrahim Clinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001]과 같은 간행물(내용 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 생검 및 세포학적 방법에 대한 일반적인 방법을 기재한다. 하나의 구현예에서, 샘플은 식도 또는 의심되는 식도 종양 또는 신생물의 미세 바늘 흡인물이다. 경우에 따라 미세 바늘 흡인 샘플링 절차는 초음파, X선 또는 기타 영상 장치를 사용하여 안내될 수 있다.
본 방법의 일부 구현예에서, 분자 프로파일링 사업은 대상체로부터 직접, 의료 전문가로부터, 제3자로부터, 또는 분자 프로파일링 사업체 또는 제3자가 제공하는 키트로부터 생물학적 샘플을 수득할 수 있다. 경우에 따라 대상체, 의료 전문가 또는 제3자가 생물학적 샘플을 수득하여 분자 프로파일링 사업에 보낸 후 분자 프로파일링 사업에서 생물학적 샘플을 수득할 수 있다. 경우에 따라 분자 프로파일링 사업은, 생물학적 샘플을 보관 및 분자 프로파일 사업에 운송하기에 적합한 용기와 부형제를 제공할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 의료 전문가는 초기 진단 또는 샘플 수득에 관여할 필요가 없다. 개인은 일반의약품(OTC) 키트를 사용하여 대안적으로 샘플을 수득할 수 있다. OTC 키트에는 본원에 기재된 샘플을 수득하기 위한 수단, 검사를 위해 샘플을 보관하는 수단, 및 키트의 적합한 사용을 위한 설명서가 포함될 수 있다. 어떤 경우에는 분자 프로파일링 서비스가 키트 구매 가격에 포함된다. 다른 경우에는 분자 프로파일링 서비스가 별도로 청구된다. 분자 프로파일링 사업에서 사용하기에 적합한 샘플은 조직, 세포, 핵산, 유전자, 유전자 단편, 발현 산물, 유전자 발현 산물 또는 검사할 개인의 유전자 발현 산물 단편을 포함하는 임의의 물질일 수 있다. 샘플 적합성 및/또는 적절성을 결정하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 대상체는 종양학자, 외과의 또는 내분비학자와 같은 전문가에게 의뢰 받을 수 있다. 전문가는 마찬가지로 시험을 위해 생물학적 샘플을 수득하거나 생물학적 샘플 제출을 위해 개인을 시험 센터 또는 실험실에 의뢰할 수 있다. 어떤 경우에는 의료 전문가가 생물학적 샘플 제출을 위해 대상체를 시험 센터나 실험실에 의뢰할 수 있다. 다른 경우에는 대상체가 샘플을 제공할 수 있다. 일부 경우에는 분자 프로파일링 사업에서 샘플을 수득할 수 있다.
VI. 치료 조성물의 투여
본원에 제공된 요법은 치료제, 예를 들어 제1 암 요법(예를 들어, TDO2 억제제) 및 제2 암 요법(예를 들어, 화학요법, 방사선 요법 또는 면역요법과 같은 추가적인 암 요법)의 조합의 투여를 포함할 수 있다. 상기 요법은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 암 치료제는 순차적으로(상이한 시간에) 또는 동반하여(동시에) 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 암 치료제는 별도의 조성물로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 암 치료제는 동일한 조성물 중에 있다.
본 개시내용의 구현예는 치료 조성물을 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 상이한 요법은 하나의 조성물 또는 2개 조성물, 3개 조성물 또는 4개 조성물과 같은 하나 초과의 조성물로 투여될 수 있다. 작용제의 다양한 조합이 사용될 수 있다.
본 개시내용의 치료제는 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 암 요법은 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내, 뇌실내 또는 비강내로 투여된다. 일부 구현예에서, 항생제는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척추강내, 뇌실내 또는 비강내로 투여된다. 적합한 투여량은 치료할 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 개인의 임상 상태, 개인의 임상 병력 및 치료에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 결정될 수 있다.
치료는 다양한 "단위 용량"을 포함할 수 있다. 단위 용량은 미리 결정된 양의 치료 조성물을 함유하는 것으로 정의된다. 투여되는 양, 및 특정 경로 및 제형은 임상 분야의 전문가의 기술 범위 내에 있다. 단위 용량은 단일 주사로 투여될 필요는 없지만 정해진 기간에 걸쳐 연속 주입을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 단일 투여가능한 용량을 포함한다.
투여되는 양은, 치료 횟수 및 단위 용량 모두에 따라, 목적하는 치료 효과에 따라 변한다. 유효 용량은 특정 효과를 달성하는 데 필요한 양을 나타내는 것으로 이해된다. 특정 구현예의 실시에서, 10 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏ 범위의 용량이 이들 작용제의 보호 능력에 영향을 미칠 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 용량은 약 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 및 200, 300, 400, 500, 1000 ㎍/kg, ㎎/㎏, ㎍/일 또는 ㎎/일, 또는 이 중에서 유도 가능한 임의의 범위의 용량을 포함하는 것으로 고려된다. 또한, 이러한 용량을 하루 동안 수회, 및/또는 수일, 수주, 또는 수 개월 투여할 수 있다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물의 유효 용량은 약 1 μM 내지 150 μM의 혈액 수준을 제공할 수 있는 것이다. 또 다른 구현예에서, 유효 용량은 약 4 μM 내지 100 μM.; 또는 약 1 μM 내지 100 μM; 또는 약 1 μM 내지 50 μM; 또는 약 1 μM 내지 40 μM; 또는 약 1 μM 내지 30 μM; 또는 약 1 μM 내지 20 μM; 또는 약 1 μM 내지 10 μM; 또는 약 10 μM 내지 150 μM; 또는 약 10 μM 내지 100 μM; 또는 약 10 μM 내지 50 μM; 또는 약 25 μM 내지 150 μM; 또는 약 25 μM 내지 100 μM; 또는 약 25 μM 내지 50 μM; 또는 약 50 μM 내지 150 μM; 또는 약 50 μM 내지 100 μM(또는 이 중에서 유도 가능한 임의의 범위)의 혈액 수준을 제공한다. 다른 구현예에서, 상기 용량은 대상체에게 투여되는 치료제로부터 생성되는 하기 혈액 수준의 작용제를 제공할 수 있다: 약, 적어도 약, 또는 기껏해야 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 μM 또는 이 중에서 유도 가능한 임의의 범위. 특정 구현예에서, 대상체에게 투여되는 치료제는 대사된 치료제로 체내에서 대사되며, 이 경우 혈액 수준은 그 작용제의 양을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 치료제가 대상체에 의해 대사되지 않는 한, 본원에서 논의되는 혈액 수준은 대사되지 않은 치료제를 지칭할 수 있다.
치료 조성물의 정확한 양은 또한 의사의 판단에 달려 있으며 각 개인에 고유하다. 용량에 영향을 미치는 요인에는 환자의 신체적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도된 치료 목표(증상 완화 대 치유) 및 특정 치료 물질 또는 대상체가 받을 수 있는 다른 요법의 효능, 안정성 및 독성이 포함된다.
당업자는 ㎍/kg 또는 ㎎/㎏ 체중의 투여량 단위가 ㎍/㎖ 또는 mM(혈액 수준)의 필적하는 농도 단위, 예를 들어 4 μM 내지 100 μM로 전환되고 표현될 수 있음을 인지할 것이다. 또한 흡수는 종 및 기관/조직에 따라 달라진다는 것이 이해된다. 흡수 및 농도 측정에 관해 이루어지는 적용 가능한 전환 계수 및 생리학적 가정은 주지되어 있으며, 이는 당업자로 하여금 하나의 농도 측정을 또 다른 것으로 전환시키고 본원에 기재된 용량, 효능 및 결과에 관한 합리적인 비교 및 결론을 내릴 수 있게 할 것이다.
VII. 키트
본 개시내용의 특정 측면은 또한 본 개시내용의 조성물 또는 본원에 개시된 방법을 구현하기 위한 조성물을 함유하는 키트에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 키트를 사용하여 하나 이상의 생물마커를 평가할 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는 적어도 또는 기껏해야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 100, 500, 1,000개 이상의 탐침, 프라이머 또는 프라이머 세트, 합성 분자 또는 억제제, 또는 이 중에서 유도 가능한 임의의 값 또는 범위 및 조합을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포에서 생물마커 활성을 평가하기 위한 키트가 존재한다.
키트는 개별적으로 포장되거나, 튜브, 병, 바이알, 주사기 또는 기타 적합한 용기 수단과 같은 용기에 배치될 수 있는 구성요소를 포함할 수 있다.
개별 구성요소는 또한 키트에 농축된 양으로 제공될 수 있으며; 일부 구현예에서, 구성요소는 다른 구성요소와 함께 용액 중에 있는 것과 동일한 농도로 개별적으로 제공된다. 구성요소의 농도는 1x, 2x, 5x, 10x 또는 20x 이상으로 제공될 수 있다.
예후 또는 진단 적용을 위해 본 개시내용의 탐침, 합성 핵산, 비합성 핵산, 및/또는 억제제를 사용하기 위한 키트가 본 개시내용의 일부로서 포함된다. 본원에서 확인된 임의의 생물마커에 상응하는 임의의 그러한 분자가 구체적으로 고려되며, 이는 생물마커의 비암호화 서열 및 암호화 서열을 포함할 수 있는, 생물마커의 전부 또는 일부와 동일하거나 상보적인 핵산 프라이머/프라이머 세트 및 탐침을 포함한다.
특정 측면에서, 음성 및/또는 양성 대조용 핵산, 탐침, 및 억제제가 일부 키트 구현예에 포함된다. 또한, 키트에는 하나 이상의 생물마커의 메틸화에 대한 음성 또는 양성 대조군인 샘플이 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 대조군은 하나 이상의 CpG를 함유하거나 CpG 메틸화 부위를 식별할 수 있는 핵산을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있으며, 상이한 구현예를 병용할 수 있음이 고려된다. 원래 출원된 청구항은 임의의 출원된 청구항 또는 출원된 청구항의 조합에 다중 의존하는 청구항을 포함하는 것으로 간주된다.
특정 생물마커를 이름으로 수반하는 본 개시내용의 임의의 구현예는 명시된 핵산의 성숙한 서열에 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 일치하는 서열을 갖는 생물마커를 수반하는 구현예를 포함하는 것으로 고려된다.
본 개시내용의 구현예는 적합한 용기 수단에 2개 이상의 생물마커 탐침을 포함하는, 샘플에 대한 생물마커 프로파일을 평가함으로써 병리학적 샘플을 분석하기 위한 키트를 포함하며, 여기서 생물마커 탐침은 본원에서 확인된 생물마커 중 하나 이상을 검출한다. 키트는 샘플에서 핵산을 표지하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 아민-변형된 뉴클레오티드, 폴리(A) 폴리머라제 및 폴리(A) 폴리머라제 완충제 중 적어도 하나를 포함하는 표지화 시약을 포함할 수 있다. 표지화 시약에는 아민 반응성 염료가 포함될 수 있다.
VIII. 암 요법
일부 구현예에서, 개시된 방법은 암 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 암 요법은 단독으로, 또는 환자에 대해 계산된 임상 위험 점수와 조합하여 발현 수준 측정에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 암 요법은 국소 암 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 암 요법은 전신 암 요법을 배제한다. 일부 구현예에서, 암 요법은 국소 요법을 배제한다. 일부 구현예에서, 암 요법은 전신 암 요법의 투여가 없는 국소 암 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 암 요법은 면역 관문 요법일 수 있는 면역 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 암 요법은 IDO2 억제제를 사용한 치료를 포함한다. 일부 구현예에서, 암 요법은 IDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 사용한 치료를 포함한다. 이들 암 요법 중 임의의 요법이 또한 배제될 수 있다. 이러한 요법의 조합이 또한 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 또는 miRNA 발현 측정 및 분석은 하나 이상의 암 요법이 유효하거나 무효일 가능성이 있음을 암시할 수 있다.
IX. 세포 요법
A. 세포 배양
일부 구현예에서, 세포를 적어도 약 10일 내지 약 40일 동안, 적어도 약 15일 내지 약 35일 동안, 적어도 약 15일 내지 21일 동안, 예를 들어 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19 또는 21일 동안 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포를 60일 이하, 또는 50일 이하, 또는 45일 이하 동안 배양할 수 있다. 세포를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40일 동안 배양할 수 있다. 세포를 액체 배양 배지의 존재 하에서 배양할 수 있다. 전형적으로, 배지는 당업계에 공지된 기본 배지 제형을 포함할 수 있다. 본원에서 다수의 기본 배지 제형, 예를 들어 비제한적으로 이글(Eagle)의 최소 필수 배지(MEM), 둘베코(Dulbecco)의 변형된 이글 배지(DMEM), 알파 변형된 최소 필수 배지(알파-MEM), 기본 필수 배지(BME), 아이스코베(Iscove)의 변형된 둘베코 배지(IMDM), BGJb 배지, F-12 영양 혼합물(Ham), 리보비츠(Liebovitz) L-15, DMEM/F-12, 필수 변형된 이글 배지(EMEM), RPMI-1640, 및 이들의 변형 및/또는 조합을 사용하여 세포를 배양할 수 있다. 상기 기본 배지의 조성은 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 배양된 세포에 필요한 배지 및/또는 배지 보충물의 농도를 변형 또는 조절하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지 제형은 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 U/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mmol/L L-글루타민이 보충된 IMDM으로 구성된 외식편 배지(CEM)일 수 있다. 다른 구현예는 상기의 것들로부터 선택되는 것과 같은 추가의 기본 배지 제형을 사용할 수 있다.
시험관내에서 세포를 지지할 수 있는 임의의 배지를 사용하여 세포를 배양할 수 있다. 세포의 생육을 지원할 수 있는 배지 제형은 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 알파 변형된 최소 필수 배지(αMEM), 및 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(Roswell Park Memorial Institute Media) 1640(RPMI 배지 1640) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 세포의 생육을 지원하기 위해 최대 20% 소 태아 혈청(FBS) 또는 1-20% 말 혈청을 상기 배지에 첨가한다. 그러나 세포 배양에 필요한 생육인자, 사이토카인, 및 호르몬이 배지에 적합한 농도로 제공되는 경우, 정의된 배지를 사용할 수도 있다. 본 개시내용의 방법에 유용한 배지는 항생제, 유사분열 화합물, 또는 세포 배양에 유용한 분화 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 관심 화합물을 포함할 수 있다. 세포를 27℃ 내지 40℃, 예를 들어 31℃ 내지 37℃의 온도에서 생육시킬 수 있으며, 가습 배양기에서 생육시킬 수 있다. 이산화탄소 함량을 2% 내지 10%로 유지시킬 수 있으며 산소 함량은 1% 내지 22%로 유지시킬 수 있다. 그러나, 본 개시내용은 세포를 단리하고 배양하는 임의의 한 방법으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 세포를 단리하고 배양하는 임의의 방법이 본 개시내용에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
세포 배양에 사용하기 위해 배지에는 하나 이상의 추가 성분이 제공될 수 있다. 예를 들어, 최적의 성장과 확대를 위해 필요한 미량 원소 및 물질을 세포에 공급하기 위해 추가 보충제를 사용할 수 있다. 이러한 보충제에는 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 염 및 이들의 조합이 포함된다. 이러한 성분을 행크스(Hanks') 균형 염 용액(HBSS), 얼스(Earle's) 염 용액과 같은 염 용액에 포함시킬 수 있지만 이에 제한되지 않는다. β-머캅토에탄올과 같은 추가의 산화방지제 보충제를 첨가할 수 있다. 다수의 배지는 이미 아미노산을 함유하지만, 일부 아미노산, 예를 들어 L-글루타민(용액 중에 있을 때 덜 안정한 것으로 공지되어 있다)은 나중에 보충될 수 있다. 배지에는 항생제 및/또는 항진균제 화합물, 예를 들어 전형적으로 페니실린과 스트렙토마이신의 혼합물, 및/또는 암포테리신, 암피실린, 젠타마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 날리딕식산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리믹신, 퓨로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 타이로신 및 제오신이 예시되지만 이에 제한되지 않는 기타 화합물이 추가로 공급될 수 있다. 포유동물 혈장 또는 혈청을 세포 배양 배지에 보충하는 것도 고려된다. 혈장 또는 혈청에는 종종 생육력 및 확대에 필요한 세포 인자 및 성분이 포함되어 있다. 적합한 혈청 대체물의 사용도 또한 고려된다.
특정 완충액, 배지, 시약, 세포, 배양 조건 등, 또는 이들의 일부 하위 부류에 대한 언급은 제한하려는 의도가 아니라, 해당 논의가 제시되는 특정 맥락에서 관심이나 가치가 있는 것으로 당업자가 인식할 수 있는 모든 이와 같은 관련 물질을 포함하는 것으로 판독해야 한다. 예를 들어, 하나의 완충 시스템이나 배양 배지를 다른 것으로 대체하는 것이 종종 가능하며, 따라서 제안된 방법, 물질 또는 조성물의 사용이 지시되는 바와 동일한 목표를 달성하기 위해, 상이하지만 공지된 방법이 사용된다. 특정 구현예에서, 세포를, 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 시스템에서, 바람직하게는 배양 용기, 특히 시험관내 노화로부터 세포를 보호하고/하거나 비특이적인 또는 특이적인 재프로그램화를 유도하는 데 적합한 것으로 밝혀진 물질이 보충된 세포 배양 배지에서 배양한다.
B. 세포 생성
본 개시내용의 특정 방법은 인간 조직 샘플로부터 수득된 세포를 배양하는 것과 관련된다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 세포를, 세포의 부착을 허용하는 기재 상에 도말한다. 이는 예를 들어 세포 부착과 양립할 수 있는 하나 이상의 기질 표면을 드러내는 배양 플레이트에 세포를 도말함으로써 수행될 수 있다. 하나 이상의 기질 표면이 배양 시스템에 도입된 세포의 현탁액(예를 들어, 배지 중 현탁액)과 접촉할 때, 세포와 기질 표면간의 세포 부착이 이어질 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서 세포를, 도말된 세포가 기질 표면과 접촉할 수 있도록, 일반적으로 세포의 부착과 양립할 수 있는 적어도 하나의 기질 표면을 특징으로 하는 배양 시스템 내로 도입시키며, 이러한 구현예는 기질 상의 도말을 포함하고, 이는 기질에 대한 세포의 부착을 허용한다.
본 개시내용의 세포는 세포-표면 마커와 같은 특정 마커 단백질의 발현에 의해 식별 및 특성화될 수 있다. 이러한 세포의 검출 및 단리는 예를 들어 유식 세포분석, ELISA 및/또는 자기 비드를 통해 달성될 수 있다. 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 세포 특이적 유전자를 정량분석하고/하거나 분화에 대한 반응으로 유전자 발현의 변화를 모니터링할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포를 식별하고 특성화하는 데 사용되는 마커 단백질은 c-Kit, Nanog, Sox2, Hey1, SMA, 비멘틴, 사이클린 D2, 스네일, E-카데린, Nkx2.5, GATA4, CD105, CD90, CD29, CD73, Wt1, CD34, CD45 및 이들의 조합으로 이루어지는 목록 중에서 선택된다.
X. 유전자 시그니처 검출
특정 구현예는 개체에서 유전자 시그니처를 검출하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 유전자 시그니처를 검출하는 방법은 예를 들어 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침, 어레이, 대립유전자-특이적 혼성화, 분자 표지, 제한 단편 길이 다형성 분석, 효소 연쇄 반응, 플랩 엔도뉴클레아제 분석, 프라이머 연장, 5'-뉴클레아제 분석, 올리고뉴클레오티드 결찰 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석, 온도 구배 젤 전기영동, 변성 고성능 액체 크로마토그래피, 고해상도 용융, DNA 불일치 결합 단백질 분석, 서베이어 뉴클레아제 분석, 서열분석, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 유전자 시그니처를 검출하는 방법은 예를 들어 형광 제자리 혼성화, 비교 게놈 혼성화, 어레이, 폴리머라제 연쇄 반응, 서열분석 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 유전자 시그니처의 검출은 특정 방법을 사용하여 유전자 시그니처의 하나의 특징을 검출하고 추가로 동일한 방법 또는 다른 방법을 사용하여 유전자 시그니처의 상이한 특징을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 동일한 특징 또는 복수의 특징을 검출하기 위해 여러 상이한 방법을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
A. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 검출
본 개시내용의 특정 구현예는 개체에서 SNP를 검출하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용에서 특정 SNP를 검출하기 위해 SNP를 검출하기 위한 공지된 일반적인 방법 중 임의의 것을 사용할 수 있다. 이러한 방법에는 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침, 어레이, 대립유전자 특이적 혼성화, 분자 비콘, 제한 단편 길이 다형성 분석, 효소 연쇄 반응, 플랩 엔도뉴클레아제 분석, 프라이머 연장, 5'-뉴클레아제 분석, 올리고뉴클레오티드 결찰 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석, 온도 구배 젤 전기영동, 변성 고성능 액체 크로마토그래피, 고해상도 용융, DNA 불일치 결합 단백질 분석, 서베이어 뉴클레아제 분석, 서열분석 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, SNP를 검출하기 위해 사용되는 방법은 개체로부터의 핵산 물질을 서열분석하고/하거나 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 것을 포함한다. 개체로부터의 핵산 물질을 서열분석하는 것은 예를 들어 게놈 DNA, RNA로부터 역전사되는 상보적 DNA, 또는 RNA의 형태로, 개체로부터 핵산 물질을 수득하는 것을 포함할 수 있다. Sanger 서열분석, 쇄 연장 서열분석, Maxam-Gilbert 서열분석, 샷건 서열분석, 브리지 PCR 서열분석, 서열분석을 위한 대량처리 방법, 차세대 서열분석, RNA 서열분석 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 표준 서열분석 기법을 사용할 수 있다. 개체로부터의 핵산을 서열분석한 후, 특정 SNP에서 개체에 존재하는 특정 뉴클레오티드를 결정하기 위해 임의의 데이터 처리 소프트웨어 또는 기법을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 특정 SNP의 뉴클레오티드는 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침에 의해 검출된다. 탐침은 예를 들어 게놈 DNA, RNA로부터 역전사되는 상보적 DNA, 또는 RNA를 포함하는 개체의 핵산 물질에 사용될 수 있다. 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침은 SNP에 존재하는 특정 뉴클레오티드를 기반으로 하는 상보적 가닥에 우선적으로 결합한다. 예를 들어, 하나의 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침은 암호화 가닥상의 SNP에 A 뉴클레오티드가 있지만 상기 암호화 가닥상의 SNP에 G 뉴클레오티드는 없는 상보적 가닥에 결합하는 반면, 다른 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침은 암호화 가닥상의 SNP에 G 뉴클레오티드가 있지만 상기 암호화 가닥상의 SNP에 A 뉴클레오티드는 없는 상보적 가닥에 결합한다. 유사한 방법을 사용하여, SNP에 C 또는 T 뉴클레오티드를 갖지만 둘 다 갖지는 않는 암호화 가닥에 선택적으로 결합하는 탐침을 설계할 수 있다. 따라서, 다른 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침에 대한 하나의 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침의 결합을 결정하는 임의의 방법을 사용하여 SNP에 존재하는 뉴클레오티드를 결정할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하여 SNP를 검출하는 한 가지 방법은 분광광도계 및/또는 젤 전기영동 분석에 의해 핵산 물질의 품질을 분석하고 양을 측정하는 단계; 핵산 물질을 적어도 하나의 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침, PCR 프라이머, 및 폴리머라제, 데옥시뉴클레오티드 및 반응에 적합한 완충제를 포함할 수 있는, 정량적 PCR(qPCR)을 수행하는 데 필요한 성분과의 혼합물을 사용하여 반응 혼합물로 가공하는 단계; 및 반응을 모니터링하면서 가공된 반응 혼합물을 순환시키는 단계를 포함한다. 방법의 하나의 구현예에서, qPCR에 사용된 폴리머라제는 증폭되는 가닥에 결합하는 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침을 만나고, 엔도뉴클레아제 활성을 사용하여, 상기 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침을 분해할 것이다. 분해된 탐침의 검출은 탐침이 증폭된 가닥에 결합했는지를 결정한다.
특정 뉴클레오티드에 대한 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침의 결합을 결정하는 또 다른 방법은 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침을 PCR 프라이머로서 사용하는 것을 포함하며, 상기 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침은 SNP 위치에서 특정 뉴클레오티드에 우선적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 탐침은 일반적으로 탐침의 3' 단부가 SNP와 쌍을 이루도록 설계된다. 따라서 탐침이 SNP에서 특정 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 올바른 상보적 염기를 가지고 있으면 상기 탐침은 PCR의 증폭 단계 동안 연장될 것이다. 예를 들어, 탐침의 3' 위치에 T 뉴클레오티드가 있고 SNP 위치에 A 뉴클레오티드가 있는 경우, 탐침은 SNP에 결합하여 PCR의 증폭 단계 동안 연장될 것이다. 그러나 동일한 탐침을 사용하고(3' 단부에 T가 있음) SNP 위치에 G 뉴클레오티드가 있는 경우, 탐침은 완전히 결합하지 않고 PCR의 증폭 단계 동안 연장되지 않을 것이다.
일부 구현예에서, SNP 위치는 PCR 프라이머의 단부가 아니라 PCR 프라이머 내에 위치한다. PCR 프라이머는, PCR 프라이머가 하나의 변이체, 예를 들어 A 뉴클레오티드를 갖는 SNP에 선택적으로 결합할 수 있지만 다른 변이체, 예를 들어 G 뉴클레오티드를 갖는 SNP에 결합할 수 없다는 점에서 충분한 길이와 상동성을 가져야 한다. 또한, PCR 프라이머를 특히 G 뉴클레오티드를 갖는 SNP에 선택적으로 결합하지만 A, C 또는 T 뉴클레오티드를 갖는 변이체에는 결합하지 않도록 설계할 수 있다. 유사하게, PCR 프라이머를 C 또는 T 뉴클레오티드를 갖지만 둘 다를 갖지는 않는 SNP에 결합하도록 설계할 수 있으며, 이어서 이들은 각각 G, A 또는 T 뉴클레오티드 또는 G, A 또는 C 뉴클레오티드를 갖는 변이체에 결합하지 않는다. 특정 구현예에서, PCR 프라이머는 주형 서열과 100% 상동성을 갖는, 적어도 또는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,3 5, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75개 뉴클레오티드 길이 이상의 뉴클레오티드 길이이며, 이때 비-상동성 SNP 위치를 잠재적으로 제외한다. 수회 라운드의 증폭 후에, PCR 프라이머가 예상된 밴드 크기를 생성시키는 경우, 상기 SNP는 A 뉴클레오티드를 갖고 G 뉴클레오티드는 갖지 않는 것으로 결정될 수 있다.
B. 사본수 변화 검출
본 개시내용의 특정 구현예는 특정 대립유전자의 사본수 변화(CNV)를 검출하는 방법에 관한 것이다. CNV를 검출하기 위해 상기 CNV를 검출하기 위한 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 형광 제자리 혼성화, 비교 게놈 혼성화, 어레이, 폴리머라제 연쇄 반응, 서열분석 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, CNV는 어레이를 사용하여 검출된다. Agilent, Illumina 또는 Affymetrix와 같은 어레이 플랫폼을 사용하거나 맞춤형 어레이를 설계할 수 있다. 어레이가 사용될 수 있는 방법의 한 가지 예는 CNV를 갖는 것으로 의심되는 개체 및 적어도 일부 경우에는 CNV를 갖지 않는 개체 또는 참조 게놈으로부터 적합한 방식으로 핵산 물질을 단리하고; 상기 핵산 물질을 단편화에 의해 처리하고, 상기 핵산을 예를 들어 형광 표지로 표지화하고, 상기 단편화되고 표지된 핵산 물질을 정제하고; 상기 핵산 물질을 충분한 시간 동안, 예를 들어 적어도 24시간 동안 상기 어레이에 혼성화하고; 혼성화 후에 상기 어레이를 세척하고; 어레이 스캐너를 사용하여 상기 어레이를 스캐닝하고; 상기 어레이를 적합한 소프트웨어를 사용하여 분석하는 단계들 중 하나 이상을 포함하는 방법을 포함한다. 소프트웨어는, CNV를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터의 핵산 물질을 CNV를 갖지 않는 것으로 알고 있는 개체의 핵산 물질 또는 참조 게놈과 비교하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CNV의 검출은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 달성된다. PCR 프라이머는 CNV에서 또는 그 부근에서 핵산을 증폭하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 CNV를 가진 개체는 참조 게놈으로부터의 PCR 산물과 비교할 때 측정 가능한 더 높은 수준의 PCR 산물을 초래할 것이다. PCR 생성물 량의 검출은 정량적 PCR(qPCR)에 의해 측정될 수 있거나 예로서 젤 전기영동에 의해 측정될 수 있다. 젤 전기영동을 사용한 정량분석은 공지된 크기의 핵산 표준과 함께 생성된 PCR 산물에 아가로스 젤 상에서 전류를 적용하고, 생성된 밴드의 크기 및 강도를 측정하는 것을 포함한다. 생성 밴드의 크기는 공지된 표준과 비교하여 상기 생성 밴드의 크기를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, CNV의 증폭은 CNV를 검출하기 위해 사용된 것과 동일한 프라이머를 사용하여, 참조 게놈 또는 CNV가 검출되지 않은 개체로부터 증폭되는 밴드보다 더 큰 크기를 갖는 밴드를 생성시킬 것이다. 상기 CNV 증폭으로부터 생성되는 밴드는 상기 참조 게놈 또는 CNV가 검출되지 않는 개체로부터 생성되는 밴드의 거의 2배, 2배이거나 또는 2배가 넘을 수 있다. 일부 구현예에서, CNV를 핵산 서열분석을 사용하여 검출할 수 있다. 사용될 수 있는 서열분석 기법은 비제한적으로 전체 게놈 서열분석, 전체 엑솜 서열분석, 및/또는 표적화된 서열분석을 포함한다.
C. DNA 서열분석
일부 구현예에서, DNA를 서열분석에 의해 분석할 수 있다. DNA는 개체로부터(예를 들어, 개체의 생식세포계열로부터) 유래될 수 있다. DNA는 암 세포에서 유래될 수 있다. DNA는 라이브러리 제조, 하이브리드 캡처, 샘플 품질 관리, 제품-활용 결찰-기반 라이브러리 제조 또는 이들의 조합과 같은, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 서열분석을 위해 준비될 수 있다. DNA는 임의의 서열분석 기법을 위해 준비될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 샘플에 대한 고유한 유전자 판독은 하나 이상의 고도로 다형성인 SNP를 유전자형 분석함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 76개 염기쌍, 대응-단부 서열분석과 같은 서열분석을, 20x, 25x, 30x, 35x, 40x, 45x, 50x, 또는 50x 초과의 적용범위로, 표적의 대략 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그보다 많은 백분율을 포함하도록 수행할 수 있다. 특정 구현예에서, 돌연변이, SNPS, INDELS, 사본수 변경(체세포 및/또는 생식세포계열), 또는 기타 유전적 차이를, VarScan2, 임의의 R 패키지(CopywriteR 포함) 및/또는 Annovar를 포함한, 적어도 하나의 생물정보학 도구를 사용하여 서열분석으로부터 확인할 수 있다. 서열분석을 사용하여 유전자 중의 돌연변이를 결정할 수 있다. 서열분석을 또한 유전자의 메틸화 상태를 확인하는 데 사용할 수 있다(예를 들어 비설파이트 서열분석 또는 다른 메틸화-민감성 서열분석).
D. RNA 서열분석
일부 구현예에서, RNA를 서열분석에 의해 분석할 수 있다. RNA를 폴리-A 선택, cDNA 합성, 가닥 또는 비가닥 라이브러리 제조, 또는 이들의 조합과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 서열분석을 위해 준비할 수 있다. RNA는 가닥 특이적 RNA 서열분석을 포함한 임의의 유형의 RNA 서열분석 기법을 위해 준비될 수 있습니다. 일부 구현예에서, 서열분석을 수행하여, 대응 쌍을 포함하여 대략 10 M, 15 M, 20 M, 25 M, 30 M, 35 M, 40 M 이상의 판독을 생성시킬 수 있다. 서열분석을 대략 50 bp, 55 bp, 60 bp, 65 bp, 70 bp, 75 bp, 80 bp, 85 bp, 90 bp, 95 bp, 100 bp, 105 bp, 110 bp, 또는 그 이상의 판독 길이로 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열분석 원 데이터를, 추정된 판독 카운트(RSEM), 백만 매핑된 판독당 전사물 킬로염기당 단편(FPKM), 및/또는 백만 매핑된 판독당 전사물의 킬로염기당 판독(RPKM)으로 전환시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 기질 함량, 면역 침윤, 및/또는 종양 면역 세포 프로파일을 추론하기 위해, 예를 들어 상위 사분위수 정규화된 RSEM 데이터의 사용과 같은 하나 이상의 생물정보학 도구를 사용할 수 있다.
E. 프로테오믹스
일부 구현예에서, 단백질을 질량 분광분석에 의해 분석할 수 있다. 단백질을 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 질량 분광분석을 위해 제조할 수 있다. 본원에 포함된 임의의 단리된 단백질을 포함하는 단백질을 DTT에 이어서 요오도아세트아미드로 처리할 수 있다. 단백질을 엔도펩티다제, 프로테이나제, 프로테아제, 또는 단백질을 절단하는 임의의 효소를 포함하는 적어도 하나의 펩티다제와 함께 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질을 엔도펩티다제, LysC 및/또는 트립신과 함께 배양한다. 단백질을 대략 1:1000, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:1, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 효소 ㎍ 대 단백질 ㎍의 비를 포함한, 임의의 비로 하나 이상의 단백질 절단 효소와 함께 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 절단된 단백질을 예를 들어 컬럼 정제에 의해 정제시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 정제된 펩티드를 급속 냉동 및/또는 건조, 예를 들어 진공 하에 건조시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 정제된 펩티드를 예를 들어 역상 크로마토그래피 또는 염기성 역상 크로마토그래피에 의해 분획화할 수 있다. 본 개시내용의 방법의 실행을 위해 분획들을 합할 수 있다. 일부 구현예에서, 합한 분획을 포함하여, 하나 이상의 분획에, 친화성 크로마토그래피 및/또는 결합, 이온 교환 크로마토그래피, 화학적 유도체화, 면역침전, 공-침전, 또는 이들의 조합에 의한 포스포-농축을 포함한 포스포펩티드 농축을 가한다. 상기 합한 분획 및/또는 포스포-농축된 분획을 포함하여, 하나 이상의 분획의 전체 또는 일부를 질량 분광분석할 수 있다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석 원 데이터를 적어도 하나의 관련 생물정보학 도구를 사용하여 처리하고 정규화할 수 있다.
F. 검출 키트 및 시스템
본원에 기재된 방법에 기반하여, 검출 시약, 키트 및/또는 시스템이 개인을 진단하기 위한 유전자 시그니처와 관련된 SNP 및/또는 CNV를 검출하는데 사용될 수 있음을 인지할 수 있다(검출은 개별적으로 또는 조합하여). 시약은 당업계에 공지된 바와 같이 키트 및/또는 시스템에 대해 확립된 형식 중 적어도 하나로 조합될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "키트" 및 "시스템"은 적어도 하나의 SNP 검출 시약, 예를 들어 적어도 하나의 선택적 올리고뉴클레오티드 탐침, 및 적어도 하나의 CNV 검출 시약, 예를 들어 적어도 하나의 PCR 프라이머의 조합과 같은 구현예를 지칭한다. 키트에는 다른 시약, 화학 물질, 완충액, 효소, 패키지, 용기, 전자 하드웨어 구성요소 등이 포함될 수 있다. 키트/시스템은 또한 PCR 프라이머, 올리고뉴클레오티드, 어레이, 비드 또는 기타 검출 시약의 패키지 세트를 포함할 수 있다. 검출 어레이에 대해 임의의 수의 탐침을 실행시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 시약 및/또는 키트/시스템은 화학발광 또는 형광 검출 시약과 쌍을 이룬다. 키트/시스템의 특정 구현예는 예를 들어 DNA 칩 또는 어레이, 또는 미세유동 시스템과 같은 전자 하드웨어 구성요소의 사용을 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 또한 개체이 이를 필요로 하는 것으로 결정되는 경우에, 하나 이상의 치료적 또는 예방적 개입을 포함한다.
XI. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기법은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 본 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시되는 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 이는 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 여전히 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1 - 암에서 APC 결핍에 대한 하류 효과기로서 TDO2의 확인
APC 결핍 종양, 특히 합성 필수(SE) 유전자의 하류 효과기를 식별하기 위해, The Cancer Genome Atlas(TCGA) 데이터베이스에서 APC/베타-카테닌과 상호 배타적인 돌연변이/결실 패턴을 나타내는 유전자가 확인되었다. CRC 사례의 작은 부분만이 APC에 대해 온전하지 않는다는 한계를 극복하기 위해, CRC, 유방암, 전립선암, 폐암, 두경부 편평 세포 암종 및 육종을 포함한 APC 결실/돌연변이 암에서 트립토판 2,3-디옥시게나제 2(TDO2)의 일관된 잔류를 보여주는 범-암 분석을 수행하였다(도 1A). 이러한 게놈 사건의 제한된 샘플 크기와 낮은 빈도를 인식하여, 상기 게놈 결과를, APC 기능 상실 돌연변이를 갖는 암 세포에 일관되게 유지되는 유전자를 식별하도록 설계된 게놈 전체 기능상실 스크린의 히트와 교차시켰다(Rosenbluh et al.Cell. 2012 Dec 21;151(7):1457-73; 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다). 이 교차는 APC 결핍 종양에 대한 3개의 후보 SE 유전자: TDO2, 어댑터 관련 단백질 복합체 3 서브유닛 델타 1(AP3D1) 및 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제(PPAT)를 생성시켰다(도 1B).
동질유전자 APC-WT 및 APC-KO RKO 세포주가 생성되었고 APC 결실은 TDO2 및 PPAT의 유전자 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며(도 2A 및 2B), 이는 APC와 TDO2 또는 PPAT 사이의 잠재적인 유전적 연결을 암시한다. 또한, 편향되지 않은 전사물 분석은 WNT 경로 활성화 시그니처(Van der Flier et al., 2007)와 CRC 데이터세트에서 TDO2 발현의 가능한 상관관계를 평가하였으며, 이는 TDO2 유전자 발현이 WNT 경로 활성화와 양의 상관관계가 있음을 드러냈다(도 1C; 도 2C-2F). 상응하게, 인간 CRC 샘플의 종양 마이크로어레이 분석은 일치하는 핵 베타-카테닌(활성화된 WNT 경로의 대용물) 및 TDO2 발현을 나타내었다(도 1D 및 1E). 최종적으로, 마우스에서 TDO2 발현은 정상 결장 상피 세포에서 검출될 수 없었지만 APC 돌연변이 마우스(APCmin)의 폴립 및 iKAP 마우스의 종양(APCmut/TP53mut를 사용한 유도성 Krasmut)에서 대단히 증가하였다(Boutin et al., 2017)(도 1F). 대조적으로, 다른 키누레닌 경로(KP) 효소인 IDO1 및 IDO2는 TCGA CRC에서 APC 및 베타-카테닌(CTNNB1) 돌연변이와 상호 배타적인 패턴을 나타내지 않았으며 WNT 경로 활성화와 상관관계를 나타내지 않았다(도 2G-2I). 종합적으로, 이러한 관찰은 TDO2가 CRC 및 기타 암 유형에서 잠재적인 생물학적 및 임상적 관련성이 있는 APC 결핍의 하류 효과기일 수 있음을 나타낸다.
각 데이터세트에 대한 통계적 컷오프가 있는 동일한 데이터 세트를 사용하여 유사한 분석을 수행하였다. TDO2는 삼각측량(triangulation)으로 식별된 가장 높은 순위의 유전자였다. 구체적으로, 삼각측량은 p<0.01 및 FDR<=0.01의 컷오프를 갖는 5개의 유전자(TDO2, C3, MAFB, CAB39L, PPFIA2)를 식별하였다(도 2J).
실시예 2 - APC 결핍은 TCF4를 통해 TDO2 발현을 상향조절한다
APC 결실은 TDO2 mRNA 및 단백질 수준을 증가시켰고(도 3A 및 3B), 이는 WNT 경로-관련 전사 인자의 결합 요소에 대한 인간 및 마우스 TDO2 유전자의 프로모터 영역의 조사를 촉진하였다. 전사 인자 결합 프로파일 데이터베이스 JASPAR 및 ECR 브라우저를 사용하여, TDO2 유전자의 상류 영역이 WNT 경로를 매개하는 공지된 전사 인자인 TCF4/TCF7L2에 대한 결합 부위를 보유함을 발견하였다(도 3C). 모티프 서열 중 하나는 TSS에 가깝게 위치하며 인간 및 마우스에서 보존된다(도 3D).
항-TCF4 항체를 사용한 ChIP-seq 분석은 APC-KO에서 TDO2 프로모터 영역에 대한 TCF4의 특이적 결합을 나타내었지만, APC-WT, MC38 세포는 그렇지 않았다(도 3E). APC null DLD1 세포주에서 추가 CHIP-PCR 분석은 TDO2 프로모터에 직접적으로 결합하는 TCF4 뿐만 아니라, 주지된 WNT 경로가 AXIN2 및 MYC를 표적화하지만 음성 대조군으로 작용하는 GAPDH를 표적화하지 않는다는 것을 기록하였다(도 3F). 따라서, 인간 TDO2 프로모터에 의해 구동되는 구조물을 사용하는 루시페라제 리포터 분석은 구성적으로 활성인 베타-카테닌(CTNNB1 90, WNT 경로 활성화 조건을 모방함)의 형질도입이 리포터 유전자 전사를 증가시킨다는 것을 보여주었다. 대조적으로, 리포터 유전자 발현은 TCF4의 우성-음성 형태의 발현 또는 TCF4 결합 모티프의 돌연변이에 따라 감소하였다(도 3G 및 3H). 클론 변이 효과를 제거하기 위해 다중 APC-KO MC38 클론을 생성시켜 TDO2 발현 상태를 확인하였다(도 3I). 각각의 APC-KO 클론은 클로닝되지 않은 대조용 세포 및 APC-WT 클론에 비해 더 높은 TDO2 발현을 보였다. 또한, APC-WT MC38 세포를 재조합 마우스 WNT3a 단백질로 처리하면 TDO2 발현이 증가하였으며(도 3J), 이는 WNT 신호전달의 내인성 활성화가 TDO2의 발현을 증가시킬 수 있음을 암시한다.
Caco-2, DLD-1 및 HCT-15 세포주를 용량 의존적인 방식으로 WNT 억제제 XAV-939로 처리하였고 TDO2 발현이 감소된 β-카테닌 수준으로 표시되는 억제된 WNT 활성에 의해 감소되었다(도 3K-3M). 따라서, APC 손실은 WNT-베타카테닌-TCF4 경로의 활성화를 유도하여 TDO2 유전자 전사의 TCF4 매개 상향조절을 초래하였다.
실시예 3 - TDO2 고갈은 APC/WNT 돌연변이된-CRC 세포의 성장 및 생존을 특이적으로 손상시킨다
TDO2가 APC-결핍 세포에 대해 특이적으로 필수적인지 여부를 시험하기 위해, 인간 APC-결핍(DLD1, HT-29, LS180) 및 APC WT(RKO) CRC 계열을 확인하였으며(도 5A) DLD1, RKO, LS180 및 HT29 계열에서 TDO2의 shRNA-매개 고갈을 2개의 독립적인 유효 shRNA(#3 및 #6)를 사용하여 수행하였다(도 5B). APC WT RKO 세포에서 TDO2 고갈은 콜로니 형성에 영향을 미치지 않는 반면 APC-결핍 DLD1 세포는 현저하게 감소된 콜로니 형성을 나타내었다. 더욱이, RKO 세포에서 APC의 CRISPR/Cas9-매개 돌연변이 불활성화는 TDO2 고갈에 대한 민감성, 즉 부모 APC WT RKO 세포에 비해 감소된 콜로니 형성을 초래하였다(도 5C). 또한, TDO2-특이적 억제제 680C91(Pilotte et al., 2012)은 APC 결핍 세포주의 성장 및 생존을 손상시켰지만 정상 결장 상피 세포인 CCD-841-CoN 세포를 포함하는 APC 온전한 세포는 손상시키지 않았다(도 5D). 쥐 CRC 세포주 MC38 및 이의 동질유전자 APC-null 대조군은 또한 APC 고갈된 세포가 세포 성장을 위해 TDO2를 특이적으로 필요로 하고 TDO2 억제에 대해 더 높은 민감성을 갖는다는 것을 입증하였다(도 4A-4C). APCmin 마우스로부터 단리된 장 오가노이드는 또한 TDO2 고갈 시 증가된 세포 사멸 및 손상된 성장을 나타내었다(도 4D 및 4E; 도 5I).
TDO2 고갈에 의한 동소 종양의 감소된 성장이 면역 결핍 NSG 마우스의 APC-null RKO 세포에서 관찰되었다(도 5E). shTDO2를 발현하는 DLD-1 세포주는 헤어핀-내성 TDO2 ORF의 강제 발현에 의해 구제된 감소된 종양 성장을 나타내었다(도 5F). TDO2-고갈된 종양 조직의 병리학적 분석은 감소된 암 세포 증식(Ki67) 및 증가된 세포자멸사(절단된 카스파제-3)를 나타내었고, 이는 TDO2가 암 세포 고유의 특징을 유도하는 역할을 한다는 것을 암시한다(도 5G; 도 5H).
면역 능력이 있는 C57BL/6J 마우스에서 TDO2 작용을 조사하기 위해, APC-null 및 부모 MC38 세포를 유도성 shTDO2 시스템으로 조작하였으며, 이는 TDO2가 고갈된 APC-KO MC38 세포에서만 성장 장애와 증가된 세포자멸사를 나타내었고 APC 손상되지 않은 대조군은 그렇지 않음을 나타내었다(도 4F 및 4G). TDO2 고갈된 APC-KO MC38 세포는 감소된 Ki67, 증가된 절단된 카스파제-3 및 증가된 생존과 관련된 감소된 종양 성장을 나타내었다(도 4H-4L). APC-KO MC38 세포가 있는 NSG 마우스의 동소 종양은 동소 C57BL/6J 마우스와 유사한 생존을 나타내었지만 면역 능력이 있는 마우스와 비교할 때 TDO2 고갈로 더 짧은 생존 이점을 보였으며, 이는 APC null 암에서의 종양 면역성 조절에 있어서 TDO2의 중요한 역할을 가리킨다(도 4M).
본 발명자들은 생체내에서 TDO2 활성을 억제하는 것으로 기록된 TDO2 억제제 PF06845102/EOS200809("TDO2i")를 합성하였으며(Schramme et al., Cancer Immunol Res. 2020 Jan;8(1):32-45; 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다) APC-WT 또는 APC-KO MC38 동소 종양이 있는 마우스에게 경구 위관 영양법으로 상기 약물을 투여하였다. 도 4N에 도시된 바와 같이, TDO2 억제제는 APC-KO MC38 종양을 보유하는 마우스의 생존을 특이적으로 개선시켰고 APC-WT MC38 종양을 보유하는 마우스의 생존에는 영향을 미치지 않았다. 이러한 발견은 APC 결핍 종양에서 TDO2의 상황 특이적 역할을 강력하게 확인시켜준다. 더욱이, 독성학 분석은 TDO2 억제제가 간 독성이나 체중 감소의 징후 없이 내약성이 우수함을 입증하였다. 최종적으로, 도 4O에 도시된 바와 같이, IDO 억제제인 에파카도스탯("Epa")은 MC38 APC-WT 또는 APC-KO CRC 동소 종양이 있는 마우스에서 항종양 효과를 나타내지 않았다. TDO2i 처리된 종양은 감소된 Ki67, 증가된 절단된 카스파제-3 및 감소된 M2-유사 대식세포 침윤(F4/80 및 CD163)을 나타내었으며, 후자는 종양 관련 대식세포 생물학에서 TDO2의 역할을 입증하였다(도 4P).
또한, 유도성 shTDO2를 갖는 Wnt 신호전달-의존성 유방암 세포주 4T1(Ganesh et al., 2018)은 TDO2 고갈 시 감소된 동소 종양 성장을 나타내었다(도 6A-6D). 종합적으로, 이러한 데이터는 TDO2가 특히 APC 손실 및 WNT 경로 활성화 설정에서 암 세포 생존 및 종양 성장을 지원하는 데 필수적인 역할을 한다는 것을 나타낸다.
실시예 4 - TDO2-Kyn-AhR 축은 APC-돌연변이 CRC 암 세포의 종양발생 가능성을 지지한다
TDO2는 트립토판(Trp)을 대사하여 키누레닌(Kyn)을 생성하고, 이는 차례로 AhR을 활성화하여 수많은 세포 기능을 지배하는 유전자를 상향조절한다. 동질유전자 APC-KO 및 APC-WT MC38 세포주의 유전자 세트 농축 분석(GSEA)은 shTDO2의 Dox-유도가 트립토판 대사뿐만 아니라 생체이물 대사의 시그니처를 감소시켰으며, 패턴은 AhR 경로의 주요 기능과 일치함을 보여주었다(도 7A). 상응하게, AhR 및 이의 표적 유전자 CYP1B1의 발현은 TCGA COAD 데이터세트에서 TDO2 수준과 양의 상관관계가 있었다(도 7B). APCmin 마우스 및 iKAP 종양의 폴립도 또한 상승된 AhR을 나타내었다(도 7C). 더욱이, APC-KP 연결은 ELISA를 통해 APC-KO MC38 모델 시스템에서 확인되었으며, 이는 APC-WT 대조군에 비해 상승된 Kyn 분비 및 TDO2 고갈 시 감소된 Kyn 수준을 기록하였다(도 7D). 최종적으로, 유전자 발현 분석은 특히 APC-KO MC38 및 DLD1 세포주에서 TDO2 고갈 시 AhR 발현 및 이의 하류 유전자의 하향조절을 입증하였다(도 7E; 도 8A).
암 관련 과정에서 TDO2-Kyn-AhR 축의 역할을 평가하기 위해, APC-KO MC38 ishTDO2 세포주 및 APC-KO MC38 shAhR 세포주를 사용하여 콜로니 형성 분석을 수행하였다. APC-KO MC38 세포에서 TDO2 및 AhR 고갈은 Kyn 처리에 의해 구제된 감소된 콜로니 형성을 나타내었다(도 7F). 유사하게, APC-KO MC38 세포를 사용하여, 카스파제-3 분석에 의해 표시된 바와 같이, 680C91 처리로 증가된 세포 사멸이 기록되었고, 이는 Kyn 보충에 의해 구제되었다(도 7G 및 7H). 또 다른 확인 모델로 iKAP 모델 시스템을 사용하였으며 이는 Kyn을 처리함으로써 감소된 세포 사멸을 입증하였다(도 7I). 더욱이, APC-KO MC38 세포가 주사된 마우스는 AhR 고갈 시 증가된 생존을 나타내었고 종양은 감소된 Ki67 및 증가된 절단된 카스파제-3을 나타내었다(도 7J; 도 8B). 따라서, TDO2-Kyn-Ahr 축은 APC-null 암 세포 증식 및 생존 및 이의 종양 형성 가능성을 지지한다.
실시예 5 - TDO2 고갈은 종양 관련 대식세포의 침윤을 억제한다
CRC에서 APC 결실 및 TDO2 고갈의 영향을 받는 암 특징을 평가하기 위해 APC-KO MC38 ishTDO2 세포주의 RNA-seq 데이터와 파생 종양의 마이크로어레이 데이터에 대한 GSEA 분석을 수행하였다. APC-WNT 경로의 공지된 암 세포 고유 기능과 일치되게(Pate et al., 2014), 저산소증 및 해당작용 경로는 APC-KO 세포에서 상향 조절되었다(도 9A; 도 10A). APC-KO MC38 세포는 APC-WT MC38 세포보다 GLUT1 억제제 STF-31에 대해 더 높은 민감도를 나타내었고(도 10B), 증가된 글루코스 흡수 및 락테이트 분비를 나타내었으며, 이는 TDO2 고갈에 의해 역전되었다(도 10C 및 10D). RT-PCR 분석은 SLC2A1, HK1/2 및 PFKL과 같은 주요 해당작용 유전자의 상향조절을 확인하였으며, 이들 유전자는 TDO2 또는 AhR 고갈 시 하향조절되었다(도 10E 및 10F). APC-KO MC38 세포로부터의 세포 용해물 및 순화 배지의 대사산물 분석은 TDO2 고갈 시 해당작용 대사 경로-관련 대사산물의 감소된 수준을 나타내었다(도 10G). 이러한 데이터는 TDO2-AhR 신호 전달에 의해 조절되는 주요 암 세포 고유 과정으로서의 해당작용 경로를 나타낸다.
이러한 암 세포 고유 경로 외에도, APC 상태(APC-KO 대 APC-WT MC38) 또는 APC 결핍 세포주 및 종양의 TDO2 고갈은 TNFA 신호, 염증 반응, IL-6_JAK_STAT, 알로그래프 거부 및 보완을 초래하였다(도 9A 및 9B). 이러한 인실리코 관찰은 TDO2 고갈의 존재 및 부재하에서 동질유전자 APC-KO 및 APC-WT MC38 세포로 확립된 동소 종양의 면역 프로파일링을 촉발하였다. CyTOF 데이터의 viSNE 플롯은 APC KO가 대식세포 풍부도의 상당한 증가를 초래한 반면, TDO2 고갈은 대식세포 풍부도를 감소시켰음을 보여주었다(도 9C). CD45 양성 세포에서 F4/80 양성 면역 세포 및 CD206high M2 집단의 정량분석 데이터는 APC-KO 종양에서 대식세포의 농축 및 TDO2 고갈 시 이들의 감소를 확인하였다(도 9D). 이들 종양에서 CD163의 면역조직화학 염색을 전술한 CyTOF 데이터와 정렬하였다(도 11A). WNT-활성 CRC 세포주 CT26 및 유방암 세포주 4T1로 확립된 종양은 또한 TDO2 고갈 시 감소된 대식세포 집단을 나타내었다(도 9E 및 9F; 도 11B 및 11C). CT26 ishTDO2 세포주가 주사된 Balb/C 마우스는 클로드로네이트 리포솜을 처리하여 대식세포가 고갈되었을 때 연장된 생존을 보였으며, 이 모델 시스템에서 종양 관련 대식세포의 중요성을 강조한다(도 9G).
TDO2-매개된 TME 조절을 추가로 확증하기 위해, TCGA CRC 데이터세트를 대식세포(전체 및 M2)뿐만 아니라 Treg 및 MDSC 마커의 발현에 대해 조사하여, WNT 활성화와 TDO2 발현 사이의 강한 양의 상관관계를 밝혀내었다(도 9H; 도 11D). 또한, WNT-대식세포 상관관계는 핵 베타-카테닌 신호를 갖는 암 세포가 TME에서 더 높은 CD163 발현을 나타냄을 나타내는 CRC 종양 마이크로어레이(TMA) 분석에 의해 추가로 검증되었다(도 9I 및 9J). 함께, 이러한 발견은 TDO2의 WNT 경로-활성화된 상향조절이 면역 억제 종양 관련 대식세포를 TME로 모집하는 AhR 네트워크를 활성화한다는 모델을 지지한다.
실시예 6 - TDO2-AhR-CXCL5는 종양 관련 대식세포(TAM)를 CRC TME로 모집함으로써 종양 성장을 촉진한다
TAM을 모집할 수 있는 WNT-TDO2-AhR 경로 표적을 식별하기 위해 APC-KO MC38 ishTDO2 세포로부터 순화 배지(CM)의 사이토카인 어레이 프로파일링을 수행하였다. TDO2 고갈은 G-CSF, GM-CSF, CXCL2(도 13A) 및 기타 사이토카인(하기 참조)을 포함하는 고전적인 대식세포 사이토카인의 분비를 감소시켰다. 상응하게, 골수 유래 대식세포(BMDM)를 사용한 트랜스웰 이동 분석은 APC-KO MC38 ishTDO2 배양물로부터의 CM이 TDO2 고갈 시 무효화된 대식세포 이동을 증가시킴을 입증하였(도 13B).
다음으로, 가장 고도로 조절된 사이토카인을 보다 완전히 조사하기 위해, RNA-seq 데이터세트에서 최상위 유전자를 식별하고 qRT-PCR을 검증하였다. CXCL5, CXCL7(PPBP), CSF3(G-CSF), CXCR2, CXCL2, CXCL10, CCL2 및 CXCL1은 APC 결실 또는 TDO2 결핍과 관련된 가장 유의한 발현 변화를 나타내었다(도 12A). APC-KO MC38 세포에서 AhR 유전자 표적의 CHIP-seq 분석은 이들 유전자에 대한 직접적인 AhR 결합(도 13C) 및 APC-KO MC38 세포에서 shRNA에 의한 AhR 고갈이 이들 표적 유전자의 발현을 억제함을 보여주었다(도 13D).
TDO2의 표적 사이토카인을 추가로 확인하기 위해, RNA-seq 데이터에서 상위 3개 유전자(CXCL5, CXCL7(PPBP) 및 CSF3)의 ORF를 발현하는 세포주를 APC-KO MC38 ishTDO2 세포에서 생성시키고 종양 성장을 모니터링하여, TDO2 녹다운에 의해 손상된 증식을 구제하는 유전자를 식별하였다. 가장 높은 변화 배수를 보인 CXCL5의 강제 발현은 TDO2 고갈에 의해 매개된 감소된 종양 성장을 가장 유의하게 구제하였다(도 12B). CXCL5-과발현 APC-KO 종양의 CyTOF 분석은 shTDO2의 존재 하에 증가된 대식세포를 나타내었다(도 12C-12E).
이동 분석은 APC-KO TDO2 고갈된 MC38 세포로부터 CM에 CXCL5를 보충함으로써 대식세포 모집의 구제를 입증한 반면, CXCL5가 결합하는 CXCR1/2 억제제의 공동-처리는 CXCL5 보충에 의한 구제를 없앴다(도 12F). APC-KO MC38 세포로부터의 순화 배지는 Raw264.7 세포에서 여러 M2 대식세포 마커를 상향조절하였고, 이는 TDO2 녹다운에 의해 감소되고 CXCL5 보충에 의해 구제되었다(도 13E). 유사하게, BMDM이 Kyn 또는 CXCL5와 공동 배양될 때, M2 대식세포 마커가 증가하였으며, 이는 TAM 분극에 있어서 TDO2-AhR 축의 잠재적인 역할을 암시한다(도 13F).
대식세포 마커의 면역조직화학 분석은, CXCL5 발현이 강화된 종양에서 대식세포의 침윤이 증가함을 입증하였다(도 13G). 최종적으로, APC-KO MC38 세포를 가진 이종이식 마우스는 TDO2 또는 대식세포 고갈에 의해 증가된 생존을 보였다. APC-KO MC38 세포주에서 CXCL5 과발현은 마우스의 생존을 유의하게 단축시켰고, 이는 대식세포를 고갈시킴으로써 역전되었다(도 12G). shCXCL5로 처리되거나 항-CXCL5 중화 항체로 처리된 APC-KO MC38 세포는 또한 연장된 생존을 나타내었다(도 13H 및 13I).
TDO2-AhR-CXCL5 축과 대식세포 침윤 간의 관계를 추가로 검증하기 위해, TCGA CRC(COAD 및 READ) 및 BRCA 데이터세트를 CXCL5 발현을 기반으로 클러스터링하고 상관관계가 있는 면역 집단에 대해 분석하였으며 대식세포가 CXCL5-높은 그룹에서 상향조절된다는 것을 발견하였다(도 14A-14D). 또한, CXCL5 발현은 증가된 트립토판 대사(상위 경로 시그니처 유전자로서의 TDO2) 및 TCGA CRC 및 BRCA에서 생체이물 대사(추세)와 유의하게 상관관계가 있었다(도 14E-14G). 함께, 이들 데이터는 TDO2-AhR 경로에 의한 CXCL5의 상향조절이 종양 성장을 촉진하기 위해 TME로의 대식세포 모집을 유도하고 TDO2-AhR-CXCL5 경로의 중화가 종양 성장을 억제할 수 있음을 입증한다.
실시예 7 - GAS6은 대식세포에서 CXCL5에 의해 상향조절되고 세포 성장을 촉진한다
수용체 티로신 키나제 포스포어레이 분석을 수행하여, APC-KO 세포에서 인산화된 Axl의 현저한 상향조절을 밝혀내었으며, 이는 APC-KO 세포주에서만 TDO2 고갈 시 감소하였다(도 15A).
Gas6은 Axl의 리간드이며 주로 TME의 종양 관련 대식세포에 의해 분비되고(Loges et al., 2010), 이는 대식세포 유래 Gas6이 APC 결핍 암 세포의 성장을 지원하기 위해 Axl을 활성화할 가능성을 상승시킨다. 이러한 가능성을 평가하기 위해, APC-KO 세포가 증가된 전체 Axl 및 Axl 인산화를 갖는 지를 검증하였으며 Axl 억제제 R428은 Axl 인산화를 감소시키는 것으로 나타났다(도 15B). 반대로, 마우스 재조합 Gas6(rmGas6)은 Axl을 활성화하였고(도 15C), 시험관내에서 R428 처리에 의해 역전된 암 세포 성장을 촉진시켰다(도 15D). 더욱이, APC-결핍 세포는 APC-온전한 MC38 세포와 비교할 때 R428에 대한 증가된 감수성을 나타내었다(도 15E). 또한, APC-KO MC38 세포로 확립된 동소 종양은 TDO2 고갈에 의해 감소된 종양 세포에서 증가된 인산화된 Axl(EpCam 염색에 의해 표시됨)을 나타내었다. 이들 동소 종양은 또한 인산화된 Axl을 구제한 TDO2-고갈된 APC-KO MC38 세포에서 CXCL5의 강제 발현을 나타내었다(도 15F).
암 세포에서 분비된 인자가 대식세포에서 Gas6 발현을 상향조절할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, BMDM을 MC38 세포주의 순화 배지와 함께 배양하였다. APC-KO MC38 세포주로부터의 순화 배지는 TDO2가 고갈된 APC-WT 세포주 및 APC-KO MC38 세포와 비교하여 대식세포에서 Gas6 mRNA 수준을 유의하게 증가시켰다(도 15G). 또한 CSF1은 대식세포에서 Gas6을 상향조절하는 것으로 공지되어 있지만 Kyn과 CXCL5는 또한 BMDM뿐만 아니라 Gas6 자체에서 Gas6 발현을 증가시키며, 이는 양의 피드백 루프를 암시한다(도 15H). 최종적으로, 생체내 종양 성장 촉진에서 Gas6의 역할을 검증하기 위해, CT26 세포주 및 2개의 독립적인 Raw 264.7 shGas6 세포주를 동계 Balb/CJ 마우스에 공동 주사하였다(도 15I). Gas6이 고갈된 대식세포가 주사된 마우스는 종양 성장이 감소된 것으로 나타났고(도 15J), CXCL5로 사전 처리된 대식세포는 CT26의 성장을 유의하게 촉진시켰다(도 15K). 종합적으로, 이러한 데이터는 부분적으로 CXCL5-Gas6-Axl 회로에 의해 매개되는 암 세포와 대식세포 사이의 공생 관계를 밝혀내었다.
실시예 8 - 실시예 1-7에 기재된 특정 연구와 관련된 물질 및 방법
물질
마우스
마우스를 대형 플라스틱 케이지에서 5마리 동물로 그룹화하고 병원균이 없는 조건에서 유지하였다. 모든 동물 연구는 MD Anderson 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행되었다. NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ), C57BL/6J 및 BALB/cJ 마우스는 Jackson 연구소(스톡 번호: 005557, 000664, 000651)에서 구입하였다. 결장직장 동소 이종이식 종양 모델은 하기의 프로토콜에 의해 확립되었다(Tseng et al., 2007, JoVE).
세포
CRC 세포주 MC38 및 이의 동질유전자 세포뿐만 아니라 BMDM 및 293T 세포를 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양하였다. CCD-841-CoN, RKO, HT-29 및 LS180 세포를 이글의 최소 필수 배지(EMEM)에서 배양하였다. HT-29 세포를 맥코이(McCoy)의 5A 배지에서 배양하였다. DLD-1, CT26, 4T1 및 Raw264.7 대식세포 세포주를 RPMI 1640 배지(RPMI)에서 배양하였다. 모든 세포주는 10% Tet 시스템 승인된 FBS(Clontech) 및 100 U/㎖ 암피실린/페니실린을 함유하는 표시된 배지에서 배양되었다. 모든 인간 세포주는 MD Anderson 세포주 코어 시설에서 핑거프린팅을 통해 검증되었다. 모든 세포는 마이코플라스마가 없는 것으로 확인되었으며 37℃ 및 5% CO2에서 유지되었다. C57BL/6 마우스의 BMDM은 앞서 기재된 바와 같이 배양되었다(Chen et al., 2017). FBS가 없는 배양 배지에서 24시간 동안 배양한 후 표시된 대로 처리된 또는 처리되지 않은 세포로부터 순화 배지를 수집하였다.
CRISPR-Cas9 형질감염
인간 APC 유전자(sc-400374)를 표적으로 하는 sgRNA 플라스미드는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. 마우스 APC 유전자의 경우, TTGAGCGTAGTTTCACTCCG의 sgRNA 표적 서열을 pCas-Guide-EF1a-GFP 플라스미드(Origene Technologies, Inc.)에 클로닝하였다. 인간 RKO 및 마우스 MC38 세포를 6웰 플레이트에서 10% 열-불활성화된 FBS 및 100 U/㎖ 암피실린/페니실린이 보충된 배양 배지에서 70-80% 융합율로 유지시켰다. sgRNA가 있는 플라스미드를 제조 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 72시간 후에 수확하고, GFP-양성 세포를 유식 세포분석에 의해 단일 세포로서 96-웰 플레이트의 각 웰에 분류하였다. 세포 분류 후 10일째에, 성장된 세포 콜로니를 24-웰 플레이트에서 확대시켰다. 각 콜로니에서 APC 유전자의 녹아웃을 RT-PCR과 APC 및 β-카테닌에 대한 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.
APC min 마우스 오가노이드
18주령 수컷 APCmin 마우스의 장 폴립을 채취하고 절단된 조직을 30 mM EDTA를 포함하는 완전한 킬레이트 용액으로 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 이어서 조직 조각을 부드럽게 피펫팅하여 선와를 분리하였다. 이어서 이러한 선와를 7-10일 동안 ROCK 억제제 Y-27632의 존재 하에 높은 WNT 인간 오가노이드 배지의 존재 하에서 매트리젤(Corning)에 시딩하였다.
방법
유전자 안정성 shRNA 녹다운 및 유도성 shRNA 녹다운
마우스뿐만 아니라 TDO2 및 AhR을 표적으로 하는 shRNA 헤어핀이 이 연구에서 사용되었다. 각 유전자에 대해 5 내지 7개의 헤어핀을 선별하고 단백질 수준을 >70%까지 감소시키는 서열을 선택하였다. 이 선택된 헤어핀은 pLKO.1 벡터에 있었다. 재조합 렌티바이러스 입자를 293T 세포로의 플라스미드의 일시적 형질감염에 의해 생성시켰다. 요약하면, 8 ㎍의 shRNA 플라스미드, 4 ㎍의 psPAX2 플라스미드 및 2 ㎍의 pMD2.G 플라스미드를 리포펙타민 2000을 사용하여 100 ㎜ 접시에 도말된 293T 세포에 형질감염시켰다. 바이러스 상등액을 형질감염 48시간 및 72시간 후에 수집하고 여과하였다. 세포를 8 ㎍/㎖ 폴리브렌을 함유하는 바이러스 상등액으로 48시간 동안 2회 감염시킨 다음, 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 사용하여 선택하고 RT-qPCR에 의해 TDO2 및 AhR 발현을 시험하였다.
웨스턴 블롯
세포 용해물을 프로테아제 억제제 cock가 있는 RIPA 용해 완충액(Roche)으로 제조하였다. 면역블롯팅을 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 항체는 표시된 회사에서 구입하였다.
면역조직화학 및 면역형광
면역조직화학을 앞서 기재된 표준 프로토콜을 사용하여 수행하였다(Chen et al., 2017; Zhao et al., 2017). 간단히, 압력솥(30분 동안 95℃, 이어서 10초 동안 120℃)을 항원 노출 용액(Vector Laboratories)을 사용하여 항원 검색에 사용하였다. X에 특이적인 항체가 이 연구에서 사용되었다. 인간 및 마우스 종양 조직 섹션을 검토하고 채점하였다. Pannoramic 250 Flash III(3DHISTECH Ltd)를 사용하여 슬라이드를 스캔하고 Pannoramic Viewer 소프트웨어(3DHISTECH Ltd)를 통해 영상을 캡처하였다. 인간 시편과 관련된 연구는 MD Anderson 생명윤리위원회의 승인을 받았다.
이동 분석
대식세포(Raw264.7 및 BMDM의 경우 1 x 104)를 무혈청 배양 배지에 현탁시키고 24웰 트랜스웰 삽입물(5.0 ㎛)에 접종하였다. 표시된 인자가 있는 배지 또는 순화 배지를 나머지 수용 웰에 추가하였다. 24시간 후, 이동된 대식세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛(0.05%, sigma)으로 염색하고, 이어서 크리스탈 바이올렛이 용해된 후 현미경 하에서 시야당 세포로 카운트하거나 OD590 ㎚(이동 지수로 표시)로 측정하였다.
콜로니 형성 분석
시험관 내 결장직장 암 세포 증식을 콜로니 형성을 통해 분석하였다. 1 × 103 세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고 5-7일 동안 배양하였다. 종점에서 세포를 고정시키고 1시간 동안 25% 메탄올 중 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 이러한 연구를 3회 수행하였다.
질량 세포분석법(CyTOF)
CyTOF 분석을 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(Lao et al., 2019). 간략하게, 종양을 절단하고 FcR로 차단된 단일 세포를 표면 항체와 함께 배양하였다. 이어서 세포를 Cell-ID 시스플라틴(Fluidigm, Cat# 201064)과 함께 배양하고 FOXP3 세포내 염색을 위해 투과화하였다. 핵 염색을 위해 세포를 고정하면서 Cell-ID Intercalator-Ir(Fluidigm, Cat #201192A)과 함께 배양하였다. 샘플은 MD Anderson 암 센터의 유식 세포분석 및 세포 영상화 코어 시설에서 CyTOF 기기(Fluidigm)로 분석되었다. FlowJo(Tree Star) 및 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 각 세포 집단의 세포 수와 백분율을 분석하였다. CyTOF 데이터를, Cytobank(Chen and Kotecha, 2014)를 사용하여 구현된 차원 축소 방법 viSNE(Amir el et al., 2013)를 사용하여 시각화하였다.
ChIP-서열분석 및 ChIP-PCR
ChIP를 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(Zhao et al., 2017). 간략하게, PFA로 고정된 세포의 염색질을 1% PFA를 사용하여 10분 동안 가교결합시킨 다음 실온에서 0.125 M 글리신(5분)을 사용하여 반응을 급냉시켰다. 세포를 ChIP 용해 완충액[10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton X-100, 0.2% SDS 및 0.1% 데옥시콜산]으로 30분 동안 빙상에서 용해시켰다. 염색질 단편화를 Diagenode BioruptorPico 초음파 분쇄기를 사용하여 수행하였다(30초 온 및 30초 오프, 45주기). 이어서 용해된 염색질을 항체 및 Dynabeads(Life Technologies)의 적합한 혼합물과 함께 밤새 배양하였다. 이어서 면역 복합체를 RIPA 완충액(3회), RIPA-500(500 mM NaCl이 포함된 RIPA)으로 1회, 및 LiCl 세척 완충액[10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 250 mM LiCl, 0.5% NP-40 및 0.5% 데옥시콜산]으로 1회 세척하였다. 용출 및 역-가교결합을 65℃에서 하룻밤 동안 프로테나제 K(20 ㎎/㎖)를 함유하는 직접 용출 완충액[10 mM Tris-Cl(pH 8.0), 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, 0.5% SDS]에서 수행하였다. 용출된 DNA를 AMPure 비드(Beckman-Coulter)를 사용하여 정제한 다음 NEBNext Ultra DNA 라이브러리 키트(E7370)를 사용하여 라이브러리를 생성시키거나 qPCR을 수행하는 데 사용하였다. Illumina HiSeq 2500 장비를 사용하여 서열분석을 수행하여 데이터세트를 생성시켰다.
mRNA 발현 분석 및 마이크로어레이
제조사의 지시에 따라 Trizol(Invitrogen)을 사용하여 세포로부터 RNA를 단리하였다. RNA(200-500 ng)를 먼저 DNA-free 키트(Ambion)를 사용하여 RNase-free DNase I으로 처리하여 모든 게놈 DNA를 제거하고, 이어서 ABI 고 용량 cDNA RT 키트(Invitrogen)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. cDNA를, Applied Biosystems 7900 서열 검출 시스템과 함께 실시간 정량 PCR(SYBR Green, Invitrogen)을 사용하여 분석하였다. 각 반응을 3회 중복수행하였다. 각 유전자의 발현을 마우스 액틴 또는 인간 GAPDH에 의해 정규화하였다.
제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen; #15596-026)을 사용하여 세포에서 RNA 단리하였다. 그런 다음 RNA를 RNeasy(QIAGEN)로 추가 정제하고 이어서 SuperScript III 제1-가닥 합성 시스템(Invitrogen)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 표적 유전자의 발현을 분석하기 위해 RT-qPCR을 수행하였다. 마이크로어레이 분석을, GeneChip Mouse Clariom D 어레이(Affymetrix)를 사용하여 MD Anderson 마이크로어레이 코어 설비에서 독시사이클린 처리(대조군 및 APC-KO MC38 종양에 대해 생물학적 3중복제물)와 함께 및 상기 처리 없이 APC-WT 및 APC-KO MC38 ishTDO2 종양으로부터 제조된 RNA 상에서 수행하여 데이터세트를 생성시켰다. 대조군과 APC-고갈된 MC38 세포 사이에 차등적으로 발현된 유전자를 유전자세트 농축 분석(GSEA)에 적용하였다. 원 데이터를, 전사체 분석 콘솔(Transcriptome Analysis Console)을 사용하여 GenePattern에 의해 처리 및 분석하였다.
정량분석 및 통계 분석
모든 통계 분석을 스튜던트 t-검정으로 수행하였으며 평균 ± SD로 표시하였다. 핵 β-카테닌, TDO2 및 CD163 간의 상관관계에 대한 TAM IHC 염색 분석을 카이제곱 검정을 사용하여 수행하였다. 마우스 생존 분석은 로그-순위(만텔-콕스) 검정(GraphPad Prism 7)을 사용하여 수행하였다. p 값을 하기와 같이 지정하였다: *, p<0.05; **, p<0.01 및 ***, p<0.001; n.s. 중요하지 않음(p>0.05).
***
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이, 변형이 본원에 기재된 방법 및 단계 또는 설명된 방법의 단계의 순서에 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 작용제가, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안, 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 자명한 그러한 모든 유사한 대체물 및 수정은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 진의, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌은 예시적인 절차 또는 본원에 기재된 것에 보충적인 기타 세부사항을 제공하는 한, 본원에 참고로 구체적으로 포함된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Board of Regents, The University of Texas System <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF APC-DEFICIENT CANCER <130> UTSC.P1205WO (1001157641) <150> 62/982,561 <151> 2020-02-27 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Gly Cys Pro Phe Leu Gly Asn Asn Phe Gly Tyr Thr Phe Lys 1 5 10 15 Lys Leu Pro Val Glu Gly Ser Glu Glu Asp Lys Ser Gln Thr Gly Val 20 25 30 Asn Arg Ala Ser Lys Gly Gly Leu Ile Tyr Gly Asn Tyr Leu His Leu 35 40 45 Glu Lys Val Leu Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ser Glu Thr Lys Gly Asn 50 55 60 Lys Ile His Asp Glu His Leu Phe Ile Ile Thr His Gln Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Leu Trp Phe Lys Gln Ile Leu Trp Glu Leu Asp Ser Val Arg Glu Ile 85 90 95 Phe Gln Asn Gly His Val Arg Asp Glu Arg Asn Met Leu Lys Val Val 100 105 110 Ser Arg Met His Arg Val Ser Val Ile Leu Lys Leu Leu Val Gln Gln 115 120 125 Phe Ser Ile Leu Glu Thr Met Thr Ala Leu Asp Phe Asn Asp Phe Arg 130 135 140 Glu Tyr Leu Ser Pro Ala Ser Gly Phe Gln Ser Leu Gln Phe Arg Leu 145 150 155 160 Leu Glu Asn Lys Ile Gly Val Leu Gln Asn Met Arg Val Pro Tyr Asn 165 170 175 Arg Arg His Tyr Arg Asp Asn Phe Lys Gly Glu Glu Asn Glu Leu Leu 180 185 190 Leu Lys Ser Glu Gln Glu Lys Thr Leu Leu Glu Leu Val Glu Ala Trp 195 200 205 Leu Glu Arg Thr Pro Gly Leu Glu Pro His Gly Phe Asn Phe Trp Gly 210 215 220 Lys Leu Glu Lys Asn Ile Thr Arg Gly Leu Glu Glu Glu Phe Ile Arg 225 230 235 240 Ile Gln Ala Lys Glu Glu Ser Glu Glu Lys Glu Glu Gln Val Ala Glu 245 250 255 Phe Gln Lys Gln Lys Glu Val Leu Leu Ser Leu Phe Asp Glu Lys Arg 260 265 270 His Glu His Leu Leu Ser Lys Gly Glu Arg Arg Leu Ser Tyr Arg Ala 275 280 285 Leu Gln Gly Ala Leu Met Ile Tyr Phe Tyr Arg Glu Glu Pro Arg Phe 290 295 300 Gln Val Pro Phe Gln Leu Leu Thr Ser Leu Met Asp Ile Asp Ser Leu 305 310 315 320 Met Thr Lys Trp Arg Tyr Asn His Val Cys Met Val His Arg Met Leu 325 330 335 Gly Ser Lys Ala Gly Thr Gly Gly Ser Ser Gly Tyr His Tyr Leu Arg 340 345 350 Ser Thr Val Ser Asp Arg Tyr Lys Val Phe Val Asp Leu Phe Asn Leu 355 360 365 Ser Thr Tyr Leu Ile Pro Arg His Trp Ile Pro Lys Met Asn Pro Thr 370 375 380 Ile His Lys Phe Leu Tyr Thr Ala Glu Tyr Cys Asp Ser Ser Tyr Phe 385 390 395 400 Ser Ser Asp Glu Ser Asp 405

Claims (81)

  1. 대장선종용종(adenomatous polyposis coli; APC) 돌연변이를 갖는 것으로 결정된 암이 있는 대상체(subject)를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 (a) 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO2) 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공함을 포함하는, 방법.
  2. APC-결핍 암(APC-deficient cancer)에 대해 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 (a) 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO2) 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공함을 포함하는, 방법.
  3. 대상체를 암에 대해 치료하는 방법으로서,
    (a) 암을 APC 결핍이 있는 것으로서 확인하고;
    (b) 상기 대상체에게 유효량의 (i) 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO2) 또는 (ii) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공함
    을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    결핍이 APC 돌연변이인, 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    결핍이 APC 발현의 억제(repression)인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    억제가 후성적 억제(epigenetic repression)인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    억제제가 TDO2의 억제제인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    억제제가 암에서 TDO2의 발현을 억제하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    억제제가 암에서 TDO2의 활성을 억제하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    억제제가 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 억제제, 항체 또는 항체-유사 분자인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    억제제가, TDO2를 표적화(targeting)하는 siRNA, shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    억제제가 PF06845102/EOS200809, 680C91, LM10, HTI-1090, DN1406131, RG70099, EPL-1410, CB548, CMG017, 또는 이들의 유도체인, 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    억제제가, TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    사이토카인이 CXCL5, CXCL7, CSF3, CXCR2, CXCL2, CXCL10, CCL2 또는 CXCL1인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    사이토카인이 CXCL5, CXCL7 또는 CSF3인, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    사이토카인이 CXCL5인, 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    억제제가 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소분자 억제제, 항체, 또는 항체-유사 분자인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    억제제가 CXCR1/2 억제제인, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    억제제가 CXCR5 억제제인, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    억제제가, CXCR5를 표적화하는 항체 또는 항체-유사 분자인, 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    억제제가, CXCL5를 표적화하는 siRNA, shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 대조 또는 참조 샘플에 비해 증가된 TDO2 발현을 갖는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    대조 또는 참조 샘플이 건강한 대상체로부터의 생물학적 샘플인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 구성적으로 활성인 WNT 신호전달(signaling)을 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 결장직장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 폐암(lung cancer), 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma) 또는 육종(sarcoma)인, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    암이 결장직장암인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 I기 암(stage I cancer)인, 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IIa기 암인, 방법.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IIb기 암인, 방법.
  30. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IIc기 암인, 방법.
  31. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IIIa기 암인, 방법.
  32. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IIIb기 암인, 방법.
  33. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IIIc기 암인, 방법.
  34. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IVa기 암인, 방법.
  35. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 IVb기 암인, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 재발성 암인, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 암 면역요법을 제공함을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    암 면역요법이 항체 요법 또는 세포 요법인, 방법.
  39. 제37항에 있어서,
    암 면역요법이 관문 억제제 요법(checkpoint inhibitor therapy)인, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 추가 요법을 제공함을 추가로 포함하고, 상기 추가 요법이 화학요법, 방사선 요법, 수술, 또는 이들의 조합인, 방법.
  41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 화학요법, 방사선 요법, 수술, 또는 이들의 조합을 제공함을 포함하지 않는, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    대상체에게 화학요법, 방사선 요법, 또는 수술 중 임의의 것을 제공함을 포함하지 않는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에서 종양 관련 대식세포의 수를 감소시킴을 포함하는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1(IDO1) 또는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 2(IDO2)의 억제제를 제공함을 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체에게 IDO1 또는 IDO2의 억제제를 제공함을 포함하지 않는, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제학적 조성물을 정맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수강내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소, 흡입을 통해, 또는 둘 이상의 투여 경로의 조합을 통해 투여하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 이전에 암에 대해 치료받은 적이 없는, 방법.
  48. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 이전에 첫 번째 치료로 암에 대해 치료받은, 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    첫 번째 치료가 수술, 화학요법, 방사선 요법, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서,
    암이 선행 치료에 대해 내성인 것으로 결정된, 방법.
  51. 암을 TDO2 억제에 민감한 것으로 확인하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 암 세포를 수득하고;
    (b) 상기 암 세포에서 APC 유전자의 결핍을 검출하고;
    (c) 상기 (b)에 기반하여 암이 TDO2 억제에 민감한 것으로 확인함
    을 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    비-암성 생물학적 샘플(non-cancerous biological sample)로부터의 세포에 비해, 암 세포에서 TDO2의 증가된 발현 또는 활성을 검출함을 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    결핍이 APC 돌연변이인, 방법.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    결핍이 APC 발현의 억제인, 방법.
  55. 제53항에 있어서,
    억제가 후성적 억제인, 방법.
  56. 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함하는지 여부를 결정하는 방법으로서,
    (a) 생물학적 샘플에서 APC 결핍의 존재 또는 부재를 측정하고;
    (b) 생물학적 샘플이 APC 결핍을 포함하는 경우 상기 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함함을 결정하고;
    (c) 생물학적 샘플이 APC 결핍을 포함하지 않는 경우 상기 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함하지 않음을 결정함
    을 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    생물학적 샘플에서 TDO2의 발현 또는 활성 수준을 측정함을 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    생물학적 샘플에서의 TDO2 발현 또는 활성 수준이 비-암성 생물학적 샘플에서의 발현 또는 활성 수준과 유의하게 다르지 않은 경우, 상기 생물학적 샘플이 TDO2 억제에 민감한 암 세포를 포함하지 않음을 결정함을 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    결핍이 APC 돌연변이인, 방법.
  60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    결핍이 APC 발현의 억제인, 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    억제가 후성적 억제인, 방법.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 샘플이 혈액 또는 혈청 샘플인, 방법.
  63. 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 세포가 결장직장 암 세포인, 방법.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 샘플이 결장직장암 환자의 수술 부위에 인접한 조직인, 방법.
  65. 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-암성 생물학적 샘플이 정상 점막 조직인, 방법.
  66. 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    샘플 중의 TDO2의 발현 또는 활성 수준을, 비-암성 샘플 중의 TDO2의 발현 또는 활성 수준과 비교함을 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제51항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체로부터 생물학적 샘플을 수득함을 추가로 포함하는, 방법.
  68. 대상체를 구성적으로 활성인 WNT 신호전달을 갖는 것으로 결정된 암에 대해 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 (a) 트립토판 2,3-디옥시게나제(TDO2) 또는 (b) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공함을 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    구성적으로 활성인 WNT 신호전달이 대장선종용종(APC) 유전자의 결핍을 포함하는, 방법.
  70. 제68항에 있어서,
    결핍이 APC 돌연변이인, 방법.
  71. 제68항에 있어서,
    결핍이 APC 발현의 억제인, 방법.
  72. 제10항에 있어서,
    억제가 후성적 억제인, 방법.
  73. 제68항에 있어서,
    구성적으로 활성인 WNT 신호전달이 구성적으로 활성인 β-카테닌을 포함하는, 방법.
  74. 제13항에 있어서,
    암이 구성적으로 활성인 β-카테닌 단백질을 포함하는, 방법.
  75. 암에 APC 돌연변이가 있는지 여부를 결정함을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 암에 APC 돌연변이가 있는 경우, 상기 대상체에게 유효량의 (i) TDO2 또는 (ii) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제를 제공하고;
    (b) 암에 APC 돌연변이가 없는 경우, 상기 대상체에게 유효량의 대체 요법을 제공하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서,
    대체 요법이 TDO2의 억제제 또는 TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인이 아닌, 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서,
    대체 요법이 화학요법, 방사선 요법, 수술, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  78. 대상체의 APC-돌연변이 암의 치료에서 (a) (i) TDO2 또는 (ii) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체의 용도.
  79. 대상체의 APC-돌연변이 암의 치료를 위한 약제의 제조에서의, (a) (i) TDO2 또는 (ii) TDO2 활성에 의해 활성화된 사이토카인의 억제제 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체의 용도.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서,
    암이 결장직장암인, 용도.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 대조 또는 참조 샘플에 비해 TDO2의 증가된 발현 또는 활성을 갖는 것으로 결정되는, 용도.
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