JP2023515190A - Ａｐｃ欠損がんの治療のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】 本開示では、ＡＰＣ欠損がんなどの異常なＷＮＴシグナル伝達を有するがんを有する対象を治療するための方法及び組成物が提供される。【解決手段】したがって、本開示の態様は、ＴＤＯ２またはＴＤＯ２によって活性化されるサイトカインの阻害剤を投与することを含む、ＡＰＣ欠損がんを治療するための方法に関するものである。さらなる態様は、ＡＰＣ遺伝子の欠損を検出すること及び／又はＴＤＯ２の発現レベルを測定することを含む、ＴＤＯ２阻害に感受性であるとしてがんを同定する方法に関するものである。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、２０２０年２月２７日に出願された米国仮出願第６２／９８２，５６１号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
シーケンスリスト
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で提出されたシーケンスリストを含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年２月２３日に作成され、ＵＴＳＣＰ１２０５ＷＯシークリスティングテキストと名付けられ、３８９９倍とのサイズである。
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）から授与されたＲ０１ＣＡ２３１３６０および５Ｔ３２ＣＡ１８６８９２－０４の政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本発明の側面は、少なくとも分子生物学、免疫学、および腫瘍学の分野に関するものである。
大腸がん（ＣＲＣ）は、先進国におけるがん関連の死亡原因の第２位であり、毎年世界中で６０万人以上の死亡に関与している。腺腫から腺がん、そして最終的には浸潤性及び転移性疾患へのＣＲＣの進化は、特徴的な遺伝子変化、最も顕著な腺腫性ポリポーシスコリー（ＡＰＣ）及びｐ５３腫瘍サプレッサーの不活性化及びＫＲＡＳオンコジーンの活性化の獲得によって支配されている（オーチャードら、２０１３年）。ＡＰＣの損失はまた、他の多くのがん種にわたって頻繁に起こる（Ｆａｎｇら、２００２；Ｆｕｒｕｕｃｈｉら、２０００；Ｈｏｒｉｉら、１９９２；Ｏｈｇａｋｉら、２００４）。ＡＰＣ経路に関して、変異したＡＰＣタンパク質はグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を活性化する能力を失い、これがβカテニンのＮ末端のセリン／スレオニン残基をリン酸化し、ユビキチン化によるβカテニンの分解を仲介している。したがって、ＡＰＣの欠損は、β－カテニンの蓄積をもたらし、次いで、核に移動してＴ細胞因子／リンパ球エンハンサー結合因子（ＴＣＦ／ＬＥＦ）転写因子複合体に結合して抑制を解除し、正則ＷＮＴシグナル伝達ネットワークの活性化を可能にする。
がんにおけるその重要性にもかかわらず、このＡＰＣシグナル伝達カスケードの治療標的化は、がん治療にとってとらえどころのない目標のままである。現在、ＷＮＴ経路を標的とする薬剤には、ＷＮＴリガンドの阻害剤、ｂ－カテニン分解複合体の阻害剤、ＴＣＦ／ＬＥＦの阻害剤、及びＷＮＴとクロストークするＮｏｔｃｈ及びＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達の阻害剤が含まれる。現在までのところ、これらのＷＮＴを標的としたプログラムは、まだ有意義な臨床結果を得ていない。ＡＰＣ欠損大腸がん（ＣＲＣ）やその他のＡＰＣ欠損腫瘍を標的とする特有の戦略の必要性が残されている。
本開示は、ＡＰＣ欠損がんを有する対象を処置するために好適である方法および組成物を提供する。本開示によれば、本開示の様々な局面が、ＡＰＣ欠損がんを有する対象を処置するための方法であって、対象にＴＤＯ２の阻害剤、またはＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤を与えることを含む、方法に関する。さらなる局面が、がんのために対象を処置するための方法であって、ＡＰＣ欠損を有するとしてがんを特定すること、および対象にＴＤＯ２の阻害剤、またはＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインを与えることを含む、方法に関する。さらなる局面が、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるとしてがんを特定するための方法であって、ＡＰＣ遺伝子における欠損および／またはＴＤＯ２の発現における増大を当該がんにおいて検出することを含む、方法を含む。さらにさらなる局面が、ＷＮＴシグナル伝達が構成的に活性であるがんのために対象を処置するための方法であって、対象にＴＤＯ２の阻害剤、またはＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤を与えることを含む、方法に関連する。
本開示の様々な実施形態には、ＡＰＣ欠損がんを有する対象を処置するための方法、ＡＰＣ変異を有すると判定されるがんを有する対象を処置するための方法、ＡＰＣ欠損ＣＲＣを有する対象を処置するための方法、ＴＤＯ２阻害を受けやすいとしてがんを特定するための方法、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害を受けやすいとしてがんを特定するための方法、患者を診断するための方法、患者を予後判定するための方法、がん細胞を検出するための方法、ＡＰＣ欠損がんを処置するための組成物、およびＷＮＴシグナル伝達が構成的に活性であるがんを有する対象を処置するための方法が含まれる。
本開示の方法では、下記工程のうちの少なくとも１工程、２工程、３工程、４工程、５工程、６工程、７工程、８工程、９工程、１０工程、またはそれ以上を含むことができる：ＴＤＯ２阻害剤を与える工程、サイトカインの阻害剤を与える工程、ＡＰＣ欠損を有するとしてがんを特定する工程、医薬組成物を対象に与える工程、がん細胞からの核酸を配列決定する工程、変異をがん細胞からの核酸において特定する工程、核酸発現レベルを対照値または参照値と比較する工程、がん細胞からの核酸のメチル化状態を分析する工程、生体サンプルを得る工程、がん細胞を対象から単離する工程、対象をガン治療法により処置する工程、対象を免疫療法により処置する工程、遺伝子の増大した発現を検出する工程、処置の成果を判定する工程、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるとしてがんを特定する工程、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害に対して感受性であるとしてがんを特定する工程、ＴＤＯ２を阻害する工程、ＣＸＣＬ５を阻害する工程、およびＣＸＣＬ１／２を阻害する工程。いくつかの実施形態において、いずれか１つまたは複数の工程が、開示された方法から除外されるとして意図される。
いくつかの実施形態において、本明細書中には、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異を有すると判定されるがんを有する対象を処置するための方法であって、（ａ）トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）の阻害剤、または（ｂ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を対象に与えることを含む、方法が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書中には、ＡＰＣ欠損がんのために対象を処置するための方法であって、（ａ）ＴＤＯ２の阻害剤、または（ｂ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を対象に与えることを含む、方法が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書中には、がんのために対象を処置するための方法であって、（ａ）ＡＰＣ欠損を有するとしてがんを特定すること、および（ｂ）（ｉ）ＴＤＯ２の阻害剤、または（ｉｉ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を対象に与えることを含む、方法が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書中には、ガンを対象において処置するための方法であって、ガンがＡＰＣ変異を有するかどうかを判定すること、ならびに（ａ）ガンがＡＰＣ変異を有するならば、（ｉｉ）ＴＤＯ２の阻害剤、または（ｉｉ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を対象に与えること、および（ｂ）ガンがＡＰＣ変異を有しないならば、効果的な量の代替治療法を対象に与えることを含む、方法が開示される。代替治療法が、例えば、放射線療法、化学療法または手術である場合がある。
いくつかの実施形態において、阻害剤がＴＤＯ２の阻害剤である。いくつかの実施形態において、阻害剤により、ＴＤＯ２の発現がガンにおいて阻害される。いくつかの実施形態において、阻害剤により、ＴＤＯ２の活性がガンにおいて阻害される。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子阻害剤、抗体、または抗体様分子である。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＴＤＯ２を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＰＦ０６８４５１０２／ＥＯＳ２００８０９、６８０Ｃ９１、ＬＭ１０、ＨＴＩ－１０９０、ＤＮ１４０６１３１、ＲＧ７００９９、ＥＰＬ－１４１０、ＣＢ５４８、ＣＭＧ０１７、またはそれらの誘導体である。いくつかの実施形態において、阻害剤はＰＦ０６８４５１０２／ＥＯＳ２００８０９である。いくつかの実施形態において、阻害剤は６８０Ｃ９１である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、脳脊髄内投与、皮下投与、関節内投与、滑液包内投与、クモ膜下腔内投与、経口投与、局所投与、吸入による投与、または２つ以上の投与経路の組み合わせによる投与によって投与される。
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、ＣＳＦ３、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２またはＣＸＣＬ１である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７またはＣＳＦ３である。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＣＸＣＬ５である。いくつかの実施形態において、阻害剤はＣＸＣＬ１／２阻害剤である。いくつかの実施形態において、阻害剤はＣＸＣＬ５阻害剤である。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＣＸＣＲ５を標的とする抗体または抗体様分子である。いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＣＸＣＬ５を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本明細書中には、いくつかの局面において、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるとしてがんを特定するための方法であって、（ａ）がん細胞を対象からの生体サンプルから得ること、（ｂ）ＡＰＣ遺伝子における欠損をがん細胞において検出すること、および（ｃ）ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるとしてガンを（ｂ）に基づいて特定することを含む、方法が開示される。いくつかの実施形態において、生体サンプルが、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるがん細胞を含むかどうかを判定するための方法であって、（ａ）ＡＰＣ欠損の有無を生体サンプルにおいて測定すること、（ｂ）生体サンプルがＡＰＣ欠損を含むならば、生体サンプルは、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるがん細胞を含んでいると判定すること、および（ｃ）生体サンプルがＡＰＣ欠損を含まないならば、生体サンプルは、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるがん細胞を含んでいないと判定することを含む、方法もまた開示される。
いくつかの実施形態において、方法はさらに、ＴＤＯ２の増大した発現または活性を非ガン性生体サンプルからの細胞と比較してがん細胞において検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法はさらに、ＴＤＯ２の発現レベルまたは活性レベルを生体サンプルにおいて測定することを含む。いくつかの実施形態において、方法はさらに、生体サンプルにおけるＴＤＯ２の発現レベルまたは活性レベルが非ガン性生体サンプルにおける発現レベルまたは活性レベルと有意に異なっていないならば、生体サンプルは、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるがん細胞を含んでいないと判定することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＣ欠損がＡＰＣ変異である。いくつかの実施形態において、ＡＰＣ欠損はＡＰＣ発現の抑制である。いくつかの実施形態において、抑制はエピジェネティック抑制である。
いくつかの実施形態において、ガンは、健常な対象からの生体サンプルである場合がある対照サンプルまたは参照サンプルと比較して、ＴＤＯ２の増大した発現を有する。いくつかの実施形態において、ガンは、構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態において、ガンは、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、頭頸部扁平上皮がんまたは肉腫である。いくつかの実施形態において、ガンは結腸直腸がんである。いくつかの実施形態において、ガンは、所与の診断ステージのガンである。いくつかの実施形態において、ガンは、ステージＩ、ステージＩＩａ、ステージＩＩｂ、ステージＩＩｃ、ステージＩＩＩａ、ステージＩＩＩｂ、ステージＩＩＩｃ、ステージＩＶａまたはステージＩＶｂのガンである。いくつかの実施形態において、ガンは再発性ガンである。いくつかの実施形態において、対象は上記がんのために以前に処置された。いくつかの実施形態において、対象は上記がんのために以前に処置されたことがない。いくつかの実施形態において、ガンは、以前の処置に対して抵抗性であると判定された。
いくつかの実施形態において、開示された方法はさらに、対象にがん免疫療法を与えることを含む。がん免疫療法が、例えば、抗体療法または細胞療法である場合がある。いくつかの実施形態において、がん免疫療法はチェックポイント阻害剤療法である。いくつかの実施形態において、方法はさらに、化学療法、放射線療法、手術、またはそれらの組み合わせであるさらなる治療法を対象に与えることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、化学療法、放射線療法または手術を対象に与える工程をどのような工程であれ含まない。いくつかの実施形態において、方法は、腫瘍関連マクロファージの数を対象において低下させることを含む。
いくつかの実施形態において、生体サンプルが、血液サンプルまたは血清サンプルである。いくつかの実施形態において、がん細胞が結腸直腸がん細胞である。いくつかの実施形態において、生体サンプルが、結腸直腸がん患者の手術部位に隣接する組織サンプルである。いくつかの実施形態において、非ガン性生体サンプルが、正常な粘膜組織である。
いくつかの実施形態において、開示された方法はさらに、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）またはインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）の阻害剤を対象に与えることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＩＤＯ１またはＩＤＯ２の阻害剤を対象に与えることを含まない。
本開示の様々な局面が、構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達を有すると判定されるがんのために対象を処置するための方法であって、（ａ）ＴＤＯ２の阻害剤、または（ｂ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を対象に与えることを含む、方法に関する。いくつかの実施形態において、構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達はＡＰＣ欠損を含む。いくつかの実施形態において、構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達はＡＰＣ欠損を含まない。いくつかの実施形態において、がんは、構成的に活性なβ－カテニンタンパク質を含む。
さらなる局面が、ＡＰＣ変異型ガンを対象において処置することにおける、またはＡＰＣ変異型ガンを対象において処置するための医薬品の製造における、（ａ）（ｉ）ＴＤＯ２の阻害剤、または（ｉｉ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤と、（ｂ）医薬用の許容され得るキャリアとの使用に関する。
本出願を通じて、用語「約」は、値が測定又は定量方法についての誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。
用語 ”ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”と共に使用される場合の単語”ａ”又は”ａｎ”の使用は、”１つ”を意味することがあるが、”１つ以上”、”少なくとも１つ”、”１以上”の意味とも一致する。
用語”及び／又は”は、”及び”又は”又は”を意味する。例示すると、Ａ、Ｂ、および／またはＣは、以下を含む。Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、またはＡ、Ｂ、及びＣの組み合わせが含まれる。言い換えれば、及び／又は、包括的な「又は」として機能する。Ａ、Ｂ、またはＣが実施形態から具体的に除外されてもよいことが特に企図される。
単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（含む）（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「ｈａｖｉｎｇ」（有する）（及び「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（含む）（及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）又は「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」（及び「ｃｏｎｔａｉｎ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は包括又はオープンエンドで、追加の、再現できない要素又は方法工程を除外しない。
組成物及びその使用方法は、本明細書を通じて開示される成分又はステップのいずれかを「含む」、「本質的になる」、又は「成る」ことができる。 開示された成分またはステップのいずれかから「本質的になる」組成物および方法は、請求された発明の基本的かつ新規な特性に重大な影響を及ぼさない指定された材料またはステップに請求の範囲を限定する。
本明細書及び請求項において使用される場合、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「ｈａｖｉｎｇ」（及び「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（及び「ｃｏｎｔａｉｎ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は包括又は開放的で、追加の未記述要素や方法の手順を除外するものではない。用語”含む”の文脈で本明細書に記載される実施形態は、用語”からなる”又は”から本質的になる”の文脈でも実施され得ることが企図される。
治療的、診断的、又は生理学的目的又は効果の文脈における任意の方法はまた、記載された治療的、診断的、又は生理学的目的又は効果を達成又は実施するための、本明細書で議論される任意の化合物、組成物、又は薬剤の「使用」等の「使用」（用途）クレームの言語で記載することができる。
様々な実施形態が、本出願を通じて議論される。１つの態様に関して論じられた任意の実施形態は、他の態様にも同様に適用され、逆もまた同様である。本明細書で説明される各実施形態は、すべての側面に適用可能な実施形態であると理解される。 本明細書で論じられる任意の実施形態は、任意の方法または組成物に関して実施することができ、その逆もまた然りであることが企図される。さらに、組成物及びキットは、本明細書に開示される方法を実現するために使用することができる。実施例に規定される実施形態の側面は、異なる実施例または本願の他の場所、例えば概要、詳細な説明、請求項、および図面の簡単な説明において論じられる実施形態の文脈で実施され得る実施形態でもある。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内での様々な変更及び修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示しながら、例示のためにのみ与えられていることが理解されるべきである。
以下の図面は本明細書の一部を形成しており、本発明のある特定の局面をさらに明らかにするために含まれる。本発明は、本明細書中に示される具体的な実施形態の詳細な説明との組み合わせでこれらの図面の１つまたは複数を参照することによってよりよく理解され得る。
ＴＤＯを変異ＡＰＣ遺伝子のための合成上必須遺伝子としてＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。多数のガンタイプのＴＣＧＡデータベースにおけるＴＤＯ２およびＡＰＣ／ＣＴＮＮＢ１の相互の排他的パターンを示す。それぞれの遺伝子における変化の割合が示される。 ＴＤＯを変異ＡＰＣ遺伝子のための合成上必須遺伝子としてＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。可能性のある３つのＳＥ遺伝子が特定される２つの異なるデータセットを使用するベン図分析を示す。 ＴＤＯを変異ＡＰＣ遺伝子のための合成上必須遺伝子としてＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２のｍＲＮＡ発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）患者（ｎ＝４３３）においてＷＮＴ経路シグナチャー遺伝子の発現と有意に相関することを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＴＤＯを変異ＡＰＣ遺伝子のための合成上必須遺伝子としてＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。核β－カテニンが陰性のヒトＣＲＣ腫瘍（ｎ＝３４）および陽性のヒトＣＲＣ腫瘍（ｎ＝４７）におけるＴＤＯ２についての免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を描写するものを示す。スケールバー：Ｘ１０（２００μｍ）およびＸ４０（５０μｍ）。 ＴＤＯを変異ＡＰＣ遺伝子のための合成上必須遺伝子としてＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。核β－カテニンを有するＣＲＣ腫瘍がより高いＴＤＯ２発現を示したことを示す（ＴＤＯ２染色スコア０～３）。ピアソン相関係数＝４２．３４２、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。カイ二乗検定。 ＴＤＯを変異ＡＰＣ遺伝子のための合成上必須遺伝子としてＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。正常な結腸組織と比較して、核β－カテニン、Ｋｉ ６７およびＴＤＯ２の増大を明らかにする、ＡＰＣｍｉｎマウス由来のポリープおよびｉＫＡＰマウスモデル由来の腫瘍のＩＨＣ分析を示す。三連での研究の代表的画像が示される。スケールバー：１００μｍ。
ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＣＣＤ－８４１－ＣｏＮ細胞株および同質遺伝子型ＲＫＯ細胞株におけるＰＰＡＴのｍＲＮＡ発現を示す。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＣＣＤ－８４１－ＣｏＮ細胞株および同質遺伝子型ＲＫＯ細胞株におけるＡＰ３Ｄ１のｍＲＮＡ発現を示す。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＷＮＴシグナチャー遺伝子（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒ他、２００７）の発現に基づく、ＴＣＧＡ ＣＯＡＤおよびＲＥＡＤのデータセットのクラスター化を描写するものを示す。ＡＰＣ変異状態が示される。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。特徴的ＷＮＴ遺伝子セット（ＨＡＬＬＭＡＲＫ＿ＷＮＴ＿ＢＥＴＡ＿ＣＡＴＥＮＩＮ＿ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ）の発現に基づく、ＴＣＧＡ ＣＯＡＤおよびＲＥＡＤのデータセットのクラスター化を描写するものを示す。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。特徴的ＷＮＴ遺伝子の発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）患者サンプル（ｎ＝４３３）においてＴＤＯ２発現と相関することを示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＰＰＡＴのｍＲＮＡ発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）患者（ｎ＝４３３）においてＷＮＴ経路シグナチャー遺伝子の発現と逆相関することを示す。＊＊Ｐ＜０．０１。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）データセット（ｎ＝２２０）におけるＡＰＣおよびＣＴＮＮＢ１に対するＩＤＯ１／２の相互の排他的パターンを示す。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＩＤＯ１のｍＲＮＡ発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）患者（ｎ＝４３３）においてＷＮＴ経路シグナチャー遺伝子の発現と相関しないことを示す。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＩＤＯ２のｍＲＮＡ発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）患者（ｎ＝４３３）においてＷＮＴ経路シグナチャー遺伝子の発現との相関を示すことを示す。 ＴＤＯ２発現とＷＮＴ活性化との間での相関をＣＲＣにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＡＰＣ変異のためのＳＥ遺伝子をＣＲＣにおいて特定するための分析を表すベン図を示す。異なるカットオフを使用する２つの別個の分析が示される。＊左Ｐ値－β－カテニン活性がん細胞株について必須である遺伝子についてのＰ値。
ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＲＣ細胞株のＲＫＯ（ヒト）およびＭＣ３８（マウス）においてそれらの同質遺伝子型ＡＰＣ－ＫＯ対応体とともにＴＤＯ２およびβ－カテニンについての免疫ブロットを示す。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＡＰＣ欠失のＲＫＯ細胞株およびＭＣ３８細胞株はＴＤＯ２のｍＲＮＡ発現の増大を示すことを明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。転写因子ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２についてのＤＮＡ配列結合モチーフを示す。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ヒトおよびマウスのＴＤＯ２遺伝子のプロモーター領域はＴＣＦ４結合モチーフを転写開始部位の近くに有することを示す。このモチーフ配列はヒトおよびマウスの遺伝子において保存されている。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞におけるＣｈＩＰ－ｓｅｑがＴＣＦ４についての結合ピークをＴＤＯ２遺伝子のプロモーターで示したことを示す。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＣＦ ４抗体を使用するＣＨＩＰ－ＰＣＲがＴＤＯ２遺伝子のプロモーター領域への高まった結合をＤＬＤ－１細胞において示したことを示す。陰性対照としてのＧＡＰＤＨ、陽性対照としてのＭＹＣおよびＡＸＩＮ２。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ドミナントネガティブ（ＤＮ）ＴＣＦ４と同時トランスフェクションされたときにβ－カテニンの構成的活性形態（Δ９０）を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＴＤＯ２プロモーターのルシフェラーゼ活性からの結果を示す。ｎ＝３の生物学的反復。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。β－カテニンの構成的活性形態（Δ９０）およびドミナントネガティブ（ＤＮ）ＴＣＦ４を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈＴＤＯ２プロモーターおよびＴＣＦ４結合モチーフ変異ｈＴＤＯ２プロモーターのルシフェラーゼ活性を示す。ｎ＝３の生物学的反復。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２がＴＤＯ２のアップレギュレーションをＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。非クローン化ＭＣ３８細胞、ＡＰＣ陽性クローンおよびＡＰＣ欠失クローンにおけるＡＰＣおよびＴＤＯ２の免疫ブロッティングを示す。 ０ｎｇ、５０ｎｇおよび１００ｎｇの組換えマウスＷＮＴ３ａタンパク質が３６時間補充されるＭＣ３８細胞におけるＴＤＯ２の免疫ブロッティングを示す。 ＸＡＶ－９３９により用量依存的様式で処理されるＤＬＤ－１細胞におけるＴＤＯ２およびβ－カテニンについての免疫ブロットを示す。 ＸＡＶ－９３９により用量依存的様式で処理されるＣａｃｏ－２細胞におけるＴＤＯ２およびβ－カテニンについての免疫ブロットを示す。 ＸＡＶ－９３９により用量依存的様式で処理されるＨＣＴ－１５細胞におけるＴＤＯ２およびβ－カテニンについての免疫ブロットを示す。
ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２のｓｈＲＮＡノックダウン効率をＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株において明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲを示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ｓｈＴＤＯ２を発現するＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株のコロニー形成アッセイの代表的画像を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。６８０Ｃ９１を用量依存的様式で４８時間処理した後におけるＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株のクリスタルバイオレット染色の代表的画像を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。９６時間のｄｏｘ処理を行った後でのｉｓｈＴＤＯ２感染ＡＰＣｍｉｎコロノイド（ｃｏｌｏｎｏｉｄ）におけるＲＦＰ－カスパーゼ－３の免疫蛍光染色を示す。ｓｈＴＤＯ２の誘導がＧＦＰによって示される（矢印により強調される）。６３倍の倍率。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。Ｄｏｘ処理を４８時間行った後でのＡＰＣｍｉｎ ｉｓｈＴＤＯ２オルガノイド細胞溶解物におけるＴＤＯ２および切断型カスパーゼ－３についての免疫ブロットを示す。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２誘導のｓｈＲＮＡノックダウン効率をＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株において明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲを示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処理後でのｉｓｈＴＤＯ２を有するＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株における切断型カスパーゼ－３の免疫ブロットを示す。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（２×１０５個の細胞）の同所性注射後２１日目におけるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのインビボ生物発光に基づく代表的画像を示す。Ｄｏｘ食物が、ＴＤＯ２ノックダウンをインビボで誘導するために注射後５日目に与えられた（ｎ＝５／群）。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。Ｈにおける腫瘍からの腫瘍の総放射束測定を示す。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。図４Ｈにおけるマウスから採取される腫瘍の重量を示す（ｎ＝６／群）。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。図４Ｈにおけるサンプルから生じるＣＲＣ同所性腫瘍組織におけるＫＩ６７およびカスパーゼ－３のＩＨＣを示す。スケールバー：１００μｍ。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（５×１０５個の細胞）が同所移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存曲線を示す。Ｄｏｘ食物が、ＴＤＯ２ノックダウンをインビボで誘導するために同所性注射後５日目に適用された（ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８、ｎ＝５；ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ＋Ｄｏｘ ＭＣ３８、およびｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８、ｎ＝６；ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８＋Ｄｏｘ、ｎ＝７）。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（５×１０５個の細胞）が同所移植されたＮＳＧマウスの生存曲線を示す。Ｄｏｘ食物が、ＴＤＯ２ノックダウンをインビボで誘導するために同所性注射後５日目に適用された（ｎ＝８／群）。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２阻害剤により処理される、ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（５×１０５個の細胞）が同所移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存曲線を示す。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。エパカドスタットにより処理される、ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（５×１０５個の細胞）が同所移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存曲線を示す。ＴＤＯ２阻害剤処理およびエパカドスタット処理（１００ｍｇ／ｋｇ）が経口胃管栄養法によって１日２回、注射後５日目に開始された。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において生存のために必須であることを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２阻害剤（１００ｍｇ／ｋｇ）またはエパカドスタット（１００ｍｇ／ｋｇ）により処理され、終点で採取されたＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８腫瘍およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８腫瘍における切断型カスパーゼ－３、Ｆ４／８０、ＣＤ１６３およびＫｉ６７の免疫組織化学染色を示す。スケールバー：×１０（２００μｍ）。
ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。研究で使用されるヒトの正常細胞株およびＣＲＣ細胞株におけるＡＰＣおよびＣＴＮＮＢ１の変異状態を示す。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。同質遺伝子型のＡＰＣ－ＷＴ ＲＫＯ細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＲＫＯ細胞株、同様にまた、ＤＬＤ－１細胞株、ＬＳ１８０細胞株およびＨＴ－２８細胞株におけるＴＤＯ２のｓｈＲＮＡノックダウン効率を明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲを示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。ｓｈＴＤＯ２を発現するヒトＣＲＣ細胞株のコロニー形成アッセイの代表的画像を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。６８０Ｃ９１を用量依存的様式で４８時間処理した後におけるＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株のクリスタルバイオレット染色の代表的画像を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。ｓｈＴＤＯ２を発現するＡＰＣ－ＷＴ ＲＫＯ細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＲＫＯ細胞株（５×１０５細胞／注射）が注射されたＮＳＧマウスにおける腫瘍の重量を示す。腫瘍が皮下注射後２５日目に採取された（ｎ＝７／群）。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。ヌードマウスにおけるＴＤＯ２ノックダウンかつヘヤピン抵抗性（ＨＲ）のＴＤＯ２－ＯＲＦ発現ＤＬＤ－１細胞株の皮下腫瘍成長の測定を示す（５×１０５細胞／注射）。ｎ＝５／群。腫瘍の総放射束測定が示される。＊Ｐ＜０．０５、両側ｔ検定。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。図Ｓ２Ｅおよび図Ｓ２Ｆにおけるサンプルから生じる腫瘍組織におけるＫｉ６７およびカスパーゼ－３のＩＨＣを示す。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。図Ｓ２Ｅおよび図Ｓ２Ｆにおけるサンプルから生じる腫瘍組織におけるＫｉ６７およびカスパーゼ－３のＩＨＣを示す。スケールバー：１００μｍ。 ＴＤＯ２必須性をＡＰＣ変異／ＷＮＴ活性のヒトＣＲＣ細胞株において明らかにする研究からの結果を示す。Ｄｏｘ処理を９６時間行った後における誘導性ＴＤＯ２を有するＡＰＣｍｉｎオルガノイドの明視野画像を描写するものを示す。スケールバー：５０μｍ。
ＴＤＯ２枯渇による低下した腫瘍成長をＷＮＴ依存性ＢＲＣＡ腫瘍において明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２のｓｈＲＮＡノックダウン効率をｉｓｈＴＤＯ２ ４Ｔ１細胞株において明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲを示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２枯渇による低下した腫瘍成長をＷＮＴ依存性ＢＲＣＡ腫瘍において明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ４Ｔ１細胞（２×１０４細胞／注射）を乳房脂肪パッドに同所的に注射することによって生じる乳房腫瘍の代表的な画像をｄｏｘ処理の有無とともに示す。 ＴＤＯ２枯渇による低下した腫瘍成長をＷＮＴ依存性ＢＲＣＡ腫瘍において明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ４Ｔ１細胞（２×１０４細胞／注射）を乳房脂肪パッドに同所的に注射することによって生じる乳房腫瘍の測定重量をｄｏｘ処理の有無とともに示す。ｎ＝６／群。＊＊＊Ｐ＜０．００１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２枯渇による低下した腫瘍成長をＷＮＴ依存性ＢＲＣＡ腫瘍において明らかにする研究からの結果を示す。図Ｓ３Ｂにおけるサンプルから生じる腫瘍組織におけるＫｉ６７およびカスパーゼ－３のＩＨＣを示す。スケールバー：１００μｍ。
ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。代わりに発現した遺伝子とのトリプトファン代謝および生体異物代謝のＧＳＥＡ相関をＴＤＯ２枯渇ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞において示す。正規化された強化スコア（ＮＥＳ）および名目上のＰ値が示される。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＣＧＡ ＣＯＡＤデータベース（ｎ＝２８６）におけるＡｈＲ発現およびＣＹＰ１Ｂ１発現に対するＴＤＯ２発現の正の相関を示す。Ｐ値およびＲ二乗値が示される。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。ＡＰＣｍｉｎマウス由来のポリープおよびｉＫＡＰマウスモデル由来の腫瘍のＩＨＣ分析が、正常な結腸組織と比較して、増大したＡｈＲを示したことを示す。三連での研究の代表的画像が示される。スケールバー：１００μｍ。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株とインキュベーションされた培養培地に存在するキヌレニン（ｋｙｎ）についてのＥＬＩＳＡアッセイからの結果を示す。ｎ＝４の生物学的反復。＊＊Ｐ＜０．０１。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２ノックダウンがＡｈＲ下流側の標的遺伝子の発現をＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株において低下させたことを明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲを示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。Ｄｏｘ単独の後、Ｄｏｘ／Ｋｙｎ同時処理の後、およびｓｈＡｈＲ発現の後におけるｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株のコロニー形成アッセイの代表的画像を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。６８０Ｃ９１単独の後、および６８０Ｃ９１／Ｋｙｎ同時処理の後におけるＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株のコロニー形成アッセイからの代表的画像を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。６８０Ｃ９１単独および６８０Ｃ９１／Ｋｙｎにより処理されるＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞溶解物およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞溶解物における切断型カスパーゼ－３についての免疫ブロットを示す。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。６８０Ｃ９１単独および６８０Ｃ９１／Ｋｙｎにより処理されるｉＫＡＰ細胞溶解物における切断型カスパーゼ－３についての免疫ブロットを示す。 ＴＤＯ２によるアップレギュレーションされたキヌレニン経路がＡｈＲシグナル伝達をＡＰＣ変異型ＣＲＣ細胞において活性化することを明らかにする研究からの結果を示す。ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（２×１０５個の細胞）ならびに２つのｓｈＡｈＲ（＃１および＃２）ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（２×１０５個の細胞）が同所移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存曲線を示す。Ｄｏｘ食物が、ＴＤＯ２ノックダウンをインビボで誘導するために同所性注射後５日目に適用された（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ、ｎ＝７；Ｄｏｘ、ｎ＝８；ｓｈＡｈＲ ＃１、＃２、ｎ＝７）。＊＊＊Ｐ＜０．００１。両側ｔ検定。
ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞においてＡｈＲシグナル伝達を介して細胞の生存および成長を調節することを明らかにする研究からの結果を示す。ＡｈＲ、ＣＹＰ１Ｂ１およびＣＹＰ１Ａ１の低下した発現をｓｈＴＤＯ２ ＤＬＤ－１細胞において明らかにするＲＴ－ｑＰＣＲを示す。ｎ＝３の生物学的反復。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＴＤＯ２がＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞においてＡｈＲシグナル伝達を介して細胞の生存および成長を調節することを明らかにする研究からの結果を示す。図４Ｊにおけるサンプルから生じる腫瘍組織におけるＫｉ６７およびカスパーゼ－３のＩＨＣを示す。スケールバー：１００μｍ。
ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株のＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（無ｄｏｘ対４８時間ｄｏｘ、ｎ＝３）と、ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株により確立される異種移植片腫瘍のマイクロアレイデータセット（無ｄｏｘ対ｄｏｘ処理、ｎ＝３）との間で重複する遺伝子に関するＧＳＥＡ分析（Ｈａｌｌｍａｒｋ遺伝子セット）を示す。ＡＰＣ－ＫＯ細胞においてアップレギュレーションされる遺伝子のみを分析した。青色バーは免疫応答関連経路を示している。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。代わりに発現した遺伝子とのＴＮＦＡシグナル伝達および炎症応答のＧＳＥＡ相関をＴＤＯ２枯渇のＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞において示す。正規化された強化スコア（ＮＥＳ）および名目上のＰ値が示される。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＲＣ同所性のｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８腫瘍およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８腫瘍からのＣｙＴＯＦによって評価されるＦ４／８０陽性免疫細胞およびＣＤ２０６陽性免疫細胞のｖｉＳＮＥ分析を示す。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。図９Ｃに示される腫瘍におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋）およびＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋）の定量化を示す。ＣｙＴＯＦデータ、ＦｌｏｗＪｏによって分析。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＲＣ同所性のｉｓｈＴＤＯ２ ＣＴ２６腫瘍からのＣｙＴＯＦによって評価されるＦ４／８０陽性免疫細胞およびＣＤ２０６陽性免疫細胞のｖｉＳＮＥ分析を示す。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＣＴ２６細胞株により確立される腫瘍におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋）およびＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋）の定量化を示す。ＣｙＴＯＦデータがＦｌｏｗＪｏによって分析された。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＣＴ２６細胞株（２×１０５個の細胞）が同所移植されたＢａｌｂ／Ｃマウスの生存曲線を示す。クロドロナートリポソームまたは対照のエンカプソームリポソームが同所性注射後２日目に、かつ週に３回、腹腔内に与えられた（１００μｌ）（エンカプソーム、ｎ＝６；クロドロナート、ｎ＝９）。＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２のｍＲＮＡ発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）患者（ｎ＝４３３）において総マクロファージマーカーおよびＭ２マクロファージマーカーの発現と有意に相関することを示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。核β－カテニンが陰性のヒトＣＲＣ腫瘍（ｎ＝４２）および陽性のヒトＣＲＣ腫瘍（ｎ＝５０）におけるＣＤ１６３についてのＩＨＣ染色を描写するものを示す。スケールバー：Ｘ１０（２００μｍ）およびＸ４０（５０μｍ）。 ＴＤＯ２－ＡｈＲが、マクロファージ浸潤を調節することによって腫瘍成長を媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。核β－カテニンを有するＣＲＣ腫瘍がより高いＣＤ１６３発現を示したことを示す。ピアソン相関係数＝５．０７４、Ｐ＝０．０２４３。カイ二乗検定。
ＴＤＯ２－ＡｈＲ軸が解糖をＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。変化した遺伝子発現との解糖のＧＳＥＡ相関をＴＤＯ２枯渇のＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞において示す。正規化された強化スコア（ＮＥＳ）および名目上のＰ値が示される。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ軸が解糖をＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ＳＴＦ－３１により用量依存的様式で２４時間処理されるＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞の細胞生存率アッセイからの結果を示す。群あたり６つの反復。＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ軸が解糖をＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｄｏｘ処理の有無によるｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株を用いる２－ＤＧ取り込みアッセイの結果を示す。ｎ＝３の生物学的反復。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ軸が解糖をＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｄｏｘ処理の有無によるｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株からの条件培地を用いる分泌された乳酸の測定を示す。ｎ＝３の生物学的反復。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ軸が解糖をＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株における解糖経路遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３の生物学的反復。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ軸が解糖をＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｓｈＣｏｎｔｒｏｌまたはｓｈＡｈＲを発現するＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株における解糖経路遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３の生物学的反復。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ軸が解糖をＡＰＣ変異ＣＲＣ細胞において媒介することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株溶解物における主要な解糖代謝産物の濃度における変化を示す。赤色バーは、ｄｏｘ処理を伴わない細胞を示しており、緑色バーは、ｄｏｘ処理された細胞を示している。ｎ＝５／生物学的反復。
ＴＤＯ２ノックダウンによる低下したマクロファージ浸潤をＣＲＣ同所性モデルおよびＢＲＣＡ同所性モデルにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株により確立されるＣＲＣ同所性腫瘍組織におけるＦ４／８０およびＣＤ１６３についてのＩＨＣ染色を描写するものを示す。スケールバー：１００μｍ。 ＴＤＯ２ノックダウンによる低下したマクロファージ浸潤をＣＲＣ同所性モデルおよびＢＲＣＡ同所性モデルにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＣＴ２６細胞により確立されるＣＲＣ同所性腫瘍組織におけるＦ４／８０およびＣＤ１６３についてのＩＨＣ染色を描写するものを示す。スケールバー：１００μｍ。 ＴＤＯ２ノックダウンによる低下したマクロファージ浸潤をＣＲＣ同所性モデルおよびＢＲＣＡ同所性モデルにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ４Ｔ１細胞により確立されるＣＲＣ同所性腫瘍組織におけるＦ４／８０およびＣＤ１６３についてのＩＨＣ染色を描写するものを示す。スケールバー：１００μｍ。 ＴＤＯ２ノックダウンによる低下したマクロファージ浸潤をＣＲＣ同所性モデルおよびＢＲＣＡ同所性モデルにおいて明らかにする研究からの結果を示す。ＴＤＯ２のｍＲＮＡ発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤ＋ＲＥＡＤ、暫定的）患者（ｎ＝４３３）において調節性Ｔ細胞マーカーおよびＭＤＳＣマーカーの発現と有意に相関することを示す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸がマクロファージ動員をＡＰＣ変異ＣＲＣ腫瘍において調節することを明らかにする研究からの結果を示す。ＲＮＡ－ｓｅｑ分析において特定されるサイトカイン遺伝子の発現、ならびにｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株を使用してＲＴ－ｑＰＣＲによって確認されるＴＤＯ２を示す。ｎ＝３の生物学的反復。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。二元配置ＡＮＯＶＡ分析。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸がマクロファージ動員をＡＰＣ変異ＣＲＣ腫瘍において調節することを明らかにする研究からの結果を示す。ブランク、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７およびＣＳＦ３を発現するｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株により確立される腫瘍の体積を示す。Ｄｏｘ食物が、ＴＤＯ２ノックダウンをインビボで誘導するために同所性注射後５日目に適用された。ｎ＝４／群。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸がマクロファージ動員をＡＰＣ変異ＣＲＣ腫瘍において調節することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＲＣ同所性ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８腫瘍およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８腫瘍、ならびにＴＤＯ２枯渇を伴うＣＸＣＬ５－ＯＲＦ発現ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８からのＣｙＴＯＦによって評価されるＦ４／８０陽性免疫細胞およびＣＤ２０６陽性免疫細胞のｖｉＳＮＥ分析を示す。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸がマクロファージ動員をＡＰＣ変異ＣＲＣ腫瘍において調節することを明らかにする研究からの結果を示す。図１２Ｃに示される腫瘍におけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋）の定量化を示す。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸がマクロファージ動員をＡＰＣ変異ＣＲＣ腫瘍において調節することを明らかにする研究からの結果を示す。図１２Ｃに示される腫瘍におけるＭ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋）の定量化を示す。ＦｌｏｗＪｏによって分析されるＣｙＴＯＦデータ。データは平均±ｓ．ｄ．を表す。ｎ＝３／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸がマクロファージ動員をＡＰＣ変異ＣＲＣ腫瘍において調節することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８条件培地およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８条件培地とともにトランスウエルアッセイにおいて培養される遊走Ｒａｗ２６４．７の代表的画像を示す。組換えＣＸＣＬ５タンパク質（５０ｎｇ）およびＳＸ－６８２（１μＭ）を採取された条件培地に３６時間にわたって加えた。スケールバー：１００μｍ。ｎ＝３の生物学的反復。定量化が下段パネルに示される。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。 ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸がマクロファージ動員をＡＰＣ変異ＣＲＣ腫瘍において調節することを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株およびｉｓｈＴＤＯ２／ＣＸＣＬ５－ＯＲＦ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（５×１０５個の細胞）が同所移植されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの生存曲線を示す。クロドロナートリポソームまたは対照のエンカプソームリポソームが同所性注射後２日目に、かつ週に３回、腹腔内に与えられた（１００μｌ）。（エンカプソーム群およびクロドロナート群、ｎ＝６；Ｄｏｘ群およびＤｏｘ＋クロドロナート群、ｎ＝７；Ｄｏｘ＋ＣＸＣＬ５－ＯＲＦ＋エンカプソーム、ｎ＝５；Ｄｏｘ＋ＣＸＣＬ５－ＯＲＦ＋クロドロナート、ｎ＝６）。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。両側ｔ検定。
ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ｄｏｘ処理の有無によるｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞からの馴化培地のサイトカインアレイを示す。赤色ボックス（１～６として表示）は、ＴＤＯ２ノックダウン後に有意に低下したサイトカインを示している。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ｓｈＣｏｎｔｒｏｌまたはｓｈＴＤＯ２を発現するＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株からの条件培地において培養される遊走ＢＭＤＭを描写するものを示す。ｎ＝３の生物学的反復。スケールバー：５０μｍ。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＸＣＬ５遺伝子のプロモーターでのＡｈＲについての結合ピークを明らかにする、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞におけるＣｈＩＰ－ｓｅｑを示す。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株におけるＡｈＲノックダウン後のサイトカインの発現についてのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞からの馴化培地と３０時間インキュベーションされるＲａｗ２６４．７細胞におけるＭ２マクロファージシグナチャー遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３の生物学的反復。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＳＦ１（５０ｎｇ）、ＣＸＣＬ５（５０ｎｇ）およびＫｙｎ（１ｍＭ）により２４時間処理されるＢＭＤＭにおけるＭ２マクロファージシグナチャー遺伝子（Ａｒｇ１およびＹＭ１）およびＭ１マクロファージシグナチャー遺伝子（ｉＮＯＳ）のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３の生物学的反復。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株およびｉｓｈＴＤＯ２／ＣＸＣＬ５－ＯＲＦ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株により確立されるＣＲＣ同所性腫瘍組織におけるＦ４／８０およびＣＤ１６３についてのＩＨＣ染色を描写するものを示す。スケールバー：１００μｍ。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ｓｈＣＸＣＬ５を発現するｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（５×１０５個の細胞）が同所移植されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの生存曲線を示す。（ｉｓＴＤＯ２群およびｉｓＴＤＯ２／ｓｈＣＸＣＬ５（＃２）群、ｎ＝７；ｉｓＴＤＯ２／ｓｈＣＸＣＬ５（＃３）、ｎ＝８）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。 ＣＸＣＬ５がＡＰＣ変異型ＣＲＣにおいてＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によって調節され、マクロファージ動員に関わることを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株（５×１０５個の細胞）が同所移植されたＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの生存曲線を示す。（ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ群およびｓｈＣＸＣＬ５（＃２）群、ｎ＝７；ｓｈＣＸＣＬ５（＃３）、ｎ＝８）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。
ＣＸＣＬ５発現がＣＲＣおよびＢＲＣＡにおいてマクロファージ集団およびトリプトファン代謝と相関することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＸＣＬ５が高い腫瘍とのマクロファージ集団のＧＳＥＡ相関をＴＣＧＡ ＣＲＣデータベースにおいて示す。 ＣＸＣＬ５発現がＣＲＣおよびＢＲＣＡにおいてマクロファージ集団およびトリプトファン代謝と相関することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＸＣＬ５が高い腫瘍とのマクロファージ集団のＧＳＥＡ相関をＢＲＣＡデータベースにおいて示す。ＮＥＳおよび名目上のＰ値が示される。 ＣＸＣＬ５発現がＣＲＣおよびＢＲＣＡにおいてマクロファージ集団およびトリプトファン代謝と相関することを明らかにする研究からの結果を示す。ＴＣＧＡ ＣＲＣ腫瘍（ｎ＝２５４）においてＣＸＣＬ５発現と正に相関する免疫集団のリストを示す。 ＣＸＣＬ５発現がＣＲＣおよびＢＲＣＡにおいてマクロファージ集団およびトリプトファン代謝と相関することを明らかにする研究からの結果を示す。ＢＲＣＡ腫瘍（ｎ＝７３０）においてＣＸＣＬ５発現と正に相関する免疫集団のリストを示す。強調されたバーはマクロファージを示している。ＮＥＳ値が示される。 ＣＸＣＬ５発現がＣＲＣおよびＢＲＣＡにおいてマクロファージ集団およびトリプトファン代謝と相関することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＸＣＬ５が高いＴＣＧＡ ＣＲＣ腫瘍とのトリプトファン代謝および生体異物代謝のＧＳＥＡ相関を示す。正規化された強化スコア（ＮＥＳ）および名目上のＰ値が示される。 ＣＸＣＬ５発現がＣＲＣおよびＢＲＣＡにおいてマクロファージ集団およびトリプトファン代謝と相関することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＸＣＬ５発現および相関する上位６つのトリプトファン代謝関連遺伝子（ＴＤＯ２、ＫＹＮＵ、ＫＭＯ、ＩＤＯ１、ＩＬ４Ｉ１およびＡＯＸ１）の発現に基づくクラスター化されたＴＣＧＡ ＣＲＣ患者サンプルの代表的画像をランク付け順序で示す（高ＣＸＣＬ５、ｎ＝１２７；低ＣＸＣＬ５、ｎ＝１２７）。 ＣＸＣＬ５発現がＣＲＣおよびＢＲＣＡにおいてマクロファージ集団およびトリプトファン代謝と相関することを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＸＣＬ５が高いＴＣＧＡ ＢＲＣＡ腫瘍とのトリプトファン代謝および生体異物代謝のＧＳＥＡ相関を示す。正規化された強化スコア（ＮＥＳ）および名目上のＰ値が示される。
マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。ｄｏｘ処理の前後でのｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株からの溶解物のマウスＲＴＫホスホアレイを示す。赤色ボックスはＡｘｌを示している。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。Ｒ４２８処理（０．２μＭ、２４時間）の後でのＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞におけるＡｘｌおよびホスホ－Ａｘｌについての免疫ブロットを示す。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。組換えマウスＧａｓ６タンパク質（ｒｍＧＡＳ ６）を２４時間補充した後でのＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞におけるＡｘｌおよびホスホ－Ａｘｌについての免疫ブロットを示す。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。Ｇａｓ６（２５ｎｇ）のみによる処理およびＲ４２８（１μＭ）による処理が３６時間行われるＬＳ１８０細胞株およびＨＴ－２９細胞株のコロニー形成アッセイを描写するものを示す。ｎ＝３の生物学的反復。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。０．５μＭのＲ４２８により用量依存的様式で４８時間処理されるＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞の細胞生存率アッセイからの結果を示す。群あたり６つの反復。両側ｔ検定。＊Ｐ＜０．０５。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射することによって確立されるＣＲＣ同所性腫瘍におけるリン酸化Ａｘｌ（ＲＦＰ）の免疫蛍光染色を示す。上皮細胞がＥｐＣａｍにより染色され、ＧＦＰによって示される。６３倍の倍率。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。ｉｓｈＴＤＯ２ ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株からの条件培地において培養されるＢＭＤＭにおけるＧａｓ６発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３の生物学的反復。ｎ．ｓ．Ｐ＞０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＳＦ１（５０ｎｇ）、Ｋｙｎ（１ｍＭ）、ＣＸＣＬ５（５０ｎｇ）およびＧａｓ６（２５ｎｇ）により２４時間処理されるＢＭＤＭにおけるＧａｓ６発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。ｎ＝３の生物学的反復。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。両側ｔ検定。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲがＲａｗ２６４．７におけるＧＡＳ６ ｓｈＲＮＡノックダウン効率を示すことを示す。ｎ＝３の生物学的複製。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。ＣＴ２６細胞（１×１０５個の細胞）およびマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７（１×１０５個の細胞）のｓｈＣｏｎｔｒｏｌまたはｓｈＧＡＳ６との同所性同時注射後２０日目におけるＢａｌＢ／ＣＪマウスのインビボ生物発光に基づく代表的画像を示す。終点での の総放射束測定。＊＊Ｐ＜０．０１、両側ｔ検定。 マクロファージによって分泌されるＧａｓ６が腫瘍細胞表面のＡｘｌに結合し、腫瘍成長を促進させることを明らかにする研究からの結果を示す。１００ｎｇのＣＸＣＬ５により注射前に４８時間にわたって前処理されるＣＴ２６細胞（１×１０５個の細胞）およびマクロファージ細胞株Ｒａｗ２６４．７（１×１０５個の細胞）の同所性同時注射後２０日目におけるＢａｌＢ／ＣＪマウスのインビボ生物発光に基づく代表的画像を示す。腫瘍の総放射束測定が終点で行われた。＊＊Ｐ＜０．０１、両側ｔ検定。
ＡＰＣ欠損ＣＲＣ細胞におけるＴＤＯ２－Ｋｙｎ－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸の活性化およびＴＡＭの動員についての作業モデルの概略図を示す。
腫瘍抑制因子である大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）の不活性化が、散発性結腸直腸がん（ＣＲＣ）の大部分（約９０％）の発症のための重要な開始事象である。ＡＰＣ喪失がまた、多くの他のガンタイプにわたって頻繁に生じている。ＡＰＣシグナル伝達カスケードが依然としてガン治療のための捉えどころのない標的である。合成上必須であるという概念を使用して、トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＴＤＯ２）が、ＡＰＣ欠損がんのための合成上必須（ＳＥ）遺伝子として本明細書中では特定される。機構的には、ＴＤＯ２－Ｋｙｎ－ＡｈＲ軸の活性化により、解糖の駆動、ならびに細胞の増殖および成長の促進がＡＰＣ欠損ＣＲＣ細胞において生じ、同様にまた、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を動員するＣＸＣＬ５のアップレギュレーションが生じる。これらのＴＡＭは免疫抑制性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を促進させ、同様にまた、ＡＸＬをがん細胞において活性化するＧＡＳ６を分泌することを介してがん細胞の生存を支援する。したがって、ＡＰＣ欠損は、ＣＲＣ ＴＭＥにおけるがん細胞と浸潤性ＴＡＭとの間での共生的関係を確立するＴＤＯ２駆動回路をもたらしている。本明細書中には、いくつかの実施形態において、ＡＰＣ欠損腫瘍を処置するためにＴＤＯ２および下流側エフェクター（例えば、サイトカイン）を標的とするための方法および組成物が開示される。
Ｉ．ＴＤＯ２核酸およびＴＤＯ２ポリペプチド
トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＴＤＯ２）はこの技術分野では知られており、本明細書中に記載される下記のＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列およびタンパク質配列によって例示される。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２は、酵素委員会（ＥＣ）分類番号１．１３．１１．１１を有する酵素である。
例えば、ＴＤＯ２遺伝子がヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のトリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００４．１２）によって例示される場合がある。
別の一例において、ＴＤＯ２のｍＲＮＡがヒトのトリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５６５１．４）によって例示される。
別の一例において、ＴＤＯ２タンパク質がヒトのトリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５６４２．１）によって例示される（下記参照）：
ＭＳＧＣＰＦＬＧＮＮＦＧＹＴＦＫＫＬＰＶＥＧＳＥＥＤＫＳＱＴＧＶＮＲＡＳＫＧＧＬＩＹＧＮＹＬＨＬＥＫＶＬＮＡＱＥＬＱＳＥＴＫＧＮＫＩＨＤＥＨＬＦＩＩＴＨＱＡＹＥＬＷＦＫＱＩＬＷＥＬＤＳＶＲＥＩＦＱＮＧＨＶＲＤＥＲＮＭＬＫＶＶＳＲＭＨＲＶＳＶＩＬＫＬＬＶＱＱＦＳＩＬＥＴＭＴＡＬＤＦＮＤＦＲＥＹＬＳＰＡＳＧＦＱＳＬＱＦＲＬＬＥＮＫＩＧＶＬＱＮＭＲＶＰＹＮＲＲＨＹＲＤＮＦＫＧＥＥＮＥＬＬＬＫＳＥＱＥＫＴＬＬＥＬＶＥＡＷＬＥＲＴＰＧＬＥＰＨＧＦＮＦＷＧＫＬＥＫＮＩＴＲＧＬＥＥＥＦＩＲＩＱＡＫＥＥＳＥＥＫＥＥＱＶＡＥＦＱＫＱＫＥＶＬＬＳＬＦＤＥＫＲＨＥＨＬＬＳＫＧＥＲＲＬＳＹＲＡＬＱＧＡＬＭＩＹＦＹＲＥＥＰＲＦＱＶＰＦＱＬＬＴＳＬＭＤＩＤＳＬＭＴＫＷＲＹＮＨＶＣＭＶＨＲＭＬＧＳＫＡＧＴＧＧＳＳＧＹＨＹＬＲＳＴＶＳＤＲＹＫＶＦＶＤＬＦＮＬＳＴＹＬＩＰＲＨＷＩＰＫＭＮＰＴＩＨＫＦＬＹＴＡＥＹＣＤＳＳＹＦＳＳＤＥＳＤ（配列番号１）。
いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２ポリペプチドまたはＴＤＯ２核酸はヒトＴＤＯ２ポリペプチドまたはヒトＴＤＯ２核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２ポリペプチドまたはＴＤＯ２核酸は非ヒト型である。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２ポリペプチドまたはＴＤＯ２核酸は、マウス、ウマ、イヌ、ウサギまたはヤギに由来する。
ＩＩ．阻害剤
本開示の様々な局面には、ＴＤＯ２の阻害剤、および／またはＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤が含まれる。
いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物はＴＤＯ２の阻害剤を含む。ＴＤＯ２の阻害剤は、ＴＤＯ２の発現および／または活性を阻害することができる分子をどのような分子であれ表し得る。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤が、ＴＤＯ２の酵素活性を阻害するために役立つことがある小分子阻害剤である。小分子のＴＤＯ２阻害剤の例には、ＰＦ０６８４５１０２／ＥＯＳ２００８０９、６８０Ｃ９１、ＬＭ１０、ＨＴＩ－１０９０、ＤＮ１４０６１３１、ＲＧ７００９９、ＥＰＬ－１４１０、ＣＢ５４８、ＣＭＧ０１７、およびそれらの誘導体が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤が二重のＴＤＯ２／ＩＤＯ１阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤が二重のＴＤＯ２／ＩＤＯ２阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤が選択的ＴＤＯ２阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤が、ＴＤＯ２発現を細胞において阻害することができる核酸である。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤が、ＴＤＯ２ ｍＲＮＡを標的とし、その翻訳を阻害するように設計される低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノまたは類似核酸である。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤は、ＴＤＯ２タンパク質（配列番号１）をコードするＴＤＯ２メッセンジャーＲＮＡの全体または一部に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤が、抗体、抗体様分子、または他のＴＤＯ２結合タンパク質である。
いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤を含む。ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインにより、ＴＤＯ２の酵素活性の結果として発現が増大するサイトカインが表される場合がある。ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインには、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、ＣＳＦ３、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２およびＣＸＣＬ１が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、開示された方法は、ＣＸＣＬ５の阻害剤を与えることを含む。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤が、サイトカインの発現を細胞において阻害することができる核酸である。いくつかの実施形態において、そのような阻害剤は、サイトカインｍＲＮＡを標的とし、その翻訳を阻害するように設計されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは類似核酸である。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ阻害剤は、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカイン（例えば、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、ＣＳＦ３、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２またはＣＸＣＬ１）をコードするメッセンジャーＲＮＡの全体または一部に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤が、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインに特異的に結合することができる抗体、抗体様分子または他の結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、開示された方法は、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１またはＣＸＣＬ２に特異的に結合することができる抗体を与えることを含む。いくつかの実施形態において、開示された方法は、ＣＸＣＬ５に特異的に結合することができる抗体を与えることを含む。
Ａ．阻害性オリゴヌクレオチド
いくつかの局面において、本開示は、ＴＤＯ２の遺伝子発現を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドに関連する。阻害性オリゴヌクレオチドの例には、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムが含まれるが、これらに限定されない。阻害性オリゴヌクレオチドにより、遺伝子の転写が細胞において阻害される場合があり、または遺伝子転写物の翻訳が細胞において妨げられる場合がある。阻害性オリゴヌクレオチド酸は１６個～１０００個のヌクレオチドの長さである場合があり、ある特定の実施形態においては１８個～１００個のヌクレオチドの長さである場合がある。オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個または９０個（あるいはどのような範囲であれそれらにおいて導かれ得る範囲）のヌクレオチドを有する場合があり、あるいは多くても２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個または９０個（あるいはどのような範囲であれそれらにおいて導かれ得る範囲）のヌクレオチドを有する場合がある。オリゴヌクレオチドは、阻害性ＲＮＡをコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡである場合がある。
本明細書中で使用される場合、「単離された（される）」は、ヒトの介入により天然の状態から変えられた（変えられる）、または取り出された（取り出される）ことを意味する。例えば、生きている動物において天然に存在するｓｉＲＮＡは「単離され」ておらず、しかし、合成ｓｉＲＮＡ、あるいはその天然状態の共存物質から部分的または完全に分離されるｓｉＲＮＡは「単離され」ている。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形態で存在することができ、または非生来的な環境（例えば、当該ｓｉＲＮＡが送達されている細胞など）において存在することができる。
様々な阻害性オリゴヌクレオチドがこの技術分野では広く知られている。例えば、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが米国特許第６，５０６，５５９号および同第６，５７３，０９９号に、同様にまた、米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００４／０２６５８３９号、同第２００２／０１６８７０７号、同第２００３／０１５９１６１号および同第２００４／００６４８４２号に記載されており、これらのすべてがそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。
特に、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＴＤＯ２の発現を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％、あるいはどのような範囲または値であれ前記の間における範囲または値だけ低下させることができる場合がある。
さらなる実施形態において、ＴＤＯ２阻害剤である合成オリゴヌクレオチドが開示される。阻害剤は、長さにおいて１７個～２５個のヌクレオチドである場合があり、成熟型ＴＤＯ２ ｍＲＮＡの５’→３’配列に対して少なくとも９０％相補的である５’→３’配列を含む。ある特定の実施形態において、阻害剤分子は、長さにおいて１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個もしくは２５個のヌクレオチド、またはどのような範囲であれそれらにおいて導かれ得る範囲である。そのうえ、阻害剤分子は、成熟型ＴＤＯ２ ｍＲＮＡ（特に成熟型の天然に存在するｍＲＮＡ）の５’→３’配列に対する相補性が、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％である、あるいは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％である配列（５’から３’）を有する。
いくつかの実施形態において、阻害性オリゴヌクレオチドは類似体であり、様々な修飾、特にヌクレアーゼ抵抗性を増大させる修飾、結合親和性を改善する修飾、および／または結合特異性を改善する修飾を含む場合がある。例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖部分が炭素環式部分によって置き換えられるとき、糖部分はもはや糖ではない。そのうえ、他の置換、例えば、糖間のホスホジエステル連結に代わる置換などが行われるとき、生じる物質はもはや真の種ではない。すべてのそのような化合物が類似体であるとみなされる。本明細書を通して、核酸種の糖部分に対する言及は、真の糖、または野生型核酸の糖の構造的位置を取る種をどちらも示すように理解されなければならない。そのうえ、糖間の連結に対する言及は、糖部分または糖類似体部分を野生型核酸の様式でつなぐために役立つ部分を含むように解釈されなければならない。
ＩＩＩ．治療方法
本開示の組成物は、インビボ投与、インビトロ投与またはエクスビボ投与のために使用される場合がある。組成物の投与経路は、例えば、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、限局的投与、局所投与および腹腔内投与である場合がある。
いくつかの実施形態において、開示された方法は、がんを処置するための方法に関する。がんは、固形腫瘍、転移性がんまたは非転移性がんである場合がある。ある特定の実施形態において、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、泌尿器、子宮頸部、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮に生じる場合がある。いくつかの実施形態において、がんは結腸に生じる。いくつかの実施形態において、がんは直腸に生じる。
がんは具体的には下記の組織学的タイプの１つまたは複数のがんである場合があり、だが、それらに限定されない：未分化がん、膀胱、血液、骨、脳、乳房、泌尿器、食道、胸腺腫、十二指腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、軟部組織、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、子宮、胸腺、皮膚扁平細胞、非結腸直腸の胃腸、結腸直腸、メラノーマ、メルケル細胞、腎細胞、子宮頸部、肝細胞、尿路上皮、非小細胞肺、頭頸部、子宮内膜、食道胃、小細胞肺中皮腫、卵巣、食道胃、神経膠芽細胞腫、副腎皮質、ブドウ膜、膵臓、生殖細胞のがん腫、巨細胞がんおよび紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛母がん（ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；胆管がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管がんとの混合型；小柱状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープにおける腺がん；腺がん、家族性大腸ポリポーシス；固形がん；鰓肺胞（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ－ａｌｖｅｏｌａｒ）腺がん；乳頭状腺がん；嫌色素性がん；好酸性（ａｃｉｄｏｐｈｉｌ）がん；好酸性（ｏｘｙｐｈｉｌｉｃ）腺がん；好塩基性がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭状濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；類内膜がん（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性乳管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性乳がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；胸腺腫；莢膜細胞腫；アンドロブラストーマ；セルトリ細胞がん；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；肉腫；間葉系（例えば、線維肉腫；線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；がん肉腫；未分化胚細胞腫；胎児性がん；絨毛がん；中腎腫；血管肉腫；カポジ肉腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮線維肉腫；脊索腫；上衣細胞腫；星状膠細胞腫；原形質性星状膠細胞腫；原線維性星状膠細胞腫；星状膠芽細胞腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；神経線維肉腫；傍肉芽腫）；または造血系（例えば、多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリー細胞白血病）。
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、がんを処置することを含み、この場合、がんは、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、頭頸部扁平上皮がんまたは肉腫である。いくつかの実施形態において、がんは結腸直腸がん（ＣＲＣ）である。いくつかの実施形態において、がんは、構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達を有するがんである。いくつかの実施形態において、がんはＡＰＣ欠損がんである。いくつかの実施形態において、がんはＡＰＣ欠損ＣＲＣである。
本明細書中で使用される場合、「ＡＰＣ欠損がん」により、正常な細胞または非がん性細胞と比較して、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子またはＡＰＣタンパク質の低下した発現および／または活性を有するがんが表される。一例において、ＡＰＣ欠損がんが、変異をＡＰＣ遺伝子またはＡＰＣ遺伝子の調節領域に有し、変異によりＡＰＣの発現が妨げられるがんである。別の一例において、ＡＰＣ欠損がんが、変異をＡＰＣ遺伝子に有し、変異により、ＡＰＣタンパク質が正常に機能することが妨げられる（例えば、タンパク質のミスフォールディングが引き起こされる）がんである。別の一例において、ＡＰＣ欠損がんが、ＡＰＣ遺伝子発現のエピジェネティック抑制を有するがんである。
本開示のある特定の局面が、ＡＰＣ欠損がんを有する対象を処置するための治療方法に関する。いくつかの実施形態において、開示された方法は、ＡＰＣ欠損（例えば、変異、エピジェネティック抑制など）を処置前に、例えば、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応または他の好適な分子技術により、対象からのがん細胞において検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＡＰＣ欠損を伴うがんを有することが知られている対象を処置することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＡＰＣ欠損を伴うがんを有することが推定される対象を処置することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、結腸直腸がんを有する対象を処置する方法であって、結腸直腸がんが、ＡＰＣ欠損を有すると推定される、方法が開示される。いくつかの実施形態において、開示された方法は、ＡＰＣ欠損を対象からのがん細胞において検出する工程を含まない。
いくつかの実施形態において、方法は、ＡＰＣ欠損を対象からの健常な（例えば、非がん性の）細胞において検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＡＰＣ欠損を有することが知られている対象を処置することを含む。例えば、方法は、家家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）を有する対象を診断すること、および／またはＦＡＰを有することが知られている対象を処置することを含む場合がある。いくつかの実施形態において、開示された方法は、ＡＰＣ欠損を対象からの健常な細胞において検出する工程を含まない。
ＩＶ．免疫療法
いくつかの実施形態において、開示された方法は、がん免疫療法を与えることを含む。がん免疫療法（これは時には免疫腫瘍学と呼ばれており、ＩＯと略される）は、がんを処置するために免疫系を使用することである。免疫療法は、能動的、受動的、または複合型（能動的および受動的）として分類することができる。これらの取り組みでは、がん細胞が多くの場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として知られている免疫系によって検出され得る分子をその表面に有するという事実が利用される；そのような分子は多くの場合、タンパク質または他の高分子（例えば、炭水化物）である。能動的免疫療法は、免疫系に、ＴＡＡを標的とすることによって腫瘍細胞を攻撃するように命じる。受動的免疫療法では、既存の抗腫瘍応答が増強され、モノクローナル抗体、リンパ球およびサイトカインの使用が含まれる。ある特定の免疫療法がこの技術分野では知られており、いくつかが以下に記載される。
１．共刺激分子の活性化
いくつかの実施形態において、免疫療法は、共刺激分子のアゴニストを含んでなる。いくつかの実施形態では、アゴニストは、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７；ＴＮＦＲＳＦ９）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０ＬＧ）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、及びこれらの組み合わせのアゴニストからなる。アゴニストには、アゴニスト抗体、ポリペプチド、化合物、および核酸が含まれる。
Ａ．チェックポイント阻害剤及び併用治療
本開示の実施形態は、以下にさらに記載される免疫チェックポイント阻害剤の投与を含むことができる。
１．ＰＤ－１、ＰＤＬ１、及びＰＤＬ２阻害剤
ＰＤ－１は、Ｔ細胞が感染または腫瘍に遭遇する腫瘍微小環境において作用し得る。活性化されたＴ細胞はＰＤ－１をアップレギュレートし、周辺組織でそれを発現し続ける。ＩＦＮ－γのようなサイトカインは、上皮細胞および腫瘍細胞上のＰＤＬ１の発現を誘導する。ＰＤＬ２はマクロファージや樹状細胞で発現している。ＰＤ－１の主な役割は、末梢におけるエフェクターＴ細胞の活性を制限し、免疫反応中の組織への過剰な損傷を防止することである。本開示の阻害剤は、ＰＤ－１及び／又はＰＤＬ１活性の１つ以上の機能を遮断し得る。
「ＰＤ－１」の代替名には、ＣＤ２７９及びＳＬＥＢ２が含まれる。ＰＤＬ１」の代替名には、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－４、ＣＤ２７４、およびＢ７－Ｈが含まれる。ＰＤＬ２」の代替名としては、Ｂ７－ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＰＤＬ１、およびＰＤＬ２は、ヒトＰＤ－１、ＰＤＬ１、およびＰＤＬ２である。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１及び／又はＢ７－１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２阻害剤は、ＰＤＬ２とその結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。阻害剤は、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであってもよい。例示的な抗体は、米国特許第８，７３５，５５３号、第８，３５４，５０９号、及び第８，００８，４４９号に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供される方法及び組成物における使用のための他のＰＤ－１阻害剤は、米国特許出願番号ＵＳ２０１４／０２９４８９８、ＵＳ２０１４／０２２０２１、及びＵＳ２０１１／０００８３６９に記載されているような当該分野で既知であり、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。）一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びピジリズマブからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシンである）である。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤は、ＡＭＰ－ ２２４を含んでなる。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られるニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ ３４７５、ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ＳＣＨ－９００４７５としても知られている）は、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。ＣＴ－０１１、ｈＢＡＴ、またはｈＢＡＴ－１としても知られるピディリズマブは、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られるＡＭＰ－２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶型受容体である。追加のＰＤ－１阻害剤には、ＡＭＰ－５１４としても知られるＭＥＤＩ０６８０、及びＲＥＧＮ２８１０が含まれる。
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＥＤＩ４７３６としても知られるＤｕｒｖａｌｕｍａｂ、ＭＰＤＬ３２８０Ａとしても知られるアテゾリズマブ、ＭＳＢ０００１０１１８Ｃとしても知られるアベルマブ、ＭＤＸ－１１０５、ＢＭＳ－９３６５５９、又はそれらの組み合わせなどのＰＤＬ１阻害剤である。特定の態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７などのＰＤＬ２阻害剤である。
ある実施形態では、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、又はピジリズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＶＲを含んでなる。したがって、一実施形態では、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインから構成されている。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体とＰＤ－１、ＰＤＬ１、またはＰＤＬ２上の同じエピトープと結合するために競合する、および／またはＰＤ－１、ＰＤＬ１、またはＰＤＬ２に結合する。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、または９９％（またはそこに派生する任意の範囲）の可変領域アミノ酸配列の同一性を有する。
２．ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１、及びＢ７－２
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４はＴ細胞の表面に存在し、抗原提示細胞表面のＢ７－１（ＣＤ８０）またはＢ７－２（ＣＤ８６）に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞に抑制シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の共刺激タンパク質であるＣＤ２８と類似しており、両分子とも抗原提示細胞上のＢ７－１およびＢ７－２に結合する。ＣＴＬＡ－４はＴ細胞に抑制的なシグナルを伝達し、ＣＤ２８は刺激的なシグナルを伝達する。細胞内のＣＴＬＡ－４は制御性Ｔ細胞にも存在し、その機能にとって重要であると考えられる。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化は、Ｂ７分子に対する抑制性受容体であるＣＴＬＡ－４の発現を増加させることになる。 本開示の阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１、および／またはＢ７－２活性の１つまたは複数の機能をブロックし得る。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４とＢ７－１の相互作用をブロックする。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４とＢ７－２の相互作用を阻害する。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
本発明の方法における使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれに由来するＶＨおよび／またはＶＬドメイン）は、当技術分野において周知の方法を用いて生成することができる。あるいは、技術的に認識された抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例えば、以下に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体が挙げられる。ＵＳ ８，１１９，１２９，ＷＯ０１／１４４２４，ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４ （ＣＰ６７５，２０６，ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ； ｆｏｒｍｅｒｌｙ ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ），米国特許番号６，２０７，１５６；Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８；において開示された抗ＣＴＬＡ－４抗体を本書において使用することが可能である。前述の各出版物の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ－４への結合についてこれらの技術的に認識された抗体のいずれかと競合する抗体もまた、使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ－４抗体は、国際特許出願番号ＷＯ２００１／０１４４２４、ＷＯ２０００／０３７５０４、および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、これらは、全て参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の方法及び組成物におけるチェックポイント阻害剤として有用なさらなる抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られている）又はその抗原結合フラグメント及びバリアント（例えば、ＷＯ０ １／１４４２４を参照）である。）
ある実施形態では、阻害剤は、トレメリムマブ又はイピリムマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＶＲを含んでなる。したがって、一実施形態では、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにトレメリムマブまたはイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体とＰＤ－１、Ｂ７－１、またはＢ７－２上の同じエピトープと結合するために競合する、および／またはＰＤ－１、Ｂ７－１、またはＢ７－２上の同じエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、または９９％（またはそこに派生する任意の範囲）の可変領域アミノ酸配列の同一性を有する。
Ｂ．樹状細胞療法
樹状細胞療法は、樹状細胞に腫瘍抗原をリンパ球に提示させ、リンパ球を活性化し、抗原を提示する他の細胞を殺すようにプライミングすることにより、抗腫瘍反応を誘発するものである。樹状細胞は、哺乳類の免疫系における抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。樹状細胞は、哺乳類の免疫系における抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、がん治療においては、がん抗原のターゲティングを補助する。樹状細胞に基づく細胞がん治療の一例は、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔである。
樹状細胞が腫瘍抗原を提示するように誘導する方法の一つは、自己の腫瘍溶解物または短いペプチド（がん細胞上のタンパク質抗原に対応するタンパク質の小さな部分）を用いたワクチン接種によるものである。これらのペプチドは、免疫反応や抗腫瘍反応を高めるために、しばしばアジュバント（免疫原性の高い物質）と組み合わせて投与される。他のアジュバントには、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）のような樹状細胞を誘引及び／又は活性化するタンパク質又は他の化学物質が含まれる。
樹状細胞は、腫瘍細胞にＧＭ－ＣＳＦを発現させることによっても、インビボで活性化することができる。これは、ＧＭ－ＣＳＦを産生するように腫瘍細胞を遺伝子操作するか、またはＧＭ－ＣＳＦを発現するオンコリティックウイルスで腫瘍細胞を感染させることによって達成することができる。
もう一つの戦略は、患者の血液から樹状細胞を取り出し、体外で活性化させることである。樹状細胞は、単一の腫瘍特異的ペプチド／タンパク質または腫瘍細胞溶解物（腫瘍細胞を分解した溶液）であってもよい、腫瘍抗原の存在下で活性化される。これらの細胞（任意にアジュバントを含む）は注入され、免疫応答を引き起こす。
樹状細胞療法は、樹状細胞の表面の受容体に結合する抗体の使用を含む。抗体は、抗体に添加することができ、樹状細胞を成熟させ、腫瘍に対する免疫を提供するように誘導することができる。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＣＤ４０などの樹状細胞受容体が抗体ターゲットとして使用されている。
Ｃ．ＣＡＲ－Ｔ細胞療法
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られている）は、がん細胞を標的とするために免疫細胞に新しい特異性を結合する工学的な受容体である。通常、これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植したものである。この受容体は、異なる供給源からの部品を融合させたものであるため、キメラと呼ばれています。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法とは、このような形質転換された細胞をがん治療に用いる治療法を指す。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の設計の基本原理は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能を併せ持つ組換え受容体である。ＣＡＲ－Ｔ細胞の大前提は、がん細胞に見られるマーカーを標的とするＴ細胞を人工的に生成することである。科学者たちは、人からＴ細胞を取り出し、遺伝子組み換えを行い、それを患者に戻して、がん細胞を攻撃させることができる。いったんＴ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞になるように遺伝子操作されると、それは「生きた薬」として機能する。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞外のリガンド認識ドメインと細胞内のシグナル伝達分子との間にリンクを作り、それがＴ細胞を活性化する。細胞外リガンド認識ドメインは、通常、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の安全性において重要なことは、いかにして正常細胞ではなく、がんの腫瘍細胞のみを標的とするかということである。ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性は、標的とする分子の選択によって決定される。
例示的なＣＡＲ－Ｔ療法には、ティサゲンレクロイセル（Ｋｙｍｒｉａｈ）及びアクシカブタゲンシロロイセル（Ｙｅｓｃａｒｔａ）が含まれる。）いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ療法は、ＣＤ１９を標的としている。
Ｄ．サイトカイン療法
サイトカインは、腫瘍内に存在する多くの種類の細胞によって産生されるタンパク質である。それらは、免疫応答を調節することができる。腫瘍は、しばしばそれらを採用して、成長を可能にし、免疫応答を減少させる。これらの免疫調節作用により、免疫反応を誘発するための薬物として使用することができる。一般的に使用される２つのサイトカインは、インターフェロンとインターロイキンである。
インターフェロンは、免疫系によって産生される。通常、抗ウイルス反応に関与しているが、がんにも使用されている。それらは３つのグループに分類される：Ｉ型（ＩＦＮαおよびＩＦＮβ）、ＩＩ型（ＩＦＮγ）およびＩＩＩ型（ＩＦＮλ）。
インターロイキンは、一連の免疫系作用を有する。ＩＬ－２は、例示的なインターロイキンサイトカイン療法である。
Ｅ．養子縁組Ｔ細胞療法
養子縁組Ｔ細胞療法は、Ｔ細胞の輸血（養子細胞移植）による受動免疫の一形態である。Ｔ細胞は、血液や組織中に存在し、通常、外来病原体を見つけると活性化する。具体的には、Ｔ細胞の表面受容体が、外来タンパク質の一部を表面抗原に持つ細胞に出会うと活性化する。この細胞は、感染細胞であったり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であったりする。ＴＩＬは正常組織にも腫瘍組織にも存在し、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と呼ばれる。ＴＩＬは、腫瘍抗原を提示する樹状細胞などのＡＰＣの存在により活性化される。これらの細胞は腫瘍を攻撃することができるが、腫瘍内の環境は非常に免疫抑制的であり、免疫介在性腫瘍の死が防止される。
腫瘍標的Ｔ細胞を産生し、得るための複数の方法が開発されてきた。腫瘍抗原に特異的なＴ細胞は、腫瘍サンプル（ＴＩＬｓ）から除去することができ、または血液から濾過することができる。その後、生体外で活性化と培養を行い、その結果を再注入します。活性化は、遺伝子治療によって、またはＴ細胞を腫瘍抗原に暴露することによって行われ得る。
がん治療が、本明細書に記載されるがん治療のいずれかを除外し得ることが企図される。さらに、本開示の実施形態は、本明細書に記載される療法に対して以前に治療された患者、本明細書に記載される療法に対して現在治療されている患者、又は本明細書に記載される療法に対して治療されていない患者を含む。 いくつかの実施形態では、患者は、本明細書に記載の療法に対して耐性があると判断された者である。いくつかの実施形態では、患者は、本明細書に記載される療法に対して感受性であると判定された者である。
Ｖ．試料の調製
特定の態様において、方法は、対象から試料を得ることを含む。本明細書で提供される入手方法は、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、切開生検、切除生検、パンチ生検、剃毛生検または皮膚生検などの生検の方法を含んでもよい。 特定の実施形態では、サンプルは、先に述べた生検方法のいずれかによって食道組織からの生検から得られる。他の実施形態では、サンプルは、血清、胆嚢、粘膜、皮膚、心臓、肺、乳房、膵臓、血液、肝臓、筋肉、腎臓、平滑筋、膀胱、結腸、腸、脳、前立腺、食道、または甲状腺組織からの非がん性またはがん性組織および非がん性またはがん性組織が含まれるがこれらに限定されない、本明細書に提供する組織のいずれからも得ることができる。あるいは、サンプルは、血液、汗、毛包、頬部組織、涙、月経、糞便、または唾液を含むがこれらに限定されない任意の他のソースから得てもよい。現在の方法の特定の態様では、医師、看護師、医療技術者などの任意の医療専門家が、試験のために生物学的試料を得ることができる。さらに、生物学的試料は、医療専門家の助けなしに得ることができる。
サンプルは、組織、細胞、又は被験者の細胞からの、又は細胞に由来する生物学的材料を含むことができるが、これらに限定されるものではない。生物学的試料は、細胞又は組織の異種集団又は同種集団であってもよい。生体試料は、本明細書に記載される分析方法に適した試料を提供することができる当技術分野で既知の任意の方法を用いて得られてもよい。試料は、以下を含むがこれらに限定されない非侵襲的な方法によって得られてもよい：皮膚又は子宮頸部の掻き取り、頬のスワビング、唾液の採取、尿の採取、糞の採取、月経、涙、又は精液の採取であり得る。
サンプルは、当技術分野で既知の方法によって得ることができる。特定の実施形態では、サンプルは、生検によって得られる。他の実施形態では、サンプルは、スワビング、内視鏡検査、掻き取り、瀉血、又は当技術分野で既知の他の任意の方法によって得られる。場合によっては、サンプルは、本方法のキットの構成要素を用いて取得、保存、又は輸送されてもよい。場合によっては、本明細書に記載の方法による診断のために、複数のサンプル、例えば複数の食道サンプルを得てもよい。他の態様では、１つの組織型（例えば食道）からの１つ又は複数の試料及び他の検体（例えば血清）からの１つ又は複数の試料のような複数の試料が、本方法による診断のために得られてもよい。場合によっては、１つの組織型（例えば食道）からの１つ又は複数の試料及び別の検体（例えば血清）からの１つ又は複数の試料などの複数の試料が、同じ時間又は異なる時間に得られてもよい。異なる時期に得られた試料は、異なる方法で保存及び／又は分析されてもよい。例えば、試料は、ルーチン染色法又は他の任意の細胞学的分析法によって得られ、分析されてもよい。
いくつかの実施形態では、生物学的試料は、医師、看護師、又は医療技術者、内分泌学者、細胞学者、瀉血医、放射線学者、若しくは呼吸器学者などの他の医療専門家によって取得されてもよい。医療専門家は、試料に対して実施すべき適切な検査又はアッセイを指示することができる。特定の局面では、分子プロファイリング事業者が、どのアッセイまたは検査が最も適切に指示されるかを相談することができる。現在の方法のさらなる態様において、患者又は対象は、全血試料、尿試料、糞便試料、頬試料、又は唾液試料を得るなど、医療専門家の助けなしに、試験のための生体試料を得ることができる。
他の場合、サンプルは、生検、針吸引、内視鏡検査、又は瀉血を含むがこれらに限定されない侵襲的な手順によって得られる。針吸引の方法は、さらに、細針吸引、コア針生検、真空補助生検、又は大型コア生検を含んでもよい。いくつかの実施形態では、十分な量の生物学的材料を確保するために、本明細書の方法によって複数の試料が得られてもよい。
生物学的試料を得るための一般的な方法もまた、当技術分野で知られている。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲａｍｚｙ， Ｉｂｒａｈｉｍ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｂｉｏｐｓｙ ２００１などの出版物は、生検及び細胞学的方法に関する一般的な方法を記載している。一実施形態では、サンプルは、食道または食道腫瘍もしくは新生物の疑いのあるものの細針吸引物である。場合によっては、細針吸引サンプリング手順は、超音波、Ｘ線、または他のイメージングデバイスの使用によって誘導され得る。
本方法のいくつかの実施形態では、分子プロファイリング事業者は、対象から直接、医療従事者から、第三者から、または分子プロファイリング事業者もしくは第三者が提供するキットから生物学的試料を入手することができる。場合によっては、被験者、医療従事者、または第三者が生体試料を取得し、分子プロファイリング事業者に送付した後に、分子プロファイリング事業者が生体試料を取得することがある。場合によっては、分子プロファイリング事業者は、分子プロファイリング事業者への生体サンプルの保管及び輸送のための適切な容器、及び賦形剤を提供することができる。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、医療専門家は、最初の診断又はサンプルの取得に関与する必要がない。個人は、代替的に、市販の（ＯＴＣ）キットの使用を通じて試料を取得することができる。ＯＴＣキットは、本明細書に記載されるように、前記サンプルを取得するための手段、検査のために前記サンプルを保管するための手段、及びキットの適切な使用のための説明書を含むことができる。場合によっては、分子プロファイリングサービスは、キットの購入価格に含まれる。他の場合では、分子プロファイリングサービスは別途請求される。分子プロファイリング事業による使用に適した試料は、被検者の組織、細胞、核酸、遺伝子、遺伝子断片、発現産物、遺伝子発現産物断片を含む任意の物質であってよい。試料の適合性及び／又は適切性を決定するための方法が提供される。
いくつかの実施形態では、対象は、腫瘍学者、外科医、又は内分泌学者などの専門家に紹介される場合がある。専門家は、同様に、試験のための生物学的試料を得るか、又は生物学的試料の提出のために個人を試験センター又は研究所に紹介してもよい。場合によっては、医療専門家は、生物学的試料を提出するために、被験者を検査 センターまたは研究所に紹介することができる。他の場合では、被験者が試料を提供することができる。場合によっては、分子プロファイリング事業者が試料を入手することもある。
ＶＩ．治療用組成物の投与
本明細書で提供される療法は、第１のがん治療（例えば、ＴＤＯ２阻害剤）及び第２のがん治療（例えば、化学療法、放射線療法、又は免疫療法などの追加のがん治療）などの治療剤の組み合わせの投与を含んでいてもよい。療法は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法で投与されてもよい。例えば、第１及び第２のがん治療は、順次（異なる時間に）又は同時に（同じ時間に）投与されてもよい。いくつかの実施形態では、第１のがん治療と第２のがん治療は、別々の組成物で投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２のがん治療薬は、同じ組成物中にある。
本開示の実施形態は、治療用組成物を含む組成物及び方法に関する。異なる治療薬は、１つの組成物中で、又は２つの組成物、３つの組成物、若しくは４つの組成物のような２つ以上の組成物中で投与されてもよい。薬剤の様々な組み合わせが採用されてもよい。
本開示の治療剤は、同じ投与経路で投与されてもよいし、異なる投与経路で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、がん治療薬は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、軌道内、移植、吸入、髄腔内、または経鼻で投与される。いくつかの実施形態では、抗生物質は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、軌道内、移植、吸入、髄腔内、脳室内、または鼻腔内に投与される。適切な投与量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度及び経過、個体の臨床状態、個体の臨床歴及び治療に対する反応、並びに主治医の裁量に基づいて決定することができる。
治療は、様々な”単位用量”を含むことができる。単位用量は、治療用組成物の所定－量を含むと定義される。投与される量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術に携わる者の判断の範囲内である。単位用量は、１回の注射として投与される必要はないが、一定期間にわたる連続注入を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、単位用量は、単一の投与可能な用量からなる。
投与される量は、治療回数及び単位用量の両方に従って、所望される治療効果に依存する。有効量は、特定の効果を達成するために必要な量を指すと理解される。特定の実施形態における実践では、１０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が、これらの薬剤の保護能力に影響を与え得ることが企図される。したがって、投与量には、約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、および２００、３００、４００、５００、１０００μｇ／ｋｇ、ｍｇ／ｋｇ、μｇ／日またはｍｇ／日あるいはそこから誘導できる任意の範囲の投与が含まれる。さらに、そのような用量は、１日の間の複数の時間に、および／または複数の日、週、または月に投与することができる。
特定の実施形態では、医薬組成物の有効量は、約１μＭ～１５０μＭの血中濃度を提供することができるものである。別の実施形態では、有効用量は、約４μＭ～１００μＭの血中濃度を提供する。または約１μＭ～１００μＭ；または約１μＭ～５０μＭ；または約１μＭ～４０μＭ；または約１μＭ～３０μＭ；または約１μＭ～２０μＭ；または約１μＭ～１０μＭ；または約１０μＭ～１５０μＭ；または約１０μＭ～１００μＭ．又は約１０μＭ～５０μＭ；又は約２５μＭ～１５０μＭ；又は約２５μＭ～１００μＭ；又は約２５μＭ～５０μＭ；又は約５０μＭ～１５０μＭ；又は約５０μＭ～１００μＭ（又はそこに派生する任意の範囲）である。他の実施形態では、用量は、治療剤が被験体に投与されることから生じる、薬剤の以下の血中濃度を提供することができる。約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５１、５４、５５、５２、５３、５４、５５のいずれかに相当する。５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００μＭまたはそこから誘導できる範囲のものであればよい。特定の実施形態では、被験者に投与される治療薬は、体内で代謝されて代謝型治療薬となり、その場合、血中濃度はその治療薬の量を指す場合がある。代替的に、治療剤が対象によって代謝されない程度に、本明細書で議論される血中レベルは、代謝されない治療剤を指す場合がある。
治療用組成物の正確な量もまた、施術者の判断に依存し、各個人に特有である。用量に影響を与える要因としては、患者の身体的及び臨床的状態、投与経路、治療の意図する目標（症状の緩和対治癒）、及び特定の治療物質又は被験者が受けている可能性がある他の治療の効力、安定性及び毒性が挙げられる。
体重のμｇ／ｋｇ又はｍｇ／ｋｇの投与量単位は、４μＭ～１００μＭのようなμｇ／ｍｌ又はｍＭ（血中濃度）の同等の濃度単位に変換して表現できることは、当業者には理解され、認識されるであろう。また、取り込みは種および臓器／組織に依存することが理解される。取り込みおよび濃度測定に関して適用可能な変換係数および生理学的仮定は周知であり、当業者であれば、ある濃度測定を別のものに変換し、本明細書に記載の用量、効能および結果に関して合理的な比較および結論を出すことができるであろう。
ＶＩＩ．キット
本開示のある態様は、本開示の組成物又は本明細書に開示される方法を実施するための組成物を含むキットにも関する。いくつかの実施形態では、キットは、１つ又は複数のバイオマーカーを評価するために使用することができる。特定の実施形態では、キットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５を含む、少なくとも含む、または最大で含む。３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、５００、１０００またはそれ以上のプローブ、プライマーまたはプライマーセット、合成分子または阻害剤、またはそこから派生する任意の値または範囲および組み合わせがある。いくつかの実施形態では、細胞におけるバイオマーカー活性を評価するためのキットが存在する。
キットは、構成要素から構成されてもよく、これらは、個別に包装されてもよいし、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、又は他の適切な容器手段などの容器内に配置されてもよい。
個々の成分はまた、濃縮された量でキット中に提供されてもよい；いくつかの実施形態では、成分は、それが他の成分と共に溶液中にあるのと同じ濃度で個々に提供される。成分の濃度は、１倍、２倍、５倍、１０倍、又は２０倍以上として提供されてもよい。
本開示のプローブ、合成核酸、非合成核酸、及び／又は阻害剤を予後又は診断用途に使用するためのキットは、本開示の一部として含まれる。具体的に企図されるのは、本明細書で同定される任意のバイオマーカーに対応する任意のそのような分子であり、バイオマーカーの全部又は一部と同一又は相補的な核酸プライマー／プライマーセット及びプローブを含み、バイオマーカーの非コード化配列、並びにバイオマーカーのコード化配列を含むことができる。
特定の態様において、陰性及び／又は陽性対照核酸、プローブ、及び阻害剤は、いくつかのキットの実施形態に含まれる。加えて、キットは、１つ以上のバイオマーカーのメチル化に関する陰性又は陽性対照である試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、対照は、少なくとも１つのＣｐＧを含むか、又はＣｐＧメチル化部位を特定することが可能な核酸を含む。
本明細書に記載される任意の方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法又は組成物に関して実施することができ、異なる実施形態を組み合わせることができることが企図される。当初出願された請求項は、任意の出願された請求項又は出願された請求項の組み合わせに多重に従属する請求項をカバーすることが企図されている。
名称による特定のバイオマーカーを含む本開示の任意の実施形態は、その配列が指定された核酸の成熟配列と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一のバイオマーカーを含む実施形態も対象となることが企図されている。
本開示の実施形態は、適切な容器手段中に、２つ以上のバイオマーカープローブを含むサンプルについてバイオマーカープロファイルを評価することによって病理学的サンプルを分析するためのキットを含み、ここでバイオマーカープローブは、本明細書に特定されるバイオマーカーの１つ又は複数を検出する。キットは、サンプル中の核酸を標識するための試薬をさらに含むことができる。キットは、アミン修飾ヌクレオチド、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、及びポリ（Ａ）ポリメラーゼバッファーのうちの少なくとも１つを含む標識試薬も含み得る。標識試薬は、アミン反応性色素を含むことができる。
ＶＩＩＩ．がん治療
いくつかの実施形態では、開示された方法は、患者にがん療法を投与することを含む。がん療法は、発現レベル測定値に基づいて、単独で、又は患者について計算された臨床リスクスコアと組み合わせて選択され得る。いくつかの実施形態では、がん療法は、局所がん療法を含んでいる。いくつかの実施形態では、がん療法は、全身がん療法を除く。いくつかの実施形態では、がん療法は、局所療法を除く。いくつかの実施形態では、がん療法は、全身がん療法を投与することなく局所がん療法を含んでいる。いくつかの実施形態では、がん療法は、免疫チェックポイント療法であってよい、免疫療法を含んでいる。いくつかの実施形態では、がん治療は、ＩＤＯ２阻害剤による治療を含んでいる。いくつかの実施形態では、がん治療は、ＩＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤による治療を含んでいる。これらのがん治療のいずれかを除外することもできる。これらの療法の組み合わせもまた、投与されてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子又はｍｉＲＮＡの発現測定及び解析は、１つ以上のがん治療が有効又は無効である可能性が高いであろうことを示すことができる。
ＩＸ．細胞療法
Ａ．細胞培養
いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも約１０日間～約４０日間、少なくとも約１５日間～約３５日間、少なくとも約１５日間～２１日間、例えば少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９又は２１日間培養され得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、６０日以下、又は５０日以下、又は４５日以下、培養されてもよい。細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日間、培養されてもよい。細胞は、液体培養液の存在下で培養されてもよい。典型的には、培地は、当該技術分野で知られているような基底培地製剤を含んでいてもよい。本明細書では、多くの基底培地処方を使用して細胞を培養することができ、これには、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、アルファ改変最小必須培地（アルファＭＥＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ（ＢＭＥ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、ＢＧＪｂ培地、Ｆ－１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ Ｌ－１５、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０およびこれらの改変物および／または組み合わせが挙げられる。上記基礎培地の組成は、当技術分野において一般に知られており、培養される細胞に対して必要に応じて培地及び／又は培地サプリメントの濃度を変更又は調節することは、当業者の技術範囲内である。いくつかの実施形態では、培養液の処方は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミンを補充したＩＭＤＭからなるエクスプラント培地（ＣＥＭ）であってもよい。他の実施形態は、上記のものから選択されるような、さらなる基礎培地処方を採用することができる。
細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで支持することができる任意の培地が、細胞を培養するために使用されてもよい。細胞の増殖を支持することができる培地製剤としては、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α変法ミニマルエッセンシャル培地（αＭＥＭ）、ロスウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０）等が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。通常、上記培地には、細胞の増殖を補助するために、２０％までのウシ胎児血清（ＦＢＳ）または１～２０％のウマ血清が添加される。ただし、細胞の培養に必要な成長因子、サイトカイン、ホルモンが培地中に適切な濃度で供給されていれば、定義された培地も使用できる。本開示の方法に有用な培地は、細胞の培養に有用な抗生物質、分裂促進化合物、または分化化合物を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の目的の化合物を含んでいてもよい。細胞は、２７℃～４０℃、例えば３１℃～３７℃の温度で培養されてもよく、加湿インキュベータ内であってもよい。二酸化炭素含有量は、２％～１０％の間に維持されてもよく、酸素含有量は、１％～２２％の間に維持されてもよい。しかしながら、本開示は、決して、細胞を単離及び培養する任意の１つの方法に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、細胞を単離し、培養する任意の方法は、本開示に含まれると解釈されるべきである。
細胞培養に使用するために、培地には１つ以上のさらなる成分を供給することができる。例えば、最適な成長および拡張のために必要な微量元素および物質を細胞に供給するために、追加のサプリメントを使用することができる。このようなサプリメントには、インスリン、トランスフェリン、セレン塩、およびそれらの組み合わせが含まれる。これらの成分は、Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＨＢＳＳ）， Ｅａｒｌｅ’ｓ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ などの塩溶液に含ませることができるが、これらに限定されるものではない。さらに抗酸化剤サプリメント、例えばβ－メルカプトエタノールを加えてもよい。多くの培地は既にアミノ酸を含んでいるが、一部のアミノ酸は後で補充してもよい。例えば、Ｌ－グルタミンは、溶液中では安定性が低いことが知られている。培地は、抗生物質および／または抗真菌化合物、例えば、典型的には、ペニシリンとストレプトマイシンの混合物、および／または他の化合物、例示されるがこれに限定されない、アンフォテリシン， アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ナリディキシン酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクトロマイシン、テトラサイクリン、チロシンおよびゼオシンを例示することができる。また、細胞培養液に哺乳類の血漿または血清を補充することも考えられる。血漿または血清は、しばしば、生存率および拡張に必要な細胞因子および成分を含む。適切な血清代替物の使用もまた企図される。
特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件など、またはそれらのサブクラスへの言及は、限定することを意図したものではなく、当業者がその議論が提示される特定の文脈において関心または価値があると認識するであろうそのような関連材料のすべてを含むと読み取るべきである。例えば、提案された方法、材料又は組成物の使用が向けられるものと同じ目標を達成するために、異なるが既知の方法が使用されるように、ある緩衝系又は培養液を別のものに置き換えることが可能であることが多い。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液、好ましくは培養容器、特に、細胞をインビトロ老化から保護するため及び／又は非特異的若しくは特異的な初期化を誘導するために適切かつ決定された物質を補充した細胞培養液を含む細胞培養系で培養される。
Ｂ．細胞の生成
本開示の特定の方法は、ヒト組織試料から得られた細胞の培養に関するものである。本開示の特定の実施形態では、細胞は、その上に細胞の付着が可能な基材上にプレーティングされる。これは、例えば、細胞の付着に適合する１つ以上の基材表面を表示する培養プレート内に細胞をプレーティングすることによって実施され得る。１つ以上の基材表面が、培養系に導入された細胞の懸濁液（例えば、培地中の懸濁液）に接触すると、細胞と基材表面との間の細胞接着が生じ得る。したがって、特定の実施形態では、細胞は、プレーティングされた細胞が前記基材表面に接触し得るように、一般に細胞の付着に適合する少なくとも１つの基材表面を特徴とする培養系に導入され、そのような実施形態は、細胞のその上への付着を可能にする、基材へのプレーティングを包含している。
本開示の細胞は、細胞表面マーカーなどの特定のマーカータンパク質の発現によって同定及び特徴付けることができる。これらの細胞の検出及び単離は、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、及び／又は磁気ビーズによって達成することができる。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、細胞特異的遺伝子を定量化するため、及び／又は分化に応じた遺伝子発現の変化を監視するために使用され得る。特定の実施形態では、細胞を同定し特徴付けるために使用されるマーカータンパク質は、ｃ－Ｋｉｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｈｅｙ１、ＳＭＡ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ２、Ｓｎａｉｌ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ７３、Ｗｔ１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びこれらの組み合わせからなるリストから選択される。
Ｘ．遺伝子シグナチャーの検出
特定の実施形態が、遺伝子シグナチャーを個体において検出する方法に関する。いくつかの実施形態において、遺伝子シグナチャーを検出するための方法には、例えば、選択的オリゴヌクレオチドプローブ、アレイ、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、分子ビーコン、制限断片長多型分析、酵素連鎖反応、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ分析、プライマー伸長、５’－ヌクレアーゼ分析、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、一本鎖高次構造多型分析、温度勾配ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィー、高分解能融解、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質分析、ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ、配列決定、またはそれらの組み合わせが含まれる場合がある。遺伝子シグナチャーを検出するための方法には、例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイ、ポリメラーゼ連鎖反応、配列決定、またはそれらの組み合わせが含まれる場合がある。遺伝子シグナチャーの検出では、遺伝子シグナチャーの１つの特徴を検出するために特定の方法を使用することが伴う場合があり、加えて、遺伝子シグナチャーの異なる特徴を検出するために同じ方法または異なる方法が使用される場合がある。多数の異なる方法が独立して、または組み合わせで、同じ特徴または複数の特徴を検出するために使用される場合がある。
Ａ．一塩基多型（ＳＮＰ）検出
本開示の特定の実施形態が、ＳＮＰを個体において検出する方法に関する。ＳＮＰを検出するための知られている一般的な方法のどれもが、例えば、本開示において特定のＳＮＰを検出するために用いられる場合がある。そのような方法には、選択的オリゴヌクレオチドプローブ、アレイ、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、分子ビーコン、制限断片長多型分析、酵素連鎖反応、ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ分析、プライマー伸長、５’－ヌクレアーゼ分析、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、一本鎖高次構造多型分析、温度勾配ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィー、高分解能融解、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質分析、ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ、配列決定、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態において、ＳＮＰを検出するために使用される方法は、個体からの核酸物質を配列決定すること、および／または選択的オリゴヌクレオチドプローブを使用することを含む。個体からの核酸物質を配列決定することには、個体からの核酸物質を、例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写される相補的ＤＮＡ、またはＲＮＡの形態で得ることが伴う場合がある。標準的な配列決定技法はどれも用いられる場合があり、これには、サンガー配列決定、鎖伸長配列決定、マクサム・ギルバート配列決定、ショットガン配列決定、ブリッジＰＣＲ配列決定、配列決定のためのハイスループット方法、次世代配列決定、ＲＮＡ配列決定、またはそれらの組み合わせが含まれる。個体からの核酸を配列決定した後、データ処理ソフトウェアまたはデータ処理技法がどのようなものであれ、どの特定のヌクレオチドが特定のＳＮＰにおいて個体に存在するかを決定するために利用される場合がある。
いくつかの実施形態において、特定のＳＮＰにおけるヌクレオチドが選択的オリゴヌクレオチドプローブによって検出される。プローブは、例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡから逆転写される相補的ＤＮＡ、またはＲＮＡを含めて個体からの核酸物質に対して使用される場合がある。選択的オリゴヌクレオチドプローブが、ＳＮＰにおいて存在する特定のヌクレオチドに基づいて相補鎖に優先的に結合する。例えば、１つの選択的オリゴヌクレオチドプローブが、Ａヌクレオチドをコード鎖でのＳＮＰにおいて有し、しかしＧヌクレオチドをコード鎖でのＳＮＰにおいて有しない相補鎖に結合し、一方、異なる選択的オリゴヌクレオチドプローブが、Ｇヌクレオチドをコード鎖でのＳＮＰにおいて有し、しかしＡヌクレオチドをコード鎖でのＳＮＰにおいて有しない相補鎖に結合する。同様な方法が、ＳＮＰにおいてＣヌクレオチドまたはＴヌクレオチドを有し、しかし両方のヌクレオチドを有しないコード鎖に選択的に結合するプローブを設計するために使用され得るであろう。したがって、１つの選択的オリゴヌクレオチドプローブが別の選択的オリゴヌクレオチドプローブに優先して結合することを明らかにするための方法はどれも、ＳＮＰにおいて存在するヌクレオチドを決定するために使用され得るであろう。
オリゴヌクレオチドプローブを使用してＳＮＰを検出するための１つの方法が、分光光度計および／またはゲル電気泳動アッセイによって核酸物質の品質を分析し、その量を測定する工程、核酸物質を、少なくとも１つの選択的オリゴヌクレオチドプローブと、ＰＣＲプライマーと、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施するために必要とされる成分を含む混合物（これは、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、および反応のための好適な緩衝液を含み得るであろう）とを含む反応混合物に処理する工程、および処理された反応混合物を、反応をモニターしながら循環させる工程を含む。この方法の１つの実施形態において、ｑＰＣＲのために使用されるポリメラーゼは、増幅途中の鎖に結合する選択的オリゴヌクレオチドプローブと出会い、エンドヌクレアーゼ活性を使用して、この選択的オリゴヌクレオチドプローブを分解するであろう。分解されたプローブの検出により、プローブが増幅鎖に結合したかが明らかにされる。
選択的オリゴヌクレオチドプローブが特定のヌクレオチドに結合することを明らかにするための別の方法が、選択的オリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲプライマーとして使用することを含み、この場合、選択的オリゴヌクレオチドプローブはＳＮＰ位置において特定のヌクレオチドに対して優先的に結合する。いくつかの実施形態において、プローブは一般に、プローブの３’末端がＳＮＰと対形成するように設計される。したがって、プローブが、ＳＮＰにおいて特定のヌクレオチドと対形成するための正しい相補的塩基を有するならば、プローブは、ＰＣＲの増幅工程の期間中に伸長されることになるであろう。例えば、Ｔヌクレオチドがプローブの３’位置に存在し、かつ、ＡヌクレオチドがＳＮＰ位置に存在するならば、プローブはＳＮＰに結合し、ＰＣＲの増幅工程の期間中に伸長されることになるであろう。しかしながら、同じプローブが使用され（Ｔが３’末端に存在する）、かつ、ＧヌクレオチドがＳＮＰ位置に存在するならば、プローブは完全には結合しないことになり、ＰＣＲの増幅工程に期間中に伸長されないことになるであろう。
いくつかの実施形態において、ＳＮＰ位置はＰＣＲプライマーの終末端ではなく、むしろＰＣＲプライマーの内部に位置する。ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲプライマーが１つのバリアント（例えば、Ａヌクレオチドを有するＳＮＰ）に選択的に結合することができ、しかし別のバリアント（例えば、Ｇヌクレオチドを有するＳＮＰ）には結合しないという点で十分な長さおよび相同性でなければならない。ＰＣＲプライマーはまた、特にＧヌクレオチドを有するＳＮＰには選択的に結合し、しかし、Ａヌクレオチド、ＣヌクレオチドまたはＴヌクレオチドを有するバリアントには結合しないように設計される場合がある。同様に、ＰＣＲプライマーが、ＣヌクレオチドまたはＴヌクレオチドを有し、しかし両方を有しないＳＮＰに結合し、後では、Ｇヌクレオチド、ＡヌクレオチドもしくはＴヌクレオチドを有するバリアント、またはＧヌクレオチド、ＡヌクレオチドもしくはＣヌクレオチドを有するバリアントにそれぞれ結合しないように設計され得るであろう。特定の実施形態において、ＰＣＲプライマーは、非相同性がＳＮＰ地点で除外される可能性があるが、テンプレート配列に対する１００％の相同性を伴って、長さにおいて、少なくとも１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３ ５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個またはそれ以上のヌクレオチドであり、あるいは１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３ ５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個またはそれ以上のヌクレオチドにすぎない。数回の増幅の後、ＰＣＲプライマーにより、予想されたバンドサイズが生じているならば、ＳＮＰはＡヌクレオチドを有しており、Ｇヌクレオチドを有していないと判定することができる。
Ｂ．コピー数変動検出
本開示の特定の実施形態が、特定の対立遺伝子のコピー数変動（ＣＮＶ）を検出する方法に関する。ＣＮＶを検出するための知られている方法がどれも、ＣＮＶを検出するために利用することができる。そのような方法には、例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイ、ポリメラーゼ連鎖反応、配列決定、またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＮＶは、アレイを使用して検出される。様々なアレイプラットフォーム、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘなどから得られるアレイプラットフォームが使用される場合があり、あるいはカスタムアレイが設計され得るであろう。アレイがどのように使用され得るかの一例には、核酸物質を好適な様式で、ＣＮＶを有すると疑われる個体から、また、少なくともいくつかの場合にはＣＮＶを有しない個体または参照ゲノムから単離する工程、核酸物質を断片化によって処理し、核酸を、例えば、蛍光標識により標識し、断片化され、標識された核酸物質を精製する工程、核酸物質を十分な時間にわたって、例えば、少なくとも２４時間、アレイに対してハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーション後のアレイを洗浄する工程、アレイを、アレイスキャナーを使用してスキャンする工程、およびアレイを、好適なソフトウェアを使用して分析する工程の１つまたは複数を含む、方法が含まれる。ソフトウェアが、ＣＮＶを有すると疑われる個体からの核酸物質を、ＣＮＶを有しないことが知られている個体の核酸物質、または参照ゲノムと比較するために使用される場合がある。
いくつかの実施形態において、ＣＮＶの検出がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成される。ＰＣＲプライマーを、核酸をＣＮＶまたはその付近において増幅するために用いることができ、この場合、ＣＮＶを有する個体が、参照ゲノムからのＰＣＲ産物と比較したとき、測定可能なより高レベルのＰＣＲ産物をもたらすことになるであろう。ＰＣＲ産物量の検出が、例として、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定され得るであろうし、またはゲル電気泳動によって測定され得るであろう。ゲル電気泳動を使用する定量化は、得られたＰＣＲ産物を既知サイズの核酸標準物と共にアガロースゲルでの電流に供し、得られたバンドのサイズおよび強度を測定することを含む。得られたバンドのサイズを、得られたバンドのサイズを決定するために既知標準物と比較することができる。いくつかの実施形態において、ＣＮＶの増幅は、ＣＮＶを検出するために使用されたのと同じプライマーを使用して、参照ゲノムから、またはＣＮＶが検出されることがない個体から増幅されるバンドよりも大きいサイズを有するバンドをもたらすであろう。ＣＮＶ増幅からの得られたバンドは、参照ゲノムからの得られたバンド、またはＣＮＶが検出されてことがない個体からの得られたバンドのほぼ２倍、２倍、または２倍超である場合がある。いくつかの実施形態において、ＣＮＶは、核酸配列決定を使用して検出することができる。使用され得るであろう配列決定技法には、全ゲノム解析、全エクソーム解析、および／または標的化配列決定が含まれるが、これらに限定されない。
Ｃ．ＤＮＡ配列決定
いくつかの実施形態において、ＤＮＡが配列決定によって分析される場合がある。ＤＮＡは個体から（例えば、個体の生殖系列から）得られる場合がある。ＤＮＡはがん細胞から得られる場合がある。ＤＮＡは、どのような方法であれこの技術分野において知られている方法によって、例えば、ライブラリー調製、ハイブリッド捕捉、サンプル品質管理、生成物利用連結に基づくライブラリー調製、またはそれらの組み合わせなどによって配列分析のために調製される場合がある。ＤＮＡは、どのような技法であれ配列決定技法のために調製される場合がある。いくつかの実施形態において、それぞれのサンプルについての一義的な遺伝子読み出しが、１つまたは複数の高度多型ＳＮＰを遺伝子型決定することによってもたらされる場合がある。いくつかの実施形態において、配列決定、例えば、７６塩基対のペアエンド配列決定などが、およそ７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の割合の標的を、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍または５０倍超を超える被覆度で網羅するために実施される場合がある。ある特定の実施形態において、変異、ＳＮＰ、ＩＮＤＥＬ、コピー数変化（体細胞および／または生殖系列）、または他の遺伝子差異が、ＶａｒＳｃａｎ２、いずれかのＲパッケージ（ＣｏｐｙｗｒｉｔｅＲを含む）および／またはＡｎｎｏｖａｒを含めて少なくとも１つの生物情報学ツールを使用して配列決定から特定される場合がある。配列決定が、変異を遺伝子において明らかにするために使用される場合がある。配列決定がまた、遺伝子のメチル化状態を特定するために使用される場合がある（例えば、重亜硫酸塩法配列決定または他のメチル化高感度配列決定）。
Ｄ．ＲＮＡ配列決定
いくつかの実施形態において、ＲＮＡが配列決定によって分析される場合がある。ＲＮＡは、どのような方法であれこの技術分野において知られている方法によって、例えば、ポリＡ選択、ｃＤＮＡ合成、鎖型（ｓｔｒａｎｄｅｄ）ライブラリー調製もしくは非鎖型（ｎｏｎｓｔｒａｎｄｅｄ）ライブラリー調製、またはそれらの組み合わせなどによって配列決定のために調製される場合がある。ＲＮＡは、鎖特異的ＲＮＡ配列決定を含めてどのようなタイプのＲＮＡ配列決定技法であれＲＮＡ配列決定技法のために調製される場合がある。いくつかの実施形態において、配列決定が、ペアとなった読み取りを含めて、およそ１０Ｍ個、１５Ｍ個、２０Ｍ個、２５Ｍ個、３０Ｍ個、３５Ｍ個、４０Ｍ個、またはそれ以上の読み取りをもたらすように実施される場合がある。配列決定は、およそ５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１０５ｂｐ、１１０ｂｐ、またはそれ以上の読み取り長さで実施される場合がある。いくつかの実施形態において、生の配列決定データが、推定読み取りカウント数（ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｒｅａｄ ｃｏｕｎｔｓ、ＲＳＥＭ）、断片数／キロ塩基転写物／百万個のマップ化読み取り（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ、ＦＰＫＭ）、および／または読み取り数／キロ塩基転写物／百万個のマップ化読み取り（ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ、ＲＰＫＭ）に変換される場合がある。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の生物情報学ツールが、間質含量、免疫浸潤および／または腫瘍免疫細胞プロフィルを、例えば、上位四分位数の正規化ＲＳＥＭデータを使用することによって推測するために使用される場合がある。
Ｅ．プロテオミクス
いくつかの実施形態において、タンパク質が質量分析法によって分析される場合がある。タンパク質は、どのような方法であれこの技術分野において知られている方法を使用して質量分析法のために調製される場合がある。本明細書中に包含されるどのような単離されたタンパク質も含めて、タンパク質が、ＤＴＴ、それに続いてヨードアセトアミドにより処理される場合がある。タンパク質は、エンドペプチダーゼ、プロテイナーゼ、プロテアーゼ、またはどのような酵素であれ、タンパク質を切断する酵素を含めて少なくとも１つのペプチダーゼとインキュベーションされる場合がある。いくつかの実施形態において、タンパク質が、エンドペプチダーゼ、ＬｙｓＣおよび／またはトリプシンとインキュベーションされる。タンパク質は、およそ１：１０００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：１、またはどのような範囲であれそれらの間の範囲でのμｇ酵素対μｇタンパク質の比率を含めて、どのような比率においてであれ１つまたは複数のタンパク質切断酵素とインキュベーションされる場合がある。いくつかの実施形態において、切断されたタンパク質は、例えば、カラム精製などによって精製される場合がある。ある特定の実施形態において、精製されたペプチドが急速凍結され、かつ／または、真空下で乾燥されるなど、乾燥される場合がある。いくつかの実施形態において、精製されたペプチドは、例えば、逆相クロマトグラフィーまたは塩基性逆相クロマトグラフィーなどによって分画される場合がある。分画物が、本開示の方法の実施のために一緒にされる場合がある。いくつかの実施形態において、一緒にされた分画物を含めて１つまたは複数の分画物が、アフィニティークロマトグラフィーならびに／あるいは結合、イオン交換クロマトグラフィー、化学的誘導体化、免疫沈殿、共沈殿、またはそれらの組み合わせによるホスホ濃縮を含めて、ホスホペプチド濃縮を受ける。一緒にされた分画物および／またはホスホ濃縮された分画物を含めて１つまたは複数の分画物の全体または一部が質量分析法を受ける場合がある。いくつかの実施形態において、生の質量分析データは処理および正規化が、少なくとも１つの関連した生物情報学ツールを使用して行われる場合がある。
Ｆ．検出キットおよび検出システム
本明細書中に記載される方法に基づいて、様々な検出試薬、キットおよび／またはシステムが、個体を診断するための遺伝子シグナチャーに関連づけられるＳＮＰおよび／またはＣＮＶを検出するために利用され得ることが認識され得る（検出は、個々に、または組み合わせでのどちらでもある）。これらの試薬は、この技術分野では知られているようなキットおよび／またはシステムのための確立された形式の少なくとも１つに組み合わせることができる。本明細書中で使用される場合、用語「キット」および用語「システム」は、少なくとも１つのＳＮＰ検出試薬、例えば、少なくとも１つの選択的オリゴヌクレオチドプローブと、少なくとも１つのＣＮＶ検出試薬、例えば、少なくとも１つのＰＣＲプライマーとの組み合わせなどの様々な実施形態を示す。キットはまた、他の試薬、化学物質、緩衝液、酵素、パッケージ物、容器、電子工学ハードウエア構成要素などを含有し得るであろう。キット／システムはまた、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチド、アレイ、ビーズまたは他の検出試薬のパッケージ化されたセットを含有し得るであろう。どのような数のプローブであれ、検出アレイのために実装され得るであろう。いくつかの実施形態において、検出試薬および／またはキット／システムは化学発光検出試薬または蛍光検出試薬と対にされる。キット／システムの特定の実施形態には、電子工学ハードウエア構成要素の使用、例えば、ＤＮＡチップもしくはＤＮＡアレイ、またはマイクロ流体システムなどの使用が含まれる。具体的な実施形態において、キットはまた、個体が必要としていると判定される場合における１つまたは複数の治療的介入または予防的介入を含む。
ＸＩ．実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その実施のための好ましい態様を構成するとみなすことができることが、当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変化を開示される具体的な実施形態において行うことができ、また、多くの変化が依然として、同じような結果または類似する結果を、本発明の精神および範囲から逸脱することなくもたらし得ることを理解しなければならない。
実施例１－がんにおけるＡＰＣ欠損についての下流側エフェクターとしてのＴＤＯ２の特定
ＡＰＣ欠損腫瘍の下流側エフェクター、具体的には合成上必須（ＳＥ）遺伝子を特定するために、ガンゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データベースにおいてＡＰＣ／β－カテニンとの相互に排他的な変異／欠失パターンを示す遺伝子を特定した。ＣＲＣ事例のほんの小さい割合がＡＰＣについて損なわれていないという制約を克服するために、汎がん分析を行い、これにより、ＣＲＣ、乳がん、前立腺がん、肺がん、頭頸部扁平上皮がんおよび肉腫を含めたＡＰＣ欠失／変異がんにおけるトリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＴＤＯ２）の一貫した保持が示された（図１Ａ）。これらのゲノム事象の限られたサンプルサイズおよび低い頻度を認識して、その後、これらのゲノム結果を、ＡＰＣ機能喪失変異を持つがん細胞において一貫して保持される遺伝子を特定するために設計されるゲノム全域での機能喪失スクリーニングからの的中物と交差させた（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｈ他、Ｃｅｌｌ、２０１２（１２月２１日）；１５１（７）：１４５７～７３；これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。この交差から、ＡＰＣ欠損腫瘍についての３つの候補ＳＥ遺伝子が得られた：ＴＤＯ２、アダプター関連タンパク質複合体３サブユニットデルタ１（ＡＰ３Ｄ１）、ホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ）（図１Ｂ）。
同質遺伝子型のＡＰＣ－ＷＴ ＲＫＯ細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＲＫＯ細胞株を作製し、ＡＰＣ欠失が、ＴＤＯ２およびＰＰＡＴの遺伝子発現を増大させることが見出され（図２Ａおよび図２Ｂ）、このことから、ＡＰＣとＴＤＯ２またはＰＰＡＴとの間における可能性のある遺伝的連関が示唆された。加えて、偏りのないトランスクリプトーム解析では、ＷＮＴ経路活性化シグナチャー（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｌｉｅｒ他、２００７）およびＴＤＯ２発現のあるかもしれない相関関係がＣＲＣデータセットにおいて評価され、これにより、ＴＤＯ２遺伝子発現がＷＮＴ経路活性化と正に相関することが明らかにされた（図１Ｃ；図２Ｃ～図２Ｆ）。これに対応して、ヒトＣＲＣサンプルの腫瘍マイクロアレイ分析では、一致した核ベータ－カテニン（活性化ＷＮＴ経路の代用物）およびＴＤＯ２の発現が示された（図１Ｄおよび図１Ｅ）。最後に、マウスにおいて、ＴＤＯ２発現が、正常な結腸上皮細胞では検出不能であり、それにもかかわらず、ＡＰＣ変異型マウス（ＡＰＣｍｉｎ）のポリープおよびｉＫＡＰマウス（ＡＰＣｍｕｔ／ＴＰ５３ｍｕｔを伴う誘導性Ｋｒａｓｍｕｔ）の腫瘍では劇的に増大した（Ｂｏｕｔｉｎ他、２０１７）（図１Ｆ）。対照的に、それ以外のキヌレニン経路（ＫＰ）酵素、すなわち、ＩＤＯ１およびＩＤＯ２は、ＴＣＧＡ ＣＲＣにおいてＡＰＣおよびベータ－カテニン（ＣＴＮＮＢ１）変異との相互の排他的パターンを示さず、また、ＷＮＴ経路活性化との相関関係も示さなかった（図２Ｇ～図２Ｉ）。まとめると、これらの知見は、ＴＤＯ２が、可能性のある生物学的関連性および臨床的関連性をＣＲＣおよび他のがんタイプにおいて有するＡＰＣ欠損の下流側エフェクターであるかもしれないことを示していた。
類似した分析を、それぞれのデータセットについての統計学的カットオフとともに同じデータセットを使用して実施した。ＴＤＯ２は、三角法によって特定される最高ランクの遺伝子であった。具体的には、三角法により、５つの遺伝子（ＴＤＯ２、Ｃ３、ＭＡＦＢ、ＣＡＢ３９Ｌ、ＰＰＦＩＡ２）が、ｐ＜０．０１およびＦＤＲ≦０．０１のカットオフにより特定された（図２Ｊ）。
実施例２－ＡＰＣ欠損はＴＣＦ４を介してＴＤＯ２発現をアップレギュレーションする
ＡＰＣ欠失はＴＤＯ２のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを増大させた（図３Ａおよび図３Ｂ）：このことから、ＷＮＴ経路関連転写因子の結合エレメントについてのヒトＴＤＯ２遺伝子およびマウスＴＤＯ２遺伝子のプロモーター領域を調べることが促された。転写因子結合プロフィルデータベースのＪＡＳＰＡＲおよびＥＣＲ Ｂｒｏｗｓｅｒを使用すると、ＴＤＯ２遺伝子の上流側領域には、ＴＣＦ４／ＴＣＦ７Ｌ２（ＷＮＴ経路を媒介する既知の転写因子）のための結合部位がいくつか含まれていることが見出された（図３Ｃ）。これらのモチーフ配列の１つがＴＳＳの近くに位置しており、ヒトおよびマウスにおいて保存されている（図３Ｄ）。
抗ＴＣＦ４抗体を使用するＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析により、ＴＣＦ４のＴＤＯ２プロモーター領域に対する特異的結合が、ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞ではなく、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞において示された（図３Ｅ）。ＡＰＣヌルＤＬＤ１細胞株におけるさらなるＣＨＩＰ－ＰＣＲ分析でもまた、ＴＣＦ４がＴＤＯ２プロモーターに直接に結合すること、同様にまた、広く知られているＷＮＴ経路がＡＸＩＮ２およびＭＹＣを標的とし、しかし、陰性対照として役立つＧＡＰＤＨを標的としないことが実証された（図３Ｆ）。それによれば、ヒトＴＤＯ２プロモーターによって駆動される構築物を用いるルシフェラーゼレポーターアッセイにより、構成的に活性なベータ－カテニン（ＣＴＮＮＢ１Δ９０、これはＷＮＴ経路活性化の状態を模倣する）の形質導入がレポーター遺伝子転写の増大をもたらすことが示された。対照的に、レポーター遺伝子発現がＴＣＦ４のドミナントネガティブ形態の発現により、またはＴＣＦ４結合モチーフの変異により低下した（図３Ｇおよび図３Ｈ）。クローン変動影響を排除するために、多数のＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８クローンを作製して、ＴＤＯ２発現の状態を確認した（図３Ｉ）。ＡＰＣ－ＫＯクローンのそれぞれが、非クローン化対照細胞およびＡＰＣ－ＷＴクローンと比較して、より高いＴＤＯ２発現を示した。加えて、ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞を組換えマウスＷＮＴ３ａタンパク質により処理すると、ＴＤＯ２発現が増大し（図３Ｊ）、このことから、ＷＮＴシグナル伝達の内因性活性化がＴＤＯ２の発現を増大させ得ることが示唆された。
Ｃａｃｏ－２細胞株、ＤＬＤ－１細胞株およびＨＣＴ－１５細胞株をＷＮＴ阻害剤ＸＡＶ－９３９により用量依存的様式で処理したところ、ＴＤＯ２発現が、β－カテニンの低下したレベルによって示される阻害されたＷＮＴ活性によって低下した（図３Ｋ～図３Ｍ）。したがって、ＡＰＣ喪失は、ＴＤＯ２遺伝子転写のＴＣＦ４媒介アップレギュレーションを生じさせるＷＮＴ－ベータカテニン－ＴＣＦ４経路の活性化を誘導した。
実施例３－ＴＤＯ２枯渇はＡＰＣ／ＷＮＴ変異ＣＲＣ細胞の成長および生存を特異的に損なう
ＴＤＯ２がＡＰＣ欠損細胞のために特異的に必須であるかどうかを調べるために、ヒトＡＰＣ欠損ＣＲＣ株（ＤＬＤ１、ＨＴ－２９、ＬＳ１８０）およびＡＰＣ ＷＴ（ＲＫＯ）ＣＲＣ株を特定し（図５Ａ）、ＤＬＤ１株、ＲＫＯ株、ＬＳ１８０株およびＨＴ２９株におけるＴＤＯ２のｓｈＲＮＡ媒介枯渇を、２つの依存していない効果的なｓｈＲＮＡ（＃３および＃６）を使用して実施した（図５Ｂ）。ＡＰＣ ＷＴ ＲＫＯ細胞におけるＴＤＯ２枯渇はコロニー形成に対する影響が何らなく、一方、ＡＰＣ欠損ＤＬＤ１細胞はコロニー形成の際立った低下を示した。そのうえ、ＲＫＯ細胞におけるＡＰＣのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介変異不活性化は、ＴＤＯ２枯渇に対する感受性、すなわち、元のＡＰＣ ＷＴ ＲＫＯ細胞と比較しての低下したコロニー形成をもたらした（図５Ｃ）。加えて、ＴＤＯ２特異的阻害剤６８０Ｃ９１（Ｐｉｌｏｔｔｅ他、２０１２）はＡＰＣ欠損細胞株の成長および生存を損ない、しかし、正常な結腸上皮細胞であるＣＣＤ－８４１－ＣｏＮ細胞を含めてＡＰＣ無傷細胞の成長および生存は損なわなかった（図５Ｄ）。マウスＣＲＣ細胞株ＭＣ３８およびその同質遺伝子型ＡＰＣヌル対照もまた、ＡＰＣ枯渇細胞がＴＤＯ２を細胞成長のために特異的に要求し、かつ、ＴＤＯ２阻害に対するより大きい感受性を有することを明らかにした（図４Ａ～図４Ｃ）。誘導性ｓｈＴＤＯ２が感染させられるＡＰＣｍｉｎマウスから単離される腸管オルガノイドもまた、ＴＤＯ２枯渇時の増大した細胞死および損なわれた成長を示した（図４Ｄおよび図４Ｅ；図５Ｉ）。
ＴＤＯ２枯渇による同所性腫瘍の低下した成長が免疫不全ＮＳＧマウスにおけるＡＰＣヌルＲＫＯ細胞において認められた（図５Ｅ）。ｓｈＴＤＯ２を発現するＤＬＤ－１細胞株が、ヘヤピン抵抗性のＴＤＯ２ ＯＲＦの強制発現によって救済される低下した腫瘍成長を示した（図５Ｆ）。ＴＤＯ２枯渇腫瘍組織の病理学的分析により、低下したがん細胞増殖（Ｋｉ ６７）および増大したアポトーシス（切断型カスパーゼ－３）が明らかにされ、このことは、ＴＤＯ２が、がん細胞固有の特徴を駆動させるように働くことを示していた（図５Ｇ；図５Ｈ）。
ＴＤＯ２の作用を免疫適格Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて詳しく調べるために、ＡＰＣヌルＭＣ３８細胞および元のＭＣ３８細胞を、ＡＰＣが無傷の対照ではなく、ＴＤＯ２枯渇のＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞のみによる損なわれた成長および増大したアポトーシスを明らかにする誘導性ｓｈＴＤＯ２システムにより操作した（図４Ｆおよび図４Ｇ）。ＴＤＯ２枯渇ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞は、低下したＫｉ ６７と、増大した切断型カスパーゼ－３と、増大した生存とが伴う低下した腫瘍成長を示した（図４Ｈ～図４Ｌ）。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞を有するＮＳＧマウスにおける同所性腫瘍は、同所性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと類似した生存を示し、しかし、免疫適格マウスと比較したときにはＴＤＯ２枯渇によるより短い生存利益を示し、このことは、腫瘍免疫を調節する際の、ＡＰＣヌルガンにおけるＴＤＯ２についての重要な役割を示していた（図４Ｍ）。
本発明者らは、ＴＤＯ２活性をインビボで阻害することが実証されている（Ｓｃｈｒａｍｍｅ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ、２０２０（Ｊａｎ）；８（１）：３２～４５、これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）が、ＴＤＯ２阻害剤のＰＦ０６８４５１０２／ＥＯＳ２００８０９（「ＴＤＯ２ｉ」）を合成し、この薬物を、ＡＰＣ－ＷＴまたはＡＰＣ－ＫＯのＭＣ３８同所性腫瘍を有するマウスに経口胃管栄養法によって投与した。図４Ｎに示されるように、このＴＤＯ２阻害剤は、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８腫瘍を有するマウスの生存を特異的に改善し、ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８腫瘍を有するマウスの生存に対しては影響が何らなかった。これらの所見から、ＡＰＣ欠損腫瘍におけるＴＤＯ２の状況特異的役割が強く確認される。そのうえ、毒性学分析では、このＴＤＯ２阻害剤が、肝毒性または体重減少の徴候を何ら伴うことなく十分に許容されることが示された。最後に、図４Ｏに示されるように、ＩＤＯ阻害剤のエパカドスタット（「Ｅｐａ」）は、ＭＣ３８ ＡＰＣ－ＷＴまたはＡＰＣ－ＫＯのどちらかのＣＲＣ同所性腫瘍を有するマウスにおいて抗腫瘍効果を示さなかった。ＴＤＯ２ｉ処理された腫瘍は、低下したＫｉ６７、増大した切断型カスパーゼ－３、および低下したＭ２様マクロファージ浸潤（Ｆ４／８０およびＣＤ１６３）を示し、後者から、腫瘍関連マクロファージ生物学におけるＴＤＯ２の役割が確認された（図４Ｐ）。
加えて、誘導性ｓｈＴＤＯ２を有するＷｎｔシグナル伝達依存性乳がん細胞株４Ｔ１（Ｇａｎｅｓｈ他、２０１８）はＴＤＯ２枯渇時の低下した同所性腫瘍成長を示した（図６Ａ～図６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＴＤＯ２が、がん細胞生存および腫瘍成長を具体的にはＡＰＣ喪失およびＷＮＴ経路活性化の状況において支援する際の不可欠な役割を果たすことを示している。
実施例４－ＴＤＯ２－Ｋｙｎ－ＡｈＲ軸はＡＰＣ変異型ＣＲＣがん細胞の腫瘍形成能を支援する
ＴＤＯ２はトリプトファン（Ｔｒｐ）を代謝して、多種多様な細胞機能を支配する遺伝子をアップレギュレーションするためにＡｈＲを結果として活性化するキヌレニン（Ｋｙｎ）を産生する。同質遺伝子型のＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株およびＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞株の遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）により、ｓｈＴＤＯ２のＤｏｘ誘導が、生体異物代謝と同様にトリプトファン代謝のシグナチャーを低下させること、すなわち、ＡｈＲ経路の主な機能と一致するパターンが示された（図７Ａ）。これに対応して、ＡｈＲおよびその標的遺伝子ＣＹＰ１Ｂ１の発現が、ＴＣＧＡ ＣＯＡＤデータセットにおいてＴＤＯ２レベルと正に相関した（図７Ｂ）。ＡＰＣｍｉｎマウス由来のポリープ、そしてｉＫＡＰ腫瘍もまた、上昇したＡｈＲを示した（図７Ｃ）。そのうえ、ＡＰＣ－ＫＰの繋がりが、ＡＰＣ－ＷＴ対照と比較しての上昇したＫｙｎ分泌、およびＴＤＯ２枯渇時の低下したＫｙｎレベルとを実証したＥＬＩＳＡにより、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８モデル系において立証された（図７Ｄ）。最後に、遺伝子発現分析により、ＡｈＲ発現およびその下流側遺伝子のＴＤＯ２枯渇時のダウンレギュレーションが特にＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株およびＤＬＤ１細胞株において示された（図７Ｅ；図８Ａ）。
がん関連プロセスにおけるＴＤＯ２－Ｋｙｎ－ＡｈＲ軸の役割を評価するために、コロニー形成アッセイを、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８ ｉｓｈＴＤＯ２細胞株およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８ ｓｈＡｈＲ細胞株を使用して実施した。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞において、ＴＤＯ２およびＡｈＲの枯渇は、Ｋｙｎ処理によって救済される低下したコロニー形成を示した（図７Ｆ）。同様に、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞を使用した場合、Ｋｙｎ補充によって救済されたが、増大した細胞死が、カスパーゼ－３アッセイによって示されるように、６８０Ｃ９１処理により実証された（図７Ｇおよび図７Ｈ）。別の確認モデルとして、ｉＫＡＰモデル系が利用され、これは、Ｋｙｎを処理することによる低下した細胞死を示した（図７Ｉ）。そのうえ、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞が注射されるマウスは、ＡｈＲを枯渇させると、増大した生存を示し、腫瘍は、低下したＫｉ６７および上昇した切断型カスパーゼ－３を示した（図７Ｊ；図８Ｂ）。したがって、ＴＤＯ２－Ｋｙｎ－Ａｈｒ軸はＡＰＣヌルがん細胞の増殖および生存ならびにその腫瘍形成能を支援する。
実施例５－ＴＤＯ２枯渇は腫瘍関連マクロファージの浸潤を阻害する
ＡＰＣ欠失およびＴＤＯ２枯渇によって影響されるがん特徴をＣＲＣにおいて評価するために、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８ ｉｓｈＴＤＯ２細胞株からのＲＮＡ－ｓｅｑデータおよび派生腫瘍からのマイクロアレイデータのＧＳＥＡ分析を実施した。ＡＰＣ－ＷＮＴ経路の知られているがん細胞固有機能（Ｐａｔｅ他、２０１４）と一致して、低酸素経路および解糖経路がＡＰＣ－ＫＯ細胞においてアップレギュレーションされた（図９Ａ；図１０Ａ）。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞は、ＧＬＵＴ１阻害剤ＳＴＦ－３１に対して、ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞よりも高い感受性を示し（図１０Ｂ）、また、ＴＤＯ２枯渇によって覆されたが、増大したグルコース取り込みおよび乳酸分泌を示した（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。ＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＳＬＣ２Ａ１、ＨＫ１／２およびＰＦＫＬなどの主要な解糖遺伝子のアップレギュレーションが確認され、これらの遺伝子は、ＴＤＯ２またはＡｈＲを枯渇させると、ダウンレギュレーションされた（図１０Ｅおよび図１０Ｆ）。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞からの細胞溶解物および馴化培地の代謝産物分析では、低下したレベルの解糖経路関連代謝産物がＴＤＯ２枯渇時に示された（図１０Ｇ）。これらのデータから、解糖経路が、ＴＤＯ２－ＡｈＲシグナル伝達によって調節される主たるがん細胞固有プロセスとして示される。
これらのがん細胞固有経路に加えて、ＡＰＣ欠損の細胞株および腫瘍におけるＡＰＣ状態（ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８対ＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８）またはＴＤＯ２枯渇は、免疫シグナル伝達シグナチャー（例えば、ＴＮＦＡシグナル伝達、炎症応答、ＩＬ－６＿ＪＡＫ＿ＳＴＡＴ、アログラフ（ａｌｌｏｇｒａｐｈ）拒絶および補体など）の顕著な表れをもたらした（図９Ａおよび図９Ｂ）。これらのインシリコ知見は、同質遺伝子型のＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞およびＡＰＣ－ＷＴ ＭＣ３８細胞により確立される同所性腫瘍の、ＴＤＯ２枯渇の有無による免疫プロファイリングを促した。ＣｙＴＯＦデータのｖｉＳＮＥプロットにより、ＡＰＣ ＫＯはマクロファージ存在量における有意な増大をもたらし、一方で、ＴＤＯ２枯渇はマクロファージ存在量を低下させることが示された（図９Ｃ）。ＣＤ４５陽性細胞におけるＦ４／８０陽性免疫細胞集団およびＣＤ２０６ｈｉｇｈ Ｍ２集団の定量化データにより、マクロファージがＡＰＣ－ＫＯ腫瘍において富むこと、およびＴＤＯ２枯渇時のその低下が確認された（図９Ｄ）。これらの腫瘍におけるＣＤ１６３の免疫組織化学染色は上述のＣｙＴＯＦデータと整合した（図１１Ａ）。ＷＮＴ活性のＣＲＣ細胞株ＣＴ２６および乳がん細胞株４Ｔ１により確立される腫瘍もまた、低下したマクロファージ集団をＴＤＯ２枯渇時に示した（図９Ｅおよび図９Ｆ；図１１Ｂおよび図１１Ｃ）。ＣＴ２６ ｉｓｈＴＤＯ２細胞株が注射されるＢａｌｂ／Ｃマウスは、クロドロナートリポソームを処理することによってマクロファージが枯渇化されたときには長期にわたる生存を示し、このことは、このモデル系における腫瘍関連マクロファージの重要性を強調していた（図９Ｇ）。
ＴＤＯ２媒介ＴＭＥ調節をさらに裏付けるために、ＴＣＧＡ ＣＲＣデータセットを、マクロファージ（全体およびＭ２）のマーカー、同様にまた、ＴｒｅｇマーカーおよびＭＤＳＣマーカーの発現について調べ、これにより、ＷＮＴ活性化とＴＤＯ２発現との間における強い正の相関が明らかにされた（図９Ｈ；図１１Ｄ）。加えて、ＷＮＴ－マクロファージ相関がさらに、核ベータ－カテニンシグナルを有するがん細胞がより高いＣＤ１６３発現をＴＭＥにおいて示すことが示されるＣＲＣ腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）分析によって確認された（図９Ｉおよび図９Ｊ）。まとめると、これらの所見は、ＷＮＴ経路が活性化されたＴＤＯ２のアップレギュレーションにより、免疫抑制性の腫瘍関連マクロファージをＴＭＥに動員するＡｈＲネットワークが活性化されるというモデルを支持している。
実施例６－ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＣＲＣ ＴＭＥに動員することによって腫瘍成長を促進させる
ＴＡＭを動員し得るＷＮＴ－ＴＤＯ２－ＡｈＲ経路標的を特定するために、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８ ｉｓｈＴＤＯ２細胞からの馴化培地（ＣＭ）のサイトカインアレイプロファイリングを実施した。ＴＤＯ２枯渇は、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ２を含めた古典的マクロファージサイトカインの分泌の低下（図１３Ａ）、および他のサイトカインの分泌の低下をもたらした（下記参照）。これに対応して、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用するトランスウエル遊走アッセイでは、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８ ｉｓｈＴＤＯ２培養物からのＣＭがマクロファージ遊走を増大させ、これがＴＤＯ２枯渇時に無効化されることが示された（図１３Ｂ）。
次に、最も高度に調節されたサイトカインをより完全に調べるために、ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおける上位にランクづけされた遺伝子を特定し、ｑＲＴ－ＰＣＲにより確認した。ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７（ＰＰＢＰ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２およびＣＸＣＬ１が、ＡＰＣ欠失またはＴＤＯ２枯渇に伴う最も有意な発現変化を示した（図１２Ａ）。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞におけるＡｈＲ遺伝子標的のＣＨＩＰ－ｓｅｑ分析では、これらの遺伝子に対する直接的なＡｈＲ結合（図１３Ｃ）、およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞におけるｓｈＲＮＡによるＡｈＲ枯渇がこれらの標的遺伝子の発現を阻害することが示された（図１３Ｄ）。
ＴＤＯ２の標的サイトカインをさらに特定するために、ＲＮＡ－ｓｅｑデータからの上位３つの遺伝子（ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７（ＰＰＢＰ）およびＣＳＦ３）のＯＲＦを発現する細胞株をＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８ ｉｓｈＴＤＯ２細胞において作製し、腫瘍成長を、ＴＤＯ２ノックダウンによる損なわれた増殖を救済する遺伝子を特定するためにモニターした。ＣＸＣＬ５の強制発現は、最も高い変化倍数を示したが、ＴＤＯ２枯渇によって媒介される低下した腫瘍成長を最も有意に救済した（図１２Ｂ）。ＣＸＣＬ５を過剰発現するＡＰＣ－ＫＯ腫瘍のＣｙＴＯＦ分析により、増加したマクロファージがｓｈＴＤＯ２の存在下で示された（図１２Ｃ～図１２Ｅ）。
遊走アッセイでは、マクロファージ動員の救済が、ＡＰＣ－ＫＯ ＴＤＯ２枯渇ＭＣ３８細胞からのＣＭにＣＸＣＬ５を補充することによって示され、これに対して、ＣＸＣＬ５が結合するＣＸＣＲ１／２阻害剤の同時処理はＣＸＣＬ５補充による救済を無効にした（図１２Ｆ）。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞からの馴化培地では、いくつかのＭ２マクロファージマーカーがＲａｗ２６４．７細胞においてアップレギュレーションされ、しかし、これらはＴＤＯ２ノックダウンによって低下し、ＣＸＣＬ５補充によって救済された（図１３Ｅ）。同様に、ＢＭＤＭがＫｙｎまたはＣＸＣＬ５と共培養されたときには、Ｍ２マクロファージマーカーが増大し、このことから、ＴＡＭ分極におけるＴＤＯ２－ＡｈＲ軸の潜在的役割が示唆された（図１３Ｆ）。
マクロファージマーカーの免疫組織化学的分析では、マクロファージの増大した浸潤が、ＣＸＣＬ５発現が強制される腫瘍において示された（図１３Ｇ）。最後に、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞による異種移植片マウスは、増大した生存をＴＤＯ２またはマクロファージの枯渇によって示した。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株におけるＣＸＣＬ５過剰発現はマウスの生存を有意に短くし、しかし、これは、マクロファージを枯渇させることによって覆された（図１２Ｇ）。ｓｈＣＸＣＬ５を有するＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞、または抗ＣＸＣＬ５中和抗体により処理されるＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞もまた、長期にわたる生存を示した（図１３Ｈおよび図１３Ｉ）。
ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５軸とマクロファージ浸潤との間における関係をさらに確認するために、ＴＣＧＡ ＣＲＣ（ＣＯＡＤおよびＲＥＡＤ）データセットおよびＢＲＣＡデータセットをＣＸＣＬ５発現に基づいてクラスター化し、相関する免疫集団について分析し、マクロファージが高ＣＸＣＬ５群においてアップレギュレーションされることが見出された（図１４Ａ～図１４Ｄ）。加えて、ＣＸＣＬ５発現が、ＴＣＧＡ ＣＲＣおよびＢＲＣＡ（ｔｒｅｎｄ）において、増大したトリプトファン代謝（最上位経路シグナチャー遺伝子としてのＴＤＯ２）および生体異物代謝と有意に相関した（図１４Ｅ～図１４Ｇ）。まとめると、これらのデータから、ＴＤＯ２－ＡｈＲ経路によるＣＸＣＬ５のアップレギュレーションがマクロファージをＴＭＥ内に動員させて、腫瘍成長を促進させること、そして、ＴＤＯ２－ＡｈＲ－ＣＸＣＬ５経路の中和が腫瘍成長を阻害し得ることが明らかにされる。
実施例７－ＧＡＳ６はマクロファージにおいてＣＸＣＬ５によってアップレギュレーションされ、細胞成長を促進させる
受容体チロシンキナーゼホスホアレイ分析を行った。これにより、ＴＤＯ２枯渇時にはＡＰＣ－ＫＯ細胞株でのみ低下したリン酸化Ａｘｌの顕著なアップレギュレーションがＡＰＣ－ＫＯ細胞において明らかにされた（図１５Ａ）。
Ｇａｓ６はＡｘｌのリガンドであり、ＴＭＥにおいて主に腫瘍関連マクロファージによって分泌されており（Ｌｏｇｅｓ他、２０１０）、このことから、マクロファージ由来Ｇａｓ６はＡｘｌを活性化して、ＡＰＣ欠損がん細胞の成長を支援しているかもしれないという可能性が生じている。この可能性を評価するために、ＡＰＣ－ＫＯ細胞は、総ＡｘｌおよびＡｘｌリン酸化を増加させていることが確認され、Ａｘｌ阻害剤Ｒ４２８は、Ａｘｌリン酸化を低下させることが示された（図１５Ｂ）。相互的に、マウス組換えＧａｓ６（ｒｍＧａｓ６）はＡｘｌを活性化し（図１５Ｃ）、インビトロにおいてＲ４２８処理によって覆されるがん細胞成長を促進させた（図１５Ｄ）。そのうえ、ＡＰＣ欠損細胞は、ＡＰＣが無傷のＭＣ３８細胞と比較したとき、Ｒ４２８に対する増大した感受性を示した（図１５Ｅ）。加えて、ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞により確立される同所性腫瘍は、ＴＤＯ２枯渇によって低下するが、（ＥｐＣａｍ染色によって示される）増大したリン酸化Ａｘｌを腫瘍細胞において示した。この同所性腫瘍はまた、リン酸化Ａｘｌによって救済されるＴＤＯ２枯渇したＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞においてＣＸＣＬ５の強制された発現を示した（図１５Ｆ）。
がん細胞からの分泌された因子がマクロファージにおいてＧａｓ６発現をアップレギュレーションしているかもしれないかどうかを評価するために、ＢＭＤＭをＭＣ３８細胞株からの馴化培地とインキュベーションした。ＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞株からの馴化培地は、ＡＰＣ－ＷＴ細胞株およびＴＤＯ２枯渇を伴うＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８細胞と比較して、マクロファージにおけるＧａｓ６のｍＲＮＡレベルを有意に増大させた（図１５Ｇ）。加えて、ＣＳＦ１は、Ｇａｓ６をマクロファージにおいてアップレギュレーションすることが知られているが、ＫｙｎおよびＣＸＣＬ５もまた、Ｇａｓ６自身と同様に、ＢＭＤＭにおけるＧａｓ６発現を増大させ、このことから、正のフィードバックループが示唆された（図１５Ｈ）。最後に、腫瘍成長をインビボで促進させることにおけるＧａｓ６の役割を確認するために、ＣＴ２６細胞株および２つの独立したＲａｗ２６４．７ ｓｈＧａｓ ６細胞株を同系のＢａｌｂ／ＣＪマウスに同時注射した（図１５Ｉ）。Ｇａｓ６枯渇マクロファージが注射されるマウスは腫瘍成長の低下を示し（図１５Ｊ）、ＣＸＣＬ５により前処理されるマクロファージはＣＴ２６の成長を有意に促進させた（図１５Ｋ）。まとめると、これらのデータから、ＣＸＣＬ５－Ｇａｓ６－Ａｘｌ回路によって一部が媒介される、がん細胞とマクロファージとの間における共生的関係が明らかにされた。
実施例８－実施例１～７に記載されるある特定の研究に関連する材料および方法
材料
マウス
マウスを大型プラスチック製ケージにおいて５匹ずつのグループに分けし、無菌条件下で維持した。すべての動物研究が、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認により実施された。ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＢＡＬＢ／ｃＪマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した（ストック番号：００５５５７、０００６６４、０００６５１）。結腸直腸同所性異種移植片腫瘍モデルを下記プロトコルによって確立した（Ｔｓｅｎｇ他、２００７、ＪｏＶＥ）。
細胞
ＣＲＣ細胞株のＭＣ３８細胞およびその同質遺伝子型細胞、同様にまた、ＢＭＤＭ細胞および２９３Ｔ細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＣＣＤ－８４１－ＣｏＮ細胞、ＲＫＯ細胞、ＨＴ－２９細胞およびＬＳ１８０細胞をイーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。ＨＴ－２９細胞をマッコイ５Ａ培地で培養した。ＤＬＤ－１細胞株、ＣＴ２６細胞株、４Ｔ１細胞株、およびＲａｗ２６４．７マクロファージ細胞株をＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ）で培養した。すべての細胞株を、１０％のＴｅｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｒｏｖｅｄ ＦＢＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および１００Ｕ／ｍｌのアンピシリン／ペニシリンを含有する示された培地で培養した。すべてのヒト細胞株が、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによってフィンガープリンティングにより正しいと確認されている。すべての細胞が、マイコプラズマ非含有であることが確認され、３７℃および５％ＣＯ２で維持された。Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＢＭＤＭを以前に記載されたように培養した（Ｃｈｅｎ他、２０１７）。馴化培地を、ＦＢＳ非含有培養培地における２４時間の培養の後、示されるような処理細胞または未処理細胞から集めた。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９トランスフェクション
ヒトＡＰＣ遺伝子（ｓｃ－４００３７４）を標的とするｓｇＲＮＡプラスミドを、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。マウスＡＰＣ遺伝子については、ＴＴＧＡＧＣＧＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＣＣＧのｓｇＲＮＡ標的配列をｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ－ＥＦ１ａ－ＧＦＰプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にクローン化した。ヒトＲＫＯ細胞およびマウスＭＣ３８細胞を、１０％の熱不活性化ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌのアンピシリン／ペニシリンが補充される培養培地において７０％～８０％のコンフルエンシーまで６ウエルプレートで維持した。ｓｇＲＮＡを有するプラスミドを、リポフェクタミン２０００を製造品プロトコルに従って使用して に一過性トランスフェクションした。細胞を７２時間後に集め、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによって単一細胞として９６ウエルプレートのそれぞれのウエルに選別した。細胞選別後１０日目に、成長した細胞コロニーを２４ウエルプレートにおいて拡大した。それぞれのコロニーにおけるＡＰＣ遺伝子のノックアウトをＡＰＣおよびβ－カテニンについてのＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロットによって確認した。
ＡＰＣｍｉｎマウスオルガノイド
１８週齢の雄ＡＰＣｍｉｎマウスからの腸ポリープを採取し、切断組織を、３０ｍＭのＥＤＴＡを含有する完全キレート化溶液により４℃で３０分間処理した。その後、組織片を穏やかにピペッティングして、陰窩を解離させた。その後、これらの陰窩を、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２が存在する高ＷＮＴヒトオルガノイド培地の存在下でＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に７日～１０日間播種した。
方法
遺伝子安定的ｓｈＲＮＡノックダウンおよび誘導性ｓｈＲＮＡノックダウン
マウスと同様にヒトのＴＤＯ２およびＡｈＲを標的とするｓｈＲＮＡヘアピンを本研究において使用した。５個～７個のヘアピンをそれぞれの遺伝子についてスクリーニングし、７０％を超えてタンパク質レベルを低下させる配列を選んだ。これらの選択されたヘアピンがｐＬＫＯ．１ベクターに存在した。組換えレンチウイルス粒子を２９３Ｔ細胞へのプラスミドの一過性トランスフェクションによって作製した。簡単に記載すると、８μｇのｓｈＲＮＡプラスミド、４μｇのｐｓＰＡＸ２プラスミドおよび２μｇのｐＭＤ２．Ｇプラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用して、１００ｍｍディッシュに置床される２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。ウイルス上清をトランスフェクション後４８時間および７２時間で採取し、ろ過した。細胞への感染を、８μｇ／ｍｌのポリブレンを含有するウイルス上清により４８時間において２回行い、その後、細胞を、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを使用して選択し、ＴＤＯ２およびＡｈＲの発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって調べた。
ウエスタンブロット
細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃｏｃｋ）を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）を用いて調製した。免疫ブロッティングを標準的プロトコルに従って実施した。抗体を、示された会社から購入した。
免疫組織化学および免疫蛍光
免疫組織化学を、以前に記載されたような標準的プロトコル（Ｃｈｅｎ他、２０１７；Ｚｈａｏ他、２０１７）を使用して実施した。簡単に記載すると、圧力調理器（９５℃で３０分間、続いて１２０℃で１０秒間）を、抗原暴露溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用する抗原回復のために使用した。Ｘに対する特異的な抗体を本研究において使用した。ヒトおよびマウスの腫瘍組織切片を再検討し、スコア化した。切片を、Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ２５０ Ｆｌａｓｈ ＩＩＩ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ Ｌｔｄ）を使用してスキャンし、画像を、Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ Ｌｔｄ）を介して取り込んだ。ヒト検体に関する研究は、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ施設内審査委員会によって承認された。
遊走アッセイ
マクロファージ（Ｒａｗ２６４．７およびＢＭＤＭについて１×１０４個）を血清非含有培養培地に懸濁し、２４ウエルトランスウエルの挿入物（５．０μｍ）に播種した。示された因子を含む培地、または馴化培地を残りの受器ウエルに加えた。２４時間後、遊走したマクロファージを固定処理し、クリスタルバイオレット（０．０５％、シグマ）により染色し、その後、顕微鏡により視野あたりの細胞数として計数し、またはクリスタルバイオレットを溶解させた後でＯＤ５９０ｎｍとして測定した（遊走指数として表した）。
コロニー形成アッセイ
インビトロでの結腸直腸がん細胞増殖をコロニー形成によりアッセイした。１×１０３個の細胞を６ウエルプレートのそれぞれのウエルに播種し、５日間～７日間培養した。終点で、細胞を固定処理し、２５％メタノールにおける０．５％クリスタルバイオレットにより１時間染色した。これらの研究を三連で実施した。
マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）
ＣｙＴＯＦ分析を以前に記載されたように行った（Ｌａｏ他、２０１９）。簡単に記載すると、腫瘍を消化し、ＦｃＲによりブロッキング処理された単一細胞を表面抗体とインキュベーションした。その後、細胞をＣｅｌｌ－ＩＤシスプラチン（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、カタログ番号２０１０６４）とインキュベーションし、ＦＯＸＰ３細胞内染色のために透過処理した。核染色のために、細胞を、固定処理しながら、Ｃｅｌｌ－ＩＤインターカレーター－Ｉｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、カタログ番号２０１１９２Ａ）とインキュベーションした。サンプルを、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒにおけるＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ ＦａｃｉｌｉｔｙにおいてＣｙＴＯＦ装置（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）により分析した。それぞれの細胞集団の細胞数および細胞割合をＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアにより分析した。ＣｙＴＯＦデータを、Ｃｙｔｏｂａｎｋ（ＣｈｅｎおよびＫｏｔｅｃｈａ、２０１４）を使用して実行される次元削減法ｖｉＳＮＥ（Ａｍｉｒ ｅｌ他、２０１３）を使用して可視化した。
ＣｈＩＰ－配列決定およびＣｈＩＰ－ＰＣＲ
ＣＨＩＰを以前に記載されたように実施した（Ｚｈａｏ他、２０１７）。簡単に記載すると、ＰＦＡ固定処理された細胞からのクロマチンを、１％のＰＦＡを使用して１０分間架橋し、その後、反応を、０．１２５Ｍのグリシンを（５分間）使用して室温で停止させた。細胞を氷上で３０分間、ＣｈＩＰ溶解緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．２％ ＳＤＳ、および０．１％デオキシコール酸］により溶解した。クロマチンの断片化を、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ ＢｉｏｒｕｐｔｏｒＰｉｃｏ超音波処理器を使用して実施した（３０秒作動および３０秒停止、４５サイクル）。その後、可溶化されたクロマチンを、抗体およびＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の適切な混合物と一晩インキュベーションした。その後、免疫複合体をＲＩＰＡ緩衝液により洗浄し（３回）、ＲＩＰＡ－５００（５００ｍＭのＮａＣｌを含むＲＩＰＡ）により１回洗浄し、ＬｉＣｌ洗浄緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ ＬｉＣｌ、０．５％ ＮＰ－４０、および０．５％デオキシコール酸］により１回洗浄した。溶出および逆架橋を、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を含有する直接溶出緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＳＤＳ］において６５℃で一晩実施した。溶出したＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、その後、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡライブラリーキット（Ｅ７３７０）を使用してライブラリーを作製するために、またはｑＰＣＲを実施するために使用した。配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００装置を使用して実施して、データセットを得た。
ｍＲＮＡ発現分析およびマイクロアレイ
ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して細胞から単離した。最初に、ＲＮＡ（２００ｎｇ～５００ｎｇ）を、ＤＮＡ非含有キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ Ｉにより処理して、すべてのゲノムＤＮＡを除き、その後、ＡＢＩ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００配列検出システムとともにリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分析した。それぞれの反応を三連で実施した。それぞれの遺伝子の発現をマウスアクチンまたはヒトＧＡＰＤＨの発現によって正規化した。
ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１５５９６－０２６）を製造者の説明書に従って使用して細胞から単離した。その後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）によりさらに精製し、その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第一鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して対象とする遺伝子の発現を分析するために実施した。マイクロアレイ分析を、データセットを得るためにＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｍｏｕｓｅ Ｃｌａｒｉｏｍ Ｄアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ施設において、ドキシサイクリン処理の有無によるＡＰＣ－ＷＴ腫瘍およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８ ｉｓｈＴＤＯ２腫瘍から調製されるＲＮＡに対して実施した（対照腫瘍およびＡＰＣ－ＫＯ ＭＣ３８腫瘍については生物学的三連物に対して）。対照細胞とＡＰＣ枯渇ＭＣ３８細胞との間で示差的に発現した遺伝子を遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）に供した。生データを、トランスクリプトーム分析コンソールを使用するＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎによって処理し、分析した。
定量化および統計学的分析
すべての統計学的分析をスチューデントｔ検定により実施し、平均±ＳＤとして表した。核β－カテニン、ＴＤＯ２およびＣＤ１６３の間での相関についてのＴＡＭ ＩＨＣ染色の分析を、カイ二乗検定を使用して実施した。マウス生存分析を、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７）を使用して実施した。ｐ値を以下のように指定した：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１、および＊＊＊、ｐ＜０．００１；ｎ．ｓ．有意でない（ｐ＞ ０．０５）。
本明細書中に開示される方法および主張される方法のすべてが、本開示に照らして過度の実験を行うことなく得ることができ、また、実行することができる。本発明の組成物および方法が、好ましい実施形態の観点から説明されているが、様々な変化が、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法に対して、また、本明細書中に記載される方法の工程において、または一連の工程において適用され得ることが、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の両方で関連するある特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤の代わりに使用されることがあり、同時に、同じ結果または類似する結果が達成されるであろうことが、明らかであろう。当業者には明らかであるすべてのそのような類似した代用および改変は、添付された請求項によって定義されるような本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する限りにおいて、参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
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Claims (81)

  1. 大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）変異を有すると判定されるがんを有する対象を処置するための方法であって、（ａ）トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）の阻害剤、または（ｂ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を前記対象に与えることを含む、方法。
  2. ＡＰＣ欠損がんのために対象を処置するための方法であって、（ａ）トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）の阻害剤、または（ｂ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を前記対象に与えることを含む、方法。
  3. がんのために対象を処置するための方法であって、
    （ａ）ＡＰＣ欠損を有するとして前記がんを特定すること、および
    （ｂ）（ｉ）トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）の阻害剤、または（ｉｉ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を前記対象に与えること
    を含む、方法。
  4. 前記欠損がＡＰＣ変異である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記欠損がＡＰＣ発現の抑制である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記抑制がエピジェネティック抑制である、請求項５に記載の方法。
  7. 阻害剤がＴＤＯ２の阻害剤である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記阻害剤により、ＴＤＯ２の発現が前記がんにおいて阻害される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記阻害剤により、ＴＤＯ２の活性が前記がんにおいて阻害される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子阻害剤、抗体、または抗体様分子である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記阻害剤が、ＴＤＯ２を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記阻害剤が、ＰＦ０６８４５１０２／ＥＯＳ２００８０９、６８０Ｃ９１、ＬＭ１０、ＨＴＩ－１０９０、ＤＮ１４０６１３１、ＲＧ７００９９、ＥＰＬ－１４１０、ＣＢ５４８、ＣＭＧ０１７、またはそれらの誘導体である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記阻害剤が、ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  14. 前記サイトカインが、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、ＣＳＦ３、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２またはＣＸＣＬ１である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記サイトカインが、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７またはＣＳＦ３である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記サイトカインがＣＸＣＬ５である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記阻害剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小分子阻害剤、抗体、または抗体様分子である、請求項１３～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記阻害剤がＣＸＣＲ１／２阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記阻害剤がＣＸＣＲ５阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記阻害剤が、ＣＸＣＲ５を標的とする抗体または抗体様分子である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記阻害剤が、ＣＸＣＬ５を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記がんが、対照サンプルまたは参照サンプルと比較してＴＤＯ２の増大した発現を有する、請求項１～２１のいずれかに記載の方法。
  23. 前記対照サンプルまたは参照サンプルが、健常な対象からの生体サンプルである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記がんが、構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達を含む、請求項１～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記がんが、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、頭頸部扁平上皮がんまたは肉腫である、請求項１～２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記がんが結腸直腸がんである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記がんが、ステージＩのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  28. 前記がんが、ステージＩＩａのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  29. 前記がんが、ステージＩＩｂのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  30. 前記がんが、ステージＩＩｃのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  31. 前記がんが、ステージＩＩＩａのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  32. 前記がんが、ステージＩＩＩｂのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  33. 前記がんが、ステージＩＩＩｃのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  34. 前記がんが、ステージＩＶａのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  35. 前記がんが、ステージＩＶｂのがんである、請求項１～２６のいずれかに記載の方法。
  36. 前記がんが再発性がんである、請求項１～３５のいずれかに記載の方法。
  37. 前記対象にがん免疫療法を与えることをさらに含む、請求項１～３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記がん免疫療法が、抗体療法または細胞療法である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記がん免疫療法がチェックポイント阻害剤療法である、請求項３７に記載の方法。
  40. さらなる治療法を前記対象に与えることをさらに含み、前記さらなる治療法が、化学療法、放射線療法、手術、またはそれらの組み合わせである、請求項１～３９のいずれかに記載の方法。
  41. 化学療法、放射線療法、手術、またはそれらの組み合わせを前記対象に与えることを含まない、請求項１～３９のいずれかに記載の方法。
  42. 化学療法、放射線療法または手術のいずれかを前記対象に与えることを含まない、請求項４１に記載の方法。
  43. 腫瘍関連マクロファージの数を前記対象において低下させることを含む、請求項１～４２のいずれかに記載の方法。
  44. インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）またはインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）の阻害剤を前記対象に与えることをさらに含む、請求項１～４３のいずれかに記載の方法。
  45. ＩＤＯ１またはＩＤＯ２の阻害剤を前記対象に与えることを含まない、請求項１～４３のいずれかに記載の方法。
  46. 前記医薬組成物が、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、脳脊髄内投与、皮下投与、関節内投与、滑液包内投与、クモ膜下腔内投与、経口投与、局所投与、吸入による投与、または２つ以上の投与経路の組み合わせによる投与によって投与される、請求項１～４５のいずれかに記載の方法。
  47. 前記対象は前記がんのために以前に処置されたことがない、請求項１～４６のいずれかに記載の方法。
  48. 前記対象は前記がんのために第１の処置により以前に処置された、請求項１～４６のいずれかに記載の方法。
  49. 前記第１の処置が、手術、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせを含んでいた、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記がんが、前記以前の処置に対して抵抗性であると判定された、請求項４８または４９に記載の方法。
  51. ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるとしてがんを特定するための方法であって、
    （ａ）がん細胞を対象からの生体サンプルから得ること、
    （ｂ）ＡＰＣ遺伝子における欠損を前記がん細胞において検出すること、および
    （ｃ）ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるとして前記がんを（ｂ）に基づいて特定すること
    を含む、方法。
  52. ＴＤＯ２の増大した発現または活性を非がん性生体サンプルからの細胞と比較して前記がん細胞において検出することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記欠損がＡＰＣ変異である、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記欠損がＡＰＣ発現の抑制である、請求項５１または５２に記載の方法。
  55. 前記抑制がエピジェネティック抑制である、請求項５３に記載の方法。
  56. 生体サンプルが、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるがん細胞を含むかどうかを判定するための方法であって、
    （ａ）ＡＰＣ欠損の有無を前記生体サンプルにおいて測定すること、
    （ｂ）前記生体サンプルがＡＰＣ欠損を含むならば、前記生体サンプルは、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるがん細胞を含んでいると判定すること、および
    （ｃ）前記生体サンプルがＡＰＣ欠損を含まないならば、前記生体サンプルは、ＴＤＯ２阻害に対して感受性であるがん細胞を含んでいないと判定すること
    を含む、方法。
  57. ＴＤＯ２の発現レベルまたは活性レベルを前記生体サンプルにおいて測定することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記生体サンプルにおけるＴＤＯ２の前記発現レベルまたは活性レベルが非がん性生体サンプルにおける発現レベルまたは活性レベルと有意に異なっていないならば、前記生体サンプルは、阻害に対して感受性であるがん細胞を含んでいないと判定することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記欠損がＡＰＣ変異である、請求項５６～５８のいずれかに記載の方法。
  60. 前記欠損がＡＰＣ発現の抑制である、請求項５６～５８のいずれかに記載の方法。
  61. 前記抑制がエピジェネティック抑制である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記生体サンプルが、血液サンプルまたは血清サンプルである、請求項５１～６１のいずれかに記載の方法。
  63. 前記がん細胞が結腸直腸がん細胞である、請求項５１～６２のいずれかに記載の方法。
  64. 前記生体サンプルが、結腸直腸がん患者の手術部位に隣接する組織である、請求項５１～６３のいずれかに記載の方法。
  65. 前記非がん性生体サンプルが正常な粘膜組織である、請求項５１～６４のいずれかに記載の方法。
  66. 前記サンプルにおけるＴＤＯ２の前記発現レベルまたは活性レベルを前記非がん性サンプルにおけるＴＤＯ２の発現レベルまたは活性レベルと比較することをさらに含む、請求項５１～６５のいずれかに記載の方法。
  67. 前記生体サンプルを前記対象から得ることをさらに含む、請求項５１～６６のいずれかに記載の方法。
  68. 構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達を有すると判定されるがんのために対象を処置する方法であって、（ａ）トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）の阻害剤、または（ｂ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を含む医薬組成物を前記対象に与えることを含む、方法。
  69. 前記構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達が大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子における欠損を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記欠損がＡＰＣ変異である、請求項６８に記載の方法。
  71. 前記欠損がＡＰＣ発現の抑制である、請求項６８に記載の方法。
  72. 前記抑制がエピジェネティック抑制である、請求項１０に記載の方法。
  73. 前記構成的に活性なＷＮＴシグナル伝達が、構成的に活性なβ－カテニンを含む、請求項６８に記載の方法。
  74. 前記がんが、構成的に活性なβ－カテニンタンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
  75. がんを対象において処置するための方法であって、前記がんがＡＰＣ変異を有するかどうかを判定すること、ならびに
    （ａ）前記がんがＡＰＣ変異を有するならば、（ｉｉ）ＴＤＯ２の阻害剤、または（ｉｉ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤の効果的な量を前記対象に与えること、および
    （ｂ）前記がんがＡＰＣ変異を有しないならば、効果的な量の代替治療法を前記対象に与えること
    を含む、方法。
  76. 前記代替治療法が、ＴＤＯ２活性の阻害剤、またはＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤ではない、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記代替治療法が、手術、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせを含む、請求項７５または７６に記載の方法。
  78. ＡＰＣ変異型がんを対象において処置することにおける、（ａ）（ｉ）ＴＤＯ２活性の阻害剤、または（ｉｉ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤と、（ｂ）医薬用の許容され得るキャリアとの使用。
  79. ＡＰＣ変異型がんを対象において処置するための医薬品の製造における、（ａ）（ｉ）ＴＤＯ２活性の阻害剤、または（ｉｉ）ＴＤＯ２活性によって活性化されるサイトカインの阻害剤と、（ｂ）医薬用の許容され得るキャリアとの使用。
  80. 前記がんが結腸直腸がんである、請求項７８または７９に記載の使用。
  81. 前記がんが、対照サンプルまたは参照サンプルと比較してＴＤＯ２の増大した発現を有すると判定される、請求項７８～８０のいずれかに記載の使用。
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